EA034600B1 - Конъюгаты гиалуроновой кислоты с антагонистами cox-2 и их применение для лечения рака - Google Patents

Конъюгаты гиалуроновой кислоты с антагонистами cox-2 и их применение для лечения рака Download PDF

Info

Publication number
EA034600B1
EA034600B1 EA201690487A EA201690487A EA034600B1 EA 034600 B1 EA034600 B1 EA 034600B1 EA 201690487 A EA201690487 A EA 201690487A EA 201690487 A EA201690487 A EA 201690487A EA 034600 B1 EA034600 B1 EA 034600B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
carcinoma
hyaluronic acid
conjugate
nimesulide
Prior art date
Application number
EA201690487A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690487A1 (ru
Inventor
Хуа-Ян Линь
Original Assignee
Хоули Стоун Баиотек Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Хоули Стоун Баиотек Ко., Лтд. filed Critical Хоули Стоун Баиотек Ко., Лтд.
Publication of EA201690487A1 publication Critical patent/EA201690487A1/ru
Publication of EA034600B1 publication Critical patent/EA034600B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A61K31/635—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide having a heterocyclic ring, e.g. sulfadiazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к конъюгату антагониста COX-2 нимесулида с гликозаминогликаном, таким как гиалуроновая килота (HA), способу его получения, фармацевтической композиции, содержащей данный конъюгат, и к применению конъюгата антагонистов COX-2 нимесулида или целекоксиба с гликозаминогликаном, таким как гиалуроновая килота (HA), для лечения рака. Конъюгат по изобретению может повысить концентрацию лекарственного средства в специфической области заболевания путем взаимодействия гликозаминогликана, используемого в качестве носителя для направленной доставки лекарственного средства, и рецептора поверхности клетки CD44, усиливая таким образом терапевтическую эффективность и снижая системное побочное действие доставленного в данную область лекарственного средства.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конъюгату, состоящему из галуроновой кислоты, которая конъюгирована с лекарственным средством, представляющему собой антагонист COX-2, такой как нимесулид или целекоксиб, к способу его получения, а также к его применению и содержащей его фрамацевтической композиции.
Уровень техники
Внеклеточный матрикс (ЕСМ) представляет собой динамическое скопление взаимодействующих молекул, которое регулирует функции клеток и взаимодействие в ответ на раздражение. Один класс макромолекул внеклеточного матрикса - это гликозаминогликаны, которые представляют собой молекулы, вовлеченные в обширный набор как нормальных, так и анормальных биологических процессов, включая миграцию клеток, дифференцировку, пролиферацию, иммунную реакцию и организацию цитоскелета.
Гликозаминогликаны (GAG) представляют собой неразветвленные полимеры, состоящие из повторяющихся дисахаридных звеньев. Такие дисахаридные звенья всегда содержат аминосахар (Nацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин), который в большинстве случаев сульфирован, а второй сахар, как правило, представляет собой уроновую кислоту (глюкуроновую или идуроновую). GAG являются высоко отрицательно заряженными из-за присутствия карбоксильных или сульфатных групп в большинстве остатков их сахаров, и как таковые, они являются в высокой степени гидрофильными. GAG имеют склонность принимать сильно растянутые конформации и образовывать матрицы, которые заполняют пространство и устойчивы к сжимающим усилиям. Различают четыре основные группы GAG по остаткам их сахаров, типу связи между такими остатками и числу и местоположению сульфатных групп. Они включают (1) гиалуронан, (2) хондроитина сульфат и дерматана сульфат, (3) гепарана сульфат и гепарин и (4) кератана сульфат.
Г иалуронан (также называемый гиалуроновой кислотой или гиалуронатом или HA) является самым простым GAG. Он состоит из регулярной повторяющейся последовательности звеньев несульфированных дисахаридов, а именно N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Его молекулярная масса может составлять от 400 Да (дисахарид) до нескольких миллионов дальтон. Он обнаружен в различных количествах во всех тканях, например в хрящевой ткани, и, в частности, он содержится в коже и глазах, и в большинстве, если не во всех, жидкостях организма взрослых животных. Его особенно много в эмбрионах на ранней стадии развития. В суставном хряще HA может образовывать большое скопление, которое важно для функции хряща. Кроме того, подвижность клетки и адгезия иммунных клеток опосредуются рецептором клеточной поверхности RHAMM (рецептор для подвижности, опосредуемой гиалуронаном) и CD44.
НА синтезируется непосредственно на внутренней мембране поверхности клетки путем выращивания полимера, который вытесняется через мембрану на наружную сторону клетки, по мере того как он синтезируется. Синтез опосредуется одним белковым ферментом гиалуронансинтазой (HAS). Напротив, другие GAG синтезируются внутри клетки в аппарате Гольжди, возможно, в ассоциации с неким коровым белком, и затем высвобождаются путем экзоцитоза. Расщепление HA в тканях позвоночных in vivo опосредуется гиалуронидазой и экзогликозидазами, которые последовательно удаляют сахара. Гиалуронидазы млекопитающих обладают как гидролитической, так и трансгликозидазной активностью и могут расщеплять HA и хондроитин. В соединительной ткани связанная с HA вода создает пространство между тканями, причем таким образом создается окружающая среда, способствующая движению и пролиферации клеток. HA играет ключевую роль в биологических явлениях, связанных с подвижностью клеток, включая быстрое развитие, регенерацию, репарацию, эмбриогенез, эмбрионологическое развитие, заживление ран, ангиогенез и онкогенез.
CD44 (также известный как Pgp-1, Hermes-3, HCAM, ECMR III) представляет собой широко экспрессируемый гликопротеин с молекулярной массой от 85 до 90 кДа. CD44 является главным рецептором поверхности клетки для гликозаминогликана - гиалуроновой кислоты (HA). CD44 специфически связывает HA, хотя им также могут быть узнаны некоторые протеогликаны, содержащие хондроитина сульфат. CD44 играет некую роль в различных клеточных и физиологических функциях, включая адгезию с HA и миграцию на HA, расщепление HA и метастазирование опухоли. Также показано, что CD44 играет роль в связывании внеклеточного матрикса, миграции клеток, активации лимфоцитов, хоминге лимфоцитов и пролиферации клеток гладких бронхиальных мышц (Gunthert et al., 1991, А new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, Cell, 5; 65(1): 13-24). Рецептор CD44 характеризуется сложной картиной альтернативного сплайсинга в своей вариабельной области внеклеточного домена. Оказывается, CD44 является особенно важным рецептором лейкоцитов для HA и поэтому может играть роль в патогенезе астмы. Кроме того, уровни HA, которые повышались при экспериментальной астме у контрольных мышей, заметно ослабевали у мышей, обработанных антителами, что подтверждает роль CD44 в метаболизме HA (конкретно в расщеплении высокомолекулярного HA до провоспалительных низкомолекулярных форм). Это может быть особенно важно, поскольку образовавшиеся из HA олигосахариды могут связывать и активировать Toll-подобный рецептор. Безусловно, наиболее впечатляющей стороной результатов является абсолютная значительность благоприятного действия лечения против CD44.
- 1 034600
Взаимодействия HA-CD44 могут играть важную роль в развитии, воспалении, рекрутинге и активации Т-клеток, воспалении легких и росте и метастазировании опухоли. Измененная экспрессия альтернативно сплайсированных транскриптов CD44 обнаружена при многих онкозаболеваниях, включая рак желудка (F. Reihani-Sabet et al., 2003, Effects of Inflammation and H. pylori Infection on Expression of CD44
Variant Exons in Gastric Tissue, Journal of Sciences, 14: 11-16).
Клетки злокачественной опухоли могут селективно принимать пропорционально больше биоконъюгатов, чем здоровая соединительная ткань или мезенхимные клетки из-за сверхэкспрессии на них рецептора CD44. В некоторых исследованиях усиленный синтез и поглощение HA коррелирует с развитием рака и метастатическим потенциалом. Некоторые опухоли, включая многие из тех, которые обнаружены в легких, сверхэкспрессируют маркер клеточной поверхности CD44. Известно, что клетки рака молочной железы поглощают HA в большей степени, чем здоровые ткани, поскольку им требуется HA для высокой экспрессии P-гликопротеина, вносящего основной вклад во множественную лекарственную устойчивость. Кроме того, клетки инвазивного рака молочной железы сверхэкспрессируют CD44 - основной рецептор для HA, и являются зависимыми от высоких концентраций CD44-интернализованного HA для пролиферации. Таким образом, химиотерапевтические лекарственные наноконъюгаты с HA могут быть эффективными против метастазов в лимфоузлах (Eliaz R.E. et al., 2004, Liposome-encapsulated doxorubicin targeted to CD44: a strategy to kill CD44-overexpressing tumor cells, Cancer Res., 61(6): 2592601).
Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) и селективные ингибиторы циклооксигеназы (COX)-2 являются терапевтическими средствами, обычно используемыми для лечения боли, воспаления и лихорадки. В последнее время все больше опытных данных предполагают, что некоторые NSAID и селективные ингибиторы COX-2 также могут иметь противораковую активность за счет вовлечения во многие биологические события, происходящие в онкогенном процессе.
Например, эпидемиологические исследования показали, что регулярное применение аспирина снижает риск развития рака, в частности толстой кишки (Sandier R.S. et al., 2003, A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas in patients with previous colorectal cancer, New England J. Med., 348: 883-890). Также обнаружено, что антагонист COX-2, такой как целекоксиб, рофекоксиб, нимесулид, мелоксикам и этодолак, также может иметь противораковую активность (Yamazaki R. et al., 2002, Selective cyclooxygenase-2 inhibitors show a differential ability to inhibit proliferation and induce apoptosis of colon adenocarcinoma cells., FEBS Lett., 531(2): 278-84). Кроме того, COX-2 постоянно сверхэкспрессиируется при многих предраковых и злокачественных состояниях и метастазирующих раковых заболеваниях человека, и показано, что при некоторых раковых заболеваниях уровни сверхэкспрессии значимо коррелируют с инвазивностью, прогнозом и продолжительностью существования (Dannenberg A.J. et al., 2003, Targeting cyclooxygenase-2 in human neoplasia: rationale and promise, Cancer Cell, 4(6): 431-6). Максимальная эффективность обычно ограничивается дозой из-за связанной с COX-2 токсичностью; однако на некоторых животных моделях рака толстой кишки, кожи, легких, мочевого пузыря и молочной железы показано, что ингибиторы COX-2 обладают подавляющим опухоль действием (Alane Т. Koki et al., 2002, Celecoxib: A Specific COX-2 Inhibitor With Anticancer Properties, Cancer Control, 9(2 Suppl): 28-35).
В WO 94/09811 описывается применение CD44 при лечении воспаления или для обнаружения раковых метастазов. Авторы показывают, что CD44 положительно регулируется при воспалительных состояниях, и пептиды CD44 способны ингибировать активацию Т-клеток. Однако нет данных или предложений использовать CD44 для ингибирования метастазирования, и не показано и не предлагается применять CD44 для ингибирования роста опухоли или ангиогенеза. В WO 99/45942 раскрывается применение НА-связывающих белков и пептидов, включая CD44, для подавления рака и зависимых от ангиогенеза заболеваний. В этой заявке на патент используется метастатин - 38-кДа фрагмент связующего белка хряща, а также НА-связывающий пептид, полученный из этого фрагмента, для ингибирования метастазов в легких мышиной меланомы B16 и карциномы легких Льюиса. В случае НА-связывающего пептида ингибируется рост меланомы B-16 на куриной CAM и миграция эндотелиальных клеток на HA. В обеих заявках на патент применение НА-связывающих пептидов прямо соотносится с их способностью связывать гиалуроновую кислоту.
В патенте США № 8192744 показано, что растворимый рекомбинантный связывающий гиалуроновую кислоту домен CD44 (CD44HABD) ингибирует ангиогенез in vivo у цыплят и мышей и, следовательно, ингибирует у человека рост опухолей различного происхождения. Изобретение раскрывает растворимые негликозилированные рекомбинантные белки CD44 как новый класс ингибиторов ангиогенеза, основанных на нацеливании на рецептор поверхности клетки.
Таким образом, в цитированных выше работах из уровня техники раскрывается возможное применение CD44 и предполагается, что любое действие может зависеть от взаимодействия HA-CD44. Следовательно, вся полезность, приписываемая до сих пор конъюгату CD44-HA, непосредственно зависит от его способности связывать гиалуроновую кислоту.
Однако некоторые лекарственные средства пока не конъюгированы успешно с HA, и следует продолжать эксперименты для подтверждения возможной пригодности HA в качестве носителя для направленной доставки активного соединения. В частности, в уровне техники не показано, что взаимодействия
- 2 034600 между рецептором поверхности клетки CD44 и конъюгатом HA с активным соединением можно выгодно использовать для целевой доставки такого активного соединения при заболеваниях, характеризующихся сверхэкспрессией CD44, получая при них эффективное терапевтическое улучшение.
В случае патологий, таких как, например, рак, действительно еще существует необходимость поиска доступных терапевтических инструментов, в которых уравновешено эффективное цитотоксическое действие против опухолевых клеток и цитотоксическое действие на здоровые клетки, и имеющих более хорошие профили безопасности.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является конъюгат гиалуроновой кислоты и активного соединения, представляющего собой антагонист COX-2, такой как нимесулид или целекоксиб. В данном конъюгате активное соединение непосредственно конъюгировано посредством амидной связи с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты.
Предпочтительно гиалуроновая кислота имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне 10-2000 кДа.
Указанный конъюгат может использоваться для получения фармацевтической композиции для лечения рака. Причем рак может представлять собой рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, холангиокарциному, холангиоцеллюлярную цистаденокарциному, рак толстой кишки, аденокарциному, лимфому и плоскоклеточный рак, рак молочной железы, дуктальные карциномы, лобулярные карциномы, рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак предстательной железы, рак почек, почечно-клеточный рак, переходно-клеточную карциному, множественную миелому, миелодиспластические синдромы (MDS), ходжкинскую лимфому, не-ходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или карциному поджелудочной железы.
Соответственно в соответствии с настоящим изобретением также предложена фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один указанный конъюгат по изобретению в комбинации с по меньшей мере одним эксципиентом и/или разбавителем. Данная композиция предназначена для лечения рака, в частности рака, который представляет собой рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, холангиокарциному, холангиоцеллюлярную цистаденокарциному, рак толстой кишки, аденокарциному, лимфому и плоскоклеточный рак, рак молочной железы, дуктальные карциномы, лобулярные карциномы, рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак предстательной железы, рак почек, почечно-клеточный рак, переходно-клеточную карциному, множественную миелому, миелодиспластические синдромы (MDS), ходжкинскую лимфому, не-ходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или карциному поджелудочной железы.
Также в соответствии с настоящим изобретением предложен способ получения конъюгата по изобретению, включающий стадии получения водного раствора гиалуроновой кислоты с гидрохлоридом Ы-(3-диметиламинопропил)N-этилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимидом;
получения раствора нимесулида в органическом растворителе;
смешивания и перемешивания обоих растворов при комнатной температуре в течение по меньшей мере 10 ч для получения смешанного раствора и диализа смешанного раствора в течение нескольких дней.
Краткое описание чертежей
Для более полного описания настоящего изобретения характеристика его воплощений иллюстрируется прилагаемыми чертежами. Эти чертежи образуют часть описания. Однако данные чертежи не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.
На фиг. 1 показана аффинность HA с помощью индекса флуоресценции в нормальных и поврежденных тканях толстой кишки.
На фиг. 2 показаны результаты флуоресценции соединения НА-краситель с различным временем воздействия, использованием клеточной линии HCT 15 и клеточной линии HT29, при этом на фиг. 2А представлена клеточная линию HCT 15 через 6 ч; на фиг. 2В представлена клеточная линия HCT 15 через 12 ч; на фиг. 2С представлена клеточная линия HT29 через 6 ч; на фиг. 2D представлена клеточная линия HT29 через 12 ч.
На фиг. 3A показана структура оригинального нимесулида (имеющего группу -NO2, NiNO2) и получения гидрированной модификации (имеющей группу -NH2, NiNH2).
На фиг. 3B показана структура конъюгата HA-NiNH2.
На фиг. 4А показано цитотоксическое действие NiNO2 и NiNH2 или в HT29 или HCT 15.
На фиг. 4В показано цитотоксическое действие NiNO2, NiNH2, HA и конъюгата HA-NiNH2 в HT29.
На фиг. 5А показана общая масса тела мышей в каждой из трех групп в пределах 24 дней.
На фиг. 5В показано подавляющее действие на опухоль у группы контроля, NiNO2 и HA-NiNH2.
На фиг. 6 показана процедура синтеза и структуру НА-целекоксиба.
На фиг. 7А показано цитотоксическое действие HA, целекоксиба и конъюгата НА-целекоксиб на клеточную линию HT29.
На фиг. 7В показано цитотоксическое действие HA, целекоксиба и конъюгата НА-целекоксиб на
- 3 034600 клеточную линию GBM8401.
Подробное описание изобретения
Цели, преимущества и новые особенности изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания, взятого в сочетании с прилагаемыми чертежами.
Как правило, лекарственное средство, вводимое перорально или инъецируемое в кровоток, должно прямо поступать в область, которая является мишенью его воздействия, однако поскольку концентрация и специфичность не столь высоки, действие лекарственного средства на болезнь-мишень и здоровые органы является весьма схожим. Таким образом, введение эффективных количеств активных соединений во многих случаях неполноценно и ограничено их профилями безопасности.
