KR102283978B1 - 글리코스아미노글리칸 화합물, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

글리코스아미노글리칸 화합물, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물을 히알루론산 (HA)과 같은 글리코스아미노글리칸과 컨주게이션시킨 화합물에 대한 것이며, 상기 약물은 염증, 자가-면역 질환, 알레르기, 감염 및 바람직하게는 암과 같은 질병의 치료에 유용하다. 본 발명의 컨주게이션된 화합물은 표적 약물 전달 캐리어로서 사용되는 글리코스아미노글리칸과 CD44 세포 표면 수용체와의 상호작용으로 질병의 특정한 위치에서 약물 농도를 증가시킬 수 있으므로 치료 효능을 높이고 위치-전달 약물의 전신 부작용을 감소시킨다.

Description

글리코스아미노글리칸 화합물, 이의 제조 방법 및 용도{Compound of glycosaminoglycan, preparation method and use thereof}
본 발명은 약물과 컨주게이션된 글리코스아미노글리칸으로 구성된 화합물, 그의 제조 방법 및 용도에 대한 것이다.
세포외기질 (ECM)은 세포 기능 및 자극에 대한 상호작용을 조절하는 상호작용분자들의 동적 집합체이다. 세포외기질 거대분자의 일부류인 글리코스아미노글리칸은 세포이동, 분화, 증식, 면역 반응 및 세포골격 조직을 포함하는 다양한 정상 및 비정상 생물학적 공정들 모두와 관련되는 것으로 공지된 분자이다.
글리코스아미노글리칸 (GAG)은 반복되는 이당류 단위로 구성된 비분지형 쇄 고분자이다. 이들 이당류 단위는 항상, 일반적으로 우론산인 제 2당 (글루쿠론산 또는 이듀론산)과 함께, 대부분 설페이트되는 아미노 당 (N-아세틸글루코스아민 또는 N-아세틸갈락토스아민)을 포함한다. GAG는 그의 대부분의 당 잔기에 카르복시 또는 설페이트기의 존재로 인해 음으로 높게 하전되며 그것으로서 강한 친수성을 띤다. GAG는 공간 충전성이고 압축력에 저항성인 고도로 확장된 구조 및 형태 매트릭스를 취하는 경향이 있다. GAG의 4개의 주요한 그룹은 그의 당 잔기, 이러한 잔기들 사이의 연결 유형, 및 설페이트기의 개수와 위치에 따라 구별되었다. 그들은 다음과 같다: (1) 히알루로난, (2) 콘드로이틴 설페이트 및 더마탄 설페이트, (3) 헤파란 설페이트 및 헤파린, 및 (4) 케라탄 설페이트.
히알루로난 (또한 히알루론산 또는 히알루로네이트 또는 HA로 불림)는 가장 간단한 GAG이다. 이는 비-설페이트 이당류 단위, 구체적으로는 N-아세틸글루코스아민 및 글루쿠론산의 규칙적으로 반복되는 서열로 구성된다. 이의 분자량은 400 달톤 (이당류) 내지 수백만 달톤 이상의 범위에 이를 수 있다. 이는, 예를 들어, 피부, 연골, 및 안구와 같은 모든 조직에서 다양한 양으로 발견되고, 전부는 아니라도 대부분의 성체 동물의 체액에서 발견될 수 있다. 이는 특히 초기 배아에 풍부하다. 관절 연골에서, HA는 연골의 기능에 중요한 큰 집합체를 형성할 수 있다. 더욱이, 세포 운동성 및 면역 세포 부착이 세포 표면 수용체 RHAMM (히알루로난-매개된 운동성을 위한 수용체) 및 CD44에 의해 매개된다.
HA는 세포 표면의 내막에서 직접적으로 합성되며, 합성시 막을 관통하여 세포 외부로 돌출되어 고분자를 형성한다. 합성은 단일 단백질 효소인 히알루로난 합성 효소 (HAS)에 의해서 매개된다. 대조적으로, 다른 GAG는 아마도 일부 코어 (core) 단백질과 연관되어 골지체의 세포 내부에서 합성되며, 다음으로 외포작용에 의해서 방출된다. 척추 동물 조직 생체 내 (in vivo)에서의 HA 분해는 순차적으로 당을 제거하는 히알루로니다아제, 및 엑소글리코시다아제에 의해서 매개된다. 포유류-유형 히알루로니다아제는 가수분해를 일으키고 트랜스글리코시다아제에 대해 활성이며 HA 및 콘드로이틴을 분해할 수 있다. 연결 조직에서, HA와 관련하여 수산화된 물은 조직 사이에 공간을 형성하고, 따라서 세포 운동 및 증식을 전도하는 환경을 만든다. HA는 급속한 발달, 재생, 회복, 배아발생, 발생학적 발달, 상처치유, 혈관형성, 및 종양 형성을 포함하는 세포 운동성과 관련된 생물학적 현상들에서 중요한 역할을 수행한다.
CD44 (또한 Pgp-1, Hermes-3, HCAM, ECMR III로서 공지됨)는 85 내지 90 kDa의 분자량을 갖는 당단백질을 광범위하게 발현한다. CD44는 글리코스아미노글리칸, 히알루론산 (HA)에 대한 주요 세포 표면 수용체이다. CD44는 HA에 특이적으로 결합하지만, 프로테오글리칸을 포함하는 특정 콘드로이틴-설페이트 또한 인식할 수 있다. CD44는 HA로의 부착 및 이동, HA 분해 및 종양 전이를 포함하는 다양한 세포 및 생리학적 기능에 관한 역할을 한다. CD44는 또한 세포외기질 결합, 세포이동, 림프구 활성화, 림프구 귀소(homing), 및 기관지 평활근 세포의 증식에 관한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Gunthert et al., 1991, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, Cell, 5;65(1):13-24). CD44 수용체는 세포외 도메인의 가변 영역에서 복잡한 패턴의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)를 보인다. CD44는 HA에 대하여 특히 중요한 백혈구 수용체로 보여지며 따라서 천식의 발병기전에 관한 역할을 할 수 있다. 추가로, 대조군 마우스들에서 천식 실험을 하는 동안 증가 되었던 HA의 수준은 항체-치료된 마우스들에서 현저하게 경감되었으며, 이는 HA 대사[구체적으로는, 고분자량 HA의 프로염증성(pro-inflammatory) 저분자량 형태로의 파괴]에 관한 CD44의 역할을 입증한다. 이는, HA-유도된 올리고사카라이드가 톨-유사(toll-like) 수용체에 결합하고 이를 활성화 시킬 수 있기 때문에, 특히 중요할 수 있다. 명확하게는, 이러한 결과의 가장 놀라운 측면은 항-CD44 치료의 유익한 효과에 대한 광범위한 범위이다.
HA-CD44 상호작용은 발달, 염증, T 세포 동원 및 활성화, 폐염증, 및 종양 성장 및 전이에 중요한 역할을 할 수 있다. 선택적으로 스플라이싱된 CD44 전사물의 변경된 발현은 위암을 포함하는 수많은 암에서 발견된다 (F Reihani-Sabet et al., 2003, Effects of Inflammation and H. pylori Infection on Expression of CD44 Variant Exons in Gastric Tissue, Journal of Sciences, 14:11-16).
악성 종양 세포는, CD44 수용체에 대한 이들의 과발현에 의한 정상 결합 조직 또는 중간엽 세포보다 비례적으로 더 많은 바이오컨주게이트를 선택적으로 섭취할 수 있다. 여러 연구는 증가된 HA 합성 및 섭취와 암 진행 및 전이 능력 간의 상관관계를 가진다. 폐에서 발견되는 수많은 종양들을 포함하는 특정 종양들은 CD44 세포-표면 마커를 과발현한다. 유방암 세포는 정상 조직에 비해서 더 많은 HA를 섭취하는 것으로 알려지며, 높은 P-당단백 발현을 위해 HA를 필요로 하고 주로 다중-약물내성(multi-drug resistance)에 기여한다. 더욱이, 침윤성(invasive) 유방암 세포는 HA의 주요 수용체인 CD44를 과발현하며, 증식을 위한 CD44-내재된 HA의 고농도에 의존한다. 따라서, HA와 함께한 화학요법 약물 나노컨주게이트는 림프 전이에 대해 효과적일 수 있다 (Eliaz, R. E. et al., 2004, Liposome -encapsulated doxorubicin targeted to CD44: a strategy to kill CD44- overexpressing tumor cells, Cancer Res., 61(6):2592-601).
