KR20160014690A - 글리코사미노글리칸 화합물 및 이의 제조 방법과 용도 - Google Patents

글리코사미노글리칸 화합물 및 이의 제조 방법과 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물에 히알루론산 (HA)과 같은 글리코사미노글리칸을 접합시킨 화합물에 관한 것으로서, 약물은 염증, 자가면역 질환, 알레르기, 감염, 바람직하게는 암과 같은 질환을 치료하는데 사용가능하다. 본 발명의 접합된 화합물은 타겟 약물의 전달 담체로서 사용되는 글리코사미노글리칸과 CD44 세포 표면 수용체의 상호작용에 의해 질환의 특정 부위에 약물의 농도를 증가시킴으로써, 치료학적 효능을 강화하고 부위-전달된 약물의 전신 부작용을 줄일 수 있다.

Description

글리코사미노글리칸 화합물 및 이의 제조 방법과 용도 {COMPOUND OF GLYCOSAMINOGLYCAN AND ITS PREPARATION METHOD AS WELL AS APPLICATION}
교차 참조
본 출원은 2013년 8월 29일자 미국 가출원번호 61/871,352에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 글리코사미노글리칸과 약물의 접합체로 이루어진 화합물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
세포외 기질 (ECM)은 자극에 반응하여 세포 기능과 상호작용을 조절하는 상호작용 분자들의 동역학적인 집합이다. 세포외 기질 거대분자의 한 부류인 글리코사미노글리칸은 세포 이동, 분화, 증식, 면역 반응 및 세포골격 조직화 등의 매우 다양한 정상 및 비정상적인 생물학적 프로세스 둘다에 참여하는 것으로 알려진 분자이다.
글리코사미노글리칸 (GAG)은 2당류 단위가 반복되어 구성된 비-분지형의 체인이다. 이러한 2당류 단위에는 항상 아미노 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)이 함유되어 있는데, 대부분의 경우 황산화되어 있으며, 2번째 당은 통상 우론산 (글루쿠론산 또는 이두론산)이다. GAG는, 자신의 당 잔기 대부분에 카르복시 기나 설페이트 기가 존재하므로, 고도로 음으로 하전되어 있다. 이와 같이, 이 화합물은 높은 친수성을 가진다. GAG는 넓게 연장된 형태를 취하는 경향이 있으며, 공간을 채우고 압축력에 저항하는 매트릭스를 형성한다. GAG는 4가지 주 그룹으로 당 잔기, 잔기 간의 연결 타입 및 설페이트 기의 수와 위치로 구분되고 있다. 이러한 것으로는, (1) 히알루로난, (2) 콘드로이틴 설페이트 및 더마탄 설페이트, (3) 헤파란 설페이트 및 헤파린, 그리고 (4) 케라탄 설페이트가 있다.
히알루로난 (히알루론산, 히알루로네이트 또는 HA로도 지칭됨)은 GAG의 가장 단순한 형태이다. 이것은 비-황산화 이당류, 특히 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 규칙적으로 반복되는 배열로 이루어진다. 이의 분자량은 400 달톤 (이당류) 내지 수백만 달톤의 범위일 수 있다. 이것은 피부, 연골 및 눈과 같은 모든 조직들에서 발견되며, 모두 그런 것은 아니지만 대부분 성체 동물의 체액에서 발견된다. 특히 초기 배아에 다량 존재한다. HA는 관절 연골에서 연골 기능에 중요한 거대한 응집체를 형성할 수 있다. 아울러, 세포 이동성 및 면역 세포 부착도 세포 표면 수용체 RHAMM (히알루로난-매개 이동성에 대한 수용체) 및 CD44에 의해 매개된다.
HA는 세포 표면의 내막에서 직접 합성되며, 자라나는 폴리머가 합성되면서 막을 통해 세포 외부로 돌출된다. 합성은 단일 단백질 효소인 히알루난 신테타제 (HAS)에 의해 매개된다. 이와는 대조적으로, 다른 GAG들은 세포내 골지 (Golgi) 기관에서 아마도 일부 코어 단백질과 조합된 형태로 합성된 다음, 세포외 배출 (exocytosis)에 의해 방출된다. 척추 동물 조직에서 생체내 HA 분해는 히알루로니다제와, 당을 순차적으로 제거하는 엑소글리코시다제에 의해 매개된다. 포유류-타입의 히알루로니다제는 가수분해 활성과 트랜스글리코시다제 활성 2가지를 가지고 있어, HA와 콘드로이틴을 분해할 수 있다. 결합 조직에서, HA는 물에 의한 수화 작용으로 조직들 사이에 공간을 확보함으로써, 세포 이동 및 증식에 유익한 환경을 조성한다. HA는 빠른 발달, 재생, 회복, 배아 발생, 배아의 발달, 상처 치유, 신생혈관 형성 및 종양 형성을 비롯한 세포 이동성과 관련된 생물학적 현상들에 중요한 역할을 담당한다.
CD44 (Pgp-1, Hermes-3, HCAM, ECMR III라고도 함)는 광범위하게 발현되는 당단백질로서 분자량이 85 - 90 kDa이다. CD44는 글리코사미노글리칸인 히알루론산 (HA)에 대한 주요 세포 표면 수용체이다. CD44는 일부 콘드로이틴-설페이트를 함유한 프로테오글리칸도 인지할 수 있지만, HA에 특이적으로 결합한다. CD44는 HA로의 부착 및 HA 상에서의 이동, HA 분해 및 종양 전이 등의 다양한 세포 기능과 생리 기능을 담당한다. 또한, CD44는 세포외 기질 결합, 세포 이동, 림프구 활성화, 림프구 회귀 (lymphocyte homing) 및 기관지 평활근 세포의 증식에 기능을 하는 것으로 입증되어 있다 (Gunthert et al., 1991, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, 5;65(1):13-24). CD44 수용체는 세포외 도메인의 가변부에서 복잡한 얼터너티브 스플라이싱 패턴을 보인다. CD44는 HA에 있어 특히 중요한 백혈구 수용체인 것으로 보이며, 따라서 천식 발병에 역할을 할 수 있다. 아울러, 대조군 마우스에서의 천식 실험 시 증가된 HA 수준은 항체-처리된 마우스에서 급격하게 약화되었는데, 이는 HA 대사 (특히 고분자량 HA가 저분자량의 전-염증성 형태로 분해되는 과정)에서의 CD44의 역할을 뒷받침해준다. 이는, HA-유래 올리고당이 Toll-유사 수용체에 결합하여 활성화할 수 있기 때문에, 매우 중요할 수 있다. 분명히, 이들 결과에서 가장 인상적인 부분은 항-CD44 처리에 따른 유익한 효과가 매우 중요하다는 것이다.
HA-CD44 상호작용은 발달, 염증, T 세포 동원 및 활성화, 폐 염증 및 종양 증식과 전이에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
표준 CD44와 모든 이소형이 표적 제거된 마우스는 정상적으로 성장한다. 연구들은 류마티스 관절염과 같은 염증성 상태와 조직 염증 부위에 대한 T 세포의 분출에 있어 CD44의 중요한 역할을 제시하고 있다. CD44는 마우스에서 알레르겐-유발성 기도 염증에 염증성 세포를 동원하는 중요한 역할을 담당할 수 있다. CD44는 만성 염증을 조절하는데 결정적인 역할을 수행하는 것으로 제시되었는데, 이는 CD44가 HA와의 상호작용과는 독립적으로 대식세포의 활성화를 조절하는데 결정적인 역할을 할 수 있음을 시사한다 (Dianhua Jiang, Hyaluronan in Tissue Injury and Repair, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007;23:435-61).
염증 반응과 면역 반응을 제어하는 능력이 다양한 스펙트럼의 질환의 치료에 중요하다. CD44는 활성화된 림프구가 내피세포와 평활근 세포에 부착하는 것을 지원한다. 아울러, CD44의 결찰 (ligation)은 염증성 세포와 혈관 세포 둘다의 활성화를 유발한다. HA는 CD44의 기본 리간드로서, apoE-결핍 마우스의 죽상경화성 병변에서 상향 조절되며, HA의 저분자량 전-염증성 형태는 VCAM-1 (혈관 세포 유착 분자-1)의 발현과 배양된 일차 대동맥 평활근 세포의 증식을 자극하는 반면, HA의 고분자량 형태는 평활근 세포의 증식을 저해한다. Gal-9 (갈렉틴-9)은 AHR (기도 과민성) 뿐 아니라 Th2-관련 기도 염증을 경감시킬 수 있다. 아울러, Gal-9 및 항-CD44 단일클론 항체의 투여는 말초혈 Th2 세포가 기도로 침윤되는 것을 저해하였다. 흥미롭게도, Gal-9는 CD44 유착 분자에 직접 결합하여, HA와의 상호작용을 저해하였다. CD44-HA 상호작용이 폐로의 T 세포의 이동을 매개한다는 개념과 일관되게, Gal-9은 BW5147 마우스 T 세포가 HA에 CD44-의존적으로 부착되는 것을 차단하였다. 이로써, Gal-9이 세포외 기질의 CD44-의존적인 백혈구 인지를 매개함으로써 기도의 알레르기성 염증과 AHR을 저해하는 것으로 결론내려졌다 (Shigeki Katoh, et al., Galectin-9 Inhibits CD44-Hyaluronan Interaction and Suppresses a Murine Model of Allergic Asthma, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2007 Jul 1;176(1):27-35).
