ES2654583T3

ES2654583T3 - Procedimiento de transfección de plantas

Info

Publication number: ES2654583T3
Application number: ES11724948.2T
Authority: ES
Inventors: Anatoli Giritch; Yuri Symonenko; Simone Hahn; Doreen Tiede; Anton Dr SHVARTS; Patrick Roemer; Yuri Gleba
Original assignee: NOMAD BIOSCIENCE GmbH
Current assignee: NOMAD BIOSCIENCE GmbH
Priority date: 2010-08-07
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2018-02-14
Anticipated expiration: 2031-05-06
Also published as: CA2807544A1; CN103282499A; JP2013532992A; BR112013002981B1; US20130212739A1; EP2601295A1; MX346926B; EP2601295B1; MX2013001459A; CA2807544C; BR112013002981A2; US20190136260A1; AU2011288653A1; RU2013110019A; EP2418283A1; WO2012019660A1; JP5898681B2; AU2011288653B2

Abstract

Un procedimiento de generación o alteración de un rasgo en una planta, que comprende (i) cultivar dicha planta hasta un estadio de crecimiento deseado; (ii) expresar, en dicha planta, una proteína o un ARN capaz de generar o alterar dicho rasgo, que comprende una transfección transitoria por pulverización de las partes aéreas de dicha planta con una suspensión acuosa que contiene células de una cepa de Agrobacterium, al menos un abrasivo suspendido en dicha suspensión, y, como adyuvante de pulverización agrícola, un tensioactivo no iónico con una concentración entre 0,25 y 5,0 g por litro de dicha suspensión. comprendiendo dicha cepa de Agrobacterium una molécula de ADN que comprende una construcción de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADN de interés, codificando dicha secuencia de ADN de interés dicha proteína o dicho ARN, y siendo dicho abrasivo un material particulado que es esencialmente insoluble en la suspensión acuosa de células de Agrobacterium.

Description

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Fig. 16. Fotografías que muestran la expresión de GFP bajo luz ultravioleta de distintas especies de Nicotiana después de pulverizar plantas completas con suspensiones agrobacterianas diluidas 1000 veces de DO600 = 1,0. Se utilizaron vectores víricos basados en PVX con capacidades de movimiento célula a célula y sistémico (PVX (+CP)-GFP, pNMD600). Las suspensiones pulverizadas contenían un 0,1 % por peso de Silwet L-77. Se tomaron las fotografías 12 dpi. La Fig. 17 muestra la expresión de GFP después del suministro de agrobacterias diluidas a plantas de espinaca y remolacha sumergiéndolas con tensioactivo. Se utilizaron un vector transcripcional así como vectores víricos basados en PVX y TMV sin capacidad de movimiento célula a célula. Se cultivaron los cultivos agrobacterianos a DO600 = 1,5 y se diluyeron 1:100; 0,1 % de Silwet L-77, inmersión durante 10 s. Se tomaron las fotografías a los 12 dpi. La Fig. 18 muestra la expresión después del suministro de agrobacterias diluidas a plantas de tomate Lycopersicon esculentum por pulverización en presencia de tensioactivo. El vector que se utilizó era PVX (CP)-GFP (pNMD630). El factor de dilución del cultivo agrobacteriano (DO600 = 1,5): 10-2, 0,1 % de Silwet L-77, 200 µM de acetosiringona; se tomaron fotografías a los 14 dpi. La Fig. 19 muestra la expresión de GFP después del suministro de agrobacterias diluidas a plantas de uchuva Physalis peruviana pulverizando con tensioactivo. Vector PVX (CP)-GFP (pNMD630). Dilución de cultivo agrobacteriano (DO600 = 1,5): 10-2, 0,1 % Silwet L-77, 200 µM de acetosiringona; se tomaron las fotografías a los 14 dpi. La Fig. 20 muestra una comparación entre la transfección por infiltración utilizando una jeringa y la pulverización. Los números indican la cepa de Agrobacterium/vector utilizados. El suministro de agrobacterias diluidas a las hojas de algodón Gossypium hirsutum L. utilizando la infiltración con jeringa y pulverización con suspensiones agrobacterianas. Los cultivos agrobacterianos (cepa ICF320) se cultivaron hasta la DO600 = 1,7-2,0, diluidos por un factor de 10-2 con un tampón para infiltración, e incubados con 200 µM de acetosiringona durante 2 horas antes de su uso. Para la pulverización, las suspensiones agrobacterianas se suplementaron adicionalmente con 0,1 % de Silwet L-77.

