JP2022536068A - クレブシエラの制御のためのクレビシン - Google Patents

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Abstract

本発明は、クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質を提供し、前記タンパク質は、リピドＩＩ切断活性またはクレブシエラ細胞膜における孔形成能を有する。

Description

本発明は、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）に対する細胞毒性活性を有するタンパク質を提供する。本発明はまた、１種または複数の前記タンパク質を含む医薬組成物を含めた組成物を提供する。本発明はさらに、治療に使用するための、クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質、および該タンパク質を含む組成物を提供する。また、クレブシエラによる対象の感染症を処置する方法に使用するための、タンパク質または該タンパク質を含む組成物も提供する。さらに、小腸または大腸にタンパク質または組成物を送達するための経口腸溶製剤を提供する。さらに、肺にタンパク質または組成物を送達するための肺用製剤を提供する。また、クレブシエラによる物体の感染または汚染を予防または低減する方法、対象またはそれを必要とする患者のクレブシエラによる感染を処置する方法、ならびに、該タンパク質を含む組成物を産生する方法を提供する。本発明はまた、本発明のタンパク質を含む組成物を産生する方法を提供する。本発明はさらに、クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を含む植物、植物組織または植物細胞、ならびに該核酸分子を含む植物、植物組織または植物を提供する。
クレブシエラは、非運動性の、桿形の、グラム陰性の細菌であり、多くの宿主の防御機構に対して耐性を付与する莢膜多糖によって包まれている。クレブシエラは、環境中および哺乳動物の粘膜表面において存在する日和見病原体である。クレブシエラ属の以下の３つの種は一般的に、ヒトの疾患と関連している：Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｋ．オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）およびＫ．グラニュロマティス（Ｋ．ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）。最近、さらに２つのクレブシエラ種、Ｋ．バリイコラ（Ｋ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ）およびＫ．クアシニューモニエ（Ｋ．ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）も、致命的な感染症を引き起こし得ることが見出されている（Long et al.2017）。
病原菌への感染の主要な原因として、患者の消化管および病院職員の手が挙げられる。病院外では、クレブシエラへの感染は、典型的には肺で起こる。その疾患は典型的には、例えばアルコール症、糖尿病または慢性気管支肺スピロヘータ症などの衰弱性疾患を有する中高年の男性に影響を及ぼす（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。この患者集団は、呼吸器における宿主防御機構が損なわれていると考えられる。その生物は、宿主が下気道にコロニー形成性の口咽頭微生物を吸引した後に侵入する（Hirsche et al.,2005）。
近年、クレブシエラは、院内感染における深刻な病原体となった。院内感染の一般的な部位としては、尿路、下気道、胆管および外科手術の創傷部位が挙げられる。臨床的な症候群の範囲としては、肺炎、菌血症、血栓静脈炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、胆嚢炎、下痢、上気道感染症、創傷感染、骨髄炎および髄膜炎が挙げられる（Miftode et al.,2008）。侵襲性デバイスの存在、呼吸支援装置の汚染、尿カテーテルの使用、および抗生物質の使用は、クレブシエラ種による院内感染の可能性を増加させる要因である（Weisenberg et al.,2009）。
Ｋ．ニューモニエは、抗生物質耐性を直ちに発達させる病院内ＥＳＫＡＰＥ感染症を構成する６つの病原体（エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、プシュードモナス・アエルギノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ））のうちの１つである。２０１６年、中国において、超毒性のカルバペネム耐性のＫ．ニューモニエ（ＣＲＰＫ）ＳＴ１１株への感染により、５人の外科手術患者が死亡する、という院内肺炎の発生が報告されている（Gu et al,2017）。該菌株は、超毒性であり、また超耐性の菌株であるため、「スーパーバグ」（ｓｕｐｅｒｂｕｇ）と称され得る。ＳＴ１１ ＣＲ ＨｖＫＰ株は、通常の免疫を有する比較的健常な集団に感染する。これらはムコイド株であり、集中治療室の全ての表面に粘着する。コリスチンは、カルバペネム耐性エンテロバクテリアに対する最後の手段としての抗生物質であるが、これはかかる株に対してはほとんど効果を有しない。当面の間は、セフタジジム／アビバクタム（ａｖｉｂａｃｔａｍ）がかかる感染症の処置に使用できるが、これらの抗生物質に対する耐性も、ほどなくして獲得され得る。
これまでにみられた病原体の薬剤耐性の増加は国際的な課題であり、新世代の抗菌物質の開発が緊急に必要とされている。細菌は、各々との間で生態的地位を争う際、バクテリオシンと呼ばれる毒性タンパク質を産生する。バクテリオシンは通常、同じ種または属に属する近縁の細菌のみを殺す。それらの作用機序は多様であり、例えば、孔形成、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ活性、タンパク質合成またはＤＮＡ複製の阻害等が挙げられる。グラム陽性菌によって産生されるバクテリオシンは通常、それらの特性に応じた所定のクラスのバクテリオシンと呼ばれる一方、グラム陰性菌株によって産生されるバクテリオシンは、コリシン型バクテリオシン（高い分子量、２５～８０，０００Ｄａ）またはマイクロシン（ｍｉｃｒｏｃｉｎｓ）（低い分子量、＜１０，０００Ｄａ）に分類される（Lagos et al,2009）。
抗菌性ペプチドは、細菌のみによって産生されるのではなく、細菌による感染に直面したときに各種の生物によってもまた、産生される。抗菌性ペプチドは、コリスチン（パエニバチルス・ポリミキシア（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）由来のポリミキシン）、バンコマイシン（アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来）などの、ペプチド抗生物質として薬剤において使用される。しかしながら、かかる抗生物質は、大部分が局所投与用に、または最終手段の薬剤として用いられる。ペプチドに関する他の課題は、天然給源からの精製が非効率的であり、また高コストであることである。化学合成により克服され得るが、しかしながら、それでも高価である。異種宿主における組換えペプチドの産生もまた、宿主細胞に対する毒性のため困難である（Li,2011）。
現在まで、コリシン様の抗生物質で登録されたものが存在しない。しかしながら、科学文献にコリシン様バクテリオシンが、グラム陰性の病原体に対する潜在的な抗菌物質として使用させることに関する研究が存在する。最も研究されているのがコリシンであり、いくつかの研究グループがピオシンに関して研究を行っている（Ｇｒｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｇｈｅｑｕｉｒｅ，ｄｅ Ｍｏｔ，２０１４）。この間、クレブシエラ由来のヌクレアーゼのクラスに属するバクテリオシンは、ほとんど着目されておらず、ほんのわずかな研究成果しか発表されていない（James et al,1987、Riley et al,2001、Chavan et al,2005）。クレビシン（ｋｌｅｂｉｃｉｎ）の発現、精製および活性試験に関する詳細な研究成果は存在しない。
先行技術はともかく、本発明の課題は、クレブシエラに対して活性を有する薬剤を提供することである。本発明の課題はまた、対象のクレブシエラ感染症（特に抗生物質耐性のクレブシエラによる感染症）を処置するために使用できる薬剤または組成物を提供することである。さらに本発明の課題は、物体の（例えば１種または複数のクレブシエラ種による食品の）汚染を予防または低減する方法を提供することである。
本発明者らは、クレブシエラに対して活性な新規バクテリオシンを見出した。したがって、本発明は以下を提供する。
１）クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質であって、好ましくは、クレブシエラ細胞の細胞膜におけるリピドＩＩ切断活性または孔形成能を有する、タンパク質。
２）第１のアミノ酸配列セグメントおよび第２のアミノ酸配列セグメントを含むか、またはそれらからなり、第１のアミノ酸配列セグメントが、クレブシエラ細胞の構成成分に結合することができ、第２のアミノ酸配列セグメントが、クレブシエラ細胞の細胞膜におけるリピドＩＩ切断活性または孔形成能を有する、項目１に記載のタンパク質。
３）クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質であって、第１のアミノ酸配列セグメントおよび第２のアミノ酸配列セグメントを含むか、またはそれらからなり、第１のセグメントが、好ましくは、前記タンパク質のＮ末端セグメントであり、第２のセグメントが、前記タンパク質のＣ末端セグメントである、タンパク質。
４）（Ａ）第１のセグメントが、
（Ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１～１２８、
（Ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１～１２７、
（Ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１～１２３、
（Ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１～１１８、
（Ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１～１７０、
（Ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１～１７２、
（Ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基１～２５５、
（Ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基１～２８８、または
（Ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基１～２３６
のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか；
あるいは
（Ｂ）第１のセグメントが、
（Ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
（Ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含むか；
あるいは
（Ｃ）第１のセグメントが、
（Ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または
（Ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
アミノ酸配列を含む、項目２または３のいずれか１項に記載のタンパク質。
５）（Ａ）第１のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１～１２８、
（Ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１～１２７、
（Ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１～１２３、
（Ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１～１１８、
（Ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１～１７０、
（Ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１～１７２、
（Ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基１～２５５、
（Ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基１～２８８、または
（Ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基１～２３６
のアミノ酸配列であるか；
あるいは
（Ｂ）第１のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、または
（Ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性
を有するか；
あるいは
（Ｃ）第１のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、または
（Ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失
を有する、項目２または３のいずれか１項に記載のタンパク質。
６）項目（Ｂ）において、配列同一性のいずれか１つが、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％であり；ならびに／または
項目（Ｃ）において、前記アミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失の数が、前記アミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、最も好ましくは少なくとも１～５個である、項目４または５に記載のタンパク質。
７）（Ｄ）第２のセグメントが、
（Ｄ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１２９～２７８、
（Ｄ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１２８～２７６、
（Ｄ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１２４～２７２、
（Ｄ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１１９～２６６、
（Ｄ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１７１～３７７、
（Ｄ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１７３～３７９、
（Ｄ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基２５６～４５２、
（Ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基２８９～４６６、または
（Ｄ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基２３７～４１４
のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか；
あるいは
（Ｅ）第２のセグメントが、
（Ｅ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
（Ｅ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含むか；
あるいは
（Ｆ）第２のセグメントが、
（Ｆ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
アミノ酸配列を含む、項目２～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
８）（Ｄ）第２のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ｄ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１２９～２７８、
（Ｄ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１２８～２７６、
（Ｄ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１２４～２７２、
（Ｄ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１１９～２６６、
（Ｄ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１７１～３７７、
（Ｄ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１７３～３７９、
（Ｄ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基２５６～４５２、
（Ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基２８９～４６６、または
（Ｄ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基２３７～４１４から
のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか、
あるいは
（Ｅ）第２のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ｅ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、または
（Ｅ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性
を有するか、
あるいは
（Ｆ）第２のセグメントのアミノ酸配列が、
（Ｆ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、または
（Ｆ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失
を有する、項目２～７のいずれか１項に記載のタンパク質。
９）前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｉ～Ａ－ｉｖ、Ｂ－ｉ～Ｂ－ｉｖまたはＣ－ｉ～Ｃ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｉ～Ｄ－ｉｖ、Ｅ－ｉ～Ｅ－ｉｖまたはＦ－ｉ～Ｆ－ｉｖのいずれか１つである、項目７または８のいずれか１項に記載のタンパク質。
１０）それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｉ～Ａ－ｉｖのいずれか１つまたは複数であり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｉ～Ｄ－ｉｖのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ｂ－ｉ～Ｂ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｅ－ｉ～Ｅ－ｉｖのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、Ｃ－ｉ～Ｃ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｆ－ｉ～Ｆ－ｉｖのいずれか１つである、項目９に記載のタンパク質。
１１）前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｖ～Ａ－ｉｘ、Ｂ－ｖ～Ｂ－ｉｘまたはＣ－ｖ～Ｃ－ｉｘのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｖ～Ｄ－ｉｘ、Ｅ－ｖ～Ｅ－ｉｘまたはＦ－ｖ～Ｆ－ｉｘのいずれか１つである、項目７または８のいずれか１項に記載のタンパク質。
１２）それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｖ～Ａ－ｉｘのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｖ～Ｄ－ｉｘのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ｂ－ｖ～Ｂ－ｉｘのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｅ－ｖ～Ｅ－ｉｘのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ｃ－ｖ～Ｃ－ｉｘのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｆ－ｖ～Ｆ－ｉｘのいずれか１つである、項目１１に記載のタンパク質。
１３）それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｖ～Ａ－ｖｉ、Ｂ－ｖ～Ｂ－ｖｉまたはＣ－ｖ～Ｃ－ｖｉのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｖ～Ｄ－ｖｉ、Ｅ－ｖ～Ｅ－ｖｉまたはＦ－ｖ～Ｆ－ｖｉのいずれか１つであるか；および／あるいは、
それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｖｉｉｉ～Ａ－ｉｘ、Ｂ－ｖｉｉｉ～Ｂ－ｉｘまたはＣ－ｖｉｉｉ～Ｃ－ｉｘのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｖｉｉｉ～Ｄ－ｉｘ、Ｅ－ｖｉｉｉ～Ｅ－ｉｘまたはＦ－ｖｉｉｉ～Ｆ－ｉｘのいずれか１つである、項目１１または１２に記載のタンパク質。
１４）前記タンパク質の細胞毒性活性が、前記タンパク質、および配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質が、アガープレート上の感受性クレブシエラ株の菌叢上に前記タンパク質および比較タンパク質の溶液のそれぞれの２０マイクロリットルをスポットし、その後アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、感受性クレブシエラ・クアシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）亜種シミリニューモニエ（ｓｉｍｉｌｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、溶液中の前記タンパク質の濃度が、それぞれの比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である、項目４～１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
１５）（ａ）（ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）、
（ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）、
（ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）、
（ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）、
（ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）、
（ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）、
（ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）、
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）、または
（ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）
のアミノ酸配列；
あるいは
（ｂ）（ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
（ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
アミノ酸配列；
あるいは
（ｃ）（ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または
（ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して、１～１２０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
アミノ酸配列
を含むか、またはそれらからなるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目１～１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
１６）（ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列が、
（ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）、
（ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）、
（ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）、
（ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）、
（ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）、
（ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）、
（ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）、
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）、または
（ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）
のアミノ酸配列であるか；
あるいは
（ｂ）前記タンパク質のアミノ酸配列が、
（ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性
、または
（ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性
を有するか；
あるいは
（ｃ）前記タンパク質のアミノ酸配列が、
（ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、または
（ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して、１～１２０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失
を有する、項目１または１５に記載のタンパク質。
１７）項目（ｂ）において、配列同一性のいずれか１つが、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％であり；ならびに／または
項目（ｃ）において、前記アミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失の数が、前記アミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、最も好ましくは少なくとも１～５個である、項目１５または１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
１８）項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）または（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）のいずれか１つの前記タンパク質の細胞毒性活性が、前記タンパク質、および前記項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）または（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）の配列番号のアミノ酸配列の比較タンパク質が、アガープレート上の感受性クレブシエラ株の菌叢上に前記タンパク質および比較タンパク質の溶液のそれぞれの２０マイクロリットルをスポットし、その後のアガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、感受性クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種シミリニューモニエＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、溶液中の前記タンパク質の濃度が、それぞれの比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である、項目１５、１６または１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
