BR112012004482B1

BR112012004482B1 - método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BR112012004482B1
Application number: BR112012004482A
Authority: BR
Inventors: Doi Hidetaka; Usuda Yoshihiro
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2020-05-19
Also published as: WO2011024555A1; EP2471942B1; EP2471942A4; US20120219995A1; BR112012004482A2; JP2012223092A; EP2471942A1; US8932834B2

Abstract

método para produzir um l-aminoácido é divulgado um processo para a produção de um laminoácido, que compreende cultivar uma bactéria que pertence à família enterobacteriaceae e capaz de produzir o l-aminoácido em um meio de cultura para produzir e acumular o l-aminoácido no meio de cultura e acumular o l-aminoácido a partir do meio de cultura. o processo é caracterizado em que a bactéria é modificada desta maneira de modo que a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na via de argininossuccinil transferase, tal como argininossuccinil transferase, succinilarginina diidrolase, succinilornitina aminotransferase, succinilglutanato semialdeído desidrogenase e succinilglutamato dessuccinilase seja reduzida.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO”

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito a um método para produzir um L-aminoácido usando-se um micro-organismo. Os L-aminoácidos são usados em vários campos, tais como para o uso em condimentos, aditivos alimentícios, aditivos nutricionais, produtos químicos e medicamentos. Fundamentos da Técnica

Os L-aminoácidos são industrialmente produzidos por fermentação usando-se micro-organismos que pertencem ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia ou semelhante. Em tais métodos de produção, as cepas que são usadas são isoladas de variantes naturais ou artificiais de tais cepas. Além disso, os micro-organismos modificados por técnicas de DNA recombinantes de modo que a atividade de uma enzima de biossíntese de L-aminoácido básico é aumentada e assim por diante são usados (Documentos de patente de 1 a 9).

Foi relatado que a Escherichia coli tem uma via metabólica denominada via de arginina succiniltransferase como uma via metabólica para a decomposição de L-arginina e cepas de 97% de decomposição de L-arginina pela utilização desta via de arginina succiniltransferase (Documento que não de patente 1). Além disso, também foi relatado que esta via de arginina succiniltransferase decompõe a L-arginina com um grupo de enzimas codificado pelo operon astCADBE na sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) (Documento que não de patente 1).

Entretanto, a relação entre a via de arginina succiniltransferase e de produção de L-aminoácido não é conhecido.

Documentos de patente

Documento de patente 1: EP 0643135 B

Documento de patente 2: EP 0733712 B

Documento de patente 3: EP 1477565 A

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 10/126

Documento de patente 4: EP 0796912 A

Documento de patente 5: EP 0837134 A

Documento de patente 6: WO01/53459

Documento de patente 7: EP 1170376 A

Documento de patente 8: WO2005/010175

Documento de patente 9: WO96/17930

Documento que não de patente

Documento que não de patente 1: J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, No. 16, 4278-4286 Sumário da invenção

Objetivo a ser atingido pela invenção

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método melhorado para a produção de uma L-aminoácido pela fermentação em comparação com métodos convencionais.

Meios para atingir o objetivo

Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de atingir o objetivo já mencionado, como um resultado, observou que as capacidades de produção de L-aminoácido de bactérias Enterobacteriaceae podem ser marcadamente melhoradas pela diminuição da atividade ou das atividades de um ou dois ou mais tipos de enzimas da via de arginina succiniltransferase e realizou a presente invenção.

A presente invenção, desta maneira, diz respeito ao seguinte.

(1) Um método para produzir um L-aminoácido, que compreende cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio para produzir e acumular L-aminoácido no meio e coletar o L-aminoácido do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade ou atividades de um ou dois ou mais tipos de enzimas da via de arginina succiniltransferase é/são diminuídos.

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 11/126 (2) O método como descrito acima, em que as enzimas da via de arginina succiniltransferase são selecionados do grupo que consiste de arginina succiniltransferase, succinilarginina diidrolase, succinilornitina aminotransferase, succinilgiutamate-semialdeído desidrogenase e succinilglutamato desuccinilase.

(3) O método como descrito acima, em que a arginina succiniltransferase, succinilarginina diidrolase, succinilornitina aminotransferase, succinilglutamatosemialdeído desidrogenase e succinilglutamato desuccinilase são codificados por genes astA, astB, astC, astD e astE, respectivamente.

(4) O método como descrito acima, em que a atividade ou atividades das enzimas da via de arginina succiniltransferase é/são diminuídos pela diminuição das quantidades de expressão dos genes ou pela interrupção dos genes.

(5) O método como descrito acima, em que a bactéria foi modificada de modo que pelo menos uma atividade de arginina succiniltransferase é diminuída.

(5) O método como descrito acima, em que a bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae em uma bactéria Escherichia, uma bactéria Enterobacter ou uma bactéria Pantoea.

(6) O método como descrito acima, em que a bactéria é Escherichia coli.

(7) O método como descrito acima, em que o L-aminoácido é um aminoácido da família de ácido aspártico ou um aminoácido aromático.

(8) O método como descrito acima, em que o aminoácido da família de ácido aspártico consiste de um ou dois ou mais tipos de aminoácidos selecionados de L-lisina, L-treonina e L-metionina.

(9) O método como descrito acima, em que o aminoácido aromático consiste de um ou dois ou mais tipos de aminoácidos selecionados

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 12/126 de L-triptofano, L-tirosina e L-fenilalanina.

(10) O método como descrito acima, em que o L-aminoácido é L-lisina.

(11) O método como descrito acima, em que o meio é um meio contendo um ácido graxo ou glicerol como uma fonte de carbono.

Formas de Realização para Realizar a Invenção <1> Bactéria da presente invenção

Uma bactéria usada na presente invenção é uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido, que foi modificada de modo que a atividade ou atividades de um ou dois ou mais tipos de enzimas da via de arginina succiniltransferase (daqui em diante também referida como via de AST ) é/são diminuídos. A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela modificação de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido de modo que uma atividade de uma enzima da via AST seja diminuída.

As bactérias usadas como uma cepa precursora da bactéria da presente invenção, que é modificada de modo que uma atividade de uma enzima da via AST é diminuída e os métodos para comunicar ou intensificar uma capacidade de produção de L-aminoácido será exemplificada abaixo. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida pela comunicação de uma capacidade de produção de L-aminoácido a uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e foi modificada de modo que uma atividade de uma enzima da via AST seja diminuída ou pela intensificação de uma capacidade de produção de L-aminoácido de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e foi modificada de modo que uma atividade de uma enzima da via AST seja diminuída.

Na presente invenção, a bactéria tendo uma capacidade de produção de aminoácido refere-se a uma bactéria tendo uma capacidade de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 13/126 produzir e de acumular um L-aminoácido em um meio quando este é cultivado no meio, preferivelmente uma tal bactéria que pode acumular o Laminoácido de objetivo no meio em uma quantidade de 0,5 g/L ou mais, mais preferivelmente 1,0 g/L ou mais.

Os exemplos do L-aminoácido referidos na presente invenção incluem L-lisina, ácido L-glutâmico, L-treonina, L-valina, L-leucina, Lisoleucina, L-serina, ácido L-aspártico, L-asparagina, L-glutamina, Larginina, L-cisteína (cisteína), L-metionina, L-fenilalanina, L-triptofano, Ltirosina, L-glicina, L-alanina, L-prolina, L-ornitina, L-citrulina e Lhomosserina. Um aminoácido da família de ácido aspártico ou um aminoácido aromático é especialmente desejável. Os exemplos do aminoácidos da família de ácido aspártico incluem L-lisina, L-treonina, e Lmetionina. Os exemplos do aminoácido aromático incluem L-triptofano, Lfenilalanina e L-tirosina.

Além disso, na presente invenção, o L-aminoácido inclui não apenas aqueles em uma forma livre, mas também seus sais incluindo sulfatos, cloridretos, carbonatos, sais de amônio, sais de sódio e sais de potássio. <1-1> Bactérias usadas como a cepa precursora de bactéria da presente invenção

A bactéria da presente invenção é uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade de produção de Laminoácido.

A família Enterobacteriaceae abrange bactérias que pertencem aos gêneros de Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsielia, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, e assim por diante. Em particular, as bactérias classificadas em uma família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id =91347)

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 14/126 são preferidos.

A expressão uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia” significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com a classificação de uma pessoa habilitada na técnica de microbiologia, embora a bactéria não seja particularmente limitada. Os exemplos da bactéria que pertence ao gênero Escherichia usado na presente invenção inclui, mas não limita-se a, Escherichia coli (E. coli).

A bactéria que pertence ao gênero Escherichia que pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada. Entretanto, os exemplos incluem, por exemplo, a bactéria dos grupos filéticos descrita no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt F.C. Ed., 1996, Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, pp.2477-2483, Tabela 1, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Os exemplos específicos incluem o Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) e assim por diante derivado da cepa do tipo selvagem protótipo, cepa K12.

Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, a partir da American Type Culture Collection (endereço: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America). Isto é, os números de acessão são dados para cada uma das cepas e as cepas podem ser ordenadas usando-se estes números. Os números de acessão das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection.

A expressão uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea” significa que a bactéria é classificada no gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa habilitada na técnica da microbiologia. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou semelhante na base da análise de sequência de nucleotídeo de 16S rRNA etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43, 162-173). Na

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 15/126 presente invenção, as bactérias que pertencem ao gênero Pantoea podem abranger tais bactérias re-classificadas no gênero Pantoea como descrito acima.

Os métodos para comunicar uma capacidade de produção de L-aminoácido a tal bactéria como descrito acima e métodos para intensificar uma capacidade de produção de L-aminoácido de tais bactérias como descrito acima são descritos abaixo.

Para comunicar uma capacidade de produção de Laminoácido, os métodos convencionalmente utilizados na criação de cepas produtoras de aminoácido de bactérias corineforme, bactérias Escherichia, e assim por diante (ver Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1° Edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp.77-100) podem ser usados. Tais métodos incluem adquirir uma cepa mutante auxotrófica, uma cepa resistente ao análogo de L-aminoácido ou uma cepa mutante de regulação metabólica ou construção de uma cepa recombinante de modo que esta super-expresse uma enzima de biossíntese de L-aminoácido. Na criação de bactérias produtoras de L-aminoácido, uma ou mais das propriedades descritas acima, tais como auxotrofia, resistência a análogo e mutação de regulação metabólica pode ser comunicada. A expressão de um ou dois ou mais tipos de enzimas de biossíntese de L-aminoácido pode ser intensificada. Além disso, a comunicação de tais propriedades como auxotrofia, resistência a análogo e mutação de regulação metabólica pode ser combinada com a intensificação de uma enzima de biossíntese.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente ao análogo de L-aminoácido ou cepa mutante de regulação metabólica tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser obtida submetendo-se uma cepa precursora ou do tipo selvagem à mutagênese convencional, tal como exposição a raios X ou irradiação UV ou um tratamento com um mutagênio tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina e então selecionar uma cepa

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 16/126 que apresenta autotrofia, resistência a análogo ou uma mutação de regulação metabólica e tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

Além disso, a capacidade de produção de L-aminoácido também pode ser comunicada ou intensificada pelo aumento da atividade enzimática ou pela recombinação genética. Um exemplo do método para aumentar a atividade enzimática inclui modificar uma bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica quanto a uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido é intensificada. A expressão de um gene também pode ser aumentada pela introdução de um plasmídeo de amplificação preparado pela introdução de um fragmento de DNA contendo o gene m um plasmídeo apropriado, por exemplo, um vetor de plasmídeo contendo pelo menos um gene responsável pela replicação e proliferação dos plasmídeos em micro-organismos, aumento do número de cópia do gene em um cromossomo por conjugação, transferência ou semelhante ou introdução de uma mutação na região de promotor do gene (refere-se a WO95/34672). Além disso, a atividade de uma enzima que catalisa uma reação para a geração de um outro composto que não o L-aminoácido de objetivo pela ramificação da via biossintética do L-aminoácido de objetivo pode ser diminuído ou eliminado. A atividade da enzima pode ser diminuída ou eliminada da mesma maneira como aquela para diminuir uma atividade de uma enzima da via de arginina succiniltransferase descrito abaixo.

Quando um gene de objetivo é introduzido no plasmídeo ou cromossomo de amplificação já mencionados, qualquer promotor pode ser usado para a expressão do gene contanto que o promotor escolhido funcione nas bactérias Enterobacteriaceae. O promotor pode ser um promotor natural para o gene ou um promotor modificado. A quantidade de expressão de um gene também pode ser controlada pela escolha adequada de um promotor que funcione fortemente nas bactérias Enterobacteriaceae ou pela fabricação de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 17/126 regiões -35 e -10 do promotor mais próximo da sequência de consenso. Estes métodos para intensificar a expressão de genes enzimáticos são descritos no WO00/18935, EP 1010755 A e assim por diante.

Os métodos específicos para comunicar uma capacidade de produção de L-aminoácido às bactérias e às bactérias comunicadas com a capacidade de produção de L-aminoácido são exemplificados abaixo. Bactérias produtoras de L-treonina

Os exemplos de micro-organismos tendo capacidade e produção de L-treonina incluem bactérias em que um ou mais tipos de atividades de enzimas biossintéticas de L-treonina são intensificadas. Os exemplos de enzimas biossintéticas de L-treonina incluem aspartocinase III (1ysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartocinase I (thrA), homosserina cinase (thrB), treonina sintase (thrC) e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). Os nomes dos genes que codificam quanto às enzimas respectivas são mencionados nos parênteses após os nomes das enzimas (o mesmo deve aplicar-se por toda esta especificação). Entre estas enzimas, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartocinase I, homosserina cinase, aspartato aminotransferase e treonina sintase são particularmente preferidos. Os genes que codificam quanto a enzimas biossintéticas de L-treonina podem ser introduzidos em uma bactéria Escherichia que tem uma capacidade aumentada para decompor treonina. Os exemplos de uma tal bactéria de Escherichia tendo uma capacidade diminuída para decompor treonina inclui a cepa TDH6 que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (Patente Japonesa Aberta ao Público N° 2001346578), e assim por diante.

As atividades enzimáticas das enzimas biossintéticas de Ltreonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Portanto, para a construção de cepas produtoras de L-treonina, é desejável modificar os genes das enzimas biossintéticas de L-treonina de modo que as enzimas sejam

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 18/126 dessensibilizadas para a inibição de regeneração por L-treonina. Os genes de thrA, thrB e thrC já mencionados constituem o operon de treonina, que contém uma estrutura atenuadora. A expressão do operon de treonina é inibido por isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimido por atenuação. portanto, a modificação mencionada acima pode ser atingida pela remoção da sequência líder ou atenuador na região de atenuação (refere-se a Lynn, S.F., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, and Gardner, J.E., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993;

WO2005/049808).

