WO2016171198A1 - 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム - Google Patents

微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム Download PDF

Info

Publication number
WO2016171198A1
WO2016171198A1 PCT/JP2016/062591 JP2016062591W WO2016171198A1 WO 2016171198 A1 WO2016171198 A1 WO 2016171198A1 JP 2016062591 W JP2016062591 W JP 2016062591W WO 2016171198 A1 WO2016171198 A1 WO 2016171198A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
unit
particle
fine particles
zeta potential
illumination light
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/062591
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一木　隆範
久皇 鈴木
大士 田中
Original Assignee
国立大学法人東京大学
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人東京大学, 株式会社ニコン filed Critical 国立大学法人東京大学
Priority to JP2017514177A priority Critical patent/JP6781989B2/ja
Publication of WO2016171198A1 publication Critical patent/WO2016171198A1/ja
Priority to US15/786,450 priority patent/US10295454B2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1429—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
    • G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging
    • G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means, e.g. by light scattering, diffraction, holography or imaging using imaging, e.g. a projected image of suspension; using holography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1484—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0042—Investigating dispersion of solids
    • G01N2015/0053—Investigating dispersion of solids in liquids, e.g. trouble
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G01N2015/1027—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1486—Counting the particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1493—Particle size

Definitions

  • the present invention relates to a particle detection system and a particle detection program.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2015-087021 filed in Japan on April 21, 2015, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Patent Document 1 cannot determine the correlation between the zeta potential of a plurality of fine particles present in the medium and the fine particle diameter.
  • the present invention provides a particle detection system and a particle detection program capable of determining the correlation between the zeta potential of particles such as extracellular vesicles existing in a medium and the particle diameter.
  • One embodiment of the present invention is a stage portion having an installation surface on which a fluid device including a flow path capable of moving a sample containing fine particles can be placed, and a particle diameter for determining the particle diameter of the fine particles moving in the flow path
  • a fine particle comprising: a determination unit; a zeta potential determination unit that determines a zeta potential of the fine particles moving through the flow path; and a correlation unit that associates the particle diameter of the fine particles and the zeta potential for each of the fine particles. It is a detection system.
  • a particle size of the fine particles that move in the flow path is provided in a computer including a stage unit having a setting surface on which a fluid device including a flow path capable of moving a sample containing fine particles can be set.
  • a particle diameter determining step for determining the particle a zeta potential determining step for determining a zeta potential of the fine particles moving in the flow path, and a correlation step for associating the particle diameter and the zeta potential of the fine particles for each fine particle.
  • a particle detection program for executing
  • a stage portion having an installation surface on which a fluid device including a flow channel capable of moving a sample containing fine particles can be installed, a surface orthogonal to the installation surface and parallel to the flow channel, An irradiation unit that irradiates illumination light to the flow path along an optical axis parallel to the intersecting first direction, and a width in a second direction orthogonal to the first direction of the illumination light inside the flow path.
  • An adjustment unit that converges the illumination light so that an irradiation area at the position of the side surface on the irradiation light incident side of the flow path is within the side surface, and the scattered light generated by the irradiation of the illumination light is imaged
  • a particle size determination unit for determining,
  • a zeta potential determination unit that determines a zeta potential of the microparticles for each microparticle identified by the unit, the particle diameter for each of the microparticles determined by the particle size determination unit, and the microparticles determined by the zeta potential determination unit It is a particulate detection system comprising a correlation unit that associates each zeta potential with each particulate.
  • FIG. 1 is a schematic plan view of a particle detection system according to an embodiment. It is a schematic front view of the particle
  • FIG. 7 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. It is a figure which shows schematic structure of the irradiation part and adjustment part which concern on this embodiment.
  • the particle detection system 1 of this embodiment includes a particle detection device 100 and a control device 5.
  • the particle detection system 1 is also referred to as an extracellular vesicle detection system.
  • the particle detection apparatus 100 is demonstrated with reference to FIGS. 1-10.
  • FIG. 1 is a schematic plan view of a particle detection system 1 according to the embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic front view of the particle detector 100 according to the embodiment.
  • the particle detection apparatus 100 detects information related to particles in the fluid device C by irradiating the fluid device C with the illumination light L1 and observing the scattered light L2 from the fluid device C with the fluid device C as a detection target.
  • the particle detection apparatus 100 includes a light source unit LS, an irradiation unit 20, an adjustment unit CL, a stage unit ST, a detection unit 30, a transmission unit 40, and a control device 5.
  • a particle detection system 1 is configured by the particle detection apparatus 100 and the fluid device C.
  • the direction orthogonal to the installation surface STa of the stage part ST and orthogonal to the surface (not shown) parallel to the illumination light L1 is the x direction (x axis; third direction), and parallel to the installation surface STa.
  • a direction orthogonal to the x direction is appropriately described as a y direction (y axis)
  • a vertical direction orthogonal to the x direction and the y direction is appropriately described as a z direction (z axis; second direction).
  • the fluid device C that is a detection target will be described.
  • the fluid device C in the present embodiment is, for example, an electrophoresis analysis chip used when analyzing a specimen.
  • the fine particles used as specimens include cells, bacteria, viruses, extracellular vesicles (extracellular vesicles), fine particles based on synthetic polymers, inorganic substances, or metals, magnetic fine particles, and fine particles having a polymeric micelle structure.
  • Examples of the fine particles based on the synthetic polymer include latex particles such as polystyrene.
  • Examples of the fine particles based on inorganic materials include silica particles.
  • the metal-based fine particles include iron beads.
  • the magnetic fine particles include magnetic beads containing iron, iron oxide, nickel and the like.
  • an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip for analyzing extracellular endoplasmic reticulum is used as an electrophoresis analysis chip.
  • an extracellular vesicle means a lipid vesicle including exosome (exosome), apoptotic body, microvesicle and the like.
  • the size of the extracellular vesicle is about 30 nm to 1 ⁇ m in diameter.
  • the extracellular endoplasmic reticulum is a secreted product of a cell, and expresses a cell-derived protein as a secretory source on its surface.
  • the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip electrospray analysis chip according to the present embodiment will be described by taking as an example the case of analyzing exosomes.
  • Exosomes are lipid vesicles with a diameter of about 30 to 200 nm.
  • various cells such as tumor cells, dendritic cells, T cells, and B cells can be used for blood, urine, saliva, etc. Secreted into body fluids.
  • Abnormal cells such as cancer cells existing in the body express a protein specific to the cell membrane.
  • An exosome is a secreted product of a cell and expresses a cell-derived protein as a secretory source on its surface.
  • the surface of the exosome is a membrane surface of a lipid vesicle secreted from a cell, and refers to a portion where the secreted exosome is in contact with the environment in the living body.
  • exosomes are detected in blood circulating in the living body, abnormalities in the living body can be detected by analyzing the exosomes without performing a biopsy test.
  • analysis of exosomes using an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip can be performed as follows. First, the exosome to be detected is purified. Next, the exosome is brought into contact with the specific binding substance.
  • the specific binding substance means a substance that can specifically bind to a molecule present on the surface of the exosome, and will be described in detail later.
  • the zeta potential of exosome is measured and analyzed using an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip. This analysis can be applied not only to exosomes but also to analyzes of the extracellular endoplasmic reticulum in general.
  • Specific binding substances include, for example, antibodies, modified antibodies, aptamers, ligand molecules, and the like.
  • antibodies include IgG, IgA, IgD, IgE, IgM and the like.
  • IgG include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • IgA include IgA1 and IgA2.
  • IgM include IgM1 and IgM2.
  • the modified antibody include Fab, F (ab ′) 2, scFv and the like.
  • Examples of aptamers include peptide aptamers and nucleic acid aptamers.
  • Examples of the ligand molecule include a ligand of the receptor protein when the molecule to be detected present on the surface of the exosome is a receptor protein.
  • examples of the ligand molecule include G protein.
  • the specific binding substance may be labeled with a labeling substance.
  • labeling substances include biotin, avidin, streptavidin, neutravidin, glutathione-S-transferase, glutathione, fluorescent dyes, polyethylene glycol, charged molecules such as melittic acid, and the like.
  • the exosome is purified from a sample containing exosome.
  • the sample include blood, urine, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, amniotic fluid, malignant exudate, saliva, cell culture fluid and the like depending on the purpose. Especially, it is easy to purify exosomes from blood and urine.
  • Examples of the method for purifying exosomes include ultracentrifugation, ultrafiltration, continuous flow electrophoresis, chromatography, and a method using a ⁇ -TAS (Micro-Total Analysis Systems) device.
  • ⁇ -TAS Micro-Total Analysis Systems
  • the exosome is brought into contact with a specific binding substance (antibody, aptamer, etc.).
  • a specific binding substance antibody, aptamer, etc.
  • an abnormality associated with a disease such as cancer, obesity, diabetes, or neurodegenerative disease can be detected.
  • the zeta potential of the exosome reacted with the antibody is measured.
  • the zeta potential is the surface charge of the fine particles in the solution.
  • exosomes are negatively charged while antibodies are positively charged.
  • the zeta potential of the antibody-exosome complex is shifted positively compared to the zeta potential of the exosome alone. Therefore, by measuring the zeta potential of the exosome reacted with the antibody, the expression of the antigen on the exosome membrane surface can be detected. This is true not only for antibodies but also for positively charged specific binding substances.
  • the exosome zeta potential ⁇ is obtained by performing exosome electrophoresis in the microchannel of an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, optically measuring the exosome electrophoresis speed S, and measuring the measured exosome electrophoresis. Based on the speed S, it can be calculated using the Smolkovsky equation shown in the following equation (1).
  • Equation (1) U is the electrophoretic mobility of the exosome to be measured, and ⁇ and ⁇ are the dielectric constant and viscosity coefficient of the sample solution, respectively.
  • the electrophoretic mobility U can be calculated by dividing the electrophoretic velocity S by the electric field strength in the microchannel.
  • the exosome electrophoresis speed S is obtained by electrophoresing exosomes in a microchannel of an extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, and as an example, irradiating a laser beam on exosomes flowing in the microchannel, Measurement can be performed by obtaining a particle image by scattered light.
  • the laser beam one having a wavelength of 405 nm and an intensity of 150 mW can be given.
  • the particle diameter d of the exosome is obtained by performing exosome electrophoresis in the micro-channel of the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip, optically measuring the exosome electrophoresis speed S, and measuring the exosome electrophoresis. Based on the speed S, it can be calculated using the Einstein-Stokes equation shown in the following equation (2).
  • d is the particle diameter of exosome
  • k is Boltzmann constant
  • T absolute temperature
  • ⁇ is the viscosity coefficient of the sample solution
  • D is the diffusion coefficient of the fine particles. That is, the particle diameter d of the exosome can be calculated based on the Brownian motion state of the exosome to be measured.
  • FIG. 3 is a perspective view showing the basic structure of the extracellular vesicle analysis chip according to the embodiment. 4 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip CH includes a first reservoir 110, a second reservoir 120, an electrophoresis channel 150 that connects the first reservoir 110 and the second reservoir 120, and a substrate 160.
  • the migration channel 150 is, for example, a millimeter channel or a micro channel.
  • the migration channel 150 has a width of about 200 ⁇ m, a height of 400 ⁇ m, and a length of about 10 mm.
  • the cross section of the electrophoresis channel 150 may not be rectangular, and may be, for example, a circle, an ellipse, a polygon, or a tunnel shape.
  • the electrophoresis channel 150 is a specific binding formed by interaction between an extracellular vesicle or a specific binding substance that specifically binds to a biomolecule existing on the surface of the extracellular vesicle and the extracellular vesicle.
  • a substance-extracellular endoplasmic reticulum complex (for example, an antibody-exosome complex) is electrophoresed.
  • An example of a specific binding substance includes an antibody, an aptamer, or a combination thereof.
  • Aptamers are, for example, nucleic acid aptamers, peptide aptamers and the like.
  • molecules recognized by the specific binding substance include antigens, membrane proteins, nucleic acids, sugar chains, glycolipids and the like.
  • the electrophoresis channel 150 has one end connected to the first reservoir 110 and the other end connected to the second reservoir 120.
  • the first reservoir 110 and the second reservoir 120 are provided on the base material 160 and have an electrode 130 and an electrode 140, respectively.
  • the electrode 130 is provided at the bottom of the first reservoir 110
  • the electrode 140 is provided at the bottom of the second reservoir 120.
  • the electrode 130 and the electrode 140 are each provided in the vicinity of the end of the migration channel 150.
  • a sample eg, exosome to be analyzed
  • a buffer solution is introduced into the second reservoir 120. Note that the buffer solution may be introduced into the first reservoir 110.
  • the extracellular vesicle analysis chip CH is suitable for measuring the zeta potential of the extracellular vesicle.
  • a method for measuring the zeta potential of exosome using this extracellular endoplasmic reticulum analysis chip will be described, taking as an example the case of analyzing exosomes as specimens or extracellular endoplasmic reticulum.
  • a sample solution containing exosomes to be analyzed is introduced into the first reservoir 110.
  • the exosome to be analyzed may have been reacted with a specific binding substance.
  • the exosome is extracted from, for example, a culture supernatant or serum, and the sample solution is an exosome suspension in which the exosome is suspended in a buffer solution such as a phosphate buffer solution (Phosphate Buffered Saline, PBS).
  • a sample solution containing exosomes is introduced into the migration channel 150.
  • the exosome can be introduced into the electrophoresis channel 150 by connecting a syringe to the second reservoir 120 and sucking the sample solution.
  • the buffer solution is put into the first reservoir 110 and the second reservoir 120.
  • liquid level (liquid level height) between the first reservoir 110 and the second reservoir 120 By adjusting the liquid level (liquid level height) between the first reservoir 110 and the second reservoir 120 by using a liquid level adjusting means, which will be described later, it is possible to prevent the generation of a hydrostatic pressure flow that occurs in the migration channel 150 and to measure the zeta potential. The accuracy can be improved.
  • a voltage is applied between the electrodes 130 and 140 by a control unit (for example, a control device 5 described later or a computer), and the exosome is electrophoresed.
  • the control unit applies a voltage having an electric field strength of about 50 V / cm for about 10 seconds.
  • the electrophoresis channel 150 is irradiated with laser light, and the scattered light passing through the exosome, which is emitted from the electrophoresis channel 150, is collected using an objective lens or the like, and a light receiving sensor (eg, high A sensitivity camera is used to image exosomes or specific binding substance-exosome complexes.
  • the magnification of the objective lens is about 60 times as an example.
  • the wavelength and intensity of the laser are, for example, a wavelength of 405 nm and an intensity of 150 mW.
  • the extracellular endoplasmic reticulum analysis chip in this embodiment, not only the average value of the zeta potential of the specific binding substance-exosome complex, but also the zeta potential of the specific binding substance-exosome complex is measured at the level of one particle. can do. Therefore, from the average value of the zeta potential, even if it seems that there is no exosome having a molecule (for example, antigen) recognized by the specific binding substance in the sample, it exists as a minor population. An exosome having the antigen can be detected.
  • a molecule for example, antigen
  • FIG. 5 is a plan view in which the fluid device C is installed on the installation surface STa of the stage unit ST according to the embodiment.
  • FIG. 6 is a partial cross-sectional view in which the fluid device C according to the embodiment is partially cross-sectioned in the xz plane.
  • 7 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • the fluid device C is formed in a rectangular shape in plan view.
  • the fluid device C includes a reservoir member (first base material) 10 and a bottom plate (second base material) 11 that are sequentially stacked in the z direction.
  • the fluid device C in the present embodiment has a laminated structure (laminated body) composed of at least the reservoir member 10 and the bottom plate 11.
  • the laminated structure of the fluid device C has a two-layer structure. Further, for example, such a laminated structure of the fluid device C is formed by bonding the reservoir member 10 and the bottom plate 11 to each other.
