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Verfahren, zur Herstellung von als Blutplasmastreckmittel dienenden
serologisch verträglichen Proteinderivaten Die Erfindung betrifft die Herstellung
undReinigung von Derivaten von menschlich seralogisch verträglichen Proteinen, insbesondere
Gelatine und menschlichen Blutproteinen, wie Serumalbumin, Globulin und Glebin,
um sie als Blutplasm,aersatz oder zur Vergrößerung des Blutplasmavolumens geeigneter
zu machen.
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Bekanntlich eignen sich Gelatinelösungen, wenn sie richtig hergestellt,
steril, pyrogen- und antigenfrei gemacht und so behandelt sind, daß sie eine verhältnismäßig
hohe mittlere Molekulargröße und einen geregelten osmotischen Druck besitzen, zur
parenteralen Verabfolgung, um das umlaufende Blutvolumen bei der experimentellen
und klinischen Behandlung von Schocken zu regulieren.
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Vensuch:e, die Eignung von Gelatine als Blutplasmaersatz oder -streckmittel
zu verbessern, wurden in zwei Richtungen unternommen: i. Albau des Gelatinemolekiils
in Lösung entweder durch Wärme oder durch chemische oder enzymatische, Hydrolyse
bis zu einer bestimmten Stufe derart, daß eine 3- bis 6°/oige Lösung bei 21°
kein
Gel mehr bildet. Die hierdurch erzielte Verringerung der mittleren MolekulargrößederGelatine
Ist aber von einer sehr beträchtlichen Verringerung der Retentionspernode bei Injektion
in ein intaktes Blutsvstem beigleitet.
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Die Kupplung von Gelatinemalekülen zu größeren Komplexen durch chemische
Behandlung mit Glyoxal und anschließende Oxydation mit Wasserstoffperoxyd zur Erhöhung
der Anzahl der ioni-sierberen Gruppen bei einem pH-Wert von 7,3 hatte gewissenErfclg.
DieseReaktion läßt sich aber schwer regeln und führt zu einem Präparat, das wahrscheinlich
bezüglich der Molekülgröße une gleichmäßiger zusammengesetzt istälsunbehandelte
Gelatine.
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Die Erfindung schlägt nun ,..in Verfahren zur Herstellung stabiler
Derivate von menschlich serologisch verträgl-iahen Proteinen aus Gelatine, Serumalbumin,
Globulin oder Globin vor, die verbes6@ürte Eigenschaften in ihrer Verwendung als
Blutplasmaersatz oder Blutstreckmittel besitzen. Nach diesem Verfahren wird das
Verhältnis von freien Amirtto- zu freien Camboxylgruppen verändert, so daß Derivate
entstehen, deren isoelektrischer Punkt niedriger liegt als der des Ausgangsproteins,
wodurch die kolloide osmotische Funktion derartiger Stoffe bei der Verwendung als'Blutplasmaersatzstoffe
verbessert wird.
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Weiter umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Fraktionieren und Reinigen
ausgewählter Fraktionen oder Produkte, die durch Umsetzung menschlich serologisch
verträglicher Proteine mit Polycarbonsäureanhydriden oder -chloriden entstehen.
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Es wurde nämlich gefunden, daß Anhydride und Chloride gewisser Polyca,rhonsäuren,
insbesondere Berns.teinsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid, Itaconsäureamhydrid,
Aco@niitsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäurechlorid und Fumarsäurechlorid,
mit Gelatine ünd Blutprolteinen zu s.tabflen Derivaten umgesetzt werden können (die
auch als Add-iticnsprodukte oder Anlagerungsverbindungen bezeichnet werden können)
und die durch Ausnutzung ihrer isoelektrischen Eigenschaften von unerwünschten Reaktionsprodukten
abgetrennt werden können. Physiologisch scheint kein Unterschied zwischen den Derivaten
der Anhy dride und denen der Chloride zu bestehen.
