TW201509421A - 糖胺聚醣共軛化合物及其製備方法與應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種化合物，其係由一藥物與糖胺聚醣共軛所形成，其中糖胺聚醣係以玻尿酸為例，且該藥物是用於治療疾病，例如發炎、自體免疫疾病、過敏、感染或癌症。本發明所述之共軛化合物可藉由糖胺聚醣作為藥物傳遞載體而於疾病之標的位置增加藥物的濃度，並藉由CD44細胞表面受體與糖胺聚醣的相互作用以提高治療效果及減少藥物的全身性副作用。

Description

糖胺聚醣共軛化合物及其製備方法與應用
本發明係關於一種共軛化合物，其係由一糖胺聚醣以及一種藥物鍵結所組成；本發明亦關於該共軛化合物之製備方法及其應用。
細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是一種具有調節細胞功能以及相互作用以回應刺激之動態組合。其中一種細胞外基質大分子糖胺聚醣(glycosaminoglycans，GAGs)，其係與生物體正常及不正常的生物過程有關，所述之生物過程包括細胞遷移(migration)、分化(differentiation)、增殖(proliferation)、免疫反應(immune response)和細胞骨架組織(cytoskeletal organization)。
糖胺聚醣係由重複雙醣單元(disaccharide units)組成且無支鏈。這些雙醣單元包含胺糖(amino sugar)[N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)或N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)]，且雙醣在大多數情況下是硫酸化(sulfated)。所述第二種糖通常是一種糖醛酸(uronic acid)[葡萄糖醛酸(glucuronic acid)或艾杜糖醛酸(iduronic acid)]。由於糖胺聚醣的糖殘基(sugar residue)大部分係羧基(carboxyl group)或硫酸酯基(sulfate group)而使糖胺聚醣 高度帶負電荷，因此，糖胺聚醣具有很強的親水性(hydrophilic)。糖胺聚醣具有高度延展之一致性，且形成之基質可用於空間填充和耐壓縮力。糖胺聚醣可藉由醣殘基之鍵結類型以及硫酸酯基的數目和位置分為4大類，其包括：(1)玻尿酸(hyaluronan，HA)、(2)硫酸軟骨素(chondroitin sulphate)及硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、(3)硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)及肝素(heparin)以及(4)硫酸角質素(keratan sulfate)。
玻尿酸具有不同之英文名稱(hyaluronic acid、hyaluronate或HA)，其係一種最簡單之糖胺聚醣，其係由交替重複的非硫化雙醣單元，尤其是N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)及葡萄糖醛酸(glucuronic acid)所組成，其分子量介於400道爾頓(Dalton，Da)至數百萬道爾頓之間。
玻尿酸於所有組織例如皮膚(skin)、軟骨(cartilage)以及眼睛(eye)具有不同數量，並以流體形式存於成體動物，特別是早期胚胎。在關節軟骨(articular cartilage)，玻尿酸可形成一個大聚集對於軟骨功能來說是非常重要的。此外，玻尿酸藉由玻尿酸介導的移動受體(receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM)以及CD44介導細胞移動性(cell motility)和免疫細胞的黏附(immune cell adhesion)。
玻尿酸是由單一玻尿酸合成酶(hyaluronan synthetase，HAS)介導，並於細胞表面之內膜與生長聚合物擠壓至細胞外部而被直接合成。相比之下，其他的糖胺聚 醣係於細胞內合成[例如高爾基體(Golgi apparatus)]，並與一些核心蛋白(core protein)關聯，再藉由胞吐作用(exocytosis)釋放。在脊椎動物活體內組織中，藉由外切糖苷酶(exoglycosidase)[即玻尿酸酶(hyaluronidase)]移除糖即可完成玻尿酸之降解(degradation)。哺乳動物型玻尿酸酶(mammalian-type hyaluronidases)同時具有水解和轉糖苷酶(transglycosidase)活性以降解玻尿酸和軟骨素。在結締組織中，玻尿酸與水的水合作用形成可於組織之間形成空間，從而形成一個有利於細胞運動及增殖的環境。玻尿酸於生物現象諸如快速發展(rapid development)、再生(regeneration)、修復(repair)、胚胎發生(embryogenesis)、胚胎發育(embryological development)，傷口癒合(wound healing)、血管新生(angiogenesis)以及腫瘤發生(tumorigenesis)扮演關鍵作用之角色。
CD44(也稱作Pgp-1、Hermes-3、HCAM或ECMR III)是一種廣泛表現且分子量介於8萬5千道爾頓至9萬道爾頓之醣蛋白。CD44係玻尿酸的主要細胞表面受體。儘管CD44也可辨識某些含有蛋白多醣的硫酸軟骨素，但CD44係與玻尿酸特異性地結合，且CD44在各種細胞及生理功能扮演重要角色，包括與玻尿酸之附著力(adhesion)、玻尿酸降解以及腫瘤轉移(tumor metastasis)。CD44也被證明在細胞外基質的結合、細胞遷移、淋巴細胞激活(lymphocyte activation)，淋巴細胞歸巢(lymphocyte homing)和支氣管平滑肌細胞增殖等扮演重要角色(Gunthert et al.,1991,A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells,5；65(1)：13-24)。CD44受體顯示在細胞外結構之可變區域具有一種可選擇性剪接之複雜模式，因此，CD44對於玻尿酸而言，似乎是一個特別重要的白細胞(leukocyte)受體，並可能在哮喘的發病機制扮演相當作用。此外，相較於抗體治療的小鼠，對照組小鼠施予較高玻尿酸濃度可明顯減少實驗性哮喘產生，亦證實CD44於玻尿酸代謝的作用，特別是高分子量玻尿酸分解為發炎前低分子量形式。由於玻尿酸衍生的寡糖可結合並激活類Toll受體(Toll-like receptor)，因此，對於抗CD44之治療具有利顯著正面的影響。
HA-CD44相互作用可能在發育、發炎、T細胞的募集(recruitment)與活化、肺部炎症(lung inflammation)、腫瘤生長和轉移中發揮重要作用。許多癌症中發現，交替剪接(alternatively spliced)會影響CD44轉錄(transcripts)的表現改變，例如胃癌(F Reihani-Sabet et al.,2003,Effects of Inflammation and H.pylori Infection on Expression of CD44 Variant Exons in Gastric Tissue,Journal of Sciences,14：11-16)。
基於CD44受體過度表現，惡性腫瘤細胞(malignant tumor cells)相較於正常結締組織或間質細胞(mesenchymal cell)更能選擇性攝入較高之生物共軛物(bioconjugates)。許多研究顯示，玻尿酸合成及攝入與癌症的進展及轉移相關。某些腫瘤，包括在肺中被發現之腫瘤，過度表現CD44細胞表面標誌物(cell-surface marker)。由於高P-醣蛋白(P-glycoprotein)表達需要玻尿酸以產生多重耐 藥性(multi-drug resistance)，因此乳癌細胞也被認為相較於正常細胞吸收攝入較多的玻尿酸。此外，浸潤性(invasive)乳腺癌細胞過度表現玻尿酸之主要受體CD44，並依賴於高濃度的內化HA-CD44以進行擴散。因此，化療藥物奈米共軛物(nanoconjugates)與玻尿酸可有效對抗淋巴轉移(Eliaz,R.E.et al.,2004,Liposome-encapsulated doxorubicin targeted to CD44：a strategy to kill CD44-overexpressing tumor cells,Cancer Res.,61(6)：2592-601)。