  • the reservoir member 10 may be formed of a material that can be elastically deformed in at least one direction by an external force or the like.
  • Examples of the material of the reservoir member 10 include elastomers such as silicone rubber and PDMS (polydimethylsiloxane).
  • the bottom plate 11 is formed of a material through which scattered light L2 generated by irradiation with the illumination light L1 is transmitted.
  • the bottom plate 11 is formed of a glass material as an example.
  • the fluidic device C includes a plurality (three in FIG. 5) of lanes 2 arranged in the length direction (x direction).
  • Each lane 2 includes a first reservoir 12A, a second reservoir 12B, a flow path 13, and electrodes 18A and 18B.
  • the first reservoir 12A and the second reservoir 12B are arranged at an interval in the x direction.
  • the first reservoir 12 ⁇ / b> A and the second reservoir 12 ⁇ / b> B are arranged at an interval in the flow path direction of the flow path 13.
  • the plurality of lanes are arranged in the flow path direction (in series), so that it is easy to irradiate light from the side.
  • a plurality of lanes may be analyzed in order for each lane, or may be analyzed simultaneously by a plurality of detection systems.
  • the plurality of lanes 2 may be arranged in the height direction (z direction).
  • the solution may be injected from the length direction (x direction) or from the y direction.
  • there are a plurality of irradiation light sources and each of the light sources irradiates fine particles flowing through the lane 2 having a corresponding height. Further, the fine particles flowing in the lane 2 may be irradiated by changing the irradiation direction from at least one irradiation light source.
  • the illumination light applied to each lane 2 may be adjusted by adjusting the shape of the illumination light by moving the objective lens. Further, when there are a plurality of lanes 2, a configuration in which the measurement target lane 2 is selected (switched) from among the plurality of lanes 2 by moving a stage on which the fluid device C is placed may be employed.
  • the first reservoir 12A has a holding space 14A that has a circular cross section in a plane parallel to the xy plane and extends in the z direction, and a funnel shape that gradually increases in diameter from the + z side end of the holding space 14A toward the + z direction.
  • the introduction part 15A is provided.
  • the holding space 14A opens at the ⁇ z side end facing the bottom plate 11.
  • the holding space 14 ⁇ / b> A is connected to the flow path 13.
  • the second reservoir 12B has a holding space 14B having a circular cross section in a plane parallel to the xy plane and extending in the z direction, and a funnel shape gradually increasing in diameter from the + z side end of the holding space 14B toward the + z direction.
  • the introduction part 15B is provided.
  • the holding space 14B has an end on the ⁇ z side facing the bottom plate 11 and opening.
  • the holding space 14 ⁇ / b> B is connected to the flow path 13.
  • the flow path 13 is a flow path for electrophoresis (flow path for electrophoresis).
  • the flow path 13 extends in the y direction, which is the length direction of the fluid device C.
  • the channel 13 is provided on the surface facing the bottom plate 11 so as to connect the holding space 14A and the holding space 14B.
  • the flow path 13 is formed in a rectangular cross section surrounded by the groove 10 ⁇ / b> A formed in the reservoir member 10 and the surface (second surface) 11 a of the bottom plate 11.
  • the groove portion 10A is formed to be surrounded by side surfaces (first surfaces) 16a and 16b facing in the x direction and a bottom surface (second surface) 16c facing the surface 11a of the bottom plate 11 in the z direction.
  • the side surfaces 16a, 16b, the bottom surface 16c, and the surface 11a constituting the groove 10A are mirror-finished.
  • the first surface includes a side surface 16a that is a first side surface and a side surface 16b that is a second side surface.
  • the side surface 16a and the side surface 16b face each other and are separated from each other in the x direction which is the first direction.
  • the lane 2 is arranged so as to be biased toward the side closer to the end surface 17 on the + x side than the center with respect to the optical axis direction (incident direction) of the illumination light L1 that is the width direction of the fluid device C.
  • the lane 2 is arranged so as to be biased toward the side closer to the end surface 17 on the incident side of the illumination light L1 than the center in the width direction (the x direction in FIG. 5) of the fluid device C that is the optical axis direction of the incident illumination light L1.
  • the end face 17 is mirror-finished in a range where at least the lane 2 is provided in the y direction.
  • the channel 13 is formed in a size of about 200 ⁇ m in width, about 400 ⁇ m in height (depth of the groove 10A), and about 10 mm in length.
  • An electrode 18A is provided on the surface 11a of the bottom plate 11 so as to face the holding space 14A.
  • An electrode 18B is provided on the surface 11a of the bottom plate 11 so as to face the holding space 14B.
  • Examples of the material for the electrode 18A and the electrode 18B include gold, platinum, and carbon.
  • the end surface (second end surface) 19 located on the incident side of the illumination light L1 in the bottom plate 11 is closer to the incident side of the illumination light L1 than the position of the end surface 17 of the reservoir member 10 in the x direction. Are spaced apart on the opposite side, -x side.
  • the light source unit LS has a wavelength that does not adversely affect the particles.
  • the light source unit LS has a wavelength of 405 nm and an intensity of 150 mW.
  • Laser light having a deflection direction in the z direction at 0.8 mm is emitted as illumination light L1.
  • the illumination light L1 may be polarized light (for example, linearly polarized light) or non-polarized light. However, in the present embodiment, vertical polarization is used and there is no directivity of Rayleigh scattering.
  • the illumination light L1 is applied to the fluid device C along an optical axis extending in a direction intersecting the orthogonal plane described above. In the present embodiment, the optical axis of the illumination light L1 is parallel to the x direction.
  • the illumination light L1 of the present embodiment is applied to the fluid device C along the optical axis extending in the x direction.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a schematic configuration of the irradiation unit 20 and the adjustment unit CL according to the embodiment.
  • the irradiation unit 20 includes a ⁇ / 2 plate 21 and an expander lens 22 that are sequentially arranged along the optical axis of the illumination light L1.
  • the optical axis of the illumination light L1 extends in the y direction, but the illumination light L1 that finally irradiates the fluid device C (channel 13) is x. Since the optical axis is along the direction, the illumination light L1 shown in FIG. 8 is illustrated on the assumption that the optical axis is along the x direction.
  • the illumination light L1 emitted from the light source unit LS is transmitted through the ⁇ / 2 plate 21 so that the polarization direction is rotated in the y direction.
  • the ⁇ / 2 plate 21 is not necessary when the light source unit LS emits the illumination light L1 having the deflection direction in the y direction.
  • the expander lens 22 includes cylindrical lenses 22A and 22B facing each other. Since the cylindrical lenses 22A and 22B have no power in the y direction, the illumination light L1 has a constant width in the y direction. The width of the illumination light L1 in the z direction is enlarged or reduced according to the distance in the optical axis direction of the cylindrical lenses 22A and 22B. In the present embodiment, the expander lens 22 enlarges the width of the illumination light L1 in the z direction as an example by a factor of two.
  • the adjustment unit CL adjusts the incident illumination light L ⁇ b> 1 that has been expanded by the expander lens 22 in the width in the z direction.
  • the adjustment unit CL is disposed in the optical path between the light source unit LS and the objective lens 31.
  • the adjustment unit CL is disposed in the optical path between the ⁇ / 2 plate 21 or the expander lens 22 and the objective lens 31.
  • the adjustment unit CL may include a drive mechanism, and the light collection point may be adjusted by the movement of the adjustment unit CL.
  • the adjustment unit CL can be driven in the x direction, for example. In this case, even when a chip having a different position of the flow path 13 is used, it is possible to adjust so that the light collecting point is located in the flow path 13.
  • FIG. 9 is a partial detailed view of the adjustment unit CL and the fluid device C according to the embodiment.
  • the adjustment unit CL is configured by a cylindrical lens.
  • the adjustment portion CL has a minimum width in the z-direction of the illumination light L1 inside the flow path 13, and the passage region of the illumination light L1 at the position of the side face 16a on the irradiation light incident side of the flow path 13 is within the side face 16a.
  • the convergence angle is adjusted so as to be limited.
  • the adjustment portion CL has a minimum width in the z direction of the illumination light L1 inside the flow path 13, and the irradiation area of the illumination light L1 at the position of the side face 16a on the irradiation light incident side of the flow path 13 is within the side face 16a.
  • the illumination light L1 is adjusted to a convergence angle that condenses light.
  • the adjustment part CL is adjusted to the convergence angle which converges so that the passage area
  • the adjusting unit CL adjusts the illumination light L1 to a convergence angle such that the irradiation region of the illumination light L1 (irradiation light beam) at the position of the side surface 16b on the irradiation light emission side of the flow path 13 is condensed in the side surface 16b. . Further, the adjustment unit CL adjusts the convergence angle so that the irradiation region of the illumination light L1 at the position of the end surface 17 of the reservoir member 10 converges in the end surface 17. Further, the adjustment unit CL adjusts the convergence angle so that the illumination light L1 has a convergence point in the detection region in the flow path 13.
  • the illumination light beam of the illumination light L1 outside the focal depth of the detection unit 30 has a convergence angle that is smaller than the illumination light beam within the focal depth.
  • the above-described orthogonal surface includes the end surface 17 of the reservoir member 10, the side surface 16a on the irradiation light incident side of the flow path 13, or the side surface 16b on the irradiation light emission side of the flow path 13.
  • the convergence angle in the medium is ⁇
  • the wavelength of the illumination light L1 is ⁇
  • the beam width in the z direction at the position x and the convergence angle ⁇ is ⁇ (x, ⁇ )
  • the beam profile factor of the illumination light L1 is M2
  • the minimum width ⁇ 0 Assuming that the distance from the position in the x direction to the side surface 16a is xL, the following formula (3) and formula (4) must satisfy formula (5).
  • the beam width ⁇ (x, ⁇ ) included in the above formulas (3) to (5) is 1 / with respect to the peak value of the intensity of the illumination light L1. It is defined by the width to be e2. Even when the convergence angle ⁇ satisfies the expressions (1) to (3), the illumination light L1 having an intensity that is 1 / e2 or less with respect to the peak value is outside the beam width ⁇ (xL, ⁇ ). Therefore, when the convergence angle ⁇ is set, the beam width of the illumination light L1 having an intensity that is 1 / e2 or less with respect to the peak value is also taken into consideration.
  • the detection section 30 is included in the light flux of the illumination light L1 over the entire flow path 13. It is necessary to enter a DOF of DOF.
  • the depth of focus DOF of the detection unit 30 In order for the depth of focus DOF of the detection unit 30 to fall within the luminous flux of the illumination light L1, the end surface 17 of the reservoir member 10 and the side surface 16a of the flow path 13 have It is also necessary to consider the inclination with respect to the optical axis.
  • FIG. 10 is a diagram schematically illustrating an optical path through which the illumination light L ⁇ b> 1 according to the embodiment passes through the end surface 17 of the reservoir member 10 and the side surface 16 a of the flow channel 13.
  • the focal depth DOF see FIG. 9
  • the detection unit 30 In order for the focal depth DOF (see FIG. 9) of the detection unit 30 to enter the light flux of the illumination light L1 over the entire width of the flow path 13, the following expression (6) needs to be satisfied.
  • the angle ⁇ 3 is the elevation angle of the illumination optical axis viewed from the focal plane F, and the counterclockwise direction from the focal plane F is the positive direction.
  • the incident angle and the emission angle at the interface, the inclination angle of the end surface 17 of the reservoir member 10 and the side surface 16a of the flow path 13 with respect to the yz plane, the illumination light flux in the air and in the material of the flow path device C, and in the flow path The following relationship is established between the elevation angle with respect to the focal plane F, the medium outside the channel device C, the material of the channel device C, and the refractive index of the medium in the channel 13.
  • Incident angle / outgoing angle angle from the perpendicular to the end face 17 and the wall surface 16a Tilt angle: angle
  • the elevation angle ⁇ 3 of the illumination light L1 in the flow path 13 is expressed by the following equation (7).
  • the inclination angle of the end face 17 of the reservoir member 10 and the wall surface 16a of the flow path 13 and the elevation angle ⁇ 3 of the illumination light L1 are the refractive index n1 of the free space medium, the refractive index n2 of the material of the reservoir member 10 and the flow path 13
  • the refractive index n3 of the medium it is necessary to be selected, manufactured and adjusted so as to satisfy Expression (8).
  • the stage unit ST moves in the x direction, the y direction, and the z direction by driving the stage driving unit 60 shown in FIG.
  • the driving of the stage driving unit 60 is controlled by the control device 5.
  • the stage unit ST includes an installation surface STa on which the fluid device C is installed.
  • the installation surface STa is a surface parallel to the xy plane.
  • the installation surfaces STa are arranged at intervals in the y direction.
  • the installation surface STa supports both ends in the y direction where the lane 2 of the flow channel device C is not provided from the ⁇ Z side.
  • the region where the lane 2 is arranged is supported on the installation surface STa without hindering the observation from the ⁇ Z side by the detection unit 30.
  • stage part ST does not exist in the optical path of the illumination light L1 until the lane 2 in the fluid device C is irradiated, a part of the illumination light L1 incident on the fluid device C enters the stage part ST, which will be described later. Adversely affecting the particle detection.
  • the fixing pin 51 protrudes from the installation surface STa.
  • the fixing pin 51 includes two fixing pins 51 a that contact the long side of the fluid device C and one fixing pin 51 b that contacts the short side of the fluid device C.
  • the fixing pins 51a are arranged in the vicinity of both sides of the fluid device C in the y direction.
  • the fixing pin 51b contacts the short side located on the + y side.
  • a pressing piece 52 is provided at a corner located opposite to the corner where the fixing pin 51a and the fixing pin 51b located on the + y side are arranged.
  • the pressing piece 52 presses the fluid device C diagonally against the stage part ST.
  • the pressed fluid device C is fixed in a state where the fluid device C is positioned on the stage portion ST in the xy direction so that the flow path 13 (lane 2) is parallel to the y direction by contacting the fixing pins 51a and 51b.
  • the detection unit 30 includes an objective lens 31 and an imaging unit 32.
  • the objective lens 31 is disposed on the ⁇ Z side of the stage unit ST and the fluid device C. As shown in FIG. 9, the objective lens 31 is disposed at a position where the detection axis 31a passes through the center of the flow path 13 in the x direction.
  • the detection axis 31a is orthogonal to the optical axis of the illumination light L1.
  • the imaging unit 32 includes an EMCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) camera as an example, and captures an image of incident light.
  • the imaging unit 32 acquires image information of side scattered light that enters through the objective lens 31.
  • the transmission unit 40 transmits the image information captured by the imaging unit 32 to the control device 5.
  • the operation of the particle detection apparatus 100 includes an installation process, an introduction process, an irradiation process, and a detection process.
  • the installation process is a process of installing the fluid device C on the installation surface STa of the stage part ST. Specifically, as shown in FIG. 5, by pressing the fluid device C diagonally with the pressing piece 52, the fluid device C is pressed against the fixing pins 51a and 51b, and the flow path 13 (lane 2). Is placed on the installation surface STa in a state of being positioned on the stage portion ST so as to be parallel to the y direction.
  • the introducing step is a step of introducing a sample containing particles into the holding spaces 14A and 14B and the flow path 13 of the fluid device C.
  • a sample containing particles such as a sample containing particles
  • an exosome suspension in which exosomes are suspended in a buffer solution (medium) such as a phosphate buffer can be used as the sample.
  • the control device 5 drives the stage drive unit 60 so that the lane 2 to be detected is positioned on the optical path of the illumination light L 1 and the detection axis 31 a of the detection unit 30.
  • the control device 5 controls the power supply unit BT to apply an electric field to the electrodes 18A and 18B, and applies a force for causing the exosome to electrophores along the flow path 13. To do.
  • the control device 5 applies a voltage having an electric field strength of about 50 V / cm for about 10 seconds.
  • the moving direction of the exosome is parallel to the y direction.