１９）細胞壁生合成阻害活性を有し、それによってタンパク質が、ウンデカプレニルリン酸が連結されたペプチドグリカン前駆体を分解することができる、項目１～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
２０）第１のセグメントが、転位および受容体結合ドメインを含む、項目２～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
２１）クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・グラニュロマティス、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）および／またはクレブシエラ・バリイコラに対する殺菌活性または静菌活性を有する、項目１～２０のいずれか１項に記載のタンパク質。
２２）クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質、任意に項目１～２１のいずれか１項に記載のタンパク質であって、配列番号２２～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、２０種の標準アミノ酸残基のいずれか１つ、またはアミノ酸残基の非存在を表し、Ｊが、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）のいずれかを表す、タンパク質。
２３）参照配列として配列番号１～４、７、８もしくは２２について定義されるいずれか１つ、好ましくは、参照配列として配列番号１～４もしくは２２について定義されるいずれか１つである、項目１～２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
２４）前記タンパク質の細胞毒性活性が、前記タンパク質、および配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質が、アガープレート上の感受性クレブシエラ株の菌叢上に前記タンパク質および比較タンパク質の溶液のそれぞれの２０マイクロリットルをスポットし、その後のアガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、感受性クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種シミリニューモニエＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、溶液中のタンパク質の濃度が、比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である、項目１または２３に記載のタンパク質。
２５）項目１～２４のいずれか１項に定義される１種または複数のタンパク質を含む組成物。
２６）前記組成物の細胞毒性活性が、前記組成物、および配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質を含有する比較組成物が、アガープレート上の感受性クレブシエラ株の菌叢上に前記組成物の溶液および比較組成物の比較溶液のそれぞれの２０マイクロリットルをスポットし、その後アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、感受性クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種シミリニューモニエＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、前記組成物の溶液中のタンパク質の濃度が、比較溶液中のタンパク質の濃度の最大で５倍である、項目２５に記載の組成物。
２７）少なくとも１種のコリシンおよび／または少なくとも１種のサルモシンをさらに含む、項目２５または２６に記載の組成物。
２８）医薬組成物である、項目２５～２７のいずれか１項に記載の組成物。
２９）植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記１種または複数のタンパク質を発現している植物、好ましくは、前記１種または複数のタンパク質を発現している食用植物由来の材料である、項目２５～２８のいずれか１項に記載の組成物。
３０）前記植物材料が、ホウレンソウ、チャード、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ビートの葉、アマランス、タバコ、好ましくは、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）からなる群から選択される植物由来の材料であり、および／あるいは前記植物材料が、１種もしくは複数の葉、根、塊茎もしくは種子、または前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕、粉末化もしくは粉砕された生成物である、項目２９に記載の組成物。
３１）分散形態、好ましくは、溶解形態の前記タンパク質を含有する水性溶液である、項目２５～３０のいずれか１項に記載の組成物。
３２）治療に使用するための、好ましくは、クレブシエラ、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニ、クレブシエラ・エロゲネスおよび／またはクレブシエラ・バリイコラによる対象の感染症を処置する方法に使用するための、項目１～３１のいずれか１項に記載のタンパク質または組成物。
３３）前記クレブシエラが、抗生物質耐性、例えば、カルバペネム耐性である、項目３２に記載の使用のためのタンパク質。
３４）参照配列として配列番号１～４、７、８もしくは２２について定義されるいずれか１つ、好ましくは、参照配列として配列番号１～４もしくは２２について定義されるいずれか１つである、項目３２または３３に記載の使用のためのタンパク質。
３５）１種または複数のクレブシエラ種による物体の感染もしくは汚染を予防または低減する方法であって、前記物体を、項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質、または項目２５～３１のいずれか１項に定義される組成物と接触させることを含む、方法。
３６）それを必要とする対象のクレブシエラによる感染症を処置する方法であって、前記対象に、項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質、または項目２５～３１のいずれか１項に定義される組成物を投与することを含む、方法。
３７）前記クレブシエラが、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・エロゲネスおよび／またはクレブシエラ・バリイコラを含む、項目３５または３６に記載の方法。
３８）項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質を含む組成物を産生する方法であって、
（ｉ）植物、好ましくは、食用植物またはタバコにおいて前記タンパク質を発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から発現されたタンパク質を含有する植物材料を回収するステップ、
（ｉｉｉ）水性緩衝液を使用して、前記タンパク質を前記植物材料から抽出して、前記タンパク質を含有する組成物を得るステップ、
（ｉｖ）任意に、前記組成物から望ましくない夾雑物を除去するステップ
を含む、方法。
３９）前記１種または複数のタンパク質が、小腸または大腸への経口送達用に製剤されている、項目２５～３１のいずれか１項に記載の組成物。
４０）項目１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質、または項目２５～３１のいずれか１項に記載の組成物を含む、経口製剤であって、前記製剤が、胃の条件からタンパク質を保護することができ、小腸または大腸においてタンパク質を放出することができる、経口製剤。
４１）項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質をコードする核酸分子。
４２）項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質、好ましくは、項目１５～２３のいずれか１項に定義されるタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物であって、好ましくは、植物細胞において活性な転写プロモーター、および前記プロモーターの制御下で、細胞において、好ましくは植物細胞において、ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、核酸分子または核酸構築物。
４３）項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質、好ましくは、項目１５～２３のいずれか１項に定義されるタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物であって、細胞において、好ましくは植物細胞において、ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含むウイルス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）レプリコンであるか、またはそれをコードし；前記レプリコンが、サブゲノムプロモーターの制御下で、植物細胞または植物の細胞において前記ヌクレオチド配列を発現させるための前記サブゲノムプロモーターを含有していてもよい、核酸分子または核酸構築物。
４４）項目１～２４のいずれか１項に定義されるタンパク質を含む、植物、植物組織または植物細胞。
４５）項目４２または４３に定義される核酸分子または核酸構築物を含む、植物、植物組織または植物細胞。
図１は、クレビシンの発現のためのＴＭＶベースのベクターのＴ－ＤＮＡ領域を図式的に示す。ＲＢ：右側Ｔ－ＤＮＡ境界、Ａｃｔ２：シロイヌナズナ アクチンプロモーター、ＲｄＲｐ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、３’ＮＴＲ：３’非翻訳領域、Ｔ：ｎｏｓターミネータ、ＬＢ：左側Ｔ－ＤＮＡ境界、ＫｐｎｅＭ－ｃａｔ１：トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のカタラーゼ遺伝子（ｃａｔ－１）の第１イントロンを有するクレビシン ＫｐｎｅＭ（Ｋ．ニューモニエ ＥＷＤ３５５９０．１）のコーディング配列、ＫｐｎｅＭ２：クレビシン ＫｐｎｅＭ２（クレブシエラｓｐ．ＷＰ＿０４７０６６２２０）のコーディング配列、ＫｖａｒＭ：クレビシン ＫｖａｒＭ（Ｋ．バリイコラ ＣＴＱ１７２２５．１）のコーディング配列、ＫａｅｒＭ：クレビシン ＫａｅｒＭ（Ｋ．エロゲネス ＷＰ＿０１５３６７３６０．１）のコーディング配列、ＫｐｎｅＡ：クレビシン ＫｐｎｅＡ（Ｋ．ニューモニエ ＳＡＶ７８２５５．１）のコーディング配列、ＫａｅｒＡ：クレビシン ＫａｅｒＡ（Ｋ．エロゲネス ＷＰ＿０６３４１４８４１．１）のコーディング配列、ＫｏｘｙＹ：クレビシン ＫｏｘｙＹ（Ｋ．オキシトカ ＷＰ＿０２４２７３７７８）のコーディング配列、ＫｖａｒＩａ：クレビシン ＫｖａｒＩａ（Ｋ．バリイコラ ＫＤＬ８８４０９）のコーディング配列、ＫｐｎｅＩａ：クレビシン ＫｐｎｅＩａ（Ｋ．ニューモニエ ＢＡＳ３４６７５）のコーディング配列。 図２は、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉におけるクレビシンの発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。噴霧後５または７日（ｄｐｓ）の植物材料（５０ｍｇ）（３枚の葉サンプルをプール、４ｄｐｓのクレビシン ＫａｅｒＡ、５ｄｐｓの残り全てのクレビシン）を回収し、液体窒素で粉砕し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ酢酸ナトリウム、３ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．５）によって抽出し、９８℃で１０分間変性させた。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｍ：ＰａｇｅＲｕｌｅｒＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ・プロテイン・ラダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｌｔｉｃｓ）、ＷＴ：噴霧しなかったベンサミアナタバコ葉の粗抽出物、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｏｘｙＹ、ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＡ、ＫａｅｒＭ：クレビシン発現構築物を噴霧したベンサミアナタバコ葉の抽出物。組換えクレビシンに対応するバンドを、アスタリスクで示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図３は、ベンサミアナタバコ葉のバイオマスからのクレビシンの精製を例示する。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ：ＫｐｎｅＭ（Ａ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｃ）、ＫｖａｒＭ（Ｅ）、ＫｐｎｅＡ（Ｇ）、ＫａｅｒＡ（Ｉ）およびＫｖａｒＩａ（Ｋ）の精製スキーム。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ：ＫｐｎｅＭ（Ｂ）、ＫｐｎｅＭ２（Ｄ）、ＫｖａｒＭ（Ｆ）、ＫｐｎｅＡ（Ｈ）、ＫａｅｒＡ（Ｊ）およびＫｖａｒＩａ（Ｌ）の異なる精製ステップから得られたタンパク質サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。５μｇのタンパク質を含む溶液を、１２％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｂ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｐｎｅＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｄ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン４－ＫｐｎｅＭ２溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン５－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫｐｎｅＭ２のフロースルー、レーン９－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｆ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＭ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＱセファロースのＫｖａｒＭのフロースルー、レーン１０－不純物溶出液（Ｑセファロース後）、Ｈ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｐｎｅＡ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｐｎｅＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、Ｊ：レーン１および６－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－ＳＰセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン５－ＫａｅｒＡ溶出液（ＳＰセファロース後）、レーン７－Ｑセファロースにロードされたタンパク質、レーン８－ＱセファロースのＫａｅｒＡのフロースルー。Ｌ：レーン１および７－ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄタンパク質ラダー、レーン２－粗抽出物、レーン３－Ｐｈｅｎｙｌセファロース上にロードされた全可溶性タンパク質、レーン４－Ｐｈｅｎｙｌセファロースのフロースルー、レーン５－ＫｖａｒＩａ溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン６－不純物溶出液（Ｐｈｅｎｙｌセファロース後）、レーン８－ＳＰセファロースにロードされたタンパク質、レーン９－ＳＰセファロースのフロースルー、レーン１０－ＫｖａｒＩａ溶出液（ＳＰセファロース後）。矢印は、組換えタンパク質を示す。 図４は、１つのゲル上の精製されたクレビシンを示す。０．５μｇの精製されたクレビシンを、１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおいて分離させ、クーマシー染色を行った。Ｍ：ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｌｔｉｃｓ）。 図５は、ソフトアガーオーバーレイアッセイにおける、クレブシエラ菌株に対するクレビシン活性の評価を例示する。細菌の一晩培養物をＣＡＡ培地において増殖させ、ＯＤ５９５＝１．０に均一化し、溶融したトップＣＡＡアガーで１００倍希釈し、ＣＡＡアガープレート上に注いだ。タンパク質粗抽出液の２０μＬ滴を、６ｍｍのＷｈａｔｍａｎディスクに滴下し、Ｐｅｔｒｉプレートを３０℃または３７℃で一晩インキュベートした。 図６は、６つの植物で発現させたクレビシンに対する、クレブシエラ臨床分離株の感受性を示す。１００のクレブシエラ臨床分離株（８９株のＫ．ニューモニエおよび１１株のＫ．オキシトカ）を、プレート滴下アッセイにおいて試験した。各クレビシンへの感受性を有する菌株を、阻害ゾーンのサイズによって分類する。 図７は、液体培養におけるクレビシンの細胞毒性アッセイを示す。クレブシエラの一晩培養液をＣＡＡ培地でＯＤ６００＝０．３に希釈し、いずれかの５μｇ ｍＬ-1のクレビシンで処理し、細菌をさらに５時間振とう（２００ｒｐｍ）で培養した。試験した培養液のコロニー形成単位を計数することによって、クレビシンの抗菌活性を評価した。バーは標準偏差を表す。 図８は、バイオフィルムに対するクレビシン活性を示す。ＣＡＡ培地において１日増殖させたＫ．クアシニューモニエ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．バリイコラ、Ｋ．エロゲネスのバイオフィルムを、５μｇ ｍＬ-1のいずれかのクレビシンで処理した。試験した培養液のコロニー形成単位を計数することによって、クレビシンの抗菌活性を評価した。バーは標準偏差を表す。 図９は、Ｋ．クアシニューモニエ ＤＳＭ ２８２１２によるチャレンジ後のハチノスツヅリガ（ガレリア・メロンエラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ））幼虫の生存に対する、ＫｖａｒＩａ処理のインパクトを示す。Ｇ．メロンエラ幼虫を、１２，０００～３２，０００ＣＦＵのＫ．ニューモニエ ＤＳＭ ２８２１２で感染させ、感染の２時間後に１０μｇのＫｖａｒＩａで処理した。幼虫を、３７℃で最大６８時間、ペトリ皿においてインキュベートした。各処理時点で２０匹の幼虫を用いた。 図１０は、配列番号２２～２４に示す推定コンセンサス配列を示す。「１文字コード」は、２０個の標準的なアミノ酸を指し、「Ｘ」は、それぞれの位置におけるコンセンサスアミノ酸を推定するには不十分な保存性を指し、「－」は、低い保存性のためコンセンサス配列の推定において省略したアミノ酸を指す。Ｊは、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）を表す。高度に保存されたアミノ酸を黒色で強調し、中程度に保存されたアミノ酸を灰色で強調する。コンセンサス配列の推定の際、ソフトウェア「Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」を標準設定で使用した。図１０Ａは、配列番号２２の推定を示す。図１０Ｂは、配列番号２３の推定を示す。図１０Ｃは、配列番号２４の推定を示す。 図１０は、配列番号２２～２４に示す推定コンセンサス配列を示す。「１文字コード」は、２０個の標準的なアミノ酸を指し、「Ｘ」は、それぞれの位置におけるコンセンサスアミノ酸を推定するには不十分な保存性を指し、「－」は、低い保存性のためコンセンサス配列の推定において省略したアミノ酸を指す。Ｊは、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）を表す。高度に保存されたアミノ酸を黒色で強調し、中程度に保存されたアミノ酸を灰色で強調する。コンセンサス配列の推定の際、ソフトウェア「Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」を標準設定で使用した。図１０Ａは、配列番号２２の推定を示す。図１０Ｂは、配列番号２３の推定を示す。図１０Ｃは、配列番号２４の推定を示す。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１１は、凍結乾燥された精製タンパク質として保存した際の、クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの活性およびそれらの濃度の評価を示す。感受性細菌に対するクレビシンの活性を、液体培養において、または放射状拡散アッセイによって評価した。抗菌活性は、該活性を液体培養において評価するときは、ＣＦＵ／ｍＬ Δｌｏｇ10として表し、または放射状拡散アッセイを評価のために使用する場合には、比活性単位（ＡＵ）として表した。クレビシン濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。（Ａ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、－２０℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｂ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、５℃での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｃ）クレビシン ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２の、室温での保存後のＫｖａｒＩａの活性。（Ｄ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、－２０℃での保存後の活性。（Ｅ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、５℃での保存後の活性。（Ｆ）クレビシン ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭの、室温での保存後の活性。（Ｇ）－２０℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｈ）５℃での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。（Ｉ）室温での保存後のクレビシン濃度のトレンド線。 図１２は、ソフトアガーオーバーレイアッセイにおける、インビトロでの胃内消化後のＫｖａｒＩａおよびＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａの残存活性を、ならびにペプシンによるＫｖａｒＩａの消化後断片のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価を示す。（Ａ）ソフトアガーオーバーレイアッセイにおける、ＫｖａｒＩａおよびＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａの、インビトロでシミュレーションされた胃内消化後の残存活性の評価。タンパク質サンプルを、０．５、５、１０、２０、３０および６０分にわたり、ペプシンによって消化させた（ペプシン：タンパク質の比率＝１：４０）。全てのサンプルの希釈液は、蒸留水で１：２の比で調製し、５μＬの希釈後のサンプルのアリコートを、Ｋ．クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２の菌叢を有するＭＨＡプレート上に滴下した。（Ｂ）ＫｖａｒＩａ消化のトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイ。タンパク質の分解を視覚化し、ペプチド生成物のＭＷを推定するため、クーマシー染色を用いた。ペプシンおよびＫｖａｒＩａの有無を示す。時間を分で示し、またそれらは（Ａ）に対応するものである。 図１２は、ソフトアガーオーバーレイアッセイにおける、インビトロでの胃内消化後のＫｖａｒＩａおよびＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａの残存活性を、ならびにペプシンによるＫｖａｒＩａの消化後断片のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる評価を示す。（Ａ）ソフトアガーオーバーレイアッセイにおける、ＫｖａｒＩａおよびＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａの、インビトロでシミュレーションされた胃内消化後の残存活性の評価。タンパク質サンプルを、０．５、５、１０、２０、３０および６０分にわたり、ペプシンによって消化させた（ペプシン：タンパク質の比率＝１：４０）。全てのサンプルの希釈液は、蒸留水で１：２の比で調製し、５μＬの希釈後のサンプルのアリコートを、Ｋ．クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２の菌叢を有するＭＨＡプレート上に滴下した。（Ｂ）ＫｖａｒＩａ消化のトリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥアッセイ。タンパク質の分解を視覚化し、ペプチド生成物のＭＷを推定するため、クーマシー染色を用いた。ペプシンおよびＫｖａｒＩａの有無を示す。時間を分で示し、またそれらは（Ａ）に対応するものである。 図１３は、ｋｈｅ遺伝子の増幅に基づいて、リアルタイム－ＰＣＲによって得られた、Ｋ．クアシニューモニエの検出のための標準曲線を示す。 図１４のリアルタイム－ＰＣＲの結果は、Ｋ．クアシニューモニエがクレビシン処理の前後でマウス糞便サンプルにコロニーを形成したことを示す。実験時点ごとに、３匹のマウスの糞便のサンプルを用いた。１８ｄ：クレビシン処理の開始の前の、実験の１８日目の糞便サンプルを収集した；２２ｄ：実験の２２日目（最後のクレビシン経口摂取の翌日）の糞便のサンプルを収集した。
本発明の発明者らは、クレブシエラに対して殺菌または静菌活性を有するタンパク質を同定した。かかるタンパク質を、本明細書において「クレビシン」と称する。本発明のタンパク質またはクレビシンは、細菌細胞膜におけるリピドＩＩ切断活性または孔形成能を有するのが好ましい。
本発明のタンパク質またはクレビシンは、広義には、少なくとも２つのアミノ酸配列セグメント（時々、簡潔に本明細書において、「セグメント」と称される）を含む。本願明細書において、アミノ酸配列セグメントとは、タンパク質またはポリペプチドの一次構造中の、複数の隣接するアミノ酸残基を指し、そこにおいて、該タンパク質またはポリペプチドは、その一次構造中に、該セグメントよりも多くの数のアミノ酸残基を有する。本発明のタンパク質は、広義には、第１のセグメントおよび第２のセグメントを含むか、またはそれらからなる。第１のセグメントは、広義には、クレブシエラ細胞の成分に結合する（例えば受容体に対し結合する）能力を有するタンパク質を提供し、および／または、それは、クレブシエラ細胞によって導入されるかまたは取り込まれる（細胞内転位される）能力を有するタンパク質を提供する。第２のセグメントは、リピドＩＩを切断する活性、または細菌細胞膜における孔形成能を有し得る。したがって、第２のセグメントは、該タンパク質に、その細胞毒性活性を提供する。一実施形態では、第１のセグメントは前記タンパク質の一次構造のＮ末端側にあり、かつ第２のセグメントはＣ末端側にあり、またはその逆であり、なかでも前者が好ましい。したがって、本発明のタンパク質は、Ｎ末端側の第１のセグメントおよびＣ末端側の第２のセグメントを含んでもよく、またはそれらからなってもよい。他の実施形態では、第２のセグメントが前記タンパク質の一次構造のＮ末端側にあり、第１のセグメントがＣ末端側にある。したがって、本発明のタンパク質は、Ｎ末端側の第２のセグメントおよびＣ末端側の第１のセグメントを含んでもよく、またはそれらからなってもよい。