Infiltración: 1-TMV (fsMP)-GFP (pNMD570); 2-TMV (MP)-GFP (pNMD560); 3-PVX (ΔCP)-GFP (pNMD620); 4-PVX (CP)-GFP (pNMD630); 5-35S-GFP+P19 (pNMD293). Pulverización: TMV (MP)-GFP (pNMD560). Se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana como control positivo.

La Fig. 21 muestra la expresión de GFP en las hojas de algodón Gossypium hirsutum L. infiltradas con una suspensión de agrobacterias que alberga los vectores víricos y transcripcionales.

A) SDS-PAGE con tinción por Coomasie; B) Transferencia de Western hibridada con anticuerpo anti-GFP (1:3000), Anticuerpo secundario: anti-ratón-HRP (1:5000). Las calles eran las siguientes:

1-hojas de N. benthamiana no infectadas;

2-hojas de algodón no infectadas;

3-hojas de col roja no infectadas;

4-proteína marcadora (Fermentas, nº SM0671);

5-TMV (fsMP)-GFP (pNMD570) en Nicotiana benthamiana;

6-TMV (fsMP)-GFP (pNMD570) en algodón;

7-TMV (fsMP)-GFP (pNMD560) en algodón;

8-PVX (ΔCP)-GFP (pNMD620) en algodón;

9-PVX (CP)-GFP (pNMD630) en algodón;

10-35S9-GFP + P19 (pNMD293) en algodón;

Se hirvieron 100 mg de material foliar en 600 µl de 1 x tampón de Laemmli que contenía betamercaptoetanol; se cargaron alícuotas de 2,5 µl en el gel.

La Fig. 22 muestra la expresión de GFP después del suministro de agrobacterias en hojas de Beta vulgaris vulgaris L. utilizando la pulverización con tensioactivo; influencia de acetosiringona y abrasivo. Vector: PVX (CP)-GFP (pNMD630). Las células agrobacterianas se incubaron con 200 µM de acetosiringona durante 2 horas antes de la pulverización. Para el tratamiento abrasivo se añadió un 0,3 % de carborundo (mezcla de carburo de silicio de F800, F1000 y F1200 partículas, Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Austria) a la suspensión agrobacteriana. El factor de dilución de agrobacterias de DO600 = 1,4: 10-2. Las hojas con puntos de expresión de GFP se indican a la derecha. La Fig. 23 muestra la expresión después del suministro de agrobacterias diluidas a las plantas de diferentes especies pulverizando con tensioactivo y abrasivo. Vectores: TMV (MP)-GFP (pNMD600) y PVX (CP)-GFP (pNMD630), factor de dilución del cultivo agrobacteriano (DO600 = 1,5): 10-2, un 0,1 % de Silwet L-77, un 0,3 % de carburo de silicio. La Fig. 24 muestra la expresión después de triples tratamiento posteriores de plantas Nicotiana benthamiana con agrobacterias que albergan vectores víricas. La inmersión de las hojas se llevó a cabo con un intervalo de 7 días en el orden:

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suspensión.

La suspensión acuosa que se utiliza en la invención contiene un adyuvante de pulverización agrícola. El adyuvante de pulverización es un tensioactivo. El tensioactivo tiene múltiples ventajas en la presente invención. Reduce la 5 tensión de superficie del agua de la suspensión acuosa y hace la superficie cérea de las hojas de las plantas más permeables a las agrobacterias. Mejora adicionalmente la estabilidad de la suspensión y reduce la deposición del abrasivo en la suspensión. Los surfactantes que se utilizan en la presente invención son surfactantes no iónicos y los ejemplos de surfactantes incluyen los siguientes (A). Estos se pueden utilizar de manera única o en combinación.