Для того чтобы улучшить эффективность терапии, обеспечив при этом хороший профиль безопасности, по одной стратегии следует модфицировать лекарственное средство, чтобы оно было более мишень-селективным в отношении места заболевания, через ковалентную связь лекарственного средства с носителем. Такая потребность особенно чувствуется в области противораковой терапии, как отмечалось ранее.
С этой целью авторы изобретения задумали использовать взаимодействия между гиалуроновой кислотой (HA) и ее рецептором CD44 для направленной доставки активного вещества.
Намерение поддерживать относительно высокую концентрацию лекарственного средства в намеченном месте в отличие от здоровой ткани или органа закрепилось у авторов после длительных исследований и опытов с HA.
Результаты, из которых возникает настоящее изобретение, полностью описаны в примерах и коротко суммированы далее.
Действительно, настоящее изобретение основано на выявлении того, что гиалуроновая кислота с различной средней молекулярной массой (MW) имеет более высокий индекс адгезии в пораженной ткани, чем в здоровой ткани, и что HA с более низкой средней молекулярной массой имеет качества лучше, чем HA с высокой средней молекулярной массой. В частности, как видно на фиг. 1, при сравнении различий среди HA с тремя средними молекулярными массами, адгезировавшихся на поврежденной ткани толстой кишки, измеряемый флуоресценцией индекс адгезии HA в 350 кДа к поврежденным тканям толстой кишки выше, чем у HA с двумя другими молекулярными массами (2000 кДа = 2 МДа и 1000 кДа = 1 МДа). Далее, измеряемый флуоресценцией индекс адгезии HA в 1 МДа даже к здоровым или поврежденным тканям толстой кишки был выше, чем у HA в 2 МДа. Такой результат подтверждает, что HA может более специфически прикрепляться в месте воспаления, что побудило авторов продолжать работать над настоящим изобретением и удостоверится в том, может ли сохраниться такая исключительная особенность тканевой адгезии гиалуроновой кислоты, вероятно связанная с взаимодействием HA с рецептором поверхности клетки CD44, когда такой гликозаминогликан конъюгирован с другими соединениями.
Поэтому авторы дополнительно конъюгировали лекарственное средство с HA для того, чтобы проверить, можно ли использовать HA в качестве носителя для направленной доставки для сопровождения лекарственного средства к области, изобилующей CD44. Как упоминалось выше, когда CD44 сверхэкспрессируется в ситуации наличия воспаления, инфекции или рака, соответствующее лекарственное средство может легко поступить в намеченное место и оставаться в относительно высокой концентрации там вследствие того, что лиганд HA присоединяется к рецептору CD44. В сочетании с эффектом адгезии HA к области воспаления или области, изобилующей CD44, конъюгированное лекарственное средство должно, в частности, скапливаться на намеченном участке, усиливая эффективность терапии благодаря относительно более высокой концентрации лекарственного средства в этой области, что сочетается со снижением количества используемого лекарственного средства, обеспечивая более хороший профиль безопасности.
Для того чтобы подтвердить, что лекарственное средство или краситель успешно конъюгированы с HA и также подтвердить эффект присоединения HA, авторы настоящего изобретения проводили опыты, включающие конъюгирование красителя с HA (НА-краситель) и введение полученного соединения по отдельности клеточным линиям и мышам. На фиг. 2А и 2В показаны данные опытов с различным временем воздействия на клеточную линию HCT 15 (колоректальная аденокарцинома с меньшим количеством CD44) и на фиг. 2С и 2D показаны данные опытов с различным временем воздействия на клеточную линию HT29 (колоректальная аденокарцинома с большим количеством CD44). Результаты для HT29 (фиг. 2С и 2D) показывают, что НА-краситель успешно конъюгирован, присоединяется к области изобилия CD44 в HT29 (фиг. 2С) и даже проникает в клетки HT29 (фиг. 2D). Это означает, что предположение настоящего изобретения правильное и эффективное, и также означает, что лекарственное средство или краситель можно конъюгировать с HA и что HA сохраняет свою способность связывать CD44.
Особенности присоединения свободного красителя и НА-красителя в клеточных линиях HT29 и HCT у 15 мышей анализировали в течение 4 недель. Свободный краситель инъецировали в хвостовую вену мышей. Результат показывает, что наличие экспрессии CD44 раковыми клетками двух различных видов не сказывается на результате присоединения. Отношение площади присоединения HT29 составляет 50,15%, в то время как HCT 15 составляет 49,86%. Однако, когда в хвостовую вену мышей инъециро
- 4 034600 вали HA, конъюгированную с красителем, у раковых клеток HT29 с более высокой экспрессией CD44 наблюдалась высокая концентрация HA, конъюгированной с красителем, а в HCT 15 с меньшей экспрессией CD44 наблюдался весьма ограниченный результат. Отношение площади присоединения HT29 составляет 74,15%, в то время как HCT 15 составляет 25,85%. Результат указывает на то, что когда краситель конъюгирован с HA, концентрация красителя в некой области может повышаться вследствие присоединения HA к области множества CD44.
Заболевания, тесно связанные с CD44, включают рак, инфекцию и воспаление. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, например, рак включает карциному толстой кишки, фибросаркому, рак молочной железы, аденокарциному и злокачественную глиому головного мозга.
В описании и в формуле изобретения термин лекарственное средство или активное соединение или агент в целях настоящего изобретения может включать противораковое лекарственное средство. Большинство противораковых лекарственных средств можно разделить на алкилирующие средства, антиметаболиты, антрациклины, растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомеразы и иные противораковые лекарственные средства.
В предпочтительном воплощении входящее в конъюгат противораковое лекарственное средство включает целекоксиб и нимесулид.
Нимесулид является одним из наиболее широко используемых селективных антагонистов COX-2, который имеет превосходную безопасность для желудочно-кишечного тракта по сравнению с другими NSAID. В последнее время предполагается, что нимесулид действует как противораковое средство за счет индукции экспрессии р21 - гена-супрессора опухоли и ингибирует у млекопитающих каскад, связанный с рапамицином (mTOR), существенный для роста клеток, пролиферации клеток, подвижности клеток, выживания клеток, синтеза белков раковых клеток (Zhang Y.J. et al., 2011, mTOR signaling is involved in indomethacin and Nimesulide suppression of colorectal cancer cell growth via a COX-2 independent pathway. Ann. Surg. Oncol., 18(2): 580-8).
Целью настоящего изобретения является связывание или конъюгация HA с вышеуказанными лекарственными средствами с линкером или спейсером или без них, с помощью карбоксильной группы, гидроксильной группы или аминогруппы HA для осуществления функционального воздействия в специфической области и на протяжении определенного времени. Следовательно, HA как носитель для направленной доставки для переноса лекарственного средства в специфическую область, в которой имеется множество CD44, может демонстрировать более хорошую эффективность и безопасность лечения.
Используемый в данном описании в основном термин линкер или спейсер обозначает органическую частицу, которая соединяет две части соединения. Линкеры обычно включают прямую связь или атом, такой как атом кислорода или серы, звено, такое как SS, NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, или цепь из атомов, такую как замещенный или незамещенный алкил, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться О, S, S(O), SO2, NH, NH2, С(О). Термин линкер или спейсер в настоящем изобретении может отсутствовать и обозначать любое химическое соединение, присутствующее между лекарственным средством и HA, которое может быть удалено химически, ферментативно или может разлагаться спонтанно; он также содержит по меньшей мере одну другую группу, применимую для соединения лекарственного средства, например амино, тиольную, другую карбоксильную группу и т.д. Линкер или спейсер может представлять собой полипептид, пептид или липид.
Подходящими линкерами или спейсерами являются, например, линейные или разветвленные, алифатические, ароматические или аралифатические дикарбоновые кислоты C2-C20, аминокислоты, пептиды.
Роль линкера, когда он присутствует, состоит в создании плеча или спейсера между гиалуроновой кислотой и лекарственным средством. Линкер обеспечивает, с одной стороны, связь HA через амидную, карбоксильную группу, гидроксильную группу или аминогруппу и, с другой стороны, лекарственного средства через любую возможную связь ковалентного типа.
Когда линкер или спейсер представляет собой дикарбоновую кислоту, ее карбоксильная группа образует эфирную связь с группой лекарственного средства, которая может представлять собой гидроксильную группу. Когда линкер или спейсер представляет собой дигидразид, аминогруппа образует амидную связь с HA с группой, которая может представлять собой карбоксильную группу HA. Предпочтительными линкерами или спейсерами являются янтарная кислота для лекарственного средства и гидразид адипиновой кислоты (ADH) для HA.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к соединению, состоящему из конъюгата гликозаминогликана, предпочтительно гиалуроновой кислоты, и активного соединения, в котором активное соединение конъюгировано посредством функциональной группы с карбоксильной группой гликозаминогликана, его производного или его соли, с образованием ковалентного конъюгата, и в котором активное соединение выбрано из леналидомида, гемцитабина и антагониста COX-2.
