<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen mit verlängerter Wirksamkeit.
Nach Verabfolgung einer Insulininjektion an einen Diabetiker tritt rasch ein hypoglykämischer Effekt auf, der bald abklingt. Es ist daher oft eine zweite Insulininjektion notwendig, um einen normalen Blutzuckerspiegelwert über einen Zeitraum von 24 Stunden aufrecht zu erhalten.
Um die Wirkung von Insulininjektionen nachhaltiger zu gestalten, ist eb üblich geworden, Insulin mit einem basischen Protein, z. B. Protamin,'im allgemeinen unter Zusatz von Zink, zu kombinieren, wobei ein Zink-Protamin-Insulinprodukt in Form einer Suspension erhalten wird. Die anhaltende Wirkung solcher Suspensionen ist wahrscheinlich auf die relativ geringe Löslichkeit des Insulinpräparates bei PH-Werten in der Nähe desNeutralpunktes zurückzuführen ; dadurch wirkt das Präparat als Reservoir oder Depot, welches. das Insulin langsam in die Blutbahn abgibt.
Präparate mit derartigen Eigenschaften ergeben zwar einen bedeutenden Vorteil gegenüber den bisher verwendeten Insulinlösungen, befriedigen jedoch nicht vollständig, da der damit erzielbare hypoglykämische Effekt ziemlich langsam eintritt ; es ist deshalb oft notwendig, gleichzeitig auch eine Injektion von löslichem Insulin zu machen, um ein genügend rasches Absinken des Blutzuckers hervorzurufen. Diese Behandlungsweise ist jedoch nicht zufriedenstellend, da die verschiedenen Sorten des Protamin-Zink-Insulin (Suspension) in bezug auf die Menge des im Überschuss über das isophanische Verhältnis vorhandenen Protamins etwas voneinander abweichen, so dass Mischungen von löslichem Insulin mit verschiedenen Sorten von Protamin-Zink-Insulin eine unterschiedliche hypoglykämische Wirkung ergeben können.
Ausserdem bleiben die physikalischen Eigenschaften von ProtaminZink-Insulin-Suspensionen bei längerer Lagerung nicht immer unverändert. So kann beispielsweise eine Bildung von Teilchenaggregaten oder ein"Dünnerwerden"eintreten, wodurch sich unerwünschte Änderungen in den Ansprechzeit-Blutzuckerkurven ergeben. Ferner tritt beim Aufbewahren ein Absetzen der suspendierten Phase auf und es ist notwendig, die Suspensionen vor dem Füllen der Injektionsspritze durch kräftiges Schütteln sorgfältig zu mischen. Ein kräftiges Schütteln hat aber wieder ein Schäumen und die damit verbundenen Nachteile zur Folge.
Ein weiterer Nachteil dieser und ähnlicher Präparate liegt in der Verwendung von aus natürlichem Material isoliertem Protamin, dessen Zusammensetzung in Abhängigkeit vom Ausgangsmaterial starken Schwankungen unterworfen ist, wodurch sich deutliche Unterschiede in den chemischen und physiologi- schenEigenschaften der Präparate ergeben. Ferner unterliegt Protamin bei 370 C und einen PH-Wert von 7 langsam der Autolyse, woraus folgt, dass das Material bei physiologischen pH-Werten durchaus nicht immer stabil ist.
Die vorliegende Erfindung verfolgt den Zweck, eine neue Art von Insulinpräparaten mit verlängerter Wirksamkeit inForm von Lösungen zu schaffen. Das Verfahren gemäss der Erfindung besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Lösung von Insulin und einem basischen Polypeptid, das aus einem synthetischen Polymer des Lysins oder Ornithins, einem synthetischen Copolymer des Lysins mit Ornithin oder aus einem Copolymer des Lysins oder Ornithins mit Valin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin oder Glykokoll besteht und pro Molekül nicht weniger als 8 durch Peptidbindung verbundene Aminosäurereste enthält, herstellt und auf einen PH-Wert zwischen 2 und 4, vorzugsweise zwischen 2, 8 und 3, 5 einstellt. Vorzugsweise werden von den Copolymeren solche von Lysin mit Leucin und Phenylalanin verwendet.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zu der Lösung von Insulin
<Desc/Clms Page number 2>
dem basischen Polypeptid der oben definierten AIt ein lösliches Zinksalz zugesetzt.
Die gemäss der Erfindung hergestellten Insulinlösungen sind den Protamin-Zink-Insulin-Suspensionen darin überlegen, dass sie :
1) ein rascheres Absinken des Blutzuckers bei der Injektion hervorrufen,
2) Lösungen und keinen Suspensionen sind und daher bequem aseptisch abgefüllt werden können und
3) entsprechend den jeweiligen Erfordernissen so hergestellt werden können, dass ein hypoglykämi- scher Effekt von kürzerer oder längerer Zeitdauer hervorgerufen wird.
Die Wirksamkeit der neuen Insulinlösungen hält länger an als jene einer entsprechenden Menge von gelöstem Insulin ohne Polypeptidzusatz.
Ein weiterer Vorteil der oben definierten synthetischen Polypeptide gegenuber dem natürlichen Pro- tamin liegt in der erhöhten Gleichmässigkeit der Zusammensetzung.