非類固醇抗發炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)以及選擇性抑制劑環加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)被用於治療疼痛、發炎及發熱。最近，越來越多的實驗顯示某些NSAIDs和選擇性COX-2抑制劑也可藉由涉及於腫瘤發生過程之多種生物學事件而具有抗癌活性。例如，流行病學研究顯示經常服用阿司匹林(Aspirin)可降低罹患結腸癌之風險(Sandler RS.,et al.,2003,A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas in patients with previous colorectal cancer,New England J.Med.,348：883-890)。此外，COX-2拮抗劑，例如希樂葆(Celecoxib)、羅非昔布(Rofecoxib)、尼美蘇來(Nimesulide)、美洛西卡(Meloxicam)及艾特多雷克(Etodolac)等皆具有抗癌活性(Yamazaki R.,et al.,2002,Selective cyclooxygenase-2 inhibitors show a differential ability to inhibit proliferation and induce apoptosis of colon adenocarcinoma cells.,FEBS Lett.,531(2)：278-84)。
此外，許多癌前(premalignant)、惡性以及轉移 性人類癌症中，COX-2過度表現與侵襲(invasiveness)、預後(prognosis)以及存活(survival)顯著相關(Dannenberg AJ.,et al.,2003,Targeting cyclooxygenase-2 in human neoplasia：rationale and promise,Cancer Cell,4(6)：431-6)。最大有效性通常受限於有關COX-1之劑量；且在結腸癌、皮膚癌、肺癌、膀胱癌及乳癌的幾種動物模型中，COX-2抑制劑已被證實具有腫瘤抑制效果(Alane T.Koki,et al.,2002,Celecoxib：A Specific COX-2 Inhibitor With Anticancer Properties,Cancer Control,9(2 Suppl)：28-35)。
世界專利WO94/09811案揭示一種CD44用於治療發炎或檢測癌症轉移之用途，並顯示在發炎情況中，CD44被上調控(upregulated)，且CD44胜肽(peptides)能抑制T細胞活化；但未說明可以CD44抑制轉移，亦未說明CD44可用於抑制腫瘤生長或血管生成。世界專利WO99/45942案揭示玻尿酸-結合蛋白和多肽(包括CD44)用於抑制癌症及血管生成相關疾病之用途，該專利案使用軟骨連接蛋白(cartilage link protein)之轉移抑制素(metastatin)片段(3萬8道爾頓)，以及從該片段衍生之玻尿酸-結合肽(HA-binding peptide)以抑制B16小鼠黑色素瘤(melanoma)以及Lewis肺癌之肺轉移(pulmonary metastasis)。玻尿酸-結合肽可抑制B16黑色素瘤於雞CAM之生長以及抑制內皮細胞於玻尿酸之遷移。在上述兩篇文獻中，玻尿酸-結合肽之用途及結合肽與玻尿酸的結合能力具有直接的關係。
美國專利第8,192,744號揭示，可溶性重組 CD44玻尿酸結合區(soluble recombinant CD44 hyaluronic acid binding domain，CD44HABD)可抑制雞和老鼠體內之血管新生，從而可抑制各種原因之人類腫瘤生長；並揭示一種可溶性、非糖基化(non glycosylated)的CD44重組蛋白，以作為一種針對血管細胞表面受體之新的血管生成抑制劑。
因此，現有技術僅揭示了CD44的潛在用途並揭示依賴於HA-CD44相互作用所產生之任何影響。所以到目前為止，HA-CD44結合物之所有效用是直接依賴於它們本身與玻尿酸結合之能力。
然而，有些藥物仍無法成功與玻尿酸結合並進行進一步的試驗，亦無法確認玻尿酸作為活性化合物的位置傳遞載體之潛在用途。特別的是，現有技術並無顯示細胞表面受體CD44以及活性化合物結合玻尿酸之相互作用可被開發作為一個標的傳遞物，並用於有效治療並改善CD44過度表現之疾病。
對於癌症之病症而言，作為一個可用治療工具，必須兼顧對腫瘤細胞具有有效的細胞毒殺作用以及對正常細胞有更好的安全性之平衡。
本發明之目的在於提供一種新的化合物，其化合物係包括玻尿酸以及適用於位置傳遞之活性化合物，並可用於過度表現細胞表面受體CD44之疾病。故本發明提供一種糖胺聚醣與藥物鍵結形成之化合物，其中該藥物係用於治療與CD44過度表現呈現高相關之癌症。
本發明提供一種共軛化合物，其共軛化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物所組成，其中糖胺聚醣及其衍生物或其鹽類的羧基(carboxylic group)與活性化合物之一官能基形成共價鍵結(covalent conjugation)，且活性化合物係選自於來那度胺(Lenalidomide)、吉西他濱(Gemcitabine)及環加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)拮抗劑所組成之群組。
較佳的，所述之糖胺聚醣係玻尿酸。
更佳的，所述之玻尿酸之平均重量分子量係介於1萬道爾頓至200萬道爾頓。
較佳的，所述之共價鍵結是直接共價以形成醯胺鍵(amide bond)或酯鍵(ester bond)。
較佳的，所述之COX-2拮抗劑係尼美蘇來(Nimesulide)或希樂葆(Celecoxib)。
較佳的，所述之活性化合物係藉由一間隔物(spacer)與糖胺聚醣之羧基鍵結。
更佳的，所述之間隔物係選自由多肽(polypeptide)、胜肽(peptide)、脂質(lipid)、胺基酸(amino acid)以及含有直鏈或支鏈的脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)或芳脂族的C2-C20二羧酸(dicarboxylic acids)。
較佳的，所述之共軛化合物係用於治療癌症。
更佳的，所述之癌症係肝癌(liver cancer)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、膽管細胞癌(cholangiocarcinoma)、膽管囊腺癌(cholangiocellular cystadenocarcinoma)、結腸癌(colon cancer)、腺癌 (adenocarcinoma)、淋巴瘤和鱗狀細胞癌(lymphoma and squamous cell carcinoma)、乳癌(breast cancer)、乳房腺管癌(ductal carcinomas)、小葉癌(lobular carcinomas)、肺癌(lung cancer)、非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma)、小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、腎癌(renal cancer)、腎細胞癌(renal cell carcinoma)、泌尿上皮細胞癌(urothelial cell carcinoma)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndromes，MDS)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia)或胰腺癌(carcinoma of the pancreas)。
本發明更提供一種所述之共軛化合物用於製備治療癌症的醫藥品之用途，其中該共軛化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物經鍵結所組成，其中活性化合物之一官能基係與選自於由糖胺聚醣、糖胺聚醣衍生物以及糖胺聚醣鹽類所組成之群組的羧基(carboxylic group)形成共價鍵結(covalent conjugation)，且活性化合物係選自於Lenalidomide、吉西他濱(Gemcitabine)及COX-2拮抗劑所組成之群組。
普遍來說，藥物無論經口服或注射至循環系統必須直接到達其標的治療區域，由於基於安全性考量，藥物濃度及特異性於標的位置並沒那麼高，因此藥物對於目標疾病和正常器官的效果是非常類似的。
為了改善治療效果以及具有良好的安全性，一種策略是修飾藥物，並將藥物與載體共價鍵結後，使其對於疾病區域更具有標的選擇性(target-selective)，且抗腫瘤治療領域中認為以上事項須加以改善。
