TWI577378B - Glycosaminoglycan compounds and pharmaceutical compositions and uses thereof - Google Patents

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TWI577378B TW103129270A TW103129270A TWI577378B TW I577378 B TWI577378 B TW I577378B TW 103129270 A TW103129270 A TW 103129270A TW 103129270 A TW103129270 A TW 103129270A TW I577378 B TWI577378 B TW I577378B
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糖胺聚醣化合物及其醫藥組合物與用途
本發明係關於一種化合物，其係由一糖胺聚醣以及一藥物鍵結所形成；本發明亦關於包含該化合物之醫藥組合物；本發明亦關於所述之醫藥組合物用於治療發炎之用途。
細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是一種具有調節細胞功能以及相互作用以回應刺激之動態組合。其中一種細胞外基質大分子糖胺聚醣(glycosaminoglycans，GAGs)，其係與生物體正常及不正常的生物過程有關，所述之生物過程包括細胞遷移(migration)、分化(differentiation)、增殖(proliferation)、免疫反應(immune response)和細胞骨架組織(cytoskeletal organization)。
糖胺聚醣係由無支鏈且重複雙醣單元(disaccharide units)所組成。這些雙醣單元包含胺糖(amino sugar)[N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)或N-乙醯半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)]，且雙醣在大多數情況下是硫酸化(sulfated)。所述第二種糖通常是一種糖醛酸(uronic acid)[葡萄糖醛酸(glucuronic acid)或艾杜糖醛酸(iduronic acid)]。由於糖胺聚醣的糖殘基(sugar residue)大部分係羧 基(carboxyl group)或硫酸酯基(sulfate group)而使糖胺聚醣高度帶負電荷，因此，糖胺聚醣具有很強的親水性(hydrophilic)。糖胺聚醣具有高度延展之一致性，且形成之基質可用於空間填充和耐壓縮力。糖胺聚醣可藉由醣殘基之鍵結類型以及硫酸酯基的數目和位置分為4大類，其包括：(1)玻尿酸(hyaluronan，HA)、(2)硫酸軟骨素(chondroitin sulphate)及硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、(3)硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)及肝素(heparin)以及(4)硫酸角質素(keratan sulfate)。
玻尿酸具有不同之英文名稱(hyaluronic acid、hyaluronate或HA)，其係一種最簡單之糖胺聚醣，其係由交替重複的非硫化雙醣單元，尤其是N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)及葡萄糖醛酸(glucuronic acid)所組成，其分子量介於400道爾頓(Dalton，Da)至數百萬道爾頓之間。玻尿酸於所有組織例如皮膚(skin)、軟骨(cartilage)以及眼睛(eye)具有不同數量，並以流體形式存於成體動物，特別是早期胚胎。在關節軟骨(articular cartilage)，玻尿酸可形成一個大聚集對於軟骨功能來說是非常重要的。此外，玻尿酸藉由玻尿酸介導的移動受體(receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM)以及CD44介導細胞移動性(cell motility)和免疫細胞的黏附(immune cell adhesion)。
玻尿酸是由單一玻尿酸合成酶(hyaluronan synthetase，HAS)介導，並於細胞表面之內膜與生長聚合物擠壓至細胞外部而被直接合成。相比之下，其他的糖胺聚 醣係於細胞內合成[例如高爾基體(Golgi apparatus)]，並與一些核心蛋白(core protein)關聯，再藉由胞吐作用(exocytosis)釋放。在脊椎動物活體內組織中，藉由外切糖苷酶(exoglycosidase)[即玻尿酸酶(hyaluronidase)]移除糖即可完成玻尿酸之降解(degradation)。哺乳動物型玻尿酸酶(mammalian-type hyaluronidases)同時具有水解和轉糖苷酶(transglycosidase)活性以降解玻尿酸和軟骨素。在結締組織中，玻尿酸與水的水合作用形成可於組織之間形成空間，從而形成一個有利於細胞運動及增殖的環境。玻尿酸於生物現象諸如快速發展(rapid development)、再生(regeneration)、修復(repair)、胚胎發生(embryogenesis)、胚胎發育(embryological development)，傷口癒合(wound healing)、血管新生(angiogenesis)以及腫瘤發生(tumorigenesis)扮演關鍵作用之角色。
CD44(也稱作Pgp-1、Hermes-3、HCAM或ECMR III)是一種廣泛表現且分子量介於8萬5千道爾頓至9萬道爾頓之醣蛋白。CD44係玻尿酸的主要細胞表面受體。儘管CD44也可辨識某些含有蛋白多醣的硫酸軟骨素，但CD44係與玻尿酸特異性地結合，且CD44在各種細胞及生理功能扮演重要角色，包括與玻尿酸之附著力(adhesion)、玻尿酸降解以及腫瘤轉移(tumor metastasis)。CD44也被證明在細胞外基質的結合、細胞遷移、淋巴細胞激活(lymphocyte activation)，淋巴細胞歸巢(lymphocyte homing)和支氣管平滑肌細胞增殖等扮演重要角色(Günthert et al.,1991,A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells,5；65(1)：13-24)。CD44受體顯示在細胞外結構之可變區域具有一種可選擇性剪接之複雜模式，因此，CD44對於玻尿酸而言，似乎是一個特別重要的白細胞(leukocyte)受體，並可能在哮喘的發病機制扮演相當作用。此外，相較於抗體治療的小鼠，對照組小鼠施予較高玻尿酸濃度可明顯減少實驗性哮喘產生，亦證實CD44於玻尿酸代謝的作用，特別是高分子量玻尿酸分解為發炎前低分子量形式。由於玻尿酸衍生的寡糖可結合並激活類Toll受體(Toll-like receptor)，因此，對於抗CD44之治療具有利顯著正面的影響。
玻尿酸-CD44相互作用可能在發育、發炎、T細胞的募集(recruitment)與活化、肺部炎症(lung inflammation)、腫瘤生長和轉移中發揮重要作用。
具有特定剔除之標準CD44及所有亞型(isoforms)之小鼠係正常發育。研究推測，CD44在類風濕關節炎(rheumatoid arthritis)以及T細胞外滲至組織發炎部位中扮演重要角色。CD44可能在小鼠過敏原誘導的氣道炎中，招募發炎細胞而扮演重要的作用。CD44被認為在在調節慢性發炎症有重要的作用，顯示CD44在獨立地調節巨噬細胞活化與玻尿酸之相互作用具有關鍵作用。(Dianhua Jiang,Hyaluronan in Tissue Injury and Repair,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2007；23：435-61)