O promotor natural do operon de treonina está presente a montante do operon de treonina. Este pode ser substituído por um promotor não natural (refere-se ao WO98/04715) ou um operon de treonina que foi codificado de modo que a expressão de um gene de biossíntese de expressão de uma biossíntese de treonina é controlado pelo repressor e pelo promotor de λ-fago pode ser construído (EP 0593792 B). Além disso, a fim de modificar uma bactéria de modo que esta seja dessensibilizada para a inibição de regeneração por L-treonina, uma cepa resistente a a-amino-βhidroxiisovalérico (AHV) pode ser selecionado.

É preferido que o número de cópia do operon de treonina que é modificado para dessensibilizar para a inibição de regeneração por L-treonina como descrito acima seja aumentado em um hospedeiro ou quantidade de expressão do operon de treonina é aumentado pela sua ligação a um promotor potente. O número de cópias pode ser aumentado, além da amplificação usando-se um plasmídeo, pela transferência do operon de treonina a um genoma usando-se um transposon, Mu-fago ou semelhante.

Outra que não a expressão crescente dos genes de enzima biossintética de L-treonina, a expressão dos genes envolvida na via glicolítica, ciclo de TCA ou cadeia respiratória, o gene que regula a expressão destes genes ou os genes envolvidos na absorção de açúcar também podem ser

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 19/126 aumentados. Os exemplos de tais genes eficazes na produção de treonina incluem o gene de transidrogenase (pntAB, EP 733712 B), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC, WO95/06114), gene de fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 B) e um gene de piruvato carboxilase de bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (WO99/18228, EP 1092776 A).

A intensificação a expressão de um gene que comunica resistência a L-treonina ou resistência a L-homosserina, ou comunicação de resistência a L-treonina ou resistência a L-homosserina ao hospedeiro é preferida. Os exemplos de genes que comunicam tal resistência incluem rhtA (Res. Microbiol., 154:123-135 (2003)), rhtB (EP 0994190 A), rhtC (EP 1013765 A), yfiK e yeaS (EP 1016710 A). Como para os métodos para a comunicação de resistência a L-treonina a um hospedeiro, os métodos descritos em EP 0994190 A e WO90/04636 podem ser referidos.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar tais bactérias incluem, mas não limitam-se a, cepas que pertence ao gênero Escherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U. S. N° 5.175.107 e 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U. S. N° 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U. S. N° 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U. S. N° 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (Patente U. S. N° 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) e assim por diante.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, bem como sendo assimiladora de sacarose e o seu gene ilvA tem uma mutação fraca. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que comunica resistência uma concentração alta de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 abriga o plasmídeo pVIC40, que é obtido pela inserção do operon thrA*BC contendo

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 20/126 um gene thrA mutante no vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA mutante codifica quanto à aspartocinase homosserina desidrogenase I que é substancialmente dessensibilizado para a inibição de regeneração por treonina. A cepa B-3996 foi depositado em 19 de novembro de 1987 no AllUnion Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia) sob o número de acessão RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (I Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) em 7 de abril 1987 sob o número de acessão VKPM B-3996.

O E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) também pode ser usada como uma bactéria que produz L-treonina ou uma cepa precursora para a sua derivação. A cepa B-5318 é prototrófica com respeito à isoleucina e um repressor C1 de λ-fago sensível à temperatura e o promotor PR substitui a região reguladora do operon de treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada como um depósito internacional no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) em 3 de maio de 1990 sob o número de acessão de VKPM B-5318.

O gene de thrA que codifica quanto a aspartocinase homosserina desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 337 a 2799, acessão GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrA localiza-se entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K12. O gene thrB que codifica quanto a homosserina cinase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 2801 a 3733, acessão GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrB localiza-se entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica quanto a treonina sintase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 3734 a 5020, acessão GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrC localiza-se entre os genes thrB e a estrutura de leitura aberta yaaX no cromossomo de E.

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 21/126 coli. K-12. Todos os três genes funcionam como um operon de treonina simples. Para intensificar a expressão do operon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida a partir do operon (WO2005/049808, WO2003/097939).

Um gene thrA mutante que codifica quanto a aspartocinase homosserina desidrogenase I resistente à inibição de regeneração por treonina, bem como os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon simples do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli VKPM B-3996. o plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na Patente U. S. N° 5,705,371.

O gene rhtA está presente em 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon ginHPQ, que codifica os componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORF1 (gene ybiF, números de nucleotídeo 764 a 1651, número de acessão GenBank AAA218541, gi:440181) e localiza-se entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa a proteína codificada pelo ORP1 é referida como o gene rhtA (rht: resistente a homosserina e treonina). Também foi revelado que a mutação de rhtA23 é uma substituição de A-no lugar de-G na posição -1 com respeito ao códon de partida ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California 24 a 29 de agosto de 1997, Abstract No. 457, EP 1013765 A).

O gene asd de E. coli já foi elucidado (números de nucleotídeo 3572511 a 3571408, acessão GenBank NC 000913.1, gi:16131307) e podem ser obtidos por PCR (refere-se a White, T.J. et al., Trends Genet, 5, 185 (1989)) utilizando-se os iniciadores preparados na base da sequência de nucleotídeo do gene. Os genes asd de outros micro-organismos pode ser obtidos de uma maneira similar.

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O gene aspC de E. coli também já foi elucidado (números de nucleotídeo 983742 a 984932, acessão GenBank NC 000913.1, gi:16128895) e podem ser obtidos por PCR. Os genes aspC de outros micro-organismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.

Bactérias produtoras de L-Lisina

Os exemplos de Bactérias produtoras de L-lisina que pertencem ao gênero Escherichia incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-lisina inibem o desenvolvimento de bactérias Escherichia, mas esta inibição é total ou parcialmente dessensibilizada quando a L-lisina está presente no meio. Os exemplos destes análogos de L-lisina incluem, mas não limitam-se a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metillisina, α-clorocaprolactam, e assim por diante. Os mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se as bactérias de Escherichla a tratamentos de mutagênese artificiais convencionais. Os exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para a produção de L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente U. S. N° 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes micro-organismos, a inibição de regeneração de aspartocinase por L-lisina é dessensibilizado.

Os exemplos de Bactérias produtoras de L-lisina e as cepas precursoras que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de Llisina também incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas biossintéticas de L-lisina é/são intensificadas. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não limitam-se a, diidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase (lysC), diidrodipicolinate redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (1ysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente U. S. N° 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenease (asd), diaminopimelato epimerase (dapF), tetrahydrodipicolinato succinilase (dapD), succinil diaminopimelato deacilase

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 23/126 (dapE) e aspartato (aspA) (EP 1253195 A). Entre estas enzimas, a diidrodipicolinato redutase, diaminopimelato descarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenease, tetraidrodipicolinato succinilase e succinil diaminopimelato desacilase sãoparticularmente preferidos. Além disso, as cepas precursoras pode expressar níveis aumentados do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente U. S. N° 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), que é um gene para a secreção de L-lisina ou combinações destes.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de Llisina também incluem as cepas em que a atividade de uma enzima sque catalisa uma reação de um outro composto que não L-lisina que ramifica-se além da via biossintética de L-lisina é diminuído ou eliminado. Os exemplos de uma tal enzima catalisa uma reação para a síntese de um outro composto que não L-lisina que ramifica-se além da via biossintética de L-lisina incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente U. S. N° 5.827.698) e a enzima málica (WO2005/010175).

Um exemplo preferido de cepa produtora de L-lisina-é E. coli WC196AcadAAldcC/pCABD2 (WO2006/078039). Esta cepa foi obtida pela introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes da enzima de biossíntese (Patente U. S. N° 6.040.160) na cepa WC196, em que os genes cadA e IdcC que codificam quanto a lisina descarboxilase são interrompidos. A cepa WC196 foi criada a patir da cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, pela substituição do gene lysC do tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 com um gene lysC mutante que codifica uma aspartocinase III mutante dessensibilizada à inibição de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 24/126 regeneração por L-lisina em que a treonina na posição 352 foi substituída por isoleucina (Patente U. S. N° 5.661.012) e que confere resistência a AEC à cepa resultante (Patente U. S. N° 5.827.698). A cepa WC196 foi denominada Escherichia coli AJ13069 e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 6 de dezembro de 1994 e indicado um número de acessão de FERM P-14690. Então, o depósito foi convertido a um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e indicado um número de acessão de FERM BP-5252 (Patente U. S. N° 5.827.698). A cepa WC196AcadAAldcC por si também é uma cepa produtora de L-lisina preferida. A cepa WC196AcadA11dcC foi denominada Escherichia coli AJ110692 e foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste e indicado um número de acessão FERM BP-11027.

O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli, que foi mutado para codificar diidrodipicolinato sintase (DDPS) dessensibilizado para a inibição da regeneração por L-lisina, um gene mutante 1ysC derivado de Escherichia coli, que foi mutado para codificar aspartocinase III dessensibilizada para a inibição da regeneração por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli que codifica quanto a diidrodipicolinato redutase e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum que codifica quanto a diaminopimelato desidrogenase (WO95/16042, WO01/53459).

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Bactérias produtoras de L-Metionina

Como uma bactéria produtora de L-metionin, uma bactéria de Escherichia deficiente no repressor (metJ) do sistema de biossíntese de Lmetionina e tendo uma atividade de homosserina transsuccinilase intracelular intensificada (metA) ou tendo uma atividade de S-adenosilmetionina sintase atenuada (meta) pode ser usada (Patente Japonesa N° 04110641).

L-triptofano, L-fenilalanina e L-tirosina são todos aminoácidos aromáticos e dividem uma via de biossíntese comum. Os exemplos dos genes que codificam as enzimas biossintéticas para estes aminoácidos aromáticos incluem genes de desoxiarabino-heptulosonato fosfato sintase (aroG), corismato mutase/prefenato desidratase (pheA), 3-desidroquinato sintase (aroB), ácido shikímico desidratase (aroE), shikimato cinase (aroL), 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (aroA) e corismato sintase (aroC) (FP 763127 A). E é conhecido que estes genes são controlados pelo repressor de tirosina (tyrR) e assim a atividade de uma enzima biossintética de aminoácido aromático também pode ser aumentado pela anulação do gene tyrR (ver EP 763127 B).

Além disso, a 3-desóxi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintetase (aroF, aroG) é submetido à inibição de regeneração por aminoácidos aromáticos. Portanto, a enzima pode ser modificada de modo que este não está sujeito à inibição de regeneração. Uma bactéria produtora de L-aminoácido aromático pode ser obtida, por exemplo, pela introdução de um aroF mutante que codifica quanto a uma proteína em que o ácido L-aspártico na posição 147 ou uma L-serina na posição 181, quando contado a partir do terminal N, é substituído por um outro aminoácido ou pela introdução de um gene aroG mutante codifica quanto a uma proteína em que o ácido L-aspártico na posição 146, a L-metionina na posição 147, a L-prolina na posição 150 ou a L-alanina na posição 202 ou tanto a L-metionina na posição 157 e a Lalanina na posição 219, quanto contado a partir do terminal N, são

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 26/126 substituídos por um outro aminoácido (EP 0488424 A). Além disso, a corismato mutase/prefenato desidratase também sofre de inibição de regeneração por aminoácidos aromáticos e este pode ser modificado a fim de ser dessensibilizado para a inibição de regeneração.

Os sistemas de biossíntese dos aminoácidos aromáticos incluem uma parte comum e uma cepa em que um sistema de biossíntese característico a um outro aminoácido aromático que não o L-aminoácido de objetivo é atenuado é preferivelmente usado. Por exemplo, uma cepa que produz eficientemente um L-aminoácido de objetivo pode ser obtido pelos sistemas de biossíntese de atenuação característicos da L-fenilalanina ou Ltirosina, quando o aminoácido de objetivo é L-triptofano ou pelos sistemas de biossíntese de atenuação característicos do L-triptofano ou L-tirosina, uando o aminoácido de objetivo é L-fenilalanina. A atenuação de um sistema de biossíntese pode ser fixado pela introdução de uma mutação em um gene que codifica quanto a uma enzima do sistema de biossíntese ou obtenção de uma cepa que requer um L-aminoácido sintetizado pelo sistema de biossíntese a ser atenuado usando-se um meio sintético contendo aquele L-aminoácido (Patente U. S. N° 4.371.614).

Bactéria produtora de L-triptofano

Os exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e as cepas precursoras para sua derivação incluem, mas não limitam-se a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficiente em triptofanoil-tRNA sintetase codificada por um gene trpS mutante (Patente U. S. N° 5.756.345), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B12264) deficiente em triptofanoase (Patente U. S. N° 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps em que uma capacidade de produção de fosfoenolpiruvato é intensificada (WO97/08333, Patente U. S. N° 6.319.696), e assim por diante. As bactérias produtoras de L-triptofano que pertence ao

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 27/126 gênero Escherichia tendo atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou yddG também podem ser usadas (Pedido Publicado de Patente U. S. Nos. 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 Al).

Os exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas precursoras para sua derivação também incluem cepas em que uma ou mais atividades das seguintes enzimas são intensificadas: antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato desidrogenase (serA), 3-desóxi-D-arabinoeptulosonato-7fosfato sintase (aroG), 3-desidroquinato sintase (aroB), shikimato desidrogenase (aroE), shikimato cinase (aroL), 5-enolpiruvilshikimate-3fosfato sintase (aroA), corismato sintase (aroC), prefenato desidratase, corismato mutase e triptofano sintase (trpAB) e triptofano sintase (trpAB). Tanto antranilato sintase quanto fosfoglicerato desidrogenase estão sofrendo de inibição de regeneração por L-triptofano e L-serina, e portanto uma mutação que dessensibiliza a inibição de regeneração pode ser introduzida nestas enzimas. Os exemplos específicos de cepas tendo uma tal mutação inclui E. coli. SV164 que abriga a antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante SV164(pGH5) obtida pela introdução no E. coli SV164, o plasmídeo pGH5, que contém um gene serA mutante que codifica a fosfoglycerato desidrogenase dessensibilizado pela inibição de regeneração.