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Es wurde weiterhin gefunden, daß man, wenn man mit Gelatine als serologisah
verträglichem Material arbeitet, durch entsprechende Auswahl erreichen kann, daß
das Material aus Gelatinemolekülen. besteht, die innerhalb eines bestimmten engen
mittleren Molekulargrößebereiches fallen, so daß man durch Umsetzung mit PolycarboTisäureanhydriden
oder -chloriden Gelatinederivate erhält, die fraktioniert werden können und in einer
,wirksamen onootitschen Konzentration jeden gewünschten Flüssigkeitsgrad besitzen.
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Geht man von Gelatine eines mittleren Molekulargrößenbereichs von
etwa 15 oöo bis 36 ooo aus, so entstehen Additionsprodukte, die durch geei@gnete
Fraktionier- und Reinigungsbehandlung von den anderem Reaktionsprodukten abgetrennt
und in Form eines pyrogen- und antigenfreien nicht toxischen Materials gewonnen
werden können, das als Blutplasmastreckmittel geeignet ist.
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Es wurde weiterhin gefunden, da.ß die bisher l's@hriebenen Gelatinederivate
von Carnbon@säureanhydriden oder -ohtoriden, wie Bernstei.n.säureanhydrid, wechselnde
Zusammensetzung und toxische Eigenschaften besitzen, wie durch chemiische-Analyse,
das physi@kalisch-chemiische Verhalten: und phystiolegische Reaktionen festgestellt
wurde. Diese Produkte enthalten nämlich physiologisah toxische Stoffe, welche aus
ihnen nicht ohne Anwendung der hier beschriebenen isoelektrischen Fällungs- und
Fraktionierungsbehandlungen entfernt werden können.
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Im folgenden ist eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung
des primären Gelatineadditionsp@rod-ukbes nach der Erfindung (Fraktion I) gegeben,
das neue Anwendungsmöglichkeiten hat und sich von den, bisher beschriebenen Gelatinederivaten
wesenrtlich unterscheidet.
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Die Reaktion zwischen Gelatine eines bestimmten Molekulargrößenbereichs
und- einem deT genannten Anhydride oder Chloride bann innerhalb -eines pH-Bereichs
von 6 bis z2 und eines Temperaturbe-reicihs von 2o bis 4o° durdhgeführt werden.
Man kann auf diese Weise eine große Anzahl Gelatinederivate erhalten, die von der
jewei;ligen.Molekulargewichtsfraktion der Gelatine und dem Umsetzungsgrad derGelatine
mit dem saurenRadikal.abhängen. Aus den Rohprodukten lassen sich die i,so!elektrischen
Produkte durch Einsstellen des pli innerhalb eines Bereichs von 2,5 bis 3,5 herausfraktionieren.
Bei dem isoelektrischen Punkt des jeweiligen Säureaaihydrid- oder Chloridderivats
scheidet sich das entsprechende Produkt als nicht mnisohba.rer Sirup von hoher Dichte
in- Form einer scharf abgegrenzten ölartigen Schicht am Boden des Gefäßes ab. Dieses
Material wird sorgfältig durch Dekantieren, Zentrifugieren oder im Scheidetrichter
von den rniedr igmolekularen Additionsprodukten und unvollständig umgesetzten Fraktionen
der ,Gelaüine sowie von den Nichtgelatinestoffen, die gewöhnlich in deT handelsüblichen
Gelatine enthalten sind, und von den sauren Nebenprodukten der Reaktion getrennt.
Der iisoelektrische Punkt des Additionsprodukts hängt von dem jeweils verwendeten
Säure-a#rnhydrid oder -chlorid ab.