控制發炎以及免疫反應係治療廣泛疾病之關鍵。CD44提供活化的淋巴細胞對血管內皮細胞和平滑肌細胞的黏附。此外，CD44之結合誘導活化發炎及血管細胞
玻尿酸係CD44主要配體(ligand)，上調控(upregulat)apoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化(atherosclerotic lesions)以及玻尿酸刺激細胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)之低分子量發炎前形式表現以及初級主動脈平滑肌細胞(primary aortic smooth muscle cells)培養之增殖。而高分子量形式的玻尿酸可抑制平滑肌細胞增殖。半乳糖凝集素-9(Galectin-9,GAL-9)可降低呼吸道過度敏感(airway hyperresponsiveness,AHR)以及Th2相關的呼吸道發炎。此外，施用半乳糖凝集素-9以及抗CD44單株抗體可抑制周邊血Th2細胞浸潤至呼吸道。有趣的是，半乳糖凝集素-9直接與CD44黏附分子結合並抑制與玻尿酸之相互作用。
類似的概念，CD44-玻尿酸的相互作用介導T細胞進入肺部之遷移，半乳糖凝集素-9亦阻止BW5147小鼠T細胞藉由CD44依賴(CD44-dependent)與HA黏附。結論即為藉由調節細胞外基質之CD44依賴性白細胞辨識，半乳糖凝集素-9可抑制呼吸道發炎及AHR(Shigeki Katoh,et al.,Galectin-9 Inhibits CD44-Hyaluronan Interaction and Suppresses a Murine Model of Allergic Asthma,American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2007 Jul 1；176(1)：27-35)。
CD44會在自體免疫疾病(autoimmune disease)中表現，例如全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風濕關節炎(rheumatoid arthriti，RA)，修格蘭症候群(Sjögren's syndrome，SS，又稱乾燥綜 合徵)、炎症性腸疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、關節黏連性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、牛皮癬(psoriasis)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)、脈管炎(vasculitis)及貝賽特氏症(Behcet’s disease，BD)。全身性紅斑狼瘡是一種自體免疫性原型的疾病，影響多器官系統。越來越多的證據顯示，玻尿酸與細胞表面受體CD44之相互作用在SLE介導的致病機制中扮演重要角色(Yung S and Chan TM,The Role of Hyaluronan and CD44 in the Pathogenesis of Lupus Nephritis,Autoimmune Dis.Volume 2012(2012),Article ID 207190,9 pages)。類風濕關節炎(RA)是一種常見的自體免疫性疾病，導致患者的滑液關節(synovial joints)的發炎。雖然類風濕關節炎影響的人口約1%並被歸類為一種自體免疫性疾病，但它誘發失去免疫耐受性(tolerance)之機制仍未被證實(Patrick J.Mott,CD44 Antibodies and Immune Thrombocytopenia in the Amelioration of Murine Inflammatory Arthritis,PLoS One,2013,8(6)：e65805)。修格蘭症候群(SS)是與自體免疫性疾病更相關的疾病，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎(RA)，科學及醫學領域對於修格蘭症候群係嚴重落後，迄今仍在大量的候選基因中努力(John A.Ice,Genetics of Sjögren’s syndrome in the genome-wide association era,J Autoimmun.2012 Aug；39(1-2)：57-63)。關節黏連性脊椎炎(AS)是一種常見且好發於中軸骨(axial skeleton)的發炎性風濕性疾病，影響約0.2%人口。目前的診斷標準係依賴於臨床和影像學複合變 化，平均約需花5至10年的診斷。(Roman Fischer,2011,Discovery of Candidate Serum Proteomic and Metabolomic Biomarkers in Ankylosing Spondylitis,Mol Cell Proteomics,2012 Feb；11(2)：M111.013904)。結果推測，在慢性發症條件下，循環T淋巴細胞影響活化的CD44升高，即可能代表活化循環細胞之致病性重要的亞群可能對於自體免疫疾病或慢性發炎疾病活性提供了可靠的測量標記(Estess P,et al.,1998,Functional activation of lymphocyte CD44 in peripheral blood is a marker of autoimmune disease activity,J Clin Invest.1998 Sep 15；102(6)：1173-82)。包括克隆氏症(Crohn’s disease，CD)及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)之炎症性腸疾病(IBD)的臨床和免疫學特徵與牛皮癬(psoriasis)的特徵類似。全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)發現有常見的易感基因(susceptibility genes)。然而，流行病學評估資料卻顯示牛皮癬、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)與IBD之間風險關係是稀疏的(sparse)。此研究的目的是評估牛皮癬、牛皮癬性關節炎、克隆氏症和潰瘍性結腸炎在美國婦女的事件之關聯性。牛皮癬伴隨牛皮癬性關節炎與克隆氏症的風險增加相關(Wen-Qing Li,2013,Psoriasis,psoriatic arthritis and increased risk of incident Crohn’s disease in US women,Ann Rheum Dis.2013 Jul；72(7)：1200-5)。皮肌炎(DM)是一種結締組織疾病相關的多發性肌炎(polymyositis，PM)(其特徵在於肌肉和皮膚發炎)，而皮肌炎最常影響皮膚和肌肉，它是一種全身性疾病，也可能會影響關節、食道、肺 或少部分影響心臟。血管炎是一種破壞血管的發炎性疾病，無論是動脈和靜脈都會受到影響。目前雖未深入了解血管炎的病理生理學，但已普遍得知血管炎的發炎症狀(Henry S.Su,Vasculitis：Molecular Imaging by Targeting the Inflammatory Enzyme Myeloperoxidase,Radiology,2012 Jan；262(1)：181-90)。貝賽特氏症(BD)係唯一系統性血管炎並同時涉及任何大小的動脈及靜脈，且常發於風濕病診療；在某些情況下，甚至產生重大的併發症而導致致命的後果(M.B.Owlia,2012,Behcet's Disease：New Concepts in Cardiovascular Involvements and Future Direction for Treatment,ISRN Pharmacol,2012：760484)。
