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Verfahren zur Herstellung eines Insulinpräparates mit verlängerter Wirkungszeit Wird einem Diabeteskranken Insulin injiziert, so wird ein rasches Absinken des Blutzuckerspiegels beobachtet, doch ist dieser Effekt nicht von langer Dauer. Es sind deshalb oft zwei Insulininjektionen innerhalb 24 Stunden nötig, um einen normalen Blut- znekerspiegel aufrechtzuerhalten.
Uni die Notwendigkeit solch zahlreicher Injektionen zu vermeiden, wird das Insulin gewöhnlieh mit einem basischen Protein, wie Protamin, zusammengebracht, meist unter Zusatz von Zink, wodurch ein Zink-Protamin- Insulin-Präparat in Form einer Suspension erhalten wird, welches bei der Injektion eine längere Wirkungszeit besitzt als Insulin.
Dieser Effekt ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass sieh die gebildete Verbindung bei pH-Werten in der Nähe des Neutralpunktes nur schlecht löst und somit als Insulinreservoir oder depot im Körper dienen kann, aus dem langsam Insulin in den Blutstrom über- iritt. Derartige Präparate stellen zwar gegen- über den früher verwendeten Insulinlösungen einen beachtlichen Fortschritt dar, vermögen aber doch nicht ganz zu befriedigen, weil sie ihren hypoglykämisehen Effekt ziemlieh langsam ausüben, so dass oft eine gleichzeitige Injektion einer Insulinlösung nötig ist, um den Blutzuekergehalt rasch genug zu senken.
Dieses Vorgehen ist aber auch nicht völlig zufriedenstellend, da verschiedene Marken und Ansätze von Protamin-Zink-Insulin- Suspensionen sich durch die im Überschuss über das isophane Verhältnis anwesende Prot- aminmenge beträchtlich unterscheiden, so dass Mischungen von löslichem Insulin mit solchen Präparaten einen verschiedenen hypoglykämi- schen Effekt besitzen können. Zudem bleiben die Protamin-Zink-Insulin-Suspensionen beim längeren Lagern nicht immer physikalisch unverändert.
Es können sich Zusammenballungen bilden oder ein Dünnerwerden eintreten, so dass die Ansprechzeit des Blut.zucker- gehaltes nach einer Injektion unerwünschte Veränderungen erleiden kann. Ausserdem sedimentieren die Suspensionen beim Lagern, so dass sie vor dem Aufziehen in die Spritze kräftig geschüttelt werden müssen. Dadurch wird aber ein Schäumen mit allen seinen Nachteilen hervorgerufen.
Ein weiterer Nachteil dieser und ähnlieher Präparate liegt in der Verwendung von Protamin, einem aus natürlichen Quellen isolierten Material, dessen Zusammensetzung von Fall zu Fall verschieden sein kann, was ein verschiedenes ehemisehes und biologi sches Verhalten zur Folge hat. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von Protamin liegt darin, dass dieses bei 37 und PH 7 einer langsamen Autolyse unterliegt, woraus sich ergibt, dass
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ein unter Verwendung von Protamin hergestelltes Insulinpräparat bei einem physiologischen pH unter Umständen nicht stabil ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von bei einem pji zwischen 2 und 4 löslichen Insulinpräparaten mit verlängerter Wirkungszeit Das Ver fahren ist, dadurch gekennzeichnet, dass man Insulin und ein synthetisches, basisches Poly- peptid, das nicht weniger als 8 Aminosäureeinheiten pro Molekül enthält, miteinander umsetzt.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Reaktion zwischen Insulin und dem synthetischen Polypeptid in Gegenwart einer löslichen Zinkverbindung.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Präparate sind dem Protamin-Zink-Insulin (Suspension) darin überlegen, dass sie 1. nach der Injektion einen rascheren Abfall des Blutzuckerspiegels bewirken, 2. Lösungen und nicht Suspensionen darstellen und deshalb leichter aseptisch in einen eine mehrfache Dosis enthaltenden Behälter abgefüllt werden können und 3. so hergestellt werden können, dass sie je nach Wunsch den hypoglykämischen Effekt während einer kürzeren oder längeren Zeit ausüben. Ihre Wirkungszeit ist aber immer länger als diejenige einer Insulinlösung.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung der oben definierten Polypeptide gegenüber natür- liehein Protamin liegt in der grösseren Ein- heitliehkeit der mit den ersteren hergestellten Insulinpräparate.
Gute Resultate werden zum Beispiel mit Poly peptiden aus Ly sin erzielt. Es kommen aber auch Polypeptide aus Ornithin in Be- traeht, ebenso Misehpolypeptide aus Ly sin und Ornithin oder aus den genannten Aminosäuren und Valin, Phenylalanin, Leuzin, Isoleuzin oder Glyzin. Misehpolypeptide aus Lysin, Leuzin und Phenylalanin werden bevorzugt.