本発明のタンパク質の第１のセグメント
本発明のタンパク質は、上記で定義される項目（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１のセグメントを含み得る。これらの項目において詳述される配列番号１～９のアミノ酸配列は、本発明者らによって同定されたクレビシンのアミノ酸配列である。好ましくは、第１のセグメントのアミノ酸配列は、上記で定義される項目（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｉｘ）のアミノ酸配列である。
しかしながら、本発明は、本発明者らによって同定された具体的なクレビシンの第１のセグメントを有するクレビシンに限定されない。項目（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｉｘ）のアミノ酸配列の代わりに、第１のセグメントは、それぞれ、上記で定義される項目（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。「第１のセグメントが、配列番号Ｚのアミノ酸残基ｘからｙまでのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む」（ｘおよびｙは、開始部位および終了部位を指し、Ｚは、配列番号の番号を指す）という表現は、第１のセグメントのアミノ酸配列が、好ましくは、配列番号Ｚのアミノ酸残基ｘからｙの配列と、少なくとも同数のアミノ酸残基を有し、かつ、少なくとも配列番号Ｚの残基ｘからｙまでの全長にわたり上記で示される配列同一性を有することを意味する。この原則は、項目（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｘ）、および本願明細書において定義される他の配列の同一性の全てに適用される。本願明細書において、配列同一性の決定は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ １．２．４）を使用し、標準的なパラメーターに基づき行われる。好ましくは、第１のセグメントのアミノ酸配列は、項目（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｘ）のいずれか１つのそれである。「第１のセグメントのアミノ酸配列が、配列番号Ｚのアミノ酸残基ｘからｙまでのアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する」という表現は、第１のセグメントのアミノ酸配列が、配列番号Ｚのアミノ酸残基ｘからｙへの配列と、少なくとも同数のアミノ酸残基を有し、かつ、配列番号Ｚの残基ｘからｙまでの全長にわたり上記で示される配列同一性を有することを意味する。これは、項目（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｘ）、および本願明細書において定義される他の配列の同一性の全てに適用される。
別の実施形態では、第１のセグメントは、上記で定義される項目（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。好ましくは、第１のセグメントのアミノ酸配列は、上記で定義される項目（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｘ）のいずれか１つとして定義される。項目（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｘ）の定義は、アミノ酸配列が、示される数の置換、付加、挿入および／または欠失を除き、示される配列番号の示されるアミノ残基範囲のそれであることを意味する。
タンパク質が、所定の数または数値範囲のアミノ酸の置換、付加、挿入および／または欠失によって本願明細書において定義される場合、これらのアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失は組み合わされてもよいが、その所定の数または数値範囲は、全てのアミノ酸の置換、付加、挿入および欠失の合計を指す。アミノ酸の置換、付加、挿入および欠失のうち、アミノ酸の置換、付加および欠失が好ましい。用語「挿入」とは、参照配列のアミノ酸配列中への（すなわちＣ末端またはＮ末端への付加を除く）挿入を指す。用語「付加」は、参照配列のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端への付加を意味する。欠失は、参照配列の端末または内部のアミノ酸残基の欠失であり得る。用語「参照配列」は、本願明細書においては、本発明のタンパク質のアミノ酸配列が定義される配列表中のアミノ酸配列を指すものとして用いられる。例えば、項目（Ａ－ｉ）では、参照配列は配列番号１である。
項目（Ｂ）では、配列同一性のいずれか１つは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％であり得る。項目（Ｃ）では、前記アミノ酸の置換、付加、挿入および／または欠失の数は、前記アミノ酸配列のいずれか１つと比較し、１～３０、好ましくは１～２０、より好ましくは１～１０、最も好ましくは１～５である。
したがって、各項目（Ｂ）および（Ｃ）の以下の項目（ｉ）～（ｉｘ）は、本発明のタンパク質の第１のセグメントの好ましい実施形態を定義する。本発明のタンパク質の第１のセグメントは、好ましくは以下のアミノ酸配列のいずれか：
（Ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、または、
（Ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、アミノ酸配列、
あるいは、
（Ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸１～１２８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１～１２７のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸１～１２３のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸１～１１８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸１～１７０のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸１～１７２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸１～２５５のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸１～２８８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または、
（Ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸１～２３６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、アミノ酸配列。
他の実施形態では、本発明のタンパク質の第１のセグメントのアミノ酸配列は、好ましくは以下を有する：
（Ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、または、
（Ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
あるいは、
（Ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、または、
（Ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失。
本発明のタンパク質の第２のセグメント
本発明のタンパク質（クレビシン）は、第１および第２のセグメントの両方を有するため、該タンパク質は、その第１および第２のセグメントの両方によって定義され得る。したがって、該タンパク質は、上記の第１のセグメントのいずれか１つと、本明細書で定義される第２のセグメントとの組み合わせによって定義され得る。
本発明のタンパク質の第２のセグメントは、クレブシエラに対するその殺菌または静菌活性をタンパク質に提供する。第２のセグメントは、リピドＩＩの切断活性、または細菌細胞膜における孔形成能を有するのが好ましい。かかる活性は、他の静菌性または殺菌性の細菌タンパク質（例えば大腸菌のコリシン）から公知である。
第２のセグメントは、上記で定義される項目（Ｄ－ｉ）～（Ｄ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。好ましくは、第１のセグメントのアミノ酸配列は、上記で定義される項目（Ｄ－ｉ）～（Ｄ－ｉｘ）のアミノ酸配列である。第１のセグメントの定義が第２のセグメントのそれと組み合わされる場合、好ましくは、参照配列として同じ配列番号に基づいて定義される第１および第２のセグメントが組み合わされる。例えば、項目（Ａ－ｉｉ）に基づいた第１のセグメントと、項目（Ｄ－ｉｉ）に基づいた第２のセグメントとを有することによって、タンパク質を定義し得る。
しかしながら、本発明は、本発明者らによって同定された具体的なクレビシンの第２のセグメントを有するクレビシンに限定されない。項目（Ｄ－ｉ）～（Ｄ－ｉｘ）のアミノ酸配列の代わりに、第２のセグメントは、項目（Ｅ－ｉ）～（Ｅｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。好ましくは、第２のセグメントのアミノ酸配列は、項目（Ｅ－ｉ）～（Ｅｉｘ）のいずれか１つのそれである。
別の実施形態では、第２のセグメントは、上記で定義される項目（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。好ましくは、第１のセグメントのアミノ酸配列は、上記で定義される項目（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列である。
各項目（Ｅ）および（Ｆ）の以下の項目（ｉ）～（ｉｘ）は、好ましい第２のセグメントを定義する。一実施形態では、本発明のタンパク質の第２のセグメントは、好ましくは以下のアミノ酸配列：
（Ｅ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
（Ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、または、
（Ｅ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、
あるいは、
（Ｆ－ｉ）配列番号１のアミノ酸１２９～２７８のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１２８～２７６のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸１２４～２７２のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸１１９～２６６のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖ）配列番号５のアミノ酸１７１～３７７のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸１７３～３７９のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸２５６～４５２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
（Ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２８９～４６６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または、
（Ｆ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸２３７～４１４のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、アミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、本発明のタンパク質の第２のセグメントのアミノ酸配列は、好ましくは以下を有する：
（Ｅ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（Ｅ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４からのセグメントに対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
あるいは、
（Ｆ－ｉ）配列番号１のアミノ酸１２９～２７８のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１２８～２７６のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸１２４～２７２のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸１１９～２６６のアミノ酸配列と比較して、１～２０個、好ましくは１～１５個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖ）配列番号５のアミノ酸１７１～３７７のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸１７３～３７９のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸２５６～４５２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸２８９～４６６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失、
（Ｆ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸２３７～４１４のアミノ酸配列と比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失。
本発明において、前述のいずれかの第１のセグメントを、いずれかの第２のセグメントと組み合わせて、本発明のタンパク質とし得る。一実施形態では、本発明のタンパク質は、第１のセグメントが項目（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に属するか否か、および第２のセグメントが項目（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に属するか否かにかかわりなく、項目（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つの第１のセグメントと、項目（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つの第２のセグメントとを含む。しかしながら、一実施形態では、本発明のタンパク質は、項目（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｖ）のいずれか１つの第１のセグメントと、項目（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｖ）のいずれか１つの第２のセグメントとを含む。
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、第１のセグメントが項目（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に属するか否か、および第２のセグメントが項目（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に属するか否かにかかわりなく、項目（ｖ）～（ｉｘ）のいずれか１つの第１のセグメントと、項目（ｖ）～（ｉｘ）のいずれか１つの第２のセグメントとを含む。しかしながら、一実施形態では、本発明のタンパク質は、項目（Ｃ－ｖ）～（Ｃ－ｉｘ）のいずれか１つの第１のセグメントと、項目（Ｆ－ｖ）～（Ｆ－ｉｘ）のいずれか１つの第２のセグメントとを含む。
他の実施形態は、以下の通りである：
一実施形態では、本発明のタンパク質は、最も広義で好ましい実施形態において、項目（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｉｖ）、（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｖ）、または（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｖ）のいずれかのアミノ酸を含むかまたはそれからなる第１のセグメントと、項目（Ｄ－ｉ）～（Ｄ－ｉｖ）、（Ｅ－ｉ）～（Ｅｉｖ）、または、（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｖ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる第２のセグメントとを有し得る。好ましくは、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｉｉｉ）、（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｉｉ）、または（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｉｉ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、第２のセグメントは、（Ｄ－ｉ）～（Ｄ－ｉｉｉ）、（Ｅ－ｉ）～（Ｅｉｉｉ）、または（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｉｉ）のアミノのいずれか１つを含む。より好ましくは、第１のセグメントは、（Ａ－ｉｉ）、（Ｂ－ｉｉ）または（Ｃ－ｉｉ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のセグメントは、（Ｄ－ｉｉ）、（Ｅ－ｉｉ）または（Ｆ－ｉｉ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、第１のセグメントは、（Ａ－ｉｉ）のアミノ酸配列を含み、第２のセグメントは、（Ｄ－ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖ）～（Ａ－ｉｘ）、（Ｂ－ｖ）～（Ｂ－ｉｘ）、または（Ｃ－ｖ）～（Ｃ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のセグメントは、（Ｄ－ｖ）～（Ｄ－ｉｘ）、（Ｅ－ｖ）～（Ｅｉｘ）、または（Ｆ－ｖ）～（Ｆ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖ）、（Ａ－ｖｉ）、（Ｂ－ｖ）、（Ｂ－ｖｉ）、（Ｃ－ｖ）および（Ｃ－ｖｉ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のセグメントは、項目（Ｄ－ｖ）、（Ｄ－ｖｉ）、（Ｅ－ｖ）、（Ｅｖｉ）、（Ｆ－ｖ）および（Ｆ－ｖｉ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態では、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖ）または（Ａ－ｖｉ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のセグメントは、項目（Ｄ－ｖ）または（Ｄ－ｖｉ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。別の好ましい実施形態では、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖｉｉ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のセグメントは、項目（Ｄ－ｖｉｉ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
さらなる代替的な実施形態では、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖｉｉｉ）、（Ａ－ｉｘ）、（Ｂ－ｖｉｉｉ）、（Ｂ－ｉｘ）、（Ｃ－ｖｉｉｉ）または（Ｃ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、第２のセグメントは、項目（Ｄ－ｖｉｉｉ）、（Ｄ－ｉｘ）、（Ｅｖｉｉｉ）、（Ｅｉｘ）、（Ｆ－ｖｉｉｉ）または（Ｆ－ｉｘ）のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。好ましくは、第１のセグメントは、項目（Ａ－ｖｉｉｉ）または（Ａ－ｉｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のセグメントは、項目（Ｄ－ｖｉｉｉ）または（Ｄ－ｉｘ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
本発明のタンパク質のさらなる好ましい実施形態は、上記の項目（ａ－ｉ）～（ａ－ｉｘ）、（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）、そして、（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）において定義した通りである。項目（ｂ）では、「配列番号Ｚのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列」（Ｚは配列番号の番号を表す）は、該アミノ酸配列が、少なくとも配列番号Ｚの配列と同数のアミノ酸残基を有し、少なくとも配列番号Ｚの全長にわたり示される配列同一性を有することを意味する。これは、項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）全てに、および本願明細書において定義される対応する配列同一性に適用する。項目（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）の定義は、該アミノ酸配列が、示される数の置換、付加、挿入または欠失を除き、示される配列番号の全てのアミノ配列のそれであることを意味する。
あるいは、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りに定義され得る：
（ｂ’）一実施形態では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、
（ｂ’－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、または、
（ｂ’－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％同一であり、
（ｂ’’）一実施形態では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、
（ｂ’’－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、
（ｂ’’－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、または、
（ｂ’’－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する。
本発明のタンパク質の細胞毒性活性
本発明のクレビシンは、クレブシエラ属細菌（例えばＫ．ニューモニエ、Ｋ．グラニュロマティス、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．エロゲネス、Ｋ．クアシニューモニエおよびＫ．バリイコラ）に対する細胞毒性効果を発揮できる。好ましくは、本発明のクレビシンは、Ｋ．ニューモニエおよびＫ．オキシトカに対して活性である。Ｋ．ニューモニエが最も好ましい。細胞毒性効果は、静菌性または殺菌性効果であり得る。該タンパク質が細胞毒性効果を有するか否かは、例えば例４のアッセイを使用して、実験的に試験することができる。一実施形態では、前記クレブシエラは、カルバペネム耐性などの抗生物質耐性を有し、前記タンパク質は、項目（ｉ）～（ｉｖ）、（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質であり、好ましくは上で定義される実施形態（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかである。項目（ｉ）～（ｉｖ）、（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質は、参照配列として配列番号１～４、７または８を使用して定義されるタンパク質である。
本発明のタンパク質は、クレブシエラ細胞の細胞膜における孔形成活性を有し得る。本発明では、配列番号５～９の項目（ａ－ｖ）～（ａ－ｉｘ）のタンパク質、ならびに、それぞれの項目（ｂ－ｖ）～（ｂ－ｉｘ）および（ｃ－ｖ）～（ｃ－ｉｘ）の誘導体は、孔形成性活性を有する。孔形成性活性はこれらのタンパク質の第２のアミノ酸配列セグメントの存在によることが想定される。
本発明の別のクラスのタンパク質は、大腸菌コリシンＭの活性からの類推から、リピドＩＩの切断活性を有すると想定される。本発明者らは、このクラスのタンパク質が、大腸菌コリシンＭにおいて観察されるように、ペプチドグリカンリピドＩおよびリピドＩＩ中間体（内膜のペリプラズム側にある）のリピド部分とピロホスホリル基との間の結合を特異的に切断するペプチドグリカナーゼ活性を有すると想定する（Gross and Braun, Mol. Gen. Genet. 251 (1996) 388-396; Barreteau et al., Microbial Drug Resistance 18 (2012), 222-229）。放出されたＣ５５ポリイソプレノールは、細胞膜を通じたＭｕｒＮＡｃ－ペンタペプチド－ＧｌｃＮＡｃの転位をもはやさせない。それらのクレビシンはしたがって、それらが外側の細胞壁を通じてペリプラズムに取り込まれた後で、クレブシエラ細胞に対して毒性を発揮すると想定される。本発明のタンパク質のこの特性は、El Ghachi et al., J. Biol. Chem. 281 (2006) 22761-22772に記載されるような、基質としてリピドＩを使用するコリシンＭ活性の標準的なアッセイに従い解析し得る。本発明によれば、配列番号１～４の項目（ａ－ｉ）～（ａ－ｉｖ）のタンパク質、ならびにそれぞれの項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｖ）および（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｖ）の誘導体は、ペプチドグリカナーゼまたはリピドＩＩの切断活性を有する。これらのタンパク質の第２のアミノ酸配列セグメントの存在によるこの活性が想定される。
本発明のタンパク質の細胞毒性活性は、好ましくは、前記タンパク質および配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質が、前記タンパク質および比較タンパク質の各溶液２０μＬを、アガープレート上の感受性クレブシエラ・ニューモニエ・亜種シミリニューモニエ（ｓｉｍｉｌｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の菌叢上にスポットし、その後該アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、該感受性クレブシエラ株の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、該溶液中の前記タンパク質の濃度は、比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である。該溶液は、水溶液である。この試験は、参照例１にて説明されるように実施することができる。参照例１に記載されるように、タンパク質の濃度は、体積当たりの重量として測定される。
一実施形態では、本発明のタンパク質は、上記の項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）または（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）のいずれか１つのものであり、前記タンパク質ならびに前記項目（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｘ）または（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｘ）の配列番号の参照配列のアミノ酸配列の比較タンパク質が、前記タンパク質および比較タンパク質の各溶液２０μＬを、アガープレート上の感受性クレブシエラ・ニューモニエ・亜種シミリニューモニエ ＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の菌叢上にスポットし、その後該アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、該感受性クレブシエラ株の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような細胞毒性活性を有し、該溶液中の前記タンパク質の濃度は、比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である。該溶液は、水溶液である。この試験は、参照例１にて説明されるように実施することができる。参照例１にも記載されるように、タンパク質の濃度は、体積当たりの重量として測定される。
