BR112013002981B1 - Processos de geração ou alteração de um traço de uma planta, de produção de uma proteína de interesse em uma planta e de proteção de plantas de cultura em um campo contra uma praga - Google Patents

Abstract

processo de transfecção de plantas. um processo de transfecção de uma planta compreendendo pulverização de partes da referida planta com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de agrobacterium e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, a referida cepa de agrobacterium compreendendo uma molécula de dna que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de dna de interesse a ser transfectada na planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS

DE GERAÇÃO OU ALTERAÇÃO DE UM TRAÇO DE UMA PLANTA, DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE INTERESSE EM UMA PLANTA E DE PROTEÇÃO DE PLANTAS DE CULTURA EM UM CAMPO CONTRA 5 UMA PRAGA.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para transfecção transitória de plantas por meio de pulverização das plantas com uma suspensão aquosa contendo células de Agrobacterium. A invenção também for10 nece um processo de geração ou alteração de um traço em uma planta que está crescendo em um campo. A invenção refere-se também a um processo de produção de uma proteína de interesse em uma pluralidade de plantas em um campo. A invenção refere-se também a um processo de proteção de plantas de cultura em um campo contra uma praga. Além disso, a invenção 15 refere-se a uma suspensão aquosa que contém células de uma cepa de Agrobacterium adequada para transfecção transitória em larga escala de plantas cultivadas em um campo de produção para os processos da presente invenção. A invenção refere-se também ao uso de material inorgânico em partículas para transfecção transitória de plantas por meio de pulverização 20 com suspensões que contêm células de Agrobacterium e o material inorgânico em partículas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Processos atuais de engenharia genética para agricultura são todos baseados na modificação genética estável de espécies de culturas, 25 demonstrado primeiro em 1983 (Fraley et al 1983; Barton et al 1983) e comercializado desde 1996. Embora o processo de agricultura com base na transformação genética estável de plantas seja uma realidade hoje e uma base de uma prática nova de muito sucesso, ela tem várias limitações, as principais sendo tempo muito longo e alto custo necessário para o desenvol30 vimento de culturas transgênicas. Consenso geral entre as empresas envolvidas em biotecnologia vegetal é que o processo da R&D requer, dependendo das espécies de cultura, entre 8 e 16 anos e o custo médio total é estiSegue-se na página 1a/60

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1a/60 mado como estando entre US $100 e US $150 milhões. Em virtude destas limitações, após mais de 25 anos desde a descoberta de um processo de

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2/60 espécies de culturas GM têm sido comercializados até o momento.

Sabe-se que as células vegetais e plantas inteiras podem ser reprogramadas transitoriamente (por exemplo, sem uma integração estável de novo material genético em um cromossomo de planta) e os processos transitórios, tais como infecções virais, são rápidos. Tais processos transitórios poderíam, em princípio, permitir uma modificação muito rápida do metabolismo da planta em favor de determinados traços ou produtos que são de interesse para o usuário. Evidentemente, tais processos requerem um vetor de DNA ou RNA (um vírus ou uma bactéria), que tenha sido manipulado para transfectar com eficácia e segurança a planta, com o efeito resultante sendo desprovido de efeitos colaterais indesejáveis. Tentativas anteriores de usar vetores com base em vírus de plantas têm sido parcialmente bem sucedidas pelo fato de que eles permitem a transfecção de plantas para a produção de proteínas recombinantes de alto valor, tais como determinados biofarmacêuticos (Gleba et al. 2007, 2008; Lico et al. 2008). Uso de vírus para a manipulação de outros traços, tais como traços de entrada (por exemplo, resistência a herbicidas, Shiboleth et al. 2001; Zhang e Ghabiral 2006) foi descrito na literatura, mas transfecção do vírus introduz tantas mudanças indesejáveis no hospedeiro infectado que este tipo de processo transitório não é mais feito para traços de entrada. Processos transitórios podem também ser desenvolvidos em torno da capacidade de espécies Agrobacterium de transferir uma parte do seu plasmídeo Ti para uma célula eucariota, em particular de plantas. Uso de transfecção com base em Agrobacterium é uma base para manipulações genéticas, tais como protocolos de transformação genética e ensaios de transfecção transitória em laboratório. Aplicações industriais de transfecção com base em Agrobacterium também têm estado limitadas à produção de proteína recombinante em virtude das condições ótimas de aplicação, tais como infiltração a vácuo de plantas com suspensões bacterianas, não podem ser usadas em larga escala no campo, enquanto que pulverização das partes aéreas ou irrigação de plantas com soluções bacterianas resulta em uma proporção supostamente muito pequena de células de plantas a ser transfectada e estudos anteriores simples

3/60 mente não abordaram esta questão específica. A combinação de distribuição por Agrobacteríum e uso de vírus como um mensageiro secundário em um só processo tem sido bem sucedida na produção de proteínas recombinantes de alto valor, incluindo biofarmacêuticos complexos, tais como anticorpos de IgG completos. No entanto, quando se trata de traços, tais como traços de entrada ou traços que requerem reprogramação objetivada sutil do metabolismo celular de plantas, este processo de transfecção tem as mesmas limitações conforme os vetores virais.

Há conhecimento considerável na área do uso de microorganismos para controle de determinados processos que requerem interação de micro-organismos com plantas, incluindo uso de micro-organismos, tais como Lactobacillus e leveduras Saccharomyces para fermentação de biomassa (preparo de alimentos fermentados, bebidas), para biocontrole {Agrobacteríum, Myrotecium, cepas) e uso de cepas de Rhizobium para fixação aprimorada de nitrogênio. Em trabalhos de pesquisa e patentes nos quais micro-organismos têm sido explorados como agentes de biocontrole, há um considerável corpo de conhecimentos sobre como as células vivas deverão ser aplicadas às superfícies de plantas; em particular, foram realizados estudos que identificaram as condições de pulverização e adjuvantes (agentes umidificantes, adesivos, etc.) a serem usados nas misturas de pulverização. Exemplos de tais pesquisas são numerosos. Os artigos a seguir exemplificam o estado da técnica nesta área: Arguelles-Arias et al. 2009; Nam et al. 2009; revisado por Johnson 2009.

Há cepas de Agrobacteríum rhizogenes/radiobacter registradas que têm sido usadas há décadas para controle de galha da coroa em vinhedos e pomares. Existem duas cepas usadas comercialmente, uma delas sendo uma cepa natural que traz plasmídeo (K84) e a outra, um derivado geneticamente modificado que foi modificado por meio de deleção do gene necessário para a transferência conjugativa de plasmídeo (K1026). (Kerr e Tate 1984; Vicedo et al. 1993; Reader et al. 2005; Kim et al. 2006; revisto em Moore, 1988).

Agrobacteríum tumefaciens e A. rhizogenes são amplamente

4/60 usados em laboratórios de pesquisa em todo o mundo para transfecção e transformação genética estável de plantas. Estas aplicações baseiam-se na capacidade de Agrobacteríum de transferir informação genética para células eucariotas. Muitas das plantas geneticamente modificadas cultivadas hoje, tais como soja, canola e algodão, foram geradas através de transformação genética mediada por Agrobacteríum. A diferença essencial entre a transformação transitória e estável é que, no processo de transformação estável, DNA distribuído por Agrobacteríum é eventualmente integrado em um cromossomo de planta e, após o que, é herdado pela prole da planta. Tais eventos de integração são raros, mesmo em experimentos de laboratório especificamente concebidos para proporcionar contatos maciços entre células de plantas e bactérias; assim, para a seleção de transformantes estáveis, métodos de triagem seletiva específicos têm de ser utilizados. Subsequentemente, o conhecimento acumulado neste domínio da ciência tem um valor limitado para aqueles interessados em processos transitórios que têm de ser concebidos de modo a ter um caráter maciço e afetar múltiplas células do corpo da planta.

Transfecção transitória, por outro lado, leva em conta apenas as etapas anteriores de distribuição de DNA mediada por Agrobacteríum em um núcleo de uma célula de planta, juntamente com o fato de que tais moléculas de DNA distribuídas, se apropriadamente concebidas para constituir uma unidade de transcrição trazendo promotor e terminador específico para planta e uma parte de codificação, serão transcritas em um núcleo mesmo na ausência da referida integração de DNA em um cromossomo de planta, tal expressão resultando em uma reprogramação transitória de uma célula de planta. Tal reprogramação foi obtida primeiro logo no início e foi desenvolvida em uma ferramenta padrão de laboratório para avaliação rápida de diferentes experimentos genéticos. Considerando que há considerável corpo de conhecimento sobre transferência de DNA mediada por Agrobacteríum para células de planta, com exceção de alguns casos, essa informação está limitada a experimentos em escala laboratorial e, até agora, houve poucas tentativas para desenvolver aplicações em escala industrial envolvendo Agro

5/60 bacteríum como um vetor de DNA. Uma das limitações das aplicações de laboratório é o fato de distribuição de DNA com base em Agrobacteríum requer determinados tratamentos que são difíceis ou impossíveis de aplicar em campo aberto ou em larga escala. Em experimentos transitórios típicos, células de plantas cultivadas ou partes de plantas são tratadas com um excesso de bactérias para proporcionar distribuição máxima. Em experimentos de pesquisa típicos, também se tem interesse em níveis de expressão que não são economicamente viáveis se feitos em uma escala industrial. Em geral, a pesquisa feita neste domínio levou os inventores à conclusão de que os parâmetros que afetam gravemente a expressão transitória são aqueles que permitem o melhor acesso à interação de Agrobacteria às células de planta dentro de um corpo de planta. A maioria de tais estudos utiliza infiltração a vácuo, injeção na folha da planta ou tratamento com tensoativo, ferimento de superfície da planta, por exemplo, com lâminas de barbear ou combinação dos mesmos. Na verdade, o único grupo que está desenvolvendo um processo de transfecção com base em Agrobacteríum para a produção comercial de proteínas recombinantes que não envolve amplificação (com base em vírus) adicional do DNA original é o grupo de Medicago (D'Aoust et al., 2008, 2009; Vezina et al., 2009) que conta totalmente com infiltração a vácuo como um método de distribuição. No entanto, em virtude do fato de ser com base em uma proporção grandemente excessiva de bactérias para células de planta, protocolos laboratoriais atuais usados para transfecção transitória de plantas não têm grande valor traducional, isto é, eles não podem ser diretamente reproduzidos a um nível industrial. Exceto em alguns casos (por exemplo, Vaquero et al., 1999, DAoust et al., 2008, 2009), eles também não se dirigiram quantitativamente à questão da eficiência do processo de transfecção transitória. (Exemplos de tal pesquisa são múltiplos; foi fornecida uma citação de apenas alguns poucos daqueles representativos: Li et al., 1992; Liu et al., 1992; Clough e Bent, 1998; De Buck et al., 1998, 2000; Chung et al., 2000; Yang et al., 2000; Zambre et al., 2003; Wroblewski et al., 2005; Lee e Yang, 2006; Zhao et al., 2006; Shang et al., 2007; Jones et al., 2009; Li et al., 2009; De Felippes e Weigel, 2010). Exceto em

6/60 dois casos descritos abaixo, não houve tentativas na literatura de quantificar a eficiência do processo transitório ou fornecer uma compreensão suficiente que pudesse levar à exploração comercial potencial em larga escala do fenômeno.

Um dos processos industriais que está sob desenvolvimento hoje é Magnifection, um processo que se baseia em infiltração a vácuo de Agrobacterium em folhas de plantas. O processo Magnifection (marca registrada da Icon Genetics GmbH como magnICON® e coberto por várias patentes/pedidos de patentes) é um protocolo simples e indefinidamente escalonável para expressão de proteína heteróloga em plantas, o qual é desprovido de transformação genética estável de uma planta mas, em vez disso, conta com amplificação transitória de vetores virais distribuídos à múltiplas áreas de um corpo de planta (distribuição sistêmica) por Agrobacterium como precursores de DNA. Tal processo é, em essência, uma infiltração de plantas maduras inteiras com uma suspensão diluída de Agrobacteria que trazem T-DNAs que codificam replicons de RNA viral. Neste processo, as bactérias assumem as funções (formalmente virais) de infecção primária e circulação sistêmica, enquanto que o vetor viral proporciona disseminação célula para célula (curta distância), amplificação e expressão de proteína em alto nível. Demonstração inicial de que infecção viral pode ser iniciada pela distribuição de Agrobactería a uma cópia do genoma viral em uma célula de planta é proveniente do trabalho pioneiro de Grimsley et al., 1986, em que um vírus de DNA foi distribuído, e uma primeira infecção, embora muito ineficiente, com TMV, um vírus de RNA citoplasmático distribuído como uma cópia de DNA, oriundo do trabalho de Turpen etal., 1993. A tecnologia atual, no entanto, é extremamente eficaz e umas poucas plantas de tabaco adultas são suficientes para otimização construto precoce de construto e rápida produção de quantidades de miligramas a gramas de proteína recombinante para avaliação pré-clínica ou clínica ou, no caso de vacinas individualizadas, para a fabricação. A versão escalonada (industrial) é essencialmente a mesmo, mas é construída em torno de vetores virais totalmente montados (em vez de pró-vetores que requerem montagem in planta) e requer apare

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Ihos para distribuição de Agrobacteríum em alto rendimento à plantas inteiras por meio de infiltração a vácuo. O processo pode ser escalonado, mas requer submersão de partes aéreas de plantas em suspensão bacteriana sob vácuo (o processo envolve a inversão de plantas cultivadas em vasos ou em bandejas), um procedimento que impõe limitações sobre o volume de biomassa que pode ser tratada desta forma, sobre o rendimento do processo, sobre as formas pelas quais as plantas podem ser cultivadas antes de tratamento e também traz determinados custos que limitam o uso do processo a produtos de alto custo, tais como produtos biofarmacêuticos recombinantes apenas. O processo Magnifection é eficiente uma vez que ele permite transfecção de quase todas as células de folha das plantas tratadas ou aproximadamente 50% da biomassa total da parte aérea da planta (o restante sendo caules e pecíolos). O processo foi otimizado de muitas formas, em particular mediante aprimoramento de liberação de replicon viral através da otimização da modificação pós-traducional dos transcritos de DNA primários (Marillonnet et al., 2005). No entanto, o processo atual foi construído inteiramente em torno de métodos de distribuição bacterianos, tais como injeção em folhas de planta ou infiltração a vácuo (por exemplo, Simmons et al., 2009), ferimento de folhas (Andrews e Curtis, 2005) ou derramamento de Agrobacteríum no solo (Agrodrenching, Ryu etal., 2004; Yang etal., 2008), enquanto que os referidos métodos não podem ser aplicados para o tratamento em massa de plantas em um campo (revisto em Gleba et al., 2004, 2007, 2008; Lico et al., 2008; artigos originais incluem Giritch et al., 2006; Marillonnet et al, 2004, 2005; Santi et al., 2006; e documentos ideologicamente similares de outros grupos de pesquisa - Voinnet et al., 2003; Sudarshana et al., 2006; Gao et al., 2006; Mett et al., 2007; Lindbo, 2007a, b; Plesha etal., 2007, 2009; Huang etal., 2006; Regnard etal., 2009; Green etal., 2009; Shoji etal., 2009).