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Diese Fraktion (- Fraktion I -) kann weiter gereinigt werden, indem
man sie in destilliertem Wasser bei einem mittels Nafiriumhydroxyd eingestellten
PH von 5 bis 8, vo-rzugsweise von q. bis 6 wieder auflöst und-dann wieder ausfällt,
indem man die Lösung auf den isoelektrisahen Punkt mit Salzsäure ansäuert und gegebenenfalls
Kochsalz zusetzt. Die Reinligungs!behandlung kann erforderlichenfalls wiederholt
werden und ist zur Abscheidun@g miedrigmoilekularer Additionsprodukte, unvollständig
umgesetzter Produkte und saurer Nebenprodukte von Bedeutung, die bei intravenöser
Anwendung anormale pharmakologische und bzw. oder toxische Wirkungen hervorbringen
können. An die
Wiederausfällung bei dem isoelektrischen Punkt unter
Zugabe von Kochsalz kann sich eine weitere Reinigungsbehandlung durch Dialyse gegen
Wasser durch halbdurchlässige Membranen, beispielsweise Celluloseacetatfilme, anschließen.
Ein anderes Reinigungsverfahren für das -Addition.sprno;dukt ist das Ausfällen von
Methylalkohol, Äthylalkohol, IsopräpylalkcAho.l oder Aceton beim isoelektrischen
Punkt. Das mit Natriumchlorid ausgefällte Material schließt etwas konzentrierte
Kochsalzlösung ein, und diese kann als Ausgangsquelle für das Natriumchlorid dienen,
welches zur Herstellung einer fertigen Salzlösung (mit o,9 % Natriumchloridgehalt)
des Produkts er-forderlich ist. Ein Überschuß an eingeschlossenem Kochsalz kann
durch Dialyse oder anderweitig entfernt werden.
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Die so fraktionierten endgereinigten Derivate werden schließlich zu,
iso,tonischen Lösungen von dem ungefähren pf, des Blutes verarbeitet. Andererseits
können sie auch getrocknet und später wieder zu entsprechend eingestellten Lösungen
gelöst Nv erden.
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Die nach der ersten isoelektrischen Ausfällung in der überstehenden
Lösung verbleibenden Nebenprodukte wurden einer weiteren Fraktionierung unterworfen,
wobei zwei weitere Fraktionen von geringerem Molekulargewicht isoliert wurden, die
jedoch andere Eigenschaften aufwiesen als die erste Fraktion.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Add-itionsprodukte haben höhere
Molekulargewichte als die angewandte Gelatine. Außerdem sind ihreMoleküle symmetrischer
und enthalten ionisierbare Carboxylgruppen, weaw egen der isoelektrische Punkt dieser
Derivate beträchtlich unter dem der Gelatine liegt. Zur Z,'erweindung als Blutvo,lumenstreckmitteleignen
sie sich deswegen besser, weil sie in dem Blutvaskularsvstem sowohl bei normalem
als auch bei experimentell hervorgerufenem Schock besser zurückgehalten werden als
nicht modifizierte Gelatine. Außerdem ist die Natur der irnisierbaren Gruppen in
dem Additionsprodukt eine ,andere, so daß der wirksame osmfotische Druck bei einem
pH von 7,3 wesentlich höher ist als der des Ausgangsmaterials.
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Die folgenden Merkmale machen die erfindungsgemäßen Additionsprodukte
als Bl.utplasmastreckmittel wertvoll: i. Die hohe Symmetrie des Moleküls erhöht
die kapillare Retenticn.
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2. Die Produkte sind nicht toxisch und deshalb brauchbare kol.loidosmotische
Mittel.
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3. Die vergrößerte molekulare Symmetrie der schweren isoelektrischen
Fraktion verringert die Neigung zur Gelbildunig bei Gefriertemperaturen und bei
einem PH von etwa 7,3, wodurch ein günstiger Flüssigkeitsgrad erreicht und einer
der Mängel überwunden wird, der gewöhnlicher Gelatine als Plasmaersatz anhaftet,
insbesondere bei Massenunfällen, wo die Schockbehandlung häufig im Freien durchgeführt
werden muß.
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q.. Die erhöhte Anzahl ionisierbarer Carboxyleruppen in den fraktionierten
Additionsprodukten setzt den isoelektrischen Punkt herab, wodurch der wirksame osm@otische
Druck des Derivats bei einem PH von 7,3 erheblich vergrößert wird.