  • the irradiation process is a process of irradiating the flow path 13 of the flow path device C with the illumination light L1 parallel to the x direction.
  • the irradiation unit 20 and the adjustment unit CL that irradiate the illumination light L1 have a constant width in the y direction, and have a sheet beam shape that converges in the z direction at a convergence angle ⁇ that satisfies the above-described equations (3) to (8).
  • Irradiation light L1 is irradiated.
  • the minimum beam thickness (beam width in the z direction) of the illumination light L1 is 10 ⁇ m.
  • the minimum beam thickness (beam width in the z direction) direction of the illumination light L1 is the z direction in FIGS.
  • the direction of the minimum beam thickness (beam width in the z direction) of the illumination light L1 is different from the optical axis direction and the flow path direction of the illumination light L1 on the incident surface (end surface 17 and side surface 16a). It is a direction orthogonal to the flow path direction.
  • the channel direction is a direction in which the channel 13 extends.
  • the flow path direction is a direction in which fluid flows through the flow path 13.
  • the irradiated illumination light L1 is one end surface (illumination light incident side end surface) 17 of the fluid device C, the side surface (illumination light incident side side surface) 16a of the flow channel 13, the inside of the flow channel 13, the side surface of the flow channel 13 ( The light passes through the illumination light emission side surface 16b and the other end surface (illumination light emission side end surface) 27 (see FIG. 5) of the fluid device C sequentially.
  • the illumination light L1 is irradiated in a direction orthogonal to the moving direction of the exosome. As shown in FIG.
  • the irradiated illumination light L1 converges so that the width in the z direction is minimized inside the flow path 13, and the irradiation light flux passage region at the position of the side surface 16 a of the flow path 13. Converges to be confined within the side surface 16a. Furthermore, the irradiated illumination light L1 converges so that the passage region of the irradiated light beam at the position of the side surface 16b on the illumination light exit side of the flow path 13 is limited to the side surface 16a.
  • the illumination light L1 is adjusted to a convergence angle such that the irradiation region at the position of the side surface 16a is condensed in the side surface 16a and the irradiation region at the position of the side surface 16b is condensed in the side surface 16b. Further, the irradiated illumination light L1 has a convergence point in the detection region of the detection unit 30 in the flow path 13.
  • the detection unit 30 observes (images) and detects the scattered light generated from the particles in the flow path 13 by irradiation of the illumination light L1 in parallel with the x direction. Since the detection axis 31a of the objective lens 31 in the detection unit 30 is orthogonal to the optical axis of the illumination light L1, the detection unit 30 detects side scattered light generated from the particles. The detection unit 30 detects light scattered toward the z direction perpendicular to the x direction by irradiation of the illumination light L1 irradiated in parallel with the x direction. The image of the particles in which the scattered light is observed is picked up by the image pickup unit 32. The transmission unit 40 transmits the image information captured by the imaging unit 32 to the control device 5.
  • the control device 5 comprehensively controls the particle detection system 1.
  • the control device 5 controls the movement of the stage unit ST and the fluid device C via the stage driving unit 60.
  • the control device 5 controls the power supply unit (application unit) BT to apply an electric field in the direction along the flow path 13 to the electrodes 18A and 18B.
  • the control apparatus 5 performs various determinations by processing the image captured by the particle detection apparatus 100. Details of the configuration of the control device 5 will be described with reference to FIGS. 11 to 16.
  • FIG. 11 is a diagram showing a schematic configuration of the control device 5 of the present embodiment.
  • the control device 5 includes a calculation unit 500 and a storage unit 520.
  • the storage unit 520 includes storage devices such as a flash memory, an HDD (Hard Disk Drive), a RAM (Random Access Memory), a ROM (Read Only Memory), and a register.
  • the storage unit 520 stores a program (firmware) executed by the calculation unit 500 in advance.
  • the storage unit 520 stores a calculation result obtained by performing the calculation process by the calculation unit 500.
  • the calculation unit 500 includes a CPU (Central Processing Unit) and performs various calculations.
  • the calculation unit 500 includes, as its functional units, an acquisition unit 501, an identification unit 502, a zeta potential determination unit 503, a particle diameter determination unit 504, a correlation unit 505, a state determination unit 506, and an evaluation unit 507. It has.
  • the acquisition unit 501 acquires an image captured by the particle detection device 100. Specifically, as described above, the imaging unit 32 of the particle detection apparatus 100 captures an image of side scattered light that is incident through the objective lens 31 and transmits image information of the captured image to the transmission unit 40. Output to. The acquisition unit 501 acquires the image information of the side scattered light image captured by the imaging unit 32 via the transmission unit 40. The acquisition unit 501 outputs the acquired image to the identification unit 502.
  • the identification unit 502 extracts a fine particle image from the image captured by the particle detection device 100. For example, the identification unit 502 extracts a fine particle image by performing known filter processing and pattern matching processing on the image supplied from the acquisition unit 501. At this time, the identification unit 502 may assign a particle number for each fine particle to the extracted fine particle image. When the identification target microparticle is an extracellular vesicle, the particle number may be an extracellular vesicle identifier. That is, the identification unit 502 may label the fine particles. This facilitates the correlation between the zeta potential ⁇ of the fine particles and the particle diameter d of the fine particles in the correlation section described later.
  • the identification unit 502 performs tracking on the labeled fine particle based on the difference between frames of the image captured by the particle detection device 100.
  • tracking refers to tracking changes with time in the coordinates of particles in an image. An example of the result of the identification unit 502 tracking fine particles is shown in FIG.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of the particle list LS1 stored in the storage unit 520 of the present embodiment.
  • the particle list LS1 stores the coordinates (X, Y) of the image of each fine particle at each time, with the row direction as the labeled particle number and the column direction as the imaging time.
  • the coordinates of each fine particle from the fine particle P1 to the fine particle Pn at each time from the time t0 to the time t50 are stored in the particle list LS1.
  • the zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ for each fine particle based on the result tracked by the identification unit 502. For example, the zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ 1 of the fine particle P1 based on the moving speed v1 of the fine particle P1 from the time t0 to the time t1 in the tracking result of the fine particle P1 performed by the identification unit 502. To do. The zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ based on the above equation (1). In this example, the dielectric constant ⁇ of the sample solution and the viscosity coefficient ⁇ of the sample solution are stored in the storage unit 520 in advance.
  • the zeta potential determination unit 503 is configured based on the permittivity ⁇ of the sample solution and the viscosity coefficient ⁇ of the sample solution stored in the storage unit 520 and the moving speed of the particles obtained from the tracking result by the identification unit 502. The zeta potential ⁇ is determined.
  • the particle diameter determination unit 504 determines the diameter of the fine particles based on the amount of movement of the fine particles due to Brownian motion in the sample solution and the above equation (2).
  • the particle size determination unit 504 determines the particle size of the fine particles P1.
  • the Boltzmann constant k and the absolute temperature T of the sample solution are stored in the storage unit 520 in advance.
  • the particle diameter determination unit 504 calculates the movement amount of the fine particles P1 based on the result tracked by the identification unit 502.
  • the particle size determination unit 504 determines the particles of the fine particles P1 based on the calculated movement amount of the fine particles P1, the Boltzmann constant k and the absolute temperature T stored in the storage unit 520, and the above equation (2).
  • the diameter d1 is determined.
  • the correlation unit 505 associates the zeta potential ⁇ of the fine particles determined by the zeta potential determination unit 503 with the particle size d of the fine particles determined by the particle size determination unit 504. Specifically, the first zeta potential ⁇ 1 determined for the first fine particles in the zeta potential determination unit 503, and the first particle diameter d1 determined for the first fine particles in the particle size determination unit 504 Are correlated with each other as data on the first fine particles in the correlation unit 505.
  • FIG. 13 shows an example of the particle correlation list LS2 that is a result associated with the correlation unit 505.
  • FIG. 13 is a diagram illustrating an example of the particle correlation list LS2 stored in the storage unit 520 according to the present embodiment.
  • the particle diameter d and the zeta potential ⁇ are associated with each particle number assigned by the identification unit 502.
  • the correlation unit 505 associates the particle diameter d1 of the fine particle P1 with the zeta potential ⁇ 1 of the fine particle P1 and stores it as particle correlation information PC1 (d1, ⁇ 1) in the particle correlation list LS2 for the fine particle P1.
  • the correlation unit 505 associates the particle diameter d2 of the fine particle P2 with the zeta potential ⁇ 2 of the fine particle P2 and stores the particle P2 in the particle correlation list LS2 as particle correlation information PC2 (d2, ⁇ 2).
  • the correlation of the state of the fine particles existing in the medium can be determined.
  • the state determination unit 506 determines the state of the fine particles based on the particle correlation list LS2 generated by the correlation unit 505.
  • the storage unit 520 stores reference range information indicating the reference range of the particle diameter d and the reference range of the zeta potential ⁇ .
  • state determination by the state determination unit 506 a case will be described in which it is determined whether or not the microparticles identified by the identification unit 502 are exosomes in a sample containing particles other than exosomes.
  • the characteristics of exosomes are microparticles with a particle size of about 30 to 200 nm, and the presence of chaperone molecules Hsc70, Hsc90 and tetraspanins (CD9, CD63, CD81) as constituent factors.
  • the storage unit 520 stores a threshold value Thd of particle diameter as reference range information.
  • the storage unit 520 stores a threshold value Th ⁇ of zeta potential as reference range information.
  • the storage unit 520 may be rephrased as a reference storage unit. An example of the threshold value Thd and the threshold value Th ⁇ is shown in FIG.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating an example of threshold values stored in the storage unit 520 of the present embodiment.
  • the particle diameter of exosome is about 30 to 100 nm in diameter, and among the particles to be determined, the particle diameter of particles other than exosome exceeds 100 nm in diameter.
  • the zeta potential ⁇ of the exosome is equal to or lower than the threshold Th ⁇ and the zeta potential ⁇ of fine particles other than the exosome exceeds the threshold Th ⁇ .
  • the state determination unit 506 can determine the particle based on the particle diameter of the particle and the zeta potential ⁇ of the particle.
  • the determination of fine particles performed by the state determination unit 506 may be paraphrased as identification of fine particles.
  • the storage unit 520 stores 100 nm as the particle size threshold Thd.
  • the storage unit 520 stores ⁇ 6 mV as the threshold value Th ⁇ of the zeta potential.
  • the state determination unit 506 is a particle whose particle diameter d is equal to or less than the threshold Thd in the particle correlation information PC stored in the particle correlation list LS2, and the zeta potential ⁇ is equal to or less than the threshold Th ⁇ .
  • a microparticle is determined to be an exosome.
  • the state determination unit 506 among the particle correlation information PC stored in the particle correlation list LS2, fine particles having a particle diameter d exceeding the threshold value Thd, or fine particles having a zeta potential ⁇ exceeding the threshold value Th ⁇ . Is determined not to be an exosome.
  • the particle diameter of exosome is about 30 to 100 nm, and among the fine particles to be determined, the particle diameter of fine particles other than exosome may exceed 200 nm.
  • the state determination unit 506 can determine the state of the fine particles based only on the particle diameter.
  • fine particles other than exosomes may be included in the diameter range of 100 to 200 nm.
  • the threshold value Thd (200 nm) of the particle diameter can be used as one element for determining whether or not the fine particle is an exosome.
  • a single exosome may not be contained in the range whose diameter is larger than 200 nm.
  • the threshold value Thd (200 nm) of the particle diameter can be used as one element for determining whether or not the microparticle is a single exosome.
  • a range in which the diameter is larger than 200 nm may include fine particles in which a plurality of single exosomes are aggregated.
  • the threshold value Thd (200 nm) of the particle diameter can be used as one element for determining whether the microparticle is a single exosome or an aggregated exosome.
  • the threshold value serving as the reference value stored in the reference storage unit can be used as a factor for determining the state of the fine particles.
  • the state determination unit 506 determines whether or not the exosome has reacted with the antibody when the microparticles identified by the identification unit 502 are exosomes.
  • the storage unit 520 stores a threshold value Th ⁇ of zeta potential as reference range information. As described above, the zeta potential of the antibody-exosome complex is positively shifted compared to the zeta potential of exosome alone. In this case, the storage unit 520 stores a zeta potential (eg, ⁇ 6 mv) between the zeta potential of the exosome alone and the zeta potential of the antibody-exosome complex as the zeta potential threshold Th ⁇ . .
  • the state determination unit 506 determines that, among the particle correlation information PC stored in the particle correlation list LS2, the fine particles whose zeta potential of the fine particles is less than the threshold Th ⁇ is a single exosome that has not reacted with the antibody. judge. On the other hand, in the particle correlation information PC stored in the particle correlation list LS2, the state determination unit 506 determines that the microparticles whose microparticle zeta potential is greater than or equal to the threshold Th ⁇ are antibody-exosome complexes. .
  • the threshold value Th ⁇ for example, ⁇ 6 mV
  • the threshold value Th ⁇ ( ⁇ 6 mV) of the zeta potential can be used as one element for determining whether the microparticle is a single exosome.
  • the state determination unit 506 can also determine the state of the fine particles by combining the threshold value of the particle diameter d and the threshold value of the zeta potential ⁇ .
  • the antibody-exosome complex has a low zeta potential compared to a single exosome. For this reason, the Coulomb force acting between the microparticles is weaker in the antibody-exosome complex than in the single exosome.
  • the Coulomb force acting between the fine particles acts as a repulsive force that keeps the fine particles apart. That is, the antibody-exosome complex has less repulsive force acting between the microparticles than the single exosome. For this reason, the antibody-exosome complex tends to aggregate more easily than a single exosome.
  • the particle diameter determination unit 504 shifts the particle diameter d to be larger than that in the case where the particles are not aggregated by determining a plurality of aggregated fine particles as one fine particle.
  • a case where a fine particle having a particle diameter d of 200 nm or less is determined to be an exosome will be described as an example.
  • the particle size determination unit 504 may determine that the antibody-exosome complex is a fine particle having a diameter exceeding 200 nm.
  • the state determination unit 506 determines only by the particle diameter d, the particle diameter d of the antibody-exosome complex exceeds the threshold value Thd of the particle diameter d whether or not the antibody is an exosome. -It may be determined that the exosome complex is not an exosome. Therefore, the state determination unit 506 determines that a fine particle having a particle diameter d of 200 nm or less is an exosome, and the zeta potential ⁇ is equal to or less than a threshold Th ⁇ even if the particle diameter d is greater than 200 nm. Is determined to be an exosome. That is, the state determination unit 506 determines whether or not the fine particle is an exosome by combining the threshold value Thd of the particle diameter d and the threshold value Th ⁇ of the zeta potential ⁇ .
  • an antibody that specifically binds to the exosome such as tetraspanin (CD9, CD81, etc.) can be used. That is, it is possible to determine whether or not the microparticle is an exosome based on the respective changes in the zeta potential ⁇ and the particle diameter d caused by causing the antibody to act on the exosome.
  • the particle detection system 1 of the present embodiment has an advantage that fine particles can be evaluated by variously combining the above-described evaluation conditions based on the zeta potential ⁇ and the particle diameter d.
  • the state determination unit 506 determines the state of the fine particles based on the result of tracking by the identification unit 502 after combining the threshold value Thd of the particle diameter d and the threshold value Th ⁇ of the zeta potential ⁇ . You can also. Specifically, the state determination unit 506 tracks the progress until the antibody reacts with a single exosome and further aggregates the antibody-exosome complexes based on the result of tracking by the identification unit 502. Specifically, the state determination unit 506 moves the particle diameter d and the zeta potential ⁇ of each fine particle from any of the regions DM1 to DM4 shown in FIG.
  • the state of the fine particles is determined depending on whether or not As an example, the state determination unit 506 determines that when a microparticle (for example, a single exosome) present in the region DM3 moves to the region DM2, the exosome reacts with the antibody and changes to an antibody-exosome complex. judge. Further, when the exosome moves from the region DM2 to the region DM1, the state determination unit 506 determines that the antibody-exosome complexes are aggregated.