Die Synthese der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendeten basischen Polypeptide kann in üblicherweise durch eine Einstufen-Polymerisationsreaktion mit einem geeigneten Derivat der Amino- säure, wie z. B. a-N-Carbonsäureanhydrid, in welchem die freie Aminogruppe desLysins oderOrnithins in w-Stellung durch eine geeignete anschliessend zu entfernende Gruppe, wie. ein Carbobenzoxyrad1kal, ge- schützt ist, vorgenommen werden. Die Polymerisation wird vorzugsweise in einem geeigneten inerten Lö- sungsmittel, z. B. Benzol, Nitrobenzol, Nitromethan, Dioxan, Pyridin oder Äthylacetat. bei Tempera- turen oberhalb etwa 200 C und unterhalb 1000 C und in Gegenwart eines geeigneten Init1ators, z. B. Was - sei oder Ammoniak, durchgeführt.
Die Kettenlänge der Polyaminosäure kann durch die Menge des ver- wendeten Initiators geregelt werden. Die Polymerisation der N-Carbonsäureanhydride ist eine initiierte
Kettenpolymerisation, bei welcher das Molekulargewicht, zumindest für Kettenlängen bis zu 15 Amino- säureresten, durch die relativen Konzentrationen des Monomeren und des Initiators, bestimmt wird.
Die so erhaltenen synthetischen Polypeptide sind keine Produkte von homogener Struktur, sondern bestehen aus Molekülen von etwas unterschiedlicher Kettenlänge. Durch sorgfältige Festlegung der Reak- tionsbedingungen und der Reinheit des Ausgangsmaterials können jedoch Produkte mit einer reproduzier- baren mittlerer Kettenlänge, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung vollauf geeignet sind, erhalten werden.
Zur Herstellung der basischen Polypeptide für die Insulinlösungen gemäss der Erfindung werden die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren bevorzugt verwendet ; DL-Aminosäuren und auch D-Amino- säuren können gleichfalls angewendet werden.
Die Herstellung der synthetischen Copolymeren kann durch Mischpolymerisation der geeigneten a-N-Carbonsäureanhydride in der oben angegebenen Weise bewirkt werden. Die Menge der" neutralen"
Aminosäure in solchen Produkten soll jedoch nicht so gross sein, dass das Salz der gemischt-polymeren Aminosäure (z. B. das Hydrohalogenid) in Wasser unlöslich ist. Bei Verwendung der bevorzugt eingesetz- tenAminosäure L-Lysin wurde gefunden, dass der Gehalt an L-Lysin in derartigen gemischten Polyamino- säureprodukten nicht unter etwa 30 Mol-% absinken und im allgemeinen etwa SO Mol-' o betragen soll.
Die Menge an Polypeptid, welche zur Herstellung einer solchen löslichen Inulin-Zink-Polypeptid-
Mischung erforderlich ist, die eine verlängerte Wirksamkeit ähnlich der von Protamin-Zink-Insuli ! 1 (Sus - pension) zeigt, schwankt etwas in Abhängigkeit von der Menge des Polypeptides. So ergibt für den Fall, dass ein Polymeres ausL-Lysin und L-Leucin (50 : 50) (Mol-%) angewendet wird, eine dem Zweifachen des
Isophanwertes entsprechende Menge an Polypeptid eine lösliche Insulinbereitung mit einer prolongierten
Wirkung, die jener einer Protamin-Zink-Insulin-Suspension überlegen ist. Bei Anwendung eines Isophan- verhältnisses dieses Polypeptides zu Insulin ergibt sich jedoch eine lösliche Insulinbereitung mit einer pro- longierten Wirkung, welche ungefähr jener der Protamin-Zink-Insulin-Suspension entspricht.
Mit einer dem Dreifachen des Isophanwertes entsprechenden Menge an Poly-L-Lysin wird eine lösliche Insulin-Zink-
Bereitung mit einerprolongiertenWirkung erhalten, die etv-a jener der Protamin-Zink-Insulin- Suspension gleichkommt. Im allgemeinen wird daher eine dem etwa Zwei- bis Dreifachen des Isophanwertes ent- sprechende Polypeptidmenge erforderlich sein, wenn lösliche Insulinpräparate mit stark prolongierter Wir- kung, als sie Protamin-Zink-Insulin-Suspensionen ergeben, verlangt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem Isophanwert das Gewicht des synthetischen, ba- sischen Polypeptids in mg zu verstehen, welches erforderlich ist, um isophanische Bedingungen mit 10 mg
Insulin herzustellen.
EMI2.1
b) eine Insulinlösung, zu deren Herstellung 4000 Einheiten Insulin in der geringstmöglichen Menge n/10 Salzsäure aufgelöst mit Wasser und auf ein Volumen von 100 ml verdünnt werden ; die Lösung ent-
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
phatpuffer auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.