비-스테로이드 항염증성 약물 (NSAID) 및 사이클로옥시게나제 (COX)-2의 선택적 억제제는 일반적으로 통증, 염증 및 열의 치료에 사용되는 치료 그룹이다. 최근 증가한 실험은, 일부 NSAID 및 선택적 COX-2 억제제가 또한 발암 과정 동안 여러 생물학적 이벤트에 관여함으로써 항암 활성을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 예를 들어, 역학적 연구들은 아스피린의 정기적 사용이 암, 특히 결장의 발달 위험을 감소시킨다는 것을 밝혔다 (Sandler RS., et al., 2003, A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas in patients with previous colorectal cancer, New England J. Med., 　348:883-890). 이외에 또한, 셀레콕시브 (Celecoxib), 로페콕시브, 니메술리드 (Nimesulide), 멜록시캄 및 에토돌락과 같은 COX-2 길항제도 항암 활성을 가질 수 있다는 것이 밝혀졌다 (Yamazaki R., et al., 2002, Selective cyclooxygenase -2 inhibitors show a differential ability to inhibit proliferation and induce apoptosis of colon adenocarcinoma cells., FEBS Lett., 531(2):278-84). 게다가, COX-2는 만성적으로 수많은 전암성, 악성, 및 전이성 인간 암에서 과발현하며, 과발현 수준은 일부 암에 대한 침윤력, 예후, 및 생존과 상당한 상관관계가 있음이 밝혀졌다 (Dannenberg AJ., et al., 2003, Targeting cyclooxygenase -2 in human neoplasia: rationale and promise, Cancer Cell, 4(6):431-6). 최대 효능은 전형적으로 COX-1 관련 독성에 의해서 용량-제한적이다; 그러나, COX-2 억제제는 결장, 피부, 폐, 방광, 및 유방 암의 여러 동물 모델에서 종양 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Alane T.Koki, et al., 2002, Celecoxib : A Specific COX-2 Inhibitor With Anticancer Properties, Cancer Control, 9(2 Suppl):28-35).
WO 94/09811는 염증 치료 또는 암 전이 검출에 대한 CD44의 이용를 기재한다. 저자는 CD44가 염증성 조건에서 상향조절되며 CD44 펩티드가 T-세포 활성화를 억제할 수 있다는 것을 밝힌다. CD44에 의한 전이 억제에 관하여 어떠한 데이터 또는 청구항도 제시되지 않았으며, 종양 성장 또는 혈관형성을 억제하기 위한 CD44의 이용에 관하여 어떠한 청구항도 만들어지지 않았다. WO 99/45942는 암 및 혈관형성-의존성 질환을 억제하기 위한 HA-결합 단백질 및 펩티드 (CD44 포함)를 개시한다. 이러한 특허 출원은, B16 마우스 흑색종 및 루이스 폐암종(Lewis lung carcinoma)의 폐 전이를 억제하기 위하여, 전이성, 연골 결합 단백질의 38 kDa 단편 뿐만 아니라 이러한 단편으로부터 유도된 HA-결합 펩티드를 사용한다. HA-결합 펩티드의 경우, 닭 CAM에 관한 B16 흑색종 및 HA에 관한 내피세포 이동이 억제되었다. 이 두 특허 출원 모두에서, HA-결합 펩티드의 사용은 히알루론산에 결합하는 이의 능력과 직접적으로 연관된다.
미국 특허 No. 8,192,744는 가용성 재조합 CD44 히알루론산 결합 도메인 (CD44HABD)이 병아리 및 마우스의 생체 내에서 혈관형성을 억제하고, 이에 따라 다양한 기원의 인간 종양 성장을 억제한다는 것을 밝혔다. 상기 발명은 혈관 세포 표면 수용체의 표적화에 기반하는 새로운 부류의 혈관형성 억제제로서 가용성 비-글리코실화된 CD44 재조합 단백질을 개시한다.
따라서, 본원에서 상기 인용된 종래 기술은 CD44의 잠재적 이용을 개시하고, 임의의 효과가 HA-CD44-상호작용에 의존적일 수 있다는 것을 시사한다. 결과적으로, 지금껏 CD44-HA 컨주게이트 (conjugate)로 인한 모든 유용성은 히알루론산에 결합하는 이들의 능력에 직접적으로 의존한다.
그러나, 일부 약물은 여전히 HA 상에 성공적으로 컨주게이션되지 않으며, 활성 화합물의 위치-전달 캐리어 (site-delivery carrier)로서 HA의 잠재적 유용성을 확증하기 위해 추가의 실험이 수행되어야 한다. 특히, 종래 기술에서는 표면 세포 수용체 CD44와 활성 화합물을 갖는 HA의 컨주게이트 간의 상호작용이, CD44를 과발현함으로 특징지어지는 질환에서 이러한 활성 화합물의 표적물 전달에 유익하게 이용되어 효과적인 치료 개선을 얻을 수 있다는 것이 밝혀지지 않았다.
실제로, 예를 들어 암과 같은 병변에 대해서, 더욱 안전한 프로필로 종양 세포에 대해 효과적인 세포독성 효과와 정상 세포에 대한 세포독성 효과 간에 균형을 유지하는 이용가능한 치료 수단에 대한 필요가 여전히 존재한다.
본 발명의 목적은, 표면 세포 수용체 CD44를 과발현하는 질병에서 활성 화합물을 위치 전달 (site-delivery)하기에 적합한, HA와 활성 화합물과의 컨주게이션 (conjugation)을 기반으로 한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 글리코스아미노글리칸과 약물을 컨주게이션한 화합물을 제공하며, 상기 약물은 CD44의 발현과 매우 연관된 암 질병을 치료하는데 사용된다.
제1 양태에서, 본 발명의 목적은 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성된 화합물이며, 상기 활성 화합물은 관능기에 의해 글리코스아미노글리칸, 이의 유도체, 또는 그의 염의 카르복실기에 컨주게이션되어 공유적 컨주게이션을 형성하며, 상기 활성 화합물은 레날리도미드 (Lenalidomide), 젬시타빈 (Gemcitabine), 및 COX-2 길항제로 구성되는 그룹에서 선택된다.
본 발명에 따른 컨주게이트의 글리코스아미노글리칸은 바람직하게는 히알루론산이다.
더욱이, 본 발명에 따른 글리코스아미노글리칸 컨주게이트는 바람직하게는 암 질병을 치료하는데 사용된다.
따라서, 제2 양태에서 본 발명의 추가의 목적은 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성된 화합물의 용도이며, 상기 활성 화합물은 관능기에 의해 글리코스아미노글리칸, 이의 유도체, 또는 그의 염의 카르복실기에 컨주게이션되어 공유적 컨주게이션을 형성하며, 상기 활성 화합물은 암의 치료 및 상기 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 레날리도미드, 젬시타빈, 및 COX-2 길항제로 구성되는 그룹에서 선택된다.
다른 추가의 양태에서, 본 발명의 목적은 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성된 화합물을 제조하는 방법이며, 상기 활성 화합물은 관능기에 의해 글리코스아미노글리칸, 그의 유도체, 또는 그의 염의 카르복실기에 공유적 컨주게이션을 형성하며, 상기 활성 화합물은 레날리도미드, 젬시타빈 및 COX-2 길항제로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명을 적절히 기재하기 위해, 그의 실시형태들에 대한 참조가 첨부된 도면들에 예시된다. 덧붙여 첨부된 이러한 도면들은 명세서의 일 부분을 구성한다. 그러나, 첨부된 도면들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
도 1은 정상 및 손상된 결장 조직의 형광 지수에 따른 HA의 친화도를 도시한다.
도 2는 상이한 시간 경로에 따라 HCT 15 세포주 및 HT29 세포주에 작용한 HA-염료 화합물의 형광 결과를 도시하며, 도 2A는 6 시간에서의 HCT 15 세포주를 나타내고; 도 2B는 12 시간에서의 HCT 15 세포주를 나타내며; 도 2C는 6 시간에서의 HT29 세포주를 나타내고; 도 2D는 12 시간에서의 HT29 세포주를 나타낸다.
도 3은 HA-레날리도미드 컨주게이트의 구조를 도시한다.
도 4A는 HT29 세포주에 대한 유리-레날리도미드, HA, 및 HA-레날리도미드 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 4B는 HCT15 세포주에 대한 유리-레날리도미드, HA, 및 HA-레날리도미드 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 5A는 비변형 (genuine) 니메술리드 (-NO2 기, NiNO2를 가짐)의 구조 및 수소화 변형된 산물 (-NH2 기, NiNH2를 가짐)을 도시한다.
도 5B는 HA-NiNH2 컨주게이트의 구조를 도시한다.
도 6A는 HT29 또는 HCT15에서의 NiNO2 및 NiNH2의 세포독성 효과를 도시한다.
도 6B HT29에서의 NiNO2, NiNH2, HA, 및 HA-NiNH2 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 7A는 24일 동안의 3개 그룹 각각의 마우스들의 전체 체중을 도시한다.