  • a microparticle for example, a single exosome
  • Evaluation unit 507 evaluates the quality of the fine particles.
  • the evaluation unit 507 ranks the state of the fine particles into A rank, B rank, and C rank based on the state of the fine particles determined by the state determination unit 506.
  • the A rank is a case where both the particle diameter d and the zeta potential ⁇ of the fine particles are included in the reference range.
  • the rank B is a case where either one of the particle diameter d and the zeta potential ⁇ of the fine particles is not included in the reference range.
  • the C rank is a case where neither the particle diameter d of the fine particles nor the zeta potential ⁇ is included in the reference range.
  • the evaluation unit 507 evaluates whether or not the microparticle is a single exosome.
  • the evaluation unit 507 determines that the rank of the fine particles is rank A when the fine particles are present in the region DM3. Further, the evaluation unit 507 determines that the rank of the fine particles is rank B when the fine particles are present in the region DM2 or the region DM4. The evaluation unit 507 determines that the rank of the fine particles is rank C when the fine particles are present in the region DM1.
  • FIG. 15 is a diagram illustrating an example of the operation of the control device 5 of the present embodiment.
  • the particle detection apparatus 100 captures an image of side scattered light at a predetermined time interval.
  • the acquisition unit 501 acquires images captured by the imaging unit 32 of the particle detection device 100 one by one from the particle detection device 100 (step S10).
  • This image includes an image of fine particles that are electrophoresed in the migration channel 150.
  • the fine particle image includes an exosome image.
  • the identification unit 502 extracts a fine particle image from the image acquired in step S10, and assigns a unique particle number to each fine particle. That is, the identification unit 502 labels the fine particles (step S20).
  • the identification unit 502 determines whether or not labeling has been completed for all captured images (step S30). If it is determined that the labeling has not been completed for all captured images (step S30; NO), the identification unit 502 returns the process to step S10 and performs the labeling for the next image. If it is determined that the labeling has been completed for all captured images (step S30; YES), the identification unit 502 advances the process to step S40 and performs tracking for the identified fine particles.
  • the zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ for each fine particle based on the result tracked by the identification unit 502 (step S50). Further, the particle size determination unit 504 determines the particle size for each fine particle based on the result of tracking by the identification unit 502 (step S60). Note that the order of step S50 and step S60 may be reversed or may be executed in parallel.
  • correlation section 505 associates the zeta potential ⁇ of the fine particles determined by zeta potential determination section 503 with the particle diameter d of the fine particles determined by particle diameter determination section 504 (step SS70).
  • the correlation unit 505 generates a particle correlation list LS2 indicating the associated result, and stores the generated particle correlation list LS2 in the storage unit 520.
  • the correlation unit 505 determines that the association has not been completed for all the fine particles (step S80; NO)
  • the correlation unit 505 returns the process to step S40.
  • the correlation unit 505 determines that the association has been completed for all the fine particles (step S80; YES)
  • the correlation unit 505 advances the process to step S90.
  • the state determination unit 506 and the evaluation unit 507 perform particle state determination and evaluation based on the particle correlation list LS2 generated in step S70. Specific examples of the determination of the particle state by the state determination unit 506 and the evaluation by the evaluation unit 507 will be described below.
  • the evaluation unit 507 can compare and evaluate the particle size and zeta potential distribution before the substance is allowed to act on the fine particles and the particle size and zeta potential distribution after the substance is acted on.
  • the evaluation unit 507 evaluates the particle size and zeta potential distribution when an anti-CD81 antibody is allowed to act on the exosomes.
  • the correlation unit 505 generates the particle correlation list LS2-1 by associating the zeta potential ⁇ and the particle diameter d with respect to the exosome before the anti-CD81 antibody is allowed to act.
  • the correlation unit 505 generates a particle correlation list LS2-2 by associating the zeta potential ⁇ and the particle diameter d with respect to the exosome after the anti-CD81 antibody is acted thereon.
  • the evaluation unit 507 is shown in FIG. As shown, the particle size and zeta potential distribution is output.
  • FIG. 16 is a diagram showing an example of the particle size and zeta potential distribution output by the evaluation unit 507 of the present embodiment.
  • the evaluation unit 507 outputs the particle size and zeta potential distribution before the anti-CD81 antibody is allowed to act on the exosome and the particle size and zeta potential distribution after the action are overlapped and output.
  • grain detection system 1 can show the change of distribution of the particle diameter and zeta potential at the time of making a substance act on microparticles
  • the evaluation unit 507 may be configured to calculate an evaluation threshold value based on the state of the fine particles. As a specific example, the evaluation unit 507 calculates an evaluation threshold value based on the state of the exosome before the substance is applied, and the exosome after the substance is applied based on the calculated threshold value The case of evaluation will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 17 is a configuration diagram illustrating an example of the configuration of the control device 5a of the present embodiment.
  • the control device 5a includes a counting unit 508, a ratio calculation unit 509, and a change rate calculation unit 510 in addition to the functional units included in the calculation unit 500 of the control device 5.
  • the counting unit 508 counts the number of extracellular vesicles included in each region divided by the particle size threshold Thd and the zeta potential threshold Th ⁇ indicated by the reference range information.
  • an example of the region includes the region DM1 to the region DM4 described with reference to FIG.
  • the ratio calculation unit 509 calculates the ratio between regions of the number of extracellular vesicles counted by the counting unit 508.
  • the ratio calculation unit 509 calculates, for each region, the ratio of the number of extracellular vesicles in each region when the number of extracellular vesicles counted by the counting unit 508 is 100%.
  • the change rate calculation unit 510 calculates, for each region, the change rate between the ratio of the extracellular vesicles before the substance is applied and the ratio of the extracellular vesicles after the substance is applied. For example, the change rate calculation unit 510 calculates the change rate between the ratio of each exosome region before the anti-CD81 antibody is applied and the ratio of each exosome region after the anti-CD81 antibody is applied to each region. To calculate.
  • FIG. 18 is a diagram illustrating a modified example of the operation of the control device of the present embodiment.
  • FIG. 19 is a diagram illustrating an example of threshold values and regions according to the present embodiment.
  • the particle size determination unit 504 determines the particle size d for the exosome before the antibody action.
  • the evaluation unit 507 calculates the average value of the particle diameters d determined by the particle diameter determination unit 504 (step S110). In this example, the evaluation unit 507 calculates the average particle size as 120 nm.
  • the evaluation unit 507 stores the calculated average particle size of 120 nm in the storage unit 520 as the particle size threshold Thd (step S120).
  • FIG. 19 shows an example of the threshold value Thd calculated by the evaluation unit 507.
  • the zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ for the exosome before the antibody action.
  • the evaluation unit 507 calculates the average value of the zeta potential ⁇ determined by the zeta potential determination unit 503 (step S130). In this example, the evaluation unit 507 calculates the average zeta potential as ⁇ (minus) 13 mV.
  • the evaluation unit 507 stores the calculated average zeta potential ⁇ 13 mV in the storage unit 520 as the particle size threshold Th ⁇ (step S140).
  • FIG. 19 shows an example of the threshold value Th ⁇ calculated by the evaluation unit 507. The threshold value is stored in the storage unit 520 by the processing from step S110 to step S140.
  • the counting unit 508 counts the number of particles for each region of the exosome before the antibody action (step S150).
  • An example of the counting result by the counting unit 508 is shown in FIG.
  • FIG. 20 is a table showing an example of the counting result by the counting unit 508 of the present embodiment. Specifically, the counting unit 508 counts the number of particles in the region DM1 to the region DM4 as 24, 28, 16, and 19 for the exosome before the antibody action. Next, the ratio calculation unit 509 calculates the ratio of the number of particles between regions based on the number of exosome particles counted by the counting unit 508. Specifically, as shown in FIG. 20, the ratio calculation unit 509 calculates the ratio of the number of particles in the regions DM1 to DM4 as 28%, 31%, 19%, and 22%.
  • the counting unit 508 counts the number of particles for each region of the exosome after the antibody action (step S160). Specifically, the counting unit 508 counts the number of particles in the region DM1 to the region DM4 as 13, 0, 6, and 26 with respect to the exosome after the antibody action.
  • the ratio calculation unit 509 calculates the ratio of the number of particles between regions based on the number of exosome particles counted by the counting unit 508. Specifically, as shown in FIG. 20, the ratio calculation unit 509 calculates the ratio of the number of particles in the regions DM1 to DM4 as 29%, 0%, 13%, and 58%.
  • the change rate calculation unit 510 calculates the change rate between the ratio calculated in step S150 and the ratio calculated in step S160 (step S170). Specifically, as shown in FIG. 20, the change rate calculation unit 510 calculates the change rates of the regions DM1 to DM4 as + 3.5%, ⁇ 100%, ⁇ 32%, and + 163%.
  • the evaluation unit 507 evaluates the state of the fine particles by comparing the calculated change rate with a tendency of the change rate obtained in advance.
  • the evaluation unit 507 calculates the threshold value Thd of the particle size based on the average value of the particle size, and calculates the threshold value Th ⁇ of the zeta potential based on the average value of the zeta potential. Not limited to this.
  • the evaluation unit 507 may calculate, as the particle diameter threshold Thd, a line segment that is selected from the maximum value and the minimum value of the particle diameter distribution and is parallel to the axis indicating the particle diameter. Further, the evaluation unit 507 may calculate a line segment selected from the maximum value and the minimum value of the zeta potential distribution and parallel to the axis indicating the zeta potential as the zeta potential threshold Th ⁇ .
  • the evaluation unit 507 may evaluate the state of the fine particles based on the following tendency regarding the increase or decrease in the number of particles in each region before and after the action of the antibody. That is, regarding the region DM1, the cause of increase in the number of particles is the occurrence of aggregation, and the decrease factor is the binding of antibodies and the occurrence of aggregation. Further, regarding the region DM2, the cause of increase in the number of particles is elimination of aggregation, and the reduction factor is antibody binding and generation of aggregation. In the region DM3, the increase in the number of particles is antibody binding, and the decrease is caused by aggregation.
  • the increase in the number of particles is antibody binding and aggregation, and the decrease is aggregation elimination.
  • the evaluation unit 507 may evaluate the state of the fine particles based on the following tendency with respect to the increase or decrease in the number of particles in each region predicted by antibody binding. That is, for the region DM1, as a result of the antibody action, the particles migrate to the region DM4. In this case, the assumed mechanism is antibody binding. In addition, as for the region DM2, the number of particles decreases as a result of the antibody action. In this case, the assumed mechanism is antibody binding and aggregation generation. Further, as for the region DM3, as a result of the antibody action, the particles move to the region DM4. In this case, the assumed mechanism is antibody binding and aggregation generation. In addition, in the region DM4, the number of particles increases as a result of the antibody action. In this case, the assumed mechanism is antibody binding and aggregation generation.
  • the threshold value indicating the above-described tendency is stored in the storage unit 520 as the threshold value of the change rate.
  • the evaluation unit 507 evaluates the state of the fine particles by comparing the increase / decrease rate calculated by the procedure shown in FIGS. 18 to 20 with the threshold value of the change rate stored in the storage unit 520.
  • FIG. 21 is a schematic diagram illustrating an example of adding different types of antibodies to a plurality of lanes according to the present embodiment.
  • FIG. 22 is a table showing an example of a disease determination panel according to the present embodiment.
  • FIG. 23 is a table showing an example of a disease diagnosis and guidance panel according to the present embodiment.
  • the evaluation unit 507 can also add different antibodies for each lane and evaluate the state of the fine particles in each lane.
  • the particle detection system 1 it is possible to arbitrarily select and inspect the optimal combination of antibodies for the diagnosis of the target disease. Further, according to the particle detection system 1, since a plurality of lanes can be evaluated simultaneously, the evaluation time can be shortened as compared with the case of evaluating with a single lane.
  • the evaluation unit 507 can also evaluate the physical properties of the fine particles. As a specific example, a case where the evaluation unit 507 performs physical property evaluation of an exosome having a modified function will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 24 is a diagram illustrating an example of the gate region G of the present embodiment.
  • the gate region G is a region surrounded by the lower limit threshold Thd1 and the upper limit threshold Thd2 of the particle diameter d, and the lower limit threshold Th ⁇ 1 and the upper limit threshold Th ⁇ 2 of the zeta potential ⁇ .
  • the evaluation unit 507 of the present embodiment evaluates the physical properties of the particles by setting the gap between the lower limit threshold Thd1 of the particle diameter d and the upper limit threshold Thd2 of the particle diameter d as the gate region Gd of the particle diameter d.
  • the evaluation unit 507 evaluates the physical properties of the particle by setting the gap between the lower threshold value Th ⁇ 1 of the zeta potential ⁇ and the upper threshold value Th ⁇ 2 of the zeta potential ⁇ as the gate region G ⁇ of the zeta potential ⁇ .
  • each threshold value is described as being stored in advance in the storage unit 520, the present invention is not limited to this. Each of these threshold values may be calculated by the calculation unit 500 or may be supplied from the outside of the control device 5.
  • FIG. 25 is a diagram illustrating an example of an operation of evaluating the physical properties of the fine particles by the calculation unit 500 of the present embodiment.
  • the evaluation unit 507 reads the lower limit threshold value Thd1 and the upper limit threshold value Thd2 of the particle diameter d, and the lower limit threshold value Th ⁇ 1 and the upper limit threshold value Th ⁇ 2 of the zeta potential ⁇ from the storage unit 520 (step S210). Based on each threshold value read in step S210, the evaluation unit 507 displays information indicating the gate region on a display (not shown) (see the gate region G in FIG. 24) (step S220).
  • the zeta potential determination unit 503 determines the zeta potential ⁇ of the fine particles to be evaluated. Further, the particle size determination unit 504 determines the particle size d of the fine particles to be evaluated (step S230). In this specific example, the microparticles to be evaluated are functionally modified exosomes.
  • the correlation unit 505 associates the zeta potential ⁇ determined in step S230 with the particle diameter d for each fine particle (step S240). Further, the correlation unit 505 displays the associated zeta potential ⁇ and the particle diameter d on a display (not shown) for each fine particle.
  • the counting unit 508 counts the number of fine particles present in the gate region G (step S250).
  • the counting unit 508 counts the number of fine particles existing outside the gate region G (step S260).
  • the ratio calculating unit 509 calculates the ratio between the number of particles in the gate region G and the number of particles outside the gate region G based on the number of particles counted by the counting unit 508 (step S270), and ends the process. .
  • FIG. 26 is a diagram illustrating an example of evaluation performed by the evaluation unit 507 according to the present embodiment.
  • the evaluation unit 507 determines that the particle is present when the number of particles present in the gate region G is relatively large, and determines that the particle is not suitable when the number of particles present in the gate region G is relatively small. To do. That is, the evaluation unit 507 determines suitability of the evaluation target fine particles based on the number of particles in the gate region G and the number of particles outside the gate region G.
  • exosomes can be used as drug carriers in drug delivery systems.
  • an arbitrary protein gene is introduced into a cell using a viral vector, and exosomes are recovered from the cell. This makes it possible to use exosomes as delivery carriers for siRNA and miRNA.
  • a function-modified exosome in which a specific binding substance is bound to exosome can be prepared and used. According to the evaluation unit 507 described above, it is possible to evaluate whether or not the functionally modified exosome is compatible with the drug delivery system described above.
  • the particle detection system 1 obtains the particle diameter of the fine particles and the zeta potential for each fine particle, and correlates the obtained particle diameter with the zeta potential.
  • the particle detection system 1 can detect scattered light generated from fine particles with high accuracy by making illumination light incident from the side surface of the lane 2.
  • fine-particles can be determined accurately. Therefore, according to the particle detection system 1, the state of the fine particles can be accurately determined.