本発明のタンパク質のコンセンサス配列
本発明のタンパク質は、配列番号２２～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列中、各Ｘは２０種の標準アミノ酸残基のいずれか１つまたはアミノ酸残基の欠如を表し、ＪはＬ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）を表し、好ましくは、Ｘは２０種の標準アミノ酸残基のいずれか１つであり、ＪはＬ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）のいずれかを表す。２０種の標準アミノ酸残基は、以下の通りである：Ａ（アラニン）、Ｃ（システイン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、Ｑ（グルタミン）、Ｒ（アルギニン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）、Ｖ（バリン）、Ｗ（トリプトファン）およびＹ（チロシン）。
好ましい実施形態では、前記タンパク質の細胞毒性活性は、好ましくは、前記タンパク質および配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質が、前記タンパク質および比較タンパク質の各溶液２０μＬを、アガープレート上の感受性クレブシエラ・ニューモニエ・亜種シミリニューモニエ ＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の菌叢上にスポットし、その後該アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、該感受性クレブシエラ株の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、該溶液中の前記タンパク質の濃度は、比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である。細胞毒性活性のアッセイは、参照例１にて説明されるように行われる。
クレブシエラに対する類似の作用様式を示す本発明のタンパク質では、好ましくは第１および第２セグメントのアミノ酸配列が、保全された位置関係および／またはアミノ酸配列ストレッチを有する。保全された位置関係および／またはアミノ酸配列ストレッチには、本発明のタンパク質の機能にとり重要となる可能性が高まる。第１アミノ酸配列セグメントにおいて、その保全された位置関係またはストレッチは通常、受容体への結合および転位の機能に関連する。第２アミノ酸配列セグメントにおいて、その保存された位置関係またはストレッチは通常、クレブシエラに対する細胞毒性に関連する。クレビシン ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭ、ＫｐｎｅＭおよびＫａｅｒＭは、配列番号２２のコンセンサス配列を共有する。クレビシン ＫａｅｒＡおよびＫｐｎｅＡは、配列番号２３のコンセンサス配列を共有する。クレビシン ＫｐｎｅＩａおよびＫｖａｒＩａは、配列番号２４のコンセンサス配列を共有する。配列番号２２、２３および２４の各Ｘは、２０の標準アミノ酸残基のいずれか１つ、またはこの位置のアミノ酸残基の不存在を表し、ＪはＬ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）を表す。
具体的には、リピドＩＩ切断活性を有するクレビシン（例えば、配列番号１～４に関して定義されるそれら）は、好ましくは、以下のアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチに対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチを有し：１Ｍ、２Ｓ／Ｔ、３Ｄ／Ｅ、４Ｔ、５Ｌ／Ｍ、７Ｖ、９Ａ、２２Ｇ、２４Ｇ、５０Ｓ、９１Ｔ、９７Ｐ、１３２Ｐ、１３８Ｈ、１３９Ｙ、１４２Ｇ、１４４Ｇ、１５５Ｇ、１５６Ｌ、１７６Ｇ、１８４Ｆ、１９９Ｌ、２００Ｇ、２０２Ｉ、２０３Ｔ、２０６ＴＥＧＴＬ２１０（配列番号２５）、２１２Ｉ、２１６Ｇ、２１８Ｗ、２２０ＹＮＧＶ２２３（配列番号２６）、２２５ＲＡＦＮＤＴＹＤ２３２（配列番号２７）、２３４Ｎ、２３９Ｒ、２４３Ａ、２４７Ｔ、２５５Ｇ、２５８Ｙ、２６０Ｉ、２６２Ｐ、２６２Ｇ、２７１Ｓ、２７２Ｇ；
配列中、アミノ酸残基の１文字コードの前の数は、配列番号２２における位置を示し、アミノ酸残基の１文字コードの後ろの数は、２個以上のアミノ酸残基のストレッチの場合、その前のアミノ酸残基の配列番号２２における位置を示す。「／」によって分離される２個以上のアミノ酸残基は、示される残基のいずれか１つが、配列番号２２の示される位置に対応する位置に存在することを意味する。「・・・に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチ」という表現は、所定のタンパク質の位置が、配列番号２２の位置と異なってもよいことを意味する。しかしながら、その対応する位置は、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１～４および２２（図１０Ａに示すように）のそれらに整列させ、Ｎ末端の最初のアミノ酸配列から始まるタンパク質のアミノ酸配列の残基をカウントして対応する位置を決定することにより、決定することができる。
配列番号５および６に関して定義される、孔形成活性を有するクレビシンは、好ましくは、以下のアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチに対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチを有し：１Ｍ、４Ｅ、９Ｖ、１１Ｇ、１３Ｎ、１８Ｖ、２０ＷＧＧ２２、２５ＧＮＧＮＮＧＧＡＧ３３（配列番号２８）、３６Ｇ、３９Ｇ、４５Ｇ、４７Ｔ、５２Ｌ、６５Ｐ、６７Ｎ、６８Ｐ、７２ＧＡＰＷ７５（配列番号２９）、８０Ｓ、８２Ｋ、８４Ａ、９０ＡＮ９１、９４ＫＰ９５、９７ＫＦＫＡＮＩＱＮ１０４（配列番号３０）、１０６Ｋ、１１１ＧＳＬ１１３、１１５ＳＰ１１６、１８８Ｖ、１２０ＫＳ１２１、１２３ＳＳＧＤＶＤＴＹ１３０（配列番号３１）、１３２ＶＳＦＧＫＥＫＹＮＶ１４１（配列番号３２）、１４３ＹＮＲＫＫＤＳＦＴ１５１（配列番号３３）、１５４ＹＶＤＧＧＡ１５９（配列番号３４）、１６１ＫＰＥＨＳＭＫＤＱＡＩＡＶＶ１７４（配列番号３５）、１７６ＬＹＬＬＮＥ１８１（配列番号３６）、１８６ＶＩ１８７、１８９Ｔ、１９３ＩＩ１９４、１９７ＳＧ１９８、２００Ｔ、２０２ＳＧＫＬＧ２０６（配列番号３７）、２０８ＫＹ２０９、２１２ＬＡ２１３、２１７Ａ、２２０Ｉ、２２２ＮＦＱＧＫＫ２２７（配列番号３８）、２２９ＲＳＦ２３１、２３３ＤＡＭ２３５、２３７Ｓ、２４４ＮＰ２４５、２４７ＭＫＬ２４９、２５１ＱＡＤＫ２５４（配列番号３９）、２５９ＮＡＬ２６１、２６３Ｑ、２６６ＬＳ２６７、２６９ＬＡＤＲＦＫＧＬ２７７（配列番号４０）、２７９ＡＦＴＷ２８２（配列番号４１）、２８４ＤＲＬＬＫＡ２８９（配列番号４２）、２９１ＫＩ２９２、２９４ＤＧＶＶＴＧＶＴＴＧ３０３（配列番号４３）、３０５ＷＱ３０６、３０８ＬＡ３０９、３１１ＥＶＥＡＭＹＬＳＧＶＡＧ３２２（配列番号４４）、３２４ＶＡＬＧＩ３２８（配列番号４５）、３３０Ｔ、３３２ＭＩＳ３３４、３３７Ａ、３４１Ｓ、３４３Ｐ、３４６ＡＶ、３４９ＡＬＴＶ３５２（配列番号４６）、３５４ＡＶＩＧＩ３５８（配列番号４７）、３６０Ｉ、３６２ＴＳＹＩ３６５（配列番号４８）、３６７ＡＤ３６８、３７０ＡＫＡＬＮＮＡＶ３７７（配列番号４９）、３８０ＬＦＫ３８２；
配列中、アミノ酸残基の１文字コードの前の数は、配列番号２３における位置を示し、アミノ酸残基の１文字コードの後ろの数は、２個以上のアミノ酸残基のストレッチの場合、その前のアミノ酸残基の配列番号２３における位置を示す。「／」によって分離される２個以上のアミノ酸残基は、示される残基のいずれか１つが、配列番号２３の示される位置に対応する位置に存在することを意味する。「・・・に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチ」という表現は、所定のタンパク質の位置が、配列番号２３の位置と異なってもよいことを意味する。しかしながら、その対応する位置は、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５～６および２３（図１０Ｂに示すように）のそれらに整列させ、Ｎ末端の最初のアミノ酸配列から始まるタンパク質のアミノ酸配列の残基をカウントして対応する位置を決定することにより、決定することができる。配列番号２３は、本明細書の最後に示す通りである。
配列番号８および９に関して定義される、孔形成活性を有するクレビシンは、好ましくは、以下のアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチに対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチを有し：１ＭＰＧＦＮＹＧＧＫＧＤＧＴＮＷＳＳＥＲＧＴＧＰＥＰＧＧＧＳＲＧＮＧＧＤＲＤＮＳＲＧＧＡＧＮＲＧＮＷＡＧＳＧＰＬＳＡＡＬＩＮＤＳＩＡＥＡＬＥＫＱＬＰＲＮＴＶＥＡＴＳＴＰＡＹＫＫＭＲＡＡＦＤＡＬＰＬＤＫＱＰＥＡＲＡＱＩＴＫＡＷＱＳＡＨＤＡＭＰＤ１２０（配列番号５０）、１２１Ｋ／Ｒ、１２２ＴＴＴＴＥＮＶＧＧＧＫＮＧＨＮＶＴＲＳＴＰＮＷＬＫＥＫＭＫＧＬＮＱＱＶＮＮＤＬＳＧＡＬＡＱＨＱＫＡＥＡＤＡＲＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫ１８５（配列番号５１）、２３８Ａ、２３９Ｅ／Ａ、２４０ＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡ２５４（配列番号５２）、２５５Ａ／Ｅ、２５６ＡＫＡＫＡＥＡ２６２（配列番号５３）、２６３Ｅ／Ａ、２６４ＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＤＡＶＫＤＡＶＫＦＴＡＤＦＹＫＥＶＦＳＶＹＧＥＫＡＥＱＬＡＮＬＬＡＴＱＡＫＧＫＮＩＲＮＩＤＤＡＬＫＡＹＥＫＨＫＴＮＩＮＫＫＩＮＡＱＤＲＡＡＩＡＫＡＬＥＳＶＤＶＫＥＡＡＫＮＦＡＫＦＳＫＧＬＧＹＶＧＰＴＭＤＶＶＤＬＶＬＥＬＲＫＡＩＫＥＤＮＷＲ４０５（配列番号５４）、４０６Ｓ／Ｔ、４０７ＦＦＶＫＩＥＡＩＡＩＳＦＧＡＴＱＬＡＡＬＡＦＡＳＬＬＧＡＰＶＧＬＬＧＹＡＬＩＭＡＧＩＧＡＬＶＳＤＤＶＶＤＡＡＮＫＩＩＧＩ４６６（配列番号５５）；
配列中、アミノ酸残基の１文字コードの前の数は、配列番号２４における位置を示し、アミノ酸残基の１文字コードの後ろの数は、２個以上のアミノ酸残基のストレッチの場合、その前のアミノ酸残基の配列番号２４における位置を示す。「／」によって分離される２個以上のアミノ酸残基は、示される残基のいずれか１つが、配列番号２４の示される位置に対応する位置に存在することを意味する。「・・・に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列ストレッチ」という表現は、所定のタンパク質の位置が、配列番号２４の位置と異なってもよいことを意味する。しかしながら、その対応する位置は、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８～９および２４（図１０Ｃに示すように）のそれらに整列させ、Ｎ末端の最初のアミノ酸配列から始まるタンパク質のアミノ酸配列の残基をカウントして対応する位置を決定することにより、決定することができる。
コンセンサス配列に関して上記した定義は、特許請求の範囲に記載の定義または前のセクションに記載の実施形態と組み合わせることができる。
より詳細には、保存された残基の定義を、上記の項目（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｉｖ）、（Ｃ－ｉ）～（Ｃ－ｉｖ）、（Ｅ－ｉ）～（Ｅｉｖ）、（Ｆ－ｉ）～（Ｆ－ｉｖ）、（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｖ）、および／または（ｃ－ｉ）～（ｃ－ｉｖ）のいずれかの定義と組み合わせて、変更すべきでないアミノ酸残基を定義してもよい。本発明のタンパク質を定義するために使用する具体的な参照配列に応じて、上記のアミノ酸の位置の表示は、それぞれの参照配列の対応する位置によって置き換えられる。参照配列の対応する位置は、例えば図１０Ａ～Ｃに示されるアラインメントから誘導することができる。
クレビシン組成物
本発明の組成物は、上記の通りの本発明の１種または複数のタンパク質（クレビシン）と、必要に応じて、例えば担体などの任意のさらなる成分とを含む。該組成物は、本明細書で定義される１種または複数の異なるタンパク質（クレビシン）を、例えば、本明細書で定義される２種、３種または４種の異なるタンパク質（クレビシン）を含み得る。「異なる」とは、該タンパク質が少なくとも１つのアミノ酸残基において異なることを意味する。該組成物は、上記の項目（ｉ）～（ｉｖ）の、または上記の項目（ｖ）から（ｉｘ）のいずれか１つによって表される同じクラスからの、本発明の２種、３種またはそれ以上のクレビシンを含み得る。好ましくは、該組成物は、異なるクラスからの、本発明の少なくとも２種のクレビシン、例えば、孔形成性タイプの少なくとも１種のクレビシンと、リピドＩＩ切断タイプの少なくとも１種のクレビシンとを含む。該組成物はさらに、例えば付随して病原性大腸菌（例えばＥＨＥＣ）を制御するための、例えば欧州特許出願公開第３０９７７８３号明細書に記載されるような、１種または複数の大腸菌コリシンまたはその誘導体を含み得る。
本発明はまた、本発明の１種または複数のタンパク質と、１種または複数の他の殺菌性または静菌性タンパク質とを含む組成物を提供する。かかる他の殺菌性または静菌性タンパク質は、大腸菌コリシンまたはサルモネラ属コリシン（サルモシン（ｓａｌｍｏｃｉｎｓ））であり得る。大腸菌コリシンは、従来技術において公知であり、特に欧州特許出願公開第３０９７７８３号明細書に記載されている。サルモシンは公知であり、国際公開第２０１８／１７２０６５号パンフレットに記載されている。
本発明のタンパク質は、植物またはその細胞における発現によって好ましくは産生されるため、該組成物は、植物材料またはその抽出物であってもよく、そこにおいて、植物材料は、該タンパク質を発現している植物（好ましくは該タンパク質を発現しているタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）または食用植物）由来の材料である。植物材料の抽出物は、前記植物材料に存在するかまたはそこで発現された本発明のタンパク質を含む水溶性タンパク質を含む水溶液であるか、またはかかる水溶液の乾燥物である。該抽出物は、例えばろ過または遠心分離によって該植物材料の水不溶性成分を除去したものが好ましい。該植物材料はホウレンソウ、フダンソウ（ｃｈａｒｄ）、ビート根、ニンジン、テンサイ、フダンソウ（leafy beet）、アマランス、タバコからなる群から選択される植物由来の材料であってもよく、および／または、前記植物材料は、１種または複数の葉、根、塊茎または種子であるか、または、前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕、磨砕もしくは粉砕物である。
該組成物または植物材料からの前記抽出物は、本発明のクレビシンを含む、固形物または液状組成物（例えば溶液または分散液）であり得る。液状組成物は、水性の、例えば水溶液であり得る。前記水性分散液または溶液中の前記タンパク質の濃度は、０．０００１～１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１～０．１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．００５～０．０５ｍｇ／ｍｌであり得る。クレブシエラに対して細胞毒性効果を発揮できる１つ以上のクレビシンが使用される場合、これらの濃度は、全てのかかるクレビシンの全濃度に関する。
該水溶液は、本発明の１種または複数のタンパク質とは別に、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、無機または有機の酸またはその塩であり得る。無機酸の例は、リン酸またはその塩である。有機酸の例は、ＨＥＰＥＳ、酢酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、ケイ皮酸、グリコール酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。好適な有機酸は、リンゴ酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。溶液のｐＨは、通常４～８、好ましくは５～８、より好ましくは６．０～７．５であり得る。組成物が適用される物体が肉製品である場合、溶液のｐＨは、通常４～８、好ましくは４．５～７、より好ましくは５．０～６．５、より好ましくは５．０～６．０であり得る。さらに、該溶液は、等張剤（例えばグリセリンまたは塩）を含み得る。用いられる好ましい塩は、塩化ナトリウムである。１種または複数のクレビシンを含む水溶液は、さらなる塩などの溶質を含む、例えば、５０～４００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１００～２００ｍＭのＮａＣｌを含む、緩衝された水溶液であり得る。該水溶液はさらに、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール、チオエタノールまたはグルタチオンなどのスルフヒドリル化合物、好ましくはＤＴＴを含み得る。水溶液のスルフヒドリル化合物の総濃度は、１～５０ｍＭ、好ましくは２～２０ｍＭ、より好ましくは４～１０ｍＭであり得る。
本発明の組成物が固形組成物である場合、それは例えば上記の抽出物または溶液の凍結乾燥によって得られた凍結乾燥後の固形組成物などの粉体であり得る。該粉体は、さらなる固形成分（例えば水溶液において前述したそれら）を含み得る。それは、使用前に、適切な液体（例えば水または緩衝液）によって再調製され得る。固形組成物は、固形組成物の再調製または溶解によって上記の濃度となるように、上記の緩衝剤、塩または他の成分を含み得る。
組成物の担体の例は、溶媒（例えば水または水性緩衝液（上記の通り））、塩、糖（例えば単糖および二糖）、糖アルコール、ならびに、他の担体（例えば医薬組成物において公知のもの）である。後者の例は、デンプン、セルロースおよび他のタンパク質（例えばアルブミン）である。糖の例は、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロースおよびマルトースである。
本発明の組成物は、本発明の１種または複数のクレビシンを、該組成物のタンパク質の全重量に対して、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも５０、さらにより好ましくは少なくとも７５質量％で含み得る。該組成物中のクレビシンの含量は、参照例１に従って、該組成物をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、得られたゲルを染色の後、ゲル上のバンドの強度を測定する分析を行うことにより測定され得る。それにより、クレビシンによるバンドの強度は、組成物の全タンパク質のバンドの強度の合計に対するものとして測定することができる。
一実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、本発明の１種または複数のタンパク質とは別に、大腸菌コリシンを任意に含み得る。それはまた、液体または固体であるかどうかに応じて、また使用目的に応じて、１種または複数の適切な薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む。該賦形剤または担体は、前述のそれらであってもよい。
医薬組成物としての本発明の組成物は、小腸または大腸への経口送達用に製剤され得る。したがって、本発明はまた、該タンパク質を胃の条件（例えば酸性ｐＨおよび／またはプロテアーゼ）から保護することができ、腸において該タンパク質を放出することができる、本発明のタンパク質または本発明の組成物を含む経口製剤を提供する。胃の条件から該タンパク質を保護し、腸において該タンパク質を放出する能力は、好ましくは哺乳動物の場合、好ましくはヒト対象の場合に関する。薬剤の腸への送達、または酸性の胃の条件もしくは胃のタンパク分解性条件による薬剤もしくは活性成分の分解を回避するための成分は、当業者に公知である。錠剤などの固形組成物または製剤は、胃の条件への耐性を有するが腸の中性条件では溶解するポリマーによって被覆され得る。被覆に適する市販品の例は、Ｅｖｏｎｉｋ社のＥｕｄｒａｇｉｔ（商標）Ｓ１００、またはＬｏｎｚａ社のｅｎＴＲｉｎｓｉｃ（商標）薬剤送達技術である。
別の実施形態では、医薬組成物としての本発明の組成物は、肺への送達のために調製され得る。したがって、本発明はまた、本発明のタンパク質または本発明の組成物を含む肺用製剤を提供する。タンパク質治療剤の肺への局所的送達に関する概要については、例えば、Bodier-Montagutelli et al., EXPERT OPINION ON DRUG DELIVERY 2018, VOL. 15, NO. 8, 729-736; doi.org/10.1080/17425247.2018.1503251を参照されたい。その製剤は、エアロゾール投与用の乾燥粉末、または噴霧療法のための溶液であり得る。
組成物の製剤の他の使用可能な実施形態は、下記の医療用途に関するセクションに記載の通りである。
物体に対する塗布
本発明は、クレブシエラによる物体の汚染を予防または低減する方法を提供し、該方法は、前記物体を、上記の１種または複数のタンパク質（クレビシン）または上記の組成物と接触させることを含む。該物体は、無生物の物体である。該物体は、いかなる非有機的な物体または有機的な物体（例えば食品）の表面でもあり得る。クレブシエラによる物体の汚染は、該物体に対する生きたクレブシエラ細胞の付着を意味する。クレブシエラによる汚染を低減することは、物体に付着している生きたクレブシエラ細胞の数を低減することを意味する。クレブシエラによる物体の汚染の測定は、一般的な技術常識の一部である。例えば、例において行われるような、ホモジナイズした食品の溶液または分散液の希釈プレーティング、または他の物体の洗浄液の希釈プレーティングを行い、次いで細菌コロニーのカウントを行うことにより実施し得る。好ましくは、該物体は食品または動物用餌料である。
本発明のタンパク質または組成物によって物体を処理するまたは接触させるために、広義には、上記のタンパク質の溶液または液体組成物を該物体に接触させる。例えば、前記物体を、本発明の組成物としての水溶液で噴霧するか、または該水溶液に浸漬させる。該物体は、少なくとも１０秒間、好ましくは少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間にわたり、該水溶液へ浸漬させ得る。液体組成物を該物体に接触させることにより、該物体の表面上への組成物の分散が助長される。十分に均一分布が達成され得る場合には、本発明による固形組成物を該物体に接触させることも可能である。
医療用途
本発明はまた、クレブシエラによる、特に前述のクレブシエラ種による、対象の感染症の処置または予防に使用するための、本発明のタンパク質、組成物または医薬組成物を提供する。本発明はまた、前記対象に１種または複数の本発明のタンパク質（クレビシン）または組成物を投与することを含む、対象のクレブシエラ（特に前述のクレブシエラ種）による感染の処置または予防方法を提供する。該対象は、ヒトまたは哺乳動物（例えば家畜）であり得る。ヒト対象が好ましい。処置される感染症は、抗生物質耐性を有するクレブシエラによる感染症であり得る。該耐性は、カルバペネムへの耐性または多剤耐性であり得る。
処置されるクレブシエラ感染症は、上記のクレブシエラ種のいずれかによるものであり得る。クレビシン ＫｐｎｅＭ（配列番号１）およびＫｖａｒＭ（配列番号２）、ならびに参照配列として配列番号１または配列番号２を使用して本願明細書において定義したタンパク質は、下記の例において示されるように、多様なクレブシエラ分離株に対するそれらの広範囲の活性を有するため、医療用途のための好適なタンパク質である。したがって、特にクレブシエラ・ニューモニエなどのあらゆるクレブシエラによる感染の処置のために（ならびに、汚染の予防または低減のために、上記参照）、これらのクレビシンが好ましくは使用される。
処置されるクレブシエラによる感染症は、尿路、下気道、胆管、外科手術創傷などの感染症、または肺炎、菌血症、血栓静脈炎、胆嚢炎、下痢、上気道感染症、骨髄炎および髄膜炎などの症候群（臨床症候群）であり得、好ましくは、肺炎、菌血症、血栓静脈炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、下痢、上気道感染症および創傷感染症である。
広義には、上記のクレビシンおよび任意にさらなる成分を含む液体または固形状の医薬組成物は、対象への投与のために調製される。液体組成物は、上記の通りの水溶液であり得る。固形組成物は、例えば凍結乾燥させた形態の、少なくとも１つのクレビシンを含む粉末であり得、または、かかる粉末から得られた錠剤もしくはかかる粉末を充填したカプセルであり得る。
タンパク質または医薬組成物の投与経路は、処置しようとする疾患に応じて異なる。下痢および上気道感染症の処置の場合、例えば錠剤または溶液の形態で、投与は経口的であり得る。下痢の処置の場合、医薬調製物は、胃内での酸性溶媒による攻撃を受けることなく、胃を通過できるものであり得る。クレビシンはその後で、腸内において医薬組成物から放出されなければならない。かかる製剤は、従来技術において公知である。例は、胃の酸性溶媒に対する耐性を示す錠剤およびカプセルである。例えば発現されたクレビシンを含んでいる大腸菌または植物材料などの生物学的材料を、患者に経口投与することもさらに可能である。
肺炎の処置の場合、例えば、対象がクレブシエラ・ニューモニエによる肺の感染症に罹患する場合、製剤は、肺に対するエアロゾールまたは粉末として対象に投与され得る。肺内投与用のタンパク質を調製する方法は公知であり、例えば、吸入用の組換えＤＮＡｓｅＩまたはドルナーゼ（Ｄｏｒｎａｓｅ）について、Witt DM, Anderson L. Dornase alfa: a new option in the management of cystic fibrosis. Pharmacotherapy. 1996 Jan-Feb;16(1):40-8を、Ｄｎａｓｅ Ｉの乾燥粉末製剤について、米国特許出願公開第２０１５／００２４０５０号を参照されたい。Depreter et al. 2013、Bodier-Montagutelli et al. 2018のレビューも参照されたい。
創傷感染の処置の場合、タンパク質または医薬組成物は、例えば水溶液として、局所的に投与され得る。尿路感染症（ＵＴＩ）の場合、タンパク質または医薬組成物は、カテーテルを用い、水溶液の形態で投与され得る。クレブシエラによる胆嚢炎または胆管感染症の処置の場合、タンパク質または医薬組成物は、カテーテルを用い、水溶液の形態で投与され得る。
クレビシンは、ヒト成人に対して１日当たり１ｍｇ～１０００ｍｇの量で、好ましくはヒト患者に対して１日当たり１０ｍｇ～２５０ｍｇで投与され得る。かかる量を、動物に投与してもよい。プロバイオティックな方法においては、患者に少なくとも１つのクレビシンを発現する遺伝子修飾された微生物を投与することによって、患者を処置し得る。該遺伝子修飾された微生物は、一般に乳製品の発酵において使用される、遺伝子修飾された非病原性の大腸菌または乳酸産生微生物であり得る。該乳酸産生微生物の例は、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ ）などのラクトバチルス属細菌、ならびにビフィドバクテリウム・ビフィダムまたはビフィドバクテリウム・ブレイブ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）などのビフィドバクテリウム属細菌である。他の投与経路は、クレブシエラへの感染を予防するための、患者の血流への注入による経路である。この目的のために、クレビシンを生理食塩水中に溶解させ、その溶液を滅菌し得る。
本発明のタンパク質の産生
本発明によるクレビシンまたはタンパク質は、標準的な発現系においてタンパク質を発現させる公知の方法によって産生され得る。クレビシンを産生させる場合、それをコードするヌクレオチド配列を、適切な宿主生物において発現させ得る。目的のタンパク質を産生および精製するために使用可能な方法は、先行技術に記載されており、いずれの種類の方法も用い得る。本技術分野において一般に公知である大腸菌発現系を、例えば使用し得る。真核細胞での発現系を用いる場合、１つまたは複数のイントロンをクレビシンのコーディング配列に挿入することで、クローニングのために使用する細菌性生物に対する毒性を予防し得る。