Die Synthese der für das erfindungsgemässe Verfahren in Betracht kommenden Polypeptide kann nach den Angaben in der Faehliteratur erfolgen. Sie kann vorteilhafterweise durch eine einstufige Polykondensation eines geeigneten Derivates der Aminosäure, etwa des Na-Carboxy-anhvdrides, durechgeführt werden, wobei die freie Aminogruppe in #-Stellung des Lysins oder Ornithins durch eine geeignete Gruppe, beispielsweise ein Carbobenzoxyradikal, die später wieder entfernt wird, geschützt sein kann. Die Polykondensation wird üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel, z. B.
Benzol, Nitro- benzol, Nitromethan, Dioxan, Pyridin oder Äthvlaeetat bei einer zwisechen 20 und 100 C liegenden Temperatur in Gegenwart eines die Reaktion auslösenden Stoffes, wie Wasser oder Ammoniak, durchgeführt. Die Kettenlänge der Polypeptide hängt von der Menge des auslösenden Stoffes ab. Die Polymerisation eines N-Carboxyanhydrides ist eine Kettenpoly me- risation, bei der das Molekulargewicht durch das Konzentrationsverhältnis von Monomer zu Auslöser bestimmt wird, wenigstens für Kettenlängen bis zu 15 Aminosäureresten. Ein Polymer mit jeder gewünsehten mittleren Kettenlänge kann erhalten werden, indem das Molekularverhältnis Mononmer Auslöser der gewünsehten Kettenlänge entsprechend gewählt wird.
Die so erhaltenen synthetischen Polypeptide sind nicht einheitliehe Produkte, sondern bestehen aus Molekülen mit etwas verschiedenen Kettenlängen. Durch sorgfältiges Einhalten bestimmter Reaktionsbedingungen und Verwendung reiner Ausgangsstoffe können aber immerhin Produkte erhalten werden, die eine reproduzierbare mittlere Kettenlänge aufweisen und die sieh für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gut eignen. Die mittlere Kettenlänge der Produkte kann nach einer der zahlreichen bekannten Methoden zur Endgi-uppensehätzung ermittelt werden, z. B. nach der Methode von Woiwod (Bioeheni. Journ. 19.19, 45, 412).
Zur Herstellung soleher Polypeptide werden als Ausgangsstoffe die natürlich vorkoin- inenden L-Aminosäuren bevorzugt. Es können aber auch DL-Aminosäuren und selbst DAminosäuren verwendet. werden.
Die Herstellung gemischter Polypeptide kann dureh Verwendung von Gemischen der
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entsprechenden Na-Carboxy-anhdride in der besehriebenen Weise erfolgen. Die Menge neutraler Aminosäuren in solchen Produkten sollte aber nicht so gross sein, dass das Salz des entstandenen Polypeptids (z. B. das H@drochlorid) in Wasser unlöslich ist. Bei der Verwendung der bevorzugten Aminosäure L-Lysin sollte der Gehalt der gemischten Poly- anminosäuren an L-Lvsin nicht unter 30 Molprozente sinken; 50 Molprozente L-Lysin sind wünsehenswert.
Die Menge des zur Herstellung einer löslichen Insulin-Zink-Polypeptid-Verbindung nötigen Polvpeptides hängt, je nach der gewünschten Wirkungszeit, etwas von der Natur des Polypeptides ab. Bei der Verwendung eines Poly peptids aus L-Ly sin and L-Leuzin (50:50 Molprozente) wird mit einer dem doppelten isophanen Wert entsprechenden Menge Polypeptid ein lösliches Insulinpräparat erhalten, dessen Wirkungszeit diejenige einer Protamin-Zink-Insulin-Suspension übertrifft. Wird das genannte Polypeptid in isophaner Menge verwendet, so entspricht die Wirkungszeit des erhaltenen Produktes etwa derjenigen des Protamin-Zink-Insulin-Präparates. Das trifft auch für ein Präparat zu, das unter Verwendung der dreifachen isophanen Menge Polv-L-Lvsin erhalten wird.
Wenn das Präparat eine Wirkungszeit besitzen soll, welche diejenige eines Protamin-Zink-Insulin-Präpa- rates übertrifft, werden also im allgemeinen Polypeptidmengen zu verwenden sein, die das zwei- bis dreifache des isophanen Wertes betragen.
Unter dem Ausdruck isophanes Verhältnis oder isophaner Wert ist diejenige Menge eines synthetischen basiseben Poly- peptides in Milligramm zu verstehen, die nötig ist, um mit 10 Milligrammen Insulin isophane Verhältnisse herzustellen.
Das isophane Verhältnis kann in folgender Weise bestimmt werden: Insulin und Polv- peptid werden bei einem pH von 7,4 vermischt, wobei sich entweder sogleich oder nach einigem Stehen ein Niederschlag bildet. Dieser wird entfernt und die klare Flüssigkeit in zwei Teile geteilt. Isophane Verhältnisse liegen vor, wenn durch Zusatz von Insulin zum einen Teil und von Polypeptid zum andern Teil der Lösung die gleiche Opaleszenz entsteht. Eine Methode zur Bestimmung des isophanen Verhältnisses wird später mit mehr Einzelheiten beschrieben werden.