(A) Tensioactivos no iónicos: Una medición que se utiliza frecuentemente para describir tensioactivos es el HLB (equilibrio hidrófilo/lipófilo). El HLB describe la capacidad del tensioactivo para asociarse a compuestos hidrófilos y lipófilos. Los tensioactivos con un equilibrio HLB alto se asocia mejor con compuestos hidrosolubles que con compuestos solubles en aceite. En el presente documento, el valor de HLB debería ser de 12 o mayor, preferentemente al menos 123. Como surfactantes no iónicos, son más preferidos en la presente invención los

15 tensioactivos de silicio orgánico tales como heptametiltrisiloxano modificado con un polialquilenóxido son los más preferidos de la presente invención. Un producto comercial es el adyuvante de pulverización Silwet L-77™ de GE Advanced Materials. (A-1) Tensioactivos tipo polietilenglicol: ejemplos de tensioactivos tipo polietilenglicol incluyen el éter de polietilen alquilo (C-12-18), aducto de óxido de etileno de alquil naftol, éter de fenil polioxietileno (mono o di) alquilo (C812), producto de condensación de formaldehído de éter de fenil polioxietileno (mono o di) alquilo (C8-12), éter de fenil polioxietileno (mono, di o tri) fenilo, éter de fenil polioxietileno (mono, di o tri) bencilo, éter de fenil polioxietileno (mono, di o tri) estirilo, un éter de fenil polioxipropileno (mono, di o tri) estirilo, un polímero en bloque polioxietileno polioxipropileno, un éter de polímero en bloque polioxietileno polioxipropileno, un éter de polímero en bloque fenil polioxietileno polioxipropileno de alquilo (C8-12), éter de polioxietileno bisfenilo, éster del

25 ácido de resina de polioxietileno, monoéster de polioxietileno de ácido graso (C12-18), monoéster de polioxietileno de ácido graso (C12-18), diéster de polioxietileno de ácido graso (C12-18), éster de polioxietileno sorbitan de ácido graso (C12-18), aducto de óxido de etileno de éster glicerol de ácido graso, aducto de óxido de etileno de aceite de ricino, aducto de óxido de etileno de aceite de ricino endurecido , aducto de óxido de etileno amina de alquilo (C12-8) y aducto de óxido de etileno de amida de ácido graso (C12-18); (A-2) Tensioactivos tipo alcohol polivalente: ejemplos de tensioactivos tipo alcohol polivalente incluyen éster glicerol de ácidos grasos, éster poliglicerina de ácidos grasos, éster pentaeritritol de ácido graso, éster sorbitol de ácido graso (C12-18), éster sorbitan de ácidos grasos (C12-8), éster sacarosa de ácido graso, alquil éter de alcohol polivalente, y amida alcanol de ácidos grasos. (A-3) Tensioactivos de tipo acetileno: ejemplos de tensioactivos tipo acetileno incluyen acetilenglicol, alcohol de

35 acetileno, aducto óxido de etileno de acetilenglicol y aducto óxido de etileno de alcohol de acetileno.

Los tensioactivos anteriores se pueden utilizar únicamente o en combinación con dos o más tensioactivos. De manera notable, los tensioactivos de silicona orgánica se pueden combinar con otros tensioactivos. La concentración de tensioactivos en la suspensión acuosa de la invención se puede ensayar fácilmente llevando a cabo experimentos de pulverización comparativos, de manera similar a como se hacen en los ejemplos. Sin embargo, en general, la concentración total de tensioactivos puede estar entre 0,025 y 0,5 % por volumen, preferentemente entre 0,025 y 0,2 % por volumen de dicha suspensión. Como la densidad de los tensioactivos está cerca en general de 1,9 g/ml, la concentración de tensioactivos total está entre 0,25 y 5,0 g, preferentemente entre 0,25 y 2,0 g por litro de dicha suspensión (incluyendo el abrasivo). Si los tensioactivos anteriores de silicona orgánica tal como

45 heptametiltriloxano modificado con polalquilenóxido, la concentración del tensioactivo de silicona orgánica en la suspensión agrobacteriana que se utiliza para la pulverización pueden estar entre 0,05 y 0,5 % por volumen, preferentemente entre 0,05 y 0,2 % por volumen. De manera alternativa, la concentración del tensioactivo de silicona orgánica en la suspensión agrobacteriana que se utiliza para la pulverización se puede definir que está entre 0,5 y 5,0 g, preferentemente entre 0,5 y 2,0 g por litro de dicha suspensión.