  • a configuration in which a force by an electric field is applied to move the particles in the flow path 13 is exemplified.
  • the present invention is not limited to this. It may be a configuration that moves in a direction or a configuration that does not give a force to move particles in a predetermined direction.
  • the scattered light generated from the particle toward the ⁇ Z side is detected.
  • the present invention is not limited to this.
  • the structure which detects this may be sufficient.
  • the detection unit is not limited to the bottom surface side of the flow path, but may be the side surface side of the flow path.
  • side scattered light may be detected from the bottom surface side of the flow channel, or side scattered light may be detected from the top surface side of the flow channel.
  • the structure which detects forward scattered light may be sufficient.
  • backscattered light may be detected from the illumination light exit side of the flow path, or forward scattered light may be detected from the illumination light exit side of the flow path. .
  • the fluid device C including the plurality of lanes 2 arranged in the length direction (y direction) is illustrated, but the plurality of lanes 2 are arranged in the height direction (z direction). Also good.
  • the solution may be injected from the length direction (x direction) or from the y direction.
  • there are a plurality of irradiation light sources and each of the light sources irradiates fine particles flowing through the lane 2 having a corresponding height. Further, the fine particles flowing in the lane 2 may be irradiated by changing the irradiation direction from at least one irradiation light source.
  • the second adjustment unit In order to adjust the position where the width of the illumination light L1 in the z direction is the minimum size, for example, as the second adjustment unit, a plurality of adjustment units CL (lenses) having different focal lengths are provided on the turret plate, The lens can be rotated to position a lens having a desired focal length in the optical path of the illumination light L1, or a zoom lens can be used. Further, the effective diameter of the condensing lens may be made variable by using a plurality of adjustment parts CL having different effective diameters and using a configuration in which a lens having a desired effective diameter is positioned in the optical path of the illumination light L1 or a variable NA stop.
  • a plurality of expander lenses 22 having different magnifications may be used, and the magnification may be variable by adopting a configuration in which the expander lens 22 having a desired effective diameter is positioned in the optical path of the illumination light L1 or a configuration using a zoom lens.
  • the present invention is not limited to this.
  • ⁇ It may be tilted by 10 degrees or ⁇ 5 degrees.
  • the scattering angle dependency of Rayleigh scattered light becomes the weakest.
  • Mie scattered light from particles larger than the particles is cut, noise is reduced, and the signal intensity of Rayleigh scattered light may be higher when the optical axis of the illumination light L1 is inclined with respect to the x axis. is there.
  • this apparatus and this system are applicable besides exosome.
  • this device and this system are not only organic particles such as exosomes (extracellular endoplasmic reticulum) but also foreign particles such as bacteria and viruses, as well as inorganic substances such as metals and silica. It is possible to extend the application range to particles.
  • the particle detection system 1 determines the state of the fine particles and specifies the type of the fine particles.
  • the state of the fine particles determined by the particle detection system 1 includes aggregation of the fine particles, a binding state between the fine particles and the antibody, and the like.
  • the types of fine particles specified by the particle detection system 1 include exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, cells, polymer micelles, and the like.
  • the particle detection device 100 detects the side scattered light generated from the particles, image information with less noise can be obtained compared to the case where the forward scattered light is received.
  • the illumination light L1 is not limited to the side surface 16a where the irradiation light beam passes at the position of the side surface 16a, but a part K of the illumination light L1 enters the flow path 13 via the bottom plate 11.
  • scattered light may be generated on the side surface 16b or the bottom surface 16c.
  • the signal intensity of the scattered light generated on the side surface 16b or the bottom surface 16c is several orders of magnitude greater than the signal intensity of the scattered light generated on the observation target particle, and exceeds the dynamic range of the imaging unit 32.
  • the illumination light L1 is such that the passage region of the illumination light L1 is limited within the side surface 16a at the position of the side surface 16a and the passage region of the illumination light L1 is limited within the end surface 17 at the position of the end surface 17. Therefore, the generation of scattered light having a high signal intensity can be suppressed. Therefore, the particle detection apparatus 100 can detect information regarding the particles in the flow path 13 with high accuracy.
  • the scattered light from the particles outside the DOF of the detection unit 30 becomes background light due to defocusing and cannot be detected in the form of particles.
  • the width in the z direction is minimized inside the flow path 13, and the background light outside the observation region in the flow path 13 is suppressed, so that the particles illuminated with the illumination light L1 are detected with high accuracy. It becomes possible to do.
  • the end surface 17 is mirror-finished, it can be suppressed that scattered light becomes noise on the end surface 17 and adversely affects particle detection accuracy.
  • the illumination light L1 is incident perpendicularly to the end face 17, the optical axis can be easily adjusted.
  • the particle detection apparatus 100 may move the fine particles in a predetermined direction by giving a flow rate to the medium. Further, the particle detection device 100 may be configured not to apply a force that moves the fine particles in a predetermined direction.
  • the particle detection device 100 and the control device 5 may be an integrated device.
  • the control device 5 may be configured as a computer incorporated in the particle detection device 100.
  • the program for realizing the control function may be recorded on a computer-readable recording medium, and the program recorded on the recording medium may be read by the computer system and executed.
  • the “computer system” is a computer system built in the particle detection apparatus 100 and includes an OS and hardware such as peripheral devices.
  • the “computer-readable recording medium” refers to a storage device such as a flexible medium, a magneto-optical disk, a portable medium such as a ROM or a CD-ROM, and a hard disk incorporated in a computer system.
  • the “computer-readable recording medium” is a medium that dynamically holds a program for a short time, such as a communication line when transmitting a program via a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line,
  • a volatile memory inside a computer system that serves as a server or a client may be included that holds a program for a certain period of time.
  • the program may be a program for realizing a part of the functions described above, and may be a program capable of realizing the functions described above in combination with a program already recorded in a computer system.
  • Each functional block of the particle detection apparatus 100 may be individually made into a processor, or a part or all of them may be integrated into a processor. Further, the method of circuit integration is not limited to LSI, and may be realized by a dedicated circuit or a general-purpose processor. In addition, when an integrated circuit technology that replaces LSI appears due to the advancement of semiconductor technology, an integrated circuit based on the technology may be used.
  • SYMBOLS 1 Particle detection system, 5 ... Control apparatus, 100 ... Particle detection apparatus, 501 ... Acquisition part, 502 ... Identification part, 503 ... Zeta potential determination part, 504 ... Particle diameter determination part, 505 ... Correlation part, 506 ... State determination Part, 507 ... evaluation part

Abstract

微粒子検出システムは、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置面に設置されうるステージ部と、流路に照明光を照射する照射部と、照明光の照射により、試料中の微粒子から生ずる散乱光を撮像する撮像部と、撮像部が撮像した画像に基づいて、画像に含まれる微粒子を微粒子毎に識別する識別部と、識別部が識別した微粒子毎に、微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、識別部が識別した微粒子毎に、微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、粒子径判定部が判定した微粒子毎の粒子径と、ゼータ電位判定部が判定した微粒子毎のゼータ電位とを、微粒子毎に関連付けする相関部とを備える。

Description

微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
　本発明は、微粒子検出システム及び微粒子検出プログラムに関するものである。
　本願は、２０１５年４月２１日に，日本に出願された特願２０１５－０８７０２１号に基づき優先権を主張し，その内容をここに援用する。
　媒質中を移動する微粒子を暗視野照明のもとでの顕微鏡観察により撮像し、撮像した画像を処理することによって、その微粒子の数や移動速度を計測する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような装置においては、異なるタイミングで撮像された複数枚の画像に基づいて、微粒子の移動の軌跡を追跡することにより、微粒子の数や移動速度を計測している。
特開２００９－２２９１０３号公報
　しかしながら、例えば、特許文献１記載の技術では、媒質中に存在する複数の微粒子のゼータ電位と、微粒子径との相関までは、判定することができなかった。
　本発明は、媒質中に存在する細胞外小胞体などの微粒子のゼータ電位と、微粒子径との相関を判定することができる微粒子検出システム及び微粒子検出プログラムを提供する。
　本発明の一態様は、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、を備える微粒子検出システムである。
　また、本発明の一態様は、微粒子を含む試料を移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部を備えるコンピュータに、前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定ステップと、前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定ステップと、前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関ステップと、を実行させるための微粒子検出プログラムである。
　また、本発明の一態様は、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射する照射部と、前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部と、前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、前記粒子径判定部が判定した前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、を備える微粒子検出システムである。