A E. coli SV164(trpE8) já mencionada é uma cepa obtida pela introdução de um gene trpE mutante que codifica quanto a antranilato sintase dessensibilizada para a inibição de regeneração por L-triptofano em uma cepa deficiente de trpE, Escherichia coli KB862 (DSM7196) (WO94/08031, Patente Japonesa Aberta ao Público N° 7-507693). A cepa de E. coli SV164(pGH5) é uma cepa obtida pela introdução de um plasmídeo pGH5 (WO94/08031) contendo um gene serA5 mutante que codifica quanto a fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para a inibição da regeneração por serina na cepa SV164. A cepa E. coli SV164(pGH5) produz não apenas L-triptofano mas também L-serina (Patente U. S. N° 7.045.320).

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A cepa de E. coli KB862 já mencionada foi denominada AJ13828 e foi depositada em 21 de dezembro de 2000 no National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (correntemente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) como um depósito internacional sob as determinações do Tratado de Budapeste e indicado um número de acessão de FERM BP-7405.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas precursoras para a sua derivação também incluem uma cepa que intensificou a atividade de 3-fosfoserina fosfatase (serB) (Patente U. S. N° 4.371.614), uma cepa que intensificou a atividade de fosfoenolpiruvato carboxicinase (pckA) (WO2004/090125) e uma cepa que expressa constitutivamente o operon de maleato sintase-isocitrato liase-isocitrato desidrogenase-cinase/fosfatase (operon ace) ou cuja expressão deste operon é intensificada (WO2005/103275).

Os exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas precursoras para a sua condução também incluem cepas que foram transformadas com o operon de triptofano operon contendo um gene que codifica a antranilato sintase dessensibilizada por inibição (Pedido de Patente Aberta ao Público N° 57-71397, 62-244382, Patente U. S. N° 4.371.614). Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser comunicada pela intensificação da expressão de um gene que codifica quanto a triptofano sintase no operon de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consiste de subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB genes, respectivamente. Além disso, a capacidade produtora de L-triptofano pode ser melhorada pela intensificação da expressão do operon de isocitrato liasemalato sintase (WO2005/103275).

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Bactérias Produtoras de L-Fenilalanina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina e as cepas precursoras para a sua derivação incluem, mas não limitam-se a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tal como E. coli AJ12479 (FERM BP4796) (EP 1484410 A), E. coli AJ12739 deficiente em corismato mutase/prefenato desidratase e repressor de tirocina (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) que abriga um gene pheA34 mutante que codifica quanto a corismato mutase-prefenato desidratase dessensibilizada para a inibição de regeneração (Patente U. S. N° 5,354,672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, and NRRL B-12147 (Patente U. S. N° 4,407,952). Como uma cepa precursora, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566) que abriga gene que codifica quanto a corismato mutaseprefenato desidratase dessensibilizada para a inibição de regeneração, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBRaroG4, pACMAB] denominado como AJ12604 (FERM BP-3579) também pode ser usado (EP 488424 B1). Além disso, as bactérias produtoras de Lfenilalanina que pertence ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG também pode ser usado (Pedido Publicado de Patente U. S. Nos. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

Assim como para as bactérias produtoras de fenilalanina, por tal modificação que as bactérias incorporam sub-produtos nas células, por exemplo, pelo aumento da quantidade de expressão do gene de absorção de L-triptofano, tnaB ou mfr ou o gene de absorção de L-tirosina, tyrP, cepas que produzem eficientemente L-fenilalanina também pode ser obtidas (EP 1484410). Bactérias Produtoras de L-Tirosina

Os exemplos de bactérias produtoras de tirosina incluem

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 30/126 bactérias de Escherichia tendo um gene de prefenato desidratase tipo dessensibilizado (tyrA), cujo produto não é inibido por tirosina (EP 1616940 A).

Quando a bactéria usada para a presente invenção é criada pela recombinação genética, os genes a serem usados não são limitados aos genes tendo a informação genética descrita acima ou os genes tendo sequências conhecidas, mas também inclui variantes dos genes, isto é, genes tendo mutações conservativas, tais como homólogos dos genes ou genes artificialmente modificados, também podem ser usados contanto que as funções das proteínas codificadas não sejam degradadas. Isto é, estes podem ser genes que codificam uma sequência de aminoácido conhecida contendo uma ou mais substituições, anulações, inserções, adições ou semelhante de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições.

Embora o número do um ou diversos resíduos de aminoácido referidos aqui podem diferir dependendo da posição na estrutura tri-dimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, este pode ser preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5. A mutação conservativa é tipicamente uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição acontece mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o local de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Val, se este for um aminoácido hidrofóbico; entre Gin and Asn, se este for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se este for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ste for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se este for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. As substituições consideradas conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr no lugar de Ala, substituição de Gin, His ou Lys no lugar de Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp no lugar de Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln no lugar de Asp, substituição de Ser ou Ala

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 31/126 no lugar de Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg no lugar de Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp no lugar de Glu, substituição de Pro no lugar de Gly, substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr no lugar de His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe no lugar de Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe no lugar de Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg no lugar de Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe no lugar de Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu no lugar de Phe, substituição de Thr ou Ala no lugar de Ser, substituição de Ser ou Ala no lugar de Thr, substituição de Phe ou Tyr no lugar de Trp, substituição de His, Phe ou Trp no lugar de Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu no lugar de Val. As substituições, anulações, inserções, adições, inversões ou semelhante podem ser um resultado de uma mutação de ocorrência natural ou uma variação devido a uma diferença individual ou a uma diferença de espécies de um micro-organismo a partir do qual os genes são derivados (mutante ou variante). Tais genes podem ser obtidos, por exemplo, pela modificação de uma sequência de nucleotídeo conhecida de um gene pela mutagênese específica de local de modo que os resíduos de aminoácido nos locais específicos da proteína codificada incluam substituições, anulações, inserções ou adições de resíduos de aminoácido.

Além disso, tais genes tendo mutações conservativas como descrito acima podem codificar uma proteína, tendo uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais, particularmente preferível de 97 % ou mais, à sequência de aminoácido codificada e tendo uma função equivalente daquela da proteína do tipo selvagem.

Além disso, os códons nas sequências genéticas podem ser substituídos por outros códons que são facilmente usados no hospedeiro em que os genes são introduzidos.

Os genes tendo mutações conservativas podem ser obtidos

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 32/126 pelos métodos usualmente utilizados nos tratamentos de mutagênese com agentes de mutagênese.

Além disso, os genes podem ser um DNA que pode hibridizarse com uma sequência complementar de uma sequência genética ou uma sonda conhecidas que podem ser preparadas através de uma tal sequência complementar sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo uma função equivalente àquela do produto genético conhecido. As condições estringentes referidas aqui são condições sob as quais um híbrido específico denominado desta maneira é formado e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições estringentes incluem aqueles sob os quais os DNAs altamente homólogos hibridizam-se um com o outro, por exemplo, DNAs não menos do que 80 % homólogo, preferivelmente não menos do que 90 % homólogo, mais preferivelmente não menos do que 95 % homólogo, particularmente preferível não menos do que 97 % homólogo, hibridiza-se um ao outro e os DNAs menos homólogos do que o acima não hibridiza-se um ao outro ou condições de lavar uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração de sal e temperatura correspondente à lavagem típica da hidridização de Southern, isto é, 1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS, a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 68°C.

Como uma sonda, uma parte de uma sequência complementar de um gene também pode ser usada. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando-se oligonucleotídeos preparados na base de uma sequência genética conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo as sequências de nucleotídeo como um padrão. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado, as condições de lavagem de hibridização podem ser de 50°C, 2 x SSC e 0,1 % de SDS.

As descrições já mencionadas com respeito às variantes de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 33/126 genes são similarmente aplicadas aos genes que codificam quanto às enzimas da via de arginina succiniltransferase descritas abaixo e os outros genes mencionados neste relatório descritivo.

A bactéria usada na presente invenção pode ser qualquer bactéria contanto que uma bactéria possa assimilar um sacarídeo usado para a fermentação de aminoácido usual, tal como glicose e sacarose, é escolhida. Entretanto, é particularmente preferível uma bactéria tendo uma capacidade de assimilar glicerol ou um ácido graxo e pode ser uma bactéria tendo inerentemente uma capacidade de assimilar glicerol ou um ácido graxo, uma cepa recombinante recombinada com uma capacidade de assimilar glicerol ou um ácido graxo ou uma cepa mutante cuja capacidade de assimilar glicerol ou um ácido graxo é intensificada.

A bactéria que produz L-aminoácido da presente invenção pode ser modificada de modo que uma capacidade para assimilar glicerol seja intensificada. A capacidade de assimilar glicerol pode ser intensificada pela modificação de um gene envolvido no metabolismo de glicerol.

Assim como para os genes envolvido no metabolismo de glicerol, a fim de intensificar a capacidade de assimilar glicerol, a expressão do gene glpR (EP 1715056) pode ser atenuada ou a expressão dos genes de metabolismo de glicerol (EP 1715055 A), tais como genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gidA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa e talC pode ser intensificada. Em particular, a fim de intensificar a capacidade de assimilar glicerol, é preferido que as expressões do gene de glicerol desidrogenase (gldA), gene de diidroxiacetona cinase (dhaKLM, dak) e gene de frutose-6-fosfato aldolase (fsaB) são intensificados (WO20O8/102861).

Além disso, assim como para a glicerol cinase (glpK), é preferível usar um gene de glpK tipo dessensibilizado para a dessensibilização da inibição de regeneração por frutose-l,6-fosfato (WO2008/081959,

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WO2008/107277).

A bactéria produtora de L-aminoácido usada na presente invenção pode ser modificada de modo que uma capacidade de assimilar um hidrolisado de gorduras e óleos ou um ácido graxo é aumentada. Os exemplos de uma tal modificação incluem, por exemplo, anulação do gene que codifica quanto ao fator de transcrição FadR tendo uma capacidade de ligação de DNA que controla o metabolismo de ácido graxo que é encontrado nas bactérias Enterobacteriaceae (DiRusso, C.C. et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:86858691; DiRusso, C.C. et al., 1993, Mol. Microbiol., 7:311-322). Especificamente, o gene fadR de Escherichia coli é, por exemplo, um gene localiza-se nos números de nucleotídeo 1,234,161 a 1,234,880 da sequência genômica de cepa de Escherichia coli MG1655 registrado com Banco de Gene N° de Acesso U00096, e que codifica quanto à proteína registrada com a Banco de Gene N° de Acesso AAC74271.

A fim de intensificar a capaciudade de assimilar uma hidrolisado de gorduras e óleos ou um ácido graxo, as quantidades de expressão de um ou mais dos genes selecionados de fadA, fadB, fadI, fadJ, fadL, fadE e fadD podem ser intensificados.

O gene fadL referido na presente invenção significa um gene que codifica um transportador da membrana externa tendo uma capacidade para absorver um ácido graxo de cadeia longa, que é encontrado nas bactérias Enterobacteriaceae (Kumar, G.B. and Black, P.N., 1993, J. Biol. Chem., 268:15469-15476; Stenberg, F. et al., 2005, J. Biol. Chem., 280:3440934419). Os exemplos específicos do gene que codifica gene Fade incluem o gene que localiza-se nos números de nucleotídeo 2459322 a 2460668 da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) e o gene fadL de Escherichia coli.

O gene fadD referido na presente invenção significa um gene que codifica quanto a uma enzima tendo uma atividade de sintetase de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 35/126 acil-CoA graxo, que gera um acil-CoA graxo de um ácido graxo de cadeia longa e que o absorve através da membrana interna e que é encontrado nas bactérias Enterobacteriaceae (Dirusso, C.C. and Black, P.N., 2004, J. Biol. Chem., 279:49563-49566; Schmelter, T. et al., 2004, J. Biol. Chem., 279: 24163-24170). Os exemplos específicos de gene que codifica FadD incluem o gene que localiza-se nos números de nucleotídeo 1887770 a 1886085 (filamento complementar) da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) como o gene fadD de Escherichia coli.

O gene fadE referido na presente invenção significa um gene que codifica quanto a uma enzima tendo uma atividade de acetil-CoA desidrogenase para oxidar uma acetil-CoA graxa, que é encontrada na bactéria Enterobacteiaceae (O'Brien, W. J. E Freman. F.E. 1977, J. Bacteriol., 132:532-540; Campbell, J.W. e Cronan. J.E., 2002, J. Bacterioli.,184:37593764).

Exemplos específicos de codificação de gene para FadE incluem a localização do gene nos números de nucleotídeo 243303 a 240859 (filamento complementar) da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene de Número de Acesso N° U00096) e tendo a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 7 como o gene FadE de Escherichia coli. A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada na SEQ ID NO: 8.

O “gene FadB” referido nesta presente invenção significa a codificação do gene por uma enzima constituindo o componente α do complexo de oxidação de ácido graxo encontrado na bactéria Enterobacteriaceae e tendo quatro tipos de atividades de enoil-CoA hidratase, 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase, 3-h idroxiacil-CoA epimerase e A3-cis-A2trans-enoil-CoA isomerase (Premanik, A. et al., 1979, J. Bacteriol., 137:469473; Yang, S. Y. e Schulz, H. 1983, J. Biol. Chem. 258:9780-9785). Exemplos específicos de codificação de gene para FadB incluem a localização

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 36/126 do gene nos números de nucleotídeo 4028994 a 4026805 (filamento complementar) da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene de Número de Acesso U00096) como gene FadB de Escherichia coli.

O “gene FadA” referido na presente invenção significa a codificação do gene para uma enzima constituindo o componente β do complexo de oxidação de ácido graxo encontrado na bactéria Enterobacteriaceae e tenso a atividade de 3-cetoacil-CoA tiolase (Pramanik, A. et al., J. BCTERIOL., 137: 469-473). Exemplos específicos de codificação de gene para FadA incluem a localização de gene nos números de nucleotídeo 4026795 a 4025632 (filamento complementar) da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene de Número de Acesso U00096) como o gene FadA de Escherichia coli.

É conhecido que o FadB e o FadA formam um complexo no complexo de ácido graxo encontrado na bactéria Enterobacteriaceae, e os genes também formam a operon FadA (Yang, S.Y. et al., 1990, J. biol. Chem.,265:10424-10429). Portanto, o operon total também pode ser amplificado como o operon FadA.