도 7B는 대조군, NiNO2, 및 HA-NiNH2의 그룹들에 의한 종양 억제 효과를 도시한다.
도 8은 HA-셀레콕시브의 합성 절차 및 구조를 도시한다.
도 9A는 HT29 세포주에 대한 HA, 셀레콕시브, 및 HA-셀레콕시브 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 9B는 GBM8401 세포주에 대한 HA, 셀레콕시브, 및 HA-셀레콕시브 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 10은 HA-젬시타빈의 합성 절차 및 구조를 도시한다.
도 11은 A549 세포주에 대한 HA-젬시타빈 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
도 12는 GBM8401 세포주에 대한 HA-젬시타빈 컨주게이트의 세포독성 효과를 도시한다.
본 발명의 목적, 이점 및 신규 특성은 첨부된 도면과 함께 고려되는 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
일반적으로, 경구로 투여되거나 순환계 내로 주입되는 약물은 그의 표적 치료 부위에 직접적으로 도달해야하고, 상기 표적 위치에 대한 상기 농도 및 특이성이 그렇게 높지 않기 때문에, 표적 질병 및 정상 기관에 대한 상기 약물 효과는 매우 유사하다. 따라서, 유효량의 활성 화합물의 투여는 많은 경우에 약화되고 이의 안전성 프로필에 의해 제한된다.
우수한 안전성 프로필과 결합하여 치료 효능을 향상시키기 위한 한가지 전략은, 약물을 캐리어와 공유결합시켜 약물이 상기 질병 부위에 더욱 표적-선택적이 되도록 변형하는 것이다. 이는 앞서 예상된 바와 같이 항종양 치료 분야에서 특히 요구된다.
이러한 목적으로, 본 발명자는 활성 물질의 표적 전달을 위해 히알루론산 (HA)과 그의 수용체 CD44 사이의 상호작용을 이용하는 착상을 생각해냈다.
표적 위치에서 정상 조직 또는 기관보다 상대적으로 더 높은 약물의 농도를 유지하는 착상은 HA에 대한 장기간의 연구 및 실험 후에 본 발명자에 의해 확립되었다.
본 발명이 기원한 결과들이 실시예들에 충분히 기재되며 하기에 간단히 요약되어 있다.
사실, 본 발명은, 상이한 평균 분자량 (MW)을 갖는 히알루론산이 정상 조직에 비해 손상된 조직에서 더 높은 부착 지수를 가지며 낮은 평균 분자량을 갖는 HA가 높은 평균 분자량을 갖는 HA에 비해 더 잘 수행함을 보여주는 결과에 대한 근거를 찾았다. 특히, 도 1에 도시되는 바와 같이, 손상된 결장 조직상에 부착된 3개의 평균 분자량의 HA 사이의 차이를 비교하였을 때, 손상된 결장 조직에 의한 350 KDa HA의 부착 형광 지수가 다른 2개의 평균 분자량 (2000 KDa=2 MDa 및 (1000 KDa=1 MDa)의 HA보다 더 높았다. 또한, 심지어 정상 또는 손상된 결장 조직에 의한 1 MDa HA의 부착 형광 지수는 2 MDa HA의 것보다 보다 더 높았다. 또한 이러한 결과는 HA가 염증 위치에 더 특이적으로 부착될 수 있음을 확증하였으며, 이는 본 발명자가 추가로 본 발명을 발명하고, 히알루론산의 조직 부착의 이러한 고유한 특징 (주장에 의하면 HA와 그의 표면 세포 수용체 CD44와의 상호작용에 기인함)이 이러한 글리코스아미노글리칸이 다른 화합물과 컨주게이션될 때 유지될 수 있는지 입증한다. 따라서, 본 발명자는 또한 HA가 약물을 CD44 풍부 위치로 안내하도록 표적 전달 비히클로서 사용될 수 있는지를 입증하기 위해 약물을 HA와 컨주게이션한다. 전술한 바와 같이, 염증, 감염 또는 암이 존재하는 상황에서 CD44가 과발현되었을 때, 연관 약물은, 리간드 HA가 수용체 CD44에 부착하기 때문에 표적 위치에 쉽게 도달하며 그곳에서 상대적으로 높은 농도를 유지할 수 있다. 염증 부위 또는 CD44 풍부 위치에 대한 HA의 부착 효과와 동반하여, 컨주게이션된 약물은 표적 위치에서의 상대적으로 더 높은 약물 농도로 인해 치료 효능을 향상시키기도록 특히 표적 부위에 모이며, 따라서 그에 따라 더 우수한 안전성 프로필과 함께 사용되는 약물의 양을 줄여야 한다.
약물 또는 염료가 HA와 성공적으로 컨주게이션되어 왔음을 확증하고 HA 부착 효과를 추가로 확증하기 위해, 본 발명의 발명자는 염료를 HA에 컨주게이션시키고 (HA-염료) 세포주 및 마우스를 구분하여 치료하는 것을 포함하는 실험을 수행하였다. 도 2A 및 도 2B는 세포주 HCT15 (적은 CD44의 결장 직장 선암)에 대한 상이한 작업 시간에서의 실험을 나타내며, 도 2C 및 도 2D는 세포주 HCT29 (풍부한 CD44의 결장 선암)에 대한 상이한 작업 시간에서의 실험을 나타낸다. HT29의 결과는 (도 2C 및 도 2D) HA-염료가 성공적으로 컨주게이트되고 HT29의 CD44 풍부 부위에 부착되었으며 (도 2C), 심지어 HT29 세포 내부로 들어감을 나타낸다 (도 2D). 이는 본 발명의 착상이 적절하고 효과적이며 또한 약물 또는 염료가 HA에 컨주게이션되고 HA가 CD44에 결합하는 그의 능력을 유지함을 의미한다.
마우스의 HT29의 및 HCT15 세포주에 대한 유리-염료 및 HA-염료의 부착 조건을 4주간 수행하였다. 유리-염료를 마우스의 꼬리 정맥으로 주입하였다. 결과는 부착 결과에서 2개의 상이한 CD44 발현 암 세포가 어떠한 차이도 없음을 보여주었다. HT29의 부착 부위의 비율은 50.15%이도, HCT15는 49.86%이다. 그러나, HA 컨주게이션된 염료를 마우스들의 꼬리 정맥으로 주입하였을 때, 더 많은 CD44 발현 암 세포인 HT29가 HA 컨주게이션된 염료의 현저한 농도를 나타낼수록, 더 적은 CD44 발현인 HCT15은 매우 제한된 결과를 나타냈다. HT29의 부착 부위의 비율은 74.15%이며, HCT15는 25.85%이다. 결과는 염료가 HA와 컨주게이션될 때, CD44 풍부 위치에 부착된 HA로 인하여 염료의 농도가 증가되었다는 것을 나타낼 수 있다.
CD44와 높은 연관성을 갖는 질병은 암, 감염 및 염증을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 예를 들어, 암은 결장암종, 섬유 육종, 유방암, 선암, 및 악성 뇌교종을 포함한다.
명세서 및 청구 범위에서 본 발명에서 사용된 용어 "약물" 또는 "활성 화합물" 또는 "제제 (agent)"는 항암 약물을 포함할 수 있다. 대부분의 항암 약물들은 알킬화제, 대사길항제, 안트라사이클린, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라아제 저해제, 및 다른 항암 약물들로 분류될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 항암 약물의 컨주게이션은 레날리도미드, 젬시타빈, 셀레콕시브, 및 니메술리드를 포함한다.
니메술리드는 널리 사용되는 선택적인 COX-2 길항제 중 하나로서 다른 NSAID들과 비교했을 때 우월한 위장의 안전성을 갖는다. 근래에, 니메술리드는 종양 억제 유전자인 p21의 발현을 유도함으로써 항암 약물로서 작용하며, 암 세포의 세포 성장, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성에 필수적인 경로인 표유류 표적 라파마이신 (mTOR)-연관 경로를 억제하는 것으로 간주되었다. 암 세포의, 세포 성장에 필수적인 경로인 포유류 라파마이신표적 (mTOR)-연관 경로, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 생존, 단백질 합성을 억제했어야 했다 (Zhang YJ., et al., 2011, mTOR signaling is involved in indomethacin and Nimesulide suppression of colorectal cancer cell growth via a COX-2 independent pathway. Ann Surg Oncol., 18(2):580-8).