本実施形態に係る粒子検出システムの概略的な平面図である。 本実施形態に係る粒子検出装置の概略的な正面図である。 本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。 図３におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。 本実施形態に係るステージ部の設置面に流体デバイスが設置された平面図である。 本実施形態に係る流体デバイスをｙｚ平面で部分的に断面した部分断面図である。 図６におけるＡ－Ａ線断面図である。 本実施形態に係る照射部及び調整部の概略構成を示す図である。 本実施形態に係る調整部および流体デバイスの部分詳細図である。 本実施形態に係る照明光がリザーバ部材の端面および流路の側面を通過する光路を模式的に示す図である。 本実施形態に係る制御装置の概略構成を示す図である。 本実施形態に係る記憶部が記憶する粒子リストの一例を示す図である。 本実施形態に係る記憶部が記憶する粒子相関リストの一例を示す図である。 本実施形態の記憶部が記憶するしきい値の一例を示す図である。 本実施形態の制御装置の動作の一例を示す図である。 本実施形態の評価部が出力する粒子径及びゼータ電位の分布の一例を示す図である。 本実施形態の制御装置の構成の一例を示す構成図である。 本実施形態の制御装置の動作の変形例を示す図である。 本実施形態のしきい値及び領域の一例を示す図である。 本実施形態の計数部による計数結果の一例を示す表である。 本実施形態の複数のレーンにそれぞれ種類が異なる抗体を添加する場合の一例を示す模式図である。 本実施形態の疾患の判定パネルの一例を示す表である。 本実施形態の疾患の診断及び指導パネルの一例を示す表である。 本実施形態のゲート領域の一例を示す図である。 本実施形態の演算部による微粒子の物性評価の動作の一例を示す図である。 本実施形態の評価部による評価の一例を示す図である。
　本実施形態の粒子検出システム１は、粒子検出装置１００と、制御装置５とを備えている。なお、以下の説明において、粒子検出システム１が検出する粒子が、細胞外小胞体である場合には、この粒子検出システム１を細胞外小胞体検出システムとも称する。まず、粒子検出装置１００について、図１から図１０を参照して説明する。
［粒子検出装置の構成］
　図１は、実施形態に係る粒子検出システム１の概略的な平面図である。図２は、実施形態に係る粒子検出装置１００の概略的な正面図である。
　粒子検出装置１００は、流体デバイスＣを検出対象として流体デバイスＣに照明光Ｌ１を照射し、流体デバイスＣからの散乱光Ｌ２を観察することにより、流体デバイスＣ内の粒子に関する情報を検出する。粒子検出装置１００は、光源部ＬＳ、照射部２０、調整部ＣＬ、ステージ部ＳＴ、検出部３０、送信部４０、および制御装置５を備えている。粒子検出装置１００および流体デバイスＣによって粒子検出システム１が構成される。
　以下の説明においては、ステージ部ＳＴの設置面ＳＴａと直交し、照明光Ｌ１と平行な面（不図示）と直交する方向をｘ方向（ｘ軸；第３方向）、設置面ＳＴａと平行でｘ方向と直交する方向をｙ方向（ｙ軸）、ｘ方向およびｙ方向と直交する鉛直方向をｚ方向（ｚ軸；第２方向）として適宜説明する。
　まず、検出対象である流体デバイスＣについて説明する。
　本実施形態における流体デバイスＣは、一例として、検体を分析する際に用いられる電気泳動分析チップである。検体となる微粒子としては、細胞、細菌、ウィルス、細胞外小胞体（細胞外ベシクル）、合成高分子、無機物、若しくは金属を基材とする微粒子、磁性微粒子、高分子ミセル構造を有する微粒子等が挙げられる。合成高分子を基材とする微粒子としては、例えばポリスチレン等のラテックス粒子が挙げられる。無機物を基材とする微粒子としては、例えばシリカ粒子が挙げられる。金属を基材とする微粒子としては、例えば鉄製ビーズが挙げられる。磁性微粒子としては、例えば鉄、酸化鉄、ニッケル等を含む磁性を有するビーズが挙げられる。合成高分子、無機物、若しくは金属を基材とする微粒子、及び磁性微粒子のいずれも、ペプチド、タンパク質、細胞、各種化合物等で表面を修飾された粒子を含む。
　本実施形態では、電気泳動分析チップとして、細胞外小胞体を分析するための細胞外小胞体分析チップを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。細胞外小胞体の大きさは直径３０ｎｍから１μｍ程度である。細胞外小胞体は、細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
　以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）について説明する。
［エクソソーム］
　エクソソームは、直径３０～２００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
　生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
　そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
　エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
　［エクソソームの分析］
　細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
（特異的結合物質）
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
　また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
（エクソソームの精製）
　本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
　エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
　次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質－エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。また、例えば人工的に膜表面にあるペプチドやタンパク質を発現させたエクソソームに対し、そのペプチドやタンパク質に対して特異的に結合する特異的結合物質を用いるなど、機能を改変したエクソソームを評価することもできる。
　（ゼータ電位の計測）
　一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体－エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
　エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
　エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷのものが挙げられる。
　（粒子径の計測）
　エクソソームの粒子径ｄは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（２）に示すアインシュタイン・ストークスの式を用いて算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　式（２）中、ｄはエクソソームの粒子径、ｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηはサンプル溶液の粘性係数、Ｄは微粒子の拡散係数である。すなわち、エクソソームの粒子径ｄは、測定対象のエクソソームのブラウン運動の状態に基づいて、算出することができる。
［細胞外小胞体分析チップの基本構造］
　図３は、実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。図４は、図３におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。細胞外小胞体分析チップＣＨは、第１リザーバ１１０と、第２リザーバ１２０と、第１リザーバ１１０と第２リザーバ１２０とを接続する泳動流路１５０と、基材１６０とを備えている。泳動流路１５０は、例えば、ミリ流路やマイクロ流路である。泳動流路１５０は、一例として、幅２００μｍ、高さ４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさである。泳動流路１５０の断面は矩形でなくてもよく、例えば、円、楕円、多角形、又はトンネル形状としてもよい。泳動流路１５０は、細胞外小胞体、あるいは、細胞外小胞体の表面に存在する生体分子に特異的に結合する特異的結合物質と細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質－細胞外小胞体複合体（一例として、抗体－エクソソーム複合体）を電気泳動するものである。特異的結合物質の一例として、抗体、アプタマー、またはこれらの組み合わせからなるものが挙げられる。アプタマーは例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどである。特異的結合物質が認識する分子としては、例えば抗原、膜タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質等が挙げられる。
　泳動流路１５０は、その一方の端部が第１リザーバ１１０と接続され、その他方の端部が第２リザーバ１２０と接続されている。また、第１リザーバ１１０及び第２リザーバ１２０は、基材１６０に設けられ、それぞれ電極１３０及び電極１４０を有している。例えば、電極１３０は第１リザーバ１１０の底部に設けられ、電極１４０は第２リザーバ１２０の底部に設けられている。図４に示すように、電極１３０及び電極１４０は、それぞれ泳動流路１５０の端部の近傍に設けられている。また、例えば、第１リザーバ１１０は検体（例、分析対象のエクソソーム）が導入され、第２リザーバ１２０は緩衝液が導入される。なお、その緩衝液は第１リザーバ１１０に導入されてもよい。
　本細胞外小胞体分析チップＣＨは、細胞外小胞体のゼータ電位を計測するのに好適である。以下に、検体又は細胞外小胞体としてエクソソームを分析する場合を例として、本細胞外小胞体分析チップを用いた、エクソソームのゼータ電位の測定方法について説明する。
　まず、分析対象のエクソソームを含む試料液が、第１リザーバ１１０に導入される。分析対象のエクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。エクソソームは例えば培養上清や血清から抽出したものであり、試料液は、例えば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）等の緩衝液にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液である。次に、エクソソームを含む試料液が泳動流路１５０に導入される。一例として、シリンジを第２リザーバ１２０に接続して試料液を吸引することにより、エクソソームを泳動流路１５０に導入することができる。次に、緩衝液を、第１リザーバ１１０及び第２リザーバ１２０に入れる。後述する液位調整手段により、第１リザーバ１１０と第２リザーバ１２０との液位（液面高）を調整して揃え、泳動流路１５０に生じる静水圧流の発生を防ぎ、ゼータ電位測定の精度を向上させることが可能となる。続いて、制御部（例、後述の制御装置５、又はコンピュータなど）によって電極１３０及び１４０の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。一例として、制御部は約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。
　電気泳動中に、泳動流路１５０にレーザー光を照射し、泳動流路１５０からの出射光であるエクソソームを介した散乱光を、対物レンズ等を用いて集光し、受光センサ（例、高感度カメラ）を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質－エクソソーム複合体を撮影する。対物レンズの倍率は、一例として６０倍程度である。レーザーの波長及び強度は、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷである。
　本実施形態における細胞外小胞体分析チップを用いることにより、特異的結合物質－エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質－エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子（例えば、抗原等）を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、該抗原を有するエクソソームを検出することができる。
［流体デバイスＣの構造］
　図５は、実施形態に係るステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに流体デバイスＣが設置された平面図である。図６は、実施形態に係る流体デバイスＣをｘｚ平面で部分的に断面した部分断面図である。図７は、図６におけるＡ－Ａ線断面図である。
　図５に示すように、流体デバイスＣは、平面視矩形状に形成されている。図６に示すように、流体デバイスＣは、ｚ方向に順次積み重ねられたリザーバ部材（第１基材）１０および底板（第２基材）１１を備えている。例えば、本実施形態における流体デバイスＣは、少なくともリザーバ部材１０、底板１１で構成された、積層構造（積層体）である。
この場合、流体デバイスＣの積層構造は二層構造となっている。また、例えば、このような流体デバイスＣの積層構造は、リザーバ部材１０と、底板１１とを互いに貼りあわせて形成される。
　リザーバ部材１０は、外力などによって少なくとも一方向に弾性変形可能な材料で形成してもよい。リザーバ部材１０の材料には、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。底板１１は、照明光Ｌ１の照射によって発生した散乱光Ｌ２が透過する材料で形成されている。底板１１は、一例として、ガラス材で形成されている。
　流体デバイスＣは、長さ方向（ｘ方向）に配列された複数（図５では３つ）のレーン２を備えている。各レーン２は、第１リザーバ１２Ａ、第２リザーバ１２Ｂ、流路１３および電極１８Ａ、１８Ｂを備えている。第１リザーバ１２Ａ及び第２リザーバ１２Ｂは、ｘ方向に間隔をあけて配置されている。例えば、第１リザーバ１２Ａ及び第２リザーバ１２Ｂは、流路１３の流路方向に間隔をあけて配置されている。このように、複数のレーンが流路方向に（直列に）配列されていることによって、側方からの光の照射が容易となる。
複数のレーンをレーンごとに順番に分析してもよく、また、複数の検出系によって同時に分析してもよい。なお、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。
この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
　ここで、レーン２が複数ある場合には、対物レンズの移動により照明光の形状を調整することにより、各レーン２に照射される照明光を調整してもよい。また、レーン２が複数ある場合には、流体デバイスＣが載置されるステージの移動によって、複数レーン２のうち測定対象のレーン２を選択（切換え）する構成であってもよい。
　第１リザーバ１２Ａは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形状でｚ方向に延在する保持空間１４Ａと、保持空間１４Ａの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って漸次拡径する漏斗状の導入部１５Ａとを備えている。保持空間１４Ａは、－ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ａは、流路１３と接続される。
　第２リザーバ１２Ｂは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形状でｚ方向に延在する保持空間１４Ｂと、保持空間１４Ｂの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って漸次拡径する漏斗状の導入部１５Ｂとを備えている。保持空間１４Ｂは、－ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ｂは、流路１３と接続される。
　流路１３は、電気泳動用流路（電気泳動のための流路）である。流路１３は、流体デバイスＣの長さ方向であるｙ方向に延在する。流路１３は、底板１１と対向する側の面に保持空間１４Ａと保持空間１４Ｂとを接続するように設けられている。流路１３は、図７に示すように、リザーバ部材１０に形成された溝部１０Ａと、底板１１の表面（第２面）１１ａとで囲まれた断面矩形に形成されている。溝部１０Ａは、ｘ方向に対向する側面（第１面）１６ａ、１６ｂと、底板１１の表面１１ａとｚ方向で対向する底面（第２面）１６ｃに囲まれて形成される。側面１６ａ、１６ｂ、底面１６ｃおよび溝部１０Ａを構成する表面１１ａは鏡面加工されている。第１面は、第１側面である側面１６ａと第２側面である側面１６ｂとを含む。側面１６ａと側面１６ｂとは、互いに向かい合っており、第１方向であるｘ方向に互いに離間している。
　レーン２は、流体デバイスＣの幅方向である照明光Ｌ１の光軸方向（入射方向）について、中心よりも＋ｘ側の端面１７に近い側に偏って配置されている。レーン２は、入射する照明光Ｌ１の光軸方向である流体デバイスＣの幅方向（図５におけるｘ方向）について、中心よりも照明光Ｌ１の入射側の端面１７に近い側に偏って配置されている。端面１７は、ｙ方向に関して少なくともレーン２が設けられる範囲が鏡面加工されている。流路１３は、一例として、幅２００μｍ、高さ（溝部１０Ａの深さ）４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさに形成されている。
　底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ａに臨んで電極１８Ａが設けられている。底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ｂに臨んで電極１８Ｂが設けられている。電極１８Ａ及び電極１８Ｂの素材としては、金、白金、カーボン等が挙げられる。図７に示すように、底板１１における照明光Ｌ１の入射側に位置する端面（第２端面）１９は、ｘ方向について、リザーバ部材１０の端面１７の位置よりも、照明光Ｌ１の入射側とは逆側である－ｘ側に離間している。
　図１に戻り、光源部ＬＳは、粒子に対して悪影響を及ぼさない波長として、上述したように、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷでビーム径（ピーク値に対して1/e２となる径）０．８ｍｍでｚ方向を偏向方位とするレーザー光を照明光Ｌ１として発光する。なお、照明光Ｌ１は、偏光（例えば、直線偏光など）であっても、無偏光であってもよいが、本実施形態では、垂直偏光を用い、レイリー散乱の指向性が無い構成を採る。
　照明光Ｌ１は、上述した直交面と交差する方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。本実施形態では、照明光Ｌ１の光軸は、ｘ方向と平行である。本実施形態の照明光Ｌ１は、ｘ方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。
　図８は、実施形態に係る照射部２０及び調整部ＣＬの概略構成を示す図である。照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸に沿って順次配置されたλ／２板２１およびエキスパンダレンズ２２を備えている。なお、図１に示される光源部ＬＳおよび照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸がｙ方向に延びているが、最終的に流体デバイスＣ（流路１３）を照射する照明光Ｌ１はｘ方向に沿った光軸であるため、図８に示す照明光Ｌ１は、光軸がｘ方向に沿うものとして図示している。
　光源部ＬＳが発光した照明光Ｌ１は、λ／２板２１を透過することで偏光方位がｙ方向に回転する。なお、光源部ＬＳがｙ方向を偏向方位とする照明光Ｌ１を発光する場合にはλ／２板２１は不要である。エキスパンダレンズ２２は、対向するシリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂを備える。シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂは、ｙ方向についてはパワーを有していないため、照明光Ｌ１はｙ方向の幅が一定である。照明光Ｌ１のｚ方向の幅は、シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂの光軸方向の距離に応じて拡大または縮小する。本実施形態では、エキスパンダレンズ２２は、照明光Ｌ１のｚ方向の幅を、一例として、２倍に拡大する。
　調整部ＣＬは、エキスパンダレンズ２２でｚ方向の幅が拡大されて入射した照明光Ｌ１を調整する。調整部ＣＬは、光源部ＬＳと対物レンズ３１との間の光路に配置されている。また、調整部ＣＬは、λ／２板２１又はエキスパンダレンズ２２と対物レンズ３１との間の光路に配置されている。調整部ＣＬは駆動機構を備えていてもよく、調整部ＣＬが移動することで収光点を調整できてもよい。調整部ＣＬは例えばｘ方向に駆動可能である。
この場合、流路１３の位置が異なるチップを用いた場合であっても、流路１３内に収光点が位置するように調整することが可能である。また、収光点と流路１３の中心とがほぼ一致するように調整してもよく、検出部の中心部と収光点とがほぼ一致するように調整してもよい。
　図９は、実施形態に係る調整部ＣＬおよび流体デバイスＣの部分詳細図である。調整部ＣＬは、一例として、シリンドリカルレンズで構成される。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する収束角度に調整している。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の照射領域が側面１６ａ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。また、調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の通過領域が側面１６ｂ内に限定されるように収束する収束角度に調整している。
調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。
また、調整部ＣＬは、リザーバ部材１０の端面１７の位置における照明光Ｌ１の照射領域が端面１７内に収束する収束角度に調整している。さらに、調整部ＣＬは、照明光Ｌ１が流路１３内の検出領域において収束点が存在するような収束角に調整している。
例えば、流路１３の検出領域において検出部３０の焦点深度外の照明光Ｌ１の照明光束は焦点深度内の照明光束よりも少なくなるような収束角を有する。なお、例えば、上述の直交面は、リザーバ部材１０の端面１７、流路１３の照射光入射側の側面１６ａ、又は流路１３の照射光射出側の側面１６ｂを含む。