Die Bestimmung wird in folgender Weise durchgeführt :
Zuerst werden je 4 ml der Insulinlösung in Probengläser pipettiert und in die verschiedenen Gläser
EMI3.2
bengläser werden geschüttelt, dann 5 Minuten stehen gelassen, worauf durch Whatman Filterpapier Nr. 42 filtriert wird. Dann werden aus jedem Filtrat je zwei Proben zu 1 ml in Mikroeprouvetten pipettiert. Es werden so 2 Reihen von Eprouvetten erhalten, die im folgenden mit Reihe I und Teihe P bezeichnet werden. In jede Eprouvette der Reihe I werden 6 Tropfen Insulinlösung gegeben, während jeder Eprouvette der Reihe P ausserdem noch 2 Tropfen Polypeptidlösung zugesetzt werden.
Schliesslich wird nach 15 Minuten die Trübung in den beiden Reihen von Eprouvetten geprüft. Jener Punkt, bei welchem die entsprechenden Probengläser I und P eine minimale Trübung zeigen, wird als Isophanpunkt bezeichnet.
Die Berechnung erfolgt unter Berücksichtigung der folgenden Überlegung : Wenn x mg Insulin (= 4000 Einheiten) in 120 ml der Ausgangslösung des Insulinpuffers vorhar-den sind, y mg Polypeptid in 100 ml Wasser enthalten sind und z ml der Polypeptidlösung zur Herstellung einer isophanischen Mischung zugesetzt
EMI3.3
Polypeptid 10 mg Insulin ausfällen.
Die Gegenwart einer geringen Menge Zink ist zur Entwicklung einer entsprechendenprotrahierten Wirkung der Insulinlösungen gemäss der vorliegenden Erfindung wünschenswert. Der Anteil an Zink braucht z. B. nur 0, 075 % zu betragen ; es kann kristallines Insulin verwendet werden, in welchem Falle ein Zusatz von weiteren Zinkmengen nicht erforderlich ist.
EMI3.4
Hydrochlorid, angewendet wird, gemischt wird, wobei eine oder beide dieser Lösungen ein Zinksalz enthalten und auf einen geeigneten pH-Wert in der Nähe des physiologischen pH-Wertes gepuffert sein können, worauf die Suspension auf den oben angegebenen pH-Wert angesäuert wird. Anderseits können wässerige Lösungen von Insulin und Polypeptid, die beide einen pH-Wert unterhalb von 4 besitzen, und von welchen wenigstens eine ein Zinksalz enthalten kann, gemischt werden.
Dabei wird eine klare Lösung erhalten, die anschliessend auf den gewünschten PH-Wert eingestellt wird. Die Lösungen können ferner ein antiseptisches Mittel, wie Phenol oder Kresol, enthalten, ferner auch Stoffe, die, wie Natriumchlorid oder Glyzerin, Isotonie hervorrufen, sowie Puffersubstanzen.
Nachstehend sind Verfahren angegeben, welche zur Herstellung der Polypeptide angewendet werden können.
Poly-L-lysin-hydrochlorid.
3, 35 g (0, 012 Mol) (e-Carbobenzoxy-L-lysin)-N-carbonsäureanhydrid werden in 152 ml siedendem, trockenem Benzol gelöst und mit 2, 055 ml wässerigem Dioxan mit einem Wassergehalt von 25 0 versetzt.
Nach 16-stündigem Kochen am Rückfluss wird das ausgefallene Polymer (2, 9 g) abgetrennt, mit heissem Benzol und Äther gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Poly- (e-carbobenzoxy-L-lysin) (1, 9 g) wird in 100 ml Eisessig suspendiert und in die Suspension wird 8 Stunden lang bei 40 - 500 C trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Das Polymer wird dann abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die weitere Reinigung erfolgt durch Auflösen in Wasser, Behandeln der wässerigen Lösung mit Tierkohle. Anschliessend wird die Tierkohle abfiltriert und die Lösung zur Gewinnung des Poly-L-lysinhydrochlorids (0, 9 g) der Gefriertrocknung unterworfen.
Poly- (L-lysin : L-leucin)-hydrochlorid mit einem Gehalt von 50 Mol-% l-Lysin.
(E -Carbobenzoxy-L-Iysin) -N-carbonsäureanhydrid (6, 4 g, 0, 0209 Mol) und L-Leucin-N-carbonsäu- reanhydrid (3, 28 g, 0, 0209 Mol) werden in 130 ml trockenem Dioxan gelöst. Dann werden 6, 97 ml 0, 2n Ammoniak in Dioxan zugesetzt und die Lösung wird 1 Stunde bei Zimmertemperatur und dann über Nacht am Wasserbad gerührt. Der gekühlten viskosen Lösung werden 260 ml 0,16 n Salzsäure zugesetzt und das gefällte Polymer (7,8 g) wird 6 Stunden gerührt. Dann wird das Polymer abgetrennt, mit Wasser gewa- schen und im Vakuum getrocknet.
6, 2 g Poly- (e-carbobenzoxy-L-lysin : L-leucin) werden in 200 ml Eisessig gelöst, worauf trockener Chlorwasserstoff 6 Stunden unterRühren'bei 500 C eingeleitet wird. Dann wird das Polymer mit Äther versetzt und als Öl ausgefällt. Das Öl wird abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das Poly- (L-lysin : L-leucin)-hydrochlorid (3,35 g) wird in üblicher Weise gereinigt und der Gefriertrocknung'm-
<Desc/Clms Page number 4>
terworfen.