干擾素α(Interferon alpha，IFNα)結合聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)已被廣泛地用於丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的治療，並作為一週一次注射製劑。然而，經結合PEG的干擾素α僅具有39%的低功效，且經反覆注射後會引起副作用，其原因可能是由於聚乙二醇之非特異性之輸送。因此，近來發展出特定標的之長效玻尿酸-干擾素α(HA-IFNα)之結合物並用於HCV感染的治療。玻尿酸-干擾素α(HA-IFNα)結合物係由玻尿酸之醛基(aldehyde)與IFNα之N端基團進行偶聯反應所形成，在IFNα之含量應控制在每單一玻尿酸鏈具有2至9分子，且生物交聯(bioconjugation)效率高於95%。
另有研究暗示CD44細菌和宿主細胞之間的相互作用會改變宿主細胞使它們更容易於感染。例如，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，藉由其富含玻尿酸的多醣 膠囊(或細胞壁)與細胞附著。玻尿酸與CD44結合後，進而觸發宿主細胞之蛋白酪氨酸磷酸化(tyrosine phosphorylation)以及細胞骨架重排(cytoskeletal rearrangements)，並引起褶皺(ruffles)及偽足延伸(the extension of lamellipodia)。其結果是，由於緊密連接地的E-cadherin數量減少而使細胞間黏附變鬆，進而使細菌可進入上皮下組織(subepithelial tissue)。
PCT專利WO94/09811案揭示一種CD44用於治療發炎或檢測癌症轉移之用途，並顯示在發炎情況中，CD44被上調控(upregulated)，且CD44胜肽(peptides)能抑制T細胞活化；但未說明可以CD44抑制轉移，亦未說明CD44可用於抑制腫瘤生長或血管生成。世界專利WO99/45942案揭示玻尿酸-結合蛋白和多肽(包括CD44)用於抑制癌症及血管生成相關疾病之用途，該專利案使用軟骨連接蛋白(cartilage link protein)之轉移抑制素(metastatin)片段(3萬8道爾頓)，以及從該片段衍生之玻尿酸-結合肽(HA-binding peptide)以抑制B16小鼠黑色素瘤(melanoma)以及Lewis肺癌之肺轉移(pulmonary metastasis)。玻尿酸-結合肽可抑制B16黑色素瘤於雞CAM之生長以及抑制內皮細胞於玻尿酸之遷移。在上述兩篇文獻中，玻尿酸-結合肽之用途及結合肽與玻尿酸的結合能力具有直接的關係。
美國專利第8,192,744號揭示，可溶性重組CD44玻尿酸結合區(soluble recombinant CD44 hyaluronic acid binding domain，CD44HABD)可抑制雞和老鼠體內之 血管新生，從而可抑制各種原因之人類腫瘤生長；並揭示一種可溶性、非糖基化(non glycosylated)的CD44重組蛋白，以作為一種針對血管細胞表面受體之新的血管生成抑制劑。
因此，現有技術僅揭示了CD44的潛在用途並揭示依賴於HA-CD44相互作用所產生之任何影響。所以，HA-CD44結合物之所有效用是直接依賴於它們本身與玻尿酸結合之能力。
然而，有些藥物仍無法成功與玻尿酸結合並進行進一步的試驗，亦無法確認玻尿酸作為活性化合物的位置傳遞載體之潛在用途。特別的是，現有技術並無顯示細胞表面受體CD44以及活性化合物結合玻尿酸之相互作用可被開發作為一個標的傳遞物，並用於有效治療並改善CD44過度表現之疾病。
本發明之目的在於提供一種新的化合物，其化合物係包括玻尿酸以及適用於位置傳遞之活性化合物，並可用於過度表現細胞表面受體CD44之疾病。
故本發明提供一種糖胺聚醣與藥物鍵結形成之化合物，其中該藥物係用於治療與CD44過度表現呈現高相關之發炎性疾病。
本發明提供一種化合物，其化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物所組成，其中糖胺聚醣及其衍生物或其鹽類的羧基(carboxylic group)與活性化合物之一官能基形成共價鍵結(covalent conjugation)，且活性化合物係包括 抗發炎藥物(anti-inflammatory drug)、抗過敏(anti-allergy)以及類固醇(steroid)。
較佳的，所述之糖胺聚醣係玻尿酸。
較佳的，所述之化合物係用於治療發炎疾病。
本發明更提供一種所述之化合物用於製備治療癌症的醫藥品之用途，其中該化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物經鍵結所組成，其中活性化合物之一官能基係與選自於由糖胺聚醣、糖胺聚醣衍生物以及糖胺聚醣鹽類所組成之群組的羧基(carboxylic group)形成共價鍵結(covalent conjugation)，且活性化合物係由於希樂葆(Celecoxib)、非索非那定(Fexofenadine)、布地奈德(Budesonide)及普賴蘇濃(Prednisolone)所組成，且該活性化合物係用於治療發炎以及用於所述治療之製備。
本發明更提供一種製備由一糖胺聚醣以及一活性化合物所組成之化合物的方法，其中活性化合物之一官能基係與選自於由糖胺聚醣、糖胺聚醣衍生物以及糖胺聚醣鹽類所組成之群組的羧基形成共價鍵結(covalent conjugation)，且該活性化合物係由希樂葆(Celecoxib)、非索非那定(Fexofenadine)、布地奈德(Budesonide)及普賴蘇濃(Prednisolone)所組成。本發明將進一步藉由下面的實施例來做說明，但應明瞭的是，該等實施例僅為說明之用，而不應被視為本發明的實施上的限制。
普遍來說，藥物無論經口服或注射至循環系統必須直接到達其標的治療區域，由於基於安全性考量，藥物濃度及特異性於標的位置並沒那麼高，因此藥物對於目 標疾病和正常器官的效果是非常類似的。
為了改善治療效果以及具有良好的安全性，一種策略是修飾藥物，並將藥物與載體共價鍵結後，使其對於疾病區域更具有標的選擇性(target-selective)，且抗腫瘤治療領域中認為以上事項須加以改善。
為了達成此目的，本發明係藉由玻尿酸及其受體CD44之相互作用以標的傳送活性物質。
本發明藉由維持相對高濃度的藥物於目標位置以及正常組織為器官以建立對於玻尿酸之長期研究及實驗。
本發明結果顯示，相較於正常組織，具有不同平均分子量(average molecular weights)的玻尿酸於受傷組織具有較高的黏附指數，且低平均分子量玻尿酸比高平均分子量玻尿酸具有較佳黏附效果。如圖1所示，比較3種不同平均分子量的玻尿酸於黏附於受傷組織之效果，其中35萬道爾頓玻尿酸的螢光指數相較於其它兩種平均分子量的玻尿酸來的高(平均分子量為2百萬道爾頓(dalton，Da)之玻尿酸以及平均分子量為1百萬道爾頓之玻尿酸)。另外，1百萬道爾頓之玻尿酸無論在正常的或受傷的結腸組織的黏附效果(即螢光指數)皆高於2百萬道爾頓之玻尿酸，此結果證實了玻尿酸可以特異地(specifically)黏附在發炎部位，並促使本發明之發明人藉由玻尿酸黏附於組織之特性及其細胞表面受體CD44相互作用，以維持糖胺聚醣與其他化合物之鍵結。
因此，藉由玻尿酸與藥物結合以驗證玻尿酸是 否可作為標的傳送載體以將藥物傳送至富含CD44之位置。如前所述，當CD44過度表現於發炎、感染或癌症時，由於玻尿酸的配體可附著受體CD44，因此相關的藥物可以很容易地到達並保持在目標位置且維持相對高濃度。基於玻尿酸於發炎部位之附著效果或富含CD44之位置，相對濃度較高之藥物可聚集於標的位置以及提升其治療效果，進而降低藥物使用量以具有較佳的安全性。