Активные соединения антагонисты COX-2 нимесулид или целекоксиб могут связываться предпочтительно непосредственно посредством функциональной карбоксильной группы HA и группы NH2 активных соединений.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения ковалентная конъюгация, или прямая
- 5 034600 или непрямая через линкер, между одной из функциональных карбоксильных групп HA и активным соединением может представлять собой или амидную связь или эфирную связь.
В случае непрямой конъюгации посредством линкера указанные линкеры выбирают из полипептида, пептида, липида, аминокислоты или линейных или разветвленных алифатических, ароматических или аралифатических дикарбоновых кислот C2-C2o.
Предпочтительная HA для конъюгации имеет среднюю молекулярную массу в интервале, заключенном от 10 до 2000 кДа, и конъюгация вовлекает по меньшей мере 40% карбоксильных групп HA.
Конъюгаты гликозаминоглюкана по изобретению предпочтительно предназначены для применения для лечения раковых заболеваний и предпочтительно в самом предпочтительном воплощении настоящего изобретения раковые заболевания выбирают из рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, холангиокарциномы, холангиоцеллюлярной цистаденокарциномы, рака толстой кишки, аденокарциномы, лимфомы и плоскоклеточного рака, рака молочной железы, дуктальных карцином, лобулярных карцином, рака легких, не-мелкоклеточного рака легких, мелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака предстательной железы, рака почек, почечно-клеточного рака, переходно-клеточной карциномы, множественной миеломы, миелодиспластических синдромов (MDS), ходжкинской лимфомы, не-ходжкинской лимфомы, хронического лимфоцитарного лейкоза или карциномы поджелудочной железы.
Следовательно, настоящее изобретение относится к противораковым конъюгатам HA с нимесулидом и HA с целекоксибом, где целекоксиб конъюгирован с HA путем образования амидной связи между группой -NH2 и группой -СООН HA соответственно; кроме того, в случае нимесулида группу -NO2 модифицируют до группы -NH2, так что нимесулид может ковалентно связаться с группой -СООН HA через амидную связь с образованием конъюгата HA-NiNH2. Структуры исходного нимесулида (NiNO2) и получение гидрированием NiNH2 показаны на фиг. 3A, и структура конъюгата HA-NiNH2 показана на фиг. 3B. Структура конъюгата НА-целекоксиб показана на фиг. 6.
Для одного из воплощений настоящего изобретения показано, что цитотоксическое действие оригинального нимесулида (с функциональной нитрогруппой -NO2) в целом лучше, чем действие модифицированного гидрированием продукта (с функциональной аминогруппой -NH2) как в HT29, так и в HCT 15, в особенности в более высокой дозе (фиг. 4А). Однако, когда NiNH2 конъюгирован с HA, цитотоксичность HA-NiNH2 значимо превышает цитотоксичность одного NiNH2 или NiNO2 (фиг. 4В). Такой результат согласуется с результатами, полученными для конъюгата HA с леналидомидом. Следовательно, цитотоксическое действие противораковых лекарственных средств можно усилить путем конъюгации с HA.
Кроме того, при испытании настоящего изобретения на животных показано, что супрессорное действие на опухоль HA-NiNH2 более сильное, чем действие NiNO2 или в контрольной группе (фиг. 5В). Отмечалось, что средняя масса тела мышей в каждой из трех групп является почти одинаковой в пределах 24 дней (фиг. 5А), что указывает на отсутствие значимого вредного действия, такого как потеря массы; однако видно, что объем опухоли значимо различается, причем, когда сравнивают каждую группу контроль, NiNO2 и НА-^ЫЩ в группе HA-NiNH2 имеется лучшее супрессорное действие на опухоль, чем в группе с нимесулидом или контрольной группе (фиг. 5В). Такой результат показывает, что конъюгат HA-NiNH2 по настоящему изобретению имеет превосходное лечебное действие по сравнению с одним NiNO2.
Также показано, что цитотоксическое действие НА-целекоксиба на клетки HT29 и клетки GBM8401 имеет тенденцию быть лучше, чем HA и целекоксиба (фиг. 7А и 7В). В итоге протвоопухолевая эффективность нимесулида, конъюгированного с HA, сравнима с нимесулидом самим по себе, однако существенно улучшено цитотоксическое действие и эффективность супрессии опухоли. Указанные выше результаты показывают, что настоящее изобретение вносит большой вклад в усиление лечебного действия противоракового лекарственного средства, включающего нимесулид.
Для того чтобы лечить от заболевания, предпочтительно в состав препарата или лекарственной формы по настоящему изобретению включают эксципиент для получения состава лекарственной формы для введения в глаза, уши, перорального, назального введения, введения в дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, кровоток или местного применения. Более предпочтительное воплощение пероральной лекарственной формы выбирают из группы, состоящей из твердой лекарственной формы, раствора, включая, но не ограничиваясь указанным, суспензию, таблетки, включая, но не ограничиваясь указанным, таблетку с регулируемым высвобождением, и капсулу, включая, но не ограничиваясь указанным, капсулу с энтеросолюбильным покрытием. Более предпочтительное воплощение формы для введения в желудочно-кишечный тракт выбирают из группы, состоящей из твердой лекарственной формы, перфузии, клизмы, суппозитория и раствора, включая, но не ограничиваясь указанным, суспензию. Более предпочтительное воплощение формы для введения в кровоток или системного введения выбирают из группы, состоящей из внутривенной (IV), внутримышечной (IM) и подкожной (SC) форм. Более предпочтительное воплощение формы для местного введения выбирают из группы, состоящей из перфузии, клизмы, суппозитория, спрея, ингаляции и капель.
Способ получения соединения, состоящего из конъюгата гликозаминогликана и активного фармацевтического соединения, также является объектом изобретения, и он включает стадии
- 6 034600 получения водного раствора гликозаминогликана, предпочтительно гиалуроновой кислоты;
получения водного раствора антагониста COX-2 нимесулида с гидрохлоридом N-(3диметиламинопропил)-Ы-этилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимидом;
смешивания и перемешивания обоих растворов при комнатной температуре в течение по меньшей мере 10 ч для получения смешанного раствора и диализа смешанного раствора в течение нескольких дней.
Следующие далее примеры приводятся в целях пояснения различных воплощений изобретения и не означают какого-либо ограничения настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Адгезия HA к ткани толстой кишки (система получения изображения 3 IVIS).
Процедура.
1. Добавляют 0,25 г порошка высокомолекулярного гиалуроната натрия (ННА; MW 2 МДа; Freda) и 0,25 г порошка низкомолекулярного гиалуроната натрия (LHA; MW 0,35 МДа; Freda) в 50 мл буфера PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) соответственно для образования 0,5% раствора и затем перемешивают в течение 6 ч, пока порошок полностью не растворится. Добавляют 0,25 г порошка среднемолекулярного гиалуроната натрия (МНА; MW 1 МДа; Freda) в 50 мл буфера PBS и затем перемешивают в течение 6 ч, пока порошок не растворится полностью и раствор станет готовым для использования на следующих стадиях.
2. Получают флуоресцентную HA (HA-f) следующим путем: (1) растворяют 0,39 г свободной кислоты MES (2-Щ-морфолино)этансульфоновая кислота, Calbiochem) в 100 мл бидистиллированной воды.
(2) Раствор А: 65 мг порошка флуоресцеинамина (изомер I, Fluka) растворяют в 9 мл 95% раствора этанола (EtOH) и затем перемешивают в течение 10 мин в темноте. (3) Раствор В: 359 мг порошка EDC (гидрохлорид №(3-диметиламинопропил)-Л-этилкарбодиимида, Sigma) растворяют в 9 мл буфера MES и затем перемешивают в течение 10 мин. (4) Раствор С: 216 мг порошка NHS (N-гидроксисукцинимид, Sigma) растворяют в 9 мл буфера MES и затем перемешивают в течение 10 мин. (5) Постепенно 3 мл раствора А добавляют по каплям к 50 мл 0,5% раствора HA и затем перемешивают в течение 10 мин в условиях, когда освещение запрещено. (6) По отдельности 3 мл раствора В и 5 мл раствора С добавляют по каплям к раствору со стадии (5) и затем перемешивают в течение 10 мин в условиях, когда освещение запрещено. (7) К раствору со стадии (6) постепенно добавляют 0,02 М буфер MES до тех пор, пока объем не достигнет 100 мл, и затем перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре в условиях, когда освещение запрещено. (8) Продукт после реакции выливают в диализную трубку (MW 12000-14000) в 5 л деионизованной воды как раствор для диализа и затем перемешивают в течение 5 суток при 4°С в темноте, причем раствор для диализа заменяют каждые 12 ч до тех пор, пока в растворе для диализа не будет отсутствовать флуоресценция. (9) Жидкость после диализа помещают в 50-см3 пластиковые центрифужные пробирки и затем хранят при -20°С в холодильнике в течение ночи, после чего сушат в темноте в установке для сушки вымораживанием. (10) Сухой порошок HA-f хранят в холодильнике при -20°С. (11) Постепенно добавляют 50 мг порошка HA-f в 10 мл буфера PBS и затем перемешивают в течение 6 ч, пока порошок полностью не растворится.