Con el fin de mejorar las propiedades físicas de la suspensión acuosa, es posible añadir ácido silícico (sílice) de tamaño sub-micrométrico altamente dispersado o polímeros porosos tales como condensado de urea/formaldehído (Pergopak™). De manera notable cuando el tamaño medio de partícula del abrasivo está entre 0,1 y 30 µm, o en uno de los sub-intervalos preferidos de este intervalo que se dio anteriormente, es posible añadir una sílice de

55 tamaño sub-micrométrico altamente dispersado a la suspensión. En este caso, la sílice de tamaño sub-micrométrico es una sílice que tiene un tamaño de partícula medio de entre 0,01 y 0,5 µm, preferentemente entre 0,02 y 0,5 µm, más preferentemente entre 0,02 y 0,1 µm. El ácido silícico altamente dispersado tal como Hi-Sil™ 233 (PGG Industries) puede contribuir a las propiedades abrasivas de la suspensión acuosa (véase Jensen et al., Bull. Org. Mond. Sante, Bull. Wld Hlth Org. 41 (1969) 937-940). Estos agentes se pueden incorporar en una cantidad de 1 a 10 g por litro de la suspensión de la invención.

Posibles aditivos adicionales para la suspensión agrobacteriana son sustancias tampón para mantener el pH de la suspensión que se utiliza para la pulverización en un pH deseado, típicamente entre 7,0 y 7,5. Además, se pueden añadir sales solubles inorgánicas tales como el cloruro sódico para ajustar la fuerza iónica de la suspensión.

65 También puede estar contenido en la suspensión un caldo nutritivo tal como el medio LB.

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La suspensión acuosa se puede producir de la siguiente manera. En un método, la cepa de Agrobacterium que se va a utilizar en el procedimiento de la invención se inocula en un medio de cultivo y se cultiva hasta una alta concentración celular. Se pueden inocular cultivos más grandes con pequeños volúmenes de medio de cultivo altamente concentrado para la obtención de grandes cantidades de medio de cultivo. Las agrobacterias se cultivan 5 generalmente hasta que la concentración celular que se corresponde a una DO de 500 nm de al menos 1, normalmente de aproximadamente 1,5. Dichas suspensiones agrobacterianas altamente concentradas se diluyen entonces para conseguir la concentración celular deseada. Para la dilución las suspensiones agrobacterianas altamente concentradas se utiliza agua. El agua puede contener un tampón. El agua puede contener adicionalmente un tensioactivo de la invención. De manera alternativa, las suspensiones agrobacterianas concentradas pueden diluirse en agua, y cualquiera de los aditivos tales como el tensioactivo y las sustancias tampón opcionales se añaden después o durante el procedimiento de dilución. El abrasivo se puede añadir antes, durante o después de la dilución. Sin embargo se prefiere agitar la suspensión durante la adición del abrasivo para dispersar uniformemente el abrasivo en la suspensión agrobacteriana. La etapa de dilución de la suspensión agrobacteriana concentrada puede llevarse a cabo en el depósito de pulverización del pulverizador utilizado para pulverizar las suspensiones

15 diluidas.

El pulverizador que se va a utilizar en el procedimiento de la presente invención depende principalmente del número de plantas o el área que se va a pulverizar. Para una o un pequeño número de plantas que se van a pulverizar, se pueden utilizar los pulverizadores de bomba como los que se emplean ampliamente en la casa o en jardinería. Estos pueden tener volúmenes de depósito de pulverización de entre 0,5 y 2 litros. Para aplicaciones a media escapa, se pueden utilizar pulverizadores hidráulicos operados manualmente tales como los pulverizadores de mochila operados con una palanca o los pulverizadores de compresión utilizados manualmente. Sin embargo, la transfección de alto rendimiento que se alcanza en la invención tiene su más completo potencial en la transfección de muchas plantas tal como las plantas cultivadas en un campo de cultivo o en un invernadero. Para este fin, se pueden utilizar

25 los pulverizadores hidráulicos operados con un motor tal como los pulverizadores hidráulicos montados en un tractor con barras de pulverización. Las técnicas de aplicación aérea que utilizan helicópteros o aviones también son posibles para grandes campos. Todos estos tipos de pulverizadores se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en el libro "Pesticide Application Methods" por G.A. Matthews, tercera edición, Blackwell Science, 2000. Con el fin de asegurar una suspensión homogénea en los depósitos de pulverización de los pulverizadores, se pueden agitar los pulverizadores de tamaño pequeño y medio a intervalos regulares o continuamente durante la pulverización. Los grandes pulverizadores tales como los pulverizadores montados en un tractor se deberían equipar con un agitador en el depósito de pulverización.