為了證實藥物或染料是否成功結合以及進一步驗證玻尿酸附著效果，本發明係將染料與玻尿酸結合後，分別作用於細胞株以及小鼠。圖2A和圖2B分別係HCT15細胞(具有較少CD44表現之結腸直腸腺癌細胞株)於不同時間點上的螢光圖；圖2C和圖2D分別係HT29細胞(具有較多CD44表現之結腸腺癌細胞株)於不同工作時間點上的螢光圖。並由HT29細胞(圖2C和圖2D)的結果顯示，玻尿酸-染料已成功鍵結並附著於HT29之較多CD44表現區域(圖2C)，甚至進入HT29細胞(圖2D)。這表示本發明所述之方法係有效的，也意味著藥物或染料可與玻尿酸鍵結以及玻尿酸具有與CD44結合之能力。
游離染料以及玻尿酸-染料之黏附試驗係藉由小鼠尾靜脈注射游離染料以及玻尿酸-染料並觀察4星期進行實驗。在游離染料之結果顯示，此兩種具有不同CD44表現的腫瘤細胞之黏附結果並無任何差異，其中HT29細胞的附著面積的比例為50.15%，而HCT15細胞是49.86%。然而，當玻尿酸-染料注射於小鼠尾靜脈中，較多CD44表現之HT29細胞呈現出顯著玻尿酸-染料，但較少CD44表 現之HCT15細胞呈現之結果相當有限，其中HT29細胞的附著面積的比例為74.15%，而HCT15細胞的附著面積的比例為25.85%。因此，結果證明，當染料與玻尿酸結合後，由於玻尿酸與富含CD44的位置相結合而使得染料濃度增加。
與CD44表現高度相關的疾病包括癌症、感染及發炎。在本發明之較佳的實施例中，所述之感染包括，但不限於病毒、細菌、真菌、原生動物(protozoa)、多細胞寄生蟲(multicellular parasites)以及病原性蛋白顆粒(異常蛋白)。這些病原體是疾病流行的原因，即沒有病原體就不會有感染疫情發生。在本發明較佳的實施例中，感染性疾病包括下呼吸道感染、HIV/AIDS、腹瀉性疾病、結核病(tuberculosis)、瘧疾(malaria)、麻疹(measles)，百日咳(pertussis)、破傷風(tetanus)、腦膜炎(meningitis)、梅毒(syphilis)、B型肝炎(hepatitis B)、敗血症(sepsis)及熱帶病(tropical diseases)。發炎性異常是一大群疾病包括多種人類疾病。在本發明較佳的實施例中，發炎性疾病，包括座瘡(acne vulgaris)、過敏性疾病、哮喘(asthma)、自體免疫疾病、乳糜瀉(celiac disease)、慢性前列腺炎(chronic prostatitis)、腎小球腎炎(glomerulonephritis)、超敏反應(hypersensitivities)、發炎性腸病(inflammatory bowel diseases)、骨盆炎性疾病(pelvic inflammatory disease)、再灌注損傷(reperfusion injury)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、結節病(sarcoidosis)、移植排斥反應(transplant rejection)、脈管炎(vasculitis)及間質性膀胱炎 (interstitial cystitis)。
依據本發明，用語“藥物”、“化合物”或”藥劑(agent)”係包含抗氣喘藥(anti-asthma drug)、抗組織胺藥(anti-histamine drug)、抗感染藥(anti-infection drug)、抗炎藥、抗過敏藥、抗病毒藥(anti-virus drug)、免疫抑製劑(immunosuppressant)，非固醇類抗發炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)及類固醇。較佳的，所述之藥物為抗過敏藥、抗感染藥、抗消炎藥以及類固醇。大多數抗過敏的藥物可被分為抗組胺劑、抗發炎劑、去充血劑(decongestant)及類固醇，例如非索非那定、西替利嗪(cetirizine)、縮蘋酸氯菲安明(chlorpheniramine maleate)、假麻黃鹼(pseudoephedrine)及布地奈德。大多數抗感染的藥物，可被分為局部抗發炎(即使用於皮膚或粘膜而不進入血流以及不會在肝臟代謝)或全身性抗感染(即藉由口服或注射給藥以治療內部器官感染)。大多數抗發炎的藥物可以分為固醇類抗發炎藥物、非固醇類抗發炎藥物、COX-2拮抗劑及類固醇。
在較佳的實施例中，藥物較佳為抗氣喘藥、抗真菌藥、抗組織胺藥、抗發炎藥、抗病毒藥、非固醇類抗發炎藥物以及類固醇。在另一較佳的實施例中，與玻尿酸結合之抗氣喘藥，包括沙丁胺醇(salbutamol)；與玻尿酸結合之非固醇類抗發炎藥物包括尼美蘇來(Nimesulide)、希樂葆、美洛西卡(Meloxicam)、雙氯芬酸(Diclofenac)及匹洛西卡(Piroxicam)；與玻尿酸結合之抗過敏藥物包括非索非那定；與玻尿酸結合之抗真菌藥物包括雙性殺黴素B (Amphotericin B)；與玻尿酸結合之抗病毒藥物，包括利巴韋林(Ribavirin)；與玻尿酸結合之類固醇，包括布地奈德及普賴蘇濃；此外，COX-2拮抗劑包括希樂葆。
本發明之目的是將玻尿酸與藥物結合或鍵結、連接物(linker)或間隔物(spacer)之有無，並藉由玻尿酸之羧基(carboxyl group)、羥基(hydroxyl group)或氨基(amino group)以於特定時間及位置達成所欲之效果。因此，玻尿酸用於作為標的運輸載體以攜帶藥物至富含CD44之特定部位，其具有較佳的治療效果和安全性。
依據本發明，“連接物”或“間隔物”係指連接化合物兩端之有機部分。連接物通常包括一直鏈或一原子例如氧或硫、一個單元例如雙硫(SS)、胺(NH)、一氧化碳[C(O)]、醯胺[C(O)NH]、一氧化硫(SO)、二氧化硫(SO2)、磺胺(SO2NH)或鏈原子例如取代(substituted)或未取代的烷基(unsubstituted alkyl group)、一個或多個亞甲基(methylenes)可由氧(O)、硫(S)、一氧化硫(SO)二氧化硫(SO2)、胺(NH)、胺(NH2)或一氧化碳[C(O)]中斷或終止。本發明所述之連接物或間隔物可以不存在，亦可於藥物與HA之間提供任何化學化合物，或以化學性、酶或自發地分解，其也包含至少一種用於連接藥物之氨基(amino group)、硫醇基(thiol group)、更多羧基等。連接物或間隔物可以是多肽(polypeptide)、胜肽(peptide)或脂質。
較佳的，所述之連接物或間隔物係含有直鏈或支鏈的脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)或芳脂族(araliphatic)的C2-C20二羧酸(dicarboxylic acids)、胺基酸 或胜肽。
連接物於本發明之作用在於建構玻尿酸與所述藥物之間的橋臂(arm)或間隔。當連接物介於玻尿酸與所述藥物之間時，與玻尿酸鍵結之一側係藉由醯胺(amide)、羧基、羥基(hydroxyl group)或胺基(amino group)與玻尿酸鍵結，與所述藥物鍵結之一側則係以任何可能的共價鍵結(covalent conjugation)。
當連接物或間隔物是二羧酸(dicarboxylic acid)時，該羧酸基團與藥物形成的酯鍵(ester bond)可能是玻尿酸的羥基基團。當連接物或間隔物是二醯肼(dihydrazide)時，胺基可能會與玻尿酸的游離羧基形成醯胺鍵(amide bond)。較佳的，所述之的連接物或間隔物係具有琥珀酸之藥物(succinic acid to drug)，具有己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)之玻尿酸。