3. Ткань толстой кишки крысы SD (крыса Sprague-Dawley) в возрасте 7-8 недель нарезают скальпелем и затем промывают буфером PBS, затем нарезают длиной 3-4 см и окончательно замачивают в буфере PBS.
4. Поврежденную ткань толстой кишки получают путем легкого касания зубной щеткой в продольном направлении с последующим замачиванием в буфере PBS.
5. Нормальную и поврежденную ткани толстой кишки помещают в 12-луночный планшет, затем в каждую лунку добавляют 1 мл 0,5% раствора HA-f и встряхивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Спустя 2 ч избыток раствора HA-f отсасывают наконечником и затем погружают в буфер PBS на 10 мин с последующим удалением буфера PBS, повторяя 3 раза.
6. Очищенную ткань толстой кишки помещают в 12-луночный планшет выстилкой ткани вверх и затем помещают на платформу IVIS (система получения изображения in vivo, XENOGEN). Параметр по умолчанию выставляют как GFP (зеленый флуоресцентный белок), в то время как длина волны возбуждения 465 нм и испускания 500 нм, и затем регистрируют изображение с помощью программы.
7. Все величины вычисляют как средние из наблюдений. Гистологический индекс анализируют с помощью t-критерия Стьюдента.
Результат.
Индекс флуоресценции количественно определяют и устанавливают, как показано на фиг. 1. Индекс флуоресценции нормальной ткани принимают за 1. Другие испытания с тканями толстой кишки калибруют по установленной величине. Результаты показывают, что HA с одной и той же средней Mw прилипают к поврежденным тканям толстой кишки, что видно по более высоким индексам флуоресценции, чем к нормальным тканям толстой кишки (Р<0,01). При сравнении различия между HA с тремя различными средними молекулярными массами, адгезировавшихся на поврежденных тканях толстой кишки, видно, что измеряемый флуоресценцией индекс адгезии HA в 350 кДа к поврежденным тканям толстой кишки выше, чем у HA с двумя другими средними молекулярными массами (2 и 1 МДа). Далее,
- 7 034600 измеряемый флуоресценцией индекс адгезии НА с 1 МДа даже к нормальным или поврежденным тканям выше, чем HA в 2 МДа.
Пример 2. Процесс конъюгации НА-краситель и получение изображения НА-краситель in vitro.
Процедура.
Весь следующий далее процесс конъюгации НА-краситель должен выдерживаться в темноте.
Синтез HA-ADH.
1. HA (0,34 МДа, 50 мг) растворяют в воде и получают концентрацию 4 мг/мл.
2. В раствор добавляют 5-кратный избыток (114,8 мг) ADH (гидразид адипиновой кислоты).
3. Доводят рН реакционной смеси до 4,75 путем добавления 0,1 N HCl.
4. Затем добавляют 1 экв. (25,1 мг) EDC в твердой форме. Поддерживают рН реакционной смеси 4,75 путем добавления 0,1 N HCl.
5. После 15-минутного взаимодействия реакцию гасят путем добавления 0,1 N раствора NaOH, доводя рН реакционной смеси до 7,0.
6. Затем реакционную смесь переносят в предварительно обработанную диализную трубку (порог Mw 3500) и проводят исчерпывающий диализ против 100 мМ NaCl, затем 4 цикла против смеси 25% EtOH/вода и, наконец, воды. Затем раствор фильтруют через мембрану из ацетата целлюлозы 0,2 мкм флэш-замораживают и лиофилизуют.
7. Измеряют степень замещения ADH методом 1H ЯМР.
Синтез HA-ADH-FITC.
1. Растворяют 88 мг HA-ADH (DS=36%) в 35 мл воды.
2. Растворяют 9,5 мг FITC в 10 мл ДМСО.
3. Смешивают раствор HA-ADH и раствор FITC.
4. После перемешивания в течение 48 ч при комнатной температуре раствор диализуют 3 суток с 0,3 М NaCl с чистой водой с использованием, например, диализного мешка MWCO 12000-14000.
5. Затем раствор сушат вымораживанием 2 суток.
6. Наконец, определяют степень замещения с помощью УФ-спектра.
Получение изображения НА-красителя in vitro.
(1) Высевают 1х105 клеток НТ 29 и HCT 15 (карцинома толстой кишки человека. CD44положительные клетки) в чашке 3,5 см на предметном стекле микроскопа.
(2) К клеткам добавляют указанные концентрации красителя, 1 мкМ НА-красителя (НА 0,34 МДа) соответственно в указанное время.
(3) После инкубации клетки промывают в PBS и затем фиксируют в 3,7% формальдегиде.
(4) Наблюдают за взаимодействием между НА-красителем и клетками с помощью конфокальной микроскопии.
Результат.
Наличие флуоресценции может показать место присоединения и количество красителя на HCT 15 (фиг. 2А и 2В) и HT29 (фиг. 2С и 2D). Результаты показывают, что краситель успешно конъюгирован с HA, и HA увеличивает концентрацию НА-красителя в области множества CD44 на HT29, принимая во внимание, что HT29 имеет более интенсивную флуоресценцию, это согласуется с тем, что в них CD44 больше, чем в НСТ 15. Даже оказывается, что НА-краситель может проникнуть в клетки (фиг. 2D). После 6 ч обработки НА-краситель может накапливаться и интернализоваться после 12 ч обработки в HT29 (больше CD44). Такое явление не наблюдается в HCT 15 (меньше CD44) после 6 или 12 ч обработки НАкрасителем.
Пример 3. Клеточная линия и модель с ксенотрансплантатом опухоли.
Процедура.
1. Условия культивирования клеток и пересев.
(1) Условия культивирования клеток.
(2) Пересев.
(1) Удаляют и отбрасывают культуральную среду.
НТ29: обогащенная глюкозой DMEM, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
НСТ 15: DMEM/F12, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
(2) Пересев.
(I) Удаляют и отбрасывают культуральную среду.
(II) Быстро промывают клеточный слой 1х PBS для удаления всех следов сыворотки, которая содержит ингибитор трипсина.
(III) Добавляют в колбу 1 мл раствора 0,25% трипсина-ЭДТК и наблюдают за клетками в микроскоп до тех пор, пока клеточный слой не распадется (обычно 5-15 мин). Затем добавляют 9 мл полной среды для роста и отсасывают клетки осторожным пипетированием.
(IV) В новую чашку для культивирования добавляют соответствующие аликвоты клеточной суспензии (коэффициент субкультивирования 1:3-1:8).
- 8 034600 (V) Культуры инкубируют в термостате при 37°C (5% CO2).
2. Модель с ксенотрансплантатом опухоли.
(1) Клетки HT29 и HCT 15 (2х107 клеток/мышь) инъецируют подкожно по отдельности в правые и левые бедра восьминедельных самцов голых мышей.
(2) Эксперимент с IVIS можно начинать проводить через 3-4 недели, когда размер ксенотрансплантатов опухолей станет 400-500 мм3.
3. Эксперимент с IVIS.
(1) После анестезии изофлураном изображение голых мышей с ксенотрансплантатом можно принять за контроль в парметрах f/stop: 8, время экспозиции 3 с, длина волны возбуждения 633 или 635 нм и измерения длины волны испускания 668 нм. Используемым прибором является Xenogen IVIS 200.
(2) В хвостовую вену инъецируют внутривенно соответственно 200 мкл 12,5 мкМ раствора свободного красителя или 200 мкл 12,5 мкМ раствора НА-красителя с 0,1 мг HA (HA 1,12 МДа).
(3) Фотографии изображений IVIS получают в предварительно установленное время 5, 10, 30 мин и 1, 2 ч. Параметры наблюдения и прибор коротко описаны на стадии 1. Мышей умерщвляют с последующим препарированием через 2 ч после инъекции для анализа распределения картины флуоресценции во внутренностях.
Результат.
Флуоресцентное изображение показывает, что свободный краситель распределяется почти равномерно в HT29 (слева) и HCT 15 (справа). Отношение площади присоединения HT29 составляет 50,15%, в то время как HCT 15 49,86%. Однако НА-краситель может, в частности, присоединяться в большей степени к области множества CD44 HT29, чем к HCT 15, которые имеют меньше CD44, чем HT29. Отношение площади присоединения HT29 составляет 74,15%, в то время как HCT 15 25,85%. Результаты показывают, что HA может вносить вклад в накопление красителя в области множества CD44.
Пример 4. Синтез конъюгата HA-NiNH2.