Considerando la presencia de las células agrobacterianas y el abrasivo en las suspensiones que se van a pulverizar,

35 los pulverizadores que se utilizan en la invención deberían producir una pulverización con un tamaño de gota de al menos una pulverización fina. También se pueden utilizar pulverización media y pulverización gruesa en la clasificación de pulverización que se utiliza en el libro mencionado anteriormente de G. A. Matthews, página 74. El propósito principal de la pulverización de la invención es humedecer el tejido vegetal con la suspensión. Por lo tanto, el tamaño de gota exacto no es crítico. Sin embargo, la eficacia de transfección se puede mejorar adicionalmente mejorando la pulverización de las superficies de las plantas con una presión aumentada.

En el procedimiento de la invención, al menos se pulverizan partes de planta. En una realización importante, se pulverizan las plantas que crecen en el suelo o en un campo, es decir, plantas que no se cultivan en tiestos movibles

o contenedores. Dichas plantas no se pueden dar la vuelta y sumergirlas en la suspensión agrobacteriana para la

45 infiltración al vacío. Al menos se pulverizan partes de la planta tales como las hijas. Preferentemente, se pulverizan la mayoría de las hojas y las plantas completas.

La presente invención se utiliza para la transfección transitoria de plantas con una secuencia de ADN de interés. El término “transitoria” significa que los métodos de no selección se utilizan para seleccionar células o plantas transfectadas con la secuencia de ADN de interés en el fondo de células o plantas no transfectadas que utilizan, por ejemplo agentes marcadores y genes marcadores genéticos capaces de detoxicar los agentes marcadores. Como resultado, el ADN transfectado no se introduce establemente en general en el ADN cromosómico de la planta. En vez de eso, los métodos transitorios utilizan el efecto de la transfección de muchas de las plantas transfectadas.

55 La invención se utiliza en general para la transfección de plantas multicelulares, notablemente, plantas mayores. Se pueden transfectar plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, aunque se prefieren las plantas dicotiledóneas. Las plantas para su uso en la presente invención incluyen cualquier especie de planta dando preferencia a las especies de cultivo importantes agronómica y horticulturalmente. Las plantas de cultivo comunes para su uso en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, judías, canola, frijoles, algodón, maíz, trébol, loto, lentejas, altramuz, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz, centeno, trébol dulce, girasol, guisante de olor, soja, hibrido de sorgo, judía de ñame, frijol terciopelo, algarroba, trigo, wisteria y plantas de nueces. Las especies de plantas preferidas para la práctica de la invención incluyen, pero no se restringe a, Gramineae, Compositeae, Solanaceae y Roseaceae representativas.

Las especies preferidas adicionalmente para su uso en la presente invención son plantas de los siguientes géneros:

65 Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis,

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Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus,

5 Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, y el Olyreae, el Pharoideae y otros.

En una realización, el procedimiento de la invención se puede utilizar para producir una proteína de interés en una

10 planta o en muchas plantas cultivadas en un campo. Para este fin, las plantas se pueden pulverizar con la suspensión agrobacteriana en un estado de crecimiento de las plantas deseado. Si el principal objetivo es alcanzar los niveles de expresión más alto posible seguido por la recolección de las plantas para obtener el material vegetal que contiene altas cantidades de la proteína, se pueden utilizar vectores víricos, ya que en general dan los niveles de expresión más altos.

15 En otra realización, el procedimiento de la invención se utiliza para generar o alterar un rasgo en una planta tal como un rasgo de introducción. En esta realización, la expresión excesiva de una proteína o ARN de interés puede no desearse para evitar los efectos perjudiciales sobre la salud de la planta. Para tales realizaciones, los vectores no replicantes (a los que también se hace referencia como “vectores transcripcionales”), es decir, se prefieren vectores

20 que carecen de origen de replicación funcional reconocido por una polimerasa de ácido nucleico presente en las células vegetales. Un ejemplo de dicha realización es la expresión de moléculas hormonales como mensajeros secundarios en células vegetales. En el ejemplo de la Fig. 29, los inventores demostraron el suministro de isopentenil transferasa, enzima clave de la biosíntesis de citocinina, en células de Nicotiana benthamiana pulverizando con la agrobacteria diluida que alberga un vector transcripcional que contiene la secuencia codificante