在較佳的實施例中，本發明更提供一種化合物，其化合物係由一糖胺聚醣及一活性化合物鍵結所組成，其中活性化合物之一官能基與糖胺聚醣及其衍生物或其鹽類的羧基形成共價鍵結，其中糖胺聚醣係玻尿酸，且活性化合物係選自於抗發炎藥、抗過敏藥及類固醇所組成之群組。
較佳的，所述之活性化合物係抗發炎藥時，其包括希樂葆(一種COX-2拮抗劑)；所述之發炎藥包括非索非那定；所述之類固醇包括布地奈德及普賴蘇濃；活性化合物可藉由連接物，與玻尿酸之羧基及活性物質之胺基直接或間接鍵結。
在另一較佳的實施例中，無論是直接或是藉由連接物之間接鍵結，玻尿酸之羧基與活性物質可形成醯胺鍵或酯鍵。
在間接鍵結中，連接物係選自由二醯肼(dihydrazide)、己二酸二醯肼(adipic dihydrazide)、多肽、胜肽、脂質、胺基酸或含有直鏈或支鏈的脂肪族、芳香族或芳脂族的C2-C20二羧酸所組成之群組。
在另一較佳的實施例中，玻尿酸之平均重量分子量係介於5千道爾頓至200萬道爾頓，且玻尿酸具有至少40%的羧基參與反應。
為了用於治療由感染、損傷、自體免疫疾病(例如類風濕關節炎)或過敏所引起之急性或慢性發炎，本發明所述之較佳藥物劑型包括以一賦形劑及/或稀釋劑配製可用於口或循環系統可使用的劑型。較佳的，所述之口服藥物劑型係選自於由固體劑型、溶液、片劑及膠囊所組成之群組，其中溶液包括，但不限於懸浮液；其中片劑，包括但不限於控釋片劑(controlled-release tablet)；其中膠囊，包括但不限於腸溶塗膠囊(enteric-coated capsule)。更佳的，所述之循環系統或全身給藥形式係選自於由靜脈注射(introvenous，IV)、肌肉注射(intra-muscle，IM)和皮下注射(subcutaneous，SC)所組成的群組。
圖1係將螢光玻尿酸施予正常結腸組織及受傷結腸組織所觀察到之螢光指數柱狀圖(*p<0.05)，其中螢光指數= 結腸組織以玻尿酸處理/正常結腸組織以磷酸鹽緩衝溶液處理。
圖2為玻尿酸(HA)-染料化合物與不同時間點分別作用於HCT15細胞及HT29細胞之螢光圖，其中圖2A為HCT15細胞於6小時之細胞螢光圖、圖2B為HCT15細胞於12小時之細胞螢光圖、圖2C為HT29細胞於6小時之細胞螢光圖、圖2D為HT29細胞於12小時之細胞螢光圖。
圖3為HA-Celecoxib化合物之結構圖。
圖4顯示控制組(即脂多醣)、玻尿酸、希樂葆(即“Cele”)以及玻尿酸-希樂葆(即“HA-cele”)對於RAW264.7細胞的抗發炎效果；此處所指之發炎指標是前列腺素E2(PGE2)之變化含量百分比。
圖5為玻尿酸-己二酸二醯肼-布地奈德(HA-ADH-Budesonide)化合物之結構圖。
圖6顯示控制組(即“ctrl”)、脂多醣(LPS)、玻尿酸、玻尿酸與酯多醣(即“HA+LPS”)、布地奈德(即“bude”)、布地奈德與酯多醣(即“bude+LPS”)、玻尿酸-己二酸二醯肼-布地奈德(即“HA-bude”)以及玻尿酸-己二酸二醯肼-布地奈德與酯多醣(即“HA-bude+LPS”)對於RAW264.7細胞的抗發炎效果；此處所指之發炎指標是一氧化氮(nitrite，NO)之變化含量百分比。
圖7為玻尿酸-己二酸二醯肼-非索非那定(HA-ADH-Fexofenadine)之結構圖。
圖8顯示控制組、脂多醣(LPS)、玻尿酸、非索非那定(即“Fexo”)以及玻尿酸-非索非那定(即“HA-Fexo”)對 於RAW264.7細胞的抗發炎效果；此處所指之發炎指標是前列腺素E2(PGE2)之變化含量百分比。
圖9為玻尿酸-己二酸二醯肼-普賴蘇濃(HA-ADH-Prednisolone)化合物之結構圖。
圖10顯示控制組、脂多醣(LPS)、玻尿酸、普賴蘇濃(即“Pred”)以及玻尿酸-普賴蘇濃(即“HA-Pred”)對於RAW264.7細胞的抗發炎效果；此處所指之發炎指標是前列腺素E2(PGE2)之變化含量百分比。
圖11顯示控制組(載體，即“vehicle”)、普賴蘇濃(即“Pred”)、玻尿酸-普賴蘇濃(即“HA-Pred”)以及玻尿酸、對於類風溼性關節炎之治療效果；此處所指之發炎指標是爪子厚度，大鼠於實驗之第1天至13天被誘導產生類風溼性關節炎，第14天開始施予各組治療，其中數據係藉由無母數統計分析(non-parametric statistics)計算而得，且* p<0.05 vs控制組；# p<0.05 vs普賴蘇濃組以及& p<0.05 vs玻尿酸組。
圖12顯示控制組(載體)、普賴蘇濃(即“Pred”)、玻尿酸-普賴蘇濃(即“HA-Pred”)以及玻尿酸、對於類風溼性關節炎之治療效果；此處所指之發炎指標是腳踝周長，大鼠於實驗之第1天至13天被誘導產生類風溼性關節炎，第14天開始施予各組治療，其中數據係藉由無母數統計分析計算而得，且* p<0.05 vs控制組；# p<0.05 vs普賴蘇濃組以及& p<0.05 vs玻尿酸組。
實施例1 玻尿酸在結腸組織的黏附力(透過第 三版IVIS圖像系統)
步驟：
1.將0.25克高重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為HHA，高重量平均分子量，分子量：2百萬道爾頓，購自Freda)及0.25克低重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為LHA，低重量平均分子量，分子量：35萬道爾頓，購自Freda)分別加入50毫升(mL)磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中，以形成濃度為0.5%的溶液，接著攪拌6小時直到粉末完全溶解。0.25克中重量平均分子量玻尿酸鈉粉末(標示為MHA，中重量平均分子量，分子量：1百萬道爾頓，購自Freda)加入50毫升(mL)磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)中，接著攪拌6小時直到粉末完全溶解
2.螢光玻尿酸(fluorescent HA,HA-f)係由下列方式製備：(1)將0.39克MES游離酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，購自Calbiochem]溶解於100毫升二次水中；(2)A溶液：將65毫克(mg)的螢光胺粉末(fluoresceinamine powder)(異構物I，購自Fluka)溶於9mg之95%酒精溶液中，然後在避光下攪拌10分鐘；(3)B溶液：將359mg EDC粉末[N-(3-Dimethylamino propyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride，購自Sigma]溶於步驟1之9mL MES緩衝液，然後攪拌10分鐘；(4)C溶液：216mg NHS粉末(N-Hydroxysuccinimde，購自Sigma)溶於9mL MES緩衝液，然後攪拌10分鐘；(5)將3mL A溶液緩慢地滴入50mL 0.5%的玻尿酸溶液，然後在避光下 攪拌10分鐘；(6)將3mL B溶液及5mL C溶液分別滴入步驟(5)之溶液，然後在避光下攪拌10分鐘；(7)將0.02M MES緩衝液緩慢地滴入步驟(6)的溶液直到體積達到100毫升，然後在室溫並避光下攪拌24小時；(8)將反應後的產物倒入透析管中(分子量：12000至14000)，以5公升(L)的二次水作為透析液，然後在4℃並避光下攪拌5天，期間每12小時換一次透析液，直到透析液中沒有螢光為止；(9)透析後的液體以50mL塑膠離心管分裝，接著保存在-20℃冰箱過夜，之後在避光下以冷凍乾燥機乾燥；(10)乾燥的螢光玻尿酸粉末保存在-20℃冰箱；(11)將50mg螢光玻尿酸粉末緩慢地加入10mL磷酸鹽緩衝液中，然後攪拌6小時，直到粉末完全溶解。
3.將7周至8周大的SD大鼠(Sprague-Dawley)的結腸組織切下後，以磷酸鹽緩衝液沖洗，再切成3公分至4公分，最後浸泡在磷酸鹽緩衝液中。