A capacidade de assimilar um hidrolisado de gorduras e óleos ou um ácido graxo pode ser intensificada por intensificar a operon cyo (cyoABCDE). O “cyoABCDE” referido nesta presente invenção significa um grupo de genes que codificam as subunidades do citocromo do tipo de complexo de oxidase como uma das oxidases terminais encontradas na bactéria Enterobacteriaceae. Os códigos cyoB para a subunidade I, códigos de cyoA para a subunidade II, os códigos cyoC para a subunidade III, os códigos cyoC para a subunidade IV, cyoE para uma enzima mostrando a atividade de O sintase (Gennis, R.B. e Stewart, V., 1996, págs.217-261, I F.D. Neigdhart (ed.), Escherichia coli and Salmonella Celular and Molecular Biology/Segunda edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:11185-11192).

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 37/126

Exemplo específicos de uma codificação de gene para cyoA incluem a localização de gene nos números de nucleotídeo 4508340 a 449887 (filamento complementar) da sequência genômica do Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) como o gene cyoA da Escherichia coli. Os exemplos específicos de uma codificação de gene para cyoB incluem A localização do gene nos números de nucleotídeo 449865 a 447874 (filamento complementar) da sequência genômica do Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) como o gene cyoB DE Escherichia coli.

Exemplos específicos de uma codificação de gene para cyoC incluem a localização de gene nos números de nucleotídeo 447884 a 447270 (filamento complementar) da sequência genômica do Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) como o gene cyoC DA Escherichia coli. Exemplos específicos de uma codificação de gene para cyoD incluem A localização de genenos números de nucleotídeo 447270 a 446941 (filamento complementar) da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) como o gene cyoD da Escherichia coli. Exemplos específicos de uma codificação de gene para cyoE incluem a localização de gene localizando nos números de nucleotídeo 446929 a 446039 (filamento complementar) da sequência genômica da Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096) do gene cyoE de Escherichia coli.

A bactéria usada para a presente invenção pode ser uma cepa que foi modificada de modo que a atividade de piruvato sintase ou piruvato:NADP+ oxidoredutase é aumentada (refere-se a WO 2009/031565).

A “piruvato sintase” referida na presente invenção significa uma enzima reversivelmente catalisando a reação seguinte, que gera ácido pirúvico de acetil-CoA e CO2 na presença de um doador de elétron tal como ferrodoxina ou flavodocina (EC 1.2.7.1). Piruvato sintase pode ser abreviada como OS, e pode ser piruvato oxidoredutase designado, piruvato ferredoxina oxidoredutase, piruvato flavodexina oxidoredutase, ou piruvato

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 38/126 oxidoredutase. Como o doador de elétron, ferredoxina ou flavodexina pode ser usado.

Ferredoxina reduzida + acetil-CoA + CO2 ferredoxina oxidada + ácido pirúvico + CoA

A intensificação de atividade de piruvato sintase pode ser confirmada por preparar soluções de enzima bruta do micro-organismo antes da intensificação e o micro-organismo após a intensificação, e comparar as atividades de piruvato sintase dos mesmos. A atividade de piruvato sintase pode ser medida por, por exemplo, o método de Yoon et al. (Yoon, K. S. et al., 1997, Arch. Microbiol. 167:275-279). Por exemplo, a medição pode ser obtida pela adição de ácido pirúvico a uma mistura de reação contendo metilviologênio como um receptor de elétron, CoA, e uma solução de enzima bruta, e quantidade de medida espectroscópica de metilviologênio reduzido, que aumenta devido à descarboxilação de ácido pirúvico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir 1 pmol de metilviologen por 1 minuto. Quando a cepa precursora tem a atividade de piruvato sintase, a atividade é desejavelmente aumentada, por exemplo, preferivelmente 1,5 vezes ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, e comparação com aquele da cepa precursora. Quando a presente cepa não tem a atividade de piruvato sintase, embora seja suficiente que a piruvato sintase seja produzida pela introdução do gene da piruvato sintase, a atividade é preferivelmente intensificada até um tal ponto que a atividade enzimática pode ser medida e a atividade é preferivelmente de 0,001 U/mg (proteína celular) ou mais alta, mais preferivelmente 0,005 U/mg ou mais alta, ainda mais preferivelmente 0,01 U/mg ou mais alta. A piruvato sintase é sensível a oxigênio e à expressão da atividade e a sua medição, em geral, é frequentemente difícil (Buckel, W. and Golding, B.T., 2006, Ann. Rev. of Microbiol., 60:27-49). Portanto, quando a atividade enzimática é medida, é preferível realizar a reação

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 39/126 enzimática com a redução da concentração de oxigênio em um vaso de reação.

Quando o gene que codifica a piruvato sintase, é possível usar os genes da piruvato sintase da bactéria tendo o ciclo de TCA redutor, tal como Chlorobium tepidum e Hydrogenobacter thermophilus. Além disso, também é possível usar genes da piruvato sintase das bactérias que pertencem à família Eenterobacteriaceae incluindo Escherichia coli. Além disso, quando o gene que codifica quanto a piruvato sintase, os genes da piruvato sintase de metanogênios autotróficos tal como Methanococcus maripaludis, Methanocaldococcus jannaschii e Methanothermobacter thermautotrophicus pode ser usado.

A piruvato:NADP+ oxidorredutase referida na presente invenção significa uma enzima que catalisa reversivelmente a seguinte reação, que gera ácido pirúvico a partir de acetil CoA e CO2, na presença de um doador de elétron tal como NADPH ou NADH (EC 1.2.1.15). A piruvato:NADP⁺ oxidorredutase pode ser abreviada como PNO e pode ser denominada piruvato desidrogenase. Entretanto, a atividade de piruvato desidrogenase referida na presente invenção é a atividade para catalisar a descarboxilação oxidativa de ácido pirúvico para a geração de acetil-CoA, como descrito depois e piruvato desidrogenase (PDH) que catalisa esta reação é uma enzima diferente da piruvato:NADP⁺ oxidorredutase. A piruvato:NADP+ oxidorredutase pode usar NADPH ou NADH como o doador de elétron.

NADPH + acetil-CoA + CO2 -> NADP⁺ + ácido pirúvico + CoA

A intensificação da atividade de piruvato:NADP+ oxidorredutase pode ser confirmada pela preparação das soluções enzimáticas brutas a partir do micro-organismo antes da intensificação e do microorganismo após a intensificação e comparação com as atividades de piruvato:NADP+ oxidorredutase destes. A atividade de piruvato:NADP*

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 40/126 oxidorredutase pode ser medida, por exemplo, pelo método of Inui et al. (Inui, H., et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:9130-9135). Por exemplo, a medição pode ser atingida pela adição de ácido pirúvico à mistura de reação contendo metilviologênio oxidado como um receptor de elétron, CoA e uma solução de enzima bruta e medir espectroscopicamente a quantidade de metilviologênio reduzida, que aumenta devido à descarboxilação de ácido pirúvico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir 1 pmol de metilviologênio por 1 minuto. Quando a cepa precursora teve a atividade de piruvato:NADP* oxidorredutase, a atividade aumenta desejavelmente 1,5 vezes ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, em comparação com aquela da cepa precursora. Quando a cepa precursora não tem a atividade de piruvato:NADP+ oxidorredutase, embora seja suficiente que o piruvato:NADP+ oxidorredutase seja produzido pela introdução do gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase, a atividade é preferivelmente intensificada até um tal ponto que a atividade enzimática pode ser medida e a atividade é preferivelmente de 0,001 U/mg (proteína celular) ou mais alta, mais preferivelmente 0,005 U/mg ou mais alta, ainda mais preferivelmente 0,01 U/mg ou mais alta. A piruvato:NADP+ oxidorredutase é sensível à expressão de oxigênio e à expressão de e a sua medição é, em geral, difícil (Inui, H., et al, 1987, J. Biol. Chem., 262: 9130-9135; Rotte, C. et al., 2001, Mol. Biol. Evol., 18:710-720).

Como o gene que codifica quanto a piruvato:NADP+ oxidorredutase, é conhecido que, além do gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase de Euglena gracilis, que é um micro-organismo eucariótico fotossintético e também é classificado em protozoários (Nakazawa, M. et al., 2000, FEBS Lett., 479:155-156) e o gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase de um protista, Cryptosporidium parvum (Rotte, C. et al., 2001, Mol. Biol. Evol., 18:710-720), um gene homólogo também existe em Bacillariophyta, Tharassiosira pseudonana (Ctrnacta, V. et al., 2006, J. Eukaryot. Microbial.,

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53:225-231).

Especificamente, o gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase de Eugiena gracilis pode ser usado (Banco de Gene N° de Acesso AB021127).

O micro-organismo da presente invenção pode ser um microorganismo modificado de modo que a atividade de piruvato sintase é aumentada por uma modificação para aumentar a atividade de reciclagem do doador de elétron oxidado ao doador de elétron reduzido, que é requerido para a atividade de piruvato sintase, em comparação com uma cepa precursora, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou não modificada. Os exemplos das atividades de reciclar o doador de elétron oxidado ao doador de elétron reduzido inclui uma atividade ferredoxina-NADP+ redutase. Além disso, o micro-organismo pode ser um micro-organismo modificado de modo que a atividade de piruvato sintase é aumentada por uma tal modificação que a atividade de piruvato sintase aumenta, além da intensificação da atividade de reciclagem de doador de elétron. A cepa precursora já mencionada ser uma cepa tendo inerentemente um gene que codifica quanto à atividade recicladora de doador de elétron ou uma cepa que não tem inerentemente a atividade recicladora de doador de elétron, mas pode ser comunicada com a atividade pela introdução de um gene que codifica quanto à atividade para mostrar capacidade de produção de L-aminoácido melhorada.

A ferredoxina-NADP+ redutase significa uma enzima que catalisa reversivelmente a seguinte reação (EC 1.18.1.2).

Ferredoxina reduzida + NADP+ ferredoxina oxidada + NADPH + H⁺

Esta reação é uma reação reversível e pode gerar a ferredoxina reduzida na presença de NADPH e a ferredoxina oxidada. A ferredoxina é substituível com flavodoxina e a enzima denominada flavodoxinNADP⁺redutase também tem uma função equivalente. A existência de ferredoxin-NADP⁺ redutase é confirmada em uma ampla variedade de organismos que variam de micro-organismos aos organismos muito maiores

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 42/126 (refere-se a Carrillo, N. and Ceccarelli, E.A., 2003, Eur. J. Biochem., 270:1900-1915; Ceccarelli, E.A. et al., 2004, Biochim. Biophys. Acta., 1698:155-165) e algumas das enzimas também são denominadas ferredoxinNADP⁺ oxidoredutase ou NADPH-ferredoxin oxidoredutase.

A intensificação de atividade ferredoxin-NADP⁺ redutase pode ser confirmada pela preparação das soluções de enzima bruta a partir do micro-organismo antes da modificação e micro-organismo após a modificação e comparação das atividades ferredoxin-NADP⁺ redutase destes. A atividade de ferredoxin-NADP⁺ redutase pode ser medida por, por exemplo, o método de Blaschkowski et al. (Blaschkowski, H.P. et al., 1982, Eur. J. Biochem., 123:563-569). Por exemplo, a atividade pode ser medida pelo uso de ferredoxina como um substrato para medir espectroscopicamente a diminuição da quantidade de NADPH. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como atividade para oxidação 1 qmol de NADPH por 1 minuto. Quando a cepa precursora tem a atividade de ferredoxin-NADP+ redutase e a atividade da cepa precursora é suficientemente alta, não é necessário para intensificar a atividade. Entretanto, a atividade enzimática é desejavelmente 1,5 vezes aumentada ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, como comparado aquele da cepa precursora.

Os genes que codificam a ferredoxin-NADP redutase são observados em muitas espécies biológicas e qualquer um destes mostram uma atividade na cepa que produz L-aminoácido objetivo pode ser usado. Como por Escherichia coli, o gene fpr foi identificado como um gene de flavodoxinNADP redutase (Bianchi, V. et al., 1993, 175:1590-1595). Além disso, é conhecido que, em Pseudomonas putida, um gene de redutase NADPHputidaredoxina e um gene putidaredoxina existe como um operon (Koga, H. et al., 1989, J. Biochem. (Tokyo), 106:831-836).

Exemplos de gene flavodoxin-NADP+ redutase de Escherichia

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 43/126 coli incluem o gene fpr que localiza nos números de nucleotídeo 4111749 a 4112495 (filamento complementar) da sequência genômica da cepa Escherichia coli K-12 (Banco de Gene N° de Acesso U00096). Além disso, um gene ferredoxin-NADP⁺ redutase (Banco de Gene N° de Acesso BAB99777) também é observado nos números de nucleotídeo 2526234 a 2527211 da sequência genômica de Corynebacterium glutamicum (Banco de Gene N° de Acesso BA00036).

A atividade piruvato sintase requer a presença de ferredoxina ou flavodoxina como um doador de elétron. Portanto, o micro-organismo pode ser um micro-organismo modificado de modo que a atividade de piruvato sintase é aumentada por uma tal modificação que produz a capacidade de ferredoxina ou flavodoxina ser melhorada.

Além disso, o micro-organismo também pode ser modificado de modo que a capacidade que produz ferredoxina ou flavodoxina é melhorada, além disso sendo modificada de modo que a atividade de piruvato sintase ou flavodoxin-NADP⁺ redutase e atividades de piruvato sintase são intensificadas.

Na presente invenção, ferredoxina refere-se a uma proteína ligada com um agrupador de ferro-enxofre contendo átomos de ferro não heme (Fe) e átomos de enxofre e denominado 4Fe-4S, 3Fe-4S ou agrupador 2Fe-2S e que as funções como um carregador de elétron. A flavodoxina refere-se a uma proteína contendo FMN (flavin-mononucleotídeo) como um grupo protético e que funciona como um ou dois carregadores de elétrons. A ferredoxina e flavodoxina são descritas na referência de McLean et al. (McLean K.J. et al., 2005, Biochem. Soc. Trans., 33:796-801).

As cepas precursoras a serem submetidas à modificação podem ser cepas que inerentemente tem um gene endógeno que codifica ferredoxina ou flavodoxina. Alternativamente, as cepas precursoras podem ser cepas que não inerentemente tem um gene que codifica ferredoxina ou

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 44/126 flavodoxina, mas podem ser concedidas com uma atividade pela introdução de ferredoxina ou gene de flavodoxina para mostrar a capacidade de produção de L-aminoácido melhorada.

O melhoramento da capacidade que produz ferredoxina ou flavodoxina como comparado à cepa precursora tal como uma cepa de tipo selvagem ou cepa não modificada pode ser confirmado por, por exemplo, SDS-PAGE, eletroforese bi-dimensional ou Western blotting usando anticorpos (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). O grau de aumento da quantidade de produção não é particularmente limitada de modo como este aumenta como comparado aquele de uma cepa de tipos selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, desejavelmente aumentar, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, preferivelmente 2 vezes ou mais, mais preferivelmente 3 vezes ou mais, como comparado aquele de um tipo selvagem ou cepa não modificada.