Poly- (L-lysin : L-phenylalanin)-hydrochlorid mit einem Gehalt von 50 Mol-% L-Lysin.
7, 8 g (0, 0255 Mol) (E-Carhobenzoxy-L-lysin)-N-carbonsäureanhydrid und 4, 87 g (0, 0255 Mol) L-Phenylalanin-N-carbonsäureanhydrid (Schmelzpunkt 93 - 950 C) (hergestellt aus dei DL-Form) werden in 160 ml trockenem Dioxan gelost. Dann wird 0,49 n Ammoniak in Dioxan (3, 5 ml) zu der Lösung gegeben, die anschliessend 1 Stunde bei Zimmertemperatur über Nacht am Wasserbad gerührt wird. Die Lösung wird gekühlt, mit 325 ml 0,16 n Salzsäure versetzt und weitere 6 Stunden gerührt. Es fallen 10, 05 g des Polymeren an, welcher nach Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet wurde.
Das Poly- (e-carbobenzoxy-L-lysin : L-phenylalanin) wird in 200 ml Eisessig suspendiert, worauf trockener Chlorwasserstoff bei 40 - 500 C 8 Stunden lang unter Rühren eingeleitet wird. Das Polymer löst sich während dieser Zeit auf und fällt dann als Öl aus. Die gekühlte Mischung wird mit Äther versetzt, worauf das erhärtete Polymer abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. Das Poly- (L-lysin : L-phenylalanin)-hydrochlorid (5, 5g) wird in Wasser aufgelöst und mit Tierkohle behandelt, worauf die Lösung filtriert und der Gefriertrocknung unterworfen wird.
In gleicherweise können aus den N-Carbonsäureanhydriden der folgenden Aminosäuren andere Polymere hergestellt werden : DL-Isoleucin, DL-Valin, Glykokoll, ö-Carbobenzoxy-DL-ornithin, DL-Phenylalanin, DL-Leucin (das Anhydrid wird hergestellt aus der L-Form, Fp : 50-52 C, Zersetzung 940 C) und
EMI4.1
Kresol, 1. 6 g Glyzerin, 16,7 mg wasserfreies Zinkchlorid und 9 mg Natriumchlorid gegeben ; der Zinkgehalt, bezogen auf das Gewicht des Insulins, betrug 4,6 go. Eine Lösung von 240 mg Polylysin in einem m/32 Phosphatpuffer, PH-3, 1, wurde zugesetzt und das Ganze wurde auf 100 ml mit Phosphatpuffer aufgefüllt. Der Isophanwert des Polypeptids betrug 0, 95 mg/10 mg Insulin. Dieses Präparat wurde im Vergleich zu einem Standard-Insulinpräparat an 12 Kaninchen erprobt.
Die Kaninchen wurden in 6 gleiche Gruppen geteilt. Beobachtungen des Blutzuckers wurden an Blutproben jedes Tierpaares vor der Injektion über einen Zeitraum von 6 Stunden durchgeführt. Die pro Kaninchen verabreichte Dosis betrug 0, 035 ml und wurde subkutan gegeben. Die erhaltenen Blutzuckerwerte sind aus der folgenden Tabelle 1 ersicht- lich.
Tabelle l :
EMI4.2
<tb>
<tb> Bereitung <SEP> Wirksamkeit <SEP> Blutzucket <SEP> in <SEP> %, <SEP> bezogen <SEP> auf <SEP> den <SEP> Anfangswert
<tb> nach <SEP> Stunden
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> Standard- <SEP> 40 <SEP> F. <SEP> /ml <SEP> 48,9 <SEP> 48,3 <SEP> 60,0 <SEP> 79,3 <SEP> 88,3 <SEP> 95,5
<tb> Insulin
<tb> Polylysin- <SEP> 40 <SEP> E. <SEP> /ml <SEP> 68,2 <SEP> 56,0 <SEP> 52,0 <SEP> 53,2 <SEP> 52,0 <SEP> 56,4
<tb> Zinkinsulin
<tb>
Beispiel 2 : Eine Lösung von Poly-L-lysin-Zink-Insulin, welche 3 mg Polylysin und 2, 0 mg Zink je 100 Einheiten Insulin enthielt, wurde nach Beispiel 1 hergestellt. Sie besass einen PH-Wert von 3, 1 und
EMI4.3
3 % KresolDieses Präparat wurde an Kaninchen getestet.
Die mittleren Blutzuckerwerte, welche im Verlaufe eines Zeitraumes von 6 Stunden erhalten wurden, sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 :
EMI4.4
<tb>
<tb> Angenommene <SEP> Wirksamkeit <SEP> Tag <SEP> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes <SEP> nach <SEP> Stunden
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 76 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 60 <SEP> 63 <SEP> 71
<tb> 40 <SEP> E./ml <SEP> 2 <SEP> 83 <SEP> 67 <SEP> 59 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 77
<tb> Mittel <SEP> 79 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 74
<tb>
<Desc/Clms Page number 5>
Beispiel 3 : a) 174 mg Insulin (Wirksamkeit 23 i. E./mg) wurden in 10 ml n/10 HCI gelöst. Zu der Lösung wurden 16,7 mg ZnCI, 9 mg NaCl, 0,2 ml Trikresol und 1, 6 ml Glyzerin zugesetzt. Der Zinkgehalt betrug 4,6 go, bezogen auf das Gewicht des Insulins.