4.以牙刷縱向刷結腸組織20次以製備受傷的結腸組織，並將受傷的結腸組織浸泡在磷酸鹽緩衝液中。
5.將正常與受傷的結腸組織放入12孔培養盤中，每孔分別加入1mL之0.5%螢光玻尿酸溶液，然後在室溫下搖晃2小時。過多的螢光玻尿酸溶液在2小時後以微吸管吸除，再浸泡至磷酸鹽緩衝液10分鐘後，移除磷酸鹽緩衝液。重複上述步驟三次。
6.將乾淨的結腸組織之襯裡組織(lining tissue)朝上放置在12孔培養盤中，然後放在活體分子影像系統(in vivo image system，IVIS，購於XENOGEN公司)的平台(dock) 上。出廠參數是設定為螢光綠蛋白(green fluorescent protein,GFP)，激發(excitation)波長設定為465奈米(nm)，而發射(emission)波長設定為500nm，影像再由軟體捕捉。
7.所有顯示的數值係指觀察的平均數。組織學指數(histological index)是利用學生t檢定(Student’s t-test)分析。
結果：圖1顯示螢光指數的定量及排列結果。正常結腸組織的螢光指數定義為1。其他結腸組織再依據定義的數值作校準。結果顯示相同重量平均分子量的玻尿酸，黏附在受傷的結腸組織明顯比在正常結腸組織多(P<0.01)。比較三種不同重量平均分子量玻尿酸黏附在受傷結腸組織的結果後，被吸收的35萬道爾頓玻尿酸之螢光指數明顯高過其他二種玻尿酸(2百萬與1百萬道爾頓)。此外，不論在正常結腸組織或受傷結腸組織中，被吸收的1百萬道爾頓玻尿酸之螢光指數高過2百萬道爾頓玻尿酸。
實施例2 玻尿酸-染料(HA-dye)結合作用過程以及玻尿酸-染料於活體外(in vitro)影像
HA-dye結合作用之整個過程必須避光條件下進行。
1.合成玻尿酸(HA)-己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)包括以下步驟：
(1)重量平均分子量為34萬道爾頓、50mg玻尿酸加入水中，以形成濃度為每毫升4毫克(mg/mL)的溶液。
(2)將超過5倍之114.8mg的ADH加入前述玻 尿酸溶液中。
(3)加入0.1N的氫氯酸(hydrochloric acid，HCl)將酸鹼值(pH值)調整至4.75。
(4)接著，將1當量(25.1mg)之EDC加入前述步驟3之溶液中，並以0.1N的HCl將pH值維持在4.75。
(5)經過15分鐘後，加入0.1N氫氧化鈉(sodium hydroxide，NaOH)以停止反應並將pH值調整為7.0，以獲得一混合物。
(6)將該混合物倒入透析管中(分子量：3500)，以100毫莫耳(mM)的氯化鈉(sodium chloride，NaCl)徹底透析，再以25%乙醇(EtOH)循環4次，最後一次再以水循環。將透析後的溶液以0.2微米(μm)乙酸織維素膜過濾，再快速冷凍並冷凍乾燥。
(7)ADH的取代度(substitution degree)由氫核磁共振光譜圖(1 H nuclear magnetic resonance，1 H NMR)測量。
2.合成HA-ADH-螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate，FITC)包括以下步驟：
(1)將88mg、DS=36%之HA-ADH溶解於35mL水中。
(2)將9.5mg FITC溶解於10mL二甲亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)。
(3)將步驟1之HA-ADH溶液與步驟2之FITC溶液混合。
(4)於室溫歷經48小時後，將步驟3之混合溶 液以0.3莫耳(M)氯化鈉以及純水以及截留分子量(molecular weight cut-off，MWCO)為12000至14000之透析袋交替透析3天。
(5)將步驟4之透析液冷凍乾燥2天
(6)FITC之取代度由用紫外光譜測定。
3.HA-dye於活體外(in vitro)影像
(1)將1×105人類大腸癌細胞株HT29細胞以及HCT15細胞[CD44陽性細胞，CD44 positive cell)]培養於3.5公分細胞培養盤。
(2)將前述1μM of HA-dye(HA為34萬道爾頓)分別於指定時間加入細胞培養盤。
(3)歷經培養後，以PBS清洗細胞並以3.7%甲醛(formaldehyde)固定細胞。
(4)以共軛焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察HA-dye與細胞之表現。
結果顯示：HCT15細胞(圖2A和圖2B)以及HT29細胞(圖2C和圖2D)之附著部位以及染料的量。結果顯示染料已成功與玻尿酸結合，且玻尿酸加強於HT29細胞之富含CD44位置之HA-dye濃度，且HT29細胞因較HCT15細胞具有較多之CD44而具有較強的螢光。亦證明了HA-dye可以進入細胞(圖2D)。HA-dye施予HT29細胞(含較多CD44)6小時後以及12小時後，分別產生積聚(accumulation)以及內化(internalization)現象。但在HCT15細胞(含較少CD44)中於HA-dye施予6小時或12小時後並沒有觀察到此現象。
實施例3 合成玻尿酸-希樂葆(Celecoxib)化合物
合成HA-Celecoxib化合物之步驟如以下所示：
(1)將100mg玻尿酸(分子量為1萬道爾頓至70萬道爾頓)溶解於25mL的DD水。
(2)將0.8eq四丁基氫氧化銨(tetrabutylammonium hydroxide，TBA-OH加入前述(1)所得之玻尿酸溶液中並攪拌16小時。
(3)將前述(2)溶液乾燥已獲得HA-TBA白色固體。
(4)將前述(3)40mgHA-TBA溶於DD水，並加入30mg EDC粉末以及18mg NHS粉末並於室溫攪拌5分鐘。
(5)4mg Celecoxib溶解於2ml DMSO中。
(6)將前述(4)及(5)混合並於室溫攪拌72小時，以獲得一混合物。
(7)將前述(6)所獲得之混合物以2：1之DMSO：DD於透析袋(MWCO為1200至1400)透析，並換3次溶液。
(8)再將前述(7)以0.3M NaCl於透析袋(截流分子量(MWCO)為1200至1400)透析，並於1天換2次溶液。
(9)將前述(8)去水並凍乾後以獲得HA-Celecoxib。
結果顯示：圖3顯示HA-Celecoxib化合物結構。
實施例4 HA-Celecoxib於活體外(In vitro)對於RAW 264.7細胞之抗發炎效果
步驟如以下所示：
(1)RAW 264.7細胞以每孔1×106(1000μl)細胞接種於24孔盤，且於5%CO2、37℃的環境培養24小時。
(2)將培養液換成包含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)之DMEM，且細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中4小時：100nM Celecoxib、等同於100nM Celecoxib之HA-Celecoxib或4.9μg/ml HA，接著再以1μg/mL脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)培養24小時。
(3)收集培養液以測量前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)。
(4)96孔盤(wells-plate)(購自Nunc公司)內塗覆有羊多株小鼠IgG二級抗體。
(5)將等份細胞培養液加入前述孔盤中與一級PGE2單株抗體以及示蹤劑(tracer)PGE2-乙醯膽鹼脂酶(acetylcholinesterase)於黑暗且室溫下過夜放置。
(6)隔天將培養液吸出，並以100μl洗滌液(購自於美國Cayman Chemical公司，Ann Arbor)沖洗5次。
