CN105311009A

CN105311009A - S-(羧甲基)-l-半胱氨酸在制备防治呼吸系统疾病药物的应用

Info

Publication number: CN105311009A
Application number: CN201510448850.2A
Authority: CN
Inventors: 朱少璇; 陈矛; 钟南山; 郑劲平; 王玮
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co Ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co Ltd Baiyunshan Pharmaceutical General Factory
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2016-02-10

Abstract

本发明涉及一种药物的新用途，具体地说，涉及S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐在制备用于预防和治疗NF-κB信号通路活化引起的呼吸系统疾病药物中的应用。本发明利用S-(羧甲基)？-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐可显著抑制H₂O₂、TNF-α、香烟烟雾提取物所致的NF-κB信号通路的活化及炎症因子白介素-6、白介素-8的释放；显著抑制急性肺损伤及支气管哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中白介素-6、白介素-8的释放，及肺组织中NF-κB的表达，从而可以用于防治NF-κB介导的呼吸系统疾病如支气管哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等。

Description

S-(羧甲基)-L-半胱氨酸在制备防治呼吸系统疾病药物的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，本发明涉及S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐的药物新用途。

背景技术

NF-κB是1986年由Sen等首先从B淋巴细胞核抽提物中检测到的一种能与免疫球蛋白轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，可促进轻链基因的表达，发挥转录和调控作用（SenR，BaltimoreD.Inducibilityofkappaimmunoglobulinenhancer-bindingproteinNf-kappaBbyaposttranslationalmechanism．Cell.1986;47(6):921-8.）。作为一个多功能核转录因子，NF-κB由Rel蛋白家族中的两个成员P65和P50构成的二聚体复合物，在肺组织中主要以P65亚基形式存在。在静息状态下，NF-κB与抑制物IκB结合存在于胞浆中，不具有生物活性；当受到多种细胞因子、病毒、LPS等刺激后，IκB被降解并与NF-κB分离，NF-κB进入细胞核后与DNA上的κB位点结合，启动多种炎症反应基因转录，包括前炎症细胞因子TNF-α、IL-2、IL-6，趋化因子IL-8、巨噬细胞趋化蛋白（MCP）、巨噬细胞炎症蛋白（MIP），粘附因子如细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子（VCAM-1）等，与支气管哮喘、慢性支气管炎、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化等肺部炎性疾病发生发展密切相关。然而，目前临床尚无特异性NF-κB抑制剂的应用。

S-(羧甲基)-L-半胱氨酸（carbocisteine、carboxymethylcysteine，CMC），又称羧甲司坦，于1961年由法国Joullie公司首先开发并应用于临床，为粘痰溶解药，可影响支气管腺体的分泌，使低粘度的唾液粘蛋白的分泌增加，高粘度的岩藻粘蛋白的产生减少，且可直接作用于粘蛋白的二硫键，使粘蛋白分子裂解而降低痰液粘滞性，易于咯出；可提高粘膜纤毛清除率；降低气道高反应性。CMC进入体内后易脱去羧甲基形成半胱氨酸，其所含的巯基能与活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）等的亲电子基团相互作用，发挥直接抗氧化作用；此外，半胱氨酸亦是谷胱甘肽（GSH）的前体，能再合成具有生物活性的GSH，增加体内GSH的浓度，起到间接抗氧化作用。临床上CMC主要用于治疗慢性支气管炎、肺气肿、慢性阻塞性肺病（COPD）、支气管哮喘等疾病引起的痰液粘稠、咳痰困难等。近来，有报道CMC可以抑制体外鼻病毒、IL-1β等刺激所致的IL-6、IL-8等炎性因子的释放（YasudaH,YamayaM,SasakiT,etal.Carbocisteineinhibitsrhinovirusinfectioninhumantrachealepithelialcells.EurRespirJ.2006;28(1):51-8.NogawaH,IshibashiY,OgawaA,etal.Carbocisteinecanscavengereactiveoxygenspeciesinvitro.Respirology.2009;14(1):53-9.），以及抑制香烟烟雾诱导的肺气肿（HanaokaM,DromaY,ChenY,etal.Carbocisteineprotectsagainstemphysemainducedbycigarettesmokeextractinrats.Chest.2011;139(5):1101-8.）。但对于NF-κB信号通路的影响未见。因此，探讨CMC对NF-κB信号通路的影响，对于进一步明晰COPD在肺部炎性疾病的预防治疗中的应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐或含有它们中任何一种的药物组合物在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的用途。

上述呼吸系统疾病包括支气管哮喘、肺气肿、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化等疾病。

为实现S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的用途，可以将S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐制成胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊剂或滴丸剂。

本发明解决技术问题采用的技术方案为：将S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐制成片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、干混悬剂、丸剂或滴丸剂中的一种，为实现这些制剂的制备，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼酯、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等。