CD44는 전신성 홍반성 낭창 (SLE), 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 염증성 장 질환 (IBD), 강직성 척추염, 건선성 관절염, 건선, 피부근염, 혈관염 및 베체트 질환과 같은 자가면역 질환에서 발현될 것이다. 전신성 홍반성 낭창은 복수의 장기 시스템에 작용하는 프로토타입의 자가면역 질환이다. 축적되는 증거는, 히알루로난과 이것의 세포 표면 수용체 CD44와의 상호작용이 SLE에서 병인성 기전에 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다 (Yung S and Chan TM, 2012, The Role of Hyaluronan and CD44 in the Pathogenesis of Lupus Nephritis, Autoimmune Dis. Volume 2012 (2012), Article ID 207190, 9 pages). 류마티스 관절염 (RA)은 환자의 윤활 관절에 염증을 일으키는 흔한 자가면역 장애이다. RA가 개체의 대략 1% 발병하고 자가면역 장애로서 분류됨에도 불구하고, 허용성의 회피를 개시하는 분자적 현상(들)은 이론적이며 미확인 상태로 남아있다 (Patrick J. Mott, CD44 Antibodies and Immune Thrombocytopenia in the Amelioration of Murine Inflammatory Arthritis, PLoS One, 2013, 8(6): e65805). 쇼그렌 증후군 (SS)은 전신성 홍반성 낭창 (SLE) 및 류마티스 관절염 (RA)과 같은 관련 자가면역 장애들 보다 더 빈번하지만, SS에 대한 과학적 및 의학적 연구는 엄청나게 뒤쳐져 있다. 이는 특히 SS 유전학 분야에서 그러하며, 지금까지의 시도는 후보 유전자 접근법에 상당히 의존하고 있다 (John A. Ice, Genetics of Sjogren's syndrome in the genome-wide association era, J Autoimmun. 2012 Aug;39(1-2):57-63). 강직성 척추염 (AS)은 축성 골격에서 흔한 일반적인 염증성 류마티스 질환으로서, 인구의 0.2%에서 발병한다. 현행 진단 기준은 임상 변화와 방사선적 변화의 조합에 의존하며, 평균 진단 시기는 5 내지 10년이다 (Roman Fischer, 2011, Discovery of Candidate Serum Proteomic and Metabolomic Biomarkers in Ankylosing Spondylitis, Mol Cell Proteomics, 2012 Feb;11(2):M111.013904). 이들 결과는, 활성화된 CD44를 보유한 순환성 T 림프구가 만성 염증 상황에서 상승하고 이것이 자가면역 또는 만성 염증 질환 활성에 대한 믿을 수 있는 마커를 제공할 수 있는 활성화된 순환성 세포의 병리학적으로 중요한 아집단일 수 있음을, 시사한다 (Estess P, et al., 1998, Functional activation of lymphocyte CD44 in peripheral blood is a marker of autoimmune disease activity, J Clin Invest. 1998 Sep 15;102(6):1173-82). 크론 질환 (CD) 및 궤양성 대장염 (UC)을 비롯한 염증성 장 질환 (IBD)은, 건선과 임상적 및 면역학적 특징들을 공유한다. 게놈-와이드 연관 연구들에서 공통적인 감수성 유전자들을 발굴하였다. 그러나, 건선, 건선성 관절염 및 IBD 위험성 간의 연관성을 평가하는 역학 데이타가 부족하다. 연구에서는 미국의 여성들에서 건선, 건선성 관절염 및 우발적인 CD 및 UC 간의 연관성을 평가하고자 하였다. 건선성 관절염을 수반한 건선은 우발적인 CD의 발병 위험성 증가와 관련있다 (Wen-Qing Li, 2013, Psoriasis, psoriatic arthritis and increased risk of incident Crohn's disease in US women, Ann Rheum Dis. 2013 Jul;72(7):1200-5). 피부근염 (DM)은 근육과 피부의 염증을 특징으로 하는 다발성 근염 (PM)과 관련된 결합 조직 질환이다. DM은 피부와 근육에 가장 많이 발병하지만, 관절, 식도, 폐에도 발병할 수 있으며, 희박하게는 심장에도 발병할 수 있는 전신성 장애이다. 혈관염은 염증에 의한 혈관 파괴를 보이는 일군의 장애이다. 동맥과 정맥 모두에서 발병한다. 혈관염의 병리생리학은 충분히 파악되지 않았지만, 이후의 염증 반응은 일반적으로 잘 개시되어 있다 (Henry S. Su, 2012, Vasculitis: Molecular Imaging by Targeting the Inflammatory Enzyme Myeloperoxidase, Radiology, 2012 Jan;262(1):181-90). 베체트 질환 (BD)은 모든 크기의 동맥과 정맥에서 발병하는 유일한 전신성 혈관염이다. 이는 류마티스 클리닉에서 자주 접한다. 일부 중증 병적 상태이며, 심지어 몇몇 사례들에서는 치명적인 결과로 나타나기도 한다 (M. B. Owlia, 2012, Behcet's Disease: New Concepts in Cardiovascular Involvements and Future Direction for Treatment, ISRN Pharmacol, 2012: 760484).
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 접합된 인터페론 alpha (IFNα)는 일주일에 1회 주사 제형으로서 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염을 치료하는데 널리 사용되어 왔다. 그러나, 페길화된 (PEGylated) IFNα는, 반복 주사 후, 아마도 페길화의 비특이적인 전달로 인해, 효능이 39%로 낮고 부작용이 있다. 이에, HCV 감염을 치료하기 위해 타겟 특이적인 장기-작동성 히알루론산-인터페론 alpha (HA-IFNα) 접합체가 개발되었다. HA-IFNα 접합체는 알데하이드 변형된 HA와 IFNα의 N-말단 간의 커플링 반응에 의해 합성되었다. IFNα 함량은 HA 단일 체인 당 분자 2-9개 범위로 조절될 수 있으며, 바이오접합 효능은 95% 보다 높았다.
몇몇 실험들에서 박테리아와 숙주 세포 간의 직접 상호작용과 숙주 세포를 변형시켜 감염에 보다 취약해지게 만드는 신호전달 현상에 CD44를 연루시켜 왔다. 스트렙토코커스 피로게네스 (Streptococcus pyogenes)는 예를 들어 자신의 히알루로난-풍부 다당류 캡슐 (또는 세포벽)을 통해 세포에 부착한다. HA는 CD44에 결합하여, 몇몇 숙주-세포 단백질의 티로신 인산화 뿐만 아니라 층상위족 (lamellipodia)의 주름 형성과 연장을 야기하는 세포골격 재배열을 촉발한다. 그 결과, 세포간 부착은 타이트 정션과 E-카드헤린의 수적 감소로 인해 느슨해지는데, 이는 박테리아가 상피 아래 조직으로 갈 수 있게 하는 프로세스이다.
WO94/09811은 염증 치료 또는 암 전이 검출에 있어 CD44의 용도를 개시하고 있다. 출원인은, CD44가 염증성 병태에서 상향 조절되며, CD44 펩타이드가 T-세포 활성화를 저해할 수 있음을 보여준다. CD44에 의한 전이 저해에 대한 데이타나 청구항은 제시되어 있지 않으며, 종양 증식 또는 혈관신생을 저해하는데 있어 CD44의 용도에 대한 청구항은 기재되어 있지 않다. WO 99/45942는 암 및 혈관신생-의존성 질환을 저해하기 위한 CD44 등의 HA-결합 단백질 및 펩타이드의 용도를 개시하고 있다. 이 공개 공보에서는 연골 연결 단백질의 38 kDa 단편인 메타스타틴과, B16 마우스 흑색종의 폐 전이 및 Lewis 폐암을 저해하기 위한 이 단편으로부터 유래되는 HA-결합 펩타이드를 이용한다. HA-결합 펩타이드의 경우, 닭 CAM 상의 B16 흑색종 증식 및 HA 상의 내피 세포 이동을 저해하였다. 이들 2가지 문헌들에서, HA-결합 펩타이드의 사용은 히알루론산에 결합하는 능력과 직접 관련있다.
