AT212491B - Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Lipoids - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Lipoids 
Es ist bekannt (vgl.   O.   Westphal und   O.   Lüderitz, Angew.   Chemie 66, [1954], S. 407 - 17), dass   Lipopolysaccharide aus gram-negativen Bakterien, insbesondere aus der Gruppe der Enterobacteriaceen, bei der Injektion am höheren Tier und am Menschen in ausserordentlich kleinen Dosen - in der Grössenordnung von   0, 001 y/kg (intravenös)-eine   Serie von Reaktionen auslösen, die   u. a.   (vgl. F. Hoff,   "Fieber-Unspezifische Abwehrvorgänge-Unspezifische   Therapie",   G. Thieme-Verlag, Stuttgart, 1957)   auch klinisch-therapeutisch von grossem Interesse sind, wie z.

   B. die Stimulierung der unspezifischen Resistenz gegen Infekte und andere Irritationen, die Stimulierung des Properdin Systems (vgl. 0. Westphal, Die   Aerztl. Fortbildung Nr. 9, [1957], S. l-5)   usw. Es konnte gezeigt werden, dass diese Wirkungen von bakteriellen Lipopolysacchariden im wesentlichen auf die Lipoid-Komponente, sogenanntesLipoid A,   (vgI. O. Westphal und O. Lüderitz, 1. c., 1954) zurückzuführen ist.    



   Dies liess sich unter anderem dadurch nachweisen, dass es beispielsweise gelang, die Lipoid-Kompo- 
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 proteine sind von nahezu der gleichen Wirksamkeit wie die Lipopolysaccharide. Die entsprechenden   lipoid-freienPolysaccharide   sind dagegen praktisch unwirksam. Auch ist bekannt, dass die Polysaccharide gram-positiver Bakterien, wie z. B. der Pneumococcen u. a., lipid-frei sind und keine der genannten biologischen Wirkungen in vergleichbaren Dosen ausüben. 



   Behandelt man hochgereinigte Lipopolysaccharide von Enterobacteriaceen mit verdünnter Säure in der Wärme, so flockt das abgespaltene rohe Lipoid als in Wasser schwerlösliches Material nach einiger Zeit aus, während das   lipoid-freie, degradierte Polysaccharid   in Lösung bleibt. Das so erhaltene BakterienLipoid ist in Chloroform und Pyridin und einigen sekundären aliphatischen Aminen, wie Piperidin, löslich, in andern gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln jedoch unlöslich oder nur teilweise löslich. Die Lipoid A-Komponente aus den Lipopolysacchariden gram-negativer Bakterien ist in der Klasse der Enterobacteriaceen chemisch jeweils nach dem gleichen Bauprinzip aufgebaut. Lipoid-A-Präparate verhalten sich daher chemisch und biologisch praktisch gleich, so dass auch ihre Darstellung nach genau gleichem Verfahren erfolgen kann.

   Die Elementaranalysen des rohen Lipoids A aus den Lipopolysacchariden von Enterobacteriaceen liegen jeweils innerhalb folgender Werte : C 61-64, 5, H   9, 4- 9, 5,   
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 - 2,endodoxischenLipopolysacchariden vonEnterobacteriaceen kein einheitlicher Stoff ist, sondern, wie weiter gefunden wurde, aus einigen charakteristischen Komponenten besteht, die getrennt und weiter   gerl i-   nigt werden können. 



   Diese Erkenntnis liegt der vorliegenden Erfindung zugrunde und hat sich dieselbe   dieAufgabegestll1'.,   ein einfaches und wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung eines reinen, von Begleitstoffen freien und   du-   mit hochaktiven Lipoids zu schaffen. Erfindungsgemäss wird hiezu in der Weise vorgegangen, dass das Rohlipoid mit Estern extrahiert, der ersterunlösliche Rückstand mit einem Lösungsmittel, wie (cyclischen) tertiären oder sekundären Aminen oder Tetrahydrofuran aufgenommen und aus dieser Lösung, nach dem Versetzen mit einem niederen Alkohol in grossem Überschuss, Abtrennung von dem dabei gebildeten Niederschlag, gegebenenfalls nach Einengen und Wasserzusatz, das Reinlipoid ausgefällt bzw. ausgefroren 

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 und getrocknet   wird..   



   Zur Herstellung von reinem Lipoid wird beispielsweise das Rohlipoid zunächst mit Äthylformiat extrahiert, wobei freie Fettsäuren, Oxyfettsäuren und geringe Mengen Phospholipoid in Lösung gehen. Der   ester unlösliche Rückstand   (zirka   65 - 75 ho)   wird in Pyridin gelöst (z. B. 5   % ig)   und mit abs. Methanol bis 
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 Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt, mit Pyridin aufgenommen und wiederum in abs. Methanol eingegossen, worauf sich über Nacht bei   0 - 40 G nochmals   ein geringer Niederschlag abscheidet. Der Überstand enthält das gereinigte aktive Material, während der Niederschlag komplexes, aminosäurehaltiges Material enthält.

   Zur Gewinnung des gereinigten Lipoids in Substanz wird die Lösung im Vakuum auf ein geringes Volumen eingeengt, mit Wasser versetzt und der Ansatz nach dem Einfrieren lyophilgetrocknet. Man erhält so ein leichtes, weisses Pulver in einer Ausbeute von 50 bis 60   %   des rohen Lipoids. 