　ここで、照明光Ｌ１が光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の中央（ｘ＝０とする）でｚ方向の幅が最小幅ω０となる場合、照明光Ｌ１の流路１３内の媒質での収束角をθ、照明光Ｌ１の波長をλ、位置ｘおよび収束角θでのｚ方向のビーム幅をω（ｘ、θ）、照明光Ｌ１のビームプロファイルファクタをＭ２、最小幅ω０となるｘ方向の位置から側面１６ａまでの距離をｘＬとすると、下記の式（３）、式（４）において、式（５）を満足する必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　従って、調整部ＣＬは、少なくとも式（３）～（５）を満足し、且つｘ＝ｘＬのときのビーム幅ω（ｘＬ、θ）が側面１６ａのｚ方向の長さよりも小さく、側面１６ａ内に収束する収束角θで照明光Ｌ１を収束させるように調整された光学特性を有するものが設置される。
　なお、照明光Ｌ１がガウシアン光である場合には、上記の式（３）～（５）に含まれるビーム幅ω（ｘ、θ）は、照明光Ｌ１の強度がピーク値に対して１／ｅ２となる幅で規定される。収束角θが式（１）～（３）を満足する場合でも、ピーク値に対して１／ｅ２以下となる強度の照明光Ｌ１がビーム幅ω（ｘＬ、θ）の外側で側面１６ａの位置に入射するため、収束角θを設定する際はピーク値に対して１／ｅ２以下となる強度の照明光Ｌ１のビーム幅も考慮する。
　また、検出部３０によって照明光Ｌ１の光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の全域を検出領域とするには、流路１３の全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る必要がある。照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、リザーバ部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａの光軸に対する傾きも考慮する必要がある。図１０は、実施形態に係る照明光Ｌ１がリザーバ部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａを通過する光路を模式的に示す図である。流路１３の幅全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦ（図９参照）が入るためには、下記の式（６）を満足する必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　ここで、角度δ３は、焦点面Ｆから見た照明光軸の仰角であり、焦点面Ｆから反時計回り方向を正方向とする。一方で、界面での入射角・出射角、リザーバ部材１０の端面１７及び流路１３の側面１６ａのｙｚ平面に対する傾斜角、空気中・流路デバイスＣの材質中・流路中の照明光束の焦点面Ｆに対する仰角、および流路デバイスＣの外側の媒質・流路デバイスＣの材質・流路１３内の媒質の屈折率には以下の関係が成立している。
　ｎ１ｓｉｎα１＝ｎ２ｓｉｎα２
　ｎ２ｓｉｎα３＝ｎ３ｓｉｎα４
　α１＋β１＝δ１
　α２＋β１＝δ２
　α３＋β２＝δ２
　α４＋β２＝δ３
　ここで、
　α１：自由空間からリザーバ部材１０の端面１７への照明光Ｌ１の入射角
　α２：端面１７からリザーバ部材１０内の照明光Ｌ１の出射角
　α３：リザーバ部材１０内から流路１３の壁面１６ａへの照明光Ｌ１の入射角
　α４：壁面１６ａから流路１３内部への照明光Ｌ１の出射角
　β１：端面１７の傾斜角
　β２：壁面１６ａの傾斜角
　δ１：自由空間においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
　δ２：リザーバ部材１０内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
　δ３：流路１３内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
　ｎ１：自由空間媒質の屈折率
　ｎ２：リザーバ部材１０材質の屈折率
　ｎ３：流路１３内の媒質の屈折率
であり、
　入射角・出射角：端面１７および壁面１６ａへの垂線からの角度
　傾斜角：焦点面Ｆの垂線からの角度
　仰角：焦点面Ｆからの角度
としている。また、符号は全て反時計回り方向を正とする。
　上記の式から流路１３における照明光Ｌ１の仰角δ３は、以下の式（７）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　従って、流路１３のｘ方向の幅全体に亘って、照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、以下の式（８）を満足する必要がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　従って、リザーバ部材１０の端面１７および流路１３の壁面１６ａの傾斜角、照明光Ｌ１の仰角δ３は、自由空間媒質の屈折率ｎ１、リザーバ部材１０の材質の屈折率ｎ２および流路１３内の媒質の屈折率ｎ３に応じて、式（８）を満足するように、選択・製造・調整されている必要がある。
　ステージ部ＳＴは、図２に示すステージ駆動部６０の駆動によって、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向に移動する。ステージ駆動部６０の駆動は、制御装置５によって制御される。
図５に示すように、ステージ部ＳＴは、流体デバイスＣが設置される設置面ＳＴａを備える。設置面ＳＴａは、ｘｙ平面と平行の面である。設置面ＳＴａは、ｙ方向に間隔をあけて配置されている。設置面ＳＴａは、流路デバイスＣのレーン２が設けられていないｙ方向の両端部を－Ｚ側から支持する。流体デバイスＣは、レーン２が配される領域が検出部３０による－Ｚ側からの観察に支障を来すことなく設置面ＳＴａに支持される。また、流体デバイスＣにおけるレーン２に照射されるまでの照明光Ｌ１の光路にステージ部ＳＴが存在しないため、流体デバイスＣに入射する照明光Ｌ１の一部がステージ部ＳＴに入射して、後述する粒子検出に悪影響を及ぼすことを抑制できる。
　設置面ＳＴａには、固定ピン５１が突出して設けられている。固定ピン５１は、流体デバイスＣの長辺に当接する二つの固定ピン５１ａと、流体デバイスＣの短辺に当接する一つの固定ピン５１ｂとから構成される。固定ピン５１ａは流体デバイスＣのｙ方向の両側の近傍にそれぞれ配置される。固定ピン５１ｂは、＋ｙ側に位置する短辺に当接する。当該＋ｙ側に位置する固定ピン５１ａと固定ピン５１ｂとが配置された角部と対角に位置する角部には、押し付けコマ５２が設けられている。押し付けコマ５２は、ステージ部ＳＴに対して流体デバイスＣを対角方向に押し付ける。押し付けられた流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに当接することで、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ｘｙ方向に関してステージ部ＳＴに位置決めされた状態で固定される。
　検出部３０は、対物レンズ３１、撮像部３２を備えている。対物レンズ３１は、ステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの－Ｚ側に配置されている。図９に示すように、対物レンズ３１は、検出軸３１ａがｘ方向について流路１３の中心を通る位置に配置される。検出軸３１ａは、照明光Ｌ１の光軸と直交する。撮像部３２は、一例として、ＥＭＣＣＤ（Electron Multiplying Charge Coupled Device）カメラを備えており、入射する光の画像を撮像する。撮像部３２は、対物レンズ３１を介して入射する側方散乱光の画像情報を取得する。
　送信部４０は、撮像部３２で撮像された画像情報を制御装置５へ送信する。
［粒子検出装置の動作］
　粒子検出装置１００の動作は、設置工程、導入工程、照射工程、検出工程を含む。
　設置工程は、流体デバイスＣをステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに設置する工程である。
　具体的には、図５に示したように、押し付けコマ５２により流体デバイスＣを対角方向に押し付けることにより、流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに押し付けられ、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ステージ部ＳＴに位置決めされた状態で設置面ＳＴａに設置される。
　導入工程は、粒子を含む試料を流体デバイスＣの保持空間１４Ａ、１４Ｂおよび流路１３に導入する工程である。試料としては、一例として、リン酸緩衝液等の緩衝液（媒質）にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液を用いることができる。
　試料が流路１３に導入されたら、制御装置５はステージ駆動部６０を駆動して、検出対象となるレーン２が照明光Ｌ１の光路および検出部３０の検出軸３１ａ上に位置させる。
検出対象となるレーン２が検出位置に移動すると、制御装置５は、電源部ＢＴを制御して電極１８Ａ及び電極１８Ｂに電界を印加させ、エクソソームを流路１３に沿って電気泳動させる力を付与する。一例として、制御装置５は、約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。エクソソームの移動方向は、ｙ方向と平行である。
　照射工程は、照明光Ｌ１をｘ方向と平行に流路デバイスＣの流路１３に照射する工程である。
　照明光Ｌ１を照射する照射部２０および調整部ＣＬは、ｙ方向の幅が一定で、上述した式（３）～式（８）を満足する収束角θでｚ方向に収束するシートビーム状の照明光Ｌ１を照射する。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）は、一例として、１０μｍである。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、図７および図９のｚ方向またはｚ方向と平行な方向である。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、入射面（端面１７および側面１６ａ）における照明光Ｌ１の光軸方向及び流路方向とは異なる方向であり、該光軸方向及び流路方向と直交する方向である。流路方向は、流路１３が延在する方向である。流路方向は、流路１３を流体が流れる方向である。
　照射された照明光Ｌ１は、流体デバイスＣの一方の端面（照明光入射側端面）１７、流路１３の側面（照明光入射側側面）１６ａ、流路１３の内部、流路１３の側面（照明光射出側側面）１６ｂ、流体デバイスＣの他方の端面（照明光射出側端面）２７（図５参照）を順次通過する。照明光Ｌ１は、エクソソームの移動方向と直交する方向に照射される。
照射された照明光Ｌ１は、図９に示すように、流路１３の内部においてｚ方向の幅が最小となるように収束し、且つ、流路１３の側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。さらに、照射された照明光Ｌ１は、流路１３の照明光射出側の側面１６ｂの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。照明光Ｌ１は、側面１６ａの位置における照射領域が側面１６ａ内に集光し、側面１６ｂの位置における照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角に調整されている。また、照射された照明光Ｌ１は、流路１３における検出部３０の検出領域において収束点が存在する。
　検出工程は、照明光Ｌ１のｘ方向と平行な照射によって流路１３内部の粒子から生じる散乱光を検出部３０によって観察（イメージング）し検出する。検出部３０における対物レンズ３１の検出軸３１ａが照明光Ｌ１の光軸と直交しているため、検出部３０は粒子から生じる側方散乱光を検出する。検出部３０は、ｘ方向と平行に照射された照明光Ｌ１の照射によって、ｘ方向と垂直なｚ方向に向かって散乱した光を検出する。散乱光が観察された粒子の像は撮像部３２で撮像される。送信部４０は、撮像部３２で撮像された画像情報を制御装置５へ送信する。
［制御装置の構成］
　制御装置５は、粒子検出システム１を統括的に制御する。制御装置５は、ステージ駆動部６０を介してステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの移動を制御する。制御装置５は、電源部（印加部）ＢＴを制御して、電極１８Ａ、１８Ｂに流路１３に沿った方向の電界を印加させる。また、制御装置５は、粒子検出装置１００が撮像した画像を処理することにより、種々の判定を行う。この制御装置５の構成の詳細について、図１１から図１６を参照して説明する。
　図１１は、本実施形態の制御装置５の概略構成を示す図である。制御装置５は、演算部５００と、記憶部５２０とを備えている。この記憶部５２０は、フラッシュメモリ、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ　Ｄｉｓｋ　Ｄｒｉｖｅ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）、レジスタなどの記憶装置を備えている。記憶部５２０には、演算部５００が実行するプログラム（ファームウェア）が予め格納される。また、記憶部５２０には、演算部５００が演算処理を行った演算結果が格納される。
　演算部５００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）を備えており、各種の演算を行う。この演算部５００は、その機能部として、取得部５０１と、識別部５０２と、ゼータ電位判定部５０３と、粒子径判定部５０４と、相関部５０５と、状態判定部５０６と、評価部５０７とを備えている。
　取得部５０１は、粒子検出装置１００が撮像した画像を取得する。具体的には、上述したように、粒子検出装置１００の撮像部３２は、対物レンズ３１を介して入射する側方散乱光の画像を撮像して、撮像した画像の画像情報を、送信部４０に出力する。取得部５０１は、撮像部３２が撮像した側方散乱光の画像の画像情報を、送信部４０を介して取得する。取得部５０１は、取得した画像を識別部５０２に出力する。
　識別部５０２は、粒子検出装置１００が撮像した画像のなかから、微粒子の画像を抽出する。例えば、識別部５０２は、取得部５０１から供給される画像に対して既知のフィルタ処理やパターンマッチング処理を施すことにより、微粒子の画像を抽出する。このとき、識別部５０２は、抽出した微粒子の画像に対して、微粒子ごとに粒子番号を付与してもよい。なお、識別対象の微粒子が細胞外小胞体である場合には、この粒子番号とは、細胞外小胞体識別子であってもよい。つまり、識別部５０２は、微粒子の粒子に対してラベリングを行ってもよい。このことによって後述する相関部において、微粒子のゼータ電位ζと微粒子の粒子径ｄとの関連付けが容易となる。このラベリングの際には、取得部が取得した複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された画像に含まれる第１の微粒子の画像と、第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された画像に含まれる第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定してもよい。また、識別部５０２は、ラベリングした微粒子の粒子について、粒子検出装置１００が撮像した画像のフレーム間の差分に基づいて、トラッキングを行う。ここで、トラッキングとは、画像内の粒子の座標の経時的変化を追跡することをいう。識別部５０２が、微粒子のトラッキングを行った結果の一例を図１２に示す。
　図１２は、本実施形態の記憶部５２０が記憶する粒子リストＬＳ１の一例を示す図である。この粒子リストＬＳ１には、行方向をラベリングされた粒子番号とし、列方向を撮像時刻として、各時刻における各微粒子の画像の座標（Ｘ、Ｙ）が記憶される。この一例においては、時刻ｔ０から、時刻ｔ５０までの各時刻における、微粒子Ｐ１から微粒子Ｐｎまでの、各微粒子の座標が粒子リストＬＳ１に記憶される。
　図１１に戻り、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎のゼータ電位ζを判定する。例えば、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２が行った微粒子Ｐ１についてのトラッキング結果のうち、時刻ｔ０から、時刻ｔ１までの微粒子Ｐ１の移動速度ｖ１に基づいて、微粒子Ｐ１のゼータ電位ζ１を判定する。
　ゼータ電位判定部５０３は、上述の式（１）に基づいてゼータ電位ζを判定する。なお、この一例では、サンプル溶液の誘電率ε及びサンプル溶液の粘性係数ηは、予め記憶部５２０に記憶されている。ゼータ電位判定部５０３は、記憶部５２０に記憶されているサンプル溶液の誘電率ε及びサンプル溶液の粘性係数ηと、識別部５０２によるトラッキング結果から求めた微粒子の移動速度とに基づいて、微粒子のゼータ電位ζを判定する。
　粒子径判定部５０４は、サンプル溶液中のブラウン運動による微粒子の移動量と、上述の式（２）とに基づいて、微粒子の径を判定する。ここでは、粒子径判定部５０４が、微粒子Ｐ１の粒子径を判定する場合の具体例について説明する。なお、この一例においては、ボルツマン定数ｋ及びサンプル溶液の絶対温度Ｔは、予め記憶部５２０に記憶されている。粒子径判定部５０４は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子Ｐ１の移動量を算出する。また、粒子径判定部５０４は、算出した微粒子Ｐ１の移動量と、記憶部５２０に記憶されているボルツマン定数ｋ及び絶対温度Ｔと、上述の式（２）とに基づいて、微粒子Ｐ１の粒子径ｄ１を判定する。
　相関部５０５は、ゼータ電位判定部５０３が判定した微粒子のゼータ電位ζと、粒子径判定部５０４が判定した微粒子の粒子径ｄとを関連付ける。具体的には、ゼータ電位判定部５０３において第１の微粒子に対して判定した第１のゼータ電位ζ１と、粒子径判定部５０４において第１の微粒子に対して判定した第１の粒子径ｄ１とを、相関部５０５において第１の微粒子に関するデータとして相互に結び付ける。この相関部５０５が関連付けした結果である粒子相関リストＬＳ２の一例を、図１３に示す。
　図１３は、本実施形態の記憶部５２０が記憶する粒子相関リストＬＳ２の一例を示す図である。この粒子相関リストＬＳ２において、識別部５０２によって付与された粒子番号毎に、粒子径ｄと、ゼータ電位ζとが関連付けられている。相関部５０５は、微粒子Ｐ１について、微粒子Ｐ１の粒子径ｄ１と、微粒子Ｐ１のゼータ電位ζ１とを関連付けて、粒子相関情報ＰＣ１（ｄ１、ζ１）として、粒子相関リストＬＳ２に記憶させる。また、相関部５０５は、微粒子Ｐ２について、微粒子Ｐ２の粒子径ｄ２と、微粒子Ｐ２のゼータ電位ζ２とを関連付けて、粒子相関情報ＰＣ２（ｄ２、ζ２）として、粒子相関リストＬＳ２に記憶させる。
　このように、本実施形態によれば、媒質中に存在する微粒子の状態の相関を判定することができる。
　状態判定部５０６は、相関部５０５が生成した粒子相関リストＬＳ２に基づいて、微粒子の状態を判定する。記憶部５２０には、粒子径ｄの基準範囲と、ゼータ電位ζの基準範囲とをそれぞれ示す基準範囲情報が記憶されている。ここでは、状態判定部５０６による状態判定の一例として、エクソソーム以外の粒子が含まれる試料において、識別部５０２が識別した微粒子を、エクソソームであるか否かを判定する場合について説明する。
　エクソソームの特徴として、粒径が直径３０～２００ｎｍ程度の微粒子であること、そしてまた、構成因子としてシャペロン分子であるＨｓｃ７０、Ｈｓｃ９０やテトラスパニン（ＣＤ９，　ＣＤ６３，　ＣＤ８１）が特異的に存在していることが挙げられる。
　この場合、記憶部５２０には、粒子径のしきい値Ｔｈｄが、基準範囲情報として記憶されている。また、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζが、基準範囲情報として記憶されている。これらの場合、記憶部５２０を基準記憶部と言い換えてもよい。このしきい値Ｔｈｄ、及びしきい値Ｔｈζの一例を図１４に示す。
　図１４は、本実施形態の記憶部５２０が記憶するしきい値の一例を示す図である。ここで、一例として、エクソソームの粒子径が、直径３０～１００ｎｍ程度であり、判定対象の微粒子のうち、エクソソーム以外の微粒子の粒子径が、直径１００ｎｍを超える場合について説明する。また、ここでは、一例として、エクソソームのゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζ以下であり、エクソソーム以外の微粒子のゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζを超える場合について説明する。この一例の場合には、状態判定部５０６は、微粒子の粒子径、及び微粒子のゼータ電位ζに基づいて、微粒子の判定を行うことができる。なお、状態判定部５０６が行う微粒子の判定を、微粒子の特定と言い換えてもよい。
　具体的には、この一例の場合、記憶部５２０には、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして、１００ｎｍが記憶されている。また、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして、－６ｍＶが記憶されている。状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、粒子径ｄが、しきい値Ｔｈｄ以下である微粒子であり、かつ、ゼータ電位ζがしきい値Ｔｈζ以下である微粒子を、エクソソームであると判定する。一方、状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、粒子径ｄが、しきい値Ｔｈｄを超える微粒子や、ゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζを超える微粒子を、エクソソームでないと判定する。
　また、一例として、エクソソームの粒子径が、直径３０～１００ｎｍ程度であり、判定対象の微粒子のうち、エクソソーム以外の微粒子の粒子径が、直径２００ｎｍを超える場合がある。この場合には、一例として、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄを１５０ｎｍにすることにより、状態判定部５０６は、粒子径のみに基づいて微粒子の状態を判定することができる。
　また、直径１００～２００ｎｍの範囲には、エクソソーム以外の微粒子が含まれる場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子がエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
　また、直径が２００ｎｍよりも大きい範囲には、単一のエクソソームが含まれていない場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子が単一のエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