미국 특허 8,192,744는 가용성 재조합 CD44 히알루론산 결합 도메인 (CD44HABD)이 닭과 마우스에서 생체내 혈관신생을 저해하며, 따라서 다양한 기원의 인간 종양 증식을 저해함을 보여준다. 이 발명은 혈관 세포 표면 수용체의 타겟화를 토대로 혈관신생 저해제의 새로운 유형으로서 가용성의 비-당화된 CD44 재조합 단백질을 개시한다.
즉, 선행 기술은 어떤 효과가 HA-CD44-상호작용에 의존적인지를 구체화하기 위한 CD44의 잠재적인 사용을 제시한다. 결론적으로, CD44-HA 접합체에 이러한 수준으로 부여된 모든 유용성은 이의 히알루론산 결합력에 직접적으로 의존하고 있다.
그러나, 몇몇 약물은 여전히 HA을 접합시키데 성공하지 못하고 있으며, 활성 화합물의 부위-전달 담체로서 HA의 잠재적인 유용성을 검증하기 위한 향후 실험이 실행되어야 한다. 특히, 선행 기술에서는, 표면 세포 수용체 CD44와 HA 및 활성 화합물의 접합체 간의 상호작용이 CD44의 과다발현이 특징적인 질환에서 이러한 활성 화합물의 타겟 전달에 유리하게 활용하여, 이의 효과적인 치료적 개선을 달성할 수 있다는 것을, 보여주지 못하였다.
본 발명의 목적은, 표면 세포 수용체 CD44를 과다발현하는 질환에서 활성 화합물을 부위로 전달하는데 적합한, HA와 활성 화합물의 접합체를 기반으로하는 새로운 화합물을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은, CD44의 발현과 관련성이 높은 염증 질환을 치료하는데 사용되는 약물이 글리코사미노글리칸과 접합된 화합물을 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명의 과제는 글리코사미노글리칸과 활성 화합물로부터 유래된 접합체로 이루어진 화합물로서, 활성 화합물은 관능기를 이용해 글리코사미노글리칸, 이의 유도체 또는 염의 카르복시 기에 접합되어 공유 결합된 접합을 형성하며, 활성 화합물은 항염증제, 항알레르기제 및 스테로이드를 포함한다.
본 발명에 따른 접합체의 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 히알루론산이다.
아울러, 본 발명에 따른 글리코사미노글리칸 접합체는 바람직하게는 염증 질환을 치료하기 위한 것이다.
따라서, 제2 측면에서, 본 발명의 다른 과제는, 글리코사미노글리칸 및 활성 화합물로부터 유래되는 접합체로 이루어진 화합물의 용도로서, 활성 화합물은 관능기를 이용해 글리코사미노글리칸, 이의 유도체 또는 염의 카르복시기에 접합되어 공유 결합된 접합을 형성하며, 활성 화합물은, 염증을 치료하고 치료학적 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위해, 셀레콕십 (celecoxib), 페소페나딘 (Fexofenadine), 부데소니드 (Budesonide) 및 프레드니솔론 (prednisolone)으로 구성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 과제는, 글리코사미노글리칸 및 활성 화합물로부터 유래되는 접합체로 이루어진 화합물의 제조 방법으로서, 활성 화합물은 관능기를 이용해 글리코사미노글리칸, 이의 유도체 또는 염의 카르복시기에 접합되어 공유 결합된 접합을 형성하며, 활성 화합물은 셀레콕십, 페소페나딘, 부데소니드 및 프레드니솔론으로 구성된다.
본 발명을 충분히 설명하기 위해, 구현예들에 대한 언급이 첨부된 도면에 예시된다. 이들 도면은 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 그 범위를 한정하는 것으로 간주되지 않는다.
도 1은 정상 결장 조직 및 손상 결장 조직에서 형광 지수에 의해 히알루론산 (HA)의 친화성을 도시한 것이고;
도 2는 여러가지 시간 코스로 HCT15 세포주와 HT29 세포주에 작용하는 HA-염료 화합물의 형광 결과를 도시한 것으로, 도 2A는 6시간 경과시 HCT15 세포주를 나타낸 것이고; 도 2B는 12시간 경과시 HCT15 세포주를 나타낸 것이고; 도 2C는 6시간 경과시 HT29 세포주를 나타낸 것이고; 도 2D는 12시간 경과시 HT29 세포주를 나타낸 것이다.
도 3은 HA-셀레콕십 접합체의 구조를 도시한 것이다.
도 4는 Raw 264.7 세포주에 대한 대조군, 리포폴리사카라이드 (LPS), HA, 셀레콕십 (Cele) 및 HA-셀레콕십 접합체 (HA-cele)의 항염증 효과를 도시한 것이다. 본원의 염증 지수는 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 함량 변화%이다.
도 5는 HA-ADH-부데소니드 접합체의 구조를 도시한 것이다.
도 6은 Raw 264.7 세포주에서 대조군 (ctrl), LPS, HA, HA + LPS (HA+LPS), 부데소니드 (bude.), 부데소니드 + LPS (bude+LPS), HA-부데소니드 접합체 (HA-bude, "HA-bude"는 "HA-ADH-부데소니드"를 지칭함) 및 HA-부데소니드 접합체 + LPS (HA-bude+LPS)의 항염증 효과를 도시한 것이다. 본원의 염증 지수는 아질산염 (NO)의 농도 변화이다.
도 7은 HA-ADH-페소페나딘 접합체의 구조를 도시한 것이다.
도 8은 Raw 264.7 세포주에 대한 대조군, LPS, HA, 페소페나딘 (Fexo), 및 HA-페소페나딘 접합체 (HA-fexo, "HA-fexo"는 "HA-ADH-페소페나딘"을 지칭함)의 항염증 효과를 도시한 것이다. 여기서 염증 지수는 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 함량 변화 %이다.
도 9는 HA-ADH-프레드니솔론 접합체의 구조를 도시한 것이다.
도 10은 Raw 264.7 세포주에 대한 대조군, LPS, HA, 프레드니솔론 (Pred) 및 HA-프레드니솔론 접합체 (HA-pred, "HA-pred"는 "HA-ADH-프레드니솔론"을 지칭함)의 항염증 효과를 도시한 것이다. 여기서 염증 지수는 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 함량 변화 %이다.
도 11은 대조군 (비히클), 프레드니솔론 (Pred), HA와 프레드니솔론의 접합체 (HA-ADH-Pred) 및 HA에 의한 류마티스 관절염 (RA)의 치료 효과를 도시한 것이다. 여기서 치료 지수는 발 두께 변화 % (평균 ± SE)이다. D1 - D13 동안 RA를 유도하기 위해 랫에게 식이시키고, D14일에 투여하였다. 데이타는 비-모수적 통계에 의해 계산하였다, * p<0.05 vs. 비히클 대조군; # p<0.05 vs. Prep 군 및 & p<0.05 vs. HA 군.
도 12는 대조군 (비히클), 프레드니솔론 (Pred), HA와 프레드니솔론의 접합체 (HA-ADH-Pred) 및 HA에 의한 류마티스 관절염 (RA)의 치료 효과를 도시한 것이다. 여기서 치료 지수는 발목 둘레의 변화 % (평균 ± SE)이다. D1 - D13 동안 RA를 유도하기 위해 랫에게 식이시키고, D14일에 투여하였다. 데이타는 비-모수적 통계에 의해 계산하였다, * p<0.05 vs. 비히클 대조군; # p<0.05 vs. Prep 군 및 & p<0.05 vs. HA 군.
본 발명의 다른 목적, 이점 및 새로운 특징들은 아래 상세한 설명을 첨부된 도면을 함께 취함으로써 더욱 명확해질 것이다.
통상적으로, 경구 투여되거나 또는 순환계로 주입되는 약물은 타겟 치료 부위로 직접 도달하여야 하지만, 농도 및 특이성이 타겟 부위에서 그렇게 높지 않기 때문에 타겟 질환 및 정상 장기에 대한 약물 효과가 매우 유사하며, 안전성 프로파일이 제한적이다.
동일하면서도 우수한 안전성 프로파일을 겸비하는 치료 효과를 향상시키기 위해, 한가지 전략은 약물에 담체를 공유 결합시킴으로써 약물이 질환 부위에 대한 타겟 선택성이 더 높도록 변형시키는 것이다. 이는, 특히 기존에 예상된 바와 같이, 항염증 치료 분야에서 특히 요구된다.