Der PH der Insulin-Zink-Poly peptid-Lösung muss niedrig genug sein, um ein vollständiges Auflösen der Insulin-Polypeptid-Verbindung zu erlauben, doch darf anderseits die Lösung nicht so stark sauer sein, dass sie bei der Injektion reizen würde. Der pH der Lösung sollte deshalb innerhalb der Grenzen 2,0 bis 4,0 gehalten werden. Das bevorzugte pH-Gebiet ist 2,8 bis 3,5.
Zum Erreichen einer genügend verlängerten Wirkungszeit ist die Anwesenheit geringer Zinkmengen in dem löslichen Insulinpräparat wünschenswert. Der Zinkgehalt kann zum Beispiel nur 0,075% betragen. Bei der Verwendung kristallinen Insulins ist überhaupt kein zusätzliches Zink nötig. In einigen Fällen ergab ein Zinkzusatz (als Zinksalz) in der Grössenordnung von 1 mg Zink/500 Insulineinheiten zufriedenstellende Ergebnisse (vgl. Beispiele 1, 3 und 4). In Beispiel 5 wurde die Zinkmenge auf 0,075% (Gewicht/Gewicht, bezogen auf Insulin) gesenkt, ohne dass die verlängerte Wirkungszeit verloren ging.
Die Herstellung der Insulin-Zink-Poly- peptid-Lösungen für therapeutischen Gebrauch kann erfolgen, indem eine wässrige Insulinlösung mit einer wässrigen Lösung des Poly peptides vermischt wird. Das Polypeptid wird üblicherweise als wasserlösliches Salz, beispielsweise als Hydroehlorid, verwendet. Eine oder beide Lösungen können ein Zink- salz enthalten und auf einen geeigneten, in der Nähe des physiologischen Wertes liegenden PH gepuffert sein.
Die sieh ergebende Suspension wird zum Erreichen vollständiger Lösung auf den genannten p11-Wert angesäuert. Nach einem andern Herstellungsverfahren werden eine w ässrige Insulinlösung Lind eine wä.ssrige Poly peptidlösung, wovon mindestens die eine ein Zinksalz enthalten kann und beide einen unter 4 liegenden besitzen, miteinander- vermischt und die ent-
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stehende klare Lösung dann auf den früher angegebenen PH eingestellt. Den so erhaltenen Lösungen wird vorteilhafterweise ein Antiseptikum, wie Phenol oder Kresol, zugesetzt.
Auch können sie durch Zusatz von Natriumchlorid oder Glycerin isotonisch gemacht werden und noch weitere Stoffe enthalten, die sie auf den gewünschten PH bringen und puffern. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide Im folgenden werden Verfahren angegeben, nach denen für das erfindungsgemässe Verfahren geeignete Polypeptide hergestellt werden können. Herstellung von Poly-L-lysin-hydrochorid N#-Carbobenzoxy-Na-carboxy-L-lysin-anhy- drid (3,35 g, 0,012 Mol) wurde in getrocknetem, siedendem Benzol (152 em3) gelöst und der Lösung wässriges Dioxan (2,055 em3, 25% Wasser enthaltend) zugesetzt. Nach 16stündi- gem Erhitzen am Rückfluss wurde das ausgeschiedene Polymer (2,9 g) abgetrennt, mit warmem Benzol und Äther gewaschen und getrocknet.
Das erhaltene Poly-carbobenzoxy- L-lysin (1,9 g) wurde in 100 cm3 Eisessig suspendiert und bei 40-50 C während 8 Stunden trockener Chlorwasserstoff durch die Suspension geleitet. Dann wurde das Polymer abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurde gereinigt, indem es in Wasser gelöst, die Lösung mit Holzkohle behandelt, filtriert und das Filtrat gefriergetrocknet wurde. Es wurde so 0,9g Poly- L-lysin-hy drochlorid erhalten.
Herstellung von Poly-(L-lysin : L-leuzin)- hydrochlorid mit 50 Holprozent L-Lysin N#-Carbobenzoxy-Na-earboxy-L-lysin-anhy- drid (6,4 g, 0,0209 Mol) und Na-Carboxy-L- leuzin-anhydrid (3,28 g, 0,0209 Mol) wurden in 130 cm3 trockenem Dioxan gelöst, 6,97 cm3 0,2n-Ammoniak in Dioxan zugesetzt und die Lösung eine Stunde bei Zimmertemperatur und anschliessend über Nacht auf dem Wasserbad gerührt. Der abgekühlten, viskosen Lösung wurden 260 em3 0,16n-Chlorwasserstoff zugesetzt und die entstehende Suspension des Polymers (7,8 g) 6 Stunden gerührt. Dann wurde das Produkt abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Poly-(carbobenzoxy-L-lysin : L-leuzin) (6,2 g) wurde in 200 em3 Eisessig gelöst und trockener Chlorwasserstoff bei 50 C unter Rühren 6 Stunden durch die Lösung geleitet. Durch Zusatz von Äther wurde das Polymer als Öl ausgesehieden. Dieses wurde abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das Polty - (L-lysin : L-leuzin) - hydroehlorid (3,35 g) wurde durch Lösen in Wasser. Behandlung mit Holzhohle und Gefr iertroeknen des Filtrates gereinigt.