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Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß hier zum
ersten'Mal von den i.soelektrischen Eigenschaften der Reaktionsprodukte Gebrauch
gemacht wird, um sie in Fraktionen verschiedener Molekulargrößenbereiche und von
verschiedenem Reaktionsgrad mit den Proteinen zu zerlegen.
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Obwohl es sich als vorteilhaft erwiesen hat, vnon Gelatine auszugehen,
die auf ein mittleres Molekulargewicht von 15 000 bis 36 ooo abgebaut ist,
läßt sich das Verfahren auch auf nicht abgebaute Gelatine oder Gelatine anderer
Molekulargrößenbereiche anwenden. Wenn eine nicht abgebaute Gelatine oder eine Gelatine
mit einem größeren Molekulargrößenhereich verwendet wird, entsteht eine halbheterogene
Mischung von Derivaten. Infolgedessen wird eine .geringere Ausbeute des gewünschten
Additionsprodultts erzielt, und es bedarf dann einer größeren Anzahl von. Reinigungsstufen
zur Erzielung eines befriedigenden Produkts. Bei Verwendung von Gelatine eines wesentlich
verschiedenen Molekulargrößenbereichs kann eine, entsprechend andere pH-Einstellung
erforderlich sein, um den Säuregehalt der Reaktionsmischung auf den isoe.l,ektrisohen
Punkt des jeweiligen Additionsprodukts zu bringen.
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Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich in erster
Linie auf Gelatine, weil diese kein körpereigener Stoff ist und daher besordere
Probleme mit sich bringt, die bei den Blutproteinen nicht auftreten. Beim
Arbeiten mit Blutproteinen beginnt das erfindungsgemäße Verfahren natürlich mit
der aus dem Blut isolierten Proteinfraktion, ohne daß ein Abbau dieses Proteins
erfolgt. Im übrigen ist das Verfahren das gleiche, wie es für Gelatine beschrieben
wurde, mit der Ausnahme. daß die i.soelektrischen Punkte der verschiedenen Derivate
verschieden sind und diese Derivate sich bei ihren neuen iscelektrischen Punkten
schärfer als unlösliche Produkte abscheiden.
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Serumalbumin eignet sich gut als Blutplasmaersatz oder -streckmittel,
da es eine hohe, kolloidosmotische Wirkung besitzt. Die Derivate nach der Erfindung
besitzen jedoch niedrigere isoeleektrische Punkte und demgemäß eine verhältnismäßig
höhere kolloidosmotische Wirkung in dem physiologischen Bereich.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der neuen Klasse
von gereinigten menschlich serologisch verträglichen Proteinderivaten nach der Erfindung.
Beis"piel.i 300o ccm einer 6o/oigen Gelatinelösung (i8o g) mit einem mittleren Molekulargewieht
von etwa 36 ooo (H,=0,36 bei 55°) wurden bei- 36° gehaIten und durch Zusatz einer
konzentrierten Natriumhydroxydlösung auf ein. pl, von 9 eingestellt. 6o g pulverisiertes
Bernsteinsäureanhydrid wurden der Gelatinelösung allmählich unter Rühren zugesetzt.