Zu dieser Lösung (Lösung A) wurden etwa 70 ml einer m/32 Lösung vonNaHPO. und dann eine Lösung von 124 mgPoly- (L-leucin : L-lysin)-hydrochlorid, welche 50 Mol-'yo L-Lysin enthielt und in 8 ml der Phosphatlösung gelöst war, zugesetzt. Die Lösungen wurden rasch gemischt und mit Phosphatlösung auf 100 ml aufgefüllt. Die auf diese Weise gebildete Suspension wurde mit 2, 5 ml n-HCl auf einen pH-Wert von 3, 2 angesäuert, wobei eine klare Lösung erhalten wurde, b) Zu einer mit Lösung A identischen Lösung wurden 2, 5 ml n-HCl zugefügt.
Anschliessend wurden, wie dies oben angegeben ist, Puffer-und Peptidlösung zugegeben, wobei eine klare Lösung mit einem PH-Wert von 3, 06 erhalten wurde. c) Zu einer mit der obigen Lösung A identischen Lösung wurde die oben angegebene Peptidmenge, in 0, 9 %iger Kochsalzlösung gelöst, zugesetzt, worauf die Mischung auf 100 ml mit Kochsalzlösung auf- gefüllt und auf einen p-Wert von 3, 00 eingestellt wurde.
Der Isophanwert des Polypeptids betrug 1,64 mg/10 mg Insulin.Diese 3 Lösungen wurden an 3 Gruppen zu je 5 Kaninchen, die man vor den Versuchen 21 Stunden lang hungern liess, erprobt. Den Kaninchen wur- de eine Dosis von 0, 4 i. E./kg gegeben ; gleichzeitig wurde eine Dosis von Standard-Insulin einer vierten
Gruppe von Kaninchen verabreicht.
Die mittleren Blutzuckerwerte, welche nach 0, 1, 2,4 und 6 Stunden erhalten wurden, sind in Tabelle 3 angegeben :
Tabelle 3 :
EMI5.1
<tb>
<tb> Zeit <SEP> Blutzuckerwerte <SEP> in <SEP> 0/0, <SEP> bezogen <SEP> auf <SEP> den <SEP> Anfangswert
<tb> Stunden <SEP> : <SEP> Standard <SEP> Insulin <SEP> Präp. <SEP> 3a <SEP> präg. <SEP> 3b <SEP> Präp. <SEP> 3c <SEP>
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50, <SEP> 8 <SEP> 66, <SEP> 8 <SEP> 66, <SEP> 2 <SEP> 62, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 53, <SEP> 6 <SEP> 58, <SEP> 4 <SEP> 63, <SEP> 9 <SEP> 54,1
<tb> 4 <SEP> 90,7 <SEP> 65, <SEP> 3 <SEP> 66, <SEP> 7 <SEP> 59,6
<tb> 6 <SEP> 109, <SEP> 2 <SEP> 76, <SEP> 9 <SEP> 87, <SEP> 8 <SEP> 73, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 4 :
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Änderung des Peptidanteiles in bezug auf den
Isophanwert.
EMI5.2
gelöst.Glyzerin, 16,7 mg ZnC12 und 9,0 mg NaCl zugesetzt. Der Zinkgehalt, bezogen auf das Gewicht des Insulins, betrug 4, 6 %. Es wurde eine Lösung von 20 mg Poly- (L-lysin-L-leucin)-hydrochlorid mit einem Gehalt von 50 Mol-% an L-Lysin in einem m/32 Phosphatpuffer mit einem PH-Wert von 2, 95 zugesetzt, worauf die Mischung mit Phosphatpuffer auf 100 ml verdünnt wurde. b) Es wurde ein Präparat hergestellt, das mit dem in Punkt a) angegebenen mit Ausnahme des Polypeptidgehaltes, welcher 40 mg Polypeptid betrug, identisch war. c) Es wurde ein Präparat hergestellt, das mit dem unter Punkt a) angegebenen mit Ausnahme des Po- lypeptidehaltes, welcher 60 mg betrug, übereinstimmte.
Der Isophanwert des Polypeptids betrug 2, 87 mg/10 mg Insulin. Die verwendeten Mengen betrugen daher das 0, 4-, 0, 8- und 1, 2-fache des jeweiligen Isophanwertes.