Herstellung von Poly-(L-lysin:L-phenyl- alanin)-hydrochlorid mit 50 Molprozent L-Lysin 7,8 g oder 0,0255 Mol N#-Carbobenzoxy-Nra- earboxy-L-lysin-anhydrid und 4,87 g oder 0,0255 Mol Nα-Carboxy-L-phenylamin-anhy- drid (Smp. 93-95 C) wlurden in 160 em3 trockenem Dioxan gelöst. 3,5 emn3 0,49n-Amnmo- niak in Dioxan wurden zugesetzt und die Lösung zuerst eine Stunde bei Zimmertemperatur und dann über Nacht auf dem Wasserbad gerührt. Der abgekühlten Lösung wurden 325 cm3 0,16n-Chlorwasserstoff zugesetzt und die Mischung weitere 6 Stunden gerührt. Das Polymer (10,05 g) wurde isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Poly-(carbobenzoxy-L-lysin : L-phenyl- alanin) wurde in 200 em3 Eisessig suspendiert und bei 40-50 C unter Rühren während q Stunden trockener Chlorwasserstoff in die Suspension eingeleitet. Während dieser Zeit löste sich das Polymer zuerst auf und schied sich dann als Öl aus. Der abgekühlten Mi- sehung wurde Ä tlier zugesetzt und das festgewordene Polymer abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getroeknet. Das Polt' -(L-lysin : L-phenylalanin) -hydroehlorid wurde in Wasser gelöst, mit Holzkohle behandelt und das Filtrat. gefriergetrocknet.
Andere Polymere wurden in gleicher Weiso aus den \7-Carboxy-anhydriden der 'folgenden Aminosäuren hergestellt: DL-iso-Leuzin, DL-
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Valin, Glyzin, S-Carbobenzoxy-DL-ornithin, DL-Phenylalanin, DL-Leuzin (das Anhydrid wurde wie die L-Form hergestellt; Smp. 50 bis 52 C, Zersetzung bei 94 C) und D-Lysin (das Anhy drill wurde wie die L-Form hergestellt; Smp. 97-100 C unter Zersetzung). Methode zur Bestimmung des isophanen Verhältnisses Benötigte Lösungen: 1. 0,25%ige (Gewieht/Volumen) Poly- peptidlösung in Wasser.
2. 4000 Einheiten Insulin werden in einem minimalen Volumen n/10-HCl gelöst und die Lösung mit Wasser auf 100 cm3 verdünnt. Der Lösung werden 0,3 Volumprozent Tri- kresol und 1,82%iges (Gewicht/Volumen) Glycerin zugesetzt. Der Lösung werden 20 em3 Sörensens Phosphatpufferlösung (m/15, pH 7,4) zugegeben und der pH der Mischung auf 7,4 eingestellt.
Sörensens Pufferlösung: 1,75 g KH2PO4 und 7,65 g Na2HPO4 werden in Wasser gelöst und auf 100 em3 verdünnt. Das pH wird auf 7,4 eingestellt. Vorgehen: 1. 4 em3-Portionen der Insulinlösung werden in Reagenzgläser abpipettiert und den Röhrchen von 0,5 bis 2,0 oder wenn nötig mehr cm3 steigende Mengen der Polypeptid- lösung zugesetzt. Die Gläser werden geschüttelt, 5 Minuten stehengelassen und die gebildeten Suspensionen durch ein Filterpapier Nr. 42 von Whatman filtriert.
2. Von jedem Filtrat werden zwei 1-em3- Portionen in je ein Mikroreagenzglas abpipet- tiert. Es werden so zwei Reihen von R.eagenz- gläschen erhalten, die mit I bzw. mit P bezeichnet werden. In jedes Gläschen der Reihe I werden 6 Tropfen Insulinlösung, in jedes Gläschen der Reihe P 2 Tropfen Polypeptid- lösung gegeben.
3. Nach 15 Minuten werden die Trübungen in den beiden Reagenzglasreihen beobachtet. Der Punkt, bei welchem die entsprechenden I- und P-Gläschen gleiche Trübung zeigen, wird als isophaner Punkt angenommen.