特に効率的な発現方法は、植物発現系であり、先行技術においても公知である。本発明によるクレビシンを発現させるために使用可能な植物発現系は、例に記載されている。植物に対する目的ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法は、クレビシンをコードするヌクレオチド配列を含む自己複製（ウイルス性）レプリコンの使用である。クレビシンのコーディング配列は、植物における、または発現用宿主として使用する具体的な植物における発現のためにコドン最適化され得る。植物ウイルス発現系は、国際公開第２０１２／０１９６６０号、第２００８／０２８６６１号、第２００６／００３０１８号、第２００５／０７１０９０号、第２００５／０４９８３９号、第２００６／０１２９０６号、第０２／１０１００６号、第２００７／１３７７８８号または第０２／０６８６６４号パンフレットなどの多くの刊行物に記載されており、またより多くの刊行物がこれらの文献において引用されている。核酸分子（例えばＤＮＡ分子）を、例えば一過性の発現のために、植物または植物の部分に導入するための各種の方法が公知である。アグロバクテリウムを用いて、例えばアグロインフィルトレーション、またはアグロバクテリウム懸濁液による噴霧によって、核酸分子（ベクター）または核酸構築物で植物をトランスフェクションし得る。参照のため、国際公開第２０１２／０１９６６０号、第２０１４／１８７５７１号または第２０１３／１４９７２６号パンフレットを参照されたい。該核酸分子は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
目的タンパク質としてのクレビシンの強力な発現が求められる実施形態では、クレビシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子または核酸構築物は、植物細胞において複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードし得る。複製のために、ウイルスベクターおよびレプリコンは、植物細胞に存在する核酸ポリメラーゼ（例えばレプリコンから発現されるウイルスポリメラーゼ）によって認識され得る複製開始点を含み得る。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」と称する）の場合、レプリコンは、ＤＮＡ構築物が植物細胞の核に導入された後、そこから、植物細胞において活性を有するプロモーターの制御下での転写によって形成され得る。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコンは、例えば国際公開第００／１７３６５号および第９９／２２００３号パンフレットにて説明されるように、ＤＮＡ構築物中のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位の間での組換えによって形成され得る。レプリコンがＤＮＡ構築物によってコードされる場合、ＲＮＡレプリコンが好ましい。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡレプリコン）の使用は、長年にわたって様々な文献に記載されてきた。いくつかの例は、以下の特許公報公開パンフレットである：国際公開第２００８／０２８６６１号、第２００７／１３７７８８号、第２００６／００３０１８号、第２００５／０７１０９０号、第２００５／０４９８３９号、第０２／０９７０８０号、第０２／０８８３６９号、第０２／０６８６６４号。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルス（ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ）に基づくそれらである。本発明の場合、植物ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクターまたはレプリコン、特に、（＋）センス一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくそれらが、好ましくは使用され得る。したがって、ウイルスレプリコンは、（＋）センス一本鎖ＲＮＡレプリコンであり得る。かかるウイルスベクターの例は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびポテックスウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）Ｘ（ＰＶＸ）に基づくそれらである。「基づく」とは、ウイルスベクターが、複製系（例えばこれらのウイルスの複製に関与するレプリカーゼおよび／または他のタンパク質）を使用することを意味する。ポテックスウイルスに基づくウイルスベクターおよび発現系は、欧州特許第２０６１８９０号明細書または国際公開第２００８／０２８６６１号パンフレットに記載されている。引例から公知のように、ＲＮＡレプリコン、例えば（＋）センス一本鎖ＲＮＡレプリコンは、ヌクレオチド配列の上流に位置するサブゲノムプロモーターの制御下でヌクレオチド配列を発現し得る。同じＲＮＡレプリコンにコードされ得るウイルスレプリカーゼの作用で、サブゲノミックＲＮＡは、植物細胞において複製され得、（ＲＮＡ）ヌクレオチド配列を含むことによって、タンパク質がサブゲノミックＲＮＡから翻訳され得る。
クレビシンは、多細胞植物またはその部分、特に高等植物またはその部分において発現され得る。単子葉植物および双子葉植物（作物）が使用され得る。目的タンパク質を発現するために使用可能な一般的な植物としては、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ホウレンソウ、ナノハナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アブラナ、キバナスズシロ、マスタード、イチゴ、ヒナギク（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、レタス、ヒマワリ、キュウリ、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、エシャロット、タマネギ、ラディッシュ、レタス、サヤエンドウ、カリフラワー、ブロッコリー、ゴボウ、カブ、トマト、ナス、スカッシュ、スイカ、プリンスメロンおよびメロンが挙げられる。好適な植物は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビート根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカムおよびベンサミアナタバコである。食用植物における発現を使用することで、植物またはそれから製造される食品の、クレブシエラによる汚染を予防し得る。一実施形態では、通常ヒトまたは動物の食物連鎖に入らない植物（例えばニコチニアの種（例えばＮ．タバカムおよびＮ．ベンサミアナ））が使用される。
一般に、目的タンパク質としてのクレビシンは、植物または植物部分の細胞のサイトゾルにおいて発現される。この場合において、特定の区画に目的タンパク質を輸送するシグナルペプチドは、該タンパク質に付加されない。あるいは、目的タンパク質を、植物のクロロプラストにおいて発現させるかまたはそれを標的とすることができ、この後者の場合には、プラスチド輸送ペプチドまたはクロロプラスト標的ペプチドと一般に称されるＮ末端シグナルペプチドを、目的タンパク質としてのクレビシンのＮ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端に付加させる。
本発明は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。該核酸分子は、（ｉ）植物細胞において活性な転写プロモーター、および（ｉｉ）該プロモーターの制御下で植物細胞においてヌクレオチド配列を発現させるための本発明のタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含み得る。
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物を提供し、前記核酸分子または核酸構築物は、（ｉ）好ましくは植物細胞において活性な転写プロモーター、および（ｉｉ）前記プロモーターの制御下で、細胞において、好ましくは植物細胞において、ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物を提供し、ここで、前記核酸分子または核酸構築物は、細胞において、好ましくは植物細胞において前記ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むウイルス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）レプリコンであるか、またはそれをコードし、ここで、前記レプリコンは、サブゲノムプロモーターの制御下で、植物細胞において、または植物の細胞において前記ヌクレオチド配列を発現させるための前記サブゲノムプロモーターを含んでもよい。
本発明のタンパク質は、植物においてまたは植物細胞において好ましくは発現されるため、本発明はまた、本発明のタンパク質を含む植物、植物組織または植物細胞を提供する。本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列または核酸分子を含む植物、植物組織または植物細胞を提供する。該植物は、前述のいずれか１つであり得る。
本発明の組成物の産生
少なくとも１つのクレビシンを含む組成物を産生する方法において、最初のステップでは、植物（例えば食用植物）または植物の細胞においてクレビシンが発現される。次のステップでは、クレビシンを発現した植物から、発現されたクレビシンを含む植物材料が回収される。例えば植物材料は、葉、根、塊茎もしくは種子であってもよく、または、葉、根、塊茎もしくは種子の破砕、磨砕もしくは粉砕物であってもよい。ステップ（ｉｉｉ）では、水性緩衝液を使用して該植物材料からクレビシンが抽出される。ここで、植物材料をホモジナイズしてもよく、また不溶性物質を遠心分離またはろ過によって除去してもよい。クレビシンを含む可溶性成分を水性緩衝液中に抽出し、水性緩衝液中のクレビシン溶液を調製する。水性緩衝液は、無機もしくは有機酸またはその塩を含み得、また本発明の組成物としての水溶液に関して上記で定義したｐＨを有し得る。さらに、水性緩衝液は、本発明の組成物としての水溶液に関して上記した塩および／またはスルフヒドリル化合物を含み得る。比較的純度の高いクレビシン組成物が望ましい場合には、水性緩衝液中のクレビシン溶液を、公知のタンパク質精製法に従って不要な成分を除去することによってさらに精製し得る。
したがって、本発明は、本発明によるタンパク質を含む組成物を産生する方法であって、
（ｉ）上記の植物、好ましくは食用植物またはタバコ属において前記タンパク質を発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から発現されたタンパク質を含有する植物材料を回収するステップ、
（ｉｉｉ）水性緩衝液を使用して、前記タンパク質を前記植物材料から抽出して、前記タンパク質を含有する組成物を得るステップ、
任意に、前記組成物から望ましくない夾雑物を除去するステップ
を含む、方法を提供する。
クレビシンが植物において発現される場合、発現されたタンパク質を有する植物またはその組織を回収し、その組織ホモジナイズし得、また不溶性物質を遠心分離またはろ過によって除去し得る。比較的純度の高いクレビシンが望ましい場合、クレビシンは、例えば、他の宿主細胞由来タンパク質および植物代謝産物（例えばアルカロイドおよびポリフェノール）を除去できるクロマトグラフィー法など、一般に公知のタンパク質精製法によって、さらに精製され得る。精製されたクレビシン溶液は、濃縮および／または凍結乾燥し得る。
クレビシンを食用植物において発現させる場合、該食用植物からの粗タンパク質抽出物または半精製濃縮物を用いて、物体の（例えばクレブシエラによる食品の）汚染を予防または低減し得る。
（参照例１）
クレビシン毒性の評価のためのソフトアガーオーバーレイアッセイ
クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種であるシミリニューモニエＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の一晩培養液を、ＬＢ培地でＯＤ595＝１．０に等化し、５５℃の水浴で予熱された０．８％トップアガーで１００倍に希釈する。混合オーバーレイ成分は、固形アガー（１．５％ＬＢアガー）を含むプレートに注ぐ；そのプレートを数分間保持し、アガーを硬化させる。滅菌ワットマンディスク（直径６ｍｍ）をソフトアガー上に置き、１０μｇのクレビシンタンパク質を含むクレビシン溶液の２０μｌアリコートを、ディスクに塗布する。プレートを３７℃で１６時間インキュベートする。１６時間のインキュベーション後、クレビシン阻害ゾーンの直径を測定する。
クレビシン濃度の決定
クレビシンを含む液体サンプル中のクレビシン濃度は、クーマシー染色でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行すること、および市販のリーダーを使用してクレビシンによるバンドの強度を読み取ることによって、ならびにこの決定された強度と、既知の濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の段階希釈のクーマシー染色を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行して得られたバンドとを比較することによって決定される。検量線は、ＢＳＡの染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのバンドの強度から取得され得る。ＢＳＡの濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイ（例えば、ブラッドフォード試薬、Ｂ６９１６、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を使用して決定する。
（例１）
クレビシン発現ベクターの構築
ＫｐｎｅＡ（クレブシエラ・ニューモニエＳＡＶ７８２５５．１）、ＫａｅｒＡ（クレブシエラ・エロゲネスＷＰ＿０６３４１４８４１．１）、ＫｏｘｙＹ（クレブシエラ・オキシトカ ＷＰ＿０２４２７３７７８）、ＫｖａｒＩａ（クレブシエラ・バリイコラＫＤＬ８８４０９）、ＫｐｎｅＩａ（クレブシエラ・ニューモニエ ＢＡＳ３４６７５）、ＫｐｎｅＭ（クレブシエラ・ニューモニエ ＥＷＤ３５５９０．１）、ＫｐｎｅＭ２（クレブシエラ種ＷＰ＿０４７０６６２２０）、ＫｖａｒＭ（クレブシエラ・バリイコラ ＣＴＱ１７２２５．１）、ＫａｅｒＭ（クレブシエラ・エロゲネス ＷＰ＿０１５３６７３６０．１）は、宿主植物であるニコチアナ・ベンサミアナでの発現に最適化され、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（米国）によって合成され、ＢｓａＩ－ＢｓａＩ断片として、ＴＭＶベースのｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）ベクターをアセンブルしたｐＩＣＨ２９９１２に挿入された（Marillonnet et al.,2005）（図１）。得られたプラスミドを使用して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１を形質転換した。
（例２）
植物におけるクレビシンの発現
ニコチアナ・ベンサミアナ植物は、２５℃、湿度５０％の成長チャンバーで、１６時間の明期（１５００ルクス）および８時間の暗期の光周期で成長させた。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンスのトランスフェクションには４～６週齢の植物を使用した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、５０ｍｇＬ-1のリファンピシンおよび５０ｍｇＬ-1のカナマイシンを含むＬＢ培地で、３０℃で一晩培養した。アグロバクテリウムの一晩培養物を、３２２０ｇで５分間沈降させ、ＯＤ595が１．５の水道水に再懸濁した。
４～６週齢の植物の葉を、発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の１：１０００希釈物を含んだ針のない注射器を使用して、葉の背軸側に浸透させた。植物の葉を観察し、４～７ｄｐｉ（浸透後の日数（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））で収集した。
浸透した植物の葉の可溶性タンパク質の抽出物のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色分析によって、９つのクレビシン全てが植物で効率的に発現され、非常に強い補足バンドとしてゲルで検出されることが明らかになった（図２）。電気泳動で観察されるポリペプチドの重量は、予想される理論分子量にほぼ対応する（ＫｖａｒＩａ－４３．４ｋＤａ、ＫｐｎｅＩａ－４８．５ｋＤａ、ＫｐｎｅＡ－４０ｋＤａ、Ｋａｅｒ Ａ－３９ｋＤａ、ＫｏｘｙＹ－４８．７ｋＤａ、ＫｐｎｅＭ－３０．３ｋＤａ、ＫｐｎｅＭ２－２９．７ｋＤａ、ＫｖａｒＭ－２９．８ｋＤａおよびＫａｅｒＭ－２９ｋＤａ）。個々のクレビシンの発現レベルは２．７～４．４ｍｇ／ｇ ＦＷの範囲で変化し、２つのクレブシエラ・ニューモニエのＭ型クレビシンＫｐｎｅＭ２およびＫｐｎｅＭによって達成される最高の発現レベルである（表１）。
（例３）
植物バイオマスからのクレビシンの精製
ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｖａｒＩａ、ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、およびＫｖａｒＭバクテリオシンは、タンパク質クロマトグラフィーによって均一に精製された。非常に純粋なＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、およびＫｖａｒＭタンパク質は、単一段階の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の後に得られたが、最良の結果を得るために、陰イオンクロマトグラフィーによる２番目の精製段階が含まれていた。ＫｐｎｅＡおよびＫｖａｒＩａも、最初の段階として疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用し、ただし、その後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して精製した。ＫａｅｒＡは、イオン交換クロマトグラフィーの２つの段階、第１段階としての陽イオン交換カラムおよび第２段階としての陰イオン交換カラムによって精製した。
粗タンパク質抽出物は以下のように調製した。凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素を使用して乳鉢および乳棒を用いて微粉末に粉砕した。調製した粉末を、５ｍＬの緩衝液に対する１ｇの植物材料という比率で冷抽出緩衝液と混合した。その懸濁液を氷上で１５～２０分間維持した。３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離により細胞破片を除去し、その上清をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．２２μｍ）でろ過した。得られた溶液を、総可溶性タンパク質としてとり、２段階クロマトグラフィーによる精製に適用した。精製プロトコルの詳細は、タンパク質によって異なった。
ＫｐｎｅＭは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸＣ）の組み合わせを使用して精製した（図３Ａ、Ｂ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、冷抽出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）と、１ｇの植物材料対５ｍｌの緩衝液という比率で混合した。粗抽出物を２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによって、その上清をろ過した。硫酸アンモニウムを、０．７０Ｍまで添加し、溶液のｐＨを６に調整した。形成された沈殿物を、３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムにフェニルセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で前平衡化した。タンパク質溶液を、カラムにロードし、フェニルセファロース結合タンパク質画分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．２８Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で洗浄することにより溶出した。収集したタンパク質画分を、ダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に交換し、タンパク質溶液の容積が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が１０ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液を、ＱセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階にかけた。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、Ｑセファロース非結合タンパク質を流出画分に収集した。その後、ＫｐｎｅＭを凍結乾燥し、分析に適用した。
ＫｐｎｅＭ２は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸＣ）との組み合わせを使用して精製した（図３Ｃ、Ｄ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、冷抽出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）と、１ｇの植物材料対５ｍｌの緩衝液という比率で混合した。粗抽出物を２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇで、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによってその上清をろ過した。硫酸アンモニウムを０．７０Ｍまで添加し、溶液のｐＨを６に調整した。形成された沈殿物を、３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。その上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムにフェニルセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、フェニルセファロース結合タンパク質画分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．４２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で洗浄することにより溶出した。収集したタンパク質画分を、ダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に交換し、タンパク質溶液の容積が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が１０ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液をＱセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階に供した。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、Ｑセファロース非結合タンパク質をフロースルー画分に収集した。その後、ＫｐｎｅＭ２を凍結乾燥し、分析に適用した。
ＫｖａｒＭは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸＣ）との組み合わせを使用して精製した（図３Ｅ、Ｆ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、５ｍｌの緩衝液に対する１ｇの植物材料という比率で冷抽出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ５．０）と混合した。粗抽出物を２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによってその上清をろ過した。硫酸アンモニウムを０．９５Ｍまで添加し、溶液のｐＨを６に調整した。形成された沈殿物を、３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。その上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムにフェニルセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．９５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、フェニルセファロース結合タンパク質画分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．６２Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で洗浄することにより溶出した。収集したタンパク質画分をダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に入れ、タンパク質溶液の量が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が１０ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液をＱセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階に供した。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、Ｑセファロース非結合タンパク質を流出画分に収集した。その後、ＫｖａｒＭを凍結乾燥し、分析に適用した。
ＫｐｎｅＡは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸＣ）との組み合わせを使用して精製した（図３Ｇ、Ｈ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、冷抽出緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）と、１ｇの植物材料と５ｍｌの緩衝液という比率で混合した。粗抽出物を２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによってその上清をろ過した。硫酸アンモニウムを１．５０Ｍまで添加し、溶液のｐＨを６に調整した。形成された沈殿物を、３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。その上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムにフェニルセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、フェニルセファロース結合タンパク質画分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ４、０．９０Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で洗浄することにより溶出した。収集したタンパク質画分を、ダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に入れ、タンパク質溶液の量が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が９ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液を、ＳＰセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階にかけた。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．５）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、ＳＰセファロース結合タンパク質画分を、５００ｍＭのＮａＣｌを追加で含む冷洗浄緩衝液の直線勾配によって溶出した。その後、ＫｐｎｅＡを凍結乾燥し、分析に適用した。