이를 위해, 본 발명자는 활성 물질을 타겟 전달하기 위해 히알루론산 (HA)과 이의 수용체 CD44 간의 상호작용을 조사하고자 하는 아이디어를 생각하게 되었다.
정상 조직 또는 장기와 비교해 타겟 부위에 대해 약물을 상대적으로 고 농도로 유지하고자 하는 아이디어는 이후의 HA에 대한 장기간 연구와 실험을 통해 본 발명자에 의해 확립되었다.
본 발명의 기원이 되는 이러한 결과는 실시예들에 충분히 기술되어 있으며, 이후 간략하게 요약 개시된다.
실제, 본 발명은, 여러가지 평균 분자량 (MW)을 가진 히알루론산이 정상 조직에 비해 손상된 조직에 대해 증가된 부착 지수를 가지며 저분자량의 HA가 평균 분자량이 높은 HA에 비해 성능이 우수하다는 것을 보여주는, 결과로부터 근거를 확보한다. 특히, 도 1에 도시된 바와 같이, 손상된 결장 조직 상에 부착된 3가지 평균 분자량의 HA들에서 차이를 비교해 보면, 손상된 결장 조직에서 350 KDa HA 부착을 표시하는 형광 지수가 다른 2가지 평균 분자량 (2000 KDa = 2 MDa) 및 (1000 KDa = 1 MDa)의 HA들 보다 더 높았다. 나아가, 심지어 정상 조직 또는 손상된 결장 조직에서 1 MDa HA 부착에 대한 형광 지수가 2 MDa HA 보다 더 높았다. 이러한 결과는, HA가 특히 염증 부위에 부착할 수 있다는 것을 검증해주며, 이는 본 발명자가 본 발명을 추가로 발명하고 HA와 이의 표면 세포 수용체 CD44 간의 상호작용으로 인한 것으로 추정되는 히알루론산의 이러한 특이한 조직 부착 특징이 이 글리코사미노글리칸이 다른 화합물과 접합되었을 때에도 유지될 수 있는 지를 확인하게끔 하였다. 이에, 본 발명자는, HA를 CD44가 다량 존재하는 부위에 약물을 인가하기 위한 타겟 전달 비히클로서 사용할 수 있는 지를 확인하기 위해, 약물에 HA를 또한 접합시켰다. 전술한 바와 같이, CD44는 염증, 감염 또는 암이 출현한 상태에서 과다 발현되면, 리간드 HA가 수용체 CD44에 부착하기 때문에, 해당 약물을 타겟 부위에 쉽게 도달하게 하여 상대적으로 고 농도로 체류가능하게 할 수 있다. HA가 염증 부위 또는 CD44가 풍부한 부위에 부착하는 효과와 더불어, 접합된 약물이 타겟 부위에서 특히 모여, 그 부위에 대한 상대적으로 고 농도의 약물로 인해 치료 효능을 강화하며, 그래서 안전성 프로파일이 우수하여 이용되는 약물의 양은 그에 따라 감량가능하다. 약물 또는 염료가 HA와 성공적으로 접합되었는지, 그리고 HA 부착 효과를 추가로 검증하기 위해, 본 발명의 발명자는 HA 상의 염료 접합 (HA-염료) 및 세포주 및 마우스로의 각각 처리를 비롯한 실험을 수행하였다. 도 2A 및 도 2B는 세포주 HCT15 (CD44가 적은 결장직장 선암종)에 대한 여러가지 작업 시간대로 수행한 실험을 나타낸 것이고, 도 2C 및 도 2D는 세포주 HT29 (CD44가 풍부한 결장직장 선암종)에 대한 여러가지 작업 시간대로 수행한 실험을 나타낸 것이다. HT29 (도 2C 및 도 2D)의 결과는, HA-염료가 성공적으로 접합되어 HT29의 CD44가 다량 존재하는 부위에 부착되었으며 (도 2C), 심지어 HT29 세포로 유입되었음 (도 2D)을 보여준다. 이는 본 발명의 아이디어가 적절하며, 또한 약물 또는 염료를 HA에 접합시킬 수 있으며, HA가 CD44에 결합하는 능력을 보유한다는 의미이다.
마우스의 HT29 및 HCT15 세포주에 대한 유리형 염료 (free dye) 및 HA-염료의 결합 조건을 조사하였다. 유리형 염료를 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 그 결과, CD44를 발현하는 2종의 다른 암 세포에 대한 부착 결과에는 어떠한 차이가 없는 것으로 나타났다. HT29의 부착 면적 비율은 50.15%이고, HCT15는 49.86%이다. 그러나, HA가 접합된 염료를 마우스 꼬리 정맥에 주입하였을 때, 더 많은 수의 CD44 발현 암 세포 HT29에서 HA 접합된 염료가 상당한 농축된 것으로 나타났으며, CD44 발현이 적은 HCT15에서는 매우 제한적인 결과가 나타났다. HT29의 부착 면적 비율은 74.15%이고, HCT15는 25.85%이다. 이러한 결과는, 염료에 HA를 결합시키면, CD44 풍부 부위에 HA가 결합하므로 염료의 농도가 증가되었음을, 알 수 있다.
CD44와 관련성이 높은 질환으로는 암, 감염 및 염증을 포함한다. 감염성 병원체로는, 비제한적인 예로는, 일부 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 다세포성 기생 동물 및 프리온이라고 하는 이상 단백질이 있다. 이들 병원체는, 병원체 없이는 감염성 전염병을 유발하지 않는다는 의미에서, 질환 유행의 요인이다. 바람직한 구현예에서, 감염성 질환으로는 하기도 감염, HIV/AIDS, 설사 질환, 결핵, 말라리아, 홍역, 백일해, 파상풍, 수막염, 매독, B형 간염, 패혈증 및 열대성 질환을 포함한다. 염증성 이상 (inflammatory abnormality)은 매우 다양한 인간 질환의 기저가 되는 거대한 일군의 장애이다. 바람직한 구현예에서, 염증 질환으로는 여드름, 알레르기성 질환, 천식, 자가면역 질환, 셀리악병, 만성 전립선염, 사구체신염, 과민증, 염증성 장 질환, 골반 (pelvic), 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 유육종증, 이식 거부 반응, 혈관염 및 간질성 방광염을 포함한다.
명세서와 청구항에서, 본 발명에 사용되는 용어 "약물", "화합물" 또는 "제제"는 항-천식제, 항-히스타민제, 항-감염제, 항-염증제, 항-알레르기제, 항-바이러스제, 면역억제제, NSAID (비-스테로이드계 항염증제) 및 스테로이드를 포함한다. 이 중, 항-알레르기제, 항-감염제, 항-염증제 및 스테로이드가 바람직하다. 항-알레르기제의 대부분은 항-히스타민제, 항-염증제, 소염제 및 스테로이드, 예를 들어, 페소페나딘, 세티리진, 클로르페니라민 말리에이트, 슈도에페드린 및 부데소니드로 나뉠 수 있다. 대부분의 항-감염제는 혈류로 흡수되어 간에서 대사되지 않고 피부나 점막 상에 외용으로 사용되는 국소 항-감염 용도와; 경구를 통해 또는 주입 투여를 통해 내부 장기 감염을 치료하기 위해 사용되는 전신성 항-감염 용도로 나뉠 수 있다. 대부분의 항-염증제는 비-스테로이드계 항-감염제 또는 NSAID, COX-2 길항제 및 스테로이드로 나뉠 수 있다.
다른 구현예에서, 적절한 약물의 예는 항-천식제, 항-진균제, 항-히스타민제, 항-염증제, 항-바이러스제, NSAID 및 이의 스테로이드이다. 바람직한 구현예에서, 살부타몰 등의 항-천식제; 니메술리드, 셀레콕십, 멜로시캄, 디클로페낙 및 피로시캄 등의 NSAID; 페소페나딘 등의 항-알레르기제; 암포테리신 B 등의 항-진균제; 리바바린 등의 항-바이러스제; 및 부데소니드 및 프레드니솔론 등의 스테로이드가 HA에 접합된 것이 바람직하다. 나아가, COX-2 길항제로는 셀레콕십을 포함한다.
본 발명의 목표는 링커 또는 스페이서를 사용하지 않고, HA의 카르복시기, 하이드록시기 또는 아미노기에 의해 HA를 전술한 약물에 결합 또는 접합시켜, 특정 위치에 특정 시간대에 효능 발휘를 달성하는 것이다. 따라서, HA는 약물을 CD44가 풍부한 특정 부위로 운반하기 위한 타겟 전달 비히클로서 보다 나은 치료 효능과 안전성을 발휘할 수 있다.