탈리도마이드의 4-아미노-글루타밀 유사체인, 레날리도미드는 탈리도마이드의 효력을 향상시키며 기형을 발생시키는 신경학상 부작용을 감소시키기 위해 탈리도마이드의 화학적 구조를 변형함으로 유도된 합성 화합물이다 (V. Kotla, et al., 2009, Mechanism of action of Lenalidomide in hematological malignancies, Journal of Hematology and Oncology, 2:36). 레날리도미드는 항-혈관형성, 항-종양형성, 및 면역조절 활성을 나타내왔으며, 이는 한센병성 결절성 홍반 (ENL) (J. Sheskin, 1980, The treatment of lepra reaction in lepromatous leprosy, International Journal of Dermatology, 6:318-322) 및 자가면역이상 (E. Atra and E. I. Sato, 1993, Treatment of the cutaneous lesions of systemic lupus erythematosus with thalidomide. Clinical and Experimental Rheumatology, 11(5):487-93)에서의 일화적인 면역조절 활성으로 인해 인식되었다. 레날리도미드는 항-혈관형성 속성을 가진 것으로 알려졌으며 다양한 혈액학적 및 고형 악성 종양[예: 척수형성부전증, 다발성 골수종, 만성 림프구 백혈병, 1차 전신성 아밀로이드증 (primary systemic amyloidosis), 비-호지킨 림프종, 골수 화생 및 발덴스트륌 거대글로불린혈증 (Waldenstrom Macroglobulinemia)을 동반한 골수섬유증]에 대한 활성을 지닌 약물로 떠올랐다 (Venumadhav Kotla, et al., 2009, Mechanism of action of Lenalidomide in hematological malignancies, Journal of Hematology & Oncology, 2:36). 다양한 악성 병태에서 레날리도미드의 치료 가능성에 대한 임상적 증거는 상이한 혈액암에서의 다양한 메커니즘을 통해 시험관 내 및 동물 모델에서 나타나온 다수의 약력학적 효과와 일치한다. 레날리도미드는 종양 억제 유전자인 p21를 상향조절하고; 따라서, 암 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다 (Verhelle D., et al., 2007, Lenalidomide and CC-4047 inhibit the proliferation of malignant B cells while expanding normal CD34 + progenitor cells. Cancer Res., 67(2):746-55). 레날리도미드는 또한 다발성 골수종에서 혈관형성 인자 VEGF 및 인터류킨-6 (IL-6)의 발현을 현저하게 감소시키는 것으로 나타나왔으며; 그럼으로써 혈관형성을 감소시키며 및 따라서 다발성 골수종에서의 임상적 치료 활성에 기여한다 (Gupta D., et al., 2001, Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia, 15(12):1950-61).
본 발명의 목적은 HA와 전술된 약물(링커 또는 스페이서를 동반하거나 동반하지 않는)을 HA의 카르복실기, 히드록실기, 또는 아미노기에 의해 결합하거나 컨주게이션시켜 특정한 장소 및 특정한 시간에서의 작업 효과를 달성하는 것이다. 따라서, HA는 표적 전달 비히클로서 약물을 CD44가 풍부한 특정한 위치로 운반하며, 더 나은 치료 효능 및 안전성을 산출할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로, 용어 "링커" 또는 “스페이서”는 화합물의 두 부분을 연결하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접적 결합 또는 원자 (예: 산소 또는 황), 단위 (예: SS, NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH) 또는 원자들의 쇄 (예: 하나 이상의 메틸렌이 O, S, S(O), SO2, NH, NH2, C(O)로 중단되거나 종료될 수 있는 치환된 또는 비치환된 알킬)를 포함한다. 본 발명의 용어 “링커” 또는 “스페이서”는 부재할 수 있으며 약물 및 화학적으로, 효소적으로 제거될 수 있는 HA 사이에 존재하는 임의의 화학적 화합물을 나타내거나 자발적으로 분해될 수 있다; 이는 또한 약물을 연결하는데 유용한 적어도 하나의 다른 기, 예를 들어 아미노, 티올, 추가로 카르복실기들 등을 포함한다. 링커 또는 스페이서는 폴리펩티드, 펩티드, 또는 지질이 될 수 있다.
적합한 링커 또는 스페이서는 예를 들어 선형 또는 분지형, 지방족, 방향족 또는 방향지방족(araliphatic) C2-C20 디카르복시산, 아미노산, 펩티드이다.
링커의 역할은, 존재하는 경우에는 언제나, 히알루론산 및 약물 사이에 팔 또는 스페이서를 만드는데 존재한다. 한편으로 링커는 아미드, 카르복실기, 히드록실기, 또는 아미노기 연결을 통해서 HA를 연관시키며, 다른 한편으로는, 임의의 가능한 공유-유형 결합을 통해서 약물을 연관시킨다.
링커 또는 스페이서가 디카르복시산일 때, 약물과 에스테르 결합을 형성하는 카르복실기는 화합물의 히드록실기일 수 있다. 링커 또는 스페이서가 디히드라지드일 때, HA와 아미드 결합을 형성하는 아미노기는 HA의 유리-카르복실기일 수 있다. 바람직한 링커 또는 스페이서는 약물에 대해서는 숙신산, HA에 대해서는 아디픽 디히드라지드 (ADH)이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 글리코스아미노글리칸으로부터의 컨주게이트, 바람직하게는 히알루론산, 및 활성 화합물로 구성된 화합물을 제공하며, 상기 활성 화합물은 관능기에 의해 글리코스아미노글리칸, 이의 유도체, 또는 이의 염의 카르복실기에 컨주게이트되어 공유적 컨주게이션을 형성하며, 상기 활성 화합물은 레날리도미드, 젬시타빈, 및 COX-2 길항제로 구성된 그룹에서 선택된다.
활성 화합물인 레날리도미드, 젬시타빈, 또는 바람직한 COX-2 길항제인 니메술리드 또는 셀레콕시브는 바람직하게는 HA의 관능 카르복실기 및 활성 화합물의 NH2기에 의하여 직접적으로 결합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, HA의 관능 카르복실기들 중 하나와 활성 화합물 중 하나 사이의 링커를 통한 직접적이거나 간접적인 공유 컨주게이션은 아미드 결합 또는 에스테르 결합일 수 있다.
링커에 의한 간접적 컨주게이션의 경우에, 상기 링커는 폴리펩티드, 펩티드, 지질, 아미노산 또는 선형 또는 분지형, 지방족, 방향족 또는 방향지방족 C2-C20 디카르복시산에서 선택된다.
컨주게이션을 위한 바람직한 HA는 10 kDa 내지 2000 kDa의 범위의 평균 분자량을 가지며 컨주게이션은 HA의 카르복실기의 적어도 40%를 포함한다.
본 발명에 따른 글리코스아미노글리칸 컨주게이트는 바람직하게는 암 질병 치료에 사용하기 위한 것이며 바람직하게는 본 발명의 가장 바람직한 실시 형태에서 암 질병은 간암, 간세포암종, 쓸개관암종, 쓸개관세포 (cholangiocellular) 낭샘암종, 결장암, 선암, 림프종 및 편평세포암종, 유방암, 도관암종, 소엽암종, 폐암, 비-소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 난소암, 전립선암, 신장암, 신장세포암종, 요로상피세포암종, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군 (MDS), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병, 또는 췌장암종에서 선택된다.
따라서, 본 발명은 HA와 레날리도미드, HA와 젬시타빈, HA와 니메술리드, 및 HA와 셀레콕시브의 항암 약물 컨주게이트를 제공하며, 상기 레날리도미드, 젬시타빈 및 셀레콕시브는 각각 레날리도미드의 -NH2기 및 HA의 -COOH기 사이에 아미드 결합의 형성에 의해 HA와 컨주게이션되며; 더욱이, 니메술리드의 경우에, HA-NiNH2 컨주게이트를 형성하기 위해 아미드 결합을 통해서 니메술리드가 HA의 -COOH기와 공유 결합할 수 있도록 -NO2기는 -NH2기로 변형되었다. HA-레날리도미드 컨주게이트의 구조가 도 3에 도시된다. 비변형 니메술리드 (NiNO2) 및 수소화 산물, NiNH2의 구조가 도 5A에 도시되며, HA-NiNH2 컨주게이트의 구조가 도 5B에 도시된다. HA-셀레콕시브 컨주게이트의 구조는 도 8에 도시된다. HA-젬시타빈 컨주게이트의 구조는 도 10에 도시된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 결과는 CD44 풍부 세포주 (HT29)에서, HA-레날리도미드 컨주게이트가, 레날리도미드 또는 HA 각각에 비해서 현저한 세포독성 효과를 전시함을 보여주었다 (도 4A); 그럼에도 불구하고, 이러한 상승작용 효과의 경향은 세포주 HCT15에서 잘 드러나지 않았다 (도 4B). 본 발명의 결과는 세포 생존력의 경향은 HA-레날리도미드 치료 하에 덜 풍부한 CD44의 HCT15에서 풍부한 CD44의 HT29에 비해서 더 높음을 도시하며 이는 CD44-풍부 세포주, HT29이 HA-레날리도미드 치료에 훨씬 민감함을 의미하며; 그러나, 세포 생존력에 대한 레날리도미드의 효과는 두 세포주 모두에서 거의 동일하다. 이러한 결과는 레날리도미드가 CD44와 상호작용하지 않으며, HA가 함께 컨주게이션되었을 때 동일한 약물 양에서 비교하면 실제로 레날리도미드의 치료 효능을 향상시킬수 있음을 나타낸다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 결과는 비변형 니메술리드의 세포독성 효과 (니트로 관능기, -NO2를 가짐)가 HT29 또는 HCT15에서 특히 더 높은 투여량에서 수소화 변형 산물 (아민 관능기, -NH2를 가짐)에 비해서 일반적으로 더 우수함을 보여주었다 (도 6A). 그러나, NiNH2가 HA와 컨주게이션되면, HA-NiNH2의 세포독성이 NiNH2 또는 NiNO2 단독의 경우에 비해서 현저하게 높다 (도 6B). 이러한 결과는 HA가 레날리도미드와 컨주게이션된 실시 형태와 동일하다. 따라서, 항암 약물의 세포독성 효과는 HA와 컨주게이션시킴으로 향상될 수 있었다.