Berechnung Wenn x mg Insulin (= 4000 Einheiten) in 120 cm3 der ursprünglichen Insulinpufferlösung enthalten waren, y mg Polypeptid in 100 cm3 Wasser und z cm3 Polypeptidlösung zum Bilden einer isophanen Mischung zugesetzt wurden, werden
EMI5.15
Insulin durch mg Polypeptid gefällt. Also werden
EMI5.16
EMI5.17
Polypeptid 10 mg Insulin fällen. Beispiel. 1 1.74 mg Insulin wurden in 10 em3 n/10-HCl gelöst und der Lösung 0,3 cm3 Kresol, 1,6 g Glycerin, 16,7 mg Zinkchlorid (wasserfrei) und 9 mg Natriumchlorid zugesetzt, so dass die Lösung, auf das Gewicht des Insulins bezogen, 4,6 % Zink enthielt. Eine Lösung von 240 mg Polylysin in m/32-Phosphatpuffer, pH 3,1, wurde zugesetzt, und die Mischung mit Phosphatpuffer auf das Gesamtvolumen 100 cm3 gebracht. Der isophane Wert des Polypeptides war 0,95 mg/10 mg Insulin.
Dieses Präparat wurde durch einen Übers- Kreuz-Test an 12 Kaninchen mit einem Standard-Insulin verglichen. Die Kaninchen worden in 6 gleiche Gruppen eingeteilt und Blutzuckerbestimmungen am vereinigten Blut jedes Paares vor der Injektion und anschlie- ssend stündlich während 6 Stunden ausgeführt. Die verabfolgte Dosis pro Tier war 0,035 cin3 subkutan.
Die beobachteten Blutzuckerwerte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. t
EMI5.23
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> ursprünglichen <SEP> Wertes
<tb> Präparat <SEP> Gehalt <SEP> nach <SEP> Stunden
<tb> i <SEP> '- <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
<tb> Standard-Insulin <SEP> 40 <SEP> Eicm3 <SEP> 48,9 <SEP> 48,3 <SEP> 60,0 <SEP> 79,3 <SEP> 88,3 <SEP> 95,5
<tb> Polylysin-Zink-Insulin <SEP> 40 <SEP> EI/cm3 <SEP> 68,2 <SEP> 56,0 <SEP> 52,0 <SEP> 53,2 <SEP> 52,0 <SEP> 56,4
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Beispiel 2 Eine Lösung von Poly-L-lysin-Zink-Insulin mit einem Gehalt von 3 mg Polylysin und 2,0 mg Zink pro 100 Insulineinheiten wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Sie hatte den PH 3,1 und enthielt 0,3% Kresol und 1,6% Glycerin. Der isophane Wert des Polypeptides war 0,95 mg 10 mg Insulin.
Dieses Präparat wurde an Kaninchen geprüft. Die während einer Periode von 6 Stunden erhaltenen mittleren Blutzuclkerwerte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
EMI6.1
<tb> Angenommener <SEP> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> ursprünglichen <SEP> Wertes
<tb> Gehalt <SEP> Tag <SEP> nach <SEP> Stunden
<tb> I <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6
<tb> 1 <SEP> 76 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 60 <SEP> 63 <SEP> 71
<tb> 40 <SEP> Ecm3 <SEP> 2 <SEP> 83 <SEP> 67 <SEP> 59 <SEP> 64 <SEP> 61 <SEP> 77
<tb> Mittel <SEP> 79 <SEP> 66 <SEP> 59 <SEP> 62 <SEP> 62 <SEP> 74
Beispiel 3 a) l74 mg Insulin (Gehalt 23 I. E/mg) wurden in 10 cm3 n-10-HCl gelöst und der Lösung 16,7 mg ZnCl2, 9 mg NaCl, 0,2 em3 Trikresol und 1,6 cm3 Glycerin zugesetzt, so dass sie, auf das Gewieht des Insulins bezogen, 4,6% Zink enthielten.
Dieser Lösung (Lösung A) wurden etwa 70 cm3 m/32-Na2HPO4 Lösung und dann eine Lösung von 124 mg Poly-(L-leuzin : L-lysin)-hydroehlorid, enthaltend 50 Molprozente L-Ly sin, in 8 em3 der Phosphatlösung zugesetzt. Die Lösungen wurden schnell vermischt und das Volumen durch Zusatz von Phosphatlösung auf 100 cm3 gebracht. Die gebildete Suspension wurde mit 2,5 cm3 n-HCl auf PH 3,2 angesäuert, wodurch eine klare Lösung entstand.
b) Zu einer mit der obigen Lösung A identischen Lösung wurden 2,5 em3 n-HCl gegeben, dann wurden die Puffer- und die Peptidlösung zugesetzt, wodurch eine klare Lösung mit dem pH 3,06 erhalten wurde.
e) Zu einer mit der obigen Lösung A identischen Lösung wurde die gleiche Menge in 0,9 %iger NaCl-Lösung aufgelöstes Polv- peptid gegeben, das Volumen mit Salzlösung- auf 100 em3 gebracht und der pH auf 3,00 eingestellt.
Der isophane Wert des Polypeptides war 1,64 mg/10 mg Insulin.