為了達成此目的，本發明係藉由玻尿酸及其受體CD44之相互作用以標的傳送活性物質。
本發明藉由維持相對高濃度的藥物於目標位置以及正常組織為器官以建立對於玻尿酸之長期研究及實驗。
其研究及實驗結果，由以下實施例簡要概括描述。
本發明結果顯示，相較於正常組織，具有不同平均分子量(average molecular weights)的玻尿酸於受傷組織具有較高的黏附指數，且低平均分子量玻尿酸比高平均分子量玻尿酸具有較佳黏附效果。如圖1所示，比較3種不同平均分子量的玻尿酸於黏附於受傷組織之效果，其中35萬道爾頓玻尿酸的螢光指數相較於其它兩種平均分子量的玻尿酸來的高(平均分子量為2百萬道爾頓之玻尿酸以及平均分子量為1百萬道爾頓之玻尿酸)。另外，1百萬道爾頓之玻尿酸無論在正常的或受傷的結腸組織的黏附效果(即螢光指數)皆高於2百萬道爾頓之玻尿酸，此結果證實了玻尿酸可以特異地(specifically)黏附在發炎部位，並促使本發明之發明人藉由玻尿酸黏附於組織之特性及其細胞表面受體CD44相互作用，以維持糖胺聚醣與其他化合物之鍵結。
因此，藉由玻尿酸與藥物結合以驗證玻尿酸是否可作為標的傳送載體以將藥物傳送至富含CD44之位置。如前所述，當CD44過度表現於發炎、感染或癌症時，由於玻尿酸的配體可附著受體CD44，因此相關的藥物可以很容易地到達並保持在目標位置且維持相對高濃度。基於玻尿酸於發炎部位之附著效果或富含CD44之位置，相對濃度較高之藥物可聚集於標的位置以及提升其治療效果，進而降低藥物使用量以具有較佳的安全性。
為了證實藥物或染料是否成功結合以及進一步驗證玻尿酸附著效果，本發明係將染料與玻尿酸結合後，分別作用於細胞株以及小鼠。圖2A和圖2B分別係HCT15細胞(具有較少CD44表現之結腸直腸腺癌細胞株)於不同時間點上的螢光圖；圖2C和圖2D分別係HT29細胞(具有較多CD44表現之結腸腺癌細胞株)於不同工作時間點上的螢光圖。並由HT29細胞(圖2C和圖2D)的結果顯示，玻尿酸-染料已成功鍵結並附著於HT29之較多CD44表現區域(圖2C)，甚至進入HT29細胞(圖2D)。這表示本發明所述之方法係有效的，也意味著藥物或染料可與玻尿酸鍵結以及玻尿酸具有與CD44結合之能力。
游離染料以及玻尿酸-染料之黏附試驗係藉由小鼠尾靜脈注射游離染料以及玻尿酸-染料並觀察4星期進行實驗。在游離染料之結果顯示，此兩種具有不同CD44表現的腫瘤細胞之黏附結果並無任何差異，其中HT29細胞的附著面積的比例為50.15%，而HCT15細胞是49.86%。然而，當玻尿酸-染料注射於小鼠尾靜脈中，較多CD44表 現之HT29細胞呈現出顯著玻尿酸-染料，但較少CD44表現之HCT15細胞呈現之結果相當有限，其中HT29細胞的附著面積的比例為74.15%，而HCT15細胞的附著面積的比例為25.85%。因此，結果證明，當染料與玻尿酸結合後，由於玻尿酸與富含CD44的位置相結合而使得染料濃度增加。
與CD44表現高度相關的疾病包括癌症、感染及發炎。在本發明之較佳的實施例中，所述之癌症包括結腸癌(colon carcinoma)、纖維肉瘤(fibrosarcoma)、乳癌(breast cancer)、腺癌(adenocarcinoma)及腦惡性膠質瘤(brain malignant glioma)。
依據本發明，用語“藥物”或“活性物質”係包含抗癌藥物(anti-cancer drug)，大部分的抗癌藥物可分為烷化劑(alkylating agents)、抗代謝物(anti-metabolites)，蒽環類(anthracyclines)、植物生物鹼(plant alkaloids)，拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)及其他抗癌藥物。
在較佳的實施例中，抗癌藥物包括，但不限於Lenalidomide、Gemcitabine、Celecoxib及Nimesulide。
Nimesulide是一種廣泛使用之選擇性COX-2拮抗劑(selective COX-2 antagonist)，且相較於其他NSAID，Nimesulide具有優越的腸胃道安全性。最近的研究中，Nimesulide作為一種藉由誘導p21基因(腫瘤抑制基因，tumor suppressor gene)表現之抗癌藥物，並藉由抑制哺乳動物雷帕黴素標的蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)相關路徑，其中該路徑對於癌細胞之生 長、癌細胞增殖、癌細胞運動(cell motility)、癌細胞存活以及蛋白質合成是必要的(Zhang YJ.,et al.,2011,mTOR signaling is involved in indomethacin and nimesulide suppression of colorectal cancer cell growth via a COX-2 independent pathway.Ann Surg Oncol.,18(2)：580-8)。
Lenalidomide係一種4-氨基-麩胺醯類似物(4-amino-glutamyl analogue)，其係藉由修飾沙利竇邁(thalidomide)的化學結構以提高其效力，並減少其致畸性以及神經系統的副作用(V.Kotla,et al.,2009,Mechanism of action of lenalidomide in hematological malignancies,Journal of Hematology and Oncology,2：36)。並於麻風結節性紅斑(erythema nodosum leprosum，ENL)以及自體免疫疾病(autoimmune disorders)之免疫調節活性，Lenalidomide已被證實具有抗血管生成、抗腫瘤發生以及免疫調節活性(immunomodulating activity)(J.Sheskin,1980,The treatment of lepra reaction in lepromatous leprosy,International Journal of Dermatology,6：318-322)(E.Atra and E.I.Sato,1993,Treatment of the cutaneous lesions of systemic lupus erythematosus with thalidomide.Clinical and Experimental Rheumatology,11(5)：487-93)。Lenalidomide亦被發現具有抗血管生成特性，並為具有可對抗各種血液及固體腫瘤疾病之活性藥物，其中所述之固體腫瘤疾病例如脊髓發育不良(myelodysplasia)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)、原發性全身性類澱粉變性(primary systemic amyloidosis)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、骨髓纖維化伴隨骨髓轉變(myelofibrosis with myeloid metaplasia)以及瓦爾登斯特巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)(Venumadhav Kotla,et al.,2009,Mechanism of action of lenalidomide in hematological malignancies,Journal of Hematology & Oncology,2：36)。藉由不同惡性血液(hematologic malignancies)疾病之各種機制的臨床證據顯示，Lenalidomide對於各種惡性疾病之治療潛力與許多體外(in vitro)及動物模型中的藥效學是一致的。Lenalidomide可上調控(upregulate)的腫瘤抑制基因p21基因，並誘導癌細胞的凋亡(apoptosis)(Verhelle D.,et al.,2007,Lenalidomide and CC-4047 inhibit theproliferation of malignant B cells while expanding normal CD34+ progenitor cells.Cancer Res.,67(2)：746-55)。Lenalidomide也顯示在多發性骨髓瘤中，顯著減少血管生成因子VEGF和白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)之表現，進而減少血管生成，並提升多發性骨髓瘤之臨床治療(Gupta D.,et al.,2001,Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion：therapeutic applications.Leukemia,15(12)：1950-61)。