Deverá ser mencionado que, embora Agrobacteríum tumefaciens e A. rhizogenes sejam os vetores de DNA que são usados na maioria dos casos, há outras espécies de bactérias que podem realizar transferência de DNA similar para células de plantas (Broothaerts et al., 2005).

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Tentativas de quantificar o tratamento com Agrobacterium em plantas inteiras após infiltração a vácuo foram realizados por uns poucos grupos de pesquisa apenas. Nos documentos de Joh et al., 2005, 2006, concluiu-se que a maior densidade de bactérias usada, de 10⁹ cfu/ml, foi a melhor (em oposição a 10⁸ cfu/ml ou 10⁷ cfu/ml), conforme medido pela expressão de proteína recombinante total. Em experimentos de Lindbo, 2007a, b, resultados essencialmente similares foram obtidos conforme em nosso trabalho, no entanto, nenhuma contagem de células transfectadas foi realizada e as conclusões foram obtidas a partir dos níveis de expressão de proteínas recombinantes.

As tentativas de usar o tratamento com Agrobacterium sobre plantas inteiras sem infiltração a vácuo resultaram em um número muito reduzido de células inicialmente transfectadas, assim, limitando grandemente a aplicação prática do processo. Uma maneira de contornar esta limitação inicial divulgada na literatura é o uso de um mensageiro secundário eficaz, tal como um vírus de planta, que permita amplificação do processo inicialmente ineficiente ao complementá-lo com um movimento sistêmico e célula para célula com base em vírus (Azhakanandam et al., 2007). A distribuição com base em Agrobacterium de cópias de DNA de vírus de plantas ou vetores virais de plantas foi descrito há muito tempo (Grimsley et al., 1986 e, para TMV - Turpen et al., 1993) e permite dispersar o replicon inicial distribuído a umas poucas células de plantas para o resto do corpo usando processo de infecção viral, tal movimento célula para célula e movimento sistêmico do vírus. Tal processo tem utilidade prática limitada para os nossos propósitos porque a infecção viral altera dramaticamente o desempenho da planta; todas as aplicações atualmente consideradas estão na área de produção de proteínas recombinantes em plantas (revisto por Gleba et al., 2007, 2008). Também deve ser notado que o documento citado de Azhakanandam et al., 2007 nem sequer tenta quantificar a eficiência da transfecção inicial e se baseia em uma quantidade muito elevada de Agrobacterium nos meios de transfecção.

Partindo da técnica anterior, é um objetivo da presente invenção

9/60 proporcionar um processo eficiente de transfecção transitória de plantas de modo a ser aplicável à muitas plantas que crescem em um campo agrícola. É também um objetivo da presente invenção proporcionar um processo de alteração de um traço em plantas que crescem em um campo agrícola. Nomeadamente, é um objetivo da presente invenção proporcionar um processo eficiente que permita a transfecção transitória de plantas usando Agrobacteríum em larga escala sem a necessidade de aplicação de diferenças de pressão para introduzir Agrobacteríum no espaço intercelular das plantas. É também um objetivo proporcionar uma formulação de Agrobacteríum apropriada para esta finalidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Consequentemente, a presente invenção proporciona o seguinte:

(1) Um processo de transfecção de uma planta com um construto de ácido nucleico ou uma sequência de DNA de interesse que compreende pulverização da referida planta, tais como partes aéreas da referida planta, com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacterium e, de preferência, pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse. A referida sequência de DNA de interesse pode codificar uma proteína ou RNA a ser expresso na referida planta.

(2) Um processo de geração ou alteração de um traço em uma planta, compreendendo:

fornecimento da referida planta;

expressão, na referida planta, de uma proteína ou um RNA capaz de geração ou alteração do referido traço que compreende pulverização das partes aéreas das referidas plantas com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma se

10/60 quência de DNA de interesse, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína ou o referido RNA.

(3) Um processo de geração ou alteração de um traço em uma planta, compreendendo:

(I) crescimento da referida planta até um estado de crescimento desejado;

(li) expressão, na referida planta, de uma proteína ou um RNA capaz de geração ou alteração do referido traço que compreende pulverização das partes aéreas das referidas plantas com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína ou o referido RNA.

(4) Um processo de produção de uma proteína de interesse em uma planta compreendendo:

(i) crescimento da referida planta até um estado de crescimento desejado;

(ii) expressão, na referida planta, da referida proteína de interesse compreendendo pulverização de partes aéreas das referidas plantas com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão;

a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína de interesse.

(5) Um processo de proteção de plantas de cultura em um campo contra uma praga compreendendo:

(i) crescimento das referidas plantas no solo da referida área;

(ii) determinação, em um estado de crescimento desejado das referidas plantas, de infestação, por uma praga, de pelo menos uma das re11/60 feridas plantas;

(iii) expressão, na referida planta, de uma proteína ou um RNA que é prejudicial para a praga determinada na etapa anterior compreendendo pulverização de partes aéreas das referidas plantas com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacterium e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, a referida cepa de Agrobacterium compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse operativamente ligada a um promotor, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína ou o referido RNA.

(6) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (5), em que a referida suspensão aquosa contém as referidas células da referida cepa de Agrobacterium em uma concentração de no máximo 2,2 · 10⁷, de preferência no máximo 1,1 · 10⁷, mais preferivelmente no máximo 4,4 10⁶, ainda mais preferivelmente no máximo 1,1 · 10⁶ cfu/ml da referida suspensão.

(7) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o referido abrasivo é um veículo inorgânico em partícula para pós umedecíveis, tal como sílica ou carborundum.

(8) O processo de acordo com (7), em que a referida suspensão aquosa contém o referido abrasivo em uma quantidade compreendida entre 0,02 e 2, de preferência entre 0,05 e 1 e, mais preferivelmente, entre 0,1 e 0,5% em peso da referida suspensão.

(9) O processo de acordo com (7) ou (8), em que o tamanho médio de partículas do abrasivo adicionado à suspensão está entre 0,1 e 30, de preferência entre 0,1 e 10, mais preferivelmente entre 0,5 e 10 e, ainda mais preferivelmente, entre 0,5 e 5 pm.

(10) O processo de acordo com qualquer um de (7) a (9), em que o abrasivo tem um valor Dgo de no máximo 40 pm, de preferência no máximo 30 pm e em que o abrasivo não contém partículas com um tamanho acima de 45 pm, de preferência não acima de 40 pm.

(11) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (10), em

12/60 que a referida suspensão compreende ainda um adjuvante de pulverização agrícola, de preferência um tensoativo não iônico ou um agente de umedecimento.

(12) O processo de acordo com (11), em que o adjuvante de pulverização é um agente de umedecimento de organo-silicone, tal como Silwet L-77.

(13) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (12), em que o referido construto de ácido nucleico é flanqueado por uma sequência de borda de T-DNA sobre pelo menos um lado, o qual permite a transferência do referido construto de ácido nucleico para células da referida planta.

(14) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (13), em que o referido construto de ácido nucleico codifica um vetor de replicação viral que codifica a referida proteína de interesse, o referido vetor viral sendo incapaz de movimento sistêmico na referida planta.

(15) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (13), em que a referida sequência de DNA de interesse está operativamente ligada a um promotor ativo em células de planta.

(16) Suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacterium e pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, em que a referida suspensão aquosa contém as referidas células da referida cepa de Agrobacteríum em uma concentração de no máximo 4,4 · 10⁷, de preferência no máximo 1,1 10⁷, mais preferivelmente no máximo 4,4 · 10⁶, ainda mais preferivelmente no máximo 1,1 · 10⁶ cfu/ml da referida suspensão; a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA heteróloga que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA heteróloga de interesse que pode estar operativamente ligada a uma promotor; a referida suspensão compreendendo ainda, opcionalmente, um agente de umedecimento de preferência não iônico, tal como um tensoativo de organo-silicone.

(17) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (15), em que a referida planta é uma planta dicotiledônea.

(18) O processo de acordo com (17), em que a referida planta é

13/60 tabaco ou outras espécies do gênero Nicotiana, beterrabas sacarínicas ou outras espécies do gênero Beta, tomate, batata, pimenta, soja, alfafa, ervilha, feijão, colza ou outras espécies do gênero Brassica, algodão.

(19) O processo de acordo com qualquer um de (1) a (15), em que a referida planta é uma planta monocotiledônea.

(20) O processo de acordo com (19), em que a referida planta é arroz, milho, trigo, cevada, aveia, painço, sorgo.

(21) O processo de acordo com (4), em que a referida proteína é uma celulase usada em sacarificação de polímeros de celulose ou hemicelulose.

(22) Uso do material inorgânico em partículas para transfecção transitória de plantas. No referido uso, as plantas podem ser pulverizadas com uma suspensão aquosa contendo células de Agrobacteríum e o material inorgânico em partículas.

(23) Um processo de transfecção de uma planta que compreende pulverização de partes aéreas da referida planta com uma suspensão aquosa contendo pelo menos um abrasivo na referida suspensão, seguido por pulverização das referidas partes aéreas da referida planta com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse. A referida sequência de DNA de interesse pode codificar uma proteína ou RNA a ser expresso na referida planta.

(24) Um processo de transfecção de uma planta com um construto de ácido nucleico ou uma sequência de DNA de interesse que compreende pulverização da referida planta, tais como partes aéreas da referida planta, com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse; em que a referida suspensão aquosa contém as referidas células da referida cepa de Agrobacteríum em uma concentração de no máximo 2,2 · 10⁷, de preferência no máximo 1,1 10⁷, mais prefe

14/60 rivelmente no máximo 4,4 · 10⁶, ainda mais preferivelmente no máximo 1,1 10⁶ cfu/ml da referida suspensão e em que a referida suspensão compreende ainda um adjuvante de pulverização agrícola, de preferência um tensoativo não iônico ou um agente de umedecimento.

Os inventores da presente invenção descobriram uma maneira de aumentar fortemente a probabilidade de alcançar transfecção de planta por Agrobacterium. Os inventores descobriram que a adição de um material em partículas insolúvel em suspensões aquosas de Agrobacterium aumenta significativamente a eficiência de transfecção que pode ser obtida com pulverização de partes aéreas da planta com a suspensão. A alta eficiência conseguida permite, pela primeira vez, transfecção de plantas com suspensões de Agrobacterium em larga escala, tal como em campos agrícolas, pelo que os métodos de infiltração problemáticos que fazem uso de diferenças de pressão podem ser evitados. A invenção também permite a transfecção de plantas que, até agora, não eram passíveis de transformação por pulverização com suspensões de Agrobacterium.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 mostra esquematicamente vetores usados nos Exemplos. RB e LB representam as bordas direita e esquerda de T-DNA. P35S: promotor 35S do vírus mosaico de couve-flor, O: intensificador de tradução ômega; TNOs: terminador de sintase de nopalina; TOCs: terminador ocs.

As Figs. 2A e B representam vetores virais com base em TMV com capacidade de movimento célula para célula. Pact2: promotor do gene de actina 2 de Arabidopsis; o: extremidade 5' a partir de TVCV (vírus de obstrução de veia de nabo); RdRp: quadro de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF) RNA polimerase dependente de RNA de cr-TMV (tobamovírus que infecta crucíferas); MP: ORF de proteína de movimento de cr-TMV, N: região 3' não traduzida de cr-TMV; TNOs ou nsa: terminador de sintase de nopalina; SP: peptídeo sinalizador; segmentos brancos interrompendo segmentos cinzentos nos ORFs de RdRp e MMP indicam íntrons inseridos nestes ORFs para aumentar a probabilidade de formação de replicon de RNA no citoplasma de células de planta, o qual é descrito em detalhe no docu15/60 mento W02005049839.

A Fig. 3 representa vetores com base em TMV sem capacidade de movimento célula para célula. Uma mutação de ponto no ORF MP leva a um desvio de quadro (fs) impedindo tradução correta de MP.

As Figs. 4A e B representam vetores com base em PVX (vírus X de batata) com capacidade de movimento célula para célula. PVX-pol: RNA polimerase dependente de RNA de PVX; CP: ORF da proteína de capsídeo; 25K, 12K e 8 juntos indicam os módulos em bloco de gene triplo de 25 kDa, 12 kDa e 8 kDa de PVX, N: região 3' não traduzida de PVX.

As Figs. 5A e B mostram vetores com base em PVX com deleção da sequência de codificação da proteína de capsídeo com movimento sistêmico e célula para célula desativados.

Fig. 6. Fotografias mostrando a fluorescência de GFP a 4 dpi (days post inoculation - dias após inoculação), sob luz UV em virtude de expressão de GFP após imersão de folhas de plantas Nicotiana benthamiana durante 1 minuto em culturas agrobacterianas diluídas contendo tensoativo Silwet L-77 a 0,1% em peso, conforme descrito no Exemplo 2 . Numerais 10 ² e 10'³ mostram o fator de diluição das culturas agrobacterianas noturnas de OD = 1,5 a 600 nm e, assim, indicam uma diluição de 100 vezes e 1000 vezes, respectivamente. Os vetores usados estão indicados e podem ser associados com o vetor apropriado mostrado nas Figs. 1 a 5. 35S-GFP+P19 vetor de transcrição expressando GFP sob o controle do promotor 35S e coexpresso com supressor de silenciamento P19 (pNMD293); TMV(fsMP)-GFP e PVX(ACP)-GFP - vetores virais sem capacidade de movimento célula para célula (pNMD570 e pNMD620, respectivamente). A percentagem de células que expressam GFP (indicada) foi contada após o isolamento de protoplastos da metade esquerda da lâmina foliar.