Гидрирование NiNO2.
1. Растворяют полностью 500 мг нимесулида (NiNO2) в 20 мл этилацетата и затем к раствору добавляют в качестве катализатора 200 мг 5% Pd/C (палладий-на-угле). Из сосуда при непрерывном перемешивании удаляют воздух и заменяют газом H2, ~100 кПа (1 атм), и затем перемешивают в течение 24 ч.
2. Выполняют тонкослойную хроматографию (силикагелевая пластина для ТСХ 60 F524) для идентификации чистоты продукта гидрирования при длине волны 254 нм, где подвижной фазой является смесь гексан:этилацетат = 2:1.
3. После идентификации продукта Pd/C удаляют фильтрацией и затем раствор упаривают на роторном испарителе для удаления остаточного растворителя.
4. Продукт гидрирования растворяют в смешанном растворителе гексан:этилацетат = 1:1 для дальнейшей очистки.
5. Для очистки используют колонку с силикагелем с элюированием раствором для элюирования (гексан:этилацетат = 1:1).
6. Собирают фракцию с окраской и выполняют определения концентрации и структуры с использованием УФ и ЯМР соответственно для подтверждения выхода продукта гидрирования NiNH2.
7. Порошок NiNH2 получают с помощью сублимационной сушилки.
Синтез конъюгата HA-NiNH2.
1. Растворяют 50 мг HA (10-700 кДа) в 25 мл DD воды.
2. Смешивают 25,1 мг EDC и 15,1 мг NHS в 1 мл DD воды и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.
3. Растворяют 3,65 мг NiNO2 в 1 мл раствора ДМСО и затем медленно прикапывают к раствору HA/EDC/NHS через шприц в течение 3 мин.
4. Такую смесь (НА, EDC, NHS и NiNH2) перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч в темноте.
5. Смесь диализуют в течение 2-3 суток против избытка DD воды с использованием мешка для диализа (MWCO 3500).
6. Получают порошок HA-NiNH2 из раствора HA-NiNH2 путем обезвоживания в сублимационной сушилке.
Результат.
На фиг. 3A показана структура оригинального нимесулида (NiNO2) и получение NiNH2. На фиг. 3B показана структура конъюгата HA-NiNH2.
Пример 5. Цитотоксичность NiNO2 in vitro.
Процедура.
1. Клетки HT29 высевают при низкой плотности 1х104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в среде, содержащей обогащенную глюкозой DMEM, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
2. Клетки HCT 15 высевают при низкой плотности 1 х 104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты
- 9 034600 в среде, содержащей DMEM/F12, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
3. Через сутки (24 ч) после посева клетки инкубируют в течение 24 ч в средах, содержащих указанные дозы лекарственных средств с NiNO2 (показаны для настоящего нимесулида, имеющего группу NO2): 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 мкМ и 0; NiNH2 (показаны для нимесулида, имеющего группу NH2): 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 мкМ и 0; НА: 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,0625, 0,3125 мг/мл и 0; HA-NiNH2: 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 мкМ и 0.
4. Действие лекарственных средств на жизнеспособность клеток оценивают с использованием анализа, основанного на расщеплении желтого красителя бромида 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил2Н-тетразолия (МТТ) до фиолетового кристаллического вещества формазана за счет активности дегидрогеназы в митохондриях.
5. После обработки лекарственным средством в течение 24 ч среду удаляют и клеточные слои промывают средой после разбавления в среде МТТ (0,5 мг/мл) в течение 4 ч в термостате при 37°C (5% CO2).
6. Затем к клеткам добавляют 100 мкл/лунка ДМСО и измеряют оптическую плотность клеточного гомогената при 570 нм с использованием планшет-ридера для ELISA.
7. Фракцию живых клеток вычисляют путем деления средней оптической плотности, полученной для обработанных клеток, на среднюю оптическую плотность для необработанных контрольных клеток.
Результат.
Показано, что цитотоксическое действие оригинального нимесулида (имеющего группу NO2) вообще лучше, чем модифицированного продукта (имеющего группу NH2) в HT29 или в HCT 15 (фиг. 4А). Однако, когда NiNO2 конъюгирован с HA, цитотоксичность HA-NiNH2 значимо выше, чем одного NiNH2 или одного NiNO2 (фиг. 4В).
Пример 6. Ингибирование роста опухоли на модели голых мышей с ксенотрансплантатом. Процедура.
1. Клетки HT29 (2х107 клеток/мышь) инъецируют подкожно в правое бедро (над правыми голенями) восьминедельных самок бестимусных (nu*/nu*) мышей BALB/c.
2. Эксперимент по ингибированию роста опухоли можно начинать проводить, когда размер ксенотрансплантированных опухолей будет меньше 100 мм3, что обозначают как день 0.
3. Размеры опухолей и массу тела измеряют каждые 3 или 5 дней на протяжении всего эксперимента.
4. Объем опухоли вычисляют как 1/2(4n/3)(L/2)(W/2)H, где L представляет собой длину, W представляет собой ширину и Н представляет собой высоту опухоли.
5. Мышей делят на группы различной обработки PBS - контроль, NiNO2 или HA-NiNH2.
6. Мышам через хвостовую вену вводят в дозах инъекции NiNO2 (1,5 мг/кг), HA-NiNH2 (эквивалент 1,5 мг/кг NiNO2) или PBS соответственно с интервалом 48 или 72 ч.
7. Регистрируют размер опухоли и массу тела каждой мыши.
Результат.
Показано, что средняя масса тела каждой мыши является почти одинаковой (фиг. 5А); однако, когда сравнивают все группы - контроль, с NiNO2 и HA-NiNH2, видно, что объем опухоли значимо различается, при этом в группе HA-NiNH2 подавляющее действие на опухоль сильнее, чем в группе NiNO2 и контрольной (фиг. 5В). Этот результат показывает, что конъюгат HA-NiNH2 по настоящему изобретению оказывает лечебное действие, превосходящее действие одного NiNO2.
Пример 7. Синтез конъюгата НА-целекоксиб.
Процедура.
1. Растворяют 100 мг HA (10-700 кДа) в 25 мл DD воды.
2. В раствор HA добавляют 0,8 экв. гидроксида тетрабутиламмония (ТВА-ОН) и перемешивают в течение 16 ч.
3. Раствор сушат и получают белое твердое вещество НА-ТВА.
4. Растворяют 40 мг НА-ТВА в 1 мл DD воды, затем в раствор добавляют 30 мг EDC и 18 мг порошка NHS и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Растворяют 4 мг целекоксиба в 2 мл раствора диметилсульфоксида (ДМСО).
6. Такую смесь (НА-ТВА, EDC. NHS и целекоксиб) перемешивают при комнатной температуре в течение 72 ч.
7. Смесь диализуют в течение 1 суток против смеси ДМСО и DD воды в соотношении 2:1 с использованием мешка для диализа (MWCO 1200~1400) и заменяют раствор три раза.
8. Затем смесь диализуют в течение 2 суток против 0,3 М раствора NaCl с использованием мешка для диализа (MWCO 1200-1400) и заменяют раствор два раза в сутки.
9. Получают порошок НА-целекоксиба из раствора НА-целекоксиба обезвоживанием сублимационной сушкой.
- 10 034600
Результат.
На фиг. 6 приведена процедура синтеза и структура конъюгата НА-целекоксиб.
Пример 8. Цитотоксичность целекоксиба in vitro.
Процедура.
1. Клетки HT29 высевают при низкой плотности 1х104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в среде, содержащей обогащенную глюкозой DMEM, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
2. Клетки GMB8401 высевают при низкой плотности 1 х 104 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в среде, содержащей DMEM, 10% FBS, 1% пирувата натрия, 1% пенициллина, стрептомицина и неомицина.
3. Через сутки (24 ч) после посева клетки инкубируют в течение 24 ч в средах, содержащих указанные дозы следующих лекарственных средств: НА-целекоксиб: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 мкМ и 0.
4. Действие лекарственных средств на жизнеспособность клеток оценивают с использованием анализа, основанного на расщеплении желтого красителя бромида 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил2Н-тетразолия (МТТ) до фиолетового кристаллического вещества формазана за счет активности дегидрогеназы в митохондриях.
5. После обработки лекарственным средством в течение 24 ч среду удаляют и клеточные слои промывают средой после разбавления в среде МТТ (0,5 мг/мл) в течение 4 ч в термостате при 37°C (5% CO2).
6. Затем к клеткам добавляют 100 мкл/лунка ДМСО и измеряют оптическую плотность клеточного гомогената при 570 нм с использованием планшет-ридера для ELISA.
7. Фракцию живых клеток вычисляют путем деления средней оптической плотности, полученной для обработанных клеток, на среднюю оптическую плотность для необработанных контрольных клеток.
Результат.