如前述，本發明之目的是將玻尿酸與藥物結合或鍵結、連接物(linker)或間隔物(spacer)之有無，並藉由玻尿酸之羧基、羥基或氨基以於特定時間及位置達成所欲之效果。因此，玻尿酸用於作為標的運輸載體以攜帶藥物至 富含CD44之特定部位，其具有較佳的治療效果和安全性。
依據本發明，“連接物”或“間隔物”係指連接化合物兩端之有機部分。連接物通常包括一直鏈或一原子例如氧或硫、一個單元例如雙硫(SS)、胺(NH)、一氧化碳[C(O)]、醯胺[C(O)NH]、一氧化硫(SO)、二氧化硫(SO2)、磺胺(SO2NH)或鏈原子例如取代(substituted)或未取代的烷基(unsubstituted alkyl group)、一個或多個亞甲基(methylenes)可由氧(O)、硫(S)、一氧化硫(SO)二氧化硫(SO2)、胺(NH)、胺(NH2)或一氧化碳[C(O)]中斷或終止。術本發明所述之連接物或間隔物可以不存在，亦可於藥物與HA之間提供任何化學化合物，或以化學性、酶或自發地分解，其也包含至少一種用於連接藥物之氨基(amino group)、硫醇基(thiol group)、更多羧基(carboxy groups)等。連接物或間隔物可以是多肽(polypeptide)、胜肽(peptide)或脂質。較佳的，所述之連接物或間隔物係含有直鏈或支鏈的脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)或芳脂族(araliphatic)的C2-C20二羧酸(dicarboxylic acids)或胺基酸。
連接物於本發明之作用在於建構玻尿酸與所述藥物之間的橋臂(arm)或間隔。當連接物介於玻尿酸與所述藥物之間時，與玻尿酸鍵結之一側係藉由醯胺(amide)、羧基(carboxyl group)、羥基(hydroxyl group)或胺基(amino group)與玻尿酸鍵結，與所述藥物鍵結之一側則係以任何可能的共價鍵結。
當連接物或間隔物是二羧酸(dicarboxylic acid)時，該羧酸基團與藥物形成的酯鍵(ester bond)可能是玻尿 酸的羥基基團。當連接物或間隔物是二醯肼(dihydrazide)時，胺基可能會與玻尿酸的游離羧基形成醯胺鍵(amide bond)。較佳的，所述之的連接物或間隔物係具有琥珀酸之藥物(succinic acid to drug)，具有己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)之玻尿酸。
在較佳的實施例中，本發明更提供一種共軛化合物，其共軛化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物所組成，其中活性化合物之一官能基與糖胺聚醣及其衍生物或其鹽類的羧基(carboxylic group)形成共價鍵結(covalent conjugation)，且活性化合物係選自於來那度胺(Lenalidomide)、吉西他濱(Gemcitabine)及環加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)拮抗劑所組成之群組。
其中活性化合物Lenalidomide、Gemcitabine或COX-2拮抗劑Nimesulide或Celecoxib係藉由-NH2基團與玻尿酸之羧基直接接合。
在另一較佳的實施例中，無論是直接或是藉由連接物之間接鍵結，玻尿酸之羧基與活性物質可形成醯胺鍵或酯鍵。
在間接鍵結中，連接物係選自由多肽、胜肽、脂質、胺基酸以及含有直鏈或支鏈的脂肪族、芳香族或芳脂族的C2-C20二羧酸。
在另一較佳的實施例中，玻尿酸之平均重量分子量係介於1萬道爾頓至200萬道爾頓，且玻尿酸具有至少40%的羧基參與反應。
本發明所述之共軛化合物較佳係用於治療癌 症，其包括肝癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、膽管囊腺癌、結腸癌、腺癌、淋巴瘤和鱗狀細胞癌、乳癌、乳房腺管癌、小葉癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病或胰腺癌。
因此，本發明提供了抗癌藥物，其包括玻尿酸與Lenalidomide，玻尿酸與Gemcitabine，玻尿酸與Nimesulide和玻尿酸與Celecoxib，其中Lenalidomide是藉由-NH2基團與玻尿酸之-COOH基團形成醯胺鍵；Nimesulide之-NO2基團被修飾為-NH2基團，使得Nimesulide可與玻尿酸之-COOH基團形成醯胺鍵並形成HA-Nimesulide共軛物。HA-Lenalidomide共軛物之結構如圖3所示，Nimesulide(NiNO2)之結構以及氫化產物NiNH2的結構如圖5A所示，HA-NiNH2共軛物之結構如於圖5B。HA-Celecoxib共軛物之結構如圖8所示；HA-Gemcitabine共軛物之結構如圖10所示。
本發明之結果顯示，對於富含CD44的細胞(HT29細胞)而言，HA-Lenalidomide共軛物相較單獨施予Lenalidomide或玻尿酸確實具有顯著的細胞毒性作用(圖4A)；然而，對於HCT15細胞，協同效應卻沒那麼明顯(圖4B)。本發明的結果顯示，在給予HA-Lenalidomide共軛物之條件下，含有較少CD44之HCT15細胞相較於含有較多CD44之HT29細胞具有較高細胞存活率，表示含有較多CD44之HT29細胞對於HA-Lenalidomide較為敏感。然而， Lenalidomide對於以上兩種細胞之細胞存活影響幾乎是相同。因此，顯示Lenalidomide並不與CD44有相互反應，且當玻尿酸與Lenalidomide結合時確實可於相同劑量下產生較佳治療效果。
在另一較佳實施例中，本發明之結果顯示，無論是在HT29細胞或HCT15細胞中，具有硝基(-NO2)之Nimesulide的細胞毒性作用優於氫化修飾所得之具有胺基(-NH2)，特別是在較高劑量(圖6A)。然而，當NiNH2與玻尿酸結合後，HA-NiNH2的細胞毒性比單獨施予NiNH2或NiNO2(圖6B)來得顯著。此結果如同前述HA-Lenalidomide共軛物實驗結果，抗癌藥物可藉由與玻尿酸結合以增強細胞毒性作用。
此外，在動物試驗的實施例中，本發明的結果顯示，HA-NiNH2組的腫瘤抑制效果比NiNO2組或對照組來得有效(圖7B)，此三組於24日內之平均體重幾乎相同(圖7A)，表示藥物對於體重並沒有顯著不利的影響(例如體重減輕)；然而，每一組的腫瘤體積卻顯著不同，其中HA-NiNH2組相較於NiNO2組或對照組具有較佳的腫瘤抑制效果(圖7B)。此結果顯示，本發明所述之HA-NiNH2的共軛物比單獨施予NiNO2具有優越的治療效果。
在另一較佳實施例中，本發明之結果顯示，對於HT29細胞及GBM8401細胞而言，HA-Celecoxib的細胞毒性作用比單獨施予玻尿酸和Celecoxib具有較佳的效果(圖9A及圖9B)。結果顯示，HA-Celecoxib可增加對於A549細胞的細胞毒性作用(圖11)及對於GBM8401細胞的細胞毒 性作用(圖12)。
綜上所述，Lenalidomide及Nimesulide分別與玻尿酸結合後，比單獨施予與Lenalidomide及Nimesulide顯著改善抗腫瘤療效果以及細胞毒性作用。結果顯示，本發明可提高抗癌藥物Lenalidomide及Nimesulide的治療效果，進而產生巨大貢獻。
依據本發明，為了用於治療所述癌症，本發明所述之較佳藥物劑型包括以一賦形劑配製可用於眼、耳、口、鼻、呼吸道、胃腸道、循環系統或局部使用的劑型。較佳的，所述之口服藥物劑型係選自於由固體劑型、溶液、片劑及膠囊所組成之群組，其中溶液包括，但不限於懸浮液；其中片劑，包括但不限於控釋片劑(controlled-release tablet)；其中膠囊，包括但不限於腸溶塗膠囊(enteric-coated capsule)。更佳的，所述之胃腸道給藥形式係選自於由固體劑型、灌注(perfusion)、灌腸劑(enema)、栓劑(suppository)以及溶液所組成之群組，其中溶液包括，但不限於懸浮液。更佳的，所述之循環系統或全身給藥形式係選自於由靜脈注射(introvenous，IV)、肌肉注射(intra-muscle，IM)和皮下注射(subcutaneous，SC)所組成的群組。更佳的，所述之局部給藥形式係選自於由灌注、灌腸劑、栓劑、噴霧劑、吸入劑及滴劑所組成的群組。