Diese drei Lösungen wurden an drei Gruppen zu je 5 Kaninchen geprüft, die vor der Verwendung 21 Stunden gefastet hatten. Eine Dosis von 0,4 I.E/kg wurde verwendet; eine gleiche Dosis von Standard-Insulin wurde einer vierten Gruppe von Kaninchen verabreicht. Die nach 0, 1, 2, 4 und 6 Stunden gefundenen mittleren Blutzuckerwerte sind unten angegeben.
EMI6.8
<tb> Zeit <SEP> Blutzuckerwerte <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> in <SEP> Stunden
<tb> Standard-Insulin <SEP> Präparat <SEP> 3a <SEP> Präparat <SEP> 3b <SEP> Präparat <SEP> 3c
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50,8 <SEP> 66,8 <SEP> 66,2 <SEP> 62.9
<tb> 2 <SEP> 53,6 <SEP> 58,4 <SEP> 63,9 <SEP> 54,1
<tb> 4 <SEP> 90,7 <SEP> 65,3 <SEP> 66.7 <SEP> 59,6
<tb> 6 <SEP> 109,2 <SEP> 76,9 <SEP> 87,8 <SEP> 73,0
Beispiel 4 Wirkung der Veränderung der Polypeptid- menge im Verhältnis zum isophanen Wert. a.) 174 mg Insulin wurden in 10 em3 n/10-HCl gelöst, und der Lösung 0,2 cm3 Tri-
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kresol, 1,6 g Gly eerin, 16,7 mg ZnCl2 und 9,
0 mg NaCl zugesetzt, so dass, auf das Ge- wieht des Insulins bezogen, 4,6% Zink vorhanden waren. Eine Lösung von 20 mg Poly- (L-lysin-L-leuzin)-hydroehlorid, 50 Molprozente L-Lysin enthaltend, in m/32-Phosphat- pufferlösung, pH 2,95, wurde zugesetzt und das Gesamtvolumen mit Phosphatpuffer auf 100 em3 ergänzt. h) Ein mit dem obigen identisches Präparat wurde hergestellt, nur dass 40 mg Poly- peptid verwendet wurden. c) Ein mit a) identisches Präparat wurde hergestellt, nur dass 60 mg Polypeptid verwendet wurden.
Der isophane Wert des Polypeptides war 2,87 mg/10 mg Insulin. Die oben verwendeten Mengen sind demzufolge die 0,4-, 0,8- und 1,2fachen isophanen Mengen.
Gruppen von je 5 Kaninchen wurden zur Prüfung dieser Präparate verwendet und dabei mit Standard-Insulin und einer Prot- amin-Zink-Insuzlin-Suspension verglichen. Subkutane Injektionen von je 0,01 cm3/kg wurden verabreicht.
EMI7.13
<tb> Mittlerer <SEP> Blutzuckergehalt <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<SEP> Präparat <SEP> 4a <SEP> Präparat <SEP> 4b <SEP> Präparat <SEP> 4c
<tb> 1 <SEP> 42,9 <SEP> 62,4 <SEP> 41,7 <SEP> 51,6 <SEP> 49,2
<tb> 2 <SEP> 43,9 <SEP> 56,3 <SEP> 38,8 <SEP> 55,0 <SEP> 48,8
<tb> 4 <SEP> 69,3 <SEP> 58,6 <SEP> 69,6 <SEP> 75,2 <SEP> 53,9
<tb> 6 <SEP> 97,9 <SEP> 76,0 <SEP> 100,1 <SEP> 89,7 <SEP> 67,8
Beispiel 5 174 mg Insulin mit einem Zinkgehalt von 0,075 % wurden in 10 cm3 n/10-HCl gelöst und der Lösung 1,6 em3 Glyeerin, 0,2 em3 Trikresol und 9 mg NaCl zugesetzt. Hierauf wurden der Lösung weiter etwa 80 cm3 iso- toniseher Koehsalzlösung und 120 mg Poly- (L-lysin : leuein)-hy droehlorid, 50 Molprozente L-Lysin enthaltend, in 8 cm3 Kochsalzlösung gelöst, zugefügt. Das Ganze wurde mit Kochsalzlösung auf 100 cm3 ergänzt und der pH auf 3,03 eingestellt.
Drei Gruppen hungriger Kaninchen wurden zum Vergleich dieses Präparates mit Standard-Insulin und mit Protamin-Zink- Insulin-Suspension behandelt.
EMI7.20
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Präparat <SEP> 5 <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 1 <SEP> 65,0 <SEP> 43,8 <SEP> 69,8
<tb> 2 <SEP> 55,1 <SEP> 41,3 <SEP> 50,7
<tb> 4 <SEP> 69,2 <SEP> 66,4 <SEP> 59,9
<tb> 6 <SEP> 70,2 <SEP> 97,0 <SEP> 68,5
Beispiel 6 174 mg Insulin wurden in der minimalen Menge n/10-HCl gelöst und die Lösung mit einer m/32-Na2HPO4Lösung auf 80 em3 verdünnt. Dann wurden 16,7 mg Zinkehlorid. 9,0 g Natriumehlor id, 0,2 em3 Trikresol und 1,6 cm@ Glycerin zugefügt.