Показано, что цитотксическое действие НА-целекоксиба имеет тенденцию превышать действие одних HA и целекоксиба в клетках HT29 и клетках GMB8401 (фиг. 7А и 7В).

Claims (7)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конъюгат гиалуроновой кислоты и активного соединения, где активное соединение непосредственно конъюгировано посредством амидной связи с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты и представляет собой нимесулид.
  2. 2. Конъюгат по п.1, где гиалуроновая кислота имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне 102000 кДа.
  3. 3. Применение конъюгата гиалуроновой кислоты и активного соединения, где активное соединение непосредственно конъюгировано посредством амидной связи с карбоксильной группой гиалуроновой кислоты и представляет собой нимесулид или целекоксиб, для получения фармацевтической композиции для лечения рака.
  4. 4. Применение по п.3, где рак представляет собой рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, холангиокарциному, холангиоцеллюлярную цистаденокарциному, рак толстой кишки, аденокарциному, лимфому и плоскоклеточный рак, рак молочной железы, дуктальные карциномы, лобулярные карциномы, рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак предстательной железы, рак почек, почечно-клеточный рак, переходно-клеточную карциному, множественную миелому, миелодиспластические синдромы (MDS), ходжкинскую лимфому, не-ходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или карциному поджелудочной железы.
  5. 5. Фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один конъюгат по любому из пп.1, 2 в комбинации по меньшей мере с одним эксципиентом и/или разбавителем, где композиция предназначена для лечения рака.
  6. 6. Фармацевтическая композиция по п.5, где рак представляет собой рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, холангиокарциному, холангиоцеллюлярную цистаденокарциному, рак толстой кишки, аденокарциному, лимфому и плоскоклеточный рак, рак молочной железы, дуктальные карциномы, лобулярные карциномы, рак легких, не-мелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак предстательной железы, рак почек, почечно-клеточный рак, переходно-клеточную карциному, множественную миелому, миелодиспластические синдромы (MDS), ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз или карциному поджелудочной железы.
  7. 7. Способ получения конъюгата по п.1, включающий стадии получения водного раствора гиалуроновой кислоты с гидрохлоридом И-(3-диметиламинопропил)N-этилкарбодиимида и N-гидроксисукцинимидом;
    получения раствора нимесулида в органическом растворителе;
    смешивания и перемешивания обоих растворов при комнатной температуре в течение по меньшей мере 10 ч для получения смешанного раствора и диализа смешанного раствора в течение нескольких дней.
EA201690487A 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгаты гиалуроновой кислоты с антагонистами cox-2 и их применение для лечения рака EA034600B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361871352P 2013-08-29 2013-08-29
US14/308,972 US9572832B2 (en) 2013-08-29 2014-06-19 Compound of glycosaminoglycan and its fabrication method as well as application
PCT/EP2014/063720 WO2015028172A1 (en) 2013-08-29 2014-06-27 Compound of glycosaminoglycan, preparation method and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690487A1 EA201690487A1 (ru) 2016-11-30
EA034600B1 true EA034600B1 (ru) 2020-02-25

Family

ID=52584073

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690487A EA034600B1 (ru) 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгаты гиалуроновой кислоты с антагонистами cox-2 и их применение для лечения рака
EA201992517A EA038278B1 (ru) 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и леналидомида, способ его получения и применение для лечения рака
EA201992518A EA038422B1 (ru) 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и гемцитабина, способ его получения и применение для лечения рака
EA201501166A EA031285B1 (ru) 2013-08-29 2014-08-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и стероида, способ его получения и применение

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201992517A EA038278B1 (ru) 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и леналидомида, способ его получения и применение для лечения рака
EA201992518A EA038422B1 (ru) 2013-08-29 2014-06-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и гемцитабина, способ его получения и применение для лечения рака
EA201501166A EA031285B1 (ru) 2013-08-29 2014-08-27 Конъюгат гиалуроновой кислоты и стероида, способ его получения и применение

Country Status (19)

Country Link
US (7) US9572832B2 (ru)
EP (2) EP3038656B1 (ru)
JP (2) JP6404925B2 (ru)
KR (2) KR102283978B1 (ru)
CN (5) CN105579067A (ru)
AU (6) AU2014314536B2 (ru)
BR (2) BR112016004357B1 (ru)
CA (3) CA2921830C (ru)
DK (1) DK3038656T3 (ru)
EA (4) EA034600B1 (ru)
ES (2) ES2893329T3 (ru)
HK (2) HK1223291A1 (ru)
HU (1) HUE056434T2 (ru)
LT (1) LT3038656T (ru)
MY (1) MY180502A (ru)
PL (1) PL3038656T3 (ru)
PT (1) PT3038656T (ru)
TW (2) TWI526212B (ru)
WO (2) WO2015028172A1 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9572832B2 (en) * 2013-08-29 2017-02-21 Holy Stone Healthcare Co., Ltd. Compound of glycosaminoglycan and its fabrication method as well as application
EA027663B1 (ru) * 2016-05-20 2017-08-31 Тютор С.А.С.И.Ф.И.А. Способ получения твёрдой лекарственной формы для перорального применения и твёрдая лекарственная форма для перорального применения, полученная согласно указанному способу
WO2020247407A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-10 Aihol Corporation Hyaluronan conjugates and uses thereof
US11458204B2 (en) 2020-06-02 2022-10-04 Aihol Corporation Method for improving substitution rate and/or substitution efficiency of hyaluronan-drug conjugates
AU2021289350B2 (en) * 2020-06-08 2023-10-19 Aihol Corporation Uses of hyaluronan conjugate
US20220401567A1 (en) * 2021-06-18 2022-12-22 Aihol Corporation Uses of hyaluronan conjugate
CN114377139B (zh) * 2022-03-11 2023-07-04 四川省医学科学院·四川省人民医院 载体、药物递送系统及其应用
PL442924A1 (pl) * 2022-11-23 2024-05-27 Politechnika Śląska Prolek - glikokoniugat pochodny gemcytabiny, jako związek o działaniu przeciwnowotworowym, sposób otrzymywania i zastosowanie

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008134528A1 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cancer agent-hyaluronic acid conjugate compositions and methods

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8713662D0 (en) * 1987-06-11 1987-07-15 Skandigen Ab Hyaluronic acid derivatives
US5733891A (en) * 1990-10-18 1998-03-31 Shiseido Co., Ltd. Compound for medicinal ingredient and hyaluronic acid and process for producing the same
JPH0585942A (ja) * 1991-02-26 1993-04-06 Denki Kagaku Kogyo Kk インターフエロン−ヒアルロン酸及び／又はその塩の結合体
JPH0673103A (ja) * 1991-11-27 1994-03-15 Lignyte Co Ltd ヒアルロン酸高分子複合体及びその製造方法
WO1994009811A1 (en) 1992-10-30 1994-05-11 Duke University An adhesion molecule
US5616568A (en) * 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
WO1999045942A1 (en) 1998-03-13 1999-09-16 Entremed, Inc. Metastatin and hyaluronate binding proteins and methods of use
AU752280C (en) * 1998-05-20 2005-03-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Conjugate of therapeutic agent for joint disease and hyaluronic acid.
ITPD980169A1 (it) * 1998-07-06 2000-01-06 Fidia Advanced Biopolymers Srl Ammidi dell'acido ialuronico e dei suoi derivati e processo per la loro preparazione.