본원에서, 일반적으로, 용어 "링커" 또는 "스페이서"는 화합물을 구성하는 2 파트를 연결하는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는, 전형적으로, 직접 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, SS, NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH와 같은 유닛 또는 하나 이상의 메틸렌에 O, S, S(O), SO2, NH, NH2, C(O)이 개지되거나 말단에 존재할 수 있는 치환 또는 비치환된 일킬과 같은 원자들로 된 체인을 포함한다. 본 발명의 용어 "링커" 또는 "스페이서"는 생략될 수 있으며, 약물과 HA 사이에 존재하는 모든 화학적 화합물을 의미하며, 이는 화학적으로 또는 효소에 의해 제거될 수 있거나 또는 자발적으로 분해될 수 있으며; 또한 약물을 연결하는데 사용가능한 하나 이상의 다른 기, 예를 들어, 아미노, 티올, 추가의 카르복시 기 등을 포함한다. 링커 또는 스페이서는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 지질일 수 있다.
적합한 링커 또는 스페이서는, 예를 들어, 아디픽 다이하이드라지드 (ADH), 직선형 또는 분지형, 지방족, 방향족 또는 방향지방족) C2-C20 다이카르복시산, 아미노산, 펩타이드를 포함한다.
링커의 역할은 항상 히알루론산과 약물 사이에 암 (arm) 또는 스페이서를 형성하는데 있다. 링커는, 한쪽은 아미드, 카르복시기, 하이드록시기 또는 아미노기 연결을 통해 HA와 결합하고, 다른 한쪽은 임의의 가능한 공유 결합 타입의 결합을 통해 약물과 결합한다.
링커 또는 스페이서가 다이카르복시산인 경우, 약물과 에스테르 결합을 형성하는 카르복시기는 화합물의 하이드록시기일 수 있다. 링커 또는 스페이서가 다이하이드라지드인 경우, HA와 아미드 결합을 형성하는 아미드기는 HA의 유리형 카르복시기일 수 있다. 바람직한 링커 또는 스페이서는 약물에 대한 숙신산, HA에 대한 아디픽 다이하이드라지드이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 글리코사미노글리칸, 바람직하게는 히알루론산과 활성 화합물로부터 유래된 접합체로 이루어진 화합물로서, 활성 화합물이 관능기를 이용해 글리코사미노글리칸, 또는 이의 유도체 또는 염의 카르복시기에 접합되어 공유 결합된 접합을 형성하며, 활성 화합물이 항-염증제, 항-알레르기제 및 스테로이드로 이루어지는, 화합물을 제공한다.
활성 화합물, 즉, COX-2 길항제인 셀레콕십 등의 항-염증제, 페소페나딘 등의 항-알레르기제 및 부데소니드 및 프레드니솔론 등의 스테로이드는, 바람직하게는 HA에 직접 결합하거나, 또는 링커를 통해 HA의 카르복시 관능기와 활성 화합물의 -NH2 기를 이용해 간접적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, HA의 카르복시 관능기들 중 하나와 활성 화합물 간의 직접 또는 링커를 통한 간접적인, 공유 결합된 접합은 아미드 결합 또는 에스테르 결합일 수 있다.
링커를 이용한 간접 접합의 경우, 링커는 다이하이드라지드, 아디픽 다이하이드라지드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 지질, 아미노산 또는 직선형 또는 분지형 지방족, 방향족 또는 방향지방족 C2-C20 다이카르복시산으로부터 선택된다.
접합에 바람직한 HA는 5 kDa 내지 2000 kDa으로 구성되는 범위의 평균 분자량을 가지며, 접합에는 HA의 카르복시기의 40% 이상이 참여한다.
급성 또는 만성 염증이 감염, 상해, 류마티스 관절염 등의 자가면역 질환 또는 알레르기에 의해 유발 또는 초래되는, 급성 또는 만성 염증을 치료하기 위해, 본 발명의 제형 또는 투약 형태에 대한 바람직한 구현예는 경구 또는 순환계로 투여하는 투약 형태를 제형화하기 위해 부형제 및/또는 희석제를 포함한다. 경구 투약 형태에 대한 보다 바람직한 구현예는, 고체 투약 형태, 비제한적인 예로 현탁제와 같은 용액제, 비제한적인 예로 방출 조절형 정제 등의 정제, 및 비제한적인 예로 장용 코팅 캡슐제 등의 캡슐제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 순환계 또는 전신 투여에 대한 보다 바람직한 구현예는 정맥내 (IV), 근육내 (IM) 및 피하 (SC)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
아래 실시예들은 본 발명의 다양한 구현예들을 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 결장 조직에서의 HA 부착 (IVIS 이미지 시스템-vision 3)
절차:
1. 고분자량 소듐 히알루로네이트 분말 (HHA; Mw: 2 MDa; Freda) 0.25 g과 저분자량 소듐 히알루로네이트 분말 (LHA; Mw: 0.35 MDa; Freda) 0.25 g을 각각 PBS 완충액 (포스페이트 완충화된 염수)에 첨가하여 0.5% 용액을 제조한 다음, 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 교반하였다. 중간 분자량의 소듐 히알루로네이트 분말 (MHA; Mw: 1 MDa; Freda) 0.25 g을 PBS 완충액 50 ml에 첨가한 다음 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 교반하여, 아래 단계에 사용하기 위해 준비하였다.
2. 플루오레센트 HA (HA-f)는, (1) 0.39 g MES 유리 산 (2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산, Calbiochem)을 DD 워터 100 ml에 용해하여 제조하였다. (2) 용액 A: 플루오레세인 아민 분말 (이성질체 I, Fluka) 65 mg을 95% EtOH 용액 9 ml에 용해하여, 광 차단 조건에서 10분간 교반하였다. (3) 용액 B: EDC 분말 (N-(3-다이메틸아미노 프로필)-N-에틸 카르보디이미드 하이드로클로라이드, Sigma) 359 mg을 MES 완충액 9 ml에 용해하여 10분 간 교반하였다. (4) 용액 C: NHS 분말 (N-하이드록시숙신이미드, Sigma) 216 mg을 MES 완충액 9 ml에 용해하여 10분간 교반하였다. (5) 용액 A 3 ml을 0.5% HA 용액 50 ml에 천천히 점적하고, 광 차단된 조건에서 10분간 교반하였다. (6) 용액 B 3 ml과 용액 C 5 ml을 단계 (5)의 용액에 별도로 점적하고, 광 차단된 조건에서 10분간 교반하였다. (7) 0.02 M MES 완충액을 단계 (6)의 용액에, 100 ml이 될 때까지 천천히 첨가한 다음, 광 차단된 조건에서 24시간 실온에서 교반하였다. (8) 반응 후 생성물을 투석 용액으로서 5 L dd 워터내 투석 관 (MW: 12000~14000)에 넣어, 광이 차단된 조건 하에 4℃에서 5일간 교반하였고, 투석 용액은 투석 용액에 형광이 검출되지 않을 때까지 12시간 마다 교체하였다. (9) 투석한 후 액체는 50 c.c. 플라스틱 원심분리관에 넣은 후 밤새 -20℃ 냉동고에 보관한 다음, 광 차단된 조건에서 냉동-건조기에서 건조시켰다. (10) 건조된 HA-f 분말은 -20℃ 냉동고에 보관하였다. (11) HA-f 분말 50 mg을 PBS 완충액 10 ml에 천천히 첨가한 다음 분말이 완전히 용해될 때까지 6시간 교반하였다.
3. 7-8주령의 SD-랫 (스프레그-다울리 랫)의 결장 조직을 외과용 메스로 자른 후 PBS 완충액으로 헹군 다음 3-4 cm 길이로 잘라 PBS 완충액에 최종적으로 침지시켰다.
4. 손상된 결장 조직은 칫솔로 20회 길이 방향으로 문지른 다음 PBS 완충액에 젖셔 준비하였다.
5. 정상 결장 조직과 손상된 결장 조직을 12웰 플레이트에 넣고, 각 웰에 0.5 % HA-f 1 ml을 첨가한 후 실온에서 2시간 교반시켰다. 2시간 후 팁으로 Surplus HA-f 용액을 제거한 다음, 10분간 PBS 완충액에 담근 후 PBS 완충액을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다.