在本发明中，术语“药学上可接受的盐”包括与无机碱形成的羧酸盐，如钠、钾、钙、镁、铵等无机碱的盐；与有机碱形成的羧酸盐，如葡甲胺、氨基葡萄糖、三甲基胺、三乙基胺、二环己基胺、N,N-二苄基-1,2-乙二胺、精氨酸、赖氨酸等的盐，或无毒性的盐类。

本发明优选的方案是S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐或含有它们中任何一种的药物组合物在制备用于预防或治疗由NF-κB信号通路活化所引起的呼吸系统疾病的药物中的用途。

为了更好地理解本发明的实质，下面用S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其盐在体内外的试验结果，说明其在制药领域的新用途。

附图说明

附图1所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对H₂O₂刺激引起的pNF-κBp65表达的抑制作用（注：与H₂O₂组比较，*P<0.05）。

附图2所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对TNF-α刺激引起的pNF-κBp65表达的抑制作用（注：与TNF-α组比较，*P<0.05）。

附图3所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对香烟烟雾提取物（CSE）刺激引起的pNF-κBp65表达的抑制作用（注：与CSE组比较，*P<0.05）。

附图4所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸对H₂O₂、TNF-α、CSE刺激引起的pNF-κBp65蛋白入核的抑制作用。

附图5所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对H₂O₂刺激下IL-6及IL-8释放的抑制作用（注：与H₂O₂组比较，*P<0.05）。

附图6所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对TNF-α刺激下IL-6及IL-8释放的抑制作用（注：与TNF-α组比较，*P<0.05）。

附图7所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐对CSE刺激下IL-6及IL-8释放的抑制作用（注：与CSE组比较，*P<0.05）。

附图8所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其铵盐对急性肺损伤小鼠NF-κB表达的抑制作用（注：与模型组比较，*P<0.05）。

附图9所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其铵盐对急性肺损伤小鼠IL-6、IL-8释放的抑制作用（注：与模型组比较，*P<0.05）。

附图10所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其铵盐对支气管哮喘小鼠NF-κB表达的抑制作用（注：与模型组比较，*P<0.05）。

附图11所示为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其铵盐对支气管哮喘小鼠IL-6、IL-8释放的抑制作用（注：与模型组比较，*P<0.05）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

本发明所用材料如下：

1.1主要仪器与试剂

二氧化碳培养箱（日本ASTEC公司）；BSC-1600IIA2生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；XDS-1B倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；AxioVert.A1荧光显微镜（德国ZEISS公司）。

1.2主要试剂、动物

人肺腺癌A549细胞（实验室自存）；RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素链霉素（GIBCO公司）；过氧化氢、CMC、TNF-α、DAPI（Sigma-Aldrich公司）；兔抗Phospho-NF-κBp65(Ser536)、GADPH一抗（美国CST公司）；HRP-羊抗兔IgG（美国EarthOx公司）；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔IgG；IL-6、IL-8ELISA试剂盒（R&D公司）；CMC的钠盐、铵盐、葡甲胺盐、精氨酸盐和赖氨酸盐（实验室自制）；其余试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；C57BL/6、BALB/c小鼠（南京生物医药研究院）。

香烟烟雾提取物（CSE）：取1支燃烧的香烟，由50mL注射器负压吸引连续抽吸，使烟雾缓慢进入RPMI-1640，振荡溶解后用0.22μM滤膜过滤，置冰上备用。

实施例1CMC抑制NF-κB的表达及IL-6、IL-8的释放

1实验方法

1.1免疫蛋白印迹及ELISA法

A549细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640中，置37℃、5%CO₂孵箱中培养。取对数生长期细胞，胰酶消化后用RPMI-1640调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种于6孔培养板，12h贴壁后，饥饿过夜，按不同处理分为H₂O₂组（或TNF-α、CSE组）、CMC组及其盐（加入CMC或其盐，预孵24h），对照组加入等体积PBS。取培养液上清，ELISA法测定IL-6、IL-8含量。同时收集细胞，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，定量上样25μg蛋白跑SDS聚丙烯酰胺凝胶，湿法转至PVDF膜，Phospho-NF-κBp65一抗孵育（稀释度1：1000），4℃过夜；TBST溶液洗膜，孵育二抗（浓度为1：5000），室温1h；根据ECL试剂盒说明书操作发光自显影，拍照并用ImageJ1.44p软件分析条带光密度。

1.2免疫荧光染色

A549细胞按1×10⁵个/mL浓度接种于48孔培养板，内置爬片，待细胞贴壁后，按不同处理分为H₂O₂组（或TNF-α、CSE组）、CMC组（CMC预孵24h），对照组加入等体积PBS。冰PBS洗涤3次，4%多聚甲醛室温孵育10min，冰PBS洗涤3次，再用0.5%Triton-100于4℃孵育20min，冰PBS洗涤3次。用5%BSA封闭30min，pNF-κBp65抗体孵育4℃过夜，FITC标记羊抗兔IgG室温避光孵育1h，冰PBS洗涤3次。DAPI室温避光孵育15min，PBS洗涤3次。染色结束后，取出爬片，在荧光显微镜下观察。