Zur Prüfung jedes Präparates wurden Gruppen von 5 Kaninchen verwendet, wobei Vergleiche mit Standard-Insulin und mit Protamin-Zink-Insulin-Suspension durchgeführt wurden. Es wurden Subkutaninjektionen von 0, 01 ml/kg gegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben :
Tabelle 4 :
EMI5.3
<tb>
<tb> Zeit <SEP> Mittlere <SEP> Blutzuckerwerte <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswerte. <SEP> ; <SEP> : <SEP>
<tb> Stunden <SEP> :
<SEP> Insulin-Standard <SEP> Protamin-Zink-Insulin <SEP> Präp.4a <SEP> Präp.4b <SEP> Präp.4c
<tb> 1 <SEP> 42, <SEP> 9 <SEP> 62, <SEP> 4 <SEP> 41, <SEP> 7 <SEP> 51, <SEP> 6 <SEP> 49, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 43, <SEP> 9 <SEP> 56, <SEP> 3 <SEP> 38, <SEP> 8 <SEP> 55, <SEP> 0 <SEP> 48, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 4. <SEP> 69, <SEP> 3 <SEP> 58, <SEP> 6 <SEP> 69,6 <SEP> 75,2 <SEP> 53, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 97, <SEP> 9 <SEP> 76, <SEP> 0. <SEP> 100, <SEP> 1 <SEP> 89,7 <SEP> 67, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
Beispiel 5 : 174 mg Insulin, welches 0, 075 % Zink enthielt, wurde in 10 ml n/10 HC1 gelöst. Zu der Lösung wurden 1, 6 ml Glyzerin, 0,2 ml Trikresol, 9 mg NaCl und etwa 80 ml isotonischer Kochsalzlösung zugesetzt.
Anschliessend wurden 120 mg Doly- (L-lysin:L-leucin)-hydrochlorid, welches 50 Mol-% L-Lysin enthielt und in 8 ml Kochsalzlösung gelöst war, zugesetzt. Das ganze wurde mit Kochsalzlösung auf 100 ml verdünnt und auf einen pH-Wert von 3, 03 eingestellt.
An 3 Gruppen von je 5 hungernden Kaninchen wurde dieses Präparat mit Standard-Insulin und Protamin-Zink-Insulin-Suspension verglichen. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 5 angegeben :
Tabelle 5 :
EMI6.1
<tb>
<tb> Zeit <SEP> Blutzucket <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangwertes <SEP> :
<tb> Stunden: <SEP> Präp.5 <SEP> Standard-Insulin <SEP> Protamin-Zink-Insulin
<tb> 1 <SEP> 65,5 <SEP> 43.8 <SEP> 69.8
<tb> 2 <SEP> 55, <SEP> 1 <SEP> 41, <SEP> 3 <SEP> 50, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 69, <SEP> 2 <SEP> 66, <SEP> 4 <SEP> 59, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 70, <SEP> 2 <SEP> 97, <SEP> 0 <SEP> 68, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
EMI6.2
m/32 Lösung von Na2HPO4 auf 80 ml verdünnt. Zu dieser Lösung wurden 16, 7 mg Zinc12, 9, 0 mg NaCl, 0,2 ml Trikresol und 1, 6 ml Glyzerin gegeben.
Der Zinkgehalt betrug 4, 6 %, bezogen auf das Gewicht des Insulins. Eine Lösung von 322, 9 mg Poly- (L-lysin : L-leucin)-Hydrochlorid, welches 30 Mol-% L-Lysin enthielt (Isophanwert = 8,5 mg/10 mg Insulin), in 8 ml Phosphatlösung wurde zu der ersten Lösung zugegeben und die Mischung hierauf mit Phosphatlösung auf 100 ml verdünnt. Die so gebildete Suspension wurde durch Einstellen des PH-Wertes mit n-HCl auf 3, 25 in Lösung gebracht.
Dieses Präparat wurde mit Gruppen von 10 Kaninchen ausgetestet, wobei Vergleichsversuche mit Standard-Insulin-Lösung durchgeführt wurden. Es wurde eine Dosis von 0, C35 ml pro Kaninchen verabfolgt. Die erhaltenen mittleren Blutzuckerwerte sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben. Zum Vergleich wurde eine an einem andern Tage erhaltene typische Protamin-Zink-Insulin-Reaktion für die gleichen Kaninchen ebenfalls in die Tabelle 6 aufgenommen.
Tabelle 6 :
EMI6.3
<tb>
<tb> Zeit <SEP> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Stunden <SEP> Präp. <SEP> 6 <SEP> Standard-Insulin <SEP> Typische <SEP> Protamin-ZinkInsulin-Reaktion
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 79,9 <SEP> 55,6 <SEP> 74,8
<tb> 2 <SEP> 72,6 <SEP> 55,9 <SEP> 58,0
<tb> 3 <SEP> 71,8 <SEP> 71,2 <SEP> 57,3
<tb> 4 <SEP> 79,2 <SEP> 83,9 <SEP> 56,7
<tb> 5 <SEP> 80,3 <SEP> 93,7 <SEP> 66,2
<tb> 6 <SEP> 84,4 <SEP> 93,4 <SEP> 73,0
<tb>
Beis piel 7 : Präparate mit den oben beschriebenen Polymeren wurden, wie im Beispiel 6 beschrieben, hergestellt, mit dem Unterschied, dass die Menge des zugesetzten Polymeren mit dem Isophanwert des Polymeren variierte, wobei in jedem Falle die 2, 4-fache Menge des isophanischen Verhältnisses angewendet wurde.