Mit. fortschreitender Reaktion wurde das
pt, durch weitere Zusätze
konzentrierter Natriumhydroxydlösung auf 8,5 bis io gehalten. Nachdem die Zugabe
des Bermsteinsäureamhydrids beendet war und keine weitere Änderung des pH mehr eintrat,
wurde die Reaktion als beendet angesehen. Die Mischung wurde dann durch Zugabe von
13.2 ccm konzentrierter Salzsäure auf ein PH von 2,7 eingestellt. Nach: einer kurzen
Absetzzeit schied sich am Boden des Gefäßes eine nicht mischbare sirupartige Fraktion
höher Dichte in Form einer klaren Schicht ab. Die überstehende Flüssigkeit enthielt
niedrigmalekulare Stoffe und keaktionsnebehprodukte und wurde abgehebert, worauf
die schwere Schicht vollkommen in einem Scheidetrichter abgeschieden wurde. Diese
schwere Ülfraktion wurde in :21 destillierten Wassers bei einem pH von 4,5 bis
5,0 gelöst; dann wurde das PH auf 2,5 bis 3,0 eingestellt und das
Produkt durch -allmählichen Zusatz von 584 g festem Natriumchlorid ausgefällt, wobei
eine etnva 30%ige NaCI-Lösung entstand. Der Niederschlag verteilte sich zunächst
als. Dispersion. in der ganzen Lösung und bildete mit steigender Konzentration am
-Natri,umohloirid ein flockiges Koagulat, das nach oben stieg. Währemd der Zugabe
der letzten Koohsalzmemge muB darauf geachtet werden, -da.B das Salz nicht von dem
Koagulat eingeschlossen wird: Die Kochsalz-und Reaktionsprodukte von niedrigerem
Molekulargewicht enthaltende Lösung wurde von dem Koagulat abgetrennt, aus welchem
die eingesrhlos; seien Tropfen der Kochsalzlösung soweit -wie möglich entfernt wurden..
Eine praktisch vollkommene Entfernung der Kochsalzlösung ist notwendig, um in dem
Produkt zu einem Verhältnis, von nicht mehr als i Teil Natriumchlorid auf 3,33 Teile
des gereinigten Add iitionsprodukts zu gelangen und in dem endgültigen intravenös
anwendbaren Präparat eine isotonische Natriumchloridkonzentration von 0,9°/o, bezogen
auf ein 3%iges Gelatine-Bernsteinsäureadditionspradu°kt zu erhalten. Das gereiinigte
Produkt wurde dann in sterilem, pyrogemfreiem destilliertem Wasser unter Zusaitz
von konzentriertem h'Yatriumhydroxyd aufgelöst, um eine Lösung mit einem PH von
7,0 zu erhalten. Diese wurde werter bei einem pH von 7,3 auf eine endgültige
Konzentration von 3 % in isotonischem Natriumchlorid eingestellt. Die Ausbeute an
gereinigtem Gelatine -BernsteinsäuzeadditiionspTodukt betrug 1o5 g, was einer 58,311/eigen
Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge der Gelatine, entspricht. Die Lösung wurde
filtriert, in 5oo-ccm-Flaschen eingefüllt und unter einem Dampfdruck von i at 2o
Minuten. läng -sterilisiert, worauf sie so fort intravenös angewandt werden konnte.
Das Produkt in einer 3%ngemKonzentration in. einer isotonschen Natriumchloridlös.umg
gelierte bei etwa io°.
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Will man eine mehr als 30/aige Lösung des gereinigten Additionsprodukts
herstellen, so muB man die Lösung. des mit Natriumchlorid ausgefällten und gewashenen
Materials gegen Wässer dialysieren; -um weitere Mengen Natriumchlorid zu ent:-fernen,
so daB die endgültige Lösung nicht mehr als 0,9°/o Natriumchlorid enthält. Anstatt
des Aussalzems und der Diälyse kann auch eine Ausfällung mit Methylalkohol, Äthylalkohol,
Isiopropylalkodwl oder Aceton erfolgen.
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Beispiel e Die Arbeitswed-se nach Beispiel i wusde mit der Ausnahme
wiederholt, daB die Reaktion in einem pH-Bereich von 5,5 bis. 6,5 durchgeführt wurde.