   Das gereinigte Lipoid verhält sich chromatographisch praktisch einheitlich. Es ist in Pyridin, Piperidin und Chloroform leicht, in Tetrahydrofuran mässig und in Methanol oder Äthanol wenig löslich. Das gereinigte Lipoid lässt sich auch in ölige Lösung bringen, z. B. Arachisöl, und kann auch in kolloidale wässerige Lösung übergeführt werden. Es ist durch einen Gehalt von 18 bis 20 % festgebundenem Hexosamin neben   typische-ulipoidbausteinen,   charakterisiert. Das Material hat chemisch Ähnlichkeiten mit gewissen Gangliosiden aus den Zellmembranen höherer Tiere. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren führt insbesondere dann zu besonderem Erfolg, wenn proteinfreies Rohlipoid verwendet wird. Proteinfreies Rohlipoid erhält man vor allem, wenn man proteinfreies Lipopolysaccharid verwendet, wie man es durch Anwendung des   Phenol/Wasser-Verfahrens   z. B. gemäss dem Verfahren nach der deutschen   Patentschrift Nr. 918405   (vgl. O. Westphal et al.,   Zf. Naturforschung 76,     [1952J, S. 536-48) erhält. Behandelt man   mehr oder weniger proteinhaltige Lipopolysaccharide, wie sie bei Anwendung der meisten sonst üblichen Extraktionsverfahren erhalten werden   (s.   O. Westphal und   O.   Lüderitz, 1. c., 1954) mit Säure, so erhält man lipoidfreies Polysaccharid und proteinhaltiges Lipoid. 



  Aus derartigen Lipoproteinen kann aber das Lipoid (Lipoid A) nicht abgespalten werden, ohne eine gewisse biologische Inaktivierung in Kauf nehmen zu müssen. 



   Auch hat sich ein Rohlipoid als vorteilhaft erwiesen, bei dessen Gewinnung bei der sauren, z. B. ln-salzsauren Hydrolyse von Lipopolysacchariden Elektrolyte, vorzugsweise einwertige   Jenen   wie   z. B.   



    5 - 15   %   NaCl,   zugesetzt worden waren. Hiedurch wird bei verbesserter Ausbeute die Ausflockung des abgespaltenen Lipoids begünstigt und dessen Kontakt mit dem sauren Medium, beispielsweise bei 10 % NaCl auf etwa die Hälfte der Zeit, gegenüber elektrolytfreier Säure, verkürzt. 



   Zur Extraktion des Rohlipoids werden mit Vorteil aliphatische   Fettsäureester,   insbesondere Ester niederer aliphatischer Säuren, z. B. Äthylformiat, verwendet. 



   Weiter können zur Lösung des esterunlöslichen Rückstandes als tertiäre Amine Pyridinbasen, insbesondere   Pyridin. K- undy-Picolin,   Triäthylamin und als   sekundäre   Basen Piperidin, Diäthylamin, gegebenenfalls auch Benzol verwendet werden, während zur Ausfällung von Verunreinigungen aus diesen Lösungen insbesondere Methanol, aber auch Äthanol und Propanol benutzt wird. Mit Vorteil sind alle diese Lösungsmittel wasserfrei. 



   Zweckmässig geht man zur Gewinnung des reinen Lipoids aus solchen Lösungen in der Weise vor, dass die Lösung eingeengt, dann mit Wasser versetzt und das so ausgefällte Lipoid insbesondere lyophil getrocknet wird. Insbesondere empfiehlt sich dabei, dass die Einengung der Lösung des esterunlöslichen Rückstandes im Vakuum und gegebenenfalls stufenweise unter jeweiliger Zwischenkühlung auf Temperaturen von insbesondere etwa 00   C   und Abtrennung der Niederschläge erfolgt. Dabei ist es möglich, dass zur weiteren Reinigung die eingeengte Lösung des esterunlöslichen Rückstandes gegebenenfalls mehrmals jeweils nach Verdünnen durch Zusatz neuen Lösungsmittels und Versetzen mit Alkohol eingeengt wird. 



   Die Injektion von kolloidal-wässerigen oder öligen Lösungen des derart gereinigten Lipoids A aus den Lipopolysacchariden gram-negativer Bakterien führt beim höheren Tier und Menschen zu   einer Reihe cha-   rakteristischer Reaktionen. So lässt sich an Mäusen eine signifikante Steigerung der unspezifischen Infektresistenz gegen viele virulente Bakterienarten nach der Injektion von 10 bis   100 y   zeigen, derart, dass   sie 24 - 72   Stunden nach der   Lipoid-Applikation     (intravenös, intraperitoneal   oder subkutan) gegenüber den Kontrollen beispielsweise der Infektion mit der mehr als   1000-fachen   Dosis virulenter Colibakterien widerstehen.

   Bei Kaninchen, Mäusen und Rindern führt die intravenöse Injektion von 0, 1 bis 10   y   des Lipoids/kg zu einer signifikanten Steigerung der spezifischen Antikörperbildung (Adjuvanzeffekt). Beim Menschen führt die intravenöse Injektion in Dosen von der Grössenordnung   1 - 2 r   total zu Steigerungen 

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Claims (1)

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   5. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die eingeengte Lösung des esterunlöslichen Rückstandes gegebenenfalls mehrmals, jeweils nach Verdünnen durch Zusatz neuen Lösungsmittels und Versetzen mit Alkohol, eingeengt wird.