In der Tabelle 7 sind die Isophanwerte für jedes Polymer sowie die verwendete Menge, die in den einzelnen Präparaten angewendet wurde, und der endgültige pH-Wert der Lösung angegeben :
<Desc/Clms Page number 7>
Tabelle 7 :
EMI7.1
<tb>
<tb> Präparat <SEP> Polymer-Hydrochlorid <SEP> Isophanwert <SEP> Menge <SEP> des <SEP> zugesetzten <SEP> PH
<tb> Nr. <SEP> (Moi-lo <SEP> jedes <SEP> Bestandteiles) <SEP> mg/10 <SEP> mg <SEP> Insulin <SEP> Polymers <SEP> in <SEP> mg
<tb> je <SEP> 174 <SEP> mg <SEP> Insulin
<tb> 7a <SEP> 40-L-Lysin= <SEP> 60-L-Leucin <SEP> 4,63 <SEP> 193,2 <SEP> 3,0
<tb> lb <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-L-Phenylalanin <SEP> 2,19 <SEP> 91,4 <SEP> 3,2
<tb> 7c <SEP> 50-L-Lysin: <SEP> 50-L-DL-Leucin <SEP> 1,64 <SEP> 68,3 <SEP> 3,2
<tb> 7dd <SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> : <SEP> 5O-L-Lsucin <SEP> 1,77 <SEP> 74,0 <SEP> 3,0
<tb> 7e <SEP> 50-L-Lysin <SEP> :
<SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> 0,88 <SEP> 3'6, <SEP> 5 <SEP> 3,2
<tb> 7f <SEP> 50-L-Lysin: <SEP> 50-DL-Isoleucin <SEP> 2,19 <SEP> 81,5 <SEP> 3,3
<tb> 7g <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Valin <SEP> 2,32 <SEP> 96,6 <SEP> 3,0
<tb> 7h <SEP> 50-L-Lysin: <SEP> 50-DL-Phenylalanin <SEP> 2,11 <SEP> 87,6 <SEP> 3,2
<tb> 7i <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-Glykokoll <SEP> 1,74 <SEP> 72,5 <SEP> 3, <SEP> 1
<tb> 7j <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Isoleucin <SEP> 2,32 <SEP> 96,9 <SEP> 3,1
<tb> 7k <SEP> 75-L-Lysin: <SEP> 25-DL-Valin <SEP> 1,31 <SEP> 54,7 <SEP> 3, <SEP> 3
<tb> 71 <SEP> 75-L-Lysin: <SEP> 25-DL-Phenylalanin <SEP> 1,35 <SEP> 56,4 <SEP> 3,0
<tb> 7n1 <SEP> 75-L-Lysin: <SEP> 25-Glykokoll <SEP> 1, <SEP> 38 <SEP> 57,6 <SEP> 3, <SEP> 1
<tb> 7n <SEP> 75-L-Lysin <SEP> :
<SEP> 25-L-Leucin <SEP> 1, <SEP> 37 <SEP> 57, <SEP> 2 <SEP> 3,1
<tb> 70 <SEP> 50-D-Lysin:50-L-Leucin <SEP> 2, <SEP> 18 <SEP> 91,0 <SEP> 3,3
<tb>
EMI7.2
eine Gruppe von 5 Kaninchen für die Prüfung jedes Präparates benutzt wurde. Die angewendete Dosis betrug 0, 4 i. E./kg.
Die erhaltenen mittleren Blutzuckerwerte sind in den anschliessenden Tabellen 8 - 10 als Prozenstatz des Anfangswertes dargestellt: des Anfangswertes dargestellt :
Tabelle 8 :
EMI7.3
<tb>
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard <SEP> Insulin <SEP> Präparat <SEP> Nr. <SEP> 7a <SEP> Präparat <SEP> Nr. <SEP> 7f <SEP> Protamin-Zink-Insulin
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50, <SEP> 3 <SEP> 65, <SEP> 3 <SEP> 52, <SEP> 4 <SEP> 74, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 61,4 <SEP> 60,2 <SEP> 53,5 <SEP> 63,2
<tb> 4 <SEP> 96, <SEP> 8 <SEP> 65, <SEP> 8 <SEP> 80, <SEP> 1 <SEP> 74, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 107, <SEP> 0 <SEP> 70, <SEP> 2 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> 91, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Tabelle 9 :
EMI7.4
<tb>
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> Präparat <SEP> Nr. <SEP> 7h <SEP> Präparat <SEP> Nr. <SEP> 7i <SEP> Protamin-Zink-Insulin
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 45,4 <SEP> 63,3 <SEP> 50,3 <SEP> 60, <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> 51,2 <SEP> 55,6 <SEP> 46,8 <SEP> 62,3
<tb> 4 <SEP> 93, <SEP> 3 <SEP> 65, <SEP> 8 <SEP> 82, <SEP> 1 <SEP> 65, <SEP> 8 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 103, <SEP> 5 <SEP> 90, <SEP> 2 <SEP> 97, <SEP> 8 <SEP> 76, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Tabelle 10:
EMI7.5
<tb>
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard <SEP> Insulin <SEP> Präparat <SEP> Nr. <SEP> 7b <SEP> Protamin-Zink-Insulin
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 51,8 <SEP> 57,6 <SEP> 66, <SEP> 4
<tb> 2 <SEP> 58, <SEP> 3 <SEP> 58, <SEP> 2 <SEP> 57, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 96, <SEP> 1 <SEP> 73, <SEP> 5 <SEP> 76, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 86, <SEP> 8 <SEP> 89, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
Klinische Versuche : Fall l : Es wurde eine Lösung verwendet, welche 40 E. Insulin pro ml sowie 1, 7 mg Polylysin und 0,6 mg Zink je 100 Einheiten Insulin enthielt ; diese Lösung wurde wie folgt hergestellt :
2,6 g Insulin mit einer Wirksamkeit von 23 E./mg wurden in 500 ml Wasser, welches 2,6 ml n-HCl enthielt, gelöst.