(7)將200μL Elman氏試劑加入前述(6)之孔盤中，並在室溫下培養60分鐘至90分鐘遠離直射光。
(8)將前述(7)孔盤旋轉或搖晃以減少所需顯色的時間。
(9)於波長412nm讀取吸光值。
(10)藉由PGE2標準曲線來計算各樣品之PGE2 濃度。
(11)PGE2量百分率作為各樣品PGE2之濃度，且其中一樣品由LPS處理之組別作為控制組，並將使此值乘以100。
(12)PGE2的實際量估計為1370ng/ml並作為有LPS處理之控制組。
結果顯示：如圖4所示，LPS成功誘導發炎，並PGE2的量作為指標。單獨施予藥物(Celecoxib)具有治療作用；然而，HA與Celecoxib結合(HA-cele)比單獨施予藥物具有較佳的治療效果。
實施例5 合成玻尿酸-己二酸二醯肼-布地奈德(HA-ADH-Budesonide)化合物
合成HA-ADH之步驟如以下所示：
(1)將50mg玻尿酸溶解於水中形成濃度為4mg/ml。
(2)將5倍過量的(114.8mg)ADH加入到前述(1)之溶液中，以形成一混合物。
(3)將0.1N的HCl加入至該混合物以將pH值調節至4.75。
(4)1當量(25.1mg)固體的EDC加入前述(3)中。
(5)歷經15分鐘後，加入0.1N NaOH以調節pH值至7.0並停止反應。
(6)將前述(5)所得產物轉移到經預處理的透析管(MWCO為3500)並以100mM NaCl徹底透析，再以25% 乙醇/水進行4次循環，最後以水透析。然後將溶液通過0.2μm的醋酸纖維素膜(cellulose acetate membrane)，再經快速冷凍並冷凍乾燥過濾。
(7)以1H NMR以測定ADH的取代度。
合成HA-ADH-Budesonide之步驟如以下所示：
(1)HA-ADH-Budesonide琥珀酸鹽(succinate)是由Budesonide琥珀酸鹽的羧基與HA-ADH之胺基經由EDC和NHS化學鍵結所形成。
(2)7.4mg Budesonide琥珀酸溶解於1ml的DMSO中，並用含有14.5μmol的EDC和14.5μmol的NHS之1ml純水進行反應5分鐘，以形成混合液。
(3)將混合液以滴加方式加到含有20mg HA-ADH之助溶劑(8ml水：DMSO=1：1(V/V))中。
(4)將前述(3)於室溫(約30℃)攪拌24小時。
(5)將前述(4)之溶液放入(MWCO為12000-14000)之透析袋中以0.3M NaCl及水交替使用透析3天。
(6)將前述(5)之溶液冷凍乾燥2天並保存於4℃。
(7)藉由1H-NMR測定取代度。
結果顯示：圖5顯示HA-ADH-Budesonide的化合物結構。
實施例6 HA-ADH-Budesonide於活體外(In vitro)對於RAW 264.7細胞之抗發炎效果
步驟如以下所示：
(1)使RAW 264.7細胞以無酚紅培養液(購自於澳洲Gibco-BRL,Vienna公司)懸浮並調整至106/ml)，再分別培養於以下所述劑量的培養液中4小時：10μM Budesonide、378μg/ml HA以及等同於10μM Budesonide之HA-ADH-Budesonide
(2)接著再以1μg/mL LPS培養24小時。
(3)僅以培養液處理的組別作為負控制組，以LPS(1μg/ml)處理的組別作為正控制組。
(4)移除培養液，並以格里斯反應(Griess-reaction)測定一氧化氮(nitric oxide)累積後之iNOS活性。
(5)將100μl格里斯試劑(Griess reagent)(其包含有1%磺胺(sulfanilamide)、2.5%的磷酸(phosphoric acid)中含有0.1%鹽酸萘乙二胺(naphthl ethylenediamine dihydrochloride)加入到100μl的培養上清液並以酵素連結免疫微孔板(ELISA microplate reader)(購自於美國SpectraMax®公司M2e多模式檢測儀)於波長550nm檢測顯色。
(6)以亞硝酸鈉(sodium nitrite)溶解於不含酚紅之培養液中，並經連續稀釋以做成標準曲線。
結果顯示：如圖6所示，HA+LPS的組別以及HA-bude+LPS(“HA-bude”即為“HA-ADH-Budesonide”)相較於單獨施予LPS、bude.+LPS(即Budesonide+LPS)具有治療效果。此處所指之發炎指標是亞硝酸鹽(nitrite)。
實施例7 合成玻尿酸-己二酸二醯肼-非索非那 定(HA-ADH-Fexofenadine)化合物
合成HA-ADH-Fexofenadine之步驟如以下所示：
(1)HA-ADH-Fexofenadine是由Fexofenadine的羧基與HA-ADH之胺基經由EDC和NHS化學鍵結所形成。
(2)7.4mg Fexofenadine溶解於1ml的DMSO中，並用含有73.3μmol的EDC和73.9μmol的NHS之1ml純水進行反應5分鐘，以形成混合液。
(3)將混合液以滴加方式加到含有20mg HA-ADH之助溶劑(8ml水：DMSO=1：1(V/V))中。
(4)將前述(3)於室溫(約30℃)攪拌24小時。
(5)將前述(4)之溶液放入(MWCO為12000-14000)之透析袋中以0.3M NaCl及水交替使用透析3天。
(6)將前述(5)之溶液冷凍乾燥2天並保存於4℃。
(7)藉由1H-NMR測定取代度。
結果顯示：圖7顯示HA-ADH-Fexofenadine的化合物結構。
實施例8 HA-ADH-Fexofenadine於活體外(In vitro)對於RAW 264.7細胞之抗發炎效果
步驟如以下所示：
(1)RAW 264.7細胞以每孔1×106(1000μl)細胞接種於24孔盤，且於5%CO2、37℃的環境培養24小時。
(2)將培養液換成包含10% FBS之DMEM，且細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中4小時：100μM Fexofenadine、等同於100μM Fexofenadine之HA-ADH-Fexofenadine或2.96μg/ml HA，接著再以1μg/mL LPS培養24小時。
(3)收集培養液以測量前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)。
(4)96wells-plate內塗覆有羊多株小鼠IgG二級抗體。
(5)將等份細胞培養液加入前述孔盤中與一級PGE2單株抗體以及示蹤劑PGE2-乙醯膽鹼脂酶於黑暗且室溫下過夜放置。
(6)隔天將培養液吸出，並以100μl洗滌液沖洗5次。
(7)將200μL Elman氏試劑加入前述(6)之孔盤中，並在室溫下培養60分鐘至90分鐘遠離直射光。
(8)將前述(7)孔盤旋轉或搖晃以減少所需顯色的時間。
(9)於波長412nm讀取吸光值。
(10)藉由PGE2標準曲線來計算各樣品之PGE2濃度。
(11)PGE2量百分率作為各樣品PGE2之濃度，且其中一樣品由LPS處理之組別作為控制組，並將使此值乘以100。
(12)PGE2的實際量估計為1370ng/ml並作為 有LPS處理之控制組。
結果顯示：如圖8所示，單獨施予藥物(Fexofenadine)具有治療作用；然而，HA與Fexofenadine結合(“HA-fexo”即為“HA-ADH-Fexofenadine”)比單獨施予藥物具有較佳的治療效果。
實施例9 合成玻尿酸-己二酸二醯肼-普賴蘇濃(HA-ADH-Prednisolone)化合物
合成Prednisolone 21-半酯(hemiester)：
(1)1g(2.77mmol)Prednisolone溶液與1.125克琥珀酸酐(succinic anhydride)(12.55mmol)於8ml吡啶pyridine室溫下攪拌，以形成一混合物。
(2)歷經24小時後，將混合物倒入含有25g冰、25ml水及10ml且濃度為0.1N的鹽酸中。