6. 헹군 결장 조직을 라이닝 조직이 위를 향하도록 12웰 플레이트에 넣은 후, IVIS (생체내 이미지 시스템, XENOGEN)의 도크 (dock) 위에 두었다. 디폴트 파라미터를 GFP (그린 형광 단백질)로 설정하되, 여기 465 nm, 방출 500 nm로 설정하였으며, 이후 소프트웨어로 이미지를 포착하였다.
7. 모든 값들은 n회 관찰 결과의 평균으로서 계산한다. 조직학적 지수는 스튜던트의 t 검정으로 분석하였다.
결과: 형광 지수를 정량하여, 도 1에서와 같이 정렬하였다. 정상 결장 조직의 형광 지수는 1로 정하였다. 그외 결장 조직 검사는 기준 값에 의해 보정하였다. 그 결과, 동일한 평균 Mw를 가진 HA가 손상된 결장 조직에 정상 결장 조직에 비해 확실히 높은 형광 지수로 부착하는 것으로 나타났다 (P<0.01). 손상된 결장 조직에 부착된 평균 분자량이 서로 다른 3종의 HA들 간의 차이를 비교해 보면, 손상된 결장 조직에 대한 350 KDa HA의 부착 형광 지수가 다른 2가지 평균 분자량 (2 MDa 및 1 MDa)의 HA 보다 명확하게 높았다. 또한, 1 MDa HA는 심지어 정상 또는 손상 결장 조직에 대한 부착 형광 지수가 2 MDa HA 보다 더 높았다.
실시예 2: HA-염료 접합 공정 및 HA-염료 시험관내 이미지
아래 HA-염료 접합 전 공정은 암 조건에서 실시되어야 한다.
HA-ADH의 합성
1. HA (0.34 MDa, 50 mg)을 4 mg/ml 농도가 되게 물에 용해하였다.
2. ADH를 5배 과량 (114.8 mg)으로 상기 용액에 첨가하였다.
3. 0.1 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 4.75로 조정하였다.
4. 다음으로, 1 당량 (25.1 mg)의 EDC를 고체 형태로 첨가하였다. 0.1 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 4.75로 유지시켰다.
5. 15분간 반응시킨 후, 0.1 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 7.0으로 조정함으로써 반응물을 퀀칭하였다.
6. 반응 혼합물을 이후 전처리된 투석 관 (Mw cutoff 3500)에 옮기고, 순차적으로 100 mM NaCl, 4회의 25% EtOH/물 및 물 순으로 충분히 투석하였다. 그런 후, 용액을 0.2 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 막을 통해 여과하여, 급속 냉각시킨 후 동결건조하였다.
7. ADH의 치환도를 1H NMR에 의해 측정하였다.
HA-ADH-FITC 합성
1. HA-ADH (DS=36%) 88 mg을 물 35 ml에 용해하였다.
2. FITC 9.5 mg을 10 ml DMSO에 용해하였다.
3. HA-ADH 용액과 FITC 용액을 혼합하였다.
4. 실온에서 48시간 교반한 후, 용액을 3일간 0.3 M NaCl과 순수 수를 교대로 사용해 MWCO 12000-14000 투석 백에서 투석하였다.
5. 이후, 이 용액을 2일간 냉동-건조하였다.
6. 마지막으로, UV 스펙트럼으로 치환도를 측정하였다.
HA-염료의 시험관내 이미지
(1) 1x105 HT 29 세포와 HCT15 세포 (인간 결장암, CD44 양성 세포)를 3.5 cm 디쉬의 현미경 슬라이드 상에 도말하였다.
(2) 지정된 염료 농도, 1 μM의 HA-염료 (HA: 0.34 MDa)를 각각 지정된 시간 동안 세포에 첨가하였다.
(3) 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 헹군 후 3.7% 포름알데하이드에서 고정하였다.
(4) HA-염료와 세포 간의 상호작용을 공초점 현미경으로 관찰하였다.
결과: 형광 이미지는 HCT15 (도 2A 및 도 2B) 및 HT29 (도 2C 및 도 2D)에서 염료의 부착 부위와 염료의 탑재를 볼 수 있다. 그 결과, 염료가 HA와 성공적으로 접합하여, HA가 HT29의 CD44가 풍부한 부위로 HA-염료가 집중되는 것을 강화하며, HT29에는 HCT15 보다 CD44가 더 많이 존재하여 더욱 강력한 형광성을 나타내는 것으로 확인된다. HA-염료가 세포로의 흡수도 가능한 것으로 입증되었다 (도 2D). HA-염료는 (CD44가 풍부한) HT29에서 6시간 처리 후 축적되었고, 12시간 처리 후 내재화되었다. 이러한 현상은 (CD44가 적은) HCT15에서는 HA-염료를 6시간 또는 12시간 처리한 이후에도 관찰되지 않았다.
실시예 3: HA-셀레콕십 접합체의 합성
절차
1. HA (10K-700KDa) 100 mg을 DD 워터 25 ml에 용해하였다.
2. 테트라부틸암모늄 하이드록사이드 (TBA-OH) 0.8 eq을 HA 용액에 첨가하여 16시간 교반하였다.
3. 용액을 건조시켜 백색 HA-TBA 고형물을 수득하였다.
4. HA-TBA 40 mg을 DD 워터 1 ml에 용해한 다음, EDC 30 mg과 NHS 분말 18 mg을 용액에 첨가하여 실온에서 5분간 교반하였다.
5. 셀레콕십 4 mg을 다이메틸설폭사이드 (DMSO) 용액 2 ml에 용해하였다.
6. 이 혼합물 (HA-TBA, EDC, NHS 및 셀레콕십)을 실온에서 72시간 교반하였다.
7. 혼합물을, DMSO 및 DD 워터 2:1 비율의 용액에서 투석 백 (MWCO: 1200~1400)을 사용해 하루동안 투석하고, 용액은 3회 교체하였다.
8. 혼합물을 다시 투석 백 (MWCO: 1200~1400)을 사용해 0.3 M NaCl에 대해 2일간 투석하였고, 용액은 매일 2회 교체하였다.
9. HA-셀레콕십 용액을 냉동 건조기에서 탈수시켜, HA-셀레콕십 분말을 수득하였다.
결과: 도 3은 HA-셀레콕십 접합체의 구조를 도시한다.
실시예 4: RAW 264.7 세포에 대한 HA-셀레콕십의 시험관내 항-염증 효과
절차
1. Raw 264.7 세포 (1x106 세포/웰, 1000 ㎕)를 24시간 동안 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24웰 배양 플레이트에서 배양하였다.
2. 배지를 10% FBS 함유 DMEM으로 교체하고, 세포에 화합물 (100 nM 셀레콕십, HA-셀레콕십 (100 nM 셀레콕십과 등량), 및 4.9 ㎍/ml HA)을 다양한 농도로 4시간 처리한 다음, 리포폴리사카라이드 (LPS) 1 ㎍/mL을 24시간 처리하였다.
3. 세포 배지를 취합하여, PGE2 측정에 사용하였다.
4. Nunc-Immuno 96-웰 플레이트에 염소 다클론 항-마우스 IgG 이차 항체를 코팅하였다.
5. 세포 배지의 분액을 면역 플레이트에 일차 PGE2 단일클론 항체 및 트레이서 PGE2-아세틸콜리에스테라제와 함께 첨가하여 암 조건 하에 밤새 실온에 두었다.
6. 다음날, 웰에서 흡입하고, 세척 완충액 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) 100 ㎕로 5회 헹구었다.
7. 엘만 시약 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 직광 차단 하에 실온에서 60-90분간 인큐베이션하였다.
8. 부드럽게 회전/흔들기를 수행하여, 발색 소요 시간을 단축시켰다.
9. 412 nm에서 흡광도를 판독하였다.
10. 각 샘플의 PGE2 농도를 PGE2 표준 곡선으로부터 계산하였다.
11. PGE2 함유율%는, 각 샘플의 PGE2 농도를 LPS-처리한 대조군의 값으로 나눈 후 100을 곱하는 함수로서 구하였다.
12. 실제 PGE2 함량은 LPS-처리한 대조군의 경우 1370 ng/ml인 것으로 추정되었다.
결과: 도 4에 나타낸 바와 같이, PGE2의 함량 지수로서 LPS에 의해 염증이 성공적으로 유발되었다. 약물-단독 군 (셀레콕십)은 치료 효과가 있었지만, HA에 셀레콕십을 접합한 경우 (HA-cele) 약물 단독 보다 치료 효과가 우수하였다.
실시예 5: HA-ADH-부데소니드 접합체의 합성
절차
HA-ADH 합성:
1. HA (50 mg)를 4 mg/ml 농도가 되도록 물에 용해하였다.
2. 용액에 ADH를 5배 과량 (114.8 mg)으로 첨가하였다.