A Fig. 7 mostra fotografias de protoplastos isolados para contagem das células que expressam GFP. Protoplastos que expressam GFP isolados após imersão de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana (Οϋβοο = 1,5, fator de diluição de 10-3). Vetor viral com base em TMV, TMV(fsMP)-GFP sem capacidade de movimento célula para célula

16/60 (pNMD570). Silwet a 0,1%, imersão de 1 min; os protoplastos foram isolados a 4 dpi.

Fig. 8. Influência da concentração de Silwet L-77 e da densidade da cultura agrobacteriana sobre a eficácia de transfecção após imersão de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana (OD₆oo= 1,5, fator de diluição de 10’² e 10'³). vetor de transcrição 35S-GFP + P19 expressando GFP sob o controle do promotor 35S e co-expresso com supressor de silenciamento P19 (pNMD293). Concentração de Silwet de 0,1% e 0,05%, imersão de 10 seg, 8 dpi.

Fig. 9. Influência da concentração de Silwet L-77 e da densidade da cultura agrobacteriana sobre a eficácia de transfecção após imersão de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana (OD₆oo = 1,5, fator de diluição de 10’² e 10’³). Vetor viral com base em TMV, TMV(fsMP)GFP sem capacidade movimento célula para célula (pNMD570). Concentração de Silwet de 0,1% e 0,05%, imersão de 10 seg, 8 dpi. Percentagem de células que expressam GFP foi contada após o isolamento de protoplastos da metade esquerda da lâmina foliar.

Fig. 10. Influência da concentração de Silwet L-77 e da densidade da cultura agrobacteriana sobre a eficiência de transfecção após imersão de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana (Οϋβοο =

1,5, fator de diluição de 10‘² e 10³). Vetor viral com base em PVC, PVX(ACP)-GFP sem capacidade movimento célula para célula (pNMD620). Concentração de Silwet de 0,1% e 0,05%, imersão de 10 seg, 8 dpi. Percentagem de células que expressam GFP foi contada após o isolamento de protoplastos da metade esquerda da lâmina foliar.

Fig. 11. Comparação das taxas de transfecção obtidas por imersão e pulverização de Nicotiana benthamiana em/com suspensões agrobacterianas. Fatores de diluição e taxas de transfecção estão indicados. A concentração de Silwet L-77 foi de 0,1% em peso. Cultura agrobacteriana cultura (pNMD570, vetor viral com base em TMV sem capacidade movimento célula para célula) foi cultivada até ODeoo = 1,5 e diluída 100 vezes (10’²) e 1000 vezes (10’³) em tampão de infiltração suplementado com Silwet L-77 a

17/60

0,1%. Duração de imersão de 10 seg. As fotografias são tiradas a 8 dpi. Percentagem de células que expressam GFP foi contada após o isolamento de protoplastos da metade esquerda da lâmina foliar.

A Fig. 12 mostra fotografias de expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria diluídas à Nicotiana benthamiana por meio de pulverização com tensoativo: vetor viral com base em TMV com capacidade de movimento célula para célula (TMV-GFP, pNMD560); suspensões agrobacteriana de ODeoo = 1,5 foram diluídas em fatores de diluição de 10'² ou 10’³, conforme indicado; Silwet L-77 a 0,1%, fotografia tirada a 8 dpi.

A Fig. 13A mostra os resultados de experimentos de transfecção por meio de infiltração (usando uma seringa sem agulha) de diferentes plantas com diluições de 100 vezes (fator de diluição de 10'²) de culturas agrobacterianas de OD₆oo = 1,5. As suspensões usadas para pulverização continham Silwet L-77 a 0,1% em peso, conforme descrito no Exemplo 3. Para cada caso, a mesma folha é mostrada sob luz normal e sob luz UV mostrando a expressão de GFP. Círculos tracejados indicam a área da folha tratada. Numerais próximo da área da folha tratada indicam a cepa/vetor usado como segue:

A) Infiltração com seringa. Vetores: 1 - TMV(fsMP)-GFP (pNMD570), 2 - TMV(MP)-GFP pNMD560), 3 - PVX(ACP)-GFP (pNMD620), 4 - PVX(CP)-GFP (pNMD630), 5 - 35S-GFP + P19 (pNMD293). Culturas agrobacterianas foram cultivadas até Οϋβοο = 1,5 e diluídas 100 vezes; fotografias tiradas a 8 dpi.

B) Similarmente conforme em A, contudo, a transfecção foi realizada por meio de infiltração a vácuo. Vetor: PVX(CP)-GFP (pNMD630). Culturas agrobacterianas foram cultivadas até OD₆₀o = 1,5 e diluídas 100 vezes; fotografias tiradas a 43 dpi.

Fig. 14. Triagem de vetor de expressão ótimo usando infiltração com uma seringa de membros da família de Asteraceae, Chenopodiaceae, Cucurbitaceae e Malvaceae. Numerais indicam as cepas/vetores usados como segue: 1 - TMV(fsMP)-GFP (pNMD570), 2 - TMV(MP)-GFP (pNMD560), 3 - PVX(ACP)-GFP pNMD620), 4 - PVX(CP )-GFP (pNMD630);

18/60

- 35S-GFP + Ρ19 (pNMD293). Fator de diluição das culturas agrobacterianas (Οϋβοο = 1,5-1,7): 10'²; fotografias tiradas a 8 dpi.

A Fig. 15 mostra fatores que intensificam a transfecção agrobacteriana: aceto-seringona (AS). Vetores: 1 - TMV(fsMP)-GFP (pNMD570), 2 TMV(MP)-GFP (pNMD560) 3 - PVX(ACP)-GFP (pNMD620), 4 - PVX(CP)GFP (pNMD630); 5 - 35S-GFP + P19 (pNMD293). Diluição das culturas agrobacterianas (OD₆oo = 1,5-1,7): 10’². Para tratamento com AS, acetosiringona (AS) a 200 μΜ foi adicionada à suspensão agrobacteriana 2 horas antes de transfecção. Para fins de comparação, folhas não transfectadas com suspensões sem AS também são mostradas (sem AS).

Fig. 16. Fotografias que mostram a expressão de GFP sob luz ultravioleta em várias espécies Nicotiana após pulverização de plantas inteiras com suspensões agrobacterians diluídas 1000 vezes de Οϋβοο = 1,0Vetores virais com base em PVX com capacidade movimento sistêmico e célula para célula foram usados (PVX(+CP)-GFP, pNMD600). Suspensões pulverizadas continham Silwet L-77 a 0,1% em peso. Fotografias tiradas a 12 dpi.

A Fig. 17 mostra a expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria diluídas à plantas de espinafre e beterrabas por meio de imersão com um tensoativo. Um vetor de transcrição, bem como vetores virais com base em TMV e PVX sem capacidade de movimento célula para célula, foram usados. Culturas agrobacterianas foram cultivadas até uma OD₆oo =1,5 e diluídas a 1:100, Silwet L-77 a 0,1%, imersão durante 10 segundos, fotografias tiradas a 12 dpi.

A Fig. 18 mostra a expressão de GFP após distribuição de Agrobactería diluídas à plantas de tomate Lycopersicon esculentum por meio de pulverização na presença de tensoativo. O vetor usado foi PVX(CP)-GFP (pNMD630). Fator de diluição da cultura agrobacteriana (OD₆oo = 1,5): 10², e Silwet L-77 a 0,1%, aceto-siringona a 200 μΜ; fotografias tiradas a 14 dpi.

A Fig. 19 mostra a expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria diluídas à plantas de Inca berry Physalis peruviana por meio de pulverização com tensoativo. Vetor PVX(CP)-GFP (pNMD630). Diluição de

19/60 cultura agrobacteriana (OD₆oo = 1,5): 10², Silwet L-77 a 0,1%, acetosiringona a 200 μΜ; fotografias tiradas a 14 dpi.

A Fig. 20 mostra uma comparação entre a transfecção por infiltração usando uma seringa e pulverização. Numerais indicam a cepa de Agrobacteríumlvetor usado. Distribuição de Agrobacteria diluídas à folhas de algodão Gossypium hirsutum L. usando infiltração com uma seringa e pulverização com suspensões agrobacterianas. Culturas agrobacterianas noturnas (cepa ICF320) foram crescidas até uma OD₆oo = 1,7-2,0, diluídas em um fator de 10’² com um tampão para infiltração e incubadas com acetosiringona a 200 μΜ durante 2 horas antes de uso. Para pulverização, as suspensões agrobacterianas foram adicionalmente suplementadas com Silwet L-77 a 0,1%.

Infiltração: 1 - TMV(fsMP)-GFP (pNMD570), 2 - TMV(MP)-GFP (pNMD560), 3 - PVX(ACP)-GFP (pNMD620), 4 - PVX(CP)-GFP (pNMD630); 5 - 35S-GFP + P19 (pNMD293).

Pulverização: TMV(MP)-GFP (pNMD560).

Planta Nicotiana benthamiana foi usada como um controle positivo.

A Fig. 21 mostra expressão de GFP em folhas de algodão Gossipium hirsutum L. infiltradas com suspensão de Agrobacteria trazendo vetores virais e de transcrição.

A) SDS-PAGE com coloração com Coomassie,

B) Western blot por hibridização com anticorpo anti-GFP (1:3000), segundo anticorpo: HRP anti-camundongo (1:5000). As fileiras são como segue:

- Folha de N. benthamiana não infectada;

- Folha de algodão não infectada;

- Folha de couve vermelha não infectada;

- Ladderde Proteína (Fermentas, # SM0671);

- TMV(fsMP)-GFP (pNMD570) em Nicotiana benthamiana;

- TMV(fsMP)-GFP (pNMD570) em algodão;

- TMV(MP)-GFP (pNMD560) em algodão;

20/60

- PVX(ACP)-GFP (pNMD620) em algodão;

- PVX(CP)-GFP (pNMD630) em algodão;

- 35S9-GFP + P19 (pNMD293) em algodão.

100 mg de material de folha foram fervidos em 600 μ!_ de 1 x tampão de Laemmli contendo beta-mercaptoetanol; alíquotas de 2,5 μΙ foram carregadas sobre o gel.

A Fig. 22 mostra expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria à folhas de Beta vulgaris vulgaris L. usando pulverização com tensoativo; influência de aceto-seringona e abrasivos. Vetor: PVX(CP)-GFP (pNMD630). Células agrobacterianas foram incubadas com aceto-siringona a 200 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Para tratamento com abrasivo, carborundum a 0,3% (mistura de partículas de carbureto de silício F800, F1000 e F1200, Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Áustria) foi adicionado à suspensão agrobacteriana. Fator de diluição de Agrobactería de OD₆oo = 1,4: 10’². Pontos expressando GFP sobre as folhas estão indicados à direita.

A Fig. 23 mostra expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria diluídas à plantas de espécies diferentes por meio de pulverização com um tensoativo e abrasivos. Vetores: TMV(MP)-GFP (pNM600) e PVX(CP)-GFP (pNMD630), fator de diluição da cultura agrobacteriana (OD₆oo = 1,5): 10“², Silwet L-77 a 0,1%, carbureto de silício a 0,3%.

A Fig. 24 mostra expressão após triplos tratamentos subsequentes de plantas Nicotiana benthamina com Agrobactería trazendo vetores virais. Imersão de folhas foi realizada com intervalo de 7 dias na ordem:

A) PVX(ACP)-GFP, PVX(CP)-DsRed, TMV(MP)-GFP;

B) TMV(fsMP)-GFP, PVX(CP)-DsRed, PVX(CP)-GFP;

C) PVX(ACP)-GFP, TMV(MP)-DsRed, PVX(CP)-GFP;

D) TMV(fsMP)-GFP, PVX(CP)-DsRed, TMV(MP)-GFP;

E) TMV(fsMP)-GFP, TMV(MP), DsRed, TMV(MP)-GFP;

F) PVX(ACP)-GFP, TMV(MP), DsRed, TMV(MP)-GFP;

G) TMV(fsMP)-GFP, PVX(CP)-DsRed, TMV(MP)-GFP;

H) PVX(ACP)-GFP, PVX(CP)-DsRed, TMV-GFP.

21/60

Tratamentos simples:

I) TMV(fsMP)-GFP;

J) PVX(ACP)-GFP;

K) TMV(MP)-GFP;

L) PVX(CP)-GFP;

M) TMV(MP);e

N-DsRed) PVX(CP)-DsRed.

Fig. 25. Análise de expressão de GFP em plantas Nicotiana benthamiana pulverizadas com suspensões agrobacterianas (fator de diluição de 10-2) trazendo vetores TMV(MP)-GFP (pNM600) e PVX(CP)-GFP (pNMD630).

A) Fotografia de plantas Nicotiana benthamiana transfectadas por pulverização, tirada a 15 dpi.

B) SDS-PAGE com coloração com Coomassie; gel a 12%, condições de redução. Folhas de plantas N. Benthamiana transfectadas por pulverização expressando GFP) foram coletas em 15 dpi. O material de planta foi extraída com 6 volumes de 1 x tampão de Laemmli contendo betamercaptoetanol. Após aquecimento a 95°C, alíquotas de 10 μΙ foram carregadas sobre o gel.

L - Ladderde Proteína (Fermentas, # SM0671);

- TMV(MP)-GFP, planta 1;

- TMV(MP)-GFP, planta 2;

- TMV(MP)-GFP, planta 3;

- PVX(CP)-GFP, planta 1;

- PVX(CP)-GFP, planta 2;

- PVX(CP)-GFP, planta 3;

U - Tecido foliar de N. benthamiana não infectado;

- TMV(MP)-GFP, planta infiltrada a vácuo;

- PVX(CP)-GFP, planta infiltrada a vácuo.

RbcL - subunidade grande de RUBISCO.

Fig. 26. SDS-PAGE com coloração com Coomassie para análise de alfa-interferon humano (Hu-IFN-αΑ) e Klip7-Mini-lnsulina expresso em

22/60 plantas de Nicotiana benthamiana pulverizadas com suspensões agrobacterianas de vetores virais com base em TMV capazes de movimento célula para célula.

A) Hu-IFN-αΑ: vetores pNMD38 e pNMD45, fator de diluição de 10'² da cultura agrobacteriana, coleta a 12 dpi.

L - Ladderde Proteína (Fermentas, # SM0671);

- pNMD38, infiltração com seringa;

- pNMD38, pulverização, Folhai;

- pNMD38, pulverização, Folha2;

- pNMD38, pulverização, Folha3;

- pNMD45, pulverização, Folhai;

- pNMD45, pulverização, Folha2;

- pNMD45, pulverização, Folha3;

U - Tecido foliar de N. Benthamiana infectado.