As atividades de ferredoxina e flavodoxina podem ser medidas pela adição deste a um sistema de reação de redução de oxidação apropriada. Por exemplo, um método que compreende a redução de ferrodoxina produzida com ferredoxin-NADP⁺ redutase e quantificação de redução de citocromo C pela ferredoxina reduzida produzida é divulgada por Boyer et al. (Boyer, M.E. et al., 2006, Biotechnol. Bioeng., 94:128-138). Além disso, a atividade de flavodoxina pode ser medida pelo mesmo método usando flavodoxin-NADP⁺ redutase.

Os genes que codificam ferredoxina ou flavodoxina são amplamente distribuídas e qualquer um daqueles podem ser usados de modo como codificados por ferredoxina ou flavodoxina podem ser utilizados por piruvato sintase e um doador de sistema de reciclagem de elétron.

Por exemplo, em Escherichia coli, o gene fdx existe como um gene que codifica ferredoxina tendo um agrupador 2Fe-2S (Ta, D.T. and

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Vickery, L.E., 1992, J. Biol. Chem., 267:11120-11125) e o gene yfhL é esperado como um gene que codifica a ferredoxina tendo um agrupador 4Fe4S. Além disso, como o gene de flavodoxina, a presença do gene fidA (Osborne C. et al., 1991, J. Bacteriol., 173:1729-1737) e a presença do gene fldB (Gaudu, P. and Weiss, B., 2000, J. Bacteriol., 182:1788-1793) são conhecidos. Na sequência genômica de Corynebacterium glutamicum (Banco de Gene N° de Acesso BA00036), genes de ferredoxina múltiplos, fdx (Banco de Gene N° de Acesso BAB97942) foram observados nos números de nucleotídeo de 562643 a 562963 e o gene fer foi observado nos números de nucleotídeo de 1148953 a 1149270 (Banco de Gene N° de Acesso BAB98495). Além disso, no Chlorobium tepidum, muitos genes de ferredoxina existem e ferredoxina I e ferredoxin II foram identificadas como genes para a ferredoxina tipo 4Fe-4S, que servem como auxiliares de elétron de piruvato sintase (Yoon, K.S. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:4402744036). Os genes de ferredoxina ou flavodoxina de bactéria tendo o ciclo TCA redutor, tal como Hydrogenobacter thermophilus, também pode ser usado.

Os exemplos específicos do gene de ferredoxina de Escherichia coli incluem o gene fdx localizando nos números de nucleotídeo de 2654770 a 2655105 (filamento complementar) da sequência genômica da cepa de Escherichia coli K-12 (Banco de Gene N° de Acesso U00096) e o gene yfhL localizando nos números de nucleotídeo de 2697685 a 2697945 do mesmo. Exemplos do gene de flavodoxina de Escherichia coli incluem o gene fldA localizando nos números de nucleotídeo de 710688 a 710158 (filamento complementar) da sequência genômica da cepa de Escherichia coli K-12 (Banco de Gene N° de Acesso U00096) e o gene f1dB localizando nos números de nucleotídeo 3037877 a 3038398 do mesmo.

Exemplos do gene de ferredoxina de Chlorobium tepidum incluem o gene de ferredoxin I localizando nos números de nucleotídeo de

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1184078 a 1184266 na sequência genômica de Chlorobium tepidum (Banco de Gene N° de Acesso NC_002932) e o gene de ferredoxina II localizando nos números de nucleotídeo de 1184476 a 1184664 do mesmo. Exemplos ainda incluem o gene de ferredoxina de Hydrogenobacter thermophilus (Banco de Gene N° de Acesso BAE02673) e o gene de ferredoxina de Sulfolobus solfataricus indicados com os números de nucleotídeos de 2345414 a 2345728 na sequência genômica de Sulfolobus solfataricus. Além disso, o gene pode ser aquele clonado de bactéria Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobacter, Thermoproteus, Pyrobaculum ou outros na base da homologia aos genes exemplificados acima, ou aqueles clonados de γproteobactéria tal como aquele do gênero Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia e Yersinia, bactéria coryneform tal como Corynebacterium glutamicum e Brevibacterium lactofermentum, bactéria Pseudomonas tal como Pseudomonas aeruginosa, bactéria Mycobacterium tal como Mycobacterium tuberculosis, e assim por diante.

<1-2> Diminuição da atividade de enzima na via de arginina succiniltransferase

À seguir, a modificação para a diminuição da atividade ou atividades de um ou dois ou mais tipos de enzimas da via de arginina succiniltransferase serão explicados.

Na presente invenção, a via de arginina succiniltransferase refere-se a uma via que consiste da seguinte reação, em que a arginina é decomposto para gerar glutamato e succinato em cinco etapas (daqui em diante também refere-se em uma via AST).

Arginina + succinil co-enzima A + α-cetoglutarato + NAD⁺2 glutamatos + succinato + CoA + 2NH3 + CO2 + NADH + 2H⁺Especificamente, a reação é catalisada como as cinco seguintes etapas de reação.

1) AstA (arginina succiniltransferase, EC 2.3.1.109) L-

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Arginina + succinil-CoA -> N²-succinil-L-arginina + co-enzima A

A arginina succiniltransferase também é referida como arginina N-succiniltransferase, arginina e ornitina N²-succiniltransferase, succinil-CoA:L-arginina 2-N-succiniltransferase, AST ou AOST (J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, N°. 16, 4278-4286).

1) AstA é codificado pelo gene astA (sinônimos: ECK1745, b1747, ydjV). Como o gene astA de Escherichia coli, aqui pode ser exemplificado um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N°: 1, que localiza como os números de nucleotídeos 1827755 a 1828789 na sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096). A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada como SEQ ID N°: 2. A atividade enzimática de uma arginina succiniltransferase pode ser medida por referir ao método de Wauven C.V. et al. (Arch. Microbiol., 1988, 150:400-404).

2) AstB (succinilarginina diidrolase, EC 3,5.3.23) N²-succinil-

L-arginina + 2H₂O N²-succinil-L-ornitina + 2 amônia + CO₂

A succinilarginina diidrolase também é referida como arginilsuccinato diidrolase, N-succinilarginina diidrolase, N²-succinilarginina diidrolase, arginina succinilidrolase, 2-N-succinil--L--arginina iminoidrolase, ou SAD (J. Bacteriol., 1998, Vol. 180, N°. 16, 4278-4286).

O AstB é codificado pelo gene astB (sinônimos: ECK1743, b1745, ydjT). Como o gene astB de Escherichia coli, pode ser exemplificado um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N°: 3, que localiza como os números de nucleotídeos 1824940 a 1826283 da sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096). A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada como SEQ ID N°: 4. A atividade enzimática da succinilarginina diidrolase pode ser medida por referir ao método de Tocilj A. et al. (J. Biol. Chem., 2005, 280:1580015808).

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3) AstC (succinilornitina aminotransferase, EC 2.6.1.81)

N²-Succinil-L-ornitina + 2-oxoglutarato N²-succinil-L-glutamato 5-semialdeído + L--glutamato

A succinilornitina aminotransferase também é referida como succinilornitina transaminase, N²-succinilornitina 5-aminotransferase, 2-Nsuccinil-L-ornitina:2-oxoglutarato 5-aminotransferase, ou SOT.

O AstC é codificado pelo gene astC (sinônimos: ECK1746, ydjW, b1748, argM, cstC, ydhW). Especificamente, como o gene astC, pode ser exemplificado um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N°: 5, que localiza como os números de nucleotídeos 1828786 a 1830006 na sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096). A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada como SEQ ID N°: 6. A atividade enzimática de succinilornitina aminotransferase pode ser medida por referir ao método de Schneider B.L. et al. (J. Bacterial., 1998, 180:4278-4286).

4) AstD (succinilglutamato-semialdeído desidrogenase, EC 1.2.1.71)

N²-succinil-L-glutamato 5-semialdeído + NAD+ + H2O

N²-succinilglutamato + NADH + 2H⁺

O succinilglutamato-semialdeído desidrogenase também é referido como succinilglutamic semialdeído desidrogenase, Nsuccinilglutamato 5-semialdeído desidrogenase ou SGSDH.

O AstD é codificado pelo gene astD (sinônimos: ECK1744, b1746, ydjU). Como o gene astD de Escherichia coli, pode ser exemplificado um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N°: 7, que localiza como os números de nucleotídeos 1826280 a 1827758 na sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096). A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada como SEQ ID N°: 8.

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A atividade enzimática de succinilglutamatosemialdeído desidrogenase pode ser medida por referir ao método de Schneider B.L. et al. (J. Bacteriol., 1998, 180:4278-4286).

5) AstE (succinilglutamato desuccinilase, EC 3,5.1.96)

N²-Succinilglutamato + H2O succinato + L-glutamato

O succinilglutamato desuccinilase também é referido como N²-succinilglutamato desuccinilase ou SGDS.

O AstE é codificado pelo gene astE (sinônimos: ECK1742, b1744, ydjS). Especificamente, como o gene astE de Escherichia coli, pode ser exemplificado um gene tendo a sequência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N°: 9, que localiza como os números de nucleotídeos 1823979 a 1824947 na sequência genômica de Escherichia coli (Banco de Gene N° de Acesso U00096). A sequência de aminoácido codificada por este gene é mostrada como SEQ ID N°: 10. A atividade enzimática de succinilglutamato desuccinilase pode ser medida por referir-se ao método de Itoh Y. et al., 1: J. Bacteriol., 1997 Dec., 179(23):7280-90.

Como por Escherichia coli, por exemplo, exemplos das enzimas da via AST incluem proteínas tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8 ou 10. Entretanto, estes podem ser aqueles tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos, mas incluindo uma mutação conservativa, de modo que as funções das proteínas não foram mudadas. Isto é, estas podem ser proteínas tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8 ou 10, incluindo substituições, anulações, inserções, adições ou outros de um ou diversos resíduos de aminoácidos.

Embora o número de “um ou diversos” resíduos de aminoácidos referidos neste podem diferenciar dependendo das posições na estrutura tri-dimensional da proteína ou os tipos de resíduos de aminoácidos, especificamente, estes podem ser, por exemplo, 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5. A mutação conservativa é tipicamente uma

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 50/126 substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição acontece mutualmente entre Phe, Trp, e Tyr, se o local de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Val, se este é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se este é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se este é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se este é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se este é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. As substituições consideradas substituições conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr no lugar de Ala, substituição de Gln, His ou Lys no lugar de Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp no lugar de Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln no lugar de Asp, substituição de Ser ou Ala no lugar de Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg no lugar de Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp no lugar de Glu, substituição de Pro no lugar de Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr no lugar de His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe no lugar de Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe no lugar de Leu, substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg no lugar de Lys, substituição de Ile, Lou, Val ou Phe no lugar de Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu no lugar de Phe, substituição de Thr ou Ala no lugar de Ser, substituição de Ser ou Ala no lugar de Thr, substituição de Phe ou Tyr no lugar de Trp, substituição de His, Phe ou Trp no lugar de Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu no lugar de Val. As substituições, anulações, inserções, adições, inversões de aminoácidos ou outros podem ser um resultado de uma mutação de ocorrência natural ou variação devido a uma diferença individual ou diferença das espécies de um micro-organismo a partir de que os genes são derivados (mutante ou variante). Tais genes podem ser obtidos por, por exemplo, modificação de uma sequência de nucleotídeo conhecida de um gene pela mutagênese específica local de modo que os resíduos de aminoácidos nos locais específicos da proteína codificada incluem substituições, anulações, inserções, ou adições de resíduos de aminoácidos.

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Além disso, os genes codificados para as enzimas da via AST podem ser um DNA que podem hibridizar com uma sequência complementar da sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 1, 3, 5, 7 ou 9, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência de nucleotídeo sob condições estringentes, de modo como codificam no lugar de arginina succiniltransferase, succinilarginina diidrolase, succinilornitina aminotransferase, succinilglutamato semialdeído desidrogenase ou succinilglutamato desuccinilase. As condições estringentes são condições sob o qual um híbrido específico denominado é formado e um híbrido não específico não é formado. Exemplos das condições estringentes incluem aqueles sob o qual os DNAs altamente homólogo hibridiza a cada outro, por exemplo, DNAs não menos do que 90 % homólogo, preferivelmente não menos do que 95 % homólogo, mais preferivelmente não menos do que 97 % homólogo, particularmente preferivelmente não menos do que 99 % homólogo, hibridizar a cada outro e DNAs menos homólogo do que o acima não hibridizam a cada outro e condições de lavagem uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração salina e temperatura correspondente a lavagem na hibridização Southern típica, isto é, 1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 68°C.

Como a sonda, uma parte da sequência complementar dos genes também podem ser usados. Uma tal sonda pode ser preparado por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base de uma sequência gene conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a sequência de nucleotídeos como um modelo. Embora o comprimento da sonda é adequadamente escolhido dependente das condições de hibridização, é usualmente 100 bp a 1 kbp. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usada como a sonda, as condições de lavagem de hibridização pode ser 50°C, 2 x SSC e 0,1 % de SDS.

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A frase modificado de modo que atividade de uma enzima da via AST é diminuído significa que a atividade da enzima da via AST ppor célula de uma bactéria tornar-se inferior do que aquele de uma cepa não modificada, tal como uma cepa de tipo selvagem, de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae. Este significa, por exemplo, que o número de moléculas da enzima por célula é diminuída como comparado aquele do precursor ou cepa de tipo selvagem, ou aquele da atividade da enzima por molécula é diminuída como comparado aquele do precursor ou cepa de tipo selvagem. A atividade enzimática por célula pode ser comparada em comparação de uma atividade enzimática nos extratos celulares da cepa de tipo selvagem ou cepa precursora e uma cepa modificada cultivada sob a mesma condição. O termo diminuição da atividade incluem desaparecimento completo da atividade. A enzima de que a atividade é diminuída pode ser qualquer um de AstA, AstB, AstC, AstD e AstE e pode consistir de um ou dois ou mais tipos destes. É preferível diminuir a atividade de uma enzima no lado a montante da via AST e este é particularmente preferível modificar de modo que pelo menos a atividade de AstA é diminuída.