本發明另提供一種製備共軛化合物之方法，其包括以下步驟：齊備一含有N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-(3-dimethylamino propyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride，EDC HCl)、N-羥基琥珀酰亞 胺(N-hydroxysuccinimide)以及糖胺聚醣之水溶液；齊備一含有Lenalidomide、Gemcitabine或COX-2拮抗劑之有機溶劑；將該水溶液與該有機溶劑於室溫下混合並攪拌至少10小時，以獲得一混合液；透析該混合液，以獲得該共軛化合物。
圖1係將螢光玻尿酸施予正常結腸組織及受傷結腸組織所觀察到之螢光指數柱狀圖(*p<0.05)，其中螢光指數=結腸組織以玻尿酸處理/正常結腸組織以磷酸鹽緩衝溶液處理；圖2為玻尿酸(HA)-染料化合物與不同時間點分別作用於HCT15細胞及HT29細胞之螢光圖，其中圖2A為HCT15細胞於6小時之細胞螢光圖、圖2B為HCT15細胞於12小時之細胞螢光圖、圖2C為HT29細胞於6小時之細胞螢光圖、圖2D為HT29細胞於12小時之細胞螢光圖；圖3為HA-Lenalidomide共軛物之結構圖。
圖4A為游離Lenalidomide、HA以及HA-Lenalidomide共軛物作用於HT29細胞之細胞存活率折線圖；圖4B為游離Lenalidomide、HA以及HA-Lenalidomide共軛物作用於HCT15細胞之細胞存活率折線圖；圖5A為Nimesulide(NiNO2，含有NO2基)以及更氫化修飾之產物NiNH2(含有NH2基)之結構圖；圖5B為HA-NiNH2共軛物之結構圖；圖6A為NiNO2及NiNH2分別作用於HT29細胞及 HCT15細胞之細胞存活率折線圖；圖6B為NiNO2、NiNH2、HA以及HA-NiNH2共軛物分別作用於HT29細胞之細胞存活率折線圖；圖7A為各組(對照組、NiNO2組以及HA-NiNH2組)之小鼠於24天內之體重變化圖；圖7B為各組(對照組、NiNO2組以及HA-NiNH2組)之小鼠於24天內之腫瘤體積變化圖；圖8為HA-Celecoxib之合成步驟以及結構圖；圖9A為Celecoxib、HA以及HA-Celecoxib共軛物作用於HT29細胞之細胞存活率折線圖；圖9B為Celecoxib、HA以及HA-Celecoxib共軛物作用於GBM401細胞之細胞存活率折線圖；圖10為HA-Gemcitabine共軛物之合成步驟以及結構圖；圖11為HA-Gemcitabine共軛物作用於A549細胞之細胞存活率折線圖；以及，圖12為HA-Gemcitabine共軛物作用於GBM401細胞之細胞存活率折線圖。
本發明將進一步藉由下面的實施例來做說明，但應明瞭的是，該等實施例僅為說明之用，而不應被視為本發明的實施上的限制。
實施例1 玻尿酸在結腸組織的黏附力(透過第三版IVIS圖像系統)
步驟：
1.將0.25克高重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為HHA，高重量平均分子量，分子量：2百萬道爾頓，購自Freda)及0.25克低重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為LHA，低重量平均分子量，分子量：35萬道爾頓，購自Freda)分別加入50毫升(mL)磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中，以形成濃度為0.5%的溶液，接著攪拌6小時直到粉末完全溶解。0.25克中重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為MHA，中重量平均分子量，分子量：1百萬道爾頓，購自Freda)加入50毫升(mL)磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中，接著攪拌6小時直到粉末完全溶解
2.螢光玻尿酸(fluorescent HA,HA-f)係由下列方式製備：(1)將0.39克MES游離酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，購自Calbiochem]溶解於100毫升二次水中；(2)A溶液：將65毫克(mg)的螢光胺粉末(fluoresceinamine powder)(異構物I，購自Fluka)溶於9mg之95%酒精溶液中，然後在避光下攪拌10分鐘；(3)B溶液：將359mg EDC粉末[N-(3-Dimethylamino propyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride，購自Sigma]溶於步驟1之9mL MES緩衝液，然後攪拌10分鐘；(4)C溶液：216mg NHS粉末(N-Hydroxysuccinimde，購自Sigma)溶於9mL MES緩衝液，然後攪拌10分鐘；(5)將3mL A溶液緩慢地滴入50mL 0.5%的玻尿酸溶液，然後在避光下攪拌10分鐘；(6)將3mL B溶液及5mL C溶液分別滴入步驟(5)之溶液，然後在避光下攪拌10分鐘；(7)將0.02M MES緩衝液緩慢地滴入步驟(6)的溶液直到體積達到100毫升，然後在室溫並避光下攪拌24小時；(8)將反應後的產物倒入透析管中(分子量：12000至14000)，以5公升(L)的二次水作為透析液，然後在4℃並避光下攪拌5天，期間每12小時換一次透析液，直到透析液中沒有螢光為止；(9)透析後的液體以50mL塑膠離心管分裝，接著保存在-20℃冰箱過夜，之後在避光下以冷凍乾燥機乾燥；(10)乾燥的螢光玻尿酸粉末保存在-20℃冰箱；(11)將50mg螢光玻尿酸粉末緩慢地加入10mL磷酸鹽緩衝液中，然後攪拌6小時，直到粉末完全溶解。
3.將7周至8周大的SD大鼠(Sprague-Dawley)的結腸組織切下後，以磷酸鹽緩衝液沖洗，再切成3公分至4公分，最後浸泡在磷酸鹽緩衝液中。
4.以牙刷縱向刷結腸組織20次以製備受傷的結腸組織，並將受傷的結腸組織浸泡在磷酸鹽緩衝液中。
5.將正常與受傷的結腸組織放入12孔培養盤中，每孔分別加入1mL之0.5%螢光玻尿酸溶液，然後在室溫下搖晃2小時。過多的螢光玻尿酸溶液在2小時後以微吸管吸除，再浸泡至磷酸鹽緩衝液10分鐘後，移除磷酸鹽緩衝液。重複上述步驟三次。
6.將乾淨的結腸組織之襯裡組織(lining tissue)朝上放置在12孔培養盤中，然後放在活體分子影像系統(in vivo image system，IVIS，購於XENOGEN公司)的平台(dock)上。出廠參數是設定為螢光綠蛋白(green fluorescent protein,GFP)，激發(excitation)波長設定為465奈米(nm)， 而發射(emission)波長設定為500nm，影像再由軟體捕捉。
7.所有顯示的數值係指觀察的平均數。組織學指數(histological index)是利用學生t檢定(Student’s t-test)分析。
結果：圖1顯示螢光指數的定量及排列結果。正常結腸組織的螢光指數定義為1。其他結腸組織再依據定義的數值作校準。結果顯示相同重量平均分子量的玻尿酸，黏附在受傷的結腸組織明顯比在正常結腸組織多(P<0.01)。比較三種不同重量平均分子量玻尿酸黏附在受傷結腸組織的結果後，被吸收的35萬道爾頓玻尿酸之螢光指數明顯高過其他二種玻尿酸(2百萬與1百萬道爾頓)。此外，不論在正常結腸組織或受傷結腸組織中，被吸收的1百萬道爾頓玻尿酸之螢光指數高過2百萬道爾頓玻尿酸。
實施例2 玻尿酸-染料(HA-dye)結合作用過程以及玻尿酸-染料於活體外(in vitro)影像
HA-dye結合作用之整個過程必須避光條件下進行。
1.合成玻尿酸(HA)-己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)包括以下步驟：
(1)重量平均分子量為34萬道爾頓、50mg玻尿酸加入水中，以形成濃度為每毫升4毫克(mg/mL)的溶液。
(2)將超過5倍之114.8mg的ADH加入前述玻尿酸溶液中。
(3)加入0.1N的氫氯酸(hydrochloric acid，HCl) 將酸鹼值(pH值)調整至4.75。
(4)接著，將1當量(25.1mg)之EDC加入前述步驟3之溶液中，並以0.1N的HCl將pH值維持在4.75。
(5)經過15分鐘後，加入0.1N氫氧化鈉(sodium hydroxide，NaOH)以停止反應並將pH值調整為7.0，以獲得一混合物。
(6)將該混合物倒入透析管中(分子量：3500)，以100毫莫耳(mM)的氯化鈉(sodium chloride，NaCl)徹底透析，再以25%乙醇(EtOH)循環4次，最後一次再以水循環。將透析後的溶液以0.2微米(μm)乙酸織維素膜過濾，再快速冷凍並冷凍乾燥。
(7)ADH的取代度(substitution degree)由氫核磁共振光譜圖(1 H nuclear magnetic resonance，1 H NMR)測量。