ＫａｅｒＡは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸＣ）と陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸＣ）との組み合わせを使用して精製した（図３Ｉ、Ｊ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、冷抽出緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ５．０）と、１ｇの植物材料対５ｍｌの緩衝液という比率で混合した。粗抽出物を、２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによってその上清をろ過した。溶液のｐＨを４．５に調整し、形成された沈殿物を３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。その上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムにＳＰセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．５）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、ＳＰセファロース結合タンパク質画分を、５００ｍＭのＮａＣｌを追加で含む冷洗浄緩衝液の直線勾配によって溶出した。収集したタンパク質画分を、ダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に入れ、タンパク質溶液の量が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が８ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液をＱセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階にかけた。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ８．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、Ｑセファロース非結合タンパク質を流出画分に収集した。その後、ＫａｅｒＡを凍結乾燥し、分析に適用した。
ＫｖａｒＩａは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）と陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸＣ）との組み合わせを使用して精製した（図３Ｋ、Ｌ）。
凍結した葉組織のごく一部を、液体窒素中で冷やした乳鉢および乳棒を用いて均質化した。調製した粉末を、冷抽出緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）と、１ｇの植物材料と５ｍｌの緩衝液という比率で混合した。粗抽出物を２０～２５℃で１０～１５分間保持した。細胞破片は、３２２０ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によって除去した。ペレットを廃棄し、溶液をメンブレンフィルター（孔径５μｍおよび０．４５μｍ）に通すことによってその上清をろ過した。硫酸アンモニウムを１．３５Ｍまで添加し、溶液のｐＨを６に調整した。形成された沈殿物を、３２２０ｇ、４℃で５分間の遠心分離によって除去した。その上清を総可溶性タンパク質として取り、２段階で精製に適用した。
最初の精製段階で、クロマトグラフィーカラムに、フェニルセファロースＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を充填し、冷緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、１．３５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、フェニルセファロース結合タンパク質画分を、溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、０．８１Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０）で洗浄することにより溶出した。収集したタンパク質画分を、ダイアフィルトレーション濃縮器（１０ｋＤａ）に入れ、タンパク質溶液の量が８～１０倍減少するまで３２２０ｇで遠心分離した。濃縮物を、２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を含む緩衝液で一次容積まで希釈した。導電率が８ｍＳ／ｃｍ未満に低下するまで手順を繰り返し、タンパク質溶液をＳＰセファロースＦＦ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して最終精製段階にかけた。クロマトグラフィー媒体は、冷緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．５）で前平衡化した。タンパク質溶液をカラムにロードし、ＳＰセファロース結合タンパク質画分を、５００ｍＭのＮａＣｌを追加で含む冷洗浄緩衝液の直線勾配によって溶出した。その後、ＫｖａｒＩａを凍結乾燥し、分析に適用した。
精製タンパク質の濃度は、ブラッドフォードアッセイによって、または同じＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで実行されたバンド強度と既知のＢＳＡ量とを比較することによって評価された。クレビシン精製の結果は表１に要約されている。図４は、同じゲルにロードされた精製ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、およびＫｖａｒＩａクレビシンタンパク質を示している。キャピラリーゲル電気泳動で測定したところ、全ての精製クレビシンには０．２～３．７％の不純物しか含まれていない。精製後の個々のクレビシンの収量は、０．３４～１．１ｍｇ／ｇＦＷの範囲である。最大の発現レベルでクレビシンを精製すると、最大の最終収量およびまた最高品質の精製タンパク質も得られる。
Figure 2022536068000001
（例４）
ソフトアガーオーバーレイアッセイにおけるクレビシン活性試験
バクテリオシン発現粗植物抽出物の活性を、異なる種（クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・バリイコラ、およびクレブシエラ・エロゲネス）に属する１２のクレブシエラ菌株を用いたソフトアガーオーバーレイアッセイで試験した。クレブシエラ菌株は、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ－ドイツ微生物および細胞培養コレクションから購入し、表２に記載されている。
一晩のクレブシエラ培養物をＬＢ培地でＯＤ595＝１．０に等化し、５５℃の水浴で予熱した０．８％トップアガーで１００倍に希釈した。混合オーバーレイ成分を、固形アガー（１．５％ＬＢアガー）を含むプレートに注いだ；そのプレートを室温で数分間維持し、アガーを硬化させた。滅菌ワットマンディスク（直径６ｍｍ）をソフトアガー上に置き、それぞれの量のクレビシン（２０μｌの粗抽出物または１０μｇの精製クレビシン）をディスクに適用した。そのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、クレビシン阻害ゾーンの直径を観察した。このアッセイの結果は図５に要約されている。
試験されたバクテリオシンのうちの２つ、ＫｏｘｙＹおよびＫａｅｒＭは、いくつかの試験された菌株の菌叢で知覚できるが狭い阻害ゾーンを示し、ＫａｅｒＭはクレブシエラ・エロゲネスの菌叢でのみより大きなぼんやりした阻害ゾーンを形成した。活性が弱いせいで、これら２つのタンパク質は以降の実験には含まれていない。
Figure 2022536068000002
残りの７つのバクテリオシンは全て、試験したいくつかのクレブシエラ種および菌株の菌叢に大きな阻害ゾーンを形成した。試験した１２株全てが、１つだけでなく、いくつかのバクテリオシンによっても阻害された。残りの３つのｃｏｌＭ様タンパク質は、最大の活性スペクトルおよび同様の活性パターンを示し、１２の試験菌株のうち１１を標的とした。ただし、ＫｖａｒＭは、クレブシエラ・ニューモニエｃｏｌＭ様のバクテリオシン（ＫｐｎｅＭおよびＫｐｎｅＭ２）の両方よりも有意に大きな阻害ゾーンを形成した。２つのＣｏｌＡ様タンパク質ＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡも非常に類似した活性パターンを示したが、試験した菌株のいくつかではゾーンの直径が異なっていた。そして最後に、Ｃｏｌｌａ様タンパク質ＫｖａｒＩａおよびＫｐｎｅＩａの両方が非常に類似した活性パターンを示した（図５）。ＫｖａｒＩａおよびＫｐｎｅＩａを除いて、全てのバクテリオシンは５つの異なるクレブシエラ種全てに属する菌株に阻害ゾーンを形成した。２つのｃｏｌｌａ様タンパク質は、試験した４つのクレブシエラ・ニューモニエ株のいずれにもほとんど影響を与えなかった。
（例５）
臨床クレブシエラ分離株のパネルに対するクレビシン活性の評価
次に、６つの精製クレビシン全てをクレブシエラ菌株のより大きなパネルに対して試験した：全部で１００の臨床クレブシエラ分離株で、８９のクレブシエラ・ニューモニエおよび１１のクレブシエラ・オキシトカ菌株。アガーオーバーレイアッセイに使用される臨床クレブシエラ菌株は、リトアニア健康科学大学のカウナスクリニックで分離され、表３に記載されている。精製された凍結乾燥クレビシンを、脱イオン水に再懸濁し、クレブシエラをストリークしたＬＢプレートに置いた６ｍｍのワットマンディスク上に１０μｌの液滴（タンパク質１０μｇ）として塗布した。一晩のインキュベーション後、阻害ゾーンを測定した。
ＫｖａｒＭは、驚くほど幅広い活性を示した。菌株の８５％がこのクレビシンに感受性であった（図６、表３）。ＫｐｎｅＭはそれほど遅れておらず、一般にわずかに小さい阻害ゾーンで、試験された菌株の７４％を標的としている。ＫｖａｒＭおよびＫｐｎｅＭの活性スペクトルの特異性はほぼ重複していたが、ＫｖａｒＭは、ＫｐｎｅＭよりも多く１１株を標的とし、ＫｖａｒＭに免疫のある１株のみがＫｐｎｅＭに感受性であった（図６、表３）。対照的に、３番目のＭ型クレビシンＫｐｎｅＭ２は、かなり活性が低く、２０％の菌株のみを標的としていた。ｃｏｌＡ様のクレビシンＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡは両方とも、それぞれ３０％と２８％の菌株を標的とし、プロファイルは部分的に重複している。ＫａｅｒＡに免疫のある９株は、ＫｐｎｅＡに感受性があり、ＫｐｎｅＡに免疫のある７株はＫａｅｒＡに感受性があった。ＫｐｎｅＡはまた、一般的に、より大きな阻害ゾーンを形成した。ＫｖａｒＩａの活性スペクトルは最も狭く、全菌株の１０％のみを標的とした（クレブシエラ・オキシトカでは６およびクレブシエラ・ニューモニエで４）（図６、表３）。
Figure 2022536068000003
Figure 2022536068000004


Figure 2022536068000005


Figure 2022536068000006

（例６）
液体培養およびバイオフィルムにおけるクレブシエラ菌株に対するクレビシン活性の評価
本発明者らは、次に、液体培地および若い１日齢のバイオフィルムで、異なるクレブシエラ種の５つの代表例であるクレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・バリイコラ、およびクレブシエラ・エロゲネスでクレビシン活性のより詳細な分析を行った。
液体培地でのクレビシン活性を評価するために、一晩のクレブシエラ培養物を、鉄欠乏カザミノ酸（ＣＡＡ）培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で最大１．２ｍＬまでＯＤ595＝０．３に希釈した。凍結乾燥した精製クレビシンをＣＡＡ培地に再懸濁し、希釈した細菌懸濁液に加え、振とう（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で５．５～６．５時間インキュベートした。クレビシンの抗菌活性は、細菌試験培養物の細胞数を決定することによって評価された。１０、１０-1、１０-2、１０-3、１０-4、および１０-5の段階希釈を行い、ＬＢアガープレートにプレートし、３７℃で一晩インキュベートし、ＣＦＵを計算した。
バイオフィルムは、ある程度の変更を伴いMoskowitz et al.,(2004)およびPaskevicius et al.,(2017)に記載の通り増殖した。簡単に説明すると、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・バリイコラ、クレブシエラ・エロゲネス株をＬＢで一晩増殖させ、新鮮なＣＡＡ培地でＯＤ＝０．１に希釈した。１０μｌの細菌培養物を、９０μｌのＣＡＡ培地を含む９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク州、ロチェスター）のウェルに移した。バクテリアのバイオフィルムは、変性ポリスチレンマイクロタイターリッド（Ｎｕｎｃ ＴＳＰシステム）のペグをバイオフィルム増殖プレートに浸し、続いてサーモスタットで制御された３０℃または３７℃で２０時間インキュベートすることによって形成された。クレビシンで処理するために、ペグの蓋を滅菌水で３回リンスし、１ウェル当たり１００μｌのＣＡＡで希釈した５μｇ／ｍＬのクレビシンを含むマイクロタイタープレートに入れ、株次第で、３０℃または３７℃で５時間インキュベートした。クレビシンとのインキュベーション後、ペグの蓋を再び滅菌水で３回すすぎ、滅菌マイクロタイタープレートのＣＡＡに入れ、８１０ｇで３０分間遠心分離した。毎回同じように処理された６つのウェルをプールし、段階希釈を行い、ＣＦＵカウントのために細菌をＬＢプレートにプレートした。
液体培養アッセイのために、５μｇｍＬ-1の濃度で例４からの各群（ｃｏｌＭ様、ｃｏｌＡ様およびｃｏｌｌａ様）の１つの最高性能のクレビシンを試験した。Ｋｌｅｂｉｃｉｎ ＫｖａｒＭは、５つの菌株全ての増殖を阻害し、ＣＦＵ数をほぼ同じ程度に減少させた。クレブシエラ・ニューモニエＤＳＭ１６２３１では４桁、および残りの全てのクレビシンでは約３桁減少した（図７）。ＫｖａｒＩａは、４つの菌株を阻害し、３つのクレビシン全ての中で最も効率的であり、菌株に応じてＣＦＵ数を４～９桁減少させた（図７）（図５に示すように、クレブシエラ・ニューモニエＤＳＭ１６２３１はこのクレブシエラに非感受性である）。ＫｐｎｅＡは、３つの菌株のＣＦＵ数を４．６～５．７対数減少させた（図７）。
バイオフィルムアッセイには、液体培養アッセイと同じクレブシエラ菌株を使用した。本発明者らは、最初に、これら５つの菌株がバイオフィルムを形成する能力を試験した。クレブシエラ・ニューモニエ ＤＳＭ １６２３１を除いて、試験された菌株のうち４つは、試験された条件でバイオフィルムを形成したので、この菌株はさらなる実験には使用されなかった。残りの４つの染色全てのバイオフィルムを、それぞれ２つのクレビシンで２０時間処理し、これによって、液体培養アッセイで最良の結果が示された。バイオフィルムで得られた結果は、ＫｐｎｅＡおよびＫｖａｒＩａによってバイオフィルムが完全に根絶されたクレブシエラ・クアシニューモニエを除いて、液体培養アッセイで得られた結果を非常によく反映している（図８）。残りの全ての菌株について、クレビシン処理は、液体培養と同程度にバイオフィルムのＣＦＵ数を減少させ、Δｌｏｇのわずかな変動のみが達成された（図７、図８）。
（例７）
インビボでのクレビシン抗菌活性の評価
インビボでのクレブシエラ活性の最初の実証のために、非哺乳動物モデルであるガレリア・メロネラ（ハチノスツヅリガ）（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）幼虫でクレブシエラチャレンジアッセイを実施した。ハチノスツヅリガは、より大きい蜂蜜ガまたはハチノスガであり、メイガ科の蛾である。ハチノスツヅリガは、インビボの毒性学および病原性試験の便利なモデル生物であり、そのような実験での小型哺乳類の使用に取って代わることが示されている（Harding et al.2013;Paskevicius et al.,2017）。
本発明者らは、このアッセイでは、最も活性の高いクレビシンの１つとしてＫｖａｒＩａを、およびＫｖａｒＩａ感受性チャレンジ株としてクレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２を、選択した。ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）チャレンジ実験は、ある程度改変を伴う、Paskevicius et al.,(2017)に記載された通り行った。クレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ ２８２１２株の一晩培養物をＣＡＡ培地で増殖させ、０．８％ＮａＣｌで希釈して、１０μＬのクレブシエラ・クアシニューモニエ培養液で１．２～３．２×１０6ＣＦＵｍＬ-1の濃度を達成し、１０μＬのクレビシン溶液を、左および／または右の腹脚の近くで５齢ハチノスツヅリガ（ガレリア・メロネラ）幼虫（Ｌｉｖｅｆｏｏｄ ＵＫ）の血体腔に注入した。クレビシンは、クレブシエラ・クアシニューモニエの感染から２時間後に注射された。注射された幼虫は、３７℃で９ｃｍのペトリ皿で餌なしで最大３日間インキュベートした。毛虫は、頭への機械的刺激に反応して動きがなく、クリーム色から暗褐色／黒色への明確な色の変化をもたらした場合、死んでいると見なした。各処理ポイントごとに２０匹の幼虫を使用した。
まず、６８時間（実験期間）で全ての幼虫を殺すのに十分なチャレンジ株の最小致死量（ＭＬＤ）は、２．３×１０4ＣＦＵであると本発明者らは、判断した。
次に、ＭＬＤを使用してチャレンジ実験を実行し、さらに２つのチャレンジ用量を追加し、それぞれ係数１．９と１．４だけ一方はＭＬＤよりも劣り、もう一方はＭＬＤよりも優れている。幼虫の１５％が６８時間後も生き残ったため、１．２×１０4ＣＦＵでは全ての幼虫を殺すのに十分ではなかった。しかし、２．３および３．２×１０4ＣＦＵは、４４時間で全ての幼虫を殺すのに十分であった。感染の２時間後にＫｖａｒＩａを注射すると、１．２および２．３×１０4ＣＦＵに感染した全ての幼虫が完全にレスキューされた。最高量の細菌（３．２×１０4ＣＦＵ）に感染した幼虫は部分的にレスキューされ、８５％の幼虫が実験終了まで生き残った（図９）。
要約すると、ＫｖａｒＭは、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・バリイコラ、クレブシエラ・オキシトカ、およびクレブシエラ・エロゲネス種に属するクレブシエラ菌株を標的とすることができるため、非常に幅広い活性スペクトルを持っていることが活性アッセイからわかる。また、抗生物質耐性の臨床クレブシエラ分離株のパネルの８５％の菌株に対しても活性であった。液体培養アッセイでは、このクレビシンは、コロニー形成数を３～４対数、バイオフィルムアッセイでは２対数以上減らし得る。孔形成クレビシンは、一般に、ペプチドグリカン合成阻害剤よりも液体培養またはバイオフィルムの細菌数を減らすのにさらに効率的であり、液体培養で４～９対数のＣＦＵカウントの減少、および２～ほぼ６対数のＣＦＵカウントの減少をバイオフィルムで達成することができた。インビトロで最高の効率を示したＫｖａｒＩａは、ハチノスツヅリガ（ガレリア・メロネラ）幼虫チャレンジアッセイでもインビボで試験され、非常に良好な結果が得られた。しかし、このクレブシエラの適用性は、近縁のクレブシエラ・クアシニューモニエでうまく機能するものの、クレブシエラ・ニューモニエに対して広く活性がないという事実によって現在は損なわれている。
（例８）
クレビシン受容体／転位因子の同定
コリシンの普遍的な特徴は、それらのドメイン構成であり、各コリシンは受容体結合、転位および細胞毒性ドメインを有するようであり、これは、これらのバクテリオシンがグラム陰性菌の外膜を通過する必要性によって条件付けられる特徴である（Kleanthous,2010）。それらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対応物との孔形成クレビシンアミノ酸配列アラインメントによって、それらの殺傷ドメインが有意な程度の相同性を示すことが明らかになっている。ただし、原則として、孔形成クレビシンは、コリシンよりも小さい。転位ドメインおよび受容体結合ドメインを含むはずのそれらのアミノ末端部分は、コリシンのそれぞれのドメインよりもかなり短く、配列の類似性はほとんどまたはまったくない。したがって、本発明者らは、孔形成クレビシンの転位機構がそれらの大腸菌の対応物とは異なる場合があると予想した。
厳密に種特異的である他のいくつかのバクテリオシン（例えば、ピオシン）とは対照的に、クレビシン活性は、それらが単離された単一の種に限定されず、少なくとも属に限定される。この点で、クレビシンの受容と転位の機構に関与しているプレーヤーを調査することが重要であった。クレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ ２８２１２は、既知のゲノム配列および試験された全てのクレビシンに対する感受性を備えた株であり、トランスポゾン変異誘発を数回受け、プールされた変異体を、異なるクレビシンに対する感受性について試験された。
クレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ ２８２１２のトランスポゾン変異誘発は、Martinez-Garcia et al.,(2011)に記載の通り行った。ｐＢＡＭ１プラスミドに局在するミニトランスポゾンの自殺送達は、三親交配によって行われた。このプラスミドは、ヘルパー株大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ６００）の助けを借りて、大腸菌ＣＣ１１８λｐｉｒ（ｐＢＡＭ１）ドナー細胞からクレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２細胞に動員された。得られたカナマイシン耐性クローンは、アンピシリン耐性の喪失が確認され、それらのゲノムＤＮＡは、トランスポゾン隣接領域のＰＣＲ増幅に使用され、その後、Martinez-Garcia et al.,(2011)に記載の通り配列決定された。
２９の独立した変異クローンを分離し、トランスポゾンの挿入が１８のクレビシン耐性変異体にうまくマッピングされた。クレビシン感受性の喪失が実際にマッピングされた変異によるものであることを確認するために、それぞれの野生型遺伝子の異所性発現による補完アッセイを実施した。
補完アッセイのために、ＥｘｂＢ、ＥｘｂＢＤ、ＯｍｐＣ、ＦｈｕＡ、ＴｏｎＢ、およびＦｉｍＢ遺伝子ＯＲＦを、５’非コードプロモーター領域とともに含むクレブシエラゲノム領域を、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼの助けを借りてクレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｌｔｉｃｓ）およびｐＪＥＴ１．２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｌｔｉｃｓ）にライゲーションした。配列決定後、クローニングされた断片を、各断片に特異的な制限エンドヌクレアーゼ対で切り出し、ｐＡＣＹＣ１８４（ＮＥＢ）にライゲーションし、それぞれのクレブシエラ・クアシニューモニエ変異体に形質転換した。使用したプライマーの配列とクローニング戦略を表４に示す。
Figure 2022536068000007
変異クレビシン感受性研究および補完アッセイから要約した結果を表５に示す。
Figure 2022536068000008
得られた結果に基づいて、ＫｖａｒＩａを除く全てのクレビシンは、グループＢコリシンに類似しており、ＴｏｎＢ依存性転位経路を使用する。３つのＭ型クレビシンは全て、受容－転位にＦｈｕＡ、ＴｏｎＢ、およびＥｘｂＢを必要とし、これは、大腸菌のホモログであるコリシンＭ．ＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡもＴｏｎＢ転位経路に依存しており、さらに機能的なＯｍｐＣが必要だからである。これまでのところ、これら２つのクレビシンの任意の他の推定受容体を特定することは本発明者らにはできなかった（表６）。
Figure 2022536068000009
ＫｖａｒＩａ耐性転位変異体は、入手が非常に困難であり、一部の偽陽性クローンのみが単離された。したがって、ＫｖａｒＩａの受容－転位に関与しているタンパク質は、外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）の１つだけであることがわかった。ＯｍｐＣ変異体は、ＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡに対する耐性によって選択され、ＫｖａｒＩａに対して同等に耐性があるように見えた。
要約すると、このように、３つのＭ型クレビシンＫｐｎｅＡ、ＫｐｎｅＭ２、およびＫｖａｒＭが、全て、コリシンＭと同様の機構で転位し、そしてペリプラズムに入り、その活性を発揮するには、ＦｈｕＡ受容体とＴｏｎＢ関連の転位経路が必要であることを、本発明者らは、実証した。
コリシンＡとの殺傷ドメインの類似性に基づいてＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡと本発明者らが名付けた２つのクレビシンも、ＴｏｎＢ転位経路に依存しているように見えた。これは、ＴｏｌＡ依存性経路によって転位するコリシンＡとは対照的である。また、コリシンＡは、ＢｔｕＢに結合するが、ＫｐｎｅＡまたはＫａｅｒＡに耐性のあるＢｔｕＢ変異体は分離しなかった。ただし、ＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡは両方とも、ｃｏｌＡ転位にも関与するＯｍｐＦの類似体である機能的なＯｍｐＣを必要とする（Ｋｌｅａｎｔｈｏｕｓ ２０１０）。これまでのところ、これら２つのクレビシンの他の推定受容体は特定されていない。
ＫｖａｒＩａは、全てのＴｏｎＢおよびＥｘｂＢ変異体で機能しているように見えるので、残りの全てのクレビシンとは異なる。したがって、本発明者らの結果に基づいて、ＫｖａｒＩａは、ＴｏｎＢ依存性転位経路を使用していない。記載されている全てのコリシンが転位因子としてＴｏｎＢまたはＴｏｌＡのいずれかを使用していることを考慮すると、このタンパク質はＴｏｌ依存性経路によって転位されると予想される。ただし、ＫｖａｒＩａに耐性があるＴｏｌ依存性経路関連遺伝子の単一の転位変異体は分離しなかった。ＫｖａｒＩａ耐性トランスポゾン変異体を入手するのは非常に困難であり、一部の偽陽性クローンのみが単離されたため、これは確実に使用された方法の限界に関連している可能性がある。選択に使用した条件では、適応度ペナルティの高い変異が得られなかった可能性がある。したがって、これまでのところ、ＫｖａｒＩａの受容－転位に関与している唯一のタンパク質である外膜プロテインＣ（ＯｍｐＣ）を特定することができた。ＯｍｐＣ変異体は、ＫｐｎｅＡおよびＫａｅｒＡに対する耐性によって選択され、ＫｖａｒＩａに対して同等に耐性があるように見えた。
クレビシン受容体と転位因子のさらなる解明は、これらのクレビシンの実用化にも重要である。クレビシンは、抗生物質耐性菌と戦うための使用に最も有望である。しかし、カルバペネム耐性クレブシエラ菌株の９７．１％は、ＯｍｐＣまたはＯｍｐＦを発現しないか、発現が少ないことが示されている（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。本発明者らの研究では、カルバペネム耐性菌を試験しなかったが、カルバペネム耐性クレブシエラは、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｖａｒＩａに耐性があると期待できることが示されており、これは、これらのクレビシンが全て、その活性に機能的なＯｍｐＣを必要とするからである。次の段階は、タンパク質を操作することによって、例えば、それらの受容体－転位を交換し、ドメインを殺すことによって、クレビシンの特異性を変える試みであろう。
一方、現在の研究状況では、６つの非常に効率的な植物発現クレビシンのパネルがあり、これらを合わせて、試験された臨床株の約９１％をターゲットにし得ると結論付けることができる。さらなる操作および改善がなくても、これらのタンパク質は、抗生物質耐性クレブシエラに対する抗菌剤としての医薬での潜在的な使用のためにさらに開発され得る。
（例１０）
いくつかのクレブシエラ種に対するクレビシンＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭおよびＫｖａｒＩａのＭＩＣ測定
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、対応する細菌株の目に見える増殖を妨げたバクテリオシンの最低濃度として算出された。個々のクレビシンのＭＩＣを測定するために、精製した凍結乾燥ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、およびＫｖａｒＭタンパク質を、５μｇ／μｌの濃度で滅菌蒸留水に溶解した。個々のバクテリオシンごとに、ＭＨＢ培地（ミューラー・ヒントンブロス（Ｍｕｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）；Ｍｕｅｌｌｅｒ＆Ｈｉｎｔｏｎ（１９４１）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．４８（１）：３３０－３３３）で２倍段階希釈液を調製した。各タンパク質希釈液の１０μｌアリコートを、滅菌９６ウェルマイクロプレートの空のウェルにロードした。あらゆる評価ポイントを２回繰り返した。