Zu dieser Lösung wurden 3, 75. g Phenol, 24 g Glyzerin und eine Lösung von 0, 45 g Zinkoxyd in 113 ml n/10 HCI gegeben. Weiters wurde die Lösung mit einer Lösung von 1, 02 g Polylysin-
EMI8.1
: Q, 95dern Gelegenheit Protamin-Zink-Insulin gegeben. Blutzuckerbestimmungen nach den angegebenen Zeitabschnitten zeigten folgende Ergebnisse.
Die Zahlen bedeuten mg zucker/100 ml Blut.
EMI8.2
<tb>
<tb> Polylysin-Insulin <SEP> 65 <SEP> E. <SEP> /ml <SEP> Blutzucker <SEP> mg <SEP> % <SEP> Protamin-Zink-Insulin <SEP> 60 <SEP> E./ml <SEP> Blutzucker <SEP> mg <SEP> %
<tb> Fasten <SEP> 1 <SEP> 217 <SEP> Fasten <SEP> 1 <SEP> 208
<tb> 2 <SEP> 240 <SEP> 2 <SEP> 245 <SEP>
<tb> Insulin# <SEP> Insulin#
<tb> Stunden <SEP> 1/2 <SEP> 240 <SEP> Stunden
<tb> 1 <SEP> 248 <SEP> 1 <SEP> 217
<tb> 2 <SEP> 202 <SEP> 2 <SEP> 208
<tb> 3 <SEP> 188 <SEP> 3 <SEP> 210
<tb> 4 <SEP> 172 <SEP> 4 <SEP> 196
<tb> 24 <SEP> 163 <SEP> 24 <SEP> 210 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 2S8 <SEP> 2a <SEP> 204 <SEP>
<tb> 26 <SEP> 286 <SEP> 26 <SEP> 226
<tb> 27 <SEP> 268 <SEP> ;
<SEP> 27 <SEP> 230
<tb> 28 <SEP> 244 <SEP> 28 <SEP> 283
<tb>
EMI8.3
nisse, welche mit einem mit dem gleichen Volumen von gewöhnlichem, löslichem Insulin vermischten Präparat erzielt wurden im Vergleich zu den Resultaten, die mit Protamin-Zink-Insulin und mit löslichem Insulin allein erhalten wurden.
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb>
Polylysin-Insulin <SEP> Mischung <SEP> von <SEP> Polylysin <SEP> Protamin-Zink-Insulin <SEP> Lösliches <SEP> Insulin <SEP>
<tb> 80 <SEP> E. <SEP> /ml <SEP> und <SEP> lösl. <SEP> Insulin. <SEP> 80 <SEP> E./ml. <SEP> 80 <SEP> E./mg
<tb> Blutzucker <SEP> mg <SEP> % <SEP> Blutzucker <SEP> mg <SEP> % <SEP> Blutzucker <SEP> mg <SEP> % <SEP> Blutzucker <SEP> mg <SEP> 0/0
<tb> Fasten <SEP> 1 <SEP> 490 <SEP> 536 <SEP> 160 <SEP> 250
<tb> 2 <SEP> 490 <SEP> 536 <SEP> 200 <SEP> 260
<tb> 3 <SEP> 254
<tb> Insulin---Stunden <SEP> 1/2 <SEP> 480 <SEP> 574 <SEP> 266 <SEP> 258
<tb> 1 <SEP> 476 <SEP> 456 <SEP> 306 <SEP> 190
<tb> 404
<tb> 2 <SEP> 436 <SEP> 364 <SEP> 312
<tb> 21/2 <SEP> 155
<tb> 336
<tb> 3 <SEP> 400 <SEP> 262 <SEP> 314
<tb> 31/2 <SEP> 078
<tb> 258
<tb> 4 <SEP> 344 <SEP> 178 <SEP> 310
<tb> 24 <SEP> 284 <SEP> 080 <SEP> 360
<tb> 25 <SEP> 268 <SEP> 127 <SEP> 360
<tb> 26 <SEP> 400 <SEP>
153 <SEP> 400
<tb> 27'388 <SEP> 165 <SEP> 400
<tb> 28 <SEP> 388 <SEP> 204 <SEP> 400
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen mit verlängerter Wirksamkeit, dadurch gekenn- zeichnet, dass man eine Lösung von Insulin und einem basischen Polypeptid, das aus einem synthetischen Polymer desLysins oderOrnithins, einem synthetischen Copolymer des Lysins mit Ornithin oder aus einem Copolymer des Lysins oder Ornithins mit Valin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin oder Glykokoll besteht und pro Molekül nicht weniger als 8 durch Peptidbindung verbundene Aminosäurereste enthält, herstellt und auf einen PH-Wert zwischen 2 und 4 einstellt.