A frase atividade de uma enzima da via AST é diminuída significa que a atividade da enzima da via AST em cada célula de uma cepa modificada de uma bactéria é diminuída a 50 % ou menos, preferivelmente 30 % ou menos, mais preferivelmente 10 % ou menos, da atividade de uma cepa não modificada, tal como a cepa de tipo selvagem. Exemplos da cepa de tipo selvagem de Escherichia bacterium que serve como um objeto de comparação incluem, por exemplo, a cepa Escherichia coli MG1655 e assim por diante. Diminuição das atividades enzimáticas pode ser medido pelos métodos descritos acima.

A modificação para a diminuição da atividade de uma enzima da via AST pode ser atingida por, especificamente, parcialmente ou

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 53/126 totalmente anula-se o gene astA, astB, astC, astD ou astE em um cromossomo, ou modificação de uma expressão da sequência controle tal como um promotor ou a sequência Shine-Dalgarno (SD) do gene ou um operon incluindo o gene. A diminuição da expressão inclui a diminuição da transcrição e diminuição da tradução. Além disso, a expressão dos genes também podem ser diminuídos pela modificação de uma região não traduzida outra do que a expressão da sequência controle. O gene total bem como as sequências em ambos lados do gene no cromossomo pode ser anulado. Além disso, a modificação também pode ser ligada pela introdução de uma mutação para a substituição de aminoácido (mutação missentido), um códon de interrupção (mutação não sentido), ou uma mutação de mudança de estrutura que adiciona ou anula um ou dois nucleotídeos na região codificadora do gene alvo no cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 1997, 272:8611-8617; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1998, 95 55115515; Journal of Biological Chemistry, 1991, 266, 20833-20839).

É estimado que, em Escherichia coli, os genes codificados para as enzimas da via AST constituem a estrutura de operon astCADBE contendo os genes estruturais astC, astA, astD, astB e astE nesta ordem e inícios de transcrição a partir do promotor localizando a montante de astC (Schneider, B.L. et al., J. Bacteriol., 1998, 180, 4278-4286).

Consequentemente, se uma mutação não sentido ou uma mutação de mudança de estrutura é introduzida em um gene a montante, genes a jusantes não podem ser normalmente expressados e, portanto, a fim de diminuir as atividades de dois ou mais grupos de enzimas da via AST, é preferível introduzir a mutação não sentido, mutação de mudança de estrutura ou mutação de anulação em uma região a judante do operon, por exemplo, a região de controle de expressão do operon ast, ou a região codificadora do gene astC ou astA. Por exemplo, é estimado que, se uma mutação é introduzida no gene astA, as atividades de AstD, AstB e AstE também são

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 54/126 diminuídos, além disso a uma atividade de AstA. A fim diminuir as atividades de todas as enzimas da via AST, por exemplo, é preferível introduzir uma mutação na região de controle de expressão do operon ast ou a região codificadora dos genes astCA.

A modificação de cada gene é preferivelmente ligado pela recombinação do gene. Os exemplos específicos dos métodos com base na recombinação do gene incluem parcialmente ou totalmente anulando uma expressão da sequência controle tal como uma região promotora, a região codificadora, ou uma região não codificadora de um gene alvo em um cromossomo para a utilização da recombinação homóloga e introduzir outra sequência, a mutação de mudança de estrutura, a mutação não sentido, ou uma mutação missentido nestas regiões.

A modificação de uma expressão da sequência controle é realizado por preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente preferivelmente três ou mais nucleotídeos. Quando uma região codificadora é anulada, a região a ser anulada pode ser uma região de terminal N, uma região interna ou uma região terminal C, ou ainda a região codificadora inteira, de modo como a função da proteína alvo produzido a partir do gene é diminuído ou anulado. A anulação de uma região mais longa pode usualmente mais realmente um gene alvo. Além disso, é preferido que as estruturas de leitura a montante e a jusante da região a ser anulada não são o mesmo.

Quando outra sequência é inserida em uma região codificadora de um gene alvo, a sequência pode ser inserida em qualquer região do gene e inserção de uma sequência mais longo pode usualmente mais certamente inativo do gene alvo. É preferido que as estruturas de leitura a jusante e a montante do local de inserção não são o mesmo. A outra sequência não é particularmente limitada de modo como uma sequência de que a inserção diminui ou anula a função da proteína codificada que é escolhida e exemplos

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 55/126 incluem um transposon que realiza um gene de resistência ao antibiótico, um gene útil para a produção de L-aminoácido ou outros.

Um gene alvo no cromossomo pode ser modificado como descrito acima por, por exemplo, preparando um gene de tipo de anulação do gene, em que uma sequência parcial do gene é anulada de modo que o gene de tipo de anulação não produz uma proteína que pode funcionar normalmente. Então, uma bactéria pode ser transformada com um DNA contendo um gene de tipo de anulação para causar recombinação homóloga entre o gene de tipo de anulação e o gene natural no cromossomo, que resulta na substituição do gene de tipo de anulação para o gene no cromossomo. A proteína codificada pelo gene de tipo de anulação tem uma conformação diferente a partir daquela proteína de enzima de tipo selvagem, se este ainda é produzida e deste modo a função é diminuída ou anulada. Tal rompimento do gene com base na substituição do gene utilizando a recombinação homóloga já estabelecido e exemplos incluem a integração que conduz Red (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:6640-6645), métodos usando um DNA linear tal como o método de utilizar a integração que conduz Red em combinação com um sistema de excisão derivado do fago (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacterial., 2002, 184:5200-5203) {refer to WO2005/010175), métodos usando um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura ou um plasmídeo capaz da transferência conjugada, métodos utilizando um vetor suicida sem uma origem de replicação em um hospedeiro (Patente U.S. N°. 6.303.383, Patente Japonesa aberta ao público N°. 05-007491) e assim por diante.

A diminuição da atividade de uma enzima na via AST é confirmado por qualquer uma dos métodos de medição da atividade enzimática descritos acima. A diminuição na quantidade de transcrição de um gene alvo pode ser confirmado pela quantidade de comparação de mRNA transcrito a partir do gene alvo com aquele observado em um tipo selvagem

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 56/126 ou cepa não modificada. Os exemplos do método para a medição da quantidade de mRNA incluem hibridização Northern, RT-PCR e assim por diante (Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). Embora a quantidade de transcrição possa ser diminuída a qualquer extensão de modo como este é diminuído como comparado aquele observado em uma cepa de tipo selvagem ou cepa não modificada, este é desejável diminuíudo a pelo menos 75 % ou menos, 50 % ou menos, 25 % ou menos, ou 10 % ou menos, aquele observado em, por exemplo, a cepa de tipo selvagem ou cepa não modificada e este é particularmente preferido que o gene não é expressado em todos.

A diminuição em quantidade de uma proteína codificada pelo gene alvo pode ser confirmado por Western blotting usando os anticorpos que ligam-se a uma proteína (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001). Embora a quantidade da proteína pode ser diminuída a qualquer extensão de modo como este é diminuído como comparado aquele observado em uma cepa de tipo selvagem ou a cepa não modificada, é desejavelmente diminuída a pelo menos 75 % ou menos, 50 % ou menos, 25 % ou menos, ou 10 % ou menos, daquele observado em, por exemplo, a cepa de tipo selvagem ou cepa não modificada e é particularmente preferido que a proteína não seja produzida em todos (a atividade foi completamente extinta).

Um gene codificado para astA, AstB, AstC, AstD ou AstE mostram a atividade baixa também pode ser obtido por submeter o gene astA, astB, astC, astD ou astE a um tratamento de mutação.

Os exemplos do método para a diminuição da atividade de uma enzima na via AST incluem, além das técnicas de manipulação genéticas anteriormente mencionadas, por exemplo, um método de tratar uma bactéria Escherichia com a irradiação ultravioleta ou um mutagênio usado para o tratamento de mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-N

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 57/126 nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso e selecionando uma cepa que mostra a atividade diminuída de uma enzima na via AST.

<2> Método para a produção de L-aminoácido da presente invenção

No método para a produção de um L-aminoácido da presente invenção, uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tem uma capacidade de produção de L-aminoácido e que foi modificada de modo que a atividade ou atividades de um ou dois ou mais tipos de enzimas da via de arginina succiniltransferase é/são diminuídos é cultivada para produzir e acumular um L-aminoácido na cultura e o L-aminoácido é coletado a partir da cultura. O L-aminoácido é preferivelmente um aminoácido da família de ácido aspártico ou um aminoácido aromático.

Como o meio a ser usado, o meio convencionalmente usado para a produção de L-aminoácidos pela fermentação usando os microorganismos podem ser usados. Isto é, meio usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e opcionalmente outros componentes orgânicos como requeridos podem ser usados. Como a fonte de carbono, sacarídeos tal como glicose, sacarose, lactose, galactose, frutose e hidrolisados de amidos; alcoóis tal como glicerol e sorbitol; e ácidos orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico pode ser usado. É especialmente preferível para usar glicose, frutose, ou sacarose como a fonte de carbono. Além disso, uma cepa não tendo capacidade de assimilação de sacarose pode ser feito em uma cepa que pode utilizar a sacarose como uma fonte de carbono pela introdução de um gene para a assimilação de sacarose (Patente U.S. N°. 5.175.107).

Na presente invenção, é preferível usar glicerol ou um ácido graxo como a fonte de carbono. Glicerol pode ser usado em qualquer concentração de modo como uma concentração adequada para a produção de L-aminoácido é escolhido. Quando o glicerol é usado como uma fonte de carbono única no meio, é preferivelmente contida no meio em uma

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 58/126 quantidade de cerca de 0,1 a 50 p/v mais preferivelmente cerca de 0,5 a 40 p/v particularmente preferivelmente cerca de 1 a 30 % p/v %. O glicerol também pode ser usados em combinação com outras fontes de carbono tal como glicose, frutose, sacarose, melados blackstrap e hidrolisado de amido. Neste caso, embora o glicerol e outras fontes de carbonos podem ser misturados em uma razão arbitrária, é desejável que a razão de glicerol na fonte de carbono deve ser 10 % em peso ou mais, mais preferivelmente 50 % em peso ou mais, ainda mais preferivelmente 70 % em peso ou mais. Preferido como outras fontes de carbonos são sacarídeos tal como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, melados blackstrap, hidrolisados de amido e uma solução de açúcar obtida por hidrólise de biomassa, alcoóis tal como etanol e ácidos orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Entre estes, glicose é preferido.

Embora a concentração inicial de glicerol no tempo de partida de cultura é preferivelmente como descrito acima, glicerol pode ser suplementado com o consumo de glicerol durante a cultura.

O glicerol a ser usado pode ser glicerol puro ou glicerol bruto. O glicerol bruto refere-se ao glicerol industrialmente produzido contendo as impurezas. O glicerol bruto é industrialmente produzido pelo contato de gorduras e óleos com água sob uma temperatura alta e pressão alta para hidrolisar estes, ou pela reação de esterificação para a produção de combustível biodiesel. O combustível biodiesel refere-se aos ésteres metílicos de ácido graxo produzidos a partir de gorduras e óleos e metanol pela reação de transesterificação e o glicerol bruto é produzido como um bioproduto desta reação (refere-se a Fukuda, H., Kondo, A. e Noda, H., J. Biosci. Bioeng., 2001, 92, 405-416). No processo de produção de combustível biodiesel, o método catalisador alcalino é usado para a transesterificação em muitos casos e os ácidos são adicionados para a neutralização. Portanto, o glicerol bruto de uma pureza de cerca de 70 a 95 % em peso, contendo água e impurezas, é produzido. O glicerol bruto produzido no processo de produção de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 59/126 combustível biodiesel contém, além da água, metanol residual e sais de alcalino tal como NaOH como um catalisador e um ácido usado para a neutralização de alcalino, tal como K2SO4, como impurezas. Embora este dependende dos fabricantes e métodos de produção, a quantidade destes sais e metanol pode atingir diversos percentuais. O glicerol bruto preferivelmente contém íons derivados de alcalino ou o ácido usado para a neutralização deste, tal como íons de sódio, íons de potássio, íons de cloreto e íons de sulfato, em uma quantidade de 2 a 7 %, preferivelmente 3 a 6 %, mais preferivelmente 4 a 5,8 %, com base no peso do glicerol bruto. Embora o metanol não podem ser contido em uma impureza, é preferivelmente contém em uma quantidade de 0,01 % ou menos.

O glicerol bruto ainda pode conter as quantidades traços de metais, ácidos orgânicos, fósforos, ácidos graxos e assim por diante. Exemplos dos ácidos orgânicos incluem ácido fórmico, ácido acético e assim por diante e embora estes não podem ser contido como impurezas, estes são preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,01 % ou menos. Como os metais traços contidos no glicerol bruto, metais traços requeridos para o desenvolvimento do micro-organismo são preferidos e exemplos incluem, por exemplo, magnésio, ferro, cálcio, manganês, cobre, zinco e assim por diante. Magnésio, ferro e cálcio são preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,00001 a 0,1 %, preferivelmente 0,0005 a 0,1 %, mais preferivelmente 0,004 a 0,05 %, ainda mais preferivelmente 0,007 a 0,01 %, em termos da quantidade total no peso do glicerol bruto. O manganês, cobre e zinco são preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,000005 a 0,01 %, mais preferivelmente 0,000007 a 0,005 %, ainda mais preferivelmente 0,00001 a 0,001 %, em termos da quantidade total.

A pureza do glicerol bruto pode ser 10 % ou mais alta, preferivelmente 50 % ou mais alta, mais preferivelmente 70 % ou mais alta, particularmente preferivelmente 80 % ou mais alta. De modo que as

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 60/126 impurezas estão dentro da faixa anteriormente mencionada, a pureza de glicerol pode ser 90 % ou mais alta.

Quando o glicerol bruto é usado, o glicerol bruto pode ser adicionado ao meio de acordo com a pureza de glicerol de modo que a quantidade de glicerol está dentro da faixa de concentração descrita acima. Tanto o glicerol quanto o glicerol bruto pode ser adicionado ao meio.