Die Reaktionsmischung wurde dann der Fraktionäerungsbehandlung unterworfen, um das
gewünschte Adlitiiansprodukt zu erhalten, und dieses wurde wiederholten Reinigungsbehandlungen
naäh Beispiel i unterworfen. Die Ausbeute war beträchtlich geringer als im Fall
des Beispiels i. Beispiel 3 Das Verfahren nach Beispiel i 1 wurde mit der Ausnahme
wiederholt, daB das Gelatineausgangismaterial ein mittleres Molekulargewicht von
etwa 2oooo besaß (H0=o,i8 bei 55°). Die schwere Fraktion des Additionsprodukts ergab
eine Ausbeute von 49,5%, bezogen auf Gelatine. Das gereinigte Additionsprodukt ergab
in isotomischem Natriumehlorid eine.3%ige Lösung mit einem PH von 7,3, die noch
unterhalb 5° flüssig- war. Beispiel 4 i5oo ocm einer 6°/oigen Lösung von Gelatine
(9o g) mit einem mittlerem Malekulargewicht von etwa 2o ooo bis 25 ooo wurden auf
eine Temperatur von 13° und mit Natriumhydroxyd auf ein pH.von 9 eingestellt. Dann
wurden langsam unter Umrühren 30 g Itaconsäureanhydrid zugesetzt, wobei das
pH durch Zugabe von NatriumhydräcZyd im Bereich von 9 bis io gehalten.wurde. Sobald
keine weitere Änderung des pu mehr feststellbar war, wurde die Reaktion als -beendet
betrachtet und das PH mittels konzentrierter Salzsäure auf 3,5 eingestellt, woben
sich beim isoelektrisehen Punkt die schwere Phase abschied. Diese wurde in einem
Scheidetrichter abgetrennt und unten- Zugabe von Natriumhydroxyd in 11 destilliertem
Wasser bei einem PH von 3.95 gelöst, dann bei einem pH von 3,5 mit Salzsäure wieder
ausgefällt. Dieses Produkt ergab eine Ausbeute von 1o2 0/0, bezogen auf das Ausgangsmaterial.
Von dem Produkt wurde eine 60/mige Lösung in isatonischem Kochsalz bei einem PH
von. 7,3 hergestellt- und in einem Autoklav 2o Minuten lang bei einem Druck
von i at mit Dampf behandelt. Diese Lösung war zur intravenösen Anwendung, geeignet.
Die 6%ige Lösung bildete nach 18 Stunden langem Stehen bei 5° kein Gel. Beispiel
s 15o0 ccm einer 6%igen Lösung von Gedartine (9o g), die ein, mittleres Malekulargewicht
von 15 ooo bis 2o ooo besaß (H,='0,14 bis o, i 8 bei 55°), wurden bei Zimmertexnperatur
mit N.atriumhydroxyd auf ein PH vom, 9 eingestellt. 30 g CitraconsäuTeanhydrid
wurden allmählich unter Umrühren
zugegeben, wobei dass pli zwischen
9 und io gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann auf den isoelektrischen
Punkt (px 2,78) eingestellt, bei dem sich die schwere Fraktion abschied. Diese wurde
in 11 destilliertem Wasser unter Einstellung das pH-Wertes mittels konzentrierter
Natronlauge gelöst. Nach dem Ansäuern auf ein pH von 2,78 wurde das Additionsprodukt
durch Zugabe von i5o g Natriumchlorid ausgefällt. Eine 6o/aige Lösung des Produkts
in isoitonischein Kochsalz bei einem pH von 7,3 bildete nach 18 Stunden bei 5 °
ein Gel. Nach einer zweiten Reinigung in der gleichen Weise wurde das Produkt in
konzentrierter wäßriger Lösung bei einem pi von 7 in einem Viskingrohr gegen fließendes
Wasser 2 Stunden. lang dialysiert, um den Salzgehalt auf unter o,9 g je 6 g des
Gelatineadditionsprodukts herabzusetzen. Beispiel 6 300o ccm einer 60/aigen Lösung
von Geil.atine (i So g) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 (Ho
= o,i8) wurden bei 28 bis 37'
mit konzentrierter Natriumhydroxydlösung auf
ein pH von 9 eingestellt. Dann wurden unter Umrühren allmählich 6o g Bernsteinsäurechlorid
zugegeben. Mit dem Fortschreiten der Reaktion wurde das pH durch regelmäßigen Zusatz
von konzentrierter NaOH zwischen 8,5 und io gebarten, bis i28-ccm NaOH-Lösung zugegeben
waren. Sobald keine weitere Änderung des ph mehr festzustellen war, wurde die Reaktion
als beendet betrachtet. Die Mischung wurde dann durch Zugabe von 89 ccm konzentrierter
Salzsäure .auf ein pi von 2,3 eingestellt. Die :schwere ölige Fraktion des Gelatinederivats
wurde in 1,5 1 destilliertem Wasser gelöst und durch allmähliche Zugabe von
607 g festem N atriumchlorid bei einem pH von 3 ausgefällt. Das gereinigte
Produkt wurde dann unter Zusatz von konzentrierter Natriumhydroxydlösung in sterilem,
pyrogenfreiem destilliertem Wasser zu einer Lösung vorm PH 7 gelöst. Diese Lösung
wurde schließlich zu einer 3'o/oigen Gelatinederivatlösung in einer o,9o/oigen Kochsalzlösung
mit einem pli von 7,3 eingestellt. Die Ausbeute betrug 949=5:2,:2%, bezogen auf
die Ausgangsmenge der Gelatine. Die Lösung wurde filtriert, in 5oo ccm enthaltende
Flaschen abgefüllt und unter einem D.ampfd.ruek von i a!t 2o Minuten lang sterilisiert.