3. 반응 혼합물의 pH를 0.1 N HCl을 첨가하여 4.75로 조정하였다.
4. 다음으로, EDC 1 당량 (25.1 mg)을 고체 형태로 첨가하였다. 0.1 N HCl을 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 4.75로 유지시켰다.
5. 15분간 반응시킨 후, 0.1 N NaOH를 첨가하여 반응 혼합물의 pH를 7.0으로 조정함으로써 반응물을 퀀칭하였다.
6. 반응 혼합물을 이후 전처리된 투석 관 (Mw cutoff 3500)에 옮기고, 순차적으로 100 mM NaCl, 4회의 25% EtOH/물 및 물 순으로 충분히 투석하였다. 그런 후, 용액을 0.2 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 막을 통해 여과하여, 급속 냉각시킨 후 동결건조하였다.
7. ADH의 치환도를 1H NMR에 의해 측정하였다.
HA-ADH-부데소니드 합성:
1. 부데소니드 숙시네이트의 카르복시기를 HA-ADH의 아민기에 EDC 및 NHS를 사용해 화학적으로 접합시켜, HA-ADH-부데소니드 숙시네이트를 제조하였다.
2. 부데소니드 숙시네이트 7.4 mg을 1 ml DMSO에 용해하고, EDC 14.5 μmol과 NHS 14.5 μmol이 함유된 순수 수 1 ml과 5분간 반응시켰다.
3. 5분 후, 혼합 용액을 20 mg HA-ADH가 포함된 물: DMSO=1:1(v/v) 공용매 8 ml에 점적 첨가하였다.
4. 혼합 용액을 실온에서 (약 30℃) 24시간 교반하였다.
5. 24시간 후, 용액을 0.3 M NaCl과 순수 수를 교대로 사용해 MWCO 12000-14000 투석 백에서 3일간 투석하였다.
6. 용액을 이후 2일간 동결-건조하여, 4℃에 보관하였다.
7. 마지막으로, 치환도를 1H NMR에 의해 측정하였다.
결과: 도 5는 HA-ADH-부데소니드 접합체의 구조를 보여준다.
실시예 6: RAW 264.7 세포에 대한 HA-ADH-부데소니드의 시험관내 항-염증 효과
절차
1. Raw 264.7 세포를 페놀 레드 (Gibco-BRL, Vienna, Austria)가 무첨가된 배양 배지에 현탁하여 106 세포/ml로 적정한 후, 10 μM 부데소니드, 378 ㎍/ml HA 및 HA-ADH-부데소니드 (10 μM 부데소니드에 해당됨)를 처리하였다.
2. 약물을 4일간 처리한 후, 1 ㎍/mL LPS를 24시간 동안 배지에 첨가하였다.
3. 배지만 처리한 세포는 음성 대조군으로, LPS (1 ㎍/mL) 처리한 세포는 양성 대조군으로 사용하였다.
4. 배양 상층액을 취하여, 그리스 (Griess) 반응에 의해 iNOS 활성 측정을 위해 산화 질소를 축적시켰다.
5. 그리스 시약 (2.5% 인산 중의 1% 설파닐아미드, 0.1% 나프틸에틸렌다이아민 다이하이드로클로라이드) 100 ㎕를 세포 상층액 100 ㎕에 첨가하고, ELISA 마이크로플레이트 리더 (SpectraMax® M2e Multimode Plate Reader, Molecular Devices, USA)로 550 nm에서 발색을 측정하였다.
6. 페놀 레드가 무첨가된 배양 배지에 용해한 소듐 나이트라이트 연속 희석물로 표준 곡선을 구하였다.
결과: 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS-단독 군, HA+LPS 군, bude+LPS 군 및 HA-bude+LPS 군 ("HA-bude"는 "HA-ADH-부데소니드"를 지칭함)을 비교하였을 때, HA+LPS 군과 A-bude+LPS 군은 치료 효과가 있었다. 여기서 염증 지수는 아질산염이다.
실시예 7: HA-ADH-페소페나딘 접합체의 합성
절차
1. 페소페나딘의 카르복시기를 HA-ADH의 아민기에 EDC 및 NHS를 사용해 화학적으로 접합시켜, HA-ADH-페소페나딘을 제조하였다.
2. 페소페나딘 7.8 mg을 1 ml DMSO에 용해하고, EDC 73.3 μmol과 NHS 73.9 μmol이 함유된 순수 수 1 ml과 5분간 반응시켰다.
3. 5분 후, 혼합 용액을 20 mg HA-ADH가 포함된 물: DMSO=1:1(v/v) 공용매 8 ml에 점적 첨가하였다.
4. 혼합 용액을 실온에서 (약 30℃) 24시간 교반하였다.
5. 24시간 후, 용액을 0.3 M NaCl과 순수 수를 교대로 사용해 MWCO 12000-14000 투석 백에서 연속하여 3일간 투석하였다.
6. 용액을 이후 2일간 동결-건조하여, 4℃에 보관하였다.
7. 마지막으로, 치환도를 1H NMR에 의해 측정하였다.
결과: 도 7은 HA-ADH-페소페나딘 접합체의 구조를 보여준다.
실시예 8: RAW 264.7 세포에 대한 HA-ADH-페소페나딘의 시험관내 항-염증 효과
절차
1. Raw 264.7 세포 (1x106 세포/웰, 1000 ㎕)를 24시간 동안 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24웰 배양 플레이트에서 배양하였다.
2. 배지를 10% FBS 함유 DMEM으로 교체하고, 세포에 화합물 (100 μM 페소페나딘, HA-ADH-페소페나딘 (100 μM 페소페나딘과 등량), 및 2.96 mg/ml HA)을 다양한 농도로 4시간 처리한 다음, LPS 1 ㎍/mL을 24시간 처리하였다.
3. 세포 배지를 취합하여, PGE2 측정에 사용하였다.
4. Nunc-Immuno 96-웰 플레이트에 염소 다클론 항-마우스 IgG 이차 항체를 코팅하였다.
5. 세포 배지의 분액을 면역 플레이트에 일차 PGE2 단일클론 항체 및 트레이서 PGE2-아세틸콜리에스테라제와 함께 첨가하여 암 조건 하에 밤새 실온에 두었다.
6. 다음날, 웰에서 흡입하고, 세척 완충액 100 ㎕로 5회 헹구었다.
7. 엘만 시약 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 직광 차단 하에 실온에서 60-90분간 인큐베이션하였다.
8. 부드럽게 회전/흔들기를 수행하여, 발색 소요 시간을 단축시켰다.
9. 412 nm에서 흡광도를 판독하였다.
10. 각 샘플의 PGE2 농도를 PGE2 표준 곡선으로부터 계산하였다.
11. PGE2 함유율%는, 각 샘플의 PGE2 농도를 LPS-처리한 대조군의 값으로 나눈 후 100을 곱하는 함수로서 구하였다.
12. 실제 PGE2 함량은 LPS-처리한 대조군의 경우 1370 ng/ml인 것으로 추정되었다.
결과: 도 8에 나타낸 바와 같이, 약물-단독 군 (페소페나딘)은 치료 효과가 있었지만, HA에 페소페나딘을 접합한 경우 (HA-fexo, "HA-fexo"는 "HA-ADH-페소페나딘"을 지칭함) 약물 단독 보다 치료 효과가 우수하였다.
실시예 9: HA- ADH-프레드니솔론 접합체의 합성
절차
1. 프레드니솔론 21-헤미에스테르 합성:
2. 피리딘 (8 mL) 중의 프레드니솔론 (1 g; 2.77 mmol) 및 숙신산 무수물 (1.125 g; 12.55 mmol) 용액을 실온에서 교반하였다.
3. 24시간 후, 반응 혼합물을 얼음 (25 g), 물 (25 mL) 및 진한 HCl (10 mL)로 된 혼합물에 부었다.
4. 분리된 결정을 여과에 의해 수집하여 물로 헹군 후 톨루엔으로부터 재결정화하여 다시 밤새 건조하였다.
5. 제조된 헤미에스테르를 1H-NMR 분광광도계로 특정화하였다.
HA-ADH-프레드니솔론 헤미에스테르의 합성:
1. 용액 1: EDC 73.3 μmol (14 mg)과 NHS 73.9 μmol (8.5 mg)을 물 1 ml에 첨가하였다.
2. 용액 2: 프레드니솔론 헤미에스테르 14.5 μmol (6.4 mg)을 1 ml DMSO에 용해하였다.
3. 용액 3: HA-ADH (D.S=31%) 20 mg (ADH:14.5 μmol)을 공용매 (물:DMSO =1;1) 8 ml에 용해하였다.