더욱이, 동물 시험의 실시 형태에서, 본 발명의 결과는 HA-NiNH2의 종양 억제 효과가 NiNO2 또는 대조군 그룹에 비해서 더욱 강력함을 도시한다 (도 7B). 결과는 3개의 그룹들의 각 마우스들의 평균 체중이 24일 내에 거의 동일하였으며 (도 7A) 이는 체중 감소와 같은 현저한 부정적인 효과가 없었음을 나타내었으나; 종양 용적은 대조군, NiNO2, 및 HA-NiNH2의 각 그룹 내에서 비교하였을 때 현저히 상이하게 나타났으며, HA-NiNH2 그룹이 니메술리드 또는 대조군 그룹에 비해서 더 나은 종양 억제 효과가 있다는 것을 보여주었다 (도 7B). 이러한 결과는 본 발명의 HA-NiNH2의 컨주게이트가 NiNO2 단독의 경우에 비해서 더 우수한 치료 효과가 있음 을 나타낸다.
결과는 HT29 세포 및 GBM8401 세포에서 HA-셀레콕시브의 세포독성 효과가 HA 및 셀레콕시브 단독의 경우에 비해서 더 나은 경향을 갖는다는 것을 보여주었다 (도 9A 및 9B). 결과는 HA-젬시타빈의 세포독성 효과가 A549 세포 (도 11) 및 GBM8401 세포 (도 12)에서 증가하는 경향이 있음을 나타냈다.
모두 함께, HA와 컨주게이션된 레날리도미드의 및 니메술리드의 항종양 효능을 레날리도미드 및 니메술리드 단독의 경우와 각각 비교하였으며 세포독성 효과 및 종양 억제 효능이 현저하게 향상되었다. 전술된 결과는 본 발명이 레날리도미드 및 니메술리드를 포함하는 암 약물의 치료 효과를 향상시키는데 대단한 기여를 해왔음을 나타낸다.
질병을 치료하기 위해, 본 발명의 제형화 또는 투여량 형태의 바람직한 실시 형태는 안구, 이, 경구, 비, 기도, 위장기관, 순환계 또는 국소 사용을 위한 용량의 투여를 제형화하는 부형제를 포함한다. 경구 투여량 형태의 더욱 바람직한 실시 형태는 고체 투여량 형태, 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 용액, 조절된-방출 알약을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 알약, 및 장-피복 캡슐을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 캡슐로 구성된 그룹에서 선택된다. 위장기관 투여 형태의 더욱 바람직한 실시 형태는 고체 투여량 형태, 관류, 관장, 좌약, 및 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 용액으로 구성된 그룹에서 선택된다. 순환계 또는 전신 투여 형태의 더욱 바람직한 실시 형태는 정맥-내 (IV), 근육-사이 (IM) 및 피하 (SC)로 구성된 그룹에서 선택된다. 국소 투여 형태의 더욱 바람직한 실시 형태는 관류, 관장, 좌약, 분무, 흡입, 및 점적으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 발명의 목적인 글리코스아미노글리칸 및 활성 약제학적 화합물로부터의 컨주게이트로 구성된 화합물을 제조하는 방법은 다음 단계들을 포함한다:
- 글리코스아미노글리칸의 수용액, 바람직하게는 히알루론산을 제조하는 단계, ;
- 레날리도미드, 젬시타빈, 또는 COX-2 길항제 수용액을 N-(3-디메틸아미노 프로필)-N-에틸 카보이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드로 제조하는 단계;
- 실온에서 적어도 10시간동안 두 용액을 모두 혼합하고 교반하여 혼합된 용액을 수득하는 단계; 및
- 수 일간 상기 혼합된 용액을 투석하는 단계.
다음의 실시예들은 다양한 실시 형태들을 예시하기 위한 목적으로 제공되며 본 발명을 어떠한 방법으로든 제한하기 위함이 아니다.
실시예
실시예 1: 결장 조직에서 HA의 부착 (IVIS 이미지 시스템-비젼 3)
절차:
1. 고분자량 나트륨 히알루로네이트 분말 (HHA; Mw: 2 MDa; Freda) 0.25 g 및 저분자량 나트륨 히알루로네이트 분말 (LHA; Mw: 0.35 MDa; Freda) 0.25 g을 PBS 완충액 (인산염 완충된 식염수) 50 ml에 각각 첨가하여 0.5% 용액을 형성하였으며, 다음으로 상기 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간동안 교반하였다. 중분자량 나트륨 히알루로네이트 분말 (MHA; Mw: 1 MDa; Freda) 0.25 g을 PBS 완충액 50 ml에 첨가하고, 다음으로 상기 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간동안 교반하며 다음 단계들에서 사용할 수 있도록 준비하였다.
2. (1) MES 유리산 (2-(N-모폴리노) 에탄술폰산, Calbiochem) 0.39 g으로 형광 HA (HA-f)을 제조하고 dd 물 100 ml에 용해시켰다. (2) 용액 A: 플루오레세인아민 분말 (이성질체 I, Fluka) 65 mg를 95% 에탄올 (EtOH) 용액 9 ml에 용해시키고 다음으로 어두운 곳에서 10분간 교반하였다. (3) 용액 B: EDC 분말 (N-(3-디메틸아미노 프로필)-N-에틸 카보이미드 하이드로클로라이드, Sigma) 359 mg을 MES 완충액 9 ml에 용해시키고 다음으로 10분간 교반하였다. (4) 용액 C: NHS 분말 (N-하이드록시숙신이미드, Sigma) 216 mg을 MES 완충액 9 ml에 용해시키고 다음으로 10분간 교반하였다. (5) 용액 A 3 ml를 0.5% HA 용액 50 ml에 서서히 적하시키고 다음으로 빛이 통제된 조건 하에 10분간 교반하였다. (6) 용액 B 3 ml 및 용액 C 5 ml를 별도로 단계 (5)의 용액에 적하시키고 다음으로 빛이 통제된 조건 하에 10분간 교반하였다. (7) 0.02 M MES 완충액을 단계 (6)의 용액에 용적이 100 ml가 될 때까지 서서히 첨가하고 다음으로 실온에서 빛이 통제된 조건 하에 24시간 동안 교반하였다. (8) 반응 후 산물을 투석 관 (MW: 12000~14000)을 통해 탈-이온화된 물 5 L에 투석 용액으로서 따르고 다음으로 5일간 4℃의 어두운 곳에서 투석 용액이 형광 빛을 띠지 않을 때까지 투석 용액을 매 12시간마다 교체하면서 교반하였다. (9) 상기 액체를 투석 후에 50 c.c. 플라스틱 원심분리관에 배치하며 다음으로 밤새 -20℃ 냉동 장치에 저장하고, 다음으로 동결-건조 기계에서 어두운 가운데 건조시킨다. (10) 건조된 HA-f 분말을 -20℃ 냉동 장치에 저장한다. (11) HA-f 분말 50 mg을 PBS 완충액 10 ml에 서서히 첨가한 후 상기 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간동안 교반하였다.
3. 7-8 주 된 SD-래트 (스프라그-돌리 래트)의 결장 조직을 해부용 메스로 자르고 다음으로 PBS 완충액으로 세척한 후, 마지막으로 3-4 cm 길이로 PBS 완충액에 적신다.
4. 손상된 결장 조직을 칫솔로 20번 세로로 솔질하고 다음으로 PBS 완충액에 적심으로 제조한다.