2.合成HA-ADH-螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FITC)包括以下步驟：
(1)將88mg、DS=36%之HA-ADH溶解於35mL水中。
(2)將9.5mg FITC溶解於10mL二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)。
(3)將步驟1之HA-ADH溶液與步驟2之FITC溶液混合。
(4)於室溫歷經48小時後，將步驟3之混合溶液以0.3莫耳(M)氯化鈉以及純水以及截留分子量(molecular weight cut-off，MWCO)為12000至14000之透 析袋交替透析3天。
(5)將步驟4之透析液冷凍乾燥2天
(6)FITC之取代度由用紫外光譜測定。
3.HA-dye於活體外(in vitro)影像
(1)將1×105人類大腸癌細胞株HT29細胞以及HCT15細胞[CD44陽性細胞，CD44 positive cell)]培養於3.5公分細胞培養盤。
(2)將前述1μM of HA-dye(HA為34萬道爾頓)分別於指定時間加入細胞培養盤。
(3)歷經培養後，以PBS清洗細胞並以3.7%甲醛(formaldehyde)固定細胞。
(4)以共軛焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察HA-dye與細胞之表現。
結果顯示：HCT15細胞(圖2A和圖2B)以及HT29細胞(圖2C和圖2D)之附著部位以及染料的量。結果顯示染料已成功與玻尿酸結合，且玻尿酸加強於HT29細胞之富含CD44位置之HA-dye濃度，且HT29細胞因較HCT15細胞具有較多之CD44而具有較強的螢光。亦證明了HA-dye可以進入細胞(圖2D)。HA-dye施予HT29細胞(含較多CD44)6小時後以及12小時後，分別產生積聚(accumulation)以及內化(internalization)現象。但在HCT15細胞(含較少CD44)中於HA-dye施予6小時或12小時後並沒有觀察到此現象。
實施例3 細胞株以及異種移植腫瘤模型(xenograft tumor model)
1.細胞培養條件以及繼代
(1)細胞培養條件：
HT29細胞：高糖杜氏改良英格爾(high goucose Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、1%丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、1%青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)與新黴素(neomycin)。
HCT15細胞：DMEM-F12培養液、10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(2)繼代步驟：
(I)移除並去除培養液。
(Ⅱ)簡單以PBS沖洗細胞層以去除血清中胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor)。
(Ⅲ)添加1mL、0.25%的trypsin-EDTA溶液至細胞培養盤中，並顯微鏡下觀察細胞直至細胞層被分散(通常約5至15分鐘)。然後，輕輕吸放細胞並加入9mL完全生長培養液(complete growth medium)。
(Ⅳ)將適當細胞懸液加到新的培養盤中(繼代比例為1：3至1：8)。
2.異種移植腫瘤模型(xenograft tumor model)
(1)將2×107個細胞/小鼠之HT29及HCT15細胞分別以皮下注射(subcutaneously injection)至8週齡雄性裸鼠(nude mice)之右及左髖關節(right and left hips)(右上側和左側後肢)。
(2)當異種移植腫瘤為400毫米立方(mm3)至 500mm3(約3週至4週後)可進行活體分子影像系統(in vivo imaging system，IVIS)。
3.活體分子影像系統
(1)小鼠以異氟醚(isoflurane)麻醉後，將異種移植裸鼠的圖像以參數f/stop：8作為對照組，曝光時間為3秒，激發波長為633nm或635nm，發射波長為695至770nm，使用儀器為Xenogen IVIS200。
(2)分別於小鼠之尾靜脈(tail vein)注入200μl、12.5μM自由染料(free-dye)或200μl的HA-dye溶液[其含有0.1μM HA-dye以及0.1mg玻尿酸(玻尿酸為112百萬道爾頓)]。
(3)以5分鐘、10分鐘、30分鐘、1小時、2小時之指定時間進行IVIS圖像檢測，並於注射兩小時後，犧牲小鼠並解剖分析其內臟之螢光分佈。
結果顯示：游離染料幾乎均勻地分佈於HT29細胞以及HCT15細胞(未顯示圖式)。游離染料於HT29細胞之附著面積比例為50.15%，HCT15細胞之附著面積比例為49.86%。此外，由於HT29細胞有較多的CD44而相較HCT15細胞能吸附較多的HA-dye，故HT29細胞之附著面積的比例為74.15%，而HCT15細胞之附著面積的比例為25.85%。此結果證明，玻尿酸可促進染料累積於富含CD44的位置。
實施例4 合成玻尿酸-來那度胺(Lenalidomide)共軛物
合成HA-Lenalidomide共軛物之步驟如以下所 示：
(1)將50mg玻尿酸(分子量為1萬道爾頓至70萬道爾頓)溶解於25mL的DD水。
(2)將25.1mg EDC與15.1mg NHS混合於2mL DD水中並於室溫下攪拌5分鐘。
(3)加入1.31mL NaOH以中和步驟1所得之玻尿酸溶液。
(4)將3.4mg Lenalidomide溶解在2mL DMSO溶液。
(5)將步驟2、3及4之溶液混合以形成一混合物，並將混合物於室溫下攪拌12小時。
(6)將步驟5已攪拌之混合物以透析袋(MWCO為3500)以及過量的DD水透析2天至3天。
結果顯示：圖3顯示HA-Lenalidomide共軛物結構。
實施例5 Lenalidomide於活體外(In vitro)之細胞毒性(cytotoxicity)
步驟如以下所示：
(1)HT29細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有高葡萄糖DMEM、10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(2)HCT15細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有DMEM/F12，10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(3)上述各細胞株歷經1天(24小時)接種後，再 將細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中24小時：Lenalidomide之濃度分別為：400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM；玻尿酸之濃度分別為：4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL，0.5mg/mL、0.25mg/mL，0.0625mg/mL、0.3125mg/mL以及0mg/mL；HA-Lenalidomide共軛物之濃度分別為：400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和0μM。
(4)以上藥物係以黃色染料3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽{3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT}作為對於細胞存活影響之評估；並以紫色甲臢(formazan)結晶評估粒線體(mitochondria)中脫氫酶(dehydrogenase)之活性。
(5)以上各細胞株經上述各濃度之藥物處理24小時後，除去培養液並清洗細胞，再將稀釋之MTT(0.5mg/mL)加入細胞盤孔中並於37℃培養箱(5% CO2)歷經4小時。
(6)然後將100μL/孔的DMSO加入各細胞盤孔，並將各細胞盤孔適當均質後以酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)儀器於570nm測量。
(7)活細胞之比值係藉由經處理之細胞平均光 密度值除以未處理之細胞的平均光密度值所獲得。
結果顯示：對於具有較豐富CD44的HT29細胞，HA-Lenalidomide共軛物比單獨施予玻尿酸或Lenalidomide更能殺死細胞(圖4A)，且HCT15細胞也可觀察到類似之趨勢(圖4B)。
實施例6 合成HA-NiNH 2 共軛物