Der Zinkgehalt der Lösung, bezogen auf das Gewicht des Insulins, betrug 4,6 %. Eine Lösung von 322,9 mg Poly- (L-lysin : L-leuzin)-hydrochlorid, 30 Molpro- zente L-Lysin enthaltend (isophaner Wert
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8,5 mg/10 mg Insulin), in 8 em3 Phosphatlösung wurde zugesetzt und das Ganze mit Phosphatlösung auf 100 cm3 gebracht. Die gebildete Suspension wurde durch Einstellen des pH mit n-HCl auf 3,25 in eine Lösung übergeführt.
Dieses Präparat wurde im Übers-Kreuz- Test an Gruppen von 10 Kaninchen mit Standard-Insulin verglichen. Eine Dosis von 0,035 cm3 pro Kaninchen wurde verwendet. Die erreichten mittleren Blutzuckerspiegel und ein typisches mit P. Z. I. an den gleichen Kaninchen erhaltenes Resultat sind der folgenden Tabelle zu entnehmen.
EMI8.1
<tb> Blutzucker <SEP> in <SEP> % <SEP> des <SEP> Anfangswertes
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Präparat <SEP> 6 <SEP> Standard-Insulin <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 79,9 <SEP> 55,6 <SEP> 74,8
<tb> 2 <SEP> 72,6 <SEP> 55,9 <SEP> 58,0
<tb> 3 <SEP> 71,8 <SEP> 71,2 <SEP> 57,3
<tb> 4 <SEP> 79,2 <SEP> 83,9 <SEP> 56,7
<tb> 5 <SEP> 80,3 <SEP> 93,7 <SEP> 66,2
<tb> 6 <SEP> 84,4 <SEP> 93,4 <SEP> 73,0
Beispiel i Nach dem Vorgehen von Beispiel 6 wurden mit den unten genannten Polymeren Präparate hergestellt, wobei die zugesetzte Menge Polymer in jedem Fall das 2,4fache des iso- phanen Verhältnisses betrug.
In der Tabelle sind die isophanen Werte jedes Polymers, die zur Herstellung jedes Präparates verwendete Polymermenge und der pH der fertigen Lösung angegeben.
EMI8.4
<tb> Polymerhydrochlorid <SEP> Isophaner <SEP> Wert <SEP> Pulymermenge
<tb> Nr. <SEP> (Molprozente <SEP> jeder <SEP> Komponente) <SEP> mg/Io <SEP> mg <SEP> Insulin <SEP> in <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 174 <SEP> mg <SEP> PH
<tb> Insulin
<tb> a <SEP> 40-L-Lysin <SEP> : <SEP> 60-L-Leuzin <SEP> 4,63 <SEP> 193,2 <SEP> 3,0
<tb> b <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-L-Phenylalanin <SEP> 2,19 <SEP> 91,4 <SEP> 3,2
<tb> c <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Leuzin <SEP> 1,64 <SEP> 68,3 <SEP> 3,2
<tb> d <SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> : <SEP> 50-L-Leuzin <SEP> 1,77 <SEP> 74,0 <SEP> 3,0
<tb> 6 <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Ornithin <SEP> 0,88 <SEP> 36,5 <SEP> 3,2
<tb> f <SEP> 50-L-Lysin <SEP> :
<SEP> 50-DL-Isoleuzin <SEP> 2,19 <SEP> 81,5 <SEP> 3,3
<tb> g <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Valin <SEP> 2,32 <SEP> 96,6 <SEP> 3,0
<tb> h <SEP> 50-L-Lysin <SEP> : <SEP> 50-DL-Phenylalanin <SEP> 2,11 <SEP> 87,6 <SEP> 3,2
<tb> i <SEP> 50-L-Lysin:50-Glyzin <SEP> 1,74 <SEP> 72,5 <SEP> 3,1
<tb> j <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Isolerizin <SEP> 2,32 <SEP> 96,9 <SEP> 3,1
<tb> k <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Valin <SEP> l,31 <SEP> 54,7 <SEP> 3,3
<tb> Z <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-DL-Phenylalanin <SEP> 1,35 <SEP> 56,4 <SEP> 3,0
<tb> M <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-Glyzin <SEP> 1,38 <SEP> 57,6 <SEP> 3,1
<tb> n <SEP> 75-L-Lysin <SEP> : <SEP> 25-L-Leuzin <SEP> 1,37 <SEP> 57,2 <SEP> 3,1
<tb> 0 <SEP> 50-D-Lysin <SEP> :
<SEP> 50-L-Leuzin <SEP> 2,18 <SEP> 91,0 <SEP> 3.3
<Desc/Clms Page number 9>
Einige dieser Präparate wurden mit Standard-Insulin und Protamin-Zink-Insulin ver- g l ielien, wobei für jedes Präparat eine Gruppe von 5 Kaninchen verwendet wurde. Die Dosis betrug 0,4 I. E./kg.