5. 정상 및 손상된 결장 조직을 12-웰 플레이트(well plate)에 두고 다음으로 0.5% HA-f 용액 1 ml를 각 웰에 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 흔들었다. 과량의 HA-f 용액을 2시간 후에 끝으로 빨아들이고, 다음으로 PBS 완충액에 10분간 담근 후 PBS 완충액을 3번 반복하여 제거하였다.
6. 깨끗해진 결장 조직을 12-웰 플레이트에 내벽 조직을 위쪽으로 위치시키고 다음으로 IVIS (생체 내 이미지 시스템, XENOGEN)의 도크(dock)에 위치시킨다. 초기 파라미터를 GFP (녹색 형광 단백질)로, 자극 (excitiation)을 465 nm 및 배출 (emission)을 500 nm로 설정하고 다음으로 이미지를 소프트웨어로 기록하였다.
7. 모든 값들은 관찰의 수단으로서 계산된다. 조직학적 지수는 스튜던트 t-검정으로 분석하였다.
결과: 형광 지수를 도 1에 도시한 바와 같이 정량화하고 배열하였다. 정상 결장 조직의 형광 지수는 1로 정의하였다. 다른 결장 조직 검정은 정의된 값으로 보정하였다. 결과는 동일한 평균 Mw를 갖는 HA들이 정상 결장 조직에서 보다 손상된 결장 조직에서 명백하게 더 높은 형광 지수로 부착되었음을 보여주었다 (P<0.01). 손상된 결장 조직에 부착된, 3개의 상이한 평균 분자량의 HA 사이의 차이를 비교하였을 때, 손상된 결장 조직에 의한 350 KDa HA의 부착 형광 지수는 다른 2개의 평균 분자량 (2 MDa 및 1 MDa)의 HA들보다 더 높았다. 또한, 심지어 정상 또는 손상된 결장 조직에 의한 1 MDa HA의 부착 형광 지수는 2MDa HA의 것보다 더 높았다.
실시예 2: HA-염료 컨주게이션 공정 및 HA-염료 시험관 내 이미지
절차
다음의 HA-염료 컨주게이션의 전 공정은 어둡게 유지되어야 한다.
HA-ADH의 합성
1. HA (0.34 MDa, 50 mg)를 물에 용해시켜 4 mg/ml의 농도를 만들었다.
2. 5-배 과량 (114.8 mg)의 ADH (아디픽 디히드라지드)를 용액에 첨가하였다.
3. 반응 혼합물의 pH를 0.1 N HCl를 첨가하여 4.75로 조정하였다.
4. 다음으로, EDC의 1 당량 (25.1 mg)을 고체 형태로 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 0.1 N HCl를 첨가하여 4.75로 유지하였다.
5. 15분의 반응 후에, 0.1 N NaOH을 첨가하여 반응을 종료시키고 반응 혼합물의 pH를 7.0로 조절하였다.
6. 다음으로 반응 혼합물을 치료 전의 투석관으로 옮기고 [Mw 컷오프(cutoff) 3500] 100 mM NaCl, 다음으로 25% EtOH /물 4 주기 및 마지막으로 물에 대하여 철저히 투석하였다. 다음으로 용액을 0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 막으로 여과시킨 후, 순간 냉동, 및 동결 건조시켰다.
7. ADH의 치환도는 1 H NMR로 측정하였다.
HA-ADH-FITC의 합성
1. HA-ADH (DS=36%) 88 mg을 35 ml 물에 용해시켰다.
2. FITC 9.5 mg을 DMSO 10 ml에 용해시켰다.
3. HA-ADH 용액 및 FITC 용액을 혼합한다.
4. 실온에서 48시간 교반 후, 용액을 3일간 MWCO 12000-14000 투석 낭을 사용하여 0.3 M NaCl 및 순수한 물로 번갈아 투석하였다 .
5. 용액을 다음으로 2일간 동결-건조시켰다.
6. 마지막으로 치환도는 UV 스펙트럼으로 결정하였다.
HA-염료 시험관 내 이미지
(1) 1x105 HT 29 세포 및 HCT15 세포 (인간 결장암종, CD44 양성 세포)를 3.5 cm 접시 내의 슬라이드 상에 시딩(seeding)하였다.
(2) 필요로 하는 염료 농도인, 1 μM HA-염료 (HA: 0.34 MDa)를 각 세포가 필요로 하는 시간동안 첨가하였다.
(3) 배양 후에, 세포를 PBS에서 세척하고, 다음으로 3.7% 포름알데히드에 고정시켰다.
(4) HA-염료와 세포간의 상호작용의 관찰을 공초점 현미경으로 수행하였다.
결과: 형광 표시는 HCT15 (도 2A 및 도 2B) 및 HT29 (도 2C 및 도 2D) 상의 염료의 부착 위치 및 양을 보여줄 수 있다. 결과는, 염료가 HA와 성공적으로 컨주게이션되고 HA가 HT29 상의 CD44 풍부 위치에서 HA-염료 농도를 증가시킬 수 있고, HT29가 HT15보다 더 풍부한 CD44를 충족하는 더 강한 형광성을 갖는다는 것을 나타낸다. 심지어 HA-염료가 세포로 들어갈 수 있음이 증명되었다 (도 2D). HA-염료는 HT29 (CD44가 더 많음)에서 6시간 처리 후에 축적되었고 12시간 처리 후에 내재되었다. 이러한 현상은 HCT15 (CD44이 더 적음)에서는 6시간 또는 12시간의 HA-염료 처리 후 관찰되지 않았다.
실시예 3: 세포주 및 이종이식편 종양 모델
절차
1. 세포 배양 조건 및 계대
(1) 세포 배양 조건:
· HT29: 높은 포도당 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신.
· HCT15: DMEM/F12, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신.
(2) 계대:
(I) 배양물 배지를 제거하고 폐기한다.
(II) 상기 세포 층을 1x PBS로 간단히 헹궈서 트립신 억제제를 포함하는 혈청의 모든 흔적을 제거한다.
(III) 0.25% 트립신-EDTA 용액 1 mL를 플라스크에 첨가하고 (보통 5 내지 15분 내) 세포 층이 확산될 때까지 현미경 하에서 세포를 관찰한다. 다음으로, 완전 성장 배지 9 mL를 첨가하고 세포를 피펫으로 부드럽게 옮김으로써 흡인한다.
(IV) 상기 세포 현탁액의 적합한 부분 표본을 새로운 배양 접시에 첨가한다. (계대 배양의 비율 1:3 내지 1:8)
(V) 배양물들을 37℃ 인큐베이터 (5% CO2)에서 인큐베이션한다.
2. 이종이식편 종양 모델
(1) HT29 및 HCT 15 세포 (2x107 세포/마우스)를 8주된 수컷 누드마우스의 좌우 둔부에 분리하여 피하로 주입하였다 (좌우 뒷다리 상부).
(2) 이종이식편 종양의 크기가 3-4주 후에 400 내지 500 mm3 사이가 되었을 때 IVIS 실험 수행을 시작할 수 있었다.
3. IVIS 실험
(1) 이소푸루란으로 마취시킨 후에, f/스톱: 8, 3초의 노출 시간, 633 또는 635 nm의 자극 파장, 및 668 nm의 방출 파장의 측정의 파라미터로 이종이식편 누드 마우스의 이미지를 공백으로 찍었다. 사용된 장비는 Xenogen IVIS 200이다.
(2) 12.5 μM 유리-염료 200 μl 또는 0.1 mg의 HA (HA: 1.12 MDa)를 포함한 HA-염료의 12.5 μM 염료를 갖는 HA-염료 용액 200 μl를 각각 꼬리 정맥을 통해 정맥 주입하였다.
(3) IVIS 이미지의 사진을 미리정해진 5, 10, 30 분 및 1, 2 시간의 시간 후에 찍었다. 관찰의 파라미터 및 장비를 단계 1에 간단히 기재하였다. 내장에서 형광물질 분포를 분석하기 위해 주입 2 시간 후에 마우스를 해부하였다.
결과: 형광 이미지는 유리-염료가 HT29 (좌) 및 HCT15 (우)에 거의 균등하게 분포되어 있음을 보여주었다. HT29의 부착 부위의 비율은 50.15%이고 HCT15는 49.86%이다. 그러나, HA-염료는 특히, CD44를 HT29에 비해서 적게 갖는 HCT15 보다 HT29의 CD44 풍부 위치에 더 많이 부착될 수 있다. HT29의 부착 부위의 비율은 74.15%이며, HCT15는 25.85%이다. 결과는 HA가 CD44 풍부 위치 상의 염료 축적에 기여할 수 있음을 증명한다.