B) Klip27-Mini-lnsulina: vetor pNMD331, fatores de diluição de 10‘² e 10’³ da cultura agrobacteriana, coleta a 12 dpi.

L - Ladderde Proteína (Fermentas, # SM0671);

- pNMD331, infiltração com seringa, diluição de 10’³;

- pNMD331, pulverização, diluição de 10’³;

- pNMD331, infiltração com seringa, diluição de 10‘³.

O material de planta foi extraído com 6 volumes de 1 x tampão de Laemmli contendo beta-mercaptoetanol. Alíquotas de 10 μΙ foram separadas em gel de poliacrilamida a 15% sob condições de redução.

Fig. 27. Expressão de celulases em plantas N. benthamiana obtida por meio de pulverização de culturas agrobacterianas diluídas trazendo vetores TMV capazes de movimento célula para célula (7 e 10 dpi). Plantas N. benthamiana foram inoculadas com diluições a 10’² (painel superior) e 10' ³ (painel inferior) de culturas de Agrobacterium (OD₆oo = 1,3) através de uma seringa sem agulha ou pulverização com Silwet L-77 a 0,1%. Os níveis de proteína de fusão de celulase foram analisados em extratos brutos usando SDS-PAGE com coloração com Coomassie. Para extratos brutos, 50 mg de material de planta (amostras combinadas de 3 folhas independentes), cole

23/60 tado a 10 dpi, foram triturados em nitrogênio líquido, extraídos com 5 vol. 2 x tampão de Laemmli e desnaturados a 95°C durante 5 min. 7,5 μΙ de cada amostra foram analisadas através de SDS-PAGE a 10% e coloração com Coomassie.

L - Ladderde proteína (Fermentas, # SM0671);

- Tecido foliar de N. benthamiana não infectado;

- Exocelulase E3 de Thermobifída fusca direcionada ao apoplasto,

- Exoglucanase 1 (CBH 1) de Trichoderma reesei direcionada ao apoplasto;

- β-glicosidase BGL4 de Humicola grísea direcionada aos cloroplastos;

- β-glucosidase BGL4 de Humicola grisea expressa no citosol;

- β-glucosidase BGL4 de Humicola grisea His-marcada;

- Exocelulase E3 de Thermobifída fusca direcionada aos cloroplastos;

- Endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus direcionada ao apoplasto.

Fig. 28. Indução da biossíntese de antocianina em folhas de Nicotiana tabacum via expressão transitória, por meio de infiltração, de fator de transcrição MYB de antocianina 1 (ANT1) de Lycopersicon esculentum (AAQ55181). 7 dpi, de cultura Agrobacteríum (OD₆oo = 1,4), fator de diluição de To·².

Fig. 29. Alterações morfológicas em plantas Nicotiana benthamiana causadas pela expressão transitória do gene de transferase de isopentenila (ipt) distribuído por pulverização com Agrobactería diluídas trazendo o vetor de transcrição contendo a sequência de codificação de ipt sob o controle do promotor 35S. Cultura de Agrobacteríum (OD₆oo = 1 >4) foi diluída por um fator de 10’² e suplementada com Silwet L-77 a 0,1%. Fotografia tirada a 45 dpi.

A) Habitat de plantas transfectadas. IPT - Plantas pulverizadas com a cultura agrobacteriana diluída (construto PNMD460), controle - planta

24/60 pulverizada com tampão para transfecção não contendo Agrobactería.

B) Folhas de plantas transfectadas. Parte Superior: folhas de planta pulverizadas com tampão para transfecção não contendo Agrobactería. Parte Inferior: folhas de planta pulverizadas com a cultura agrobacteriana diluída (construto pNMD460).

Fig. 30. Expressão transitória de endotoxinas de Bacillus thuringiensis após pulverização com culturas agrobacterianas diluídas trazendo vetores de expressão com base em PVX correspondentes protege plantas Nicotiana benthamiana contra danos por alimentação por larvas do tabaco Manduca sexta. As plantas foram pulverizadas com as culturas de Agrobacterium (Οϋβοο = 1,4-1,7) diluídas pelo fator de 10’² e suplementada com Silwet L-77 a 0,1%. Duas semanas depois, três larvas no estágio 3 foram deixadas se alimentar sobre cada planta. Fotografias foram tiradas a 2 semanas após o início da alimentação.

Fig. 31. Fenótipos de N. benthamiana expressando transitoriamente defensina MsrA2 e GFP via vetores com base em TMV com capacidade de movimento célula para célula (pNMD1071 e pNMD560, respectivamente). Inoculação com Pseudomonas foi realizada a 3 dias após inoculação com Agrobacterium. Fotografias foram tiradas a 4 dias após inoculação com Pseudomonas. Inoculação de folhas com Agrobacterium e Pseudomonas foi realizada usando uma seringa sem agulha.

A Fig. 32 mostra a expressão de GFP após distribuição de Agrobacteria à folhas de berinjela Solanum melongena L. usando pulverização com tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%); influência do abrasivo. Vetor: PVX(CP)GFP (pNMD630). Células agrobacterianas (cepa ICF320) foram incubadas com aceto-siringona a 200 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Para tratamento com abrasivo, carborundum a 0,3% (mistura de partículas de carboneto de silício F800, F1000 e F1200, Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Áustria) foi adicionado à suspensão agrobacteriana. Fator de diluição de Agrobactería de OD₆oo = 1,3: 10'². Fotografias foram tiradas a 19 dpi. O número de pontos que expressam GFP é fornecido à direita.

A Fig. 33 mostra a expressão de GFP após distribuição de A

25/60 grobacteria à folhas de pimenta Capsicum annuum L. cv Feher Gelb usando pulverização com tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%), a ação sinergística de aceto-seringona e abrasivos. Vetor: PVX(CP)-GFP (pNMD630). Células agrobacterianas (ICF320 cepa) foram incubadas com aceto-siringona a 200 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Para tratamento com abrasivo, carborundum a 0,3% (mistura de partículas de carboneto de silício F800, F1000 e F1200, Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Áustria) foi adicionado à suspensão agrobacteriana. Fator de diluição de Agrobactería de OD₆oo = 1,4: 10'². Fotografias foram tiradas a 18 dpi. O número de pontos que expressam GFP é fornecido à direita.

A Fig. 34 representa a expressão de GFP após distribuição de Agrobactería à folhas de batata Solanum tuberosum L. cv Mirage usando infiltração a vácuo e pulverização com tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%); comparação de infiltração a vácuo e pulverização. Vetor: PVX(CP)-GFP (pNMD630). Células agrobacterianas (ICF320 cepa) foram incubadas com aceto-siringona a 200 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Fator de diluição de Agrobactería de Οϋθοο = 1,5: 10'². Fotografias foram tiradas a 14 dpi.

A Fig. 35 mostra a expressão de GUS após distribuição de Agrobacteria à folhas de colza Brassica napus L. usando infiltração com uma seringa e pulverização com o tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%). Vetor: 35SGUS + 35S-P19 (pNMD1971). Células agrobacterianas (cepa EHA105) foram incubadas com aceto-siringona 200 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Fator de diluição de Agrobactería de OD₆oo = 1,3: 10‘¹ e 10'². Infiltração com seringa: 1: diluição da cultura agrobacteriana a 10'¹, 2: diluição da cultura agrobacteriana a 10'². Para pulverização, diluição da cultura agrobacteriana a 10‘¹ foi usada. Fotografias para folhas infiltradas e pulverizadas foram tiradas a 5 e 13 dpi, respectivamente.

A Fig. 36 representa a expressão de GUS após distribuição de Agrobactería à folhas de cebola Allium cepa cv Stuttgarter pulverizadas com Agrobactería usando tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%). Células agrobacterianas (cepas EHA105 e GV3101) foram incubadas com aceto-siringona a 200

26/60 μΜ durante 2 horas antes de pulverização. Vetores: 35S-GUS + 35S-P19 (pNMD1971) e promotor de actina de arroz-GUS + 35S-P19 (pNMD2210). Fator de diluição de Agrobacteria de ODgoo = 1.3: 10'¹. Fotografias foram tiradas a 11 dpi.

A Fig. 37 mostra o foto-branqueamento, por meio de silenciamento gênico, de desaturase de fitoeno (PDS) em folhas de Nicotiana benthamina após distribuição, mediada por Agrobacteríum, de construtos de PVX trazendo o fragmento da sequência de codificação de PDS na orientação anti-senso; comparação de infiltração com uma seringa e pulverização com tensoativo (Silwet L-77 a 0,1%). Vetor: PVX(CP)-antiPDS (pNMD050); cepa GV3101 de Agrobacteríum tumefaciens. Factor de diluição de Agrobacteria de OD₆oo = 1,5: 10‘². Fotografias foram tiradas a 21 dpi e 140 dpi.

A Fig. 38 mostra efeito de expressão transitória de flagelina sobre a infecção de Nicotiana benthamiana por Pseudomonas. A) Folhas de plantas Nicotiana benthamiana infectadas com Pseudomonas syringae pv. syríngae B728a. B) Sintomas da doença contados como o número de lesões necróticas (vide pontos negros) por uma folha. 1 - planta preliminar pulverizada com suspensão agrobacteriana (cepa ICF320) trazendo vetor PVX(CP) que permite a expressão de fusão traducional de flagelina de comprimento total (YP236536) de Pseudomonas syríngae pv. syringae B728a com peptídeo sinalizador de apoplasto de α-amilase de cevada (pNMD1953), 2 - planta preliminar pulverizada com células agrobacterianas (ICF320 cepa) sem qualquer vetor que contém T-DNA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na invenção, são usadas Agrobacteria para transfecção de plantas com uma sequência ou construto de interesse por meio de pulverização com suspensões aquosas contendo células de uma cepa de Agrobacteríum. A cepa de Agrobacteríum pode pertencer à espécies de Agrobacteríum tumefaciens ou Agrobacteríum rhizogenes que são vulgarmente usadas para transformação e transfecção de planta e as quais são conhecidas por aqueles versados no campo. A cepa de Agrobacteríum compreende uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma

27/60 sequência de DNA de interesse. A sequência de DNA de interesse codifica uma proteína ou um RNA a ser expresso em planta. O construto de ácido nucleico está, tipicamente, presente no T-DNA de plasmídeos Ti para a introdução do construto de ácido nucleico em células de planta através do sistema de secreção da cepa de Agrobacteríum. Sobre pelo menos um dos lados ou em ambos os lados, o construto de ácido nucléico é flanqueado por uma sequência de borda de T-DNA para permitir a transfecção da(s) referida^) planta(s) e introdução de células da referida planta com a referida sequência de DNA de interesse. No construto de ácido nucleico, a sequência de DNA de interesse está presente de modo a ser expressa em células de planta. Para este efeito, a sequência de DNA de interesse está, no referido construto de ácido nucleico, normalmente sob o controle de um promotor ativo em células de planta. Exemplos da sequência de DNA de interesse são uma sequência de DNA que codifica um replicon de DNA viral ou um replicon de RNA viral ou um gene a ser expresso. O gene pode codificar um RNA de interesse ou uma proteína de interesse a ser expressa em células da(s) planta(s). Também, os replicons virais normalmente codificam um RNA ou uma proteína de interesse a ser expressa em plantas. O construto de DNA pode compreender, além da sequência de DNA de interesse, outras sequências, tais como sequências reguladoras, para expressão da sequência de DNA de interesse. Transferência de genes e respectivos vetores mediada por Agrobacteríum é conhecida por aqueles versados no campo, por exemplo, a partir das referências citadas na introdução ou livros de texto em biotecnologia de planta, tal como Slater, Scott e Fowler, Plant Biotechnology, segunda edição, Oxford University Press, 2008.

Em modalidades em que forte expressão de uma proteína ou RNA é desejada ou em que acúmulo de ácidos nucleicos virais em grandes quantidades em células de plantas e possíveis efeitos negativos sobre a saúde das plantas não são um problema, o construto de ácido nucleico pode codificar um vetor de replicação viral que pode se reproduzir em células de planta. Para ser reproduzível, o vetor viral contém uma origem de replicação que pode ser reconhecida por uma polimerase de ácido nucleico presente

28/60 em células de planta, tal como a polimerase viral expressa a partir do replicon. No caso de vetores virais de RNA, os replicons virais podem ser formados por meio de transcrição sob o controle de um promotor de planta a partir do construto de DNA após este ter sido introduzido na célula de planta. No caso de replicons de DNA virais, os replicons virais podem ser formados por meio de recombinação entre dois sítios de recombinação que flanqueiam a sequência de codificação do replicon viral no construto de DNA, por exemplo, conforme descrito nos documentos WOOO/17365 e WO 99/22003. Se replicons virais são codificados pelo construto de DNA, replicons virais de RNA são preferidos. Uso de replicons virais de DNA e RNA foi amplamente descrito na literatura, pelo menos ao longo dos últimos 15 anos. Alguns exemplos são as seguintes Publicações de Patente da Icon Genetics: W02008028661, WO2007137788, WO 2006003018, W02005071090, W02005049839, W002097080, WO02088369, WO02068664. Um exemplo de vetores virais de DNA são aqueles que se baseiam em geminivírus. Para a presente invenção, vetores virais ou replicons que se baseiam em vírus de RNA de planta, nomeadamente com base em vírus de RNA fita simples +senso, são preferidos. Exemplos de tais vetores virais são vírus mosaico do tabaco (TMV) e vírus Potex X (PVX) usados nos exemplos. Vetores virais e sistemas de expressão que se baseiam no vírus Potex são descritos no documento EP2061890. Muitos outros replicons virais de planta são descritos nas Publicações de Patentes mencionadas acima.

A suspensão aquosa usada para pulverização nos processos da invenção pode ter uma concentração de células de Agrobacterium de no máximo 1,1 10⁹ cfu/ml, o qual corresponde aproximadamente a uma cultura de Agrobacterium em meio LB de uma densidade óptica a 600 nm de 1. Em virtude da alta eficiência de transfecção obtida na invenção, concentrações muito mais baixas podem, contudo, ser usadas, a qual permite tratamento de muitas plantas, tais como campos agrícolas inteiros, sem a necessidade de grandes fermentadores para a produção de Agrobacterium. Assim, a concentração é, de preferência, no máximo, 2,2 10⁷ cfu/ml, mais preferivelmente no máximo 1,1 10⁷ cfu/ml, mais preferivelmente no máximo 4,4 · 10⁶

29/60 cfu/ml. Em uma modalidade, a concentração é de no máximo 1,1 · 10⁶ cfu/ml de suspensão. Para evitar determinação de concentrações de células em termos de CFU/ml, concentrações de suspensões agrobacterianas são, frequentemente, avaliadas medindo-se a densidade óptica aparente a 600 nm usando um espectrofotômetro. Aqui, a concentração de 1,1 10⁷ cfu/ml corresponde a uma densidade óptica a 600 nm calculada de 0,01, em que a densidade óptica calculada é definida por uma diluição de 100 vezes com água ou tampão de uma suspensão que tem uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm. Do mesmo modo, as concentrações de 4,4 · 10⁶ cfu/ml e 1,1 - 10⁶ 10 cfu/ml correspondem a uma densidade óptica a 600 nm calculada de 0,004 e 0,001, respectivamente, em que as densidades ópticas calculadas são definidas por uma diluição de 250 vezes ou 1000 vezes, respectivamente, com água ou tampão de uma suspensão que tem uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm.