25 de ipt bajo el control de un promotor 35S. Se observaron los cambios morfológicos de las plantas transfectadas causados por la sobre-producción de citocinina (Fig. 29). Otra aplicación de la invención es la expresión de ARN, por ejemplo, para la interferencia de ARN, en el que la señal de interferencia puede diseminarse en la planta a partir de las células que expresan la señal a otras células. Un ejemplo es el direccionamiento de ADN vírico no deseado en las plantas como se describen en Pooggin en Nat. Biotech. 21 (2003) 131. Un ejemplo de oncogén de silenciamiento

30 que se puede adaptar a un sistema transitorio se describe en Escobar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442. La Fig. 37 muestra el fotoblanqueamiento por silenciamiento genético de fiteno desaturasa (PDS) en hojas de Nicotiana benthamiana. Un ejemplo adicional es el control de plagas de insectos coleópteros mediante interferencia de ARN similar a como se describe en Baum et al., Nat. Biotech. 25 (2007) 1322-1326 que se puede adaptar al procedimiento transitorio de la invención por transfección transitoria de las plantas infestadas por la plaga

35 con un ADN de interés que codifica y expresa el dsARN. Los métodos adicionales aplicables al procedimiento transitorio de la invención son los descritos en Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306; Chuang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990. En el experimento los resultados que se muestran en la Fig. 38, la expresión de flagelina protege una planta de los síntomas de enfermedad producidos por Pseudomonas syringae.

40 Adicionalmente, el procedimiento de la invención permite la alteración en un momento deseado rasgos relativo a la regulación del tiempo de floración o formación de frutos tales como la tuberización en patatas (Martinez-Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 15211-15216) o la regulación de la ruta de flavonoides utilizando un factor de transcripción (Deluc et al., Plant Physiol. 147 (2008) 2041-2053). La floración se puede inducir por la expresión

45 transitoria de la proteína Fr florigen móvil (Zeevaart, Current Opinion in Plant Biology 11 (2008) 541-547; Corbesier et al., Science 316 (2007) 1030-1033). Los frutos partenocárpicos en los tomates pueden producirse a gran escala utilizando la invención y el método descrito por Pandolfini et al., BMC Biotechnology 2 (2002). Aplicaciones adicionales de la invención están en el contexto de la alteración del desarrollo de fibras de algodón mediante factores de transcripción MYB como se describe en Lee et al., Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401 o la

50 activación de genes de planta defensivos (Bergey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058). Los inventores demostraron que la expresión transitoria de defensina MsrA2 en hojas de Nicotiana benthamiana disminuye significativamente los síntomas de infección por Pseudomonas (Fig. 31).

La invención también proporciona un procedimiento de protección de plantas de cultivo en un campo contra una

55 plaga. En dicho procedimiento, se puede determinar la infestación de al menos una de las plantas de una pluralidad de plantas que crecen en un huerto o un campo. Debido a la rapidez del procedimiento de la invención la expresión de una proteína o ARN perjudicial para la plaga se tiene que producir solo si se determina la infestación por la plaga. Por lo tanto, la expresión fuerte y constitutiva de las toxinas para la plaga o el dsARN para el ARNi incluso en ausencia de un riesgo de infestación no es necesaria. La expresión transitoria de endotoxinas de Bacillus

60 thuringiensis después de la pulverización con cultivos agrobacterianos diluidos que albergan los vectores de expresión basados en PVX correspondientes las plantas de Nicotiana benthamiana del daño por alimentación de larvas del gusano del tabaco Manduca sexta (Fig. 30).

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21).

Utilizando el gen GUS como un indicador, la transfección satisfactoria por pulverización con la suspensión agrobacteriana se consiguió en Brassica napus de la familia Brassica (Fig. 35). Se creó la construcción pNMD1971 5 basándose en el plásmido pNMD293 sustituyendo la secuencia de GFP con la secuencia de beta-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli (P05804) que contenía el 7º intrón del gen PSK7 de Petunia hybrida (AJ224165).

La transfección eficaz de plantas que utilizan la pulverización con suspensión agrobacteriana diluida se demostró también en especies de monocotiledóneas. La Fig. 36 muestra la transfección de plantas de cebolla Allium cepa después de la pulverización con la suspensión agrobacteriana suplementada con un 0,1 % de Silwet L-77. La construcción pNMD2210 se creó basándose en el plásmido pNMD1971 sustituyendo el promotor 35S en el casete de expresión de GUS con el promotor actina 2 (Act2) del arroz Oryza sativa (EU155408).