실시예 4: HA-레날리도미드 컨주게이트의 합성
절차
1. HA (10K-700KDa) 50 mg을 25 ml DD 물에 용해시켰다.
2. EDC 25.1 mg 및 NHS 15.1 mg을 실온에서 5 분간 2 ml DD 물에 혼합하고 교반하였다.
3. HA 용액을 1.31ml NaOH를 첨가함으로 중화시켰다.
4. 레날리도미드 3.4 mg을 2 ml 디메틸술폭시드 (DMSO) 용액에 용해시켰다 .
5. 이러한 혼합물을 (HA, EDC, NHS 및 레날리도미드) 실온에서 12 시간동안 교반하였다.
6. 상기 혼합물을 2~3 일동안 투석기 낭 (MWCO: 3500)을 사용하여 과량의 DD 물에 대해서 투석하였다.
7. HA-레날리도미드 용액으로부터 냉동건조기를 통해 탈수함으로 HA-레날리도미드 분말을 수득하였다.
결과: 도 3은 HA-레날리도미드 컨주게이트의 구조를 도시한다.
실시예 5: 레날리도미드의 시험관 내 세포독성
절차
1. HT29 세포를 높은 포도당 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
2. HCT15 세포를 DMEM/F12, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
3. 시딩 1일 (24 시간) 후에, 세포를 다음 약물의 필요 투여량을 포함하는 배지들-레날리도미드:400 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0; HA: 4mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.3125 mg/ml 및 0; HA-레날리도미드: 400 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 세포 생존력에 대한 약물 효과를, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 황색 염료 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브롬화물 (MTT)의 자색 포르마잔 결정으로의 분열을 기반으로 한 어세이 (assay)를 사용하여 평가하였다.
5. 24시간 동안의 약물 치료 후에, 배지를 제거하고 세포층을 배지로 헹구고 이어서 37℃ 인큐베이터 (5% CO2)에서 4 시간동안 배지에서 MTT 희석 (0.5 mg/ml)하였다.
6. 다음으로 상기 세포에 웰당 100 μl의 DMSO를 첨가하고 세포 호모게네이트 (homogenate)의 광학 농도를 ELISA 리더 (reader)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
7. 생세포 (live cell)의 분율을, 치료된 세포로부터 수득된 평균 광학 농도를 미치료된 대조군 세포의 평균 광학 농도로 나눔으로써 계산하였다.
결과: 결과는, CD44 풍부 세포주 (HT29)에서 HA-레날리도미드 컨주게이트가, 레날리도미드 또는 HA 단독의 경우에 비해서 세포를 사멸시키는 효과를 가짐을 보여주었다 (도 4A). 유사하게, 이러한 상승 작용 효과의 경향은 또한 세포주 HCT15 (도 4B)에서도 발견되었다.
실시예 6: HA- NiNH 2 컨주게이트의 합성
NiNO 2 의 수소화
1. 니메술리드 (NiNO2) 500 mg을 에틸 아세테이트 20 ml에 완전히 용해시키고 다음으로 5% Pd/C (탄소 상의 팔라듐) 200 mg을 촉매로서 용액에 첨가하였다. 지속되는 교반 하에 병으로부터 공기를 추출하고 상기 공기를 1 atm 이하의 H2 기체로 교체하고 이어서 24시간 동안의 교반하였다.
2. 박층크로마토그래피 (TLC 실리카 겔 슬라이드 60 F254)를, 수소화 산물의 순도의 식별을 위해 이동상이 헥산:에틸 아세테이트=2:1인 254 nm에서의 파장으로 수행하였다.
3. 상기 산물의 식별 후에, 잔여 용매를 제거하기 위하여 여과에 이어서 회전증발기로 Pd/C를 제거하였다.
4. 상기 수소화 산물을 헥산:에틸 아세테이트=1:1인 용액에 추가의 정제를 위해 용해시켰다.
5. 실리카 겔 칼럼 (column)을 정제를 위해 사용하고 용리 용액 (헥산:에틸 아세테이트=1:1)으로 용리하였다.
6. 색을 띤 부분을 수집하고 수소화 산물, NiNH2의 수율을 확정하기 위해 UV 및 NMR로 각 구조의 농도의 결정을 수행하였다.
7. NiNH2 분말을 냉동건조기로 수득하였다.
HA-NiNH 2 컨주게이트의 합성
1. HA (10-700KDa) 50 mg을 25 ml DD 물에 용해시켰다.
2. EDC 25.1 mg 및 NHS 15.1 mg을 실온에서 5 분간 1 ml DD 물에 혼합하고 교반하였다.
3. NiNO2 3.65 mg을 1 ml DMSO 용액에 용해시키고 다음으로 3분 내에 스포이트로 천천히 HA/EDC/NHS 용액에 적하시켰다.
4. 이러한 혼합물을 (HA, EDC, NHS 및 NiNH2) 실온에서 12 시간동안 어둠 속에서 교반하였다.
5. 상기 혼합물을, 투석기 낭 (MWCO: 3500)사용하여 2-3 일동안 과량의 DD 물에 대해서 투석하였다.
6. HA-NiNH2 분말을 HA-NiNH2 용액으로부터 냉동건조기를 통해 탈수함으로 수득하였다.
결과: 도 5A는 비변형 니메술리드 (NiNO2)및 산물 NiNH2의 구조를 도시한다. 도 5B는 HA-NiNH2 컨주게이트의 구조를 도시한다.
실시예 7: NiNO 2 의 시험관 내 세포독성
절차
1. HT29 세포를 높은 포도당 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
2. HCT15 세포를 DMEM/F12, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
3. 시딩 1일 (24 시간) 후에, 세포를 다음 약물의 필요 투여량을 포함하는 배지들-NiNO2 (NO2 기를 갖는 비변형 니메술리드를 나타냄): 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0; NiNH2 (NH2 기를 갖는 니메술리드를 나타냄): 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0; HA: 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.3125 mg/ml 및 0; HA-NiNH2: 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0에서 24시간 동안 에서 인큐베이션하였다.
4. 세포 생존력에 대한 약물 효과를, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 황색 염료 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브롬화물 (MTT)의 자색 포르마잔 결정으로의 분열을 기반으로 한 어세이를 사용하여 평가하였다.
5. 24시간 동안의 약물 치료 후에, 37℃ 인큐베이터 (5% CO2)에서 4 시간동안 배지의 MTT의 희석 (0.5 mg/ml)에 이어서 배지를 제거하고 세포층을 배지로 헹구었다.
6. 다음으로 상기 세포에 웰당 100 μl의 DMSO를 첨가하고 세포 호모게네이트의 광학 농도를 ELISA 리더를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
7. 생세포의 비율을, 치료된 세포로부터 수득된 평균 광학 농도를 미치료된 대조군 세포의 평균 광학 농도로 나눔으로써 계산하였다.
결과: 결과는 HT29 또는 HCT15에서 비변형 니메술리드 (NO2 기를 가짐)의 세포독성 효과가 일반적으로 변형된 산물(NH2 기를 가짐)에 비해서 더 우수함을 보여주었다 (도 6A). 그러나, NiNO2가 HA와 컨주게이션되면, HA-NiNH2의 세포독성은 NiNH2 또는 NiNO2 단독의 경우에 비해 현저하다 (도 6B).
실시예 8: 이종이식편 누드 마우스 모델에서의 종양 성장 억제
절차
1. HT29 (2x107 세포/마우스)를 8주된 암컷 BALB/c 무흉선증 (nu+/nu+) 마우스의 우측 둔부의 (우측 다리 상부) 피하로 주입하였다.
2. 종양 성장 억제 실험을 이종이식편 종양의 크기가 100 mm3 미만일 때 이를 0일로 지정하여 수행하기 시작할 수 있었다.
3. 종양 크기 및 체중을 실험 기간동안 3 또는 5 일마다 측정하였다.
4. 종양 용적을 1/2(4π/3)(L/2)(W/2)H로 계산하였으며; 여기서 L은 길이이고, W는 너비이며, 및 H는 종양의 높이이다.
5. 마우스들을 PBS-대조군, NiNO2, 또는 HA-NiNH2의 치료를 위한 상이한 그룹들로 나누었다.
6. 마우스들에게 꼬리 정맥 주입을 통해서 각각 NiNO2 (1.5 mg/kg), HA-NiNH2 (NiNO2 1.5 mg/kg의 당량) 또는 PBS의 투여량으로 48 또는 72 시간의 간격으로 투여하였다.
7. 각 마우스의 종양 크기 및 체중의 변화를 기록하였다.