O abrasivo que pode ser usado na invenção é um material em partículas que é essencialmente insolúvel na suspensão aquosa de células de Agrobacterium. Acredita-se que o abrasivo enfraqueça, nomeadamente se for usado em conjunto com um agente de umedecimento, a superfície do tecido de planta, tal como folhas e, deste modo, facilita a penetração de cé20 lulas de Agrobacterium no espaço intercelular do tecido de planta. Como um resultado, eficiência de transfecção aumenta.

O material em partículas a ser usado como o abrasivo da presente invenção pode ser um material de suporte, conforme comumente usado como veículos em pó umedecível (Wettable Powder - WP) de formula25 ções pesticidas. No contexto de pós umedecíveis, estes veículos são também referidos no campo de formulações de pesticidas como agentes de enchimento ou agentes de enchimento inertes. Formulações de pós umedecíveis são parte do conhecimento geral no campo de proteção de plantas. Referência é feita ao livro PESTICIDE SPECIFICATION, Manual For Deve30 lopment and Use of FAO e WHO Specifications for Pesticides, editado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e Agriculture Organization of the United States, Roma, 2002, ISBN 92 -5-104857-6. Formulações de pós umede

30/60 cíveis para proteção de planta são, por exemplo, descritas nos documentos EP 1810569, EP1488697, EP1908348 e EP0789510. O abrasivo pode ser um material mineral, tipicamente um material inorgânico. Exemplos de tais materiais veículo são terra diatomácea, talco, argila, carbonato de cálcio, bentonita, argila ácida, atapulgita, zeólito, sericita, sepiolita ou silicato de cálcio. Também é possível o uso de pó de quartzo, tal como o pó de quartzo de alta pureza descrito no documento WO02/087324. Exemplos preferidos são sílica, tal como sílica hidrofílica fumegada e precipitada e carborundum. As propriedades abrasivas de diluentes ou agentes de enchimento, tal como sílica, usados em pós umedecíveis são conhecidas (vide Pesticide Application Methods por G.A. Matthews, terceira edição, Science Blackwell, 2000, na página 52 do mesmo).

Como produtos comerciais de materiais inorgânicos em partícula para uso como abrasivos na invenção, a sílica hidrofílica Sipernat™ 22S e Sipernat™ 50S fabricadas pela Degussa Evonic podem ser mencionadas. Outros produtos são Hi-Sil™ 257, uma sílica sintética, amorfa, hidratada produzida pela PPG Industries Ltda. Taiwan ou Hubersorb™ 600, um silicato de cálcio sintético fabricado pela Huber Corporation. Uma sílica comercial de tamanho submicrônico é Hi-Sil™ 233 (PPG Industries) tendo um tamanho médio de partícula de cerca de 0,02 pm.

O abrasivo pode ter um tamanho mediano de partícula entre 0,01 e 40, de preferência entre 0,015 e 30, mais preferivelmente entre 0,05 e 30, ainda mais preferivelmente entre 0,1 e 30, ainda mais preferivelmente entre 0,1 e 20, ainda mais preferivelmente entre 0,5 e 20 e, ainda mais preferivelmente, entre 1,0 e 16 pm. Em uma modalidade, o tamanho mediano de partícula está entre 0,015 e 1 ou entre 0,02 e 0,5 mícrons. O tamanho mediano de partícula é o tamanho mediano de partícula em volume que pode ser medido por meio de difração a laser usando um Mastersizer™ da Malvern Instruments, Ltda. De modo a evitar o entupimento dos bocais de pulverização, o tamanho máximo de partícula das maiores partículas contidas no abrasivo deve ser no máximo 45 pm, de preferência no máximo 40 pm, o qual pode ser determinado por peneiramento. Esta condição é consi

31/60 derada satisfeita se o resíduo na peneira está abaixo de 1,5% em peso (de acordo com a norma ISO 3262-19). O abrasivo pode ter um valor D₉₀ de no máximo 40 pm, de preferência no máximo 30 pm, medido por meio de difração de laser, tal como descrito acima. Normalmente, os tamanhos de partícula acima referem-se a tamanhos de partículas primárias.

O teor do abrasivo na suspensão aquosa da invenção pode estar entre 0,01 e 3, de preferência entre 0,02 e 2, mais preferivelmente entre 0,05 e 1 e, ainda mais preferivelmente, entre 0,1 e 0,5% em peso da referida suspensão.

A suspensão aquosa da invenção contém, de preferência, um adjuvante de pulverização agrícola. O adjuvante de pulverização pode ser um tensoativo ou agente de umedecimento. O tensoativo e agente de umedecimento têm múltiplas vantagens da presente invenção. Ele reduz a tensão superficial da água da suspensão aquosa e torna a superfície cerosa de folhas de planta mais permeável para Agrobactería. Ainda, ele aprimora a estabilidade da suspensão e reduz a sedimentação do abrasivo na suspensão. Tensoativos usados na presente invenção não estão particularmente limitados e exemplos dos tensoativos incluem (A), (B) e (C) a seguir. Estes podem ser usados isoladamente ou em combinação.

(A) Tensoativos não iônicos: uma medida frequentemente usada para descrever tensoativos é o HLB (equilíbrio hidrofílico/lipofílico). O HLB descreve a capacidade do tensoativo de associar com compostos hidrofílicos e lipofílicos. Tensoativos com um alto equilíbrio HLB se associam melhor com compostos solúveis em água do que com os compostos solúveis em óleo. Aqui, o valor de HLB deve ser de 12 ou mais, de preferência pelo menos 13. Como tensoativos não iônicos, tensoativos de organo-silicone, tal como heptametil tri-siloxano modificado com óxido de polialquileno, são mais preferidos na presente invenção. Um produto comercial é o adjuvante para pulverização Silwet L-77™ da GE Advanced Materiais.

(A-1) Tensoativos do tipo polietileno glicol: exemplos tensoativos do tipo polietileno glicol incluem alquil polioxietileno (C12-18), éter, produto de adição de óxido de etileno de alquilnaftol, polioxietileno (mono ou di) al

32/60 quil-éter (C8-12) fenil, produto de condensação de formaldeído de polioxietileno (mono ou di) alquil (C8-12) fenil éter de polioxietileno (mono, di, ou tri)fenil fenil éter de polioxietileno (mono, di, ou tri)-benzil fenil éter, polioxietileno (mono, di, ou tri) benzil fenil éter de polioxietileno (mono, di, ou tri) fenil éter estiril, polioxipropileno (mono, di ou tri) fenil éter de estiril, um polímero de polioxietileno (mono, di, ou tri) fenil éter estiril, um bloco de polioxietileno polioxipropileno polímero, um radical alquilo (C12-18) polioxietileno polioxipropileno de bloco éter polímero, um alquil (C8-12)-fenil polioxietileno polioxipropileno bloco polímero de éter, éter bisfenil polioxietileno, éster de polioxietileno de ácido de resina, ácido graxo de polioxietileno-(C12-18) monoéster, graxo de polioxietileno ácido (C12-18) de diéster, o ácido graxo de polioxietileno sorbitan (C12-18), éster de aduto de óxido de etileno de glicerina de éster de ácido graxo, adutos de óxido de etileno de óleo de rícino, adutos de óxido de etileno de óleo de rícino endurecido, aduto de óxido de etileno de alquil (C12 -8 amina) e aduto de óxido de etileno de ácidos graxos (C12-18) amida.

(A-2) Tensoativos do tipo álcool polivalente: exemplos de tensoativos do tipo álcool polivalente incluem éster de ácido graxo de glicerol, éster de ácido graxo de poliglicerina, éster de ácido graxo de pentaeritritol, éster de (C12-18) ácido graxo de sorbitol, éster de (C12-18) ácido graxo de sorbitan,éster de ácido graxo de sacarose, alquil éter de álcool polivalente e alcanol amida de ácido graxo.

(A-3) Tensoativos do tipo acetileno: exemplos de tensoativos do tipo acetileno incluem acetileno glicol, álcool acetilênico, aduto de óxido de etileno de acetileno glicol e aduto de óxido de etileno de álcool acetilênico.

(B) Tensoativos aniônicos:

(B-1) Tensoativos do tipo ácido carboxílico: exemplos de tensoativos do tipo ácido carboxílico incluem ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, ácido polimaleico, copolímeros de ácido maleico e olefina (por exemplo, isobutileno e di-isobutileno), um copolimero de ácido acrílico e ácido itacônico, um copolimero de ácido metacrílico e ácido itacônico, um copolimero de ácido maleico e estireno, um copolimero de ácido acrílico e ácido metacríli

33/60 co, um copolímero de ácido acrílico e acrilato de metila, um copolímero de ácido acrílico e acetato de vinila, um copolímero de ácido acrílico e ácido maleico, N-metil-ácido graxo (C12-18) sarcosinato, ácidos carboxílicos, tais como ácido de resina e (C12-18) ácidos graxos e similares e sais destes ácidos carboxílicos.

(B-2) Tensoativos do tipo éster sulfato: exemplos de tensoativos do tipo éster sulfato incluem (C12-18) alquil éster sulfato, (C12-18) alquil éter sulfato de polioxietileno, (mono ou di) (C8-12) alquil fenil éter de polioxietileno (mono ou di) alquil (C8-12) de éter fenil éster de sulfato, éster de sulfato de um polioxietileno (mono ou di) alquil (C8-12) polímero de éter fenil, éter polioxietileno (mono, di, ou tri)-fenil fenil éster de sulfato de éter de polioxietileno (mono, di, ou tri) fenil éter benzílico éster de sulfato, de polioxietileno (mono, di, ou tri)-éster sulfato de estiril fenil éter, éster de sulfato de um polioxietileno (mono, di, ou tri) fenil éter estiril polímero, éster de sulfato de um bloco de polioxietileno polioxipropileno polímero, óleo sulfatado, éster de ácido graxo sulfatado, ácidos graxos sulfatados, éster de sulfato de olefina sulfatado e similares e sais destes ésteres de sulfato.

(B-3) Tensoativos do tipo ácido sulfônico: exemplos de tensoativos do tipo ácido sulfônico incluem ácido sulfônico de (C12-22) parafina, ácido (C8-12) alquil-benzeno sulfônico, o produto da condensação de formaldeído de um ácido (C8-12) alquil-benzeno sulfônico, produto de condensação de formaldeído e ácido cresol sulfônico, ácido sulfônico de (C14-16) olefinas, ácido (C8-12) dialquil sulfo-succínico, ácido sulfônico de lignina, ácido sulfônico de (mono ou di) (C8-12) alquil fenil éter de polioxietileno, sulfo-succinato de (C12-18) alquil éter de meio-éster de polioxietileno, ácido naftaleno sulfônico, ácido (mono ou di) (C1-6) alquil naftaleno sulfônico, o produto da condensação de formaldeído e ácido naftaleno sulfônico, o produto da condensação de formaldeído e ácido (mono ou di) (C1-6) alquil naftaleno sulfônico, o produto da condensação de formaldeído e ácido sulfônico de óleo de creosoto, alquil (C8-12) difenil éter de ácido di-sulfônico, Igepon T (marca registrada), ácido poliestireno sulfônico, ácido sulfônico de um copolímero de ácido estireno sulfônico - ácido metacrílico e similares e sais destes ácidos sul34/60 fônicos.

(B-4) Tensoativos do tipo éster de fosfato: exemplos de tensoativos do tipo éster de fosfato incluem éster de fosfato de (C8-12) alquila, éster de fosfato de (C12-18) alquila de polioxietileno, éster de fosfato de (mono ou di) (C8-12) alquil fenil éter de polioxietileno, éster de fosfato de um polímero de (mono, di ou tri) (08-12) alquil fenil éter de polioxietileno, éster de fosfato de (mono, di, ou tri) fenil fenil éter de polioxietileno, éster de fosfato de (mono, di ou tri) benzil fenil éter de polioxietileno, éster fosfato de (mono, di ou tri) estiril fenil éter de polioxietileno, éster de fosfato de um polímero de (mono, di, ou tri) estiril fenil éter de polioxietileno, éster de fosfato de polímero em bloco de polioxietileno - polioxipropileno, fosfatidil colina, éster de fosfato de fosfatidil etanolimina e ácido fosfórico condensado (por exemplo, tal como ácido tripolifosfórico) e similares e sais destes ésteres de fosfato.

Sais de (B-1) a (B-4) mencionados acima incluem metais alcalinos (tais como sódio, lítio e potássio), metais alcalinos terrosos (tais como cálcio e magnésio), amônio e vários tipos de aminas (tal como alquilaminas, cicloalquilaminas e alcanol aminas).

(C) Tensoativos Anfotéricos: exemplos de tensoativos anfotéricos incluem tensoativos do tipo betai na e tensoativos do tipo aminoácido.

Os tensoativos acima podem ser usados isoladamente ou em combinação de dois ou mais tensoativos. Notavelmente, os tensoativos de organo-silicone preferidos podem ser combinados com outros tensoativos. A concentração total de tensoativos na suspensão aquosa da invenção pode ser facilmente testada realizando experimentos de pulverização comparativos, similarmente àqueles feitos nos exemplos. No entanto, em geral, a concentração total de tensoativos pode estar entre 0,005 e 2% em volume, de preferência entre 0,01 e 0,5% em volume, mais preferivelmente entre 0,025 e 0,2% em volume da referida suspensão. Uma vez que a densidade de tensoativos está, em geral, próxima de 1,0 g/ml, a concentração total de tensoativos pode ser definida como estando entre 0,05 e 20 g por litro da referida suspensão, de preferência entre 0,1 e 5,0 g, mais preferivelmente entre 0,25 e 2,0 g por litro da referida suspensão (incluindo abrasivo). Se os tensoativos

35/60 de organo-silicone acima, tal como hetapmetil tri-siloxano modificado com óxido de polialquileno, são usados, a concentração de tensoativo de organosilicone na suspensão agrobacteriana usada para pulverização pode estar entre 0,01 e 0,5% em volume, de preferência entre 0,05 e 0,2% em volume. Alternativamente, a concentração de tensoativo de organo-silicone na suspensão agrobacteriana usada para pulverização pode ser definida como estando entre 0,1 e 5,0 g, de preferência entre 0,5 e 2,0 g por litro da referida suspensão.