Sie was dann für intravenöse Anwendung geeignet. Das Produkt blieb unterhalb 5°
flüssig. Beispiel ? 3ooo ccmeiner 6%igen Lösung von Gelatine (i8o g) mit einem mittleren
Molekulargewicht von etwa 20 ooo (H0 = o,18) wurden bei 22 bis 30° mit Natriumhydroxydlösung
auf ein pH von 9 eingestellt. Dann wurden. langsam unter Umrühren 6o g Fumarsäu.rezhlorid
zugegeben. Mit fartschreitender Reaktion wurde das pH durch regelmäßige Zugabe t-on
Natronlauge auf 8,5 bis io gehalten, bis insgesamt 133 ccm zugesetzt waren. Sobald
keine weitere Änderung des pH mehr festzustellen war, wurde die Mischung mit 8o
ccm konzentrierter Salzsäure auf ein pH von 2,5 eingesäuert. Die schwere Ölfraktion
wurde in 21 destilliertem Wasser gelöst und die Lösung mit Natriumhydroxy d auf
ein pH von 7 eingestellt. Es wurde eine geringe Menge unlöslicher Flocken abfiltrieTt
und dann die schwere Fraktion durch allmählichen Zusatz von 6oo g festem Natriumchlorid
bei PH 3 ausgefällt. Das, gereinigte Produkt wurde unter Zusatz von. konzentrierter
Natronlauge in sterilem, pyrogenfreiem Wasser zu einer Lösung mit einem PH von 7
gelöst. Diese Lösung wurde dann nach der Analyse weiter in o,9%iger Natriumchloridlösung
zu einer 3%igen Gelatinederivatlösung mit einem pi von 7,3 gelöst. Die Ausbeute
betrug 80 g = 44,4 %, bezogen auf die Ausgangsmenge der Gelatine. Die Lösung wurde
filtriert, in 500 ccm fassende Flaschen. abgefüllt und unter einem Dampfdruck
von i at 2o Minuten lang- sterilisiert, wonach sie für intravenöse Anwendung geeignet
war. Das Prüdukt blieb unterhalb 5° flüssig.
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Es können auch andere Halogenide der Polycarboms-äuren an Stelle der
Chloride zur Herstellung brauchbarer Proteinderivate nach denn obigen Verfahren
verwendet werden. Die Reinigung erfolgt in gleicher Weise.
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Es ist wesentlich, daß Proteinstoffe einer milden Behandlung unterworfen
werden,, um .ihre Hydralyse zu vermeiden. Deshalb ist die Anwendung niedriger Temperaturen
und kurzer Reaktiomszeifen angezeigt. Für die Reaktion zwischen Gelatine und Säureanhydrid
oder -chlorid beträgt die günstigste Zeitdauer io bis 30 Minuten. In dieser
Zeit findet kein merklicher Abbau des Proteinmo@le@lcüls statt.