ＭＨＢ培地で増殖させた一晩の細菌培養物を１ｍｌのＭＨＢでＯＤ595＝０．５に希釈し、次いで１０ｍｌの同じ培地で１０００倍に希釈した。希釈された細菌懸濁液の９０μｌアリコートを、マルチチャネルピペットを使用して、タンパク質希釈液がすでに含まれている９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにロードした。希釈された細菌懸濁液の追加のアリコートを、最初の細菌接種物中のＣＦＵ列挙のために、ＭＨＡ培地（ミューラーヒントンアガー；１．７％アガー含有ＭＨＢ）にプレートした。細菌の増殖については、マイクロプレートおよびアガープレートを、クレブシエラ菌株の最適な増殖条件に応じて、３０℃または３７℃で２０時間インキュベートした。クレブシエラ・ニューモニエ亜種オザエネ ＤＳＭ １６３５８、クレブシエラ・バリイコラ ＤＳＭ１５９６８およびクレブシエラエロゲネス ＤＳＭ ３００５３を、３０℃で、クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種シミリニューモニエ ＤＳＭ２８２１２およびクレブシエラオキシトカ ＤＳＭ ５１７５を３７℃でインキュベートした。
ＭＩＣは、マイクロプレートウェル内の細菌増殖の目視検査によって決定された。２回の繰り返しの違いが１つのタンパク質希釈にある場合、ＭＩＣは２つの濃度の平均として決定された。
表７は、μｇタンパク質／ｍｌ溶液およびｎＭ（μＭ）で測定された５つの選択された感受性クレブシエラ菌株に対する６つのクレブシエラのＭＩＣ値を示している。
Figure 2022536068000010
ほとんどの場合、測定されたクレビシンＭＩＣ値は、１～２μｇ／ｍｌ未満であった。Nguen et al.(Scientific Reports(2018)8:241)は、クレブシエラの１４９７株に対する２０種の従来の抗生物質のＭＩＣを決定した。通常、この研究で決定されたＭＩＣ値は、０．５～３２μｇ／ｍｌであった。したがって、クレビシンは、重量ベースで計算された抗菌活性の点で、従来の抗生物質と同等またはそれより優れている。分子量の違いを考えると（ほとんどの抗生物質のＭＷは１ｋＤａ未満である）、クレビシンは、モルベースで計算すると有意に高い抗菌活性を有する。
（例１１）
貯蔵時のクレビシンＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、ＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭおよびＫｖａｒＩａの安定性
安定性を評価するために、精製した凍結乾燥クレビシンタンパク質サンプルを－２０℃、５℃、および室温（約２３℃）で保存した。タンパク質の安定性は、以下の時点での抗菌活性に基づいて評価された：０日目、１週間、２週間、３週間、５週間、３カ月、６カ月、１０カ月、１２カ月の保存。感受性細菌に対するタンパク質活性は、液体培養または放射状拡散アッセイによって評価した。クレビシンは次の菌株で試験した：ＫｐｎｅＭおよびＫｐｎｅＭ２はクレブシエラ・ニューモニエ ＤＳＭ１６３５８で、ＫｖａｒＩａはクレブシエラ・オキシトカ ＤＳＭ５１７５で、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡおよびＫｖａｒＭは、クレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２で試験した。
凍結乾燥したタンパク質サンプルを、蒸留水（０．２～０．４ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁した。ブラッドフォードアッセイを使用して、各サンプルの可溶性タンパク質濃度を測定した。液体培養での安定性評価のために、５μｇのバクテリオシン溶液をＣＡＡ培地中のＯＤ600＝０．３の感受性細菌株の懸濁液１ｍｌに添加した（「０」時点）。バクテリオシンと混合した細菌を、シェーカーで４．５時間インキュベートした。クレブシエラ・オキシトカＤＳＭ５１７５およびクレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＳＭ２８２１２は、３７℃でインキュベートし、クレブシエラ・ニューモニエＤＳＭ１６３５８は３０℃でインキュベートした。ＬＢ培地で段階希釈を行った。細菌をＬＢアガープレートにプレートし、３０℃または３７℃で一晩インキュベートした後、ＣＦＵを計算した。抗菌活性は、未処理のサンプルに関してＣＦＵ／ｍＬΔｌｏｇ10として評価された。
放射状拡散アッセイでは、ＰＢＳ緩衝液に可溶化したタンパク質の連続１：２希釈液を作成した。５μＬのタンパク質希釈液（希釈前のタンパク質１～１．８μｇ）を、感受性の高い細菌株を含むソフトアガープレートにスポットした。プレートのｏ／ｎインキュベーション後にクレビシンの残留活性を評価した。抗菌活性は、比放射能単位（ＡＵ）、すなわち光源の前にプレートを保持することによる、細菌増殖阻害についてプレートの目視検査によって決定された影響を受けていない細菌増殖領域に対する差を考慮する最高希釈として評価した。増殖阻害を伴う最高希釈は、ＡＵ／μｇバクテリオシンの活性として記録した。全ての実験は３回行った。
－２０℃では、可溶性タンパク質の濃度がわずかに減少したにもかかわらず（図１１Ｇ）、全てのクレビシンＫｐｎｅＭ、ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭ、ＫｐｎｅＡ、ＫａｅｒＡ、およびＫｖａｒＩａの活性は年間を通じて安定したままであった（図１１Ａ、Ｄ）。
５℃で保管すると、６つのクレビシンのうち５つが１年間活性を維持した；ＫｐｎｅＡの活性は低下した（図１１Ｅ）。溶液中のＫｖａｒＭおよびＫｐｎｅＭ２の濃度は有意に減少し、保存時の溶解度のある程度の低下を示唆している（図１１Ｈ）。
一般に、クレビシンは室温での保存中は安定性が低かった。それにもかかわらず、クレビシンＫｖａｒＩａおよびＫｐｎｅＭの活性は１年間安定していた。ＫｐｎｅＡ、ＫｖａｒＭ、およびＫｐｎｅＭ２の活性は劇的に低減した（図１１Ｃ）。この活性の低下は、溶液中のタンパク質の濃度と相関しており、保存時の溶解度の低下を示唆している（図１１Ｉ）。
（例１２）
マウス胃腸モデルにおけるクレブシエラ・クアシニューモニエに対するバクテリオシンＫｖａｒＩａ活性の評価
クレブシエラ・ニューモニエは、ヒト腸内細菌叢の正常な成分である。消化管保菌は、特に集中治療室の患者において、クレブシエラ・ニューモニエ感染の主要な貯蔵所と見なされてきた（Gorrie et al.,2017）。１９７１年の前向き研究では、入院後に多剤耐性クレブシエラ・ニューモニエが定着した１８．５％の患者は、腸の保菌者にならなかった患者と比較して、２１日以内に同一の細菌によって生じるその後の感染を発症するリスクが高いことが示された（４５％対１１％）（Martin and Bachman,2018）。
経口投与されたクレビシンは、入院患者の腸から無症候性の多剤耐性クレブシエラ・ニューモニエを根絶するための効率的なツールとなる可能性がある。クレビシンは、経口入院の場合、胃腸酵素によって迅速に不活化されるので、胃の保護ならびに小腸および大腸での放出のために処方する必要がある。この例では、クレビシンＫｖａｒＩａは、回腸および結腸への送達（７を超えるｐＨでのクレビシンの放出）のためにＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００とともに処方して、腸にクレブシエラ・クアシニューモニエがコロニー形成したマウスに強制経口投与した。
ＫｖａｒＩＡの被覆
０．５ｇのＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００（Ｅｖｏｎｉｋ）を１０ｍｌのｍｉｌｉＱ Ｈ2Ｏに溶解すること、および超音波浴で、２５℃で３０分間超音波処理することにより、５％Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００溶液を調製した。２５０μｇのＫｖａｒＩａを、２００μｇの５％Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００に溶解した。得られた溶液を－５１℃で２４時間凍結乾燥した。
シミュレートされた胃の消化、放射状拡散アッセイによる活性評価。
Ｅｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａがペプシン消化に耐性があるか否かを調べるために、シミュレートされた胃消化実験を行った。シミュレートされた胃液（ＳＧＦ、市販の酸性ペプシン抽出物）へのタンパク質の曝露は、低い酵素対基質比を使用して行った。方法は、Moreno et al.,(2005),Mandalari et al.,(2009)およびEiwegger et al.,(2006)から導いた。簡単に説明すると、植物で生産されたＫｖａｒＩａおよびＥｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａを、推奨濃度のＳＧＦと混合し、３７℃で最大６０分間インキュベートした。数分ごとに、分析のために消化混合物のサンプルを採取した。タンパク質の断片への消化は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して評価した。並行して、残留抗菌活性を、放射状拡散アッセイを使用して評価した。ゲル上のクーマシー染色を使用してタンパク質分解を視覚化し、ペプチド産物のＭＷを推定したが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００がＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でタンパク質の移動を歪めたので、この方法は被覆されていないＫｖａｒＩａにのみ使用した。
タンパク質サンプルを３７℃で、２００ｒｐｍで１０分間回転させながらインキュベートした。ペプシン（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、１ｍｇのタンパク質および０．０２５ｍｇのペプシンを含む最終消化混合物中のタンパク質１ｍｇ当たり８０－１１３Ｕ（ペプシン：タンパク質比１：４０）のペプシンを得た。サンプルをシェーカー（２００ｒｐｍ、３７℃）に入れた。反応のアリコート（５０μｌ）を様々な時点（０．５、５、１０、２０、３０、６０分）で取り出した。ペプシンを不活性化するために０．５Ｍの重炭酸アンモニウム（１０μｌのＮＨ4ＨＣＯ3）を添加してｐＨを６．５に上げることにより、消化を停止した。
Ｅｕｄｒａｇｉｔで被覆されたＫｖａｒＩａサンプルをｐＨ８に調整して、Ｅｕｄｒａｇｉｔ被覆を溶解させた。次いで、全てのサンプルを１：２という比率で、蒸留水で希釈し、希釈したサンプルの５μＬアリコートを、ソフトアガーオーバーレイアッセイのために、クレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２菌叢を備えたＭＨＡプレートに滴下した。
使用された条件下（ペプシン：タンパク質比１：４０）では、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００によるタンパク質被覆は、ペプシン消化に対する一時的な耐性を提供できるようである。被覆されたＫｖａｒＩａは、インビトロで胃消化の２０分後、アガー拡散アッセイで依然として検出可能な活性を示したが、被覆されていないＫｖａｒＩａは、シミュレートされた胃液で非常に迅速に不活性化され、消化の０．５分後にすでにその活性を完全に失った（図１２Ａ）。被覆されていないＫｖａｒＩａ消化産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルから、被覆されていないＫｖａｒＩａはペプシンによって非常に迅速に消化され、５分間の消化後にゲル上で全長タンパク質が検出されないことが明らかである（図１２Ｂ）。
クレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２およびＫｖａｒＩａ処理によるマウス腸のコロニー形成
実験の前に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１２）を個々のケージで３日間順応させた。腸内細菌叢を根絶するために、３日連続でマウスにアンピシリン（２０００Ｕ／ｍｌ）とストレプトマイシン（２ｍｇ／ｍｌ）を含む飲料水を与えた。飲料水中のアンピシリンは、実験が終了するまで続けた。
実験の４～６日目および１１～１３日目に、クレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２の強制経口投与１０9ｃｆｕを１日１回使用してマウスに投与した。最後のクレブシエラ・クアシニューモニエ強制経口投与の５日後（１８日目）、マウスを４つの群に分けた（ｎ＝３）：第１の群にはＰＢＳ強制経口投与、第２の群には１００μｇのＫｖａｒＩａ、第３の群には１００μｇのＥｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００被覆されたＫｖａｒＩａを、および第４の群には１０００μｇのＥｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００被覆されたＫｖａｒＩａを投与した。強制経口投与は、１日１回、１８日目から２１日目（４日）続けた。糞便サンプルは、クレブシエラ・クアシニューモニエの接種前に収集し、その後、実験の１８日目（ＫｖａｒＩａ処理の開始直前）から２２日目まで毎日収集した。
治療中、ケージは毎日交換した。全ての実験の間、マウスは通常の食餌と餌と水を自由に摂取したが、強制経口投与の前６時間動物は絶食させた。
実験の１８日目（ＫｖａｒＩａ処理の開始直前）と実験の２２日目（最後のＫｖａｒＩａ処理の１日後）に収集された糞便を使用して、リアルタイムＰＣＲによってクレブシエラ・クアシニューモニエＤＮＡの量を定量した。
リアルタイムＰＣＲ
ＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５０ｍｇの糞便からＤＮＡを抽出した。クレブシエラ溶血素遺伝子（ｋｈｅ）マーカーを増幅に使用した。使用したｋｈｅ遺伝子増幅プライマー：フォワード：５－ＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣ－３（配列番号５６）、リバース：５－ＣＣＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＧ－３（配列番号５７）、プローブ：５－６ＦＡＭ－ＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＣＧ－ＴＡＭＲＡ－３（配列番号５８）。「ＴＡｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ」および「ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＪＡＶ）を使用した。１４ｎｇのＤＮＡを、各ＰＣＲ反応に使用した。次のコントロールをリアルタイムＰＣＲに使用した：クレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２ ＤＮＡ（サイクル１３でのクレブシエラ溶血素遺伝子ｋｈｅ増幅）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ－ｋｈｅ増幅なし、およびｂｌａｎｃ－ｋｈｅ増幅なし。
Figure 2022536068000011
 リアルタイムＰＣＲは、クレブシエラ・クアシニューモニエを検出するための標準曲線を設定することによって検証した。この曲線によれば、ＣＴ３８は、クレブシエラ・クアシニューモニエの１０3ＣＦＵに相当し、ＣＴ２４は、１０6ＣＦＵに相当し、ＣＴ１７は１０8ＣＦＵに相当する（図１３）。
クレビシン強制経口投与前後のクレブシエラ・クアシニューモニエＤＳＭ２８２１２によるマウス腸のコロニー形成
リアルタイムＰＣＲの結果により、実験の１８日目（クレビシン治療の開始前）に、全てのマウスが糞便中にクレブシエラ・クアシニューモニエＤＮＡの存在を示したことが確認された。実験の１８日目で、マウスの各群の中央値ＣＴ値は１８．３～２０．５の範囲であった（図１４および表９）。
リアルタイムＰＣＲの結果によると、クレブシエラ・クアシニューモニエの数は、ＰＢＳおよび被覆されていないＫｖａｒＩａで処理されたマウスの群の糞便で増加し続けた。最後のクレビシン治療の翌日の２２日目に、ＰＢＳ群のＣＴ値の中央値は、１９．９７から１７．２３に低下し、ＫｖａｒＩａ治療群では２０．０５から１８．３６に低下した。
ＰＢＳで処理したマウスと被覆していないＫｖａｒＩａで処理したマウスとは対照的に、クレブシエラ・クアシニューモニエＤＮＡの量は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００で被覆したＫｖａｒＩａ（両方の濃度）で処理したマウスの糞便で急激に減少した。ＣＴ値の中央値は８～８．５サイクルまで増加した（Ｅｕｄｒａｇｉｔ＿Ｓ１００－ＫｖａｒＩａ １００μｇ群では１８．５から２６．３に、およびＥｕｄｒａｇｉｔ＿Ｓ１００－ＫｖａｒＩａ １ｍｇ群では１８．８６から２７．４３に）（図１４および表９）。
Figure 2022536068000012
したがって、リアルタイムＰＣＲの結果によると、Ｅｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａは、マウスの糞便中のクレブシエラ・クアシニューモニエＤＮＡ量を大幅に減少させた。得られた減少は、使用した両方の投与量（１００μｇおよび１ｍｇ）で類似していた。対照的に、クレブシエラ・クアシニューモニエのＤＮＡ量は、被覆されていないＫｖａｒＩａ処理マウスとＰＢＳ処理マウスでわずかに増加した。
結論として、Ｅｕｄｒａｇｉｔ－Ｓ１００で被覆されたＫｖａｒＩａは、マウスの腸内のクレブシエラ・クアシニューモニエ ＤＮＡ量を減少させる高い活性を示し、これは、この細菌の個体数の減少を示している。
核酸およびアミノ酸配列
配列番号１（ＫｐｎｅＭと呼ばれる）（クレブシエラ・ニューモニエ ＥＷＤ３５５９０．１）
ＭＳＥＴＭＶＶＶＡＴＰＴＧＦＥＰＡＧＹＧＧＧＬＦＳＰＳＴＰＮＨＳＰＳＱＧＱＩＦＬＱＶＴＬＰＹＹＱＳＴＫＦＣＱＤＳＭＡＷＬＡＱＹＶＫＴＨＧＡＱＤＰＬＴＩＱＶＶＡＮＮＩＲＹＦＬＮＡＤＴＮＬＣＨＮＰＫＱＮＶＷＥＡＦＨＳＥＭＴＨＳＧＰＰＰＡＫＹＤＹＨＳＭＳＬＫＱＭＳＧＮ ＶＶＴＰＡＡＡ ＦＧＨＹＬＷＧＮＧＥＡＲＹＶＮＬＰＤＶＧＬＫＩＴＰＱＭＩＰＥＬＭＮＩＶＮＳＧＶＴＧＨＩＰＶＤＩＫＦＶＨＤＴＳＶＳＧＧＩＶＰＡＡＹＬＧＨＩＴＬＲＴＥＧＴＬＤＩＱＳＧＧＡＷＴＹＮＧＶＡＲＡＦ ＮＤＴＹＤＦＮＬＧＤＦＲＧＰＩＡＥＳＭＴＦＬＧＳＱＦＴＧＫＱＹＥＩＳＭＰＧＱＩＮＩＳＧＳＧＲＲ
配列番号２（ＫｖａｒＭと呼ばれる）（クレブシエラ・バリイコラ ＣＴＱ１７２２５．１）
ＭＳＤＴＭＩＶＶＡＴＰＴＰＧＦＳＹＡＳＧＬＴＹＧＧＧＡＦＡＧＡＰＡＮＧＰＳＥＧＱＩＦＦＱＴＶＬＰＡＹＱＳＰＮＬＣＩＧＱＬＡＷＭＴＤＹＩＮＫＮＧＶＧＮＰＫＴＷＥＶＩＳＱＮＶＬＩＦＣＳＡＤＴＡＬＶＬＮＰＲＩＡＶＹＤＧＦＨＫＴＫＷＡＰＡＫＦＮＦＫＴＱＳＱＥＫＦＳＧＮＶＴＴＰＩＡＡＦＧ ＨＹＬＷＧＥＧＫＰＲＴＶＤＬＳＳＶＧＬＫＩＱＡＮＱＩＤＰＶＭＩＡＶＫＮＮＡＡＧＴＹＱＩＳＧＮＦＮＲＮＴＦＩＤＧＤＩＰＧＬＹＬＧＮＩＴＭＫＴＥＧＴＬＫＩＤＡＫＧＮＷＮＹＮＧＶＶＲＡＦＮＤＴＹＤＡＮＰＳＴＨＲＳＫＳＡＥＤＬＴＴＬＬＲＬＴＱＧＴＰＹＥＩＲＩＰＧＥＬＫＶＳＧＳＧＫＫ
配列番号３（ＫｐｎｅＭ２と呼ばれる）（クレブシエラ ｓｐ．ＷＰ＿０４７０６６２２０）
ＭＳＥＴＬＶＶＶＡＰＡＰＳＡＰＳＭＴＹＧＧＧＬＩＹＳＳＩＰＳＧＰＮＥＧＱＩＦＦＱＴＶＬＰＡＹＳＳＰＮＦＣＴＤＲＬＲＷＭＶＫＦＩＮＥＮＧＶＧＮＰＤＴＷＫＴＬＡＤＶＩＲＹＹＡＳＡＤＴＡＩＳＫＮＰＫＴＮＰＹＤＡＷＨＫＣＰＷＰＰＡＳＦＤＶＫＴＭＳＶＥＫＦＳＧＳＶＮＴＰＩＶＡＦＧＨＹＬ ＷＧＥＧＫＰＲＳＶＤＬＳＴＶＧＬＫＶＱＡＮＱＩＤＰＶＭＩＡＶＫＳＹＧＡＧＴＹＱＩＮＧＮＦＮＲＮＴＦＤＤＧＶＩＰＧＬＹＬＧＮＩＴＬＫＴＥＧＴＬＫＩＥＫＮＧＳＷＮＹＮＧＶＩＲＡＦＮＤＴＹＤＡＮＰＳＮ ＨＲＳＱＡＡＥＤＬＴＴＬＬＲＩＴＱＧＴＰＹＥＩＲＩＰＧＥＩＫＶＳＧＳＧＫＫ
配列番号４（ＫａｅｒＭと呼ばれる）（クレブシエラ・エロゲネス ＷＰ＿０１５３６７３６０．１）
ＭＴＤＴＬＴＶＴＡＴＩＰＮＧＳＳＦＮＦＱＦＥＧＭＧＮＹＹＡＡＧＳＳＴＷＤＤＰＡＭＡＤＡＡＨＬＹＮＡＩＱＳＭＥＤＧＳＦＴＫＡＬＦＡＤＷＬＱＦＮＡＫＧＲＥＮＩＰＭＩＮＡＲＦＡＴＭＥＴＭＲＦＮＤＰＧＫＡＹＦＱＦＡＱＹＮＥＹＥＧＨＴＰＧＮＮＦＴＳＧＡＦＡＰＦＬＧＬＷＨＹＩＳＧＮＧＶＥＴＳＬＤＩＴＴＩＧＬＴＦＮＱＳＮＬＴＰＶＮＤＡＬＫＳＱＰＰＧＮＹＰＩＳＳＮＦＧＫＳＶＡＥＤＮＬＹＶＡＡＬＬＧＲＩＳＭＫＴＥＧＴＬＳＩＧＥＳＧＥＷＳＹＮＧＶＶＲＡＹＮＤＴＹＤＡＮＦＤＰＳＲＧＶＩＡＱＡＳＴＴＶＬＳＷＦＮＧＫＰＹＰＩＡＬＰＧＥＩＰＶＱＬＳＧＨＲ
配列番号５（ＫｐｎｅＡと呼ばれる）（クレブシエラ・ニューモニエ ＳＡＶ７８２５５．１）
ＭＰＥＥＴＬＴＶＶＧＧＧＮＮＳＣＮＶＳＷＧＧＧＮＧＮＮＧＧＡＧＹＳＧＫＹＧＧＴＳＹＥＧＡＴＳＭＬＫＬＮＤＲＶＬＩＱＬＹＬＣＮＰＬＮＰＤＹＩＧＡＰＷＧＳＤＫＤＡＥＳＩＩＲＡＮＲＤＫＰＧＫＦＫＡＮＩＱＮＷＫＴＳＧＴＧＳＬＧＳＰＶＶＧＫＳＹＳＳＧＤＶＤＴＹＳＶＳＦＧＫＥＫＹＮＶＬＹＮＲＫＫＤＳＦＴＴＡＹＶＤＧＧＡＮＫＰＥＨＳＭＫＤＱＡＩＡＶＶＫＬＹＬＬＮＥＳＱＡＳＶＩＤＴＴＳＧＩＩＴＤＳＧＫＴＬＳＧＫＬＧＤＫＹＮＴＬＡＲＥＡＡＤＮＩＫＮＦＱＧＫＫＬＲＳＦＮＤＡＭＡＳＩＮＥＬＡＮＮＰＫＭＫＬＳＱＡＤＫＴＶＶＳＮＡＬＫＱＭＤＬＳＡＬＡＤＲＦＫＧＬＥＫＡＦＴＷＧＤＲＬＬＫＡＥＫＩＲＤＧＶＶＴＧＶＴＴＧＤＷＱＫＬＡＦＥＶＥＡＭＹＬＳＧＶＡＧＡＶＡＬＧＩＴＴＡＭＩＳＴＶＡＶＡＬＳＬＰＳＶＡＶＳＡＬＴＶＶＡＶＩＧＩ
ＳＩＬＴＳＹＩＤＡＤＫＡＫＡＬＮＮＡＶＬＧＬＦＫ
配列番号６（ＫａｅｒＡと呼ばれる）（クレブシエラ・エロゲネス ＷＰ＿０６３４１４８４１．１）
ＭＡＮＥＤＳＭＴＶＮＧＮＡＧＳＧＶＨＷＧＧＧＳＧＮＧＮＮＧＧＡＧＳＮＧＧＡＮＶＡＬＧＧＴＭＥＶＥＬＧＮＧＦＴＭＩＶＤＧＴＨＰＩＮＰＧＩＧＧＡＰＷＳＤＤＫＳＮＫＳＡＶＤＡＬＮＡＮＫＳＫＰＡＫＦＫＡＮＩＱＮＹＫＳＧＴＱＧＳＬＮＳＰＡＶＮＫＳＳＳＳＧＤＶＤＴＹＡＶＳＦＧＫＥＫＹＮＶＭＹＮＲＫＫＤＳＦＴＳＧＹＶＤＧＧＡＴＫＰＥＨＳＭＫＤＱＡＩＡＶＶＱＬＹＬＬＮＥＫＥＫＤＶＩＴＴＡＡＥＩＩＳＳＳＧＥＴＩＳＧＫＬＧＥＫＹＫＧＬＡＱＧＶＡＮＤＩＲＮＦＱＧＫＫＩＲＳＦＫＤＡＭＳＳＬＥＱＦＴＫＮＰＮＭＫＬＮＱＡＤＫＡＡＬＶＮＡＬＮＱＶＮＬＳＴＬＡＤＲＦＫＧＬＥＲＡ ＦＴＷＡＤＲＬＬＫＡＱＫＩＫＤＧＶＶＴＧＶＴＴＧＮＷＱＰＬＡＬＥＶＥＡＭＹＬＳＧＶＡＧＳＶＡＬＧＩＶＴＧＭＩＳＧＬＡＡＬＩＳＩＰＡＬＡＶＴＡＬ ＴＶＴＡＶＩＧＩＡＩＡＴＳＹＩＮＡＤＴＡＫＡＬＮＮＡＶＡＤＬＦＫ
配列番号７（Ｋｏｘｙと呼ばれる）（クレブシエラ・オキシトカ ＷＰ＿０２４２７３７７８）
ＭＡＧＦＳＹＧＧＦＧＤＧＴＴＷＳＫＥＲＧＴＧＰＬＰＧＧＧＳＳＧＮＳＧＮＨＳＮＴＴＰＡＥＱＫＱＩＮＡＩＲＡＤＫＮＶＲＡＲＬＳＮＬＩＫＡＡＲＫＬＮＰＳＶＫＩＴＶＨＡＩＳＰＥＧＴＭＡＩＳＭＥＧＬＴＡＴＱＡＲＱＡＧＬＴＧＬＶＭＧＩＴＶＰＧＹＩＧＳＶＧＤＦＥＴＧＨＫＹＮＬＫＮＰＥＫＬＮＳ ＩＧＶＧＴＰＬＤＧＦＮＧＧＥＮＩＤＴＴＰＫＫＹＲＮＷＲＡＴＤＥＫＳＦＹＹＶＧＴＴＶＰＭＲＬＬＨＨＬＴＶＳＲＮＫＥＴＤＴＹＴＭＹＦＫＡＫＤＩＫＡＬＹＫＩＥＶＫＮＧＤＬＤＮＭＫＬＴＴＬＡＱＧＨＰＬＦＴＡＥＦＡＫＤＩＶＲＮＦＡＳＶＫＮＥＳＤＫＥＶＬＤＫＴＳＧＶＩＩＳＶＧＤＫＡＧＡＬＬＧＥＫＹ ＫＡＬＳＲＥＶＡＳＮＩＱＮＦＱＧＫＱＩＲＴＹＤＱＡＭＡＳＭＮＫＬＭＴＮＰＮＭＫＩＫＡＡＤＫＴＡＶＩＮＡＷＫＡＦＮＶＥＤＭＧＮＫＦＴＡＬＧＲＡＦＫＶＡＤＹＶＴＫＧＮＮＶＲＥＫＳＩＴＧＹＥＴＧＮＷＧＰＬＭＲＥＶＥＳＷＴＶＳＧＬＴＳＳＶＡＬＡＶＦＳＡＴＬＧＡＭＬＶＡＡＧＶＳＴ ＡＶＶＧＩＩＧＩＩＩＡＧＬＩＧＡＬＩＤＤＫＦＩＤＫＬＮＮＥＩＩＲＰＡＹ
配列番号８（ＫｐｎｅＩａと呼ばれる）（クレブシエラ・ニューモニエ ＢＡＳ３４６７５）
ＭＰＧＦＮＹＧＧＫＧＤＧＴＮＷＳＳＥＲＧＴＧＰＥＰＧＧＧＳＲＧＮＧＧＤＲＤＮＳＲＧＧＡＧＮＲＧＮＷＡＧＳＧＰＬＳＡＡＬＩＮＤＳＩＡＥＡＬＥＫＱＬＰＲＮＴＶＥＡＴＳＴＰＡＹＫＫＭＲＡＡＦＤＡＬＰＬＤＫＱＰＥＡＲＡＱＩＴＫＡＷＱＳＡＨＤＡＭＰＤＫＴＴＴＴＥＮＶＧＧＧＫＮ ＧＨＮＶＴＲＳＴＰＮＷＬＫＥＫＭＫＧＬＮＱＱＶＮＮＤＬＳＧＡＬＡＱＨＱＫＡＥＡＤＡＲＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥ ＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＤＡＶＫＤＡＶＫＦＴＡＤＦＹＫＥＶＦＳＶＹＧＥＫＡＥＱＬＡＮＬＬＡＴＱＡＫＧＫＮＩＲＮＩＤＤＡＬＫＡＹＥＫＨＫＴＮＩＮＫＫＩＮＡＱＤＲＡＡＩＡＫＡＬＥＳＶＤＶＫＥＡＡＫＮＦＡＫＦＳＫＧＬＧＹＶＧＰＴＭＤＶＶＤＬＶＬＥＬＲＫＡＩＫＥＤＮＷＲＳＦＦＶ ＫＩＥＡＩＡＩＳＦＧＡＴＱＬＡＡＬＡＦＡＳＬＬＧＡＰＶＧＬＬＧＹＡＬＩＭＡＧＩＧＡＬＶＳＤＤＶＶＤＡＡＮＫＩＩＧＩ
配列番号９（ＫｖａｒＩａと呼ばれる）（クレブシエラ・バリイコラ ＫＤＬ８８４０９）
ＭＰＧＦＮＹＧＧＫＧＤＧＴＮＷＳＳＥＲＧＴＧＰＥＰＧＧＧＳＲＧＮＧＧＤＲＤＮＳＲＧＧＡＧＮＲＧＮＷＡＧＳＧＰＬＳＡＡＬＩＮＤＳＩＡＥＡＬＥＫＱＬＰＲＮＴＶＥＡＴＳＴＰＡＹＫＫＭＲＡＡＦＤＡＬＰＬＤＫＱＰＥＡＲＡＱＩＴＫＡＷＱＳＡＨＤＡＭＰＤＲＴＴＴＴＥＮＶＧＧＧＫＮＧＨ ＮＶＴＲＳＴＰＮＷＬＫＥＫＭＫＧＬＮＱＱＶＮＮＤＬＳＧＡＬＡＱＨＱＫＡＥＡＤＡＲＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＤＡＶＫＤＡＶＫＦＴＡＤＦＹＫＥＶＦＳＶＹＧＥＫＡＥＱＬＡＮＬＬＡＴ ＱＡＫＧＫＮＩＲ ＮＩＤＤＡＬＫＡＹＥＫＨＫＴＮＩＮＫＫＩＮＡＱＤＲＡＡＩＡＫＡＬＥＳＶＤＶＫＥＡＡＫＮＦＡＫＦＳＫＧＬ ＧＹＶＧＰＴＭＤＶＶＤＬＶＬＥＬＲＫＡＩＫＥＤＮＷＲＴＦＦＶＫＩＥＡＩＡＩＳＦＧＡＴＱＬＡＡＬＡＦＡＳＬＬＧＡＰＶＧＬＬＧ ＹＡＬＩＭＡＧＩＧＡＬＶＳＤＤＶＶＤＡＡＮＫＩＩＧＩ
配列番号１０： ＥｘｂＢ Ｅｃｏ８８Ｉ ｆｗｄ
ＡＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＣＧＴＣＴ
配列番号１１ ＥｘｂＢ Ｅｃｏ８１Ｉ ｒｅｖ
ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＡＣＣＣＧＴＡＡＴＴＴＣＴＧＣＧ
配列番号１２ ＥｘｂＢ Ｅｃｏ８８Ｉ ｆｗｄ
ＡＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＣＧＴＣＴ
配列番号１３ ＥｘｂＤ Ｅｃｏ８１Ｉ ｒｅｖ
ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＴＣ
配列番号１４ ＦｈｕＡ Ｅｃｏ８１Ｉ ｆｗｄ
ＡＡＡＣＣＴＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＣＣＣＴＡＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣＣ
配列番号１５ ＦｈｕＡ Ｅｃｏ ８１Ｉ ｒｅｖ
ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧ
配列番号１６ ＦｉｍＢ Ｅｃｏ８８Ｉ ｆｗｄ
ＡＡＡＣＴＣＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＴＡＧＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＧ
配列番号１７ ＦｉｍＢ Ｅｃｏ８１Ｉ ｒｅｖ
ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＧＣＧ
配列番号１８ ＯｍｐＣ Ｅｃｏ８８Ｉ ｆｗｄ
ＡＡＡＣＴＣＧＧＧＣＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＴＣＡＴＣＡ
配列番号１９ ＯｍｐＣ Ｅｃｏ８１Ｉ ｒｅｖ
ＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣ
配列番号２０ ＴｏｎＢ ＰｓｙＩ ｆｗｄ
ＡＡＡＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡＣＡ
配列番号２１ ＴｏｎＢ ＢｓｅＳＩ ｒｅｖ
ＡＡＡＧＴＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＡＡＴＣＴＣＧＡＣＧＣＣＧＴＴＧ
配列番号２２ コンセンサス配列 Ｍ（ＫｐｎｅＭ２、ＫｖａｒＭ、ＫｐｎｅＭ，ＫａｅｒＭ）
ＭＳＸＴＸＶＶＶＡＴＰＸＸＸＸＸＸＸＸＴＹＧＧＧＬＦＹＸＸＸＰＸＧＰＳＥＧＱＩＦＦＱＴＶＬＰＡＹＱＳＰＮＦＣＸＤＸＬＡＷＭＡＤＹＩＮＸＮＧＶＧＮＰＸＴＷＥＶＩＡＸＮＩＲＹＦＡＳＡＤＴＡＬＸＸＮＰＫＸＸＶＹＤＡＦＨＫＸＸＷＰＰＡＫＸＤＸＸＴＭＳＸＥＫＦＳＧＮＶＸＴＰＩＡＡＦＧＨＹＬＷＧＸＧＫＰＲＳＶＤＬＳＴＶＧＬＫＩＱＡＮＱＩＤＰＶＭＩＡＶＫＳＸＸＡＧＴＹＸＩＳＧＮＦＮＲＮＴＦＸＤＧＸＩＰＸＸＹＬＧＮＩＴＸＫＴＥＧＴＬＫＩＸＸＸＧＸＷＮＹＮＧＶＶＲＡＦＮＤＴＹＤＡＮＰＳＸＨＲＸＸＩＡＥＤＬＴＴＬＬＸＸＸＱＧＸＰＹＥＩＲＩＰＧＥＩＫＶＳＧＳＧＫＸ