En todos los ejemplos descritos en el presente documento, se llevó a cabo la pulverización con depósitos de bomba

15 de pulverización con un volumen nominal de 500 o 1000 ml (Carl Roth, nº 0499.1 y nº 0500.1) basado en bombeo directo manual o con un pulverizador a presión con un volumen de 1,25 l (Gardena, nº 00864-20) aprovechando el aumento de presión para bombear. Las plantas se pulverizaron hasta humedecer las hojas completamente. Los pulverizadores se agitaban de tiempo en tiempo para asegurar la homogeneidad de la suspensión que se iba a pulverizar, sobre todo si las suspensiones contenían un abrasivo.

Ejemplo 4: Transfección de plantas utilizando suspensiones de Agrobacterium que contienen un abrasivo

El carborundo utilizado en estos experimentos era una mezcla de carborundo (carburo de silicio) de partículas F800, F1000 y F1200 de Mineraliengrosshandel Hausen GmbH, Telfs, Austria. Según el proveedor, tiene unos diámetros

25 de superficie medios de 6,5, 4,5 y 3 µm, respectivamente. El 97 % por peso de las partículas de F800, F1000 y F1200 tiene un diámetro de superficie menor de 14, 10 y 7 µm, respectivamente. El 94 % por peso de las partículas tienen un diámetro de superficie mayor de 2, 1, y 1 µm, respectivamente. Se mezclaron F800, F1000 y F1200 en cantidades por peso iguales. Se añadió un 0,3 % (p/v) del carborundo mezclado en las suspensiones agrobacterianas suplementadas con 0,1 % de Silwet L-77 y se utilizaron para pulverizar las plantas utilizando los pulverizadores descritos en el ejemplo 3.

Los resultados que se muestran en las Fig. 32, 22 y 33 demostraban que el uso del abrasivo aumenta significativamente la eficacia de transfección. La pulverización de plantas de berenjena Solanum melongena con la suspensión agrobacteriana que contenía un 0,3 % de carborundo (carburo de silicio SiC) proporcionaba un aumento

35 de 2 veces de eficacia de transfección (Fig. 32). En el caso de remolachas rojas, el mismo tratamiento con abrasivo resultaba en un aumento de 15 veces de eficacia de transfección (Fig. 22). De manera reseñable, el uso de un abrasivo era un factor decisivo que permitía la transfección de plantas de pimienta pulverizando con la suspensión agrobacteriana; la combinación de un tratamiento abrasivo con activación de las células agrobacteriana con acetosiringona aumentaba adicionalmente la eficacia de transfección (Fig. 32). La lista de especies transfectadas utilizando la pulverización con tensioactivo y abrasivo incluyen también la Mangel-wurzel, otra variedad de Beta vulgaris, espinaca de Nueva Zelanda Tetragonia expansa de la familia Aizoaceae, pimienta Capsicum annuum y berenjena Solanum melongena de las Solanaceae (Fig. 23).

Ejemplo 5: Se puede repetir el tratamiento con agrobacterias: múltiples tratamientos posteriores

45 Los inventores llevaron a cabo múltiples tratamientos posteriores de plantas de Nicotiana benthamiana con agrobacterias diluidas. Para este fin se sumergieron las hojas en suspensiones diluidas de Agrobacterium que albergaban las siguientes construcciones: pNMD570 (TMV(fsMP)-GFP sin capacidad de movimiento célula a célula), pNMD560 (TMV(MP)-GFP con capacidad de movimiento célula a célula), pNMD580 (TMV(MP)-DsRED con capacidad de movimiento célula a célula), pNMD620 (PVX(ΔCP)-GFP sin capacidad de movimiento célula a célula, pNMD600 (PVX(CP)-GFP con capacidad de movimiento célula a célula y sistémico) y pNMD610 (PVX(CP)-dsRED con capacidad de movimiento célula a célula y sistémico). Después de la transfección, estos vectores formaban puntos fluorescentes que se diferenciaban en color y tamaño (Fig. 24). Los inventores llevaron a cabo la transfección por inmersión de cada hoja ensayada con 3 cultivos diferentes y con intervalos de 7 días entre las transfecciones.

55 Para cada una de las ocho combinaciones de vector ensayados todas las transfecciones con Agrobacterium eran satisfactorias, no se observó un efecto de silenciamiento particular (Fig. 24).