De forma a aprimorar as propriedades físicas da suspensão aquosa, é possível adicionar ácido silícico (sílica) de tamanho submicrônico altamente disperso ou polímeros porosos, tais como ureia/formaldeído (Pergopak™). Notavelmente, onde o tamanho médio de partículas do abrasivo está entre 0,1 e 30 pm ou em uma das sub-faixas deste intervalo fornecidas acima, é possível adicionar uma sílica altamente dispersa de tamanho submicrônico à suspensão. Aqui, sílica com tamanho submicrônico é sílica tendo um tamanho médio de partícula entre 0,01 e 0,5 pm, de preferência entre 0,02 e 0,5 pm, mais preferivelmente entre 0,02 e 0,1 p m. Ácido silícico altamente disperso, tal como Hi-Sil™ 233 (PPG Industries), pode contribuir para as propriedades abrasivas da suspensão aquosa (vide Jensen et al., Bull. Org. Mond. Sante, Bull. Wld Hlth Org. 41 (1969) 937-940). Estes agentes podem ser incorporados em uma quantidade de 1 a 10 g por litro da suspensão da invenção.

Outros possíveis aditivos à suspensão agrobacteriana são substâncias tampão para manter o pH da suspensão usada para a pulverização em um pH desejado, tipicamente entre 7,0 e 7,5. Ainda, sais inorgânicos solúveis, tal como cloreto de sódio, podem ser adicionados para ajustar a resistência iônica da suspensão. Caldo nutriente, tal como meio LB, também pode estar contido na suspensão.

A suspensão aquosa pode ser produzida como segue. Em um método, a suspensão de Agrobacterium a ser usada no processo da invenção é inoculada em meio de cultura e cultivada em uma alta concentração celular. Culturas maiores podem ser inoculadas com volumes pequenos de

36/60 um meio de cultura altamente concentrado para obtenção de grandes quantidades de meio de cultura. Agrobacteria são, em geral, cultivadas até uma concentração de células que corresponde a uma OD a 600 nm de pelo menos 1, tipicamente cerca de 1,5. Tais suspensões agrobacterianas altamente concentradas são, então, diluídas para obter a concentração celular desejada. Para diluição de suspensões agrobacterianas altamente concentradas, água é usada. A água pode conter um tampão. A água pode conter adicionalmente o tensoativo da invenção. Alternativamente, as suspensões agrobacterianas concentradas podem ser diluídas com água e quaisquer aditivos, tais como o tensoativo e as substâncias tampão opcionais, são adicionados durante ou após o processo de diluição. O abrasivo pode ser adicionado antes, durante ou após diluição. No entanto, é preferível agitar a suspensão durante adição do abrasivo para dispersar uniformemente o abrasivo na suspensão agrobacteriana. A etapa de diluição da suspensão agrobacteriana concentrada pode ser realizada no tanque de pulverização do pulverizador usado para pulverizar as suspensões diluídas.

O pulverizador de ser usado no processo da invenção depende, principalmente, do número de plantas ou da área a ser pulverizada. Para uma ou um pequeno número de plantas a serem pulverizadas, pulverizadores de bomba, conforme amplamente usados no lar e jardinagem, podem ser usado. Estes podem ter volumes do tanque de pulverização entre 0,5 e 2 litros. Para aplicações em escala mediana, pulverizadores hidráulicos operados manualmente, tais como pulverizadores para usar nas costas operados por alavanca ou pulverizadores de compressão operados manualmente, podem ser usados. No entanto, a alta eficiência de transfecção obtida na invenção tem seu potencial máximo na transfecção de várias plantas, tais como plantas que crescem em um campo ou em uma estufa. Para esta finalidade, pulverizadores hidráulicos elétricos, tais como pulverizadores hidráulicos montados em trator equipados com barras de pulverização, podem ser usados. Técnicas de aplicação aérea usando helicópteros ou aviões também são possíveis para grandes campos. Todos estes tipos de pulverizadores são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, no livro Pesticide

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Application Methods por GA. Matthews, terceira edição, Blackwell Science, 2000. De forma a assegurar uma suspensão homogênea nos tanques de pulverização dos pulverizadores, pulverizadores de tamanho pequeno ou médio podem ser agitados em intervalos regulares ou continuamente durante a pulverização. Pulverizadores grandes, tais como pulverizadores montados em trator, devem ser equipados com um agitador no tanque de pulverização.

Considerando-se a presença de células agrobacterianas e abrasivo nas suspensões a serem pulverizadas, pulverizadores usados na invenção deverão produzir pulverização de um tamanho de gotícula, pelo menos em pulverização fina. Além disso, pulverização média ou pulverização grosseira na classificação de pulverizações usada no livro mencionado acima por G.A. Matthews, página 74, podem ser usadas. A principal finalidade da pulverização na invenção é umedecimento do tecido da planta com a suspensão. Assim, o tamanho exato de gotícula não é crítico. No entanto, a eficiência da transfecção pode ser adicionalmente aprimorada ao fornecer a pulverização à superfícies das plantas com uma pressão aumentada.

No processo da invenção, pelo menos partes de plantas são pulverizadas. Em uma modalidade importante, plantas que crescem sobre o solo em um campo são pulverizadas, isto é, plantas que não estão crescendo em vasos ou recipientes móveis. Tais plantas não podem ser viradas para baixo e mergulhadas em suspensão agrobacteriana para infiltração a vácuo. Pelo menos partes de plantas são pulverizadas, tais como folhas. De preferência, a maioria das folhas ou plantas inteiras são pulverizadas.

A presente invenção é usada principalmente para transfecção transitória de plantas com uma sequência de DNA de interesse. O termo transitória significa que nenhum método de seleção é usado para seleção de células ou plantas transfectadas com a sequência de DNA de interesse com base em células ou plantas não transfectadas usando, por exemplo, agentes selecionáveis e genes marcadores selecionáveis capazes de desintoxicar os agentes selecionáveis. Como um resultado, o DNA transfectado, em geral, não é introduzido estavelmente no DNA cromossômico da planta.

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Em vez disso, métodos transitórios fazem uso do efeito de transfecção nas mesmas plantas transfectadas.

A presente invenção é, em geral, usada para transfecção de plantas multicelulares, nomeadamente plantas superiores. Plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser transfectadas, pelo que plantas dicotiledôneas são preferidas. Plantas para uso na presente invenção incluem qualquer espécie de planta, com preferência dada à espécies de culturas agronômica e agricolamente importantes. Plantas de cultura comuns para uso na invenção incluem cevada, alfafa, feijão, canola, feijão fradinho, algodão, milho, trevo, lótus, lentilhas, tremoços, milho, aveia, ervilha, amendoim, arroz, centeio, trevo doce, girassol, ervilha doce, soja, triticale, sorgo, inhame, feijão de veludo, ervilhaca, trigo, glicínias e plantas de nozes. As espécies de plantas preferidas para a prática da presente invenção incluem, porém sem limitações, representantes de Gramineae, Compositeae, Solanaceae e Rosaceae.

Outras espécies preferidas para o uso na invenção são plantas dos gêneros a seguir: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Espargos, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Gerânio, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petúnia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, sorgo, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, Olyreae, Pharoideae e outros.

Em uma modalidade, o processo da invenção pode ser usado para produção de uma proteína de interesse em uma planta ou em muitas plantas que crescem em um campo. Para esta finalidade, as plantas podem

39/60 ser pulverizadas com a suspensão agrobacteriana em um estágio de crescimento desejado das plantas. Se o objetivo principal é alcançar níveis de expressão mais elevados possível, seguido por colheita de plantas para obtenção de material de planta contendo quantidades elevadas de proteína, vetores virais podem ser usados uma vez que, em geral, eles permitem os níveis mais elevados de expressão.

Em outra modalidade, o processo da invenção é usado para geração ou alteração de um traço em uma planta, tal como um traço de entrada. Nesta modalidade, expressão excessiva de uma proteína ou RNA de interesse pode não ser desejada para evitar efeitos prejudiciais sobre a saúde da planta. Para tais modalidades, vetores de não replicação (também referidos aqui como vetores de transcrição), ou seja, vetores sem uma origem de replicação funcional reconhecida por uma polimerase de ácido nucleico presente em células de planta são preferidos. Um exemplo de tal modalidade é a expressão de moléculas hormonais como mensageiros secundários em células de planta. No exemplo da Fig. 29, foi demonstrada a distribuição da enzima chave da biossíntese de citoquinina, transferase de isopentenila, em células de Nicotiana benthamiana por meio de pulverização com Agrobacteria diluídas trazendo um vetor de transcrição contendo a sequência de codificação de ipt sob o controle de um promotor 35S. Alterações morfológicas de plantas transfectadas causadas por produção excessiva de citoquinina foram observadas (Fig. 29). Outra aplicação da invenção é expressão de RNA, por exemplo, para interferência de RNA, em que o sinal de interferência pode ser disperso na planta a partir de células que expressam o sinal para outras células. Um exemplo é a objetivação de DNA viral indesejado em plantas, conforme descrito por Pooggin em Nat. Biotech. 21 (2003) 131. Um exemplo de silenciamento de oncogene que pode ser adaptado a um sistema transitório é descrito por Escobar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98 (2001) 13437-13442. A Fig. 37 mostra foto-branqueamento por meio de silenciamento gênico de desaturase de fitoeno (PDS) em folhas de Nicotiana benthamina. Um outro exemplo é o controle de pragas de insetos coleópteros através interferência de RNA similar ao descrito por Baum et al., Nat.

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Biotech. 25 (2007) 1322-1326, que pode ser adaptado ao processo transitório da invenção por meio de transfecção transitória de plantas infestadas com praga com DNA de interesse que codifica e expressa o dsRNA. Outros métodos aplicáveis ao processo transitório da invenção são aqueles descritos por Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103 (2006) 14302-14306; Chuang et al., Proc.. Natl. Acad. Sei. USA 97 (2000) 4985-4990. No experimento, os resultados do qual são mostrados na Fig. 38, expressão de flagelina protege uma planta contra sintomas de doenças causadas por Pseudomonas syringae.

Ainda, o processo da presente invenção permite alteração, em um ponto desejado no tempo, de traços relacionados à regulação da época de floração ou formação de fruto, tal como formação de tubérculo em batata (Martinez-Garcia et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99 ( 2002) 15211-15216) ou regulação da via de flavonóides usando um fator de transcrição (Deluc et al., Plant Physiol. 147 (2008) 2041-2053). Floração pode ser induzida ao expressar transitoriamente a proteína de floração FT móvel (Zeevaart, Current Opinion in Plant Biology: 11 (2008) 541-547; Corbesier et al., Science 316 (2007) 1030-1033). Frutos partenocárpicos em tomate podem ser produzidos em larga escala usando a presente invenção e o método descrito por Pandolfini et al., BMC Biotechnology 2 (2002). Outras aplicações da presente invenção são no contexto do desenvolvimento de fibras de algodão por meio de fatores de transcrição MYB, conforme descrito por Lee et al., Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401 ou ativação de genes defensivos de plantas (Bergey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (1996) 12053-12058. Foi demonstrado que expressão transitória da defensina MsrA2 em folhas de Nicotiana benthamiana diminui significativamente os sintomas de infecção por Pseudomonas (Fig. 31).

A invenção também fornece um processo de proteção de plantas de cultura em um campo contra uma praga. Em tal processo, infestação de pelo menos uma das plantas de uma pluralidade de plantas que crescem em um campo ou lote agrícola pode ser determinada. Em virtude da rapidez do processo da invenção, expressão de uma proteína ou RNA prejudicial para a

41/60 praga precisa ser causada apenas se infestação pela praga é determinada. Assim, expressão constitutiva e forte de toxinas para a praga ou dsRNA para RNAi, mesmo na ausência de um risco de infestação, não é necessária. Expressão transitória de endotoxinas de Bacillus thuringiensis após pulverização com culturas agrobacterianas diluídas trazendo vetores de expressão com base em PVX correspondentes protegeu plantas Nicotiana benthamiana contra danos pela alimentação por larvas do tabaco Manduca sexta (Fig. 30).

EXEMPLOS

A invenção é ainda descrita a seguir por meio de exemplos. A invenção não está, no entanto, limitada a estes exemplos.

Referência Exemplo 1: Determinação da concentração de células de Agrobacteríum em cultura líquida em termos de unidades de formação de colônias (colony forming units - cfu)

A concentração de células de Agrobacteríum em suspensão líquida em termos de unidades de formação de colônias por ml (Colony Forming Units - cfu/ml) de suspensões líquidas pode ser determinada usando o protocolo a seguir. Células da cepa ICF 320 de Agrobacteríum tumefaciens transformadas com o construto pNMD620 foram cultivadas em 7,5 ml de meio de LBS líquido contendo 25 mg/l de canamicina (AppIiChem, A1493) e 50 mg/L de rifampicina (Carl Roth, 4163,2). A cultura bacteriana foi incubada a 28°C com agitação contínua. Absorbância ou densidade óptica de uma cultura bacteriana, expressa em unidades de absorbância (Absorbance Units - UA), foi monitorada em alíquotas de cultura de 1 ml usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆oo)· A concentração de células estimada como um certo número de unidades de formação de colônias por mililitro de cultura líquida (cfu/ml) pode ser analisada em valores de Οϋδοο de 1, 1,3, 1,5, 1,7 e 1,8. Para esta finalidade, alíquotas de 250 μΙ de cultura líquida foram diluídas com meio LBS para atingir um volume final de 25 ml (diluição a 1:100). 2,5 ml de tal diluição a 1:100 foram misturados com 22,5 ml de LBS para atingir a diluição de 1:1000. Diluições de cultura líquida de 1:100; 1:1000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000; 1:10.000.000 e

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1:100.000.000 foram preparadas de forma similar. Alíquotas das últimas três diluições foram dispersas em meio LBS solidificado com ágar suplementado com 25 mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina (250 μΙ de cultura bacteriana por placa de 90 mm de diâmetro). Cultura de alíquotas de cada diluição em placa foi realizada em triplicata. Após 2 dias de incubação a 28°C, as colônias bacterianas foram contadas para cada placa. Colocação em placa de diluições a 1:1.000.000 e 1:10.000.000 resultou em poucas dezenas e poucas dúzias de colônias por placa, respectivamente. Até o momento, uma vez que a diluição a 1:100.000.000 forneceu apenas poucas colônias por placa, esta diluição não foi usada para o cálculo da concentração de células. A concentração de células foi estimada de acordo com a fórmula: cfu/ml = 4 x número de colônias por placa x fator de diluição.