4. 용액 1과 2를 혼합하여 5분 교반하여, 프레드니솔론 헤미에스테르 상의 카르보닐 기를 활성화하였다.
5. 5분 후, 혼합물을 교반 혼합하면서 용액 3에 점적 첨가 (1ml/min)하였다.
6. 혼합한 용액을 실온에서 (약 30℃) 24시간 교반하였다.
7. 24시간 후, 용액을 0.3 M NaCl과 순수 수를 교대로 사용해 MWCO 12000-14000 투석 백에서 3일간 투석하였다.
8. 용액을 이후 2일간 동결-건조하였다.
9. 마지막으로, HA-ADH-Pred의 치환도를 1H NMR에 의해 측정하였다.
결과: 도 9는 HA-ADH-프레드니솔론 접합체의 구조를 보여준다.
실시예 10: RAW 264.7 세포에 대한 HA-ADH-프레드니솔론의 시험관내 항-염증 효과
1. Raw 264.7 세포 (1x106 세포/웰, 1000 ㎕)를 24시간 동안 5% CO2 및 37℃ 조건에서 24웰 배양 플레이트에서 배양하였다.
2. 배지를 10% FBS 함유 DMEM으로 교체하고, 세포에 화합물 (86.7 μM 프레드니솔론, HA-ADH-프레드니솔론 (86.7 μM 프레드니솔론과 등량), 및 70 ㎍/ml HA)을 다양한 농도로 4시간 처리한 다음, LPS 1 ㎍/mL을 24시간 처리하였다.
3. 세포 배지를 취합하여, PGE2 측정에 사용하였다.
4. Nunc-Immuno 96-웰 플레이트에 염소 다클론 항-마우스 IgG 이차 항체를 코팅하였다.
5. 세포 배지의 분액을 면역 플레이트에 일차 PGE2 단일클론 항체 및 트레이서 PGE2-아세틸콜리에스테라제와 함께 첨가하여 암 조건 하에 밤새 실온에 두었다.
6. 다음날, 웰에서 흡입하고, 세척 완충액 100 ㎕로 5회 헹구었다.
7. 엘만 시약 200 ㎕를 각 웰에 첨가하여, 직광 차단 하에 실온에서 60-90분간 인큐베이션하였다.
8. 부드럽게 회전/흔들기를 수행하여, 발색 소요 시간을 단축시켰다.
9. 412 nm에서 흡광도를 판독하였다.
10. 각 샘플의 PGE2 농도를 PGE2 표준 곡선으로부터 계산하였다.
11. PGE2 함유율%는, 각 샘플의 PGE2 농도를 LPS-처리한 대조군의 값으로 나눈 후 100을 곱하는 함수로서 구하였다.
12. 실제 PGE2 함량은 LPS-처리한 대조군의 경우 1370 ng/ml인 것으로 추정되었다.
결과: 도 10에 나타낸 바와 같이, 약물-단독 군 (프레드니솔론)은 치료 효과가 있었지만, HA에 프레드니솔론을 접합한 경우 (HA-pred, "HA-pred"는 "HA-ADH-프레드니솔론"을 지칭함) 약물 단독 보다 치료 효과가 우수하였다.
실시예 11: HA-ADH-프레드니솔론에 의한 류마티스 관절염 (RA)에 대한 생체내 치료 효과
절차
1. 8주령의 수컷 스프레그-다울리 랫 (BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) 30마리를 준비하였다. 랫을 무작위로 4개의 군으로 나누었다 (비히클 군과 프레드니솔론 군을 n=9, HA-ADH-프레드니솔론 및 HA 군은 n=6). 타이완 동물 기술 연구소의 설치류 동물 시설소에 케이지 하나에 랫 2마리씩 넣었다.
2. 열 사멸시킨 마이코박테리움 10 mg/mL이 함유된 CFA (완전 프레운드 보강제, 10 mg/mL, Chondrex Inc.) 0.1 mL을 우측 뒷발 발바닥에 피하로 주사하였다.
3. 바늘은 발목 쪽을 향하도록 발바닥 피부 바로 밑으로 삽입하여야 한다: 이는 배액성 슬와 림프절로의 보강제의 전달을 극대화한다.
4. 중증 및 급성 염증은 주사한지 30분 이내에 관찰되며, 3-4일에 최고에 도달하며, 종종 20 - 25일간 지속된다.
5. 프레드니솔론 또는 HA-프레드니솔론 (둘다 10 mg/kg)을 정맥내 주사하거나, 또는 대조군으로서 식염수를 주사하여, 보강제-유발성 관절염 (AIA)를 유도한 후 14일째에, 랫을 치료하였다.
6. 치료 후 20일째에 랫을 희생시키고, 이후 조직들을 분리하였다.
관절염 측정:
발 두께와 발목 둘레: 발 두께는 Mitsutoyo digimatic 캘리퍼 등의 캘리퍼를 사용해 발 직경을 측정함으로써 측성하였다. 발목 둘레는 좌우 직경 (a)과 앞뒤 직경 (b)로 2개의 수직 직경을 디지탈 캘리퍼를 사용해 측정하고 식: 원주 =
Figure pct00001
으로 계산하여, 측정하였다.
결과: 도 11에 나타낸 바와 같이, RA가 성공적으로 유도되었다. 약물 투여 첫날 (14일), HA-단독 군은 발 두께의 변화인 지표 측면에서 대조군 (비히클)과 비교해 거의 동일한 경향을 가진다. 약물-단독 군 (프레드니솔론)은 치료 효과를 나타내었다. 그러나, 약물이 HA와 접합된 경우 ((HA-ADH-Pred), 이의 치료 효과는 약물 단독 군에 비해 훨씬 우수하였으며, 통계적으로 유의하였다. 또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, HA는 단독으로 이러한 지표 (발목 둘레의 변화) 측면에서 RA 증상을 심지어 강화하지만, 약물에 HA가 접합된 경우 (HA-ADH-Pred 군)에는 이의 치료 효과가 약물 단독 군 보다 우수하였고, 통계적으로 유의하였다.

Claims (19)

  1. 글리코사미노글리칸 및 활성 화합물로부터 유래된 접합체로 이루어진 화합물로서,
    상기 활성 화합물은 상기 글리코사미노글리칸 또는 이의 유도체 또는 염의 카르복시기에 관능기를 이용해 접합되어, 공유 결합된 접합을 형성하며,
    상기 활성 화합물은 항-염증제 (anti-inflammatory drug), 항-알레르기제 (anti-allergy drug) 및 스테로이드로 이루어지는, 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-염증제가 COX-2 길항제인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 COX-2 길항제가 셀레콕십 (Celecoxib)인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항-알레르기제가 페소페나딘 (Fexofenadine)인, 화합물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 스테로이드가 부데소니드 (Budesonide) 및 프레드니솔론 (Prednisolone)인, 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 공유 결합된 접합이 아미드 결합 또는 에스테르 결합에 의한 직접 접합인, 화합물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 활성 화합물이 상기 글리코사미노글리칸의 카르복시기에 링커를 통해 간접적으로 접합되는, 화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 링커가 아디픽 다이하이드라지드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 지질, 아미노산 및 직선형 또는 분지형, 지방족, 방향족 또는 방향지방족 (araliphatic) C2-C20 다이카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 글리코사미노글리칸이 히알루론산인, 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 히알루론산의 평균 분자량이 5 kDa 내지 2000 kDa 범위인, 화합물.
  11. 제1항에 있어서,
    급성 염증 또는 만성 염증의 치료에 사용하기 위한 것인, 화합물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 염증이 감염, 상해, 자가면역 질환 또는 알레르기에 의해 유발 또는 초래되는 염증인, 화합물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 자가면역 질환이 류마티스 관절염인, 화합물.
  14. 제1항에 따른 글리코사미노글리칸 및 활성 화합물로부터 유래된 접합체로 이루어진 화합물을 치료학적인 유효량으로 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증의 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 염증이 감염, 상해, 자가면역 질환 또는 알레르기에 의해 유발 또는 초래되는 염증인, 염증의 치료 방법.
  16. 제1항에 따른 글리코사미노글리칸 및 활성 화합물로부터 유래된 접합체 1종 이상을, 1종 이상의 부형제 및/또는 희석제와 조합하여 포함하는, 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 조성물이 염증을 치료하기 위한 것인, 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 염증이 감염, 상해, 자가면역 질환 또는 알레르기에 의해 유발 또는 초래되는 염증인, 약학 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 조성물이 경구 또는 주입 투여용으로 설계된 것인, 약학 조성물.
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