Ejemplo 6: La pulverización con agrobacterias pueden suministrar replicones víricos capaces del movimiento célula a célula

Los inventores demostraron que la pulverización de plantas de Nicotiana benthamiana con diluciones 1:100 y 1:1000 de suspensiones agrobacterianas proporciona el suministro eficaz de replicones víricos capaces del movimiento célula a célula, que aba como resultado la alta expresión de los genes de interés, comparale con la expresión que se alcanzaba utilizando la infiltración de agrobacterias. Esto se demostró para la GFP (Fig. 25), interferón alfa-a

65 humano y klip27-mini-insulina (Fig. 26), y varias celulasas incluyendo la exocelulasa E3 de Thermobifida fusca, exoglucanasa 1 (CBH I) de Trichoderma reesei, β-glucosidasa BLG4 de Humicola grisea y la exocelulasa E3 de

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Thermobifida fusca (Fig. 27).

Ejemplo 7: Las agrobacterias se pueden utilizar para suministrar factores de transcripción como mensajeros secundarios

5 Los inventores demostraron la inducción de biosíntesis de antocianina en hojas de Nicotiana tabacum infiltradas con suspensión agrobacteriana que alberga un vector vírico basado en PVX que proporciona la expresión de MYB antocianina 1 (ANT1) de Lycopersicon esculentum (Fig. 28).

Ejemplo 8: Las agrobacterias se pueden utilizar para suministrar ARNi como mensajero secundario

Los inventores han demostrado el fotoblanqueamiento de hojas de Nicotiana benthamiana producido por el silenciamiento del gen de la fiteno desaturasa (PDS) después de la pulverización de las hojas con una suspensión agrobacteriana que albergan el vector vírico basado en PVX que contenía el fragmento de la secuencia codificante

15 de PDS en orientación anti-sentido (Fig. 37). Para generar esta construcción (pNMD050), se insertó un fragmento de 298-624 pb del ADNc de fiteno desaturasa (PDS) de Nicotiana benthamiana (EU165355) en el vector de clonación pNMD640 en una orientación anti-sentido utilizando los sitios BsaI.

Ejemplo 9: Las agrobacterias se pueden utilizar para suministrar MAMP (Patrones Moleculares Asociados a Microbios) como mensajeros secundarios

Los inventores demostraron la reducción de número de lesiones necróticas producidas por la infección por Pseudomonas syringae pv. syringae en hojas de Nicotiana benthamiana después de la pulverización preliminar de plantas con la suspensión agrobacteriana que albergaba el vector basado en PVX que proporciona la expresión del

25 gen de flagelina de Pseudomonas (pNMD1953) (Fig. 38). Para crear el plásmido pNMD1953, se sustituyó la secuencia codificante de GFP en la construcción pNMD630 con la secuencia que comprende el fragmento que codifica el péptido de señal del apoplasto del gen de la alfa-amilasa (AMY3) de la cebada (Hordeum vulgare) (FN179391) fusionado en fase con la secuencia que codifica la flagelina de Pseudomonas syringae pv. syringae (YP236536). Se inocularon cuatro plantas de Nicotiana benthamiana con diluciones 1:1000 de Agrobacterium (DO600 = 1,3) por pulverización. A los 6 dpi de los cultivos de Agrobacterium, todas las plantas se inocularon con Pseudomonas syringae pv. syringae B728 a 1 x 105 ufc/ml por pulverización. A los 7 dpi de las Pseudomonas, se valoraron los síntomas de la enfermedad por recuento de los puntos necróticos en dos hojas de cada planta. El número de puntos necróticos producidos por la infección de Pseudomonas por hoja se presenta como la media de cada 2 hojas de las 4 plantas.

35 La lista de secuencias posterior contiene las siguientes secuencias de nucleótidos:

SEQ ID NO: 1: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD280 SEQ ID NO: 2: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD033 SEQ ID NO: 3: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD035 SEQ ID NO: 4: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD661 SEQ ID NO: 5: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD670 SEQ ID NO: 6: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD694 SEQ ID NO: 7: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD1971

45 SEQ ID NO: 8: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD2210 SEQ ID NO: 9: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD050 SEQ ID NO: 10: Región TNA de la región de T-ADN de pNMD1953

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Anexo: Secuencias de regiones de T-ADN para las construcciones básicas utilizadas como vectores de clonación

pNMD280 (Fig. 1) 35

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pNMD033 (Fig. 1)

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pNMD035 (Fig. 2)

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Claims

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