Para transformação das concentrações de células, conforme medido por meio de medições de absorbância a 600 nm (em meio LB) e em termos de unidades de formação de colônias, a relação a seguir é usada aqui: uma OD₆oo de 1,0 corresponde a 1,1 χ 10⁹ cfu/ml.

Meio LBS (líquido)

Peptona de soja a 1% (hidrolisado papaíco de farelo de soja;

Duchefa, S1330)

Extrato de levedura a 0,5% (Duchefa, Y1333)

Cloreto de sódio a 1% (Carl Roth, 9265,2) dissolvidos em água e pH ajustado para 7,5 com NaOH a 1M (Carl Roth, 6771,2)

Para preparar o meio LBS sólido, meio LBS líquido foi suplementado com agar a 1,5% (Carl Roth, 2266,2). Os meios foram submetidos à autoclave a 121 ° C durante 20 min.

Exemplo 1: Vetores usados nos exemplos a seguir

No presente estudo, foram usados vetores de transcrição com base no promotor 35S de CaMV, bem como replicons virais com base em TMV e PVX com ou sem capacidade de movimento célula para célula.

Todos os vetores de transcrição foram criados a partir de pICBVIO, um vetor binário derivado de pBIN19 (Marillonnet et al., 2004,

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2006). Eles continham dois cassetes de expressão inseridos dentro das bordas direita e esquerda da mesma região de T-DNA (Fig. 1). Para clonagem do vetor de expressão pNMD293, dois construtos intermediários (pNMD280 e pNMD033) foram criados. pNMD280 continha um cassete de expressão que compreende, em ordem sequencial, o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), intensificador traducional ômega do Vírus Mosaico do Tabaco, sequência de codificação do supressor de silenciamento P19 do Vírus da Mancha Anelar de Tomate (TBSV) (N° de Acesso GenBank CAB56483 0,1) e terminador do gene de sintase de octopina de Agrobacterium tumefaciens inserido entre as bordas direita e esquerda de T-DNA. Para permitir a próxima etapa de clonagem, dois sítios de restrição, EcoRI e Sphl, foram introduzidos entre a borda direita de T-DNA e a sequência do promotor 35S. O construto pNMD033 continha, entre as bordas esquerda e direita de T-DNA, o cassete de expressão flanqueado por sítios de restrição EcoRI e Sphl e compreendia o promotor 35S, intensificador traducional ômega, sequência de codificação da proteína fluorescente verde de água-viva e terminador do gene de sintase de octopina de Agrobacterium tumefaciens, listados em ordem sequencial.

Para clonagem do construto pNMD293, o cassete de expressão de GFP foi excisado do construto pNMD033 usando enzimas de restrição EcoRI e Sphl e transferido para o vetor pNMD280 linearizado com as mesmas enzimas de restrição. O construto pNMD293 resultante continha dois cassetes de expressão inseridos entre as bordas direita e esquerda de TDNA. Um cassete de expressão adjacente à borda direita compreendia 35S de CAMV, intensificador traducional ômega, sequências de codificação de proteína fluorescente verde e o terminador Nos (listados em ordem seqüencial). O cassete de expressão adjacente à borda esquerda continha o promotor 35S, seguido pelo intensificador traducional ômega, sequência de codificação de supressor de silenciamento P19 e terminador Ocs. Todos os outros construtos foram criados com base no vetor pNMD293, substituindo a sequência de codificação de GFP por sequências de codificação amplificadas por PCR de outros genes de interesse usando, para clonagem, sítios de res

44/60 trição Ncol e BamHI. Genes de interesse introduzidos em construtos de vetor de transcrição codificavam sGFP, proteína fluorescente verde modificada (GFP) de água-viva Aequorea victoría (N° de Acesso GeneBank EF030489) (pNMD293); DsRed, proteína fluorescente vermelha de um coral de recife Discosoma sp. (N° de Acesso GeneBank AF168419.2) (pNMD1380); fator de floração SP3D de tomate (N° de Acesso AY186735) (pNMD421); locus T de floração (FT) de Arabidopsis (N° de Acesso GeneBank BAA77839) (pNMD655); regulador de brassino-esteróide DWARF4 de Arabidopsis (NM_114926) (pNMD440); enzima transferase de isopentenila (IPT), enzima chave de biossíntese de citoquinina da cepa C58/ATCC33970 de Agrobacterium tumefaciens (N° de Acessp GeneBank AE007871.2) (pNMD460).

Vetores com base em TMV com a capacidade de movimento célula para célula (Fig. 2) foram criados com base em vetores descritos em Marillonnet et al. (2006). O construto pNMD035 foi usado como um vetor de clonagem para consequente inserção de sequências de codificação de genes de interesse usando sítios de clonagem Bsal. Construtos resultantes continham, em ordem sequencial, um fragmento do promotor de actina 2 de Arabidopsis (ACT2) (N° de Acesso GenBank AB026654); a extremidade 5' de TVCV (N° de Acesso GenBank BRU03387, pares de bases, 1-5455); e um fragmento de cr-TMV [N° de Acesso GenBank. Z29370, pares de bases 5457-5677, ambos juntos contendo 16 inserções de íntrons]; um gene de interesse; região 3' não traduzida de cr-TMV (3' NTR, N° de Acesso GenBank Z29370) e o terminador de sintase de nopàlina (NOS). O fragmento inteiro foi clonado entre as bordas esquerda e direita de T-DNA do vetor binário. Genes de interesse usados nestes construtos codificavams GFP (pNMD560), DsRed (pNMD580), α-interferon humano com um sinal de objetivação de apoplasto de alfa-amilase de arroz (pNMD38), klip27-mini-insulina com sinal de objetivação de apoplasto de alfa-amilase de arroz (pNMD330), taumatina 2 de Taumatococcus danielii (pNMD700), β-glucosidase BGL4 de Humicola grisea (pNMD1200), exocelulase E3 de Thermobifída fusca (pNMD1160), exoglucanase 1 (CBH 1) de Trichoderma reesei (pNMD1180), defensina Rs-AFP2 de Rafanus sativus (pNMD1061), defensina MsrA2 (um

45/60 derivado sintético de dermaseptina B1 de rã Phyllomedusa bico/οή (pNMD1071), defensina MB39 (cecropina modificada da Traça Cepropia Hyalophora cecropia) (pNMD1280), defensina plectasina do fungo Pseudoplectania nigrella (pNMDxxxx).

Vetores com base em TMV sem capacidade do movimento célula para célula eram idênticos aos vetores com base em TMV correspondentes capazes de movimento célula para célula, exceto quanto a uma mutação de ponto na sequência de codificação de MP, levando a um desvio do quadro de leitura aberta que distorceu a tradução de MP (Fig. 3). Clonagem destes construtos foi realizada usando pNMD661 como vetor de clonagem.

Para clonagem da maioria dos vetores com base em PVX com capacidade de movimento sistêmico e célula para célula, o vetor de clonagem pNMD670foi usado. Construtos resultantes continham, em ordem sequencial, promotor 35S de CaMV, sequências de codificação de RNA polimerase dependente de RNA, proteína de revestimento, módulos em bloco de gene triplo compreendendo proteínas de 25 kDa, 12 kDa e 8 kDa, gene de interesse e região 3' não traduzida. O fragmento inteiro foi clonado entre as bordas esquerda e direita de T-DNA do vetor binário (Fig. 4). Outro grupo de construtos com base em PVX tinha uma estrutura similar com diferença na posição de CP, o qual foi inserido entre PVX polimerase e o bloco de gene triplo (por exemplo, pNMD600).

Vetores com base em PVX com deleção da sequência de codificação de proteína de revestimento tinham movimento sistêmico e célula para célula desativados. Clonagem destes construtos foi realizada usando pNMD694 como vetor de clonagem. Este tipo de vetores continham, em ordem sequencial, promotor 35S de CaMV, sequências de codificação de RNA polimerase dependente de RNA, módulo em bloco de gene triplo, gene de interesse e região 3' não traduzida inserida entre as bordas esquerda e direita de T-DNA do vetor binário ( Fig.5).

Exemplo 2: Agrobactería diluídas podem ser distribuídas à Nicotiana benthamina usando tensoativo por meio de pulverização

Foi demonstrado que plantas Nicotiana benthamiana podem ser

46/60 transfectadas por meio de pulverização das plantas com culturas agrobacterianas diluídas contendo tensoativo (Fig. 6). Para avaliar os parâmetros que influenciam a transfecção e otimizar a eficiência da transfecção, foi usada imersão de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana. Esta abordagem permite medições exatas e testagem fácil de múltiplas versões experimentais. Culturas agrobacterianas noturnas (ODeoo = 1,5) foram diluídas a 1:100 e 1:1000 (fatores de diluição 10'² e 10², respectivamente) em tampão MÊS a 10 mM (pH de 5,5) contendo sulfato de magnésio a 10 mM e suplementado com tensoativo Silwet L-77. Três tipos de construtos que conferem expressão de GFP foram testados: 1) vetores de transcrição, 2) replicons virais com base em TMV e 3) replicons virais com base em PVX (Fig. 6). Os vetores virais usados nestes experimentos tinham movimento sistêmico e célula para célula desativados. Eles permitiram a expressão do gene repórter apenas em células transfectadas com T-DNA. A percentagem de células que expressam GFP foi contada após o isolamento de protoplastos de folha (Fig. 7). Dependendo da concentração de suspensão agrobacteriana e independentemente do tipo de vetor, 2-8% das células totais de folhas foram transfectadas como um resultado de transferência de T-DNA mediada por Agrobacteríum quando Silwet L-77 a 0,1% em volume e um tempo de imersão de 1 min foram usados.

Para descobrir a concentração ótima de tensoativo, foram testados Silwet L-77 a 0,1% e 0,05% em experimentos de imersão. Para todos os três tipos de vetores, a eficiência de transfecção proporcionada pelo uso de Silwet a 0,1% foi significativamente superior se comparado com a concentração de 0,05% (Figs. 8-10).

Imersão de 10 seg de folhas de Nicotiana benthamiana em suspensão agrobacteriana diluída suplementada com Silwet L-77 a 0,1% de permitiu taxas de transfecção próximo da eficiência de pulverização com a mesma suspensão (Fig. 11). Em ambos os casos, a eficiência de transfecção foi maior para as folhas desenvolvidas mais velhas. A taxa de transfecção variou de 1,4 a 3,7% para imersão e de 1,1 a 1,7% para a pulverização de cultura agrobacteriana em uma diluição de 1:100. Na diluição a 1:1000, a

47/60 variação foi de 0,2%-1,1 para imersão e 0,1-0,6% para pulverização.

O Silwet L-77 usado em todos os exemplos aqui descritos foi adquirido da Kurt Obermeier GmbH & Co. KG (Bad Berleburg, Alemanha). O fornecedor é GE Silicones, Inc., EUA. O Silwet L-77 usado é um produto de 5 organo-silicone composto por 84,0% de heptametil tri-siloxano modificado com óxido de polialquileno (CAS-No. 27306-78-1) e 16% de alilóxi metil éter de polietileno glicol (CAS-No. 27252-80-8). Todas as concentrações de teor de Silwet L-77 fornecidas nos exemplos ou figuras referem-se a este produto comercial.

Exemplo 3: Agrobacteria diluídas podem ser distribuídas à outras espécies por meio de pulverização usando tensoativo e abrasivo

Foi testado o número de espécies de plantas usando transfecção agrobacteriana com pulverização e tensoativo. Primeiro, foi analisada cada espécie quanto ao vetor de expressão ótimo. Para está finalidade, fo15 lhas de planta foram infiltradas, com uma seringa sem agulha, com diluições a 1:100 de OD = 1,5 de cinco culturas agrobacterianas trazendo os eguintes vetores de transcrição que expressam GFP: 1) 35S-GFP + P19 (pNMD293), 2) vetor viral com base em TMV capaz de movimento célula para célula TMV(MP)-GFP (pNMD560), 3) vetor viral com base em TMV com movimento 20 célula para célula desativado TMV(fsMP)-GFP (pNMD570), 4) vetor viral com base em PXV capaz de movimento sistêmico e célula para célula PVX(ACP)-GFP (pNMD630) e 5) vetor viral com base em PVX com movimento célula para célula desativado PVX(ACP)-GFP (pNMD620). Em alguns casos, foi realizada infiltração a vácuo.

Foi demonstrada a transfecção mediada por Agrobacteríum efi- ciente para várias espécies Solanaceae, incluindo Nicotiana benthamiana (todos os cinco vetores), tabaco Nicotiana tabacum (todos os cinco vetores), tomate Lycopersicon esculentum (vetores com base em PVX e vetores de transcrição), pimenta Capsicum annuum, Inca Berry Physalis peruviana, be30 rinjela Solanum melongena, batata Solanum tuberosum (todos com vetores com base em PVX) (Fig. 13).

Transfecção mediada por Agrobacteríum foi denonstrada para a

48/60 alface Lactuca sativa da família Asteraceae (vetor de transcrição), beterraba Beta vulgaris da família Chenopodiaceae (todos os cinco vetores), abobrinha Cucurbita pepo da família Cucurbitaceae (vetor de transcrição) e algodão Gossypium hirsutum da família Malvaceae (todos os cinco vetores) (Fig. 14).

Tratamento de células agrobacterianas com aceto-siringona (200 μΜ, 2 horas) aumentou significativamente a eficiência de transfecção em várias espécies de planta, incluindo berinjela, tomate e abobrinha (Fig. 15).

Com base em dados de infiltração, pulverização com suspensões agrobacterianas diluídas foi testada para a série de espécies de plantas. A distribuição eficiente de Agrobacteria diluídas (10-3) por pulverização com suspensões contendo Silwet a 0,1% foi demonstrado para várias espécies Nicotiana (Nicotiana benthamiana, Nicotiana debne, Nicotiana excelsior, Nicotiana exigua, Nicotiana marítima e Nicotiana simulans), conforme é mostrado usando PVX com capacidade movimento sistêmico célula para célula na Fig. 16.