配列番号２３ コンセンサス配列 Ａ（ＫａｅｒＡ，ＫｐｎｅＡ）
ＭＸＸＥＸＸＸＸＶＸＧＸＮＸＸＸＸＶＸＷＧＧＸＸＧＮＧＮＮＧＧＡＧＸＸＧＸＸＧＸＸＸＸＸＧＸＴＸＸＸＸＬＸＢＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＪＮＰＸＸＸＧＡＰＷＸＸＸＸＳＢＫＸＡＸＸＸＪＸＡＮＸＸＫＰＸＫＦＫＡＮＩＱＮＸＫＸＸＸＸＧＳＬＸＳＰＸＶＸＫＳＸＳＳＧＤＶＤＴＹＸＶＳＦＧＫＥＫＹＮＶＸＹＮＲＫＫＤＳＦＴＸＸＹＶＤＧＧＡＸＫＰＥＨＳＭＫＤＱＡＩＡＶＶＸＬＹＬＬＮＥＸＺＸＸＶＩＸＴＸＸＸＩＩＸＸＳＧＸＴＪＳＧＫＬＧＸＫＹＸＸＬＡＸＸＸＡＢＢＩＸＮＦＱＧＫＫＪＲＳＦＸＤＡＭＸＳＪＸＺＸＸＸＮＰＸＭＫＬＸＱＡＤＫＸＸＸＸＮＡＬＸＱＸＢＬＳＸＬＡＤＲＦＫＧＬＥＸＡＦＴＷＸＤＲＬＬＫＡＺＫＩＸＤＧＶＶＴＧＶＴＴＧＢＷＱＸＬＡＸＥＶＥＡＭＹＬＳＧＶＡＧＸＶＡＬＧＩＸＴＸＭＩＳＸＸＡＸＸＪＳＪＰＸＸＡＶＸＡＬＴＶＸＡＶＩＧＩＸＩＸＴＳＹＩＢＡＤＸＡＫＡＬＮＮＡＶＸＸＬＦＫ
配列番号２４ コンセンサス配列 Ｉａ（ＫｐｎｅＩａ，ＫｖａｒＩａ）
ＭＰＧＦＮＹＧＧＫＧＤＧＴＮＷＳＳＥＲＧＴＧＰＥＰＧＧＧＳＲＧＮＧＧＤＲＤＮＳＲＧＧＡＧＮＲＧＮＷＡＧＳＧＰＬＳＡＡＬＩＮＤＳＩＡＥＡＬＥＫＱＬＰＲＮＴＶＥＡＴＳＴＰＡＹＫＫＭＲＡＡＦＤＡＬＰＬＤＫＱＰＥＡＲＡＱＩＴＫＡＷＱＳＡＨＤＡＭＰＤＸＴＴＴＴＥＮＶＧＧＧＫＮＧＨＮＶＴＲＳＴＰＮＷＬＫＥＫＭＫＧＬＮＱＱＶＮＮＤＬＳＧＡＬＡＱＨＱＫＡＥＡＤＡＲＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＸＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＸＡＫＡＫＡＥＡＸＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＤＡＶＫＤＡＶＫＦＴＡＤＦＹＫＥＶＦＳＶＹＧＥＫＡＥＱＬＡＮＬＬＡＴＱＡＫＧＫＮＩＲＮＩＤＤＡＬＫＡＹＥＫＨＫＴＮＩＮＫＫＩＮＡＱＤＲＡＡＩＡＫＡＬＥＳＶＤＶＫＥＡＡＫＮＦＡＫＦＳＫＧＬＧＹＶＧＰＴＭＤＶＶＤＬＶＬＥＬＲＫＡＩＫＥＤＮＷＲＸＦＦＶＫＩＥＡＩＡＩＳＦＧＡＴＱＬＡＡＬＡＦＡＳＬＬＧＡＰＶＧＬＬＧＹＡＬＩＭＡＧＩＧＡＬＶＳＤＤＶＶＤＡＡＮＫＩＩＧＩ
配列番号２５（配列番号２２中で保存された配列ストレッチ）
ＴＥＧＴＬ
配列番号２６（配列番号２２中で保存された配列ストレッチ）
ＹＮＧＶ
配列番号２７（配列番号２２中で保存された配列ストレッチ）
ＲＡＦＮＤＴＹＤ
配列番号２８（配列番号２３中で保存された配列ストレッチ）
ＧＮＧＮＮＧＧＡＧ
配列番号２９（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＧＡＰＷ
配列番号３０（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＫＦＫＡＮＩＱＮ
配列番号３１（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＳＳＧＤＶＤＴＹ
配列番号３２（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＶＳＦＧＫＥＫＹＮＶ
配列番号３３（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＹＮＲＫＫＤＳＦＴ
配列番号３４（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＹＶＤＧＧＡ
配列番号３５（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＫＰＥＨＳＭＫＤＱＡＩＡＶＶ
配列番号３６（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＬＹＬＬＮＥ
配列番号３７（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＳＧＫＬＧ
配列番号３８（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＮＦＱＧＫＫ
配列番号３９（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＱＡＤＫ
配列番号４０（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＬＡＤＲＦＫＧＬ
配列番号４１（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＡＦＴＷ
配列番号４２（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＤＲＬＬＫＡ
配列番号４３（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＤＧＶＶＴＧＶＴＴＧ
配列番号４４（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＥＶＥＡＭＹＬＳＧＶＡＧ
配列番号４５（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＶＡＬＧＩ
配列番号４６（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＡＬＴＶ
配列番号４７（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＡＶＩＧＩ
配列番号４８（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＴＳＹＩ
配列番号４９（配列番号２３で保存された配列ストレッチ）
ＡＫＡＬＮＮＡＶ
配列番号５０（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＭＰＧＦＮＹＧＧＫＧＤＧＴＮＷＳＳＥＲＧＴＧＰＥＰＧＧＧＳＲＧＮＧＧＤＲＤＮＳＲＧＧＡＧＮＲＧＮＷＡＧＳＧＰＬＳＡＡＬＩＮＤＳＩＡＥＡＬＥＫＱＬＰＲＮＴＶＥＡＴＳＴＰＡＹＫＫＭＲＡＡＦＤＡＬＰＬＤＫＱＰＥＡＲＡＱＩＴＫＡＷＱＳＡＨＤＡＭＰＤ
配列番号５１（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＴＴＴＴＥＮＶＧＧＧＫＮＧＨＮＶＴＲＳＴＰＮＷＬＫＥＫＭＫＧＬＮＱＱＶＮＮＤＬＳＧＡＬＡＱＨＱＫＡＥＡＤＡＲＡＫＡＥＡＡＡＫＡＫ
配列番号５２（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡ
配列番号５３（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＡＫＡＫＡＥＡ
配列番号５４（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＥＡＫＡＫＡＥＡＤＡＶＫＤＡＶＫＦＴＡＤＦＹＫＥＶＦＳＶＹＧＥＫＡＥＱＬＡＮＬＬＡＴＱＡＫＧＫＮＩＲＮＩＤＤＡＬＫＡＹＥＫＨＫＴＮＩＮＫＫＩＮＡＱＤＲＡＡＩＡＫＡＬＥＳＶＤＶＫＥＡＡＫＮＦＡＫＦＳＫＧＬＧＹＶＧＰＴＭＤＶＶＤＬＶＬＥＬＲＫＡＩＫＥＤＮＷＲ
配列番号５５（配列番号２４で保存された配列ストレッチ）
ＦＦＶＫＩＥＡＩＡＩＳＦＧＡＴＱＬＡＡＬＡＦＡＳＬＬＧＡＰＶＧＬＬＧＹＡＬＩＭＡＧＩＧＡＬＶＳＤＤＶＶＤＡＡＮＫＩＩＧＩ
配列番号５６ ｋｈｅ 遺伝子増幅フォワードプライマー
ＧＡＴＧＡＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣ
配列番号５７ ｋｈｅ 遺伝子増幅リバースプライマー
ＣＣＧＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＧ
配列番号５８ ｋｈｅ 遺伝子増幅プローブ配列（５’末端で６ＦＡＭで、および３’末端でＴＡＭＲＡで標識）
ＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＣＧ
参考文献
Figure 2022536068000013

Figure 2022536068000014
２０１９年６月６日に出願された欧州特許出願第１９１７８ ６７６．３号の内容は、詳細な説明、特許請求の範囲、図面、および配列表を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (28)

  1. 治療に使用するための、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）に対する細胞毒性活性を有するタンパク質または前記タンパク質を含む組成物。
  2. 前記タンパク質が、クレブシエラ細胞の細胞膜におけるリピドＩＩ切断活性または孔形成能を有する、請求項１に記載の使用のためのタンパク質または組成物。
  3. クレブシエラ、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・クアシニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｑｕａｓｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）および／またはクレブシエラ・バリイコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）による対象の感染症を処置する方法に使用するための、請求項１または２に記載の使用のためのタンパク質または組成物であって、前記クレブシエラが、抗生物質耐性、例えば、カルバペネム耐性であってもよい、タンパク質または組成物。
  4. クレブシエラ、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・エロゲネスおよび／またはクレブシエラ・バリイコラによる対象の感染症を処置する方法に使用するための、タンパク質または前記タンパク質を含む組成物であって、前記クレブシエラが、抗生物質耐性、例えば、カルバペネム耐性であってもよい、タンパク質または組成物。
  5. クレブシエラによる感染症を処置することを必要とする対象のクレブシエラによる感染症を処置する方法であって、前記対象に、クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質または前記タンパク質を含む組成物を投与することを含む、方法。
  6. １種または複数のクレブシエラ種による物体の感染もしくは汚染を予防または低減する方法であって、前記物体を、クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質または前記タンパク質を含む組成物と接触させることを含む、方法。
  7. 前記タンパク質が、第１のアミノ酸配列セグメントおよび第２のアミノ酸配列セグメントを含むか、またはそれらからなり、第１のセグメントが、好ましくは、前記タンパク質のＮ末端セグメントであり、第２のセグメントが、前記タンパク質のＣ末端セグメントである、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  8. （Ａ）第１のセグメントが、
    （Ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１～１２７、
    （Ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１～１２８、
    （Ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１～１２３、
    （Ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１～１１８、
    （Ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１～１７０、
    （Ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１～１７２、
    （Ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基１～２５５、
    （Ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基１～２８８、または
    （Ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基１～２３６
    のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか；
    あるいは
    （Ｂ）第１のセグメントが、
    （Ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
    （Ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
    （Ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
    アミノ酸配列を含むか；
    あるいは
    （Ｃ）第１のセグメントが、
    （Ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１～１２７のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１～１２８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１～１２３のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１～１１８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１～１７０のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１～１７２のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基１～２５５のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基１～２８８のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または
    （Ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基１～２３６のアミノ酸配列と比較して、１～４０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
    アミノ酸配列を含む、請求項７に記載のタンパク質、組成物または方法。
  9. 項目（Ｂ）において、配列同一性のいずれか１つが、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％であり；ならびに／または
    項目（Ｃ）において、前記アミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失の数が、前記アミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、最も好ましくは少なくとも１～５個である、請求項８に記載のタンパク質、組成物または方法。
  10. （Ｄ）第２のセグメントが、
    （Ｄ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）のアミノ酸残基１２８～２７６、
    （Ｄ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）のアミノ酸残基１２９～２７８、
    （Ｄ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）のアミノ酸残基１２４～２７２、
    （Ｄ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）のアミノ酸残基１１９～２６６、
    （Ｄ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）のアミノ酸残基１７１～３７７、
    （Ｄ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）のアミノ酸残基１７３～３７９、
    （Ｄ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）のアミノ酸残基２５６～４５２、
    （Ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）のアミノ酸残基２８９～４６６、または
    （Ｄ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）のアミノ酸残基２３７～４１４
    のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなるか；
    あるいは
    （Ｅ）第２のセグメントが、
    （Ｅ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （Ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
    （Ｅ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
    アミノ酸配列を含むか；
    あるいは
    （Ｆ）第２のセグメントが、
    （Ｆ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸残基１２８～２７６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｉ）配列番号１のアミノ酸残基１２９～２７８のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸残基１２４～２７２のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸残基１１９～２６６のアミノ酸配列と比較して、１～３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｖ）配列番号５のアミノ酸残基１７１～３７７のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸残基１７３～３７９のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸残基２５６～４５２のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸残基２８９～４６６のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （Ｆ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸残基２３７～４１４のアミノ酸配列と比較して、１～３５個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
    アミノ酸配列を含む、請求項７、８および９のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  11. 前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｉ～Ａ－ｉｖ、Ｂ－ｉ～Ｂ－ｉｖまたはＣ－ｉ～Ｃ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｉ～Ｄ－ｉｖ、Ｅ－ｉ～Ｅ－ｉｖまたはＦ－ｉ～Ｆ－ｉｖのいずれか１つである、請求項９または１０に記載のタンパク質、組成物または方法。
  12. それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ａ－ｉ～Ａ－ｉｖのいずれか１つまたは複数であり、前記第２のセグメントが、項目Ｄ－ｉ～Ｄ－ｉｖのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、項目Ｂ－ｉ～Ｂ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｅ－ｉ～Ｅ－ｉｖのいずれか１つであるか；または、それぞれ、前記第１のセグメントが、Ｃ－ｉ～Ｃ－ｉｖのいずれか１つであり、前記第２のセグメントが、項目Ｆ－ｉ～Ｆ－ｉｖのいずれか１つである、請求項１１に記載のタンパク質、組成物または方法。
  13. 前記タンパク質が、
    （ａ）（ａ－ｉｉ）配列番号２（ＫｖａｒＭ）、
    （ａ－ｉ）配列番号１（ＫｐｎｅＭ）、
    （ａ－ｉｉｉ）配列番号３（ＫｐｎｅＭ２）、
    （ａ－ｉｖ）配列番号４（ＫａｅｒＭ）、
    （ａ－ｖ）配列番号５（ＫｐｎｅＡ）、
    （ａ－ｖｉ）配列番号６（ＫａｅｒＡ）、
    （ａ－ｖｉｉ）配列番号７（Ｋｏｘｙ）、
    （ａ－ｖｉｉｉ）配列番号８（ＫｐｎｅＩａ）、または
    （ａ－ｉｘ）配列番号９（ＫｖａｒＩａ）
    のアミノ酸配列；
    あるいは
    （ｂ）（ｂ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、
    （ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する、または
    （ｂ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する
    アミノ酸配列；
    あるいは
    （ｃ）（ｃ－ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｉｖ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１～８０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｖ）配列番号５のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｖｉ）配列番号６のアミノ酸配列と比較して、１～１１０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｖｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、
    （ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と比較して、１～１３０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する、または
    （ｃ－ｉｘ）配列番号９のアミノ酸配列と比較して、１～１２０個のアミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する
    アミノ酸配列
    を含むか、またはそれらからなるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  14. 項目（ｂ）において、配列同一性のいずれか１つが、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％であり；ならびに／または
    項目（ｃ）において、前記アミノ酸の置換、付加、挿入および／もしくは欠失の数が、前記アミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、最も好ましくは少なくとも１～５個である、請求項１３に記載のタンパク質、組成物または方法。
  15. クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クレブシエラ・クアシニューモニエ、クレブシエラ・エロゲネスおよび／またはクレブシエラ・バリイコラに対する細胞毒性活性を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  16. 前記タンパク質が、配列番号２２～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、２０種の標準アミノ酸残基のいずれか１つ、またはアミノ酸残基の非存在を表し、各Ｊが、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）のいずれかを表すか；または
    前記タンパク質が、配列番号１～４、７、８もしくは２２について定義されるいずれか１つ、好ましくは、配列番号１～４もしくは２２について定義されるいずれか１つである、請求項１～１５のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  17. 前記タンパク質の細胞毒性活性が、
    － 前記タンパク質、および
    － 配列番号１のアミノ酸配列の比較タンパク質
    が、アガープレート上の感受性クレブシエラ株の菌叢上に前記タンパク質および比較タンパク質の溶液のそれぞれの２０マイクロリットルをスポットし、その後アガープレートを３７℃でインキュベートした１６時間後、感受性クレブシエラ・クアシニューモニエ亜種シミリニューモニエ（ｓｉｍｉｌｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＳＢ３０（ＤＳＭ ２８２１２）の生存細菌を含まないスポットを少なくとも同じ直径で生成するような活性であり、
    溶液中の前記タンパク質の濃度が、比較タンパク質の溶液の濃度の最大で５倍である、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質、組成物または方法。
  18. クレブシエラに対する細胞毒性活性を有するタンパク質であって、クレブシエラ細胞の細胞膜におけるリピドＩＩ切断活性または孔形成能を有し、好ましくは、第１のアミノ酸配列セグメントおよび第２のアミノ酸配列セグメントを含むか、またはそれらからなる、タンパク質。
  19. 請求項７～１７のいずれか１項にさらに定義されている、請求項１８に記載のタンパク質。
  20. 請求項７～１２、１３～１７および１８～１９のいずれか１項に定義される１種または複数のタンパク質、ならびに担体を含む組成物。
  21. 請求項７～１２、１３～１７および１８～１９のいずれか１項に定義される１種または複数のタンパク質を含む医薬組成物。
  22. １種または複数のタンパク質を含む組成物、好ましくは、医薬組成物であって、前記１種または複数のタンパク質が、配列番号２２～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、各Ｘが、２０種の標準アミノ酸残基のいずれか１つ、またはアミノ酸残基の非存在を表し、各Ｊが、Ｌ（ロイシン）またはＩ（イソロイシン）のいずれかを表すか；または
    前記タンパク質が、配列番号１～４、７、８もしくは２２について定義されるいずれか１つ、好ましくは、配列番号１～４もしくは２２について定義されるいずれか１つであり；
    前記組成物が、好ましくは、担体を含む、組成物。
  23. 植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記１種または複数のタンパク質を発現している植物、好ましくは、前記１種または複数のタンパク質を発現している食用植物由来の材料であってもよい、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記１種または複数のタンパク質が、小腸または大腸への経口送達用に製剤されている、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 請求項１～１７、１８および１９のいずれか１項に定義されるタンパク質を含むか、または請求項２０～２４のいずれか１項に記載の組成物を含む経口製剤であって、胃の条件からタンパク質を保護することができ、腸においてタンパク質を放出することができる、経口製剤。
  26. 請求項１～１７、１８または１９のいずれか１項に定義されるタンパク質、好ましくは、請求項７～１７のいずれか１項に定義されるタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物であって、好ましくは、植物細胞において活性な転写プロモーター、および前記プロモーターの制御下で、細胞において、好ましくは植物細胞において、ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、核酸分子または核酸構築物。
  27. 請求項１～１７、１８または１９のいずれか１項に定義されるタンパク質、好ましくは、請求項７～１７のいずれか１項に定義されるタンパク質をコードする核酸分子または核酸構築物であって、細胞において、好ましくは植物細胞において、ヌクレオチド配列を発現させるための前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列を含むウイルス（ＤＮＡまたはＲＮＡ）レプリコンであるか、またはそれをコードする、核酸分子または核酸構築物。
  28. 請求項１～１７、１８および１９のいずれか１項に定義されるタンパク質を含むか、または請求項２６もしくは２７に定義される核酸分子もしくは核酸構築物を含む、植物、植物組織または植物細胞。
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