实验结果

2.1免疫蛋白印迹

与对照组相比，H₂O₂、TNF-α、CSE刺激后，胞内pNF-κBp65蛋白含量显著增高，提前以CMC或盐预孵的胞内NF-κBp65蛋白减少（见附图1、2、3）。

2.2免疫荧光染色

对照组细胞的NF-κB活性处于较低的水平，胞核蛋白染色较弱；H₂O₂或TNF-α、CSE刺激后，NF-κB被激活，NF-κBp65蛋白从细胞质转移入细胞核内，胞核蛋白含量增加，染色强度较对照组明显增加；提前以CMC预孵的细胞核内NF-κBp65蛋白减少，荧光强度明显减弱（见附图4）。

2.3抗炎活性观察

与正常组相比，H₂O₂、TNF-α、CSE组培养液中IL-6、IL-8含量升高；表明上述刺激可引起A549细胞炎性损伤；给予CMC或盐后，培养液中IL-6、IL-8含量显著下降（见附图5、6、7）。

实施例2CMC对急性肺损伤小鼠NF-κB表达及IL-6、IL-8释放的抑制作用

1实验方法

60只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，分别为正常组、模型组、CMC组、铵盐组，每组15只。正常组、模型组以0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，其余组灌以相应药物（羧甲基纤维素钠混悬或溶解）。连续给药15天。

末次给药24小时后，正常组小鼠腹腔注射等量生理盐水，其余小鼠腹腔注射脂多糖（10mg/kg体重），上述处理6小时后，处死小鼠，取支气管肺泡灌洗液（BALF），测定其中IL-6、IL-8含量；取肺制备组织匀浆后，免疫蛋白印迹测定其中NF-κB的表达。

实验结果

与正常组比较，模型组小鼠BALF中IL-6、IL-8含量均显著增高（P<0.05），肺匀浆中pNF-κB蛋白表达增多。与模型组相比，试验药物组小鼠IL-6、IL-8含量及pNF-κB蛋白表达均明显降低（见附图8、9）。推测通过抑制NF-κB，S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其盐对急性肺损伤小鼠发挥了良好的抗炎作用。

实施例3CMC对支气管哮喘小鼠NF-κB表达及IL-6、IL-8释放的抑制作用

1实验方法

60只雄性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为正常组、模型组、CMC组、铵盐组，每组15只。后三组小鼠分别于第0、7、14天腹腔注射2%OVA和氢氧化铝混合溶液（溶于0.2mLPBS）；第21天将致敏小鼠置玻璃罩内，以2%OVA溶液雾化激发，1次/天，共7天。正常组予等量生理盐水致敏和雾化激发。各组自第21天起在雾化激发前半小时灌胃给药（正常组和模型组灌以等量生理盐水）。末次激发24小时内，处死小鼠，取支气管肺泡灌洗液（BALF），测定其中IL-6、IL-8含量；取肺制备组织匀浆后，免疫蛋白印迹测定其中NF-κB的表达。

实验结果

与正常组比较，模型组小鼠BALF中IL-6、IL-8含量均显著增高（P<0.05），肺匀浆中pNF-κB蛋白表达增多。与模型组相比，试验药物组小鼠IL-6、IL-8含量及pNF-κB蛋白表达均明显降低（见附图10、11）。推测通过抑制NF-κB，S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其盐对支气管哮喘小鼠发挥了良好的抗炎作用。

实验结论

NF-κB的活化与多种呼吸系统炎性疾病的发生发展密切相关，初步药效结果表明，以S-(羧甲基)-L-半胱氨酸（CMC）或其盐处理，可在体外显著对抗多种刺激引起的pNF-κBp65蛋白表达的增多及NF-κBp65蛋白入核，并可降低炎性因子IL-6、IL-8的释放，从而明显减轻了炎症介质对肺的损伤；对急性肺损伤及支气管哮喘小鼠也观察到药物的类似作用。

有益效果

经过大量实验研究发现，S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其盐能显著降低多种刺激引起的炎性因子IL-6、IL-8的释放，部分机制与药物抑制NF-κB活化有关。由于NF-κB参与了多种呼吸系统炎性疾病的发生和发展，包括支气管哮喘、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化等，因此，S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐可以用于制备预防或治疗上述疾病的药物中。

Claims

1.S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐在制备用于预防或治疗呼吸系统疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述呼吸系统疾病为支气管哮喘、肺气肿、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺纤维化。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的呼吸系统疾病由NF-κB信号通路活化引起。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物为S-(羧甲基)-L-半胱氨酸。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、葡甲胺盐、氨基葡萄糖盐、三甲基胺盐、三乙基胺盐、二环己基胺盐、N,N-二苄基-1,2-乙二胺盐、精氨酸盐、赖氨酸盐。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述药物为以S-(羧甲基)-L-半胱氨酸及其药学上可以接受的盐为有效成分以及药用载体的药物组合物。