Die erreichten mittleren Blutzuckerspiegel in Prozenten des Anfangswertes sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt.
EMI9.3
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7a <SEP> 7 <SEP> f <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 50,3 <SEP> 65,3 <SEP> 52,4 <SEP> 74,3
<tb> 2 <SEP> 61,4 <SEP> 60,2 <SEP> 53,5 <SEP> 63,2
<tb> 4 <SEP> 96,8 <SEP> 65,8 <SEP> 80,1 <SEP> 74,7
<tb> 6 <SEP> 107,0 <SEP> 70,2 <SEP> 99,1 <SEP> 91,2
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7h <SEP> 7i <SEP> P. <SEP> Z.
<SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 45,4 <SEP> 63,3 <SEP> 50,3 <SEP> 60,0
<tb> 2 <SEP> 51,2 <SEP> 55,6 <SEP> 46,8 <SEP> 62,3
<tb> 4 <SEP> 93,3 <SEP> 65,8 <SEP> 82,1 <SEP> 65,8
<tb> 6 <SEP> 103,5 <SEP> 90,2 <SEP> 97,8 <SEP> 76,1
<tb> Zeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> Standard-Insulin <SEP> 7b <SEP> P. <SEP> Z. <SEP> I.
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 1 <SEP> 51,8 <SEP> 57,6 <SEP> 66,4
<tb> 2 <SEP> 58,3 <SEP> 58,2 <SEP> 57,2
<tb> 4 <SEP> 96,1 <SEP> 73,5 <SEP> 76,7
<tb> 6 <SEP> 98,5 <SEP> 86,8 <SEP> 89,3
Klinische Versuche ball I: Die Lösung enthielt 40 Einheiten Insulin pro cm3 und 1,7 mg Polylysin und 0,6 mg Zink pro 100 Einheiten Insulin.
Sie wurde wie folgt hergestellt: 2,6 g Insulin mit einem Gehalt von 23 Einheiten/mng wurden in einer Mischung von 2,6 cm3 n-HCl und 500 cm3 Wasser gelöst und der Lösung 3,75 g Phenol, 24 g Glycerin und eine Lösung von 0,45 g Zinkoxyd in 114 cm3 n/10 HCl zugesetzt. In diese Lösung wurden 1,02 g gelöstes Polylysin- hydrochlorid (isophaner Wert 0,95 mg/10 mg Insulin) gebracht und der pH durch Zusatz von n-HCl auf 3,2 eingestellt. Das Volumen wurde durch Wasserzusatz auf 1500 cm3 gebracht und das Produkt steril filtriert.
Die Dosis betrug 1,5 cm3. Zum Vergleich wurde beim gleichen Patienten ein anderes Mal Protamin-Zink-Insulin verwendet. 'Die zu den angegebenen Zeiten ausgeführten Blutzuckerbestimmungen ergaben die folgenden Werte, ausgedrückt in mg Zucker/100 ein3 Blut
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EMI10.1
Polylysin-Insulin Blutzucker P rotamin-Zink-Insulin Blutzucker 6o Einheiten/cm3 in mg % Einheiten/cms in mg /o Fasten 1 217 Fasten 1 \308 2 2.10 2 245 Insulin -@ - Insulin Standen 240 Stunden 1 248 1 217 2 202 2 208 3 188 3 210 4 172 4 196 24 163 24 210 25 268 25 204 26 286 26 226 27 268 27 230 28 244 28 283 Fall II: Das Präparat wurde wie bei Fall I hergestellt.
Es enthielt 80 Einheiten Insulin im em3 und pro 100 Einheiten Insulin 1,7 mg Polv- lysin und 0,7 mg Zink. Die Dosis war 1,0 cm3. Die entenstehenden Zahlen geben die mit demn Polvlvsinpräparat allein und mit einer Mi- sehung des Präparates mit einem gleiehen Volumen gewöhnliehen, lösliehen Insulins erhaltenen Werte im Vergleielh zu den mit Protamin-Zink-Insulin und lösliehem Insulin erreiehten an.
EMI10.7
Polylysin-Insulin Mischung von polylysin-Insulin mit protamin-Zink-Insulin Lösliches Insulin 8o Einheiten/em3 8o Einheiten/em3 8o Einheiten/cm3 Blutzucker mg % löslichem Insulin Blutzucker m ' ' Blutzucker mg % g io Blutzucker mg ;
o Fasten 1 490 536 160 250 2 490 556 200 260 3 254 Insulin -3. -Stunden 1/2 480 574 266 258 1 476 456 306 190 2 436 364404 312 21/2 155 3 400 262--36 314 31/ 078 4 344 178258 310 24 284 080 360 25 268 127 360 26 400 153 400 27 388 165 400 28 388 204 400
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