Distribuição de Agrobacteria à outras espécies, incluindo as famílias Solanaceae, Chenopodiaceae, Amarantaceae e Aizoaceae foi demonstrada através de tratamento por imersão em suspensão agrobacteriana e pulverização com e sem abrasivo usando vetores de transcrição, bem como vetores TMV e PVX, com e sem capacidade de movimento célula para célula ( Figs. 17-21). A lista de espécies transfectadas com sucesso inclui espinafre Spinacea oleracea da família Amaranthaceae (vetores de transcrição e com base em PVX), variedades de beterraba Beta vulgaris da família Chenopodiaceae (vetores virais com base em TMV e PVX) (Fig. 17), tomate Lycopersicon esculentum ( vetor com base em PVX) (Fig. 18), Inca berry Physalis peruviana e batata Solanum tuberosum (Fig. 34) (vetor com base em PVX) (Fig. 19) da família Solanaceae, algodão Gossypium hirsutum da família Malvaceae (vetor com base em TMV) (Fig. 20). A expressão de GFP em tecidos de algodão após transfecção agrobacteriana foi confirmada usando Western blot por meio de hibridização com anticorpos específicos para GFP (Fig. 21).

Usando o gene GUS como repórter, a transfecção bem sucedida

49/60 por meio de pulverização com a suspensão agrobacteriana foi obtida para a colza Brassica napus da família Brassicaceae (Fig. 35). O construto pNMD1971 foi criado com base no plasmídeo pNMD293 substituindo a sequência de codificação de GFP pela sequência de beta-glucuronidase (GUS) de Escherichia coli (P05804) contendo o íntron 7 do gene PSK7 de Petunia hybrída (AJ224165).

A transfecção eficiente de plantas usando a pulverização com uma suspensão agrobacteriana diluída foi também demonstrada para espécies monocot. A Fig. 36 mostra a transfecção de plantas de cebola Allium cepa após a pulverização com suspensão agrobacteriana suplementada com Silwet L-77 a 0,1%. O construto pNMD2210 foi criado com base no plasmídeo pNMD1971 substituindo o promotor 35S no cassete de expressão de GUS pelo promotor de actina 2 (Act2) de arroz Oryza sativa (EU 155408).

Em todos os exemplos aqui descritos, pulverização foi realizada com frascos de pulverização com bomba com um volume nominal de 500 ou 1000 ml (Carl Roth, #0.499.1 e #0.500.1) com base em bombeamento manual direto ou com um pulverizador de pressão com volume de 1,25 L (Gardena, #00864-20) que explora a pressão aumentada para bombeamento. As plantas foram pulverizadas de modo a umedecer completamente as folhas. Pulverizadores foram agitados periodicamente para assegurar homogeneidade das suspensões a serem pulverizadas, nomeadamente se as suspensões continham abrasivo.

Exemplo 4: Transfecção das plantas usando suspensões de Agrobacterium contendo abrasivo

O carborundum usado nestes experimentos era uma mistura de partículas de carborundum (carbureto de silício) F800, F1000 e F1200 da Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Áustria. De acordo com o fornecedor, F800, F1000 e F1200 têm diâmetros medianos de superfície de

6,5, 4,5 e 3 mm, respectivamente. 97% em massa das partículas de F800, F1000 e F1200 têm um diâmetro de superfície menor do que 14, 10 e 7 μπι, respectivamente. 94% em massa das partículas têm um diâmetro de superfície maior do que 2, 1 e 1 μιτι, respectivamente. F800, F1000 e F1200 foram

50/60 misturados em quantidades iguais em peso. 0,3% (peso/v) do carborundum misturado foram adicionados às suspensões agrobacterianas suplementadas com Silwet L-77 a 0,1% e usadas para a pulverização de plantas usando os pulverizadores descritos no Exemplo 3.

Os resultados mostrados nas Figs. 32, 22 e 33 demonstraram que uso do abrasivo aumenta significativamente a eficiência da transfecção. Pulverização de plantas de berinjela Solanum melongena com suspensão agrobacteriana contendo carborundum a 0,3% (carboneto de silício, SiC) proporcionou um aumento de 2 vezes da eficácia de transfecção (Fig. 32). No caso de beterrabas vermelhas, o mesmo tratamento abrasivo resultou em um aumento de 15 vezes da eficácia de transfecção (Fig. 22). Surpreendentemente, o uso de um abrasivo foi um fator decisivo que permitiu a transfecção de plantas de pimenta por pulverização com a suspensão agrobacteriana; combinação de um tratamento abrasivo com ativação de células agrobacterianas com aceto-siringona aumentou ainda mais a eficiência de transfecção (Fig. 32). Lista de espécies transfectadas usando pulverização com tensoativo e abrasivo inclui também beterraba de raiz amarela, outra variedade de Beta vulgaris, espinafre da Nova Zelândia Tetragonia expansa da família Aizoaceae, pimenta Capsicum annuum e beringela Solanum melongena de Solanaceae (Fig. 23).

Exemplo 5: Tratamento com Agrobacterium pode ser repetido: múltiplos tratamentos subsequentes

Foram realizados múltiplos tratamentos subsequentes de plantas Nicotiana benthamiana com Agrobacteria diluídas. Para esta finalidade, folhas foram mergulhadas em suspensões diluídas de Agrobacterium que traziam os seguintes construtos: pNMD570 (TMV(fsMP)-GFP sem capacidade de movimento célula para célula), pNMD560 (TMV(MP)-GFP com capacidade de movimento célula para célula) , pNMD580 (TMV(MP)-DsRed com capacidade de movimento célula para célula), pNMD620 (PVX(áCP)-GFP sem capacidade de movimento célula para célula), pNMD600 (PVX(áCP)-GFP com e capacidade movimento sistêmico célula para célula) e pNMD610 (PVX(ÁCP)-DsRed com capacidade movimento sistêmico célula para célula).

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Após transfecção, estes vetores formam pontos fluorescentes que diferem quanto à cor e tamanho (Fig. 24). Foi realizada a transfecção por imersão de cada folha testada com 3 culturas diferentes e com intervalos de 7 dias entre as transfecções. Para cada uma das oito combinações de vetor testadas, todas as transfecções com Agrobacteríum foram bem sucedidas, nenhum efeito de silenciamento ém particular foi observado (Fig. 24).

Exemplo 6: Pulverização com Agrobacteríum pode distribuir replicons virais capazes de movimento célula para célula

Foi demonstrado que pulverização de plantas Nicotiana benthamiana com diluições a 1:100 e 1:1000 de suspensão agrobacteriana permite distribuição eficiente de replicons virais capazes de movimento célula para célula, o qual resulta em expressão elevada de genes de interesse, comparável com a expressão obtida usando infiltração de Agrobacteríum. Isto foi demonstrado para GFP (Fig. 25), alfa-interferon humano e klip2-mini-insulina (Fig. 26) e várias celulases, incluindo exocelulase E3 de Thermobifída fusca, exoglucanase 1 (CBH 1) de Tríchoderma reesei, β-glucosidase BGL4 de Humicola grisea e exocelulase E3 de Thermobifída fusca (Fig. 27).

Exemplo 7: Agrobactería podem ser usadas para distribuir fatores de transcrição como mensageiros secundários

Foi demonstrada a indução de biossíntese de antocianina em folhas de Nicotiana tabacum infiltradas com suspensão agrobacteriana trazendo o vetor viral com base em PVX, que permite a expressão do fator de transcrição antocianina 1 MYB (ANT1) de Lycopersicon esculentum (Fig. 28).

Exemplo 8: Agrobactería podem ser usadas para distribuição de RNAi como mensageiros secundários

Foi demonstrado o foto-branqueamento de folhas de Nicotiana benthamiana causado por silenciamento do gene de desaturase de fitoeno (PDS) após pulverização de folhas com uma suspensão agrobacteriana trazendo o vetor viral com base em PVX que contém o fragmento da sequência de codificação de PDS em uma orientação anti-senso (Fig. 37). Para gerar este construto (pNMD050), um fragmento de cDNA de 298-624 pb de desa

52/60 turase de fitoeno (PDS) de Nicotiana benthamiana (EU 165355) foi inserido no vetor de clonagem pNMD640 em uma orientação anti-senso usando sítios Bsal.

Exemplo 9: Agrobacteria podem ser usadas para distribuição de MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns - Padrões Moleculares Associados a Micróbio) como mensageiros secundários

Foi demonstrado que redução no número de lesões necróticas causadas por infecção com Pseudomonas syringae pv. syringae em folhas de Nicotiana benthamiana após a pulverização preliminar das plantas com a suspensão agrobacteriana trazendo o vetor com base em PVX permite a expressão do gene de flagelina de Pseudomonas (pNMD1953) (Fig. 38). Para criar o plasmídeo pNMD1953, a sequência de codificação de GFP foi substituída, no construto pNMD630, pela sequência compreendendo o fragmento que codifica o peptídeo sinalizador de apoplasto do gene de alfaamilase (AMY3) de cevada (Hordeum vulgare) (FN179391) fundido em rede com a sequência que codifica a flagelina de Pseudomonas syringae pv. syringae (YP236536). Quatro plantas Nicotiana benthamiana foram inoculadas com diluições a 1:1000 de culturas de Agrobacterium (ODeoo = 1,3) por pulverização. 6 dpi com culturas de Agrobacterium, todas as plantas foram inoculadas com Pseudomonas syringae pv. syringae B728 a 1 x 10⁵ cfu/ml por pulverização. 7 dpi com Pseudomonas, os sintomas da doença foram classificados contando-se pontos necróticos sobre duas folhas de cada planta. O número de pontos necróticos causados por infecção com Pseudomonas por folha é fornecido como a média de cada 2 folhas de 4 plantas.

A listagem de sequência abaixo contém as sequências de nucleotídeo a seguir:

SEQ ID NO: 1: Região TNA de região de T-DNA de pNMD280 SEQ ID NO: 2: Região TNA de região de T-DNA de pNMD033 SEQ ID NO: 3: Região TNA de região de T-DNA de pNMD035 SEQ ID NO: 4: Região TNA de região de T-DNA de pNMD661 SEQ ID NO: 5: Região TNA de região de T-DNA de pNMD670 SEQ ID NO: 6: Região TNA de região de T-DNA de pNMD694

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SEQ ID NO: 7: Região TNA de região de T-DNA de pNMD1971 SEQ ID NO: 8: Região TNA de região de T-DNA de pNMD2210 SEQ ID NO: 9: Região TNA de região de T-DNA de pNMD050 SEQ ID NO: 10: Região TNA de região de T-DNA de pNMD1953 Referências

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Claims (11)

1. reivindicações

   1. Processo de geração ou alteração de um traço de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) crescimento da referida planta até um estado de crescimento desejado;

   (ii) expressão, na referida planta, de uma proteína ou um RNA capaz de geração ou alteração do referido traço, compreendendo pulverização de partes aéreas da referida planta com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum, pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, e, como um adjuvante de pulverização agrícola, um agente de umedecimento não iônico de organo-silicone em uma concentração entre 0,25 e 5,0 g por litro da referida suspensão;

   a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína ou o referido RNA em que o pelo menos um abrasivo é carborundum.
2. 2. Processo de produção de uma proteína de interesse em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) crescimento da referida planta até um estado de crescimento desejado;

   (ii) expressão, na referida planta, da referida proteína de interesse compreendendo pulverização das partes aéreas da referida planta com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum, pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, e, como um adjuvante de pulverização agrícola, um agente de umedecimento não iônico de organo-silicone em uma concentração entre 0,25 e 5,0 g por litro da referida suspensão, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA compreendendo um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína de interesse,

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   2/3 em que o pelo menos um abrasivo é carborundum.
3. 3. Processo de proteção de plantas de cultura em um campo contra uma praga, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) crescimento das referidas plantas no solo do referido campo;

   (ii) determinação, em um estado de crescimento desejado das plantas referidas, de infestação de pelo menos uma das referidas plantas por uma praga;

   (iii) expressão, na referida planta, uma proteína ou um RNA que é prejudicial para a praga determinada na etapa anterior compreendendo pulverização das partes aéreas das referidas plantas com uma suspensão aquosa contendo células de uma cepa de Agrobacteríum, pelo menos um abrasivo suspenso na referida suspensão, e, como um adjuvante de pulverização agrícola, um agente de umedecimento não iônico de organo-silicone em uma concentração entre 0,25 e 5,0 g por litro da referida suspensão, a referida cepa de Agrobacteríum compreendendo uma molécula de DNA que compreende um construto de ácido nucleico contendo uma sequência de DNA de interesse operativamente ligada a um promotor, a referida sequência de DNA de interesse codificando a referida proteína ou o referido RNA, em que o pelo menos um abrasivo é carborundum.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida suspensão aquosa contém as referidas células da referida cepa de Agrobacteríum em uma concentração de no máximo 2,2 x 10⁷, de preferência de no máximo 1,1 x 10⁷, mais preferivelmente de no máximo 4,4 x 10⁶, ainda mais preferivelmente de no máximo 1,1 x 10⁶ ufc/mL da referida suspensão.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida suspensão aquosa contém o referido abrasivo em uma quantidade compreendida entre 0,02 e 2, de preferência entre 0,05 e 1 e, mais preferivelmente, entre 0,1 e 0,5% em peso da referida suspensão.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que o tamanho médio de partículas do abrasivo adicionado à

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   3/3 suspensão está entre 0,1 e 30, de preferência entre 0,1 e 10, mais preferivelmente entre 0,5 e 10 e, ainda mais preferivelmente, entre 0,5 e 5 μm.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o abrasivo tem um valor D90 de no máximo 40 μm, de preferência de no máximo 30 μm e em que o abrasivo não contém partículas tendo um tamanho acima de 45 μm, de preferência não acima de 40 μm.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de umedecimento não iônico de organo-silicone é heptametil tri-siloxano modificado com óxido de polialquileno.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido construto de ácido nucleico é flanqueado por uma sequência de borda de T-DNA sobre pelo menos um lado, a qual permite a transferência do referido construto de ácido nucleico para células da referida planta.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o referido construto de ácido nucleico codifica um vetor viral de replicação que codifica a referida proteína de interesse, o referido vetor viral de replicação sendo incapaz de movimento do sistema na referida planta.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de DNA de interesse está operativamente ligada a um promotor ativo em células de planta.