1.尼美蘇來(Nimesulide，NiNO2)之氫化(hydrogenation)步驟如下：
(1)將500mg NiNO2完全溶解於20mL乙酸乙酯(ethyl acetate)中，然後加入200mg 5%的Pd/C(鈀/碳)作為催化劑加入該溶液中。從瓶中抽取空氣並持續攪拌，且以氫氣取代並於1大氣壓下繼續攪拌24小時。
(2)以薄層色譜法(thin layer chromatography)(TLC矽膠板60 F254)於波長為254nm、移動相為己烷(hexane)：乙酸乙酯=2：1進行氫化產物之純度鑑定。
(3)過濾以移除Pd/C，並以旋轉蒸發器除去殘留溶劑。
(4)將氫化產物溶於己烷：乙酸乙酯=1：1之溶液中並進行純化。
(5)藉由矽膠柱並以己烷：乙酸乙酯=1：1作為洗脫溶液以純化氫化產物。
(6)收集有顏色之分層(fraction)並藉由UV和NMR分別測定氫化產物氨鎳(NiNH2)之結構、濃度以及產率。
(7)藉由冷凍乾燥步驟6之NiNH2以獲得NiNH2粉末。
2.合成HA-NiNH2共軛物之步驟如下：
(1)將50mg玻尿酸(分子量為1萬道爾頓至70萬道爾頓)溶解於25mL的DD水。
(2)將25.1mg EDC與15.1mg NHS混合於2mL DD水中並於室溫下攪拌5分鐘。
(3)將3.65mg NiNO2溶解於2mL DMSO中並以注射器將NiNO2溶液於3分鐘內緩慢滴入步驟1、步驟2之混合溶液中，以形成一混合物。
(4)將該混合物於黑暗中以及室溫下攪拌12小時。
(5)將已避光攪拌的混合物以過量的DD水及透析袋(MWCO為3500)透析2天至3天。
(6)將步驟5之溶液以冷凍乾燥以獲得HA-NiNH2粉末。
結果顯示：圖5A顯示Nimesulide(NiNO2)之結構以及產生NiNH2的過程。圖5B顯示HA-NiNH2共軛物之結構。
實施例7 Nimesulide於活體外(In vitro)之細胞 毒性
步驟如以下所示：
(1)HT29細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有高葡萄糖DMEM、10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(2)HCT15細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有DMEM/F12，10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(3)上述各細胞株歷經1天(24小時)接種後，再將細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中24小時：NiNO2(Nimesulide含有NO2基)之濃度分別為：200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM；NiNH2(Nimesulide含有NH2基)之濃度分別為：200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM；玻尿酸之濃度分別為：4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL、0.3125mg/mL以及0mg/mL
HA-Lenalidomide共軛物之濃度分別為：400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和0μM。
(4)以上藥物係以黃色染料MTT作為對於細胞存活影響之評估；並以紫色甲臢結晶評估粒線體中脫氫酶之活性。
(5)以上各細胞株經上述各濃度之藥物處理24小時後，除去培養液並清洗細胞，再將稀釋之MTT(0.5mg/mL)加入細胞盤孔中並於37℃培養箱(5% CO2)歷經4小時。
(6)然後將100μL/孔的DMSO加入各細胞盤孔 中，並將各細胞盤孔適當均質後以ELISA儀器於570nm測量。
(7)活細胞之比值係藉由經處理之細胞平均光密度值除以未處理之細胞的平均光密度值所獲得。
結果顯示：無論對於HT29細胞以及HCT15細胞而言，NiNO2(Nimesulide含有NO2基)的細胞毒性作用優於經修飾之NiNH2(Nimesulide含有NH2基)的細胞毒性作用(圖6A)。此外，當Nimesulide與玻尿酸結合後，HA-NiNH2共軛物之細胞毒性顯著優於單獨施予NiNH2或NiNO2(圖6B)。
實施例8於異種移植裸鼠模型抑制腫瘤生長
其步驟如下：
(1)將2×107個之HT29細胞以皮下注射(subcutaneously injection)至8週齡雌性BALB/c無胸腺(nu+/nu+)小鼠右臀部(右腿上側)。
(2)當異種移植腫瘤約100mm3設定為腫瘤生長抑制實驗之第0天。
(3)每3天或5天測量腫瘤大小及小鼠體重。
(4)腫瘤體積之計算：1/2(4π/3)(L/2)(W/2)H；其中L是腫瘤的長度，W為腫瘤的寬度，H是腫瘤的高度。
(5)將小鼠分成不同的組別，可分為PBS對照組、Nimesulide組(NiNO2組)或HA-Nimesulide共軛物組(HA-NiNH2組)。
(6)由小鼠之尾靜脈分別注射劑量為1.5毫克/公斤(mg/kg)的Nimesulide、相當於1.5mg/kg HA-Nimesulide共軛物或PBS，並以48小時或72小時間隔投藥。
(7)記錄各組每隻小鼠腫瘤大小以及體重變化。
結果顯示：各組每隻小鼠的平均體重幾乎是相同的(圖7A)；然而，比較對照組、NiNO2組和HA-NiNH2組之腫瘤體積可發現，HA-NiNH2組相較於NiNO2組及對照組具有較佳的腫瘤抑制效果(圖7B)。因此，本發明所述之HA-NiNH2共軛物，比單獨施予NiNO2具有較佳之治療效果。
實施例9 合成玻尿酸-希樂葆(Celecoxib)共軛物
合成HA-Celecoxib共軛物之步驟如以下所示：
(1)將100mg玻尿酸(分子量為1萬道爾頓至70萬道爾頓)溶解於25mL的DD水。
(2)0.8當量之四丁基氫氧化銨(Tetrabutylammonium hydroxide TBA-OH)加入到步驟1之玻尿酸溶液中並攪拌16小時。
(3)乾燥步驟2之混合溶液以獲得HA-TBA白色固體。
(4)將40mg HA-TBA固體溶解於1mL DD水中，並將30mg EDC以及18mg NHS粉末加入到該溶液中，並於室溫下攪拌5分鐘，以形成一混合液。
(5)將4mg Celecoxib溶解於2mL DMSO溶液中。
(6)該混合液與步驟5之Celecoxib溶液混合並 於室溫下攪拌72小時以形成一混合物。
(7)將混合物以透析袋(MWCO為1200至1400)以DMSO：DD水=2：1透析1天，期間並替換該溶液3次。
(8)將步驟7之透析物再以透析袋(MWCO：1200至1400)以0.3M NaCl透析2天並每天替換2次溶液。
(9)將步驟8之已透析HA-Celecoxib共軛物溶液經冷凍乾燥後以獲得的HA-Celecoxib共軛物粉末。
結果顯示：圖8顯示HA-Celecoxib共軛物之合成方法及HA-Celecoxib共軛物之結構。
實施例10 Celecoxib於活體外(In vitro)之細胞毒性
步驟如以下所示：
(1)HT29細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有高葡萄糖DMEM、10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(2)GBM8401細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有DMEM，10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(3)上述各細胞株歷經1天(24小時)接種後，再將細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中24小時：HA-Celecoxib共軛物之濃度分別為：100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM；(4)以上藥物係以黃色染料MTT作為對於細胞存活影響之評估；並以紫色甲臢結晶評估粒線體中脫氫酶 之活性。
(5)以上各細胞株經上述各濃度之藥物處理24小時後，除去培養液並清洗細胞，再將稀釋之MTT(0.5mg/mL)加入細胞盤孔中並於37℃培養箱(5% CO2)歷經4小時。
(6)然後將100μL/孔的DMSO加入各細胞盤孔中，並將各細胞盤孔適當均質後以ELISA儀器於570nm測量。
(7)活細胞之比值係藉由經處理之細胞平均光密度值除以未處理之細胞的平均光密度值所獲得。
結果顯示：無論對於HT29細胞以及GBM8401細胞，HA-Celecoxib共軛物之細胞毒性顯著優於單獨施予Celecoxib或玻尿酸(圖9A及圖9B)。