GB9902412D0 (en) * 1999-02-03 1999-03-24 Fermentech Med Ltd Process
JP2001081103A (ja) * 1999-09-13 2001-03-27 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒアルロン酸結合薬剤
JP4266571B2 (ja) * 2002-05-17 2009-05-20 生化学工業株式会社 脂質結合グリコサミノグリカンの製造法
US20040157810A1 (en) * 2002-08-23 2004-08-12 Teicher Martin H. Corticosteroid conjugates and uses thereof
US8192744B2 (en) 2002-08-26 2012-06-05 Ibcc Holding As Drug for treating states related to the inhibition of angiogenesis and/or endothelial cell proliferation
EP1564220A4 (en) * 2002-11-21 2010-03-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd EXCIPIENT FOR DELAYED RELEASE MEDICINE
US20060228331A1 (en) * 2003-10-10 2006-10-12 Novo Nordisk A/S IL-21 Derivatives and variants
RU2390529C2 (ru) * 2004-01-07 2010-05-27 Сейкагаку Корпорейшн Производное гиалуроновой кислоты и содержащее его лекарственное средство
CA2559188C (en) * 2004-03-05 2013-01-08 Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hyaluronic acid-methotrexate conjugate
US8143391B2 (en) * 2004-09-07 2012-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing water-soluble hyaluronic acid modification
CA2616607C (en) * 2005-07-27 2015-06-02 Alchemia Oncology Pty Limited Therapeutic protocols using hyaluronan
IE20060049A1 (en) * 2006-01-25 2007-08-08 Eurand Pharmaceuticals Ltd A novel drug delivery system: use of hyaluronic acid as a carrier moleclue for different classes of therapeutic active agents
WO2009048280A2 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Postech Academy-Industry Foundation Long acting hyaluronic acid - peptide conjugate
US20090170195A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 Kent State University Curcumin-hyaluronan compounds
HUE030895T2 (en) * 2008-10-10 2017-06-28 Polyactiva Pty Ltd Biodegradable polymer-bioactive group conjugates
US8759322B2 (en) * 2008-11-05 2014-06-24 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Hyaluronic acid derivative and pharmaceutical composition thereof
US8444983B2 (en) * 2009-03-23 2013-05-21 Quark Pharmaceuticals, Inc. Composition of anti-ENDO180 antibodies and methods of use for the treatment of cancer and fibrotic diseases
WO2010140869A2 (en) * 2009-06-05 2010-12-09 Iljin Copper Foil Co., Ltd. Complex, multilayer using the same, and device coated with the multilayer
AU2010306917B2 (en) * 2009-10-13 2014-11-27 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. Polymeric systems for the delivery of anticancer agents
EP2496948B1 (en) * 2009-11-05 2018-01-10 University of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for detecting plectin-1 as a biomarker for cancer
CN101732728B (zh) * 2010-01-25 2012-11-14 中国药科大学 抗炎药物-多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用
WO2011130476A2 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 The Research Foundation Of State University Of New York Polymer-based therapeutic agents
EP3566719A1 (en) * 2010-05-18 2019-11-13 Cerulean Pharma Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune and other diseases
PL2682409T3 (pl) * 2011-03-03 2017-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pochodna kwasu hialuronowego zmodyfikowana kwasem aminokarboksylowym
ES2665254T3 (es) * 2011-07-12 2018-04-25 Holy Stone Healthcare Co., Ltd. Composiciones que comprenden ácido hialurónico para tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con las mucosas
WO2015005458A1 (ja) * 2013-07-10 2015-01-15 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン誘導体及びその製造方法
US9572832B2 (en) * 2013-08-29 2017-02-21 Holy Stone Healthcare Co., Ltd. Compound of glycosaminoglycan and its fabrication method as well as application

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008134528A1 (en) * 2007-04-25 2008-11-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cancer agent-hyaluronic acid conjugate compositions and methods

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIARA DI MEO, LUIGI PANZA, DONATELLA CAPITANI, LUISA MANNINA, ALESSANDRA BANZATO, MARIA RONDINA, DAVIDE RENIER, ANTONIO ROSATO, V: "Hyaluronan as Carrier of Carboranes for Tumor Targeting in Boron Neutron Capture Therapy", BIOMACROMOLECULES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 8, no. 2, 1 February 2007 (2007-02-01), pages 552 - 559, XP055142431, ISSN: 15257797, DOI: 10.1021/bm0607426 *
KOTLA VENUMADHAV; GOEL SWATI; NISCHAL SANGEETA; HEUCK CHRISTOPH; VIVEK KUMAR; DAS BHASKAR; VERMA AMIT: "Mechanism of action of lenalidomide in hematological malignancies", JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD, LONDON UK, vol. 2, no. 1, 12 August 2009 (2009-08-12), London UK, pages 36, XP021060855, ISSN: 1756-8722, DOI: 10.1186/1756-8722-2-36 *
ROSATO, A. ; BANZATO, A. ; DE LUCA, G. ; RENIER, D. ; BETTELLA, F. ; PAGANO, C. ; ESPOSITO, G. ; ZANOVELLO, P. ; BASSI, P.: "HYTAD1-p20: A new paclitaxel-hyaluronic acid hydrosoluble bioconjugate for treatment of superficial bladder cancer", UROLOGIC ONCOLOGY: SEMINARS AND ORIGINAL INVESTIGATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 24, no. 3, 1 May 2006 (2006-05-01), AMSTERDAM, NL, pages 207 - 215, XP028071920, ISSN: 1078-1439, DOI: 10.1016/j.urolonc.2005.08.020 *
SERAFINO A; ZONFRILLO M; ANDREOLA F; PSAILA R; MERCURI L; MORONI N; RENIER D; CAMPISI M; SECCHIERI C; PIERIMARCHI P: "CD44-targeting for antitumor drug delivery: A new SN-38-hyaluronan bioconjugate for locoregional treatment of peritoneal carcinomatosis", CURRENT CANCER DRUG TARGETS, BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, HILVERSUM, NL, vol. 11, no. 5, 1 June 2011 (2011-06-01), NL, pages 572 - 585, XP008172354, ISSN: 1568-0096, DOI: 10.2174/156800911795655976 *
W M LIU, J Y HENRY, B MEYER, J B BARTLETT, A G DALGLEISH, C GALUSTIAN: "Inhibition of metastatic potential in colorectal carcinoma in vivo and in vitro using immunomodulatory drugs (IMiDs)", BRITISH JOURNAL OF CANCER, HARCOURT PUBLISHERS, vol. 101, no. 5, 1 September 2009 (2009-09-01), pages 803 - 812, XP055142773, ISSN: 00070920, DOI: 10.1038/sj.bjc.6605206 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101790649B1 (ko) 2017-10-26
CN105324132A (zh) 2016-02-10
US20170151336A1 (en) 2017-06-01
JP2016525515A (ja) 2016-08-25
JP2016529362A (ja) 2016-09-23
WO2015028172A1 (en) 2015-03-05
AU2019268087B2 (en) 2020-09-10
HK1223291A1 (zh) 2017-07-28
AU2017204619A1 (en) 2017-07-27
TW201509422A (zh) 2015-03-16
EA201992518A2 (ru) 2020-03-31
BR112015032529B1 (pt) 2022-06-21
EA031285B1 (ru) 2018-12-28
CN114010796A (zh) 2022-02-08
TW201509421A (zh) 2015-03-16
EP3038660A4 (en) 2017-05-03
CN105324132B (zh) 2020-07-21
AU2014314536B2 (en) 2019-11-07
BR112016004357B1 (pt) 2022-09-27
KR102283978B1 (ko) 2021-08-02
CN105579067A (zh) 2016-05-11
CA2921830C (en) 2022-03-08
AU2019268085A1 (en) 2019-12-12
CA3133859A1 (en) 2015-03-05
CA3133853A1 (en) 2015-03-05
AU2019201691A1 (en) 2019-04-04
CA2921830A1 (en) 2015-03-05
JP6404925B2 (ja) 2018-10-17
EP3038656B1 (en) 2021-08-18
AU2014311302A1 (en) 2016-01-21
ES2851973T3 (es) 2021-09-09
BR112016004357A2 (ru) 2017-08-01
AU2019268085B2 (en) 2021-01-07
US20150065446A1 (en) 2015-03-05
CA3133859C (en) 2023-03-14
TWI526212B (zh) 2016-03-21
EA201690487A1 (ru) 2016-11-30
EA201992517A3 (ru) 2020-05-31
AU2019268087A1 (en) 2019-12-12
US10342878B2 (en) 2019-07-09
LT3038656T (lt) 2021-12-10
CA3133853C (en) 2023-03-07
WO2015031425A1 (en) 2015-03-05
EP3038656A1 (en) 2016-07-06
EA038422B1 (ru) 2021-08-26
US9572832B2 (en) 2017-02-21
HUE056434T2 (hu) 2022-02-28
DK3038656T3 (da) 2021-10-11
AU2019201691B2 (en) 2019-10-03
CN113893354A (zh) 2022-01-07
US20240238329A9 (en) 2024-07-18
EA201992517A2 (ru) 2020-03-31
US20190275164A1 (en) 2019-09-12
KR20160014690A (ko) 2016-02-11
US20240325434A1 (en) 2024-10-03
US20220111062A1 (en) 2022-04-14
MY180502A (en) 2020-11-30
EP3038660B1 (en) 2020-12-23
JP6433494B2 (ja) 2019-02-06
EP3038660A1 (en) 2016-07-06
KR20160048905A (ko) 2016-05-04
US20240325435A1 (en) 2024-10-03
US11229665B2 (en) 2022-01-25
PT3038656T (pt) 2021-10-15
US20150065450A1 (en) 2015-03-05
ES2893329T3 (es) 2022-02-08
EA201992518A3 (ru) 2020-05-31
EA201501166A1 (ru) 2016-10-31
PL3038656T3 (pl) 2022-01-10
AU2014314536A1 (en) 2016-04-07
TWI577378B (zh) 2017-04-11
HK1225993A1 (zh) 2017-09-22
EA038278B1 (ru) 2021-08-04
CN110590971A (zh) 2019-12-20
BR112015032529A2 (pt) 2017-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019268085B2 (en) Compound of glycosaminoglycan, preparation method and use thereof
Karousou et al. Roles and targeting of the HAS/hyaluronan/CD44 molecular system in cancer
Mero et al. Recent developments in hyaluronic acid-based nanomedicine