O ácido graxo refere-se a um ácido carboxílico mono valente de hidrocarboneto de cadeia longa representado pela fórmula geral CnHmCCCH (n+1 e m+1 representa o número de átomos de carbono e o número de átomos de hidrogênio contidos no ácido graxo, respectivamente). Em geral, um ácido graxo tendo 12 ou mais átomos de carbono é referido como um ácido graxo de cadeia longa em muitos casos. Existe uma variedade de ácidos graxos coma a variação de números de carbonos e variação de grau de insaturação. Também é conhecido que os ácidos graxos são constituintes de óleos e gorduras e tipos diferentes de óleos e gorduras tem as composições diferentes de ácidos graxos. O ácido mirístico (C13H27COOH) é um ácido graxo saturado tendo 14 átomos de carbono e contido no óleo de coco e óleo de palma. O ácido palmítico (C15H31C0OH) é um ácido graxo saturado tendo 16 átomos de carbono e abundantemente contido em óleo vegetais e gorduras em geral. O ácido esteárico (C17H35COOH) é um ácido graxo saturado tendo 18 átomos de carbono e abudantemente contido nas gorduras animais e óleos vegetais. Ácido oleico (C17H33C00H) é um ácido graxo insaturado monovalente tendo 18 átomos de carbono e abudantemente contido nas gorduras de animais ou óleo vegetais. O ácido linoleico (C17H31COOH) é um ácido graxo insaturado multivalente tendo 18 átomos de carbono e duas ligações duplas de cis-configuração de 9° e 12° posições. Como o ácido graxo, uma mistura de ácidos graxos de cadeia longa anteriormente mencionada também podem ser usados. Quando uma mistura de ácidos graxos é usado como uma fonte de carbono, os ácidos graxos podem ser

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 61/126 misturados qualquer razão de mistura, de modo como os ácidos graxos são misturados nas concentrações em que uma bactéria usada no método da presente invenção pode utilizar estes como as fontes de carbono. Uma mistura de ácidos graxos obtidos para remoção de glicerol a partir de um hidrolisado de óleos e gorduras também podem ser usados.

No método da presente invenção, um hidrolisado de gorduras e óleos também podem ser usados.

As gorduras e óleos consistem de ésteres de um ácido graxo e glicerol e estes também são denominados triglicerídeos. Como as gorduras e óleos, quaisquer grupos de gorduras e óleos incluindo óleos graxos, que refere-se aquele em um estado líquido em temperatura comum e gorduras, que referem-se aquele em um estado sólido na temperatura comum, pode ser usada, de modo como as gorduras e óleos hidrolisáveis são escolhidos. Além disso, qualquer uma das gorduras e óleos vegetais e gorduras e óleos animais (incluindo gorduras e óleos de peixe) podem ser usados e estes podem ser usados independentemente ou como uma combinação de dois ou mais grupos destes. As gorduras e óleos usados como um material bruto podem ser gorduras e óleos puros, ou uma mistura contendo as gorduras e óleos e substâncias do que outras gorduras e óleos. No caso de gorduras e óleos vegetais, exemplos incluem, por exemplo, um extrato vegetal contendo as gorduras e óleos e um produto de separação destes.

Exemplos de gorduras e óleos animais incluem, mas não limitados a, manteiga, banha de porco, sebo bovino, sebo de carneiro, óleo de baleia, óleo de sardinha, óleo de arenque e assim por diante. Exemplos de gorduras e óleos vegetais incluem, mas não limitados a, óleo de palma, óleo de oliva, óleo de semente de colza, óleo de soja, óleo de farelo de arroz, óleo de noz, óleo de gergelim, óleo de amendoim e assim por diante. O óleo de palma o óleo que pode ser obtido de feitos de óleo de palma e tornar-se amplamente usado como combustível biodiesel nos anos recentes e a

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 62/126 quantidade de produção deste é aumentada. O óleo de palma é um nome genérico para as plantas classificadas no gênero Elaeis da família Palmae. O óleo de palma bruto geralmente ao óleo de palma não refinado produzido nos moinhos de óleo e tal óleo de palma é comercializado como o óleo de palma bruto. As microalgas que acumulam os óleo e gorduras também são conhecidos (Chisti, Y., Biotechnol. Adv., 2007, 25: 294-306), gorduras e óleos também podem ser extraídos a partir dos corpos de algas. Os corpos de algas contêm substâncias orgânicas outras do que as gorduras e óleos tal como sacarídeos, proteínas ou aminoácidos e uma mistura contendo estes podem ser hidrolisados e usados como a fonte de carbono.

As gorduras e óleos de que as espécies de ácido graxo formados pela hidrólise podem ser assimilados por uma bactéria usada no método da presente invenção em um teor mais alto são desejáveis. Exemplos de espécies de ácido graxo de cadeia longa que podem ser assimilados por bactéria tendo uma capacidade que produz o L-aminoácido incluem ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico e assim por diante.

Um hidrolisado de gorduras e óleos usado na presente invenção refere-se a uma substância obtida por hidrolisar quimicamente ou enzimaticamente das gorduras e óleos anteriormente mencionadas e que consiste de uma mistura de ácido graxos e glicerol. Como um método de hidrólise industrial, um método de hidrólise de temperatura alta contínua em que as gorduras e óleos são conduzidos em contato com água em temperatura alta (250 a 260°C) sob uma pressão alta (5 a 6 MPa) é comumente realizada. Uma reação realizada em temperatura baixa (cerca de 30°C) pelo uso de uma enzima também é industrialmente usada (Jaeger, K.E. et al., FEMS Microbial. Rev., 1994, 15:29-63). As enzimas anteriormente mencionadas, a lipase que catalisa uma reação de hidrólise de gorduras e óleos podem ser usadas. Lipases são industrialmente enzimas importantes e usadas por várias aplicações industriais (Hasan, F. et al., Enzyme and Microbiol. Technol.,

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2006, 39:235-251). Um hidrolisado de gorduras e óleos consistem de uma mistura de ácidos graxos e glicerol e é conhecido que a razão de peso de glicerol aos ácido graxos contidos em um hidrolisado comum de gorduras e óleos tal como óleo de palma é cerca de 10 %. O hidrolisado de gorduras e óleos não é particularmente limitado de modo como um hidrolisado contendo os ácidos graxos são usados. Por exemplo, um hidrolisado de gorduras e óleos podem ser usados como este, um hidrolisado de gorduras e óleos a parte de que os ácidos graxos e glicerol é removido também pode ser usado, ou um hidrolisado de gorduras e óleos em que os ácidos graxos ou glicerol é adicionado também podem ser usados. Em um tal caso, a razão de peso de glicerol e os ácidos graxos são preferivelmente 5 a 20:100, mais preferivelmente 7,5 a 15:100.

Um ácido graxo ou hidrolisado de gorduras e óleos podem ser contidos em um meio usado no método da presente invenção em qualquer quantidade de modo como uma bactéria usado para o método da presente invenção pode assimilar. Entretanto, quando um ácido graxo ou hidrolisado de gorduras e óleos é adicionado ao meio como uma fonte de carbono única, este é preferivelmente contido em uma concentração de 10 p/v % ou menos, preferivelmente 5 p/v % ou menos, mais preferivelmente 2 p/v % ou menos e é preferivelmente contido em uma concentração de 0,2 p/v % ou mais alta, preferivelmente 0,5 p/v % ou mais alta, mais preferivelmente 1,0 p/v % ou mais alta.

Quando um ácido graxo ou hidrolisado de gorduras e óleos é usado em um meio de alimentação como uma fonte de carbono única, é preferivelmente contido em uma tal concentração que deve ser contida no meio após a alimentação em uma concentração de 5 p/v % ou menos, preferivelmente 2 p/v % ou menos, mais preferivelmente 1 p/v % ou menos e em uma concentração de 0,01 p/v % ou mais alta, preferivelmente 0,02 p/v % ou mais alta, mais preferivelmente 0,05 p/v % ou mais alta. Concentração de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 64/126 um ácido graxo pode ser medido pela cromatografia de gás (Hashimoto, K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 70:22-30) ou HPLC (Lin, J.T. et al., J. Chromatogr. A., 1998, 808:43-49).

O ácido graxo ou ácido graxo contido em um hidrolisado de gorduras e óleos a ser adicionado ao meio é desejavelmente usado como um sal metálico alcalino de sódio, potássio, ou outros, que podem ser micelizados em água. Entretanto, a solubilidade de um sal de sódio oi sal de potássio de ácido graxo não pode ser suficiente para o uso como um material bruto de fermentação. Portanto, a fim que um ácido graxo pode ser mais eficientemente assimilado pela bactéria tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido, é preferido que a emulsificação incluem uma etapa que promove a homogeneização. Por exemplo, como o método de emulsificação, adição de um intensificador de emulsificação ou um tensoativo pode ser considerado. Exemplos do intensificador de emulsificação referido neste incluem fosfolípideos e esteróis. Exemplos de tensoativo incluem, como tensoativos não iônicos, poli(oxietileno) ésteres de ácido graxo sorbitano tal como poli(oxietileno) éster do ácido mono-oleico de sorbitano (Tween 80), glicosídeos de alquila tal como n-octil R-D-glicosídeo, ésteres de ácido graxo de sacarose tal como estearato de sacarose, ésteres do ácido graxo de poliglicerina tal como éster do ácido esteárico de poliglicerina e assim por diante. Exemplos do tensoativo incluem, como tensoativos anfolíticos, N,Ndimetil-N-dodecilglicina betaína, que é em alquilbetaína e assim por diante. Além destes, tensoativos geralmente usados no campo da biologia tal como Triton X-100, éter polioxietileno(20) cetílico (Brij--58) e etoxilato nonilfenol (Tergitol NP-40) pode ser usado.

Além disso, uma operação para a promoção de emulsificação ou homogeneização de ácido graxo também é efetivo. Esta operação pode ser qualquer operação de modo como uma operação que promove a emulsificação ou homogeneização de ácido graxo é escolhido. Exemplos específicos destes

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 65/126 incluem tratamentos homogeneizador, tratamentos de homomisturador, ultrassonicação, tratamentos de alta pressão, tratamentos de temperatura alta e assim por diante. Os tratamentos homogeneizador, ultrassonicação e combinações destes são mais preferidos.

É particularmente preferível usar um tratamento com o tensoativo e homogeneizador e/ou ultrassonificação em combinação. Estes tratamentos são desejavelmente realizados sob uma condição alcalina onde os ácidos graxos são mais estáveis. Como a condição alcalina, pH não menor do que 9 é preferido e pH não menor do que 10 é mais preferido.

Como para os outros ingredientes a serem adicionados ao meio, o meio usual contendo, além disso a fonte de carbono, a fonte de nitrogênio e íons inorgânicos, bem como outros ingredientes orgânicos como requeridos podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio contido no meio usado na presente invenção, amônia, sais de amônia tal como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos e assim por diante pode ser usado. O gás de amônia ou amônia aquosa usada para o ajuste do pH também pode ser usado como a fonte de nitrogênio. Peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, líquido da maceração do milho, hidrolisado de soja e assim por diante também podem ser usado. O meio pode conter estas fontes de nitrogênio, ou dois ou mais destes. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas tanto no meio de partida quanto no meio de alimentação. Além disso, a mesma fonte de nitrogênio pode ser usado tanto no meio de partida quanto no meio de alimentação, ou fonte de nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente a partir da fonte de nitrogênio do meio de partida.

O meio usado na presente invenção preferivelmente contém uma fonte de ácido fosfórico e uma fonte de enxofre em adição à fonte de carbono e a fonte de nitrogênio. Como a fonte de ácido fosfórico, diidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássio, polímeros de

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 66/126 ácido fosfórico tal como ácido pirofosfórico e assim por diante pode ser utilizado. Embora a fonte de enxofre possa ser qualquer substância contendo átomos de enxofre, sais de ácido sulfúrico tal como sulfatos, tiossulfatos e sulfetos e aminoácidos contendo enxofre tal como cisteína, cisteína e glutationa são desejáveis e sulfato de amônia é especialmente desejável.

Além disso, o meio pode conter um fator que promove o desenvolvimento (nutriente tendo um efeito que promove o desenvolvimento) em adição a fonte de carbono, fonte de nitrogênio e fonte de enxofre. Como o fator que promove o desenvolvimento, metais traços, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos bem como peptona, ácido casamino, extrato de levedura, produto de degradação de proteína de soja e assim por diante contendo a substâncias precedentes podem ser usados. Exemplos de metais traços incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio e assim por diante. Exemplos de vitaminas incluem vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, vitamina B12 e assim por diante. Estes fatores promovem o desenvolvimento podem ser contidos no meio de partida ou meio de alimentação.

Além disso, quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido ou outros para o desenvolvimento deste é usado, é preferível suplementar um nutriente requerido ao meio. Em particular, visto que a via biossintética de L-lisina é intensificada e a capacidade de degradação de Llisina é frequentemente atenuado na bactéria que produz L-lisina que pode ser usado para a presente invenção como descrito acima, um ou mais tipos de substâncias selecionadas de L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina e Lmetionina são preferivelmente adicionados. O meio de partida e o meio de alimentação pode ter a mesma composição ou composições diferentes. Além disso, o meio de partida e o meio de alimentação pode ter a mesma composição ou composição diferente. Além disso, quando o meio de alimentação é alimentado nos estágios múltiplos, as composições do meio de alimentação alimentam os estágios podem ser o mesmo ou diferente.

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A cultura é preferivelmente realizada como cultura de aeração em uma temperatura de fermentação de 20 a 45°C, particularmente preferivelmente 33 a 42°C. A cultura é preferivelmente realizado com o controle de concentração de oxigênio a ser cerca de 5 a 50 %, desejavelmente cerca de 10 %. Além disso, pH é preferivelmente controlado ser 5 a 9. Se o pH do meio é inferior durante uma cultura, carbonato de cálcio pode ser adicionado, ou o meio pode ser neutralizado com um alcalino tal como gás de amônia e amônia aquosa. Se a cultura é realizada sob tais condições como descrito acima preferivelmente por cerca de 10 a 120 horas, uma quantidade marcada de L-aminoácido é acumulado em um meio de cultura. Embora a concentração de L-aminoácido acumulado não é limitado de modo como este á maior do que aquele observado com a cepa de tipo selvagem e este capaz de isolar e coletar do L-aminoácido a partir do meio, é preferivelmente 50 g/L ou mais alta, desejavelmente 75 g/L ou mais alta, mais desejavelmente 100 g/L ou mais alta.

Na presente invenção, a fim de manter o acúmulo de Laminoácido a ser um certo nível ou mais alta, cultura de uma bactéria pode ser realizada como cultura de semente separada e cultura principal. A cultura de semente pode ser realizada com agitação usando um frasco ou outros ou como cultura de batelada e a cultura principal pode ser realizada como cultura de batelada por alimentação ou cultura contínua ou cultura contínua. Tanto a cultura de semente quanto a cultura principal pode ser realizada como cultura de batelada.