결과: 결과는 각 마우스의 평균 체중이 거의 동일함을 보여주었다 (도 7A); 그러나, 대조군, NiNO2, 및 HA-NiNH2의 각 그룹과 비교하였을 때, 종양 용적은 상당히 상이하게 나타나고 HA-NiNH2 그룹이 NiNO2 그룹 및 대조군에 비해서 더욱 우수한 종양 억제 효과를 가졌다 (도 7B). 이 결과는 HA-NiNH2 의 컨주게이트가 NiNO2 단독의 경우에 비해서 뛰어난 치료 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 9: HA-셀레콕시브 컨주게이트의 합성
절차
1. HA (10K-700KDa) 100 mg을 DD 물 25 ml에 용해시켰다.
2. 테트라부틸암모늄 수산화물 (TBA-OH) 0.8 당량을 HA 용액에 첨가한 후 16 시간동안 교반하였다.
3. 용액을 건조시켜 HA-TBA 백색 고체를 수득하였다.
4. HA-TBA 40 mg를 DD 물 1 ml에 용해시키고 다음으로 EDC 30 mg 및 NHS 분말 18 mg을 용액에 첨가한 후 실온에서 5 분간 교반하였다.
5. 셀레콕시브 4 mg를 디메틸술폭시드 (DMSO) 용액 2 ml에 용해시켰다.
6. 이러한 혼합물을 (HA-TBA, EDC, NHS 및 셀레콕시브) 실온에서 72 시간동안 교반하였다.
7. 상기 혼합물을 1 일동안 DMSO 및 DD 물의 비율이 2 대 1인 용액에 대해서 투석기 낭 (MWCO: 1200~1400)을 사용하여 투석하였고 용액을 세번 교체하였다.
8. 상기 혼합물을 다음으로 2 일동안 0.3 M NaCl에 대해서 투석기 낭 (MWCO: 1200~1400)을 사용하여 투석하였고 용액을 하루 두번 교체하였다.
9. HA-셀레콕시브 분말을 HA-셀레콕시브 용액으로부터 냉동건조기를 통해 탈수함으로 수득하였다.
결과: 도 8은 HA-셀레콕시브 컨주게이트의 합성 절차 및 구조를 도시한다.
실시예 10: 셀레콕시브의 시험관 내 세포독성
절차
1. HT29 세포를 높은 포도당 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
2. GBM8401 세포를 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
3. 시딩 1일 (24 시간) 후에, 세포를 다음 약물의 필요 투여량을 포함하는 배지들 HA-셀레콕시브: 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0;에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
4. 세포 생존력에 대한 약물 효과를, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 황색 염료 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브롬화물 (MTT)의 자색 포르마잔 결정으로의 분열을 기반으로 한 어세이를 사용하여 평가하였다.
5. 24시간 동안의 약물 치료 후에, 배지를 제거하고 세포층을 배지로 헹구고 이어서 37℃ 인큐베이터 (5% CO2)에서 4 시간동안 배지에서 MTT 희석 (0.5 mg/ml)하였다.
6. 다음으로 상기 세포에 웰당 100 μl의 DMSO를 첨가하고 세포 호모게네이트의 광학 농도를 ELISA 리더를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
7. 생세포의 비율을, 치료된 세포로부터 수득된 평균 광학 농도를 미치료된 대조군 세포의 평균 광학 농도로 나눔으로써 계산하였다.
결과: 결과는 HA-셀레콕시브의 세포독성 효과가 HT29 세포 및 GBM8401 세포에서 HA 및 셀레콕시브 단독의 경우에 비해서 더 나은 경향을 갖는다는 것을 보여주었다 (도 9A 및 도 9B).
실시예 11:HA-젬시타빈 컨주게이트의 합성
절차
1. HA (10-700KDa) 50 mg을 25 ml DD 물에 용해시켰다.
2. EDC 25.1 mg 및 NHS 15.1 mg을 1 ml DD 물에서 혼합하고 실온에서 5분 동안 교반하였다.
3. HA 용액에 1.44 ml NaOH를 첨가함으로 중화시켰다 .
4. 젬시타빈 3.9 mg를 DMSO 용액 1 ml과 함께 D.D 물 1 ml에 용해시키고 다음으로 스포이트로 3 분 내에 천천히 HA/EDC/NHS 용액에 적하시켰다.
5. 이러한 혼합물을 (HA, EDC, NHS 및 젬시타빈) 실온에서 12 시간동안 어둠 속에서 교반하였다.
6. 상기 혼합물을 2-3 일동안 과량의 DD 물에 대해서 투석기 낭 (MWCO: 12000~14000)사용하여 투석하였다.
7. HA-젬시타빈 분말을 HA-젬시타빈 용액으로부터 냉동건조기를 통해 탈수함으로 수득하였다.
결과: 도 10는 합성 절차 및 HA-젬시타빈 컨주게이트의 구조를 도시한다.
실시예 12: 젬시타빈의 시험관 내 세포독성
절차
1. A549 세포를 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
2. GBM8401 세포를 DMEM, 10% FBS, 1% 나트륨 피루브산염, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 포함하는 96 웰-플레이트의 웰당 1x104 세포의 낮은 농도의 배지에서 시딩하였다.
3. 시딩 1일 (24 시간) 후에, 세포를 다음 약물의 필요 투여량을 포함하는 배지들- HA-gem: 400 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0;에서 48 시간동안 인큐베이션하였다.
4. 시딩 1일 (24 시간) 후에, 세포를 다음 약물의 필요 투여량을 포함하는 배지들- HA-셀레콕시브: 200 μM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM 및 0;에서 24시간동안 인큐베이션하였다.
5. 세포 생존력에 대한 약물 효과를, 미토콘드리아의 탈수소 효소 작용에 의해 황색 염료 3-(4,5-디메틸-2-티아졸일)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브롬화물 (MTT)의 자색 포르마잔 결정으로의 분열을 기반으로 한 어세이를 사용하여 평가하였다.
6. 24시간 동안의 약물 치료 후에, 배지를 제거하고 세포층을 배지로 헹구고 이어서 37℃ 인큐베이터 (5% CO2)에서 4 시간동안 배지에서 MTT 희석 (0.5 mg/ml)하였다.
7. 다음으로 상기 세포에 웰당 100 μl의 DMSO를 첨가하고 세포 호모게네이트의 광학 농도를 ELISA 리더를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.
8. 생세포의 비율을, 치료된 세포로부터 수득된 평균 광학 농도를 미치료된 대조군 세포의 평균 광학 농도로 나눔으로써 계산하였다.
결과: 결과는 A549 세포 (도 11) 및 GBM8401 세포 (도 12)에서 HA-젬시타빈 의 세포독성 효과 증가 경향을 나타내었다.

Claims (15)

  1. 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성되는 화합물로서,
    상기 컨주케이트는 활성 화합물의 관능 아미노기 및 글리코스아미노글리칸의 카르복실기 사이의 아미드 결합에 의해 형성되며,
    상기 글리코스아미노글리칸은 히알루론산 또는 이의 염이고,
    상기 활성 화합물은 레날리도미드(Lenalidomide), 젬시타빈(Gemcitabine), 셀레콕시브(Celecoxib) 및 니메술리드(Nimesulide)의 수소화 산물로 구성되는 그룹에서 선택되는 것인, 화합물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산이 10 kDa 내지 2000 kDa의 범위 내에 포함되는 평균 분자량을 갖는, 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성되는 화합물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    암 치료에 사용하기 위한 것인, 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성되는 화합물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 암이 간암, 간세포암종, 쓸개관암종, 쓸개관세포(cholangiocellular) 낭샘암종, 결장암, 선암, 림프종 및 편평세포암종, 유방암, 도관암종, 소엽암종, 폐암, 비소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 난소암, 전립선암, 신장암, 신장세포암종, 요로상피세포암종, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군(MDS), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병, 또는 췌장암종인, 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트로 구성되는 화합물.
  6. 암 치료에 사용하기 위한, 제1항 또는 제3항에 따른 컨주게이트 및 적어도 하나의 부형제 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 암이 간암, 간세포암종, 쓸개관암종, 쓸개관세포 낭샘암종, 결장암, 선암, 림프종 및 편평세포암종, 유방암, 도관암종, 소엽암종, 폐암, 비소세포 폐암종, 소세포 폐암종, 난소암, 전립선암, 신장암, 신장세포암종, 요로상피세포암종, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군(MDS), 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 만성 림프구 백혈병, 또는 췌장암종인, 적어도 하나의 글리코스아미노글리칸 및 활성 화합물로부터의 컨주게이트를 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제3항에 따른 화합물의 제조 방법으로서,
    - N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸 카보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드와 함께, 글리코스아미노글리칸의 수용액을 제조하는 단계;
    - 레날리도미드, 젬시타빈, 셀렉콕시브 또는 니메술리드의 수소화 산물의 유기 용액을 제조하는 단계;
    - 실온에서 적어도 10시간 동안 두 용액 모두를 혼합하고 교반하여 혼합된 용액을 수득하는 단계; 및
    - 수 일간 상기 혼합된 용액을 투석하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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  12. 삭제
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  14. 삭제
  15. 삭제
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