實施例11 合成玻尿酸-吉西他濱(Gemcitabine)共軛物
合成HA-Gemcitabine共軛物之步驟如以下所示：
(1)將50mg玻尿酸(分子量為1萬道爾頓至70萬道爾頓)溶解於25mL的DD水。
(2)將25.1mg EDC與15.1mg NHS混合於2mL DD水中並於室溫下攪拌5分鐘。
(3)加入1.44mL NaOH以中和步驟1所得之玻尿酸溶液。
(4)將3.9mg Gemcitabine溶解在1mL DD水以及1mL DMSO溶液中以形成一Gemcitabine溶液，並以注 射器將Gemcitabine溶液於3分鐘內緩慢滴入步驟1、步驟2之混合溶液中，以形成一混合物。
(4)將該混合物於黑暗中以及室溫下攪拌12小時。
(5)將已避光攪拌的混合物以過量的DD水及透析袋(MWCO為12000至14000)透析2天至3天。
(6)將步驟5之溶液以冷凍乾燥以獲得HA-Gemcitabine粉末。
結果顯示：圖10顯示HA-Gemcitabine共軛物之合成過程以及HA-Gemcitabine共軛物之結構。
實施例12 玻尿酸-Gemcitabine共軛物於活體外(In vitro)之細胞毒性
步驟如以下所示：
(1)A549細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有高葡萄糖DMEM、10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(2)GBM8401細胞以低密度每孔1×104細胞接種於96孔盤中，其細胞培養液包含有DMEM，10% FBS、1%丙酮酸鈉、1%青黴素、鏈黴素與新黴素。
(3)上述各細胞株歷經1天(24小時)接種後，再將細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中24小時：HA-Gemcitabine共軛物之濃度分別為：400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM；HA-Celecoxib共軛物之濃度分別為：400μM、 200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM以及0μM
(4)以上藥物係以黃色染料MTT作為對於細胞存活影響之評估；並以紫色甲臢結晶評估粒線體中脫氫酶之活性。
(5)以上各細胞株經上述各濃度之藥物處理24小時後，除去培養液並清洗細胞，再將稀釋之MTT(0.5mg/mL)加入細胞盤孔中並於37℃培養箱(5% CO2)歷經4小時。
(6)然後將100μL/孔的DMSO加入各細胞盤孔中，並將各細胞盤孔適當均質後以ELISA儀器於570nm測量。
(7)活細胞之比值係藉由經處理之細胞平均光密度值除以未處理之細胞的平均光密度值所獲得。
結果顯示：HA-Gemcitabine共軛物分別對於A549細胞(圖11)以及GBM8401細胞皆具有提升之細胞毒性(圖12)。

Claims (16)

  1. 一種共軛化合物，其係由一糖胺聚醣以及一活性化合物所組成，其中活性化合物之一官能基係與選自於由糖胺聚醣、糖胺聚醣衍生物以及糖胺聚醣鹽類所組成之群組的羧基(carboxylic group)形成共價鍵結(covalent conjugation)，且該活性化合物係選自於來那度胺(Lenalidomide)、吉西他濱(Gemcitabine)及環加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)拮抗劑所組成之群組。
  2. 如請求項1所述之共軛化合物，其中共價鍵結是以醯胺鍵(amide bond)或酯鍵(ester bond)直接鍵結。
  3. 如請求項1所述之共軛化合物，其中COX-2拮抗劑係尼美蘇來(Nimesulide)或希樂葆(Celecoxib)。
  4. 如請求項1所述之共軛化合物，其中活性化合物係藉由一間隔物(spacer)與糖胺聚醣之羧基鍵結。
  5. 如請求項4所述之共軛化合物，其中間隔物係選自由多肽(polypeptide)、胜肽(peptide)、脂質(lipid)、胺基酸(amino acid)以及含有直鏈或支鏈的脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)或芳脂族(araliphatic)的C2-C20二羧酸(dicarboxylic acids)所組成之群組。
  6. 如請求項1所述之共軛化合物，其中糖胺聚醣係玻尿酸(hyaluronic acid)。
  7. 如請求項6所述之共軛化合物，其中玻尿酸之平均重量分子量係介於1萬道爾頓至200萬道爾頓。
  8. 如請求項1所述之共軛化合物，其中共軛化合物係用於治療癌症。
  9. 如請求項8所述之共軛化合物，其中癌症係肝癌(liver cancer)、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)、膽管細胞癌(cholangiocarcinoma)、膽管囊腺癌(cholangiocellular cystadenocarcinoma)、結腸癌(colon cancer)、腺癌(adenocarcinoma)、淋巴瘤和鱗狀細胞癌(lymphoma and squamous cell carcinoma)、乳癌(breast cancer)、乳房腺管癌(ductal carcinomas)、小葉癌(lobular carcinomas)、肺癌(lung cancer)、非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma)、小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、腎癌(renal cancer)、腎細胞癌(renal cell carcinoma)、泌尿上皮細胞癌(urothelial cell carcinoma)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma)、骨髓發育不良症候群(myelodysplastic syndromes，MDS)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia)或胰腺癌(carcinoma of the pancreas)。
  10. 一種共軛化合物用於製備治療癌症的醫藥品之用途，其中醫藥品含有如請求項1至9任一項所述之有效劑量的共軛化合物以及其醫藥學上可接受的賦形劑，其中共軛物化合物係由一糖胺聚醣以及一活性化合物所組成，且活性化合物係選自於來那度胺、吉西他濱及環加氧酶-2拮抗劑所組成之群組。
  11. 如請求項10所述之用途，其中癌症係肝癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、膽管囊腺癌、結腸癌、腺癌、淋巴瘤和 鱗狀細胞癌、乳癌、乳房腺管癌、小葉癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病或胰腺癌。
  12. 一種醫藥組合物，其包含至少一如請求項1至9任一項所述之共軛化合物以及至少一賦形劑及/或稀釋劑，其中該共軛化合物係由一糖胺聚醣以及一活性化合物所組成，且活性化合物係選自於來那度胺、吉西他濱及環加氧酶-2拮抗劑所組成之群組。
  13. 如請求項12所述之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係用於治療癌症。
  14. 如請求項13所述之醫藥組合物，其中癌症係肝癌、肝細胞癌、膽管細胞癌、膽管囊腺癌、結腸癌、腺癌、淋巴瘤和鱗狀細胞癌、乳癌、乳房腺管癌、小葉癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病或胰腺癌。
  15. 一種共軛化合物之製備方法，其包括以下步驟：齊備一含有N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽N-(3-dimethylamino propyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride，EDC HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)以及糖胺聚醣之水溶液；齊備一含有來那度胺、吉西他濱或環加氧酶-2拮抗劑 之有機溶劑；將該水溶液與該有機溶劑於室溫下混合並攪拌至少10小時，以獲得一混合液；透析該混合液，以獲得如請求項1所述之共軛化合物。
  16. 如請求項15所述之製備方法，其中糖胺聚醣係玻尿酸。
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