Quando o aminoácido objetivo é um aminoácido básico, a produção pode ser realizado pelo método em que a fermentação é realizada pelo controle de pH do meio durante a cultura a ser 6,5 a 9,0 e pH do meio no final de uma cultura a ser 7,2 a 9,0 e controle da pressão no tanque de fermentação a ser positivo durante a cultura, ou pelo fornecimento do gás de dióxido de carbono ou um gás misturados contendo gás de dióxido de carbono

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 68/126 ao meio para fornecer um período de cultura onde o meio contém 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato, de modo que estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como íons contadores de cátions principalmente consiste de um aminoácido básico e o aminoácido básico objetivo é então coletado (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2002-065287).

O L-aminoácido pode ser coletado a partir do caldo de fermentação pela combinação dos métodos convencionalmente conhecidos tal como método de resina de troca de íon (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), precipitação, separação de membrana (Patente Japonesa aberta ao público N°. 9-164323 e 9-173792), cristalização (W02008/078448, WO2008/078646) e outros métodos. Quando o Laminoácido acumula-se nas células, as células podem ser interrompidas com, por exemplo, ondas ultrassônicas ou outros e o L-aminoácido pode ser coletado pelo método de resina de troca de íon ou outros a partir do sobrenadante obtido para a remoção das células a partir da suspensão de interrupção da célula pela centrifugação.

O L-aminoácido coletado por conter as células bacterianas, componentes médios, umidade e metabólitos de bioprodutos de uma bactéria em adição ao L-aminoácido objetivo. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser 50 % ou mais alta, preferivelmente 85 % ou mais alta, particularmente preferivelmente 95 % ou mais alta (Patente Japonesa N°. 1214636, Patente U.S. N°. 5.431.933, 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, Pedido Publicado de Patente U.S. N°. 2005/0025878).

Além disso, quando o L-aminoácido deposita no meio, pode ser coletado pela centrifugação, filtração ou outros. O L-aminoácido depositado no meio e L-aminoácido dissolvido no meio pode ser isolado juntos após o L-aminoácido dissolvido no meio é cristalizado.

Além disso, L-fenilalanina produzido pelo método da presente

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 69/126 invenção pode ser usado por, por exemplo, produzindo um éster de alquil inferior de α-L-aspartil-L-fenilalanina (também referido como aspartame). Portanto, a presente invenção também fornece um método para produzir um éster de alquil inferior de α-L-aspartil-L-fenilalanina usando L-fenilalanina como um material de partida. Este método compreende a etapa de sintetizar um éster de alquil inferior de α-L-aspartil-L-fenilalanina de L-fenilalanina produzido pelo método anteriormente mencionado da presente invenção e ácido aspártico ou um derivado deste. Exemplos de éster de alquil inferior incluem éster metílico, éster etílico, éster propílico e assim por diante.

O método para sintetizar um éster de alquil inferior de α-Laspartil-L-fenilalanina de L-fenilalanina e ácido aspártico ou seu derivado não é particularmente limitado, contanto que L-fenilalanina ou seu derivado é usado pela síntese do éster de alquil inferior de α-L-aspartil-Lfenilalanina. Especificamente, por exemplo, um éster de alquil inferior de α-L-aspartil-L-fenilalanina pode ser produzido pelo seguinte método (Patente U.S. N°. 3.786.039). L-Fenilalanina é esterificado para obter um éster de alquil inferior de L-fenilalanina. O éster aquil L-fenilalanina é reagido com um derivado de L-ácido aspártico de que o grupo β-carboxila é protegido e grupo α-carboxila é esterificado e portanto ativado. Exemplos de um tal derivado incluem anidreto de N-acil-L-aspártico tal como N-formil-, N-carbobenzoxi-, ou anidreto N-p-metoxicarbobenzoxiL-aspártico. Por esta reação de condensação, uma mistura de N-acil-a-Laspartil-L-fenilalanina e N-acil-e-L-aspartil-L-fenilalanina é obtido. Se a reação de condensação é realizado na presença de um ácido orgânico de que a constante dissociação de ácido a 37°C é 10^-4 ou menos, a razão do α-isômero ao β-isômero na mistura é aumentada (Patente Japonesa aberta ao público N°. 51-113841). Então, a N-acil-a-L-aspartil-L-fenilalanina é separada a partir da mistura e hidrogenada para obter um a-L-aspartil-Lfenilalanina.

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Exemplos

Em seguida, a presente invenção ainda será mais especificamente explicada com referência aos exemplos.

Exemplo 1: Construção de bactéria que produz L-lisina mostrando a atividade diminuída de enzima na via AST <1-1> Construção da cepa em que o gene astA codificado no lugar da arginina succiniltransferase é interrompido

Primeiro, pelo uso de uma cepa Escherichia coli do tipo selvagem, cepa MG1655, uma cepa que não produz arginina succiniltransferase foi construído. O PCR foi realizado pelo uso do plasmídeo pMW118(attL-Cm-attR) (descrito na Patente U.S. N°. 7.306.933) como um modelo e os oligonucleotídeos sintéticos mostrados na SEQ ID N°: 11 e 12 tendo uma sequência correspondente a ambas extremidades dos locais de ligação de fago X, attL e attR, nas extremidades finais 3' dos oligonucleotídeos e uma sequência correspondente a uma parte do gene astA como o gene alvo nas extremidades finais 5' dos oligonucleotídeos como iniciadores. Pelo uso do produto amplificado, cepa MG1655AastA::att-Cm foi construída de acordo com o método 2-red descrito na Patente U.S. N°. 7.306.933. no método X-red, uma cepa recombinante resistente a Cm foi obtida ela cultura da cepa obtida acima a 37°C como cultura de placa no meio de L-ágar contendo Cm (cloranfenicol, 40 mg/L) e selecionando uma cepa que forma uma colônia. A cepa interrompida do gene astA obtido foi indicado a cepa MG1655AastA::att-Cm. Na cepa MG1655LastA::att-Cm, uma parte da região codificadora do gene astA no genoma é substituído com o gene de resistência Cm.

<1-2> Construção de bactéria que produz L-lisina deficiente de Ast

A partir da cepa MG1655AastA::att-Cm obtido em <1-1>, lisado P1 foi obtido em uma maneira convencional. Pelo uso deste lisado By PI e uma bactéria que produz L-lisina da cepa E. Coli WC196AcadAAldcC

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 71/126 (FERM BP-11027) construída pelo método descrito no Pedido Publicado na Patente U.S. N°. 2006/0160191 como um hospedeiro, cepa

WC196AcadAAldcCAastA::att-Cm foi construída pelo método de transdução P1 usando a resistência de cloranfenicol como um marcador. Então, esta cepa foi transformada com o plasmídeo pCABD2 para a produção de L-lisina que realiza os genes dapA, dapB e 1ysC (Publicação de Patente Internacional WO01/53459) em uma maneira convencional para construir a cepa WC196AcadAAldcCAastA::att-Cm/pCABD2 como a cepa resistente a estreptomicina e resistente a cloranfenicol. A cepa recombinante resistente a estreptomicina e resistente ao cloranfenicol foi obtido prla cultura da cepa construída acima a 37°C como cultura de placa no meio de L-ágar contendo Cm (cloranfenicol, 40 mg/L) e Sm (estreptomicina, 20 mg/L) e selecionando uma cepa que forma uma colônia. Como uma cepa comparativa, a cepa WC196AcadAAldcC foi usada.

Cada uma destas cepas foi cultivada a 37°C no meio L contendo 20 mg/L de estreptomicina até o OD600 final de cerca de 0,6 foi obtido, então um volume igual de 40 % de solução de glicerol foi adicionado ao meio e a mistura foi agitada. Então, a mistura foi dividida nos volumes apropriados, armazenados a -80°C e usado como cargas de glicerol.

Exemplo 2: Avaliação de capacidade que produz L-lisina da bactéria que produz L-lisina bloqueada pela via AST

As cargas de glicerol das cepas obtidas no Exemplo 1 foram descongelados, 100 uL de cada carga foi uniformemente aplicada a uma placa L contendo 20 mg/L de estreptomicina e cultura foi realizado a 37°C por 24 horas como cultura estacionária. As células correspondentes a cerca de 1/4 das células obtidas na placa foram recolocados em suspensão em 0,5 mL da solução salina fisiológica e a turbidez foi medida em uma microonda de 600 nm pelo uso de um espectrofotômetro U-2000 (Hitachi, Ltd.). A suspensão contendo uma bactéria obtida foi inoculada em 40 mL do meio de fermentação

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 72/126 (descrito abaixo) contendo 20 mg/L de estreptomicina contido em um frasco Erlenmeyer de volume de 500 ml com defletor em um tal volume que o OD600 final tornar-se 0,2 e a cultura foi realizada a 37°C por 48 horas em um número de revolução de 200 rpm para a agitação em uma máquina de meio de cultura de agitação rotativa, InnOva 4430 (New Brunswick Scientific).

Como a fonte de carbono para a cultura principal, oleato de sódio, glicose ou glicerol foi usado e como o intensificador de emulsificação, éster de ácido monooleico poli(oxietileno)sorbitano (Tween 80, NakaraiTesque) foi adicionado em uma concentração final de 0,5 % (p/v). A quantidade de fonte de carbono total foi de 10 g/L. Este foi separadamente confirmado que Escherichia coli não deve assimilar Tween 80 pelo uso do meio mínimo M9 (refere-se ao Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.A. et al., John Wiley & Sons Inc., Nova Iorque).

A cultura foi realizada por 48 horas sob as condições anteriormente mencionadas e a quantidade de L-lisina acumulado no meio foi medido pelo uso do analisador Biotech AS310 (Sakura Seiki). O consumo da fonte de carbono total adicionada ao meio foi separadamente confirmado pelo uso de uma cromatografia de gás GC-2014 (Shimadzu) no caso do éster de ácido oleico, Biotech Analyzer AS310 no caso de glicose, ou Biotech Analyzer BF-5 (Oji Scientific Instruments) no caso de glicerol. Além disso, Tween 80 foi adicionado em uma concentração final de 1,0 % (p/v) imediatamente após o final da cultura, então o meio foi diluído e turbidez foi medido em um comprimento de onda 600 nm pelo uso de um espectrofotômetro U-2000 (Hitachi, Ltd.) para medir a quantidade celular no tempo do final de uma cultura.

A composição do meio de fermentação usada para a cultura principal é mostrado abaixo (unidade: g/L ou % (em termos de volume/volume), todos os valores são concentrações finais). Como a fonte de carbono, oleoato de sódio (primeiro grau, Junsei Chemical), glicose ou

Petição 870190027524, de 22/03/2019, pág. 73/126 reagente glicerol foi usado.

(1) Fonte de carbono 10 g/L (ajustado ao pH 7,5 com HCl e submetido a autoclave a 120°C por 20 minutos) (2) Tween 800,5 0 (esterilizado usando Nalgene 0,45 μ m filtro (Nalge)) (3) MgSO4-7H2O1 g/L (submetido a autoclave a 120°C por 20 minutos) (4) (NH4) 2SO4 16 g/L

KH2PO41 g/L

Fe SO4-7 H2O 0,01 g/L

MnSO4-4H2O 0,082 g/L

Extrato de levedura (Difco)2 g/L ((NH4) 2SO4 KH2PO4, FeSO4-7H2O, MnSO4-4H2O foram misturados, ajustados ao pH 7,5 com 120°C por 20 minutos) (5) PIPES (pH 7,5) 20 g/L (ajustado ao pH 7,5 com NaOH e submetido a autoclave a 120°C por 20 minutos)

As soluções dos ingredientes dos cinco grupos anteriormente mencionados (1) a (5) separadamente esterilizados foram misturados para preparar o meio de fermentação contendo oleato de sódio, glicose ou glicerol como a fonte de carbono.

Os resultados da cultura principal são mostrados na tabela 1 (na coluna de L-lisina (g/L), quantidades de L-lisina acumuladas no meio são indicados). Após o final da cultura, todos da fonte de carbono foram consumidas no meio. Como visto a partir dos resultados mostrados na tabela 1, a cepa deficiente por astA, WCl96AcadAAldcCAastA::att-Cm/pCABD2, mostrou as taxas de acúmulo de L-lisina significantemente melhorada com todas as fontes de carbono, como comparado a cepa

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WC196AcadAAldcC/pCABD2, que não foi deficiente no gene astA.

Tabela 1

Fonte de carbono	Cepa	L-lisina (g/L)	OD60
Oleato	WCI96AcadAAldcC/pCABD2	4,52	8,16
Oleato	WC196AcadAAldcCAastA::att- Cm/pCABD2	4,88	7,13
Glicose	WC196AcadAAldcC/pCABD2	4,09	5,21
Glicose	WC196AcadAAldcCAastA::att- Cm/pCABD2	4,25	5,50
Glicerol	WC196AcadAAldcC/pCABD2	4,22	4,37
Glicerol	WC196AcadAAldcCAastA::att- Cm/pCABD2	4,50	4,44

Explicação da listagem de sequência

SEQ ID N°: 1: Sequência de nucleotídeo do gene astA

SEQ ID N°: 2: Sequência de aminoácido de AstA

SEQ ID N°: 3: Sequência de nucleotídeo do gene astB

SEQ ID N°: 4: Sequência de aminoácido de AstB

SEQ ID N°: 5: Sequência de nucleotídeo do gene astC

SEQ ID N°: 6: Sequência de aminoácido de AstC

SEQ ID N°: 7: Sequência de nucleotídeo do gene astD

SEQ ID N°: 8: Sequência de aminoácido de AstD

SEQ ID N°: 9: Sequência de nucleotídeo do gene astE

SEQ ID N°: 10: Sequência de aminoácido de AstE

SEQ ID N°: 11: Iniciador para o rompimento astA

SEQ ID N°: 12: Iniciador para o rompimento astA

Aplicabilidade industrial

De acordo com a presente invenção, os L-aminoácidos podem ser eficientemente produzidos.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e tendo uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio para produzir e acumular L-aminoácido no meio e coletar o Laminoácido a partir do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade da arginina succiniltransferase é diminuída, em que o L-aminoácido é um aminoácido da família de ácido aspártico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a arginina succiniltransferase é uma proteína codificadas por astA.

3. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que da arginina succiniltransferase é diminuída pela diminuição da quantidade de expressão do gene astA ou pela interrupção do gene astA.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae é uma bactéria Escherichia, uma bactéria Enterobacter ou uma bactéria Pantoea.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Escherichia coli.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

5, caracterizado pelo fato de que o aminoácido da família de ácido aspártico consiste em um ou dois ou mais tipos de aminoácidos selecionados de Llisina, L-treonina e L-metionina.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio é um meio contendo um ácido graxo ou glicerol como uma fonte de carbono.