(3)藉由過濾收集分離的晶體，以水洗滌、乾燥後，再用甲苯(toluene)使其再結晶(recrystallize)，並過夜再次乾燥。
(4)將前述(3)所製得的半酯經1H-NMR譜測量。
合成HA-ADH-Prednisolone hemiester：
(1)溶液1：將14mg EDC(73.3μmol)及8.5mg NHS(73.9μmol)加入1ml水中。
(2)溶液2：將6.4mg Prednisolone hemiester(14.5μmol)溶於1ml DMSO中。
(3)溶液3：20mg HA-ADH(DS=31%)(ADH：14.5μmol)溶於於8ml的共溶劑中(水：DMSO=1：1)。
(4)混合溶液1與溶液2，攪拌5分鐘即可活化Prednisolone hemiester之羰基，並形成一混合物。
(5)5分鐘後，將前述(4)之混合物逐滴加入(速率為1ml/min)溶液3中並攪拌混合。
(6)將前述(5)所得之混合液於室溫(約30℃)攪拌24小時。
(7)將前述(6)所得之溶液以MWCO為12000至14000透析袋及0.3M氯化鈉/純水交替使用透析3天。
(8)將前述(7)所得之溶液冷凍乾燥2天。
(9)藉由1H-NMR測量HA-ADH-Prednisolone之取代度。
結果顯示：如圖9所示，HA-ADH-Prednisolone化合物之結構。
實施例10 HA-ADH-Prednisolone於活體外(In vitro)對於RAW 264.7細胞之抗發炎效果
步驟如以下所示：(1)RAW 264.7細胞以每孔1×106(1000μl)細胞接種於24孔盤，且於5%CO2以及37℃的環境培養24小時。
(2)將培養液換成包含10% FBS之DMEM，且細胞分別培養於以下所述劑量的培養液中4小時：86.7μM Prednisolone、等同於86.7μM Celecoxib之HA-ADH-Prednisolone或70μg/ml HA，接著再以1μg/ml LPS培養24小時。
(3)收集培養液以測量前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)。
(4)96wells-plate內塗覆有羊多株小鼠IgG二級抗體。
(5)將等份細胞培養液加入前述孔盤中與一級PGE2單株抗體以及示蹤劑PGE2-乙醯膽鹼脂酶於黑暗且室溫下過夜放置。
(6)隔天將培養液吸出，並以100μl洗滌液(購自於美國Cayman Chemical公司，Ann Arbor)沖洗5次。
(7)將200μL Elman氏試劑加入前述(6)之孔盤中，並在室溫下培養60分鐘至90分鐘遠離直射光。
(8)將前述(7)孔盤旋轉或搖晃以減少所需顯色的時間。
(9)於波長412nm讀取吸光值。
(10)藉由PGE2標準曲線來計算各樣品之PGE2濃度。
(11)PGE2量百分率作為各樣品PGE2之濃度，且其中一樣品由LPS處理之組別作為控制組，並將使此值乘以100。
(12)PGE2的實際量估計為1370ng/ml並作為有LPS處理之控制組。
結果顯示：如圖10所示，單獨施予藥物(Prednisolone)具有治療作用；然而，HA與Prednisolone結合(“HA-pred”即為“HA-ADH-Prednisolone”)比單獨施予藥物具有較佳的治療效果。
實施例11 HA-ADH-Prednisolone於活體內(In vivo)治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)之效 果
步驟如以下所示：
(1)將30隻8週大Sprague-Dawely(SD)大鼠(購自於台灣BioLASCO公司)隨機分成4組(其中9隻大鼠施予安慰劑，9隻大鼠施予Prednisolone，6隻大鼠施予HA-ADH-Prednisolone以及6隻大鼠施予玻尿酸)，且每兩隻大鼠放同一籠並於台灣動物科技研究所(Institute of Taiwan Animal Technology)。
(2)將0.1ml弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，濃度為10mg/ml，購自於Chondrex公司)，其含有10mg/ml熱滅活(heat-killed)之分枝桿菌(mycobacterium)以皮下注射方式(subcutaneously)注射於大鼠之右後肢之腳墊(footpad)。
(3)針頭應插入腳墊之皮膚下並朝向腳踝的位置
(4)於注射後30分鐘內觀察嚴重且急性發炎，並觀察3天至4天的峰值，且持續20天至25天。
(5)大鼠在佐劑誘導的關節炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)的第14天，以靜脈注射皆為10mg/kg的Prednisolone或HA-Prednisolone，或以生理鹽水作為對照組。
(6)大鼠於治療的第20天犧牲，並分離組織。
測量類風濕性關節炎：
爪子厚度和腳踝周長：藉由游標卡尺(caliper)以測量大鼠爪子厚度，其中游標卡尺之種類例如數位游標 卡尺(Mitutoyo digimatic caliper，購自於三豐公司)。藉由量測2垂直的直徑以測量腳踝周長，其中外側直徑(latero-lateral diameter)為a，前後側徑為b，且腳踝周長計算公式如下=
結果顯示：如圖11所示，類風濕性關節炎已被成功誘導。於開始施予藥物之期間(14天)，單獨施予玻尿酸的組別與對照組(載體)比較，其大鼠之爪子厚度具有相同的趨勢。單獨施予藥物(Prednisolone)顯示治療效果。然而，當藥物與玻尿酸結合後(即HA-Prednisolone)，其治療效果比單獨施予藥物較好，並且具有統計學意義。此外，如圖12所示，由腳踝周長的變化來看，單獨施予玻尿酸甚至會加重類風濕性關節炎的症狀。

Claims (9)

  1. 一種化合物用於製備治療發炎的醫藥品之用途，其步驟包括施予受體一有效劑量的共軛化合物以及其醫藥學上可接受的賦形劑，其中共軛化合物係由一能與CD44細胞表面受體(receptor)結合之配體(ligand)以及一活性化合物所組成，其中該配體係指玻尿酸、玻尿酸衍生物及其鹽類，其中活性化合物之一官能基係與該配體的羧基(carboxylic group)形成共價鍵結(covalent conjugation)，且該活性化合物係布地奈德琥珀酸鹽(Budesonide succinate)及普賴蘇濃琥珀酸鹽(Prednisolone succinate)。
  2. 如請求項1所述之用途，其中共價鍵結是藉由醯胺鍵(amide bond)或酯鍵(ester bond)直接鍵結。
  3. 如請求項1所述之用途，其中活性化合物係藉由一連接物(linker)與玻尿酸之羧基間接鍵結。
  4. 如請求項3所述之用途，其中連接物係選自由己二酸二醯肼(adipic dihydrazide，ADH)、多肽(polypeptide)、胜肽(peptide)、脂質(lipid)、胺基酸(amino acid)以及含有直鏈或支鏈的脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)或芳脂族(araliphatic)的C2-C20二羧酸(dicarboxylic acids)所組成之群組。
  5. 如請求項1所述之用途，其中玻尿酸之平均重量分子量係介於5千道爾頓至200萬道爾頓。
  6. 如請求項1所述之用途，其中共軛化合物係用於治療急性或慢性發炎。
  7. 如請求項6所述之用途，其中發炎係由感染、損傷、 自體免疫疾病或過敏所引起。
  8. 如請求項7所述之用途，其中自體免疫疾病是類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)。
  9. 如請求項1所述之用途，其中醫藥組合物係藉由口服或可注射的方式施予。
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