　また、直径が２００ｎｍよりも大きい範囲には、単一のエクソソームが複数個凝集した微粒子が含まれている場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子が単一のエクソソームであるか、凝集したエクソソームであるかを判定するための一要素として、利用することができる。
　このように、基準記憶部において記憶される基準値となるしきい値を、微粒子の状態の判定のための要因として用いることができる。
　また、状態判定部５０６は、識別部５０２が識別した微粒子がエクソソームである場合に、このエクソソームが、抗体と反応しているか否かを判定する。この一例の場合、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζが、基準範囲情報として記憶されている。上述したように、抗体－エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。この場合、記憶部５２０には、エクソソーム単独のゼータ電位と、抗体－エクソソーム複合体のゼータ電位との間のゼータ電位（例えば、－６ｍｖ）が、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして記憶されている。状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、微粒子のゼータ電位が、しきい値Ｔｈζ未満である微粒子を、抗体と反応していない単独のエクソソームであると判定する。一方、状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、微粒子のゼータ電位が、しきい値Ｔｈζ以上である微粒子を、抗体－エクソソーム複合体であると判定する。
　また、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζ（例えば－６ｍＶ）の付近には、単体のエクソソーム及び、抗体－エクソソーム複合体以外の微粒子が存在している場合がある。この場合には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζ（－６ｍＶ）は、微粒子が単体のエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
　また、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値とゼータ電位ζのしきい値とを組み合わせて、微粒子の状態を判定することもできる。具体的には、抗体－エクソソーム複合体は、単独のエクソソームと比較して、ゼータ電位が低い。このため、微粒子間に働くクーロン力は、抗体－エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、弱い。この微粒子間に働くクーロン力は、微粒子間の間隔を遠ざける斥力として作用する。つまり、抗体－エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、微粒子間に働く斥力が弱い。このため、抗体－エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、凝集しやすい傾向がある。ここで、微粒子どうしが凝集すると、凝集した複数の微粒子が１つの微粒子として振る舞うため、ブラウン運動の運動量に変化が生じる。したがって、粒子径判定部５０４は、凝集した複数の微粒子を１つの微粒子として判定することにより、凝集していない場合に比べて、粒子径ｄが大きくなる方向にシフトする。
　ここで、粒子径ｄが２００ｎｍ以下の微粒子をエクソソームであると判定する場合を一例にして説明する。粒子径判定部５０４は、抗体－エクソソーム複合体を直径が２００ｎｍを超える微粒子であると判定することがある。このため、状態判定部５０６が粒子径ｄのみによって判定した場合には、抗体－エクソソーム複合体の粒子径ｄが、エクソソームであるか否かの粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄを超えるため、抗体－エクソソーム複合体がエクソソームではないと判定される場合がある。そこで、状態判定部５０６は、粒子径ｄが２００ｎｍ以下の微粒子をエクソソームであると判定するとともに、粒子径ｄが２００ｎｍを超える微粒子であっても、ゼータ電位ζがしきい値Ｔｈζ以下である場合には、その微粒子をエクソソームであると判定する。つまり、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄとゼータ電位ζのしきい値Ｔｈζとを組み合わせて、微粒子がエクソソームであるか否かを判定する。
　また、微粒子がエクソソームであるか否かの判定には、テトラスパニン（ＣＤ９，ＣＤ８１など）のように、エクソソームに特異的に結合される抗体を利用することができる。
つまり、エクソソームに対して抗体を作用させることによるゼータ電位ζ及び粒子径ｄの、それぞれの変化に基づいて、微粒子がエクソソームであるか否かを判定することができる。
　本実施形態の粒子検出システム１は、ゼータ電位ζ及び粒子径ｄに基づく、上述のような評価条件を様々に組み合わせて、微粒子の評価を行うことができる利点を有する。
　また、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄとゼータ電位ζのしきい値Ｔｈζとを組み合わせた上で、識別部５０２によるトラッキングの結果に基づいて、微粒子の状態を判定することもできる。具体的には、状態判定部５０６は、単独のエクソソームに抗体を反応させ、さらに抗体－エクソソーム複合体どうしが凝集するまでの経過を、識別部５０２によるトラッキングの結果に基づいて追跡する。具体的には、状態判定部５０６は、各微粒子の粒子径ｄとゼータ電位ζとが、時間の経過により、図１４に示す領域ＤＭ１～領域ＤＭ４のうち、いずれの領域からいずれの領域に移動するかによって、微粒子の状態を判定する。一例として、状態判定部５０６は、領域ＤＭ３に存在する微粒子（例えば、単独のエクソソーム）が、領域ＤＭ２に移動した場合には、エクソソームが抗体と反応して、抗体－エクソソーム複合体に変化したと判定する。また、状態判定部５０６は、このエクソソームが、領域ＤＭ２から領域ＤＭ１に移動した場合には、抗体－エクソソーム複合体どうしが凝集したと判定する。
　評価部５０７は、微粒子の状態の良否を評価する。一例として、評価部５０７は、状態判定部５０６が判定した微粒子の状態に基づいて、微粒子の状態をＡランク、Ｂランク、Ｃランクにランク付けする。ここで、Ａランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれもが、基準範囲内に含まれる場合である。また、Ｂランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれか一方が基準範囲内に含まれない場合である。また、Ｃランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれもが基準範囲内に含まれない場合である。
　一例として、評価部５０７が、微粒子が単独のエクソソームであるか否かを評価する場合について説明する。この場合、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ３に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＡであると判定する。また、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ２又は領域ＤＭ４に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＢであると判定する。また、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ１に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＣであると判定する。
［制御装置の動作］
　次に、図１５を参照して、制御装置５の動作について説明する。
　図１５は、本実施形態の制御装置５の動作の一例を示す図である。ここでは、粒子検出装置１００が、所定の時間間隔によって側方散乱光の画像を撮像する場合について説明する。
　取得部５０１は、粒子検出装置１００の撮像部３２が撮像した画像を、粒子検出装置１００から１枚ずつ取得する（ステップＳ１０）。この画像には、泳動流路１５０を電気泳動する微粒子の画像が含まれている。また、この微粒子の画像には、エクソソームの画像が含まれている。
　次に、識別部５０２は、ステップＳ１０において取得された画像の中から、微粒子の画像を抽出し、微粒子毎に固有の粒子番号を付与する。つまり、識別部５０２は、微粒子をラベリングする（ステップＳ２０）。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了したか否かを判定する（ステップＳ３０）。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了していないと判定した場合（ステップＳ３０；ＮＯ）には、処理をステップＳ１０に戻し、次の画像についてラベリングを行う。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了したと判定した場合（ステップＳ３０；ＹＥＳ）には、処理をステップＳ４０に進め、識別した微粒子についてトラッキングを行う。
　次に、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎のゼータ電位ζを判定する（ステップＳ５０）。また、粒子径判定部５０４は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎の粒子径を判定する（ステップＳ６０）。なお、ステップＳ５０と、ステップＳ６０とは、順序が逆であってもよく、並列して実行されてもよい。
　次に、相関部５０５は、ゼータ電位判定部５０３が判定した微粒子のゼータ電位ζと、粒子径判定部５０４が判定した微粒子の粒子径ｄとを関連付ける（ステップＳＳ７０）。
相関部５０５は、関連付けした結果を示す粒子相関リストＬＳ２を生成し、生成した粒子相関リストＬＳ２を記憶部５２０に記憶させる。相関部５０５は、すべての微粒子について関連付けが終了していないと判定した場合（ステップＳ８０；ＮＯ）には、処理をステップＳ４０に戻す。相関部５０５は、すべての微粒子について関連付けが終了したと判定した場合(ステップＳ８０；ＹＥＳ）には、処理をステップＳ９０に進める。
　次に、状態判定部５０６及び評価部５０７は、ステップＳ７０において生成された粒子相関リストＬＳ２に基づいて、粒子の状態の判定及び評価を行う。これら、状態判定部５０６による粒子の状態の判定、及び評価部５０７による評価の具体例について、以下説明する。
［評価の例（その１）：物質の作用前後の比較］
　評価部５０７は、微粒子に対して物質を作用させる前の粒子径及びゼータ電位の分布と、作用させた後の粒子径及びゼータ電位の分布とを比較評価することができる。具体例として、微粒子がヒト繊維肉芽腫由来のエクソソームである場合に、評価部５０７は、このエクソソームに抗ＣＤ８１抗体を作用させた場合の粒子径及びゼータ電位の分布を評価する。この具体例の場合、相関部５０５は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームについて、ゼータ電位ζと、粒子径ｄとを関連付けて、粒子相関リストＬＳ２－１を生成する。次に、相関部５０５は、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームについて、ゼータ電位ζと、粒子径ｄとを関連付けて、粒子相関リストＬＳ２－２を生成する。評価部５０７は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームについての粒子相関リストＬＳ２－１と、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームについての粒子相関リストＬＳ２－２とに基づいて、図１５に示すように、粒子径及びゼータ電位の分布を出力する。
　図１６は、本実施形態の評価部５０７が出力する粒子径及びゼータ電位の分布の一例を示す図である。同図に示すように、評価部５０７は、エクソソームに対して抗ＣＤ８１抗体を作用させる前の粒子径及びゼータ電位の分布と、作用させた後の粒子径及びゼータ電位の分布とを重ねて出力する。これにより、粒子検出システム１は、微粒子に物質を作用させた場合の粒子径及びゼータ電位の分布の変化を提示することができる。
［評価の例（その２）：評価しきい値（基準範囲情報）の算出］
　これまで、粒子径及びゼータ電位の評価のしきい値は、予め定められているとして説明した。評価部５０７は、微粒子の状態に基づいて、評価のしきい値を算出する構成であってもよい。具体例として、評価部５０７が、物質を作用させる前のエクソソームの状態に基づいて、評価のしきい値を算出し、この算出したしきい値に基づいて、物質を作用させた後のエクソソームについて評価する場合について、図１７から図１９を参照して説明する。
　図１７は、本実施形態の制御装置５ａの構成の一例を示す構成図である。制御装置５ａは、制御装置５の演算部５００が備える各機能部に加え、計数部５０８と、比率算出部５０９と、変化率算出部５１０とを備える。
　計数部５０８は、基準範囲情報が示す粒子径のしきい値Ｔｈｄ及びゼータ電位のしきい値Ｔｈζによって区分される領域毎に、当該領域に含まれる細胞外小胞体の数を計数する。ここで、領域の一例には、図１４を参照して説明した、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４がある。
　比率算出部５０９は、計数部５０８が計数する細胞外小胞体の数の、領域間の比率を算出する。具体的には、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数した細胞外小胞体の数を１００％とした場合の、各領域内の細胞外小胞体の数の割合を、領域毎に算出する。
　変化率算出部５１０は、物質を作用させる前の細胞外小胞体の比率と、物質を作用させた後の細胞外小胞体の比率との変化率を、領域毎に算出する。例えば、変化率算出部５１０は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームの領域毎の比率と、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームの領域毎の比率との間の変化率を、領域毎に算出する。
　次に、制御装置５ａの動作の一例について説明する。図１８は、本実施形態の制御装置の動作の変形例を示す図である。図１９は、本実施形態のしきい値及び領域の一例を示す図である。
　粒子径判定部５０４は、抗体作用前のエクソソームについて、粒子径ｄを判定する。評価部５０７は、粒子径判定部５０４が判定した粒子径ｄの平均値を算出する（ステップＳ１１０）。この一例では、評価部５０７は、平均粒径を１２０ｎｍとして算出する。評価部５０７は、算出した平均粒径１２０ｎｍを、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして、記憶部５２０に記憶させる（ステップＳ１２０）。図１９に、評価部５０７が算出したしきい値Ｔｈｄの一例を示す。
　ゼータ電位判定部５０３は、抗体作用前のエクソソームについて、ゼータ電位ζを判定する。評価部５０７は、ゼータ電位判定部５０３が判定したゼータ電位ζの平均値を算出する（ステップＳ１３０）。この一例では、評価部５０７は、平均ゼータ電位を－（マイナス）１３ｍＶとして算出する。評価部５０７は、算出した平均ゼータ電位－１３ｍＶを、粒子径のしきい値Ｔｈζとして、記憶部５２０に記憶させる（ステップＳ１４０）。図１９に、評価部５０７が算出したしきい値Ｔｈζの一例を示す。
　ステップＳ１１０からステップＳ１４０の処理によって、記憶部５２０にしきい値が記憶される。
　次に、計数部５０８は、抗体作用前のエクソソームの各領域毎の粒子数を計数する（ステップＳ１５０）。この計数部５０８による計数結果の一例を、図２０に示す。
　図２０は、本実施形態の計数部５０８による計数結果の一例を示す表である。具体的には、計数部５０８は、抗体作用前のエクソソームについて、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４の粒子数を、２４個、２８個、１６個、１９個と計数する。
　次に、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数したエクソソームの粒子数に基づいて、領域間の粒子数の比率を算出する。具体的には、図２０に示すように、比率算出部５０９は、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４の粒子数の比率を、２８％、３１％、１９％、２２％と算出する。
　次に、計数部５０８は、抗体作用後のエクソソームの各領域毎の粒子数を計数する（ステップＳ１６０）。具体的には、計数部５０８は、抗体作用後のエクソソームについて、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４の粒子数を、１３個、０個、６個、２６個と計数する。
　次に、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数したエクソソームの粒子数に基づいて、領域間の粒子数の比率を算出する。具体的には、図２０に示すように、比率算出部５０９は、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４の粒子数の比率を、２９％、０％、１３％、５８％と算出する。
　次に、変化率算出部５１０は、ステップＳ１５０において算出された比率と、ステップＳ１６０において算出された比率との変化率を算出する（ステップＳ１７０）。具体的には、図２０に示すように、変化率算出部５１０は、領域ＤＭ１～領域ＤＭ４の変化率を、＋３．５％、－１００％、－３２％、＋１６３％と算出する。
　評価部５０７は、算出された変化率と、予め求められている変化率の傾向との比較により、微粒子の状態を評価する。
　なお、ここでは、評価部５０７は、粒子径のしきい値Ｔｈｄを、粒子径の平均値に基づいて算出し、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζを、ゼータ電位の平均値に基づいて算出したが、これに限られない。評価部５０７は、粒子径分布の最大値と最小値の間から選択される、粒子径を示す軸と平行な線分を、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして算出してもよい。また、評価部５０７は、ゼータ電位分布の最大値と最小値の間から選択される、ゼータ電位を示す軸と平行な線分を、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして算出してもよい。
［評価の例（その３）：各領域の増減の要因に基づく評価］
　評価部５０７は、抗体の作用前後における各領域の粒子数の増減について、次に示すような傾向に基づいて、微粒子の状態を評価してもよい。すなわち、領域ＤＭ１について、粒子数の増加要因には、凝集発生があり、減少要因には、抗体結合、及び凝集発生がある。また、領域ＤＭ２について、粒子数の増加要因には、凝集解消があり、減少要因には、抗体結合、及び凝集発生がある。また、領域ＤＭ３について、粒子数の増加要因には、抗体結合があり、減少要因には、凝集発生がある。また、領域ＤＭ４について、粒子数の増加要因には、抗体結合及び凝集発生があり、減少要因には、凝集解消がある。
　また、評価部５０７は、抗体結合によって予測される各領域の粒子数の増減について、次に示すような傾向に基づいて、微粒子の状態を評価してもよい。すなわち、領域ＤＭ１について、抗体作用の結果、粒子が領域ＤＭ４に移行する。この場合、想定される機構は、抗体結合である。また、領域ＤＭ２について、抗体作用の結果、粒子数が減少する。この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。また、領域ＤＭ３について、抗体作用の結果、粒子が領域ＤＭ４に移行する。この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。また、領域ＤＭ４について、抗体作用の結果、粒子数が増加する。
この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。
　この一例の場合、上述の傾向を示すしきい値が、変化率のしきい値として記憶部５２０に記憶されている。評価部５０７は、図１８から図２０に示した手順により算出した増減率と、記憶部５２０に記憶されている変化率のしきい値とを比較することにより、微粒子の状態を評価する。
［評価の例（その４）：流路毎に異なる種類の抗体を反応させることによる評価］
　また、粒子検出システム１は、複数のレーンを備えているため、レーンごとに微粒子の種類及び抗体の種類を変えることができる。具体例を図２１から図２３に示す。
　図２１は、本実施形態の複数のレーンにそれぞれ種類が異なる抗体を添加する場合の一例を示す模式図である。
　図２２は、本実施形態の疾患の判定パネルの一例を示す表である。
　図２３は、本実施形態の疾患の診断及び指導パネルの一例を示す表である。
　これら図２１から図２３に示すように、評価部５０７は、レーンごとに異なる抗体を添加し、それぞれのレーンにおける微粒子の状態を評価することもできる。すなわち、粒子検出システム１によれば、目的の疾患の診断に最適な抗体の組合せを任意に選択して検査することができる。また、粒子検出システム１によれば、複数レーンを同時に評価することができるため、単一のレーンによって評価する場合に比べて、評価時間を短縮することができる。
［評価の例（その５）：機能改変したエクソソームの物性評価］
　評価部５０７は、微粒子の物性評価を行うこともできる。具体例として、評価部５０７が、機能を改変したエクソソームの物性評価を行う場合について、図２４から図２６を参照して説明する。
　図２４は、本実施形態のゲート領域Ｇの一例を示す図である。ここで、ゲート領域Ｇとは、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１及び上限しきい値Ｔｈｄ２と、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１及び上限しきい値Ｔｈζ２とに囲まれた領域をいう。本実施形態の評価部５０７は、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１と、粒子径ｄの上限しきい値Ｔｈｄ２との間を、粒子径ｄのゲート領域Ｇｄとして、粒子の物性を評価する。また、評価部５０７は、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１と、ゼータ電位ζの上限しきい値Ｔｈζ２との間を、ゼータ電位ζのゲート領域Ｇζとして、粒子の物性を評価する。以下、これらの各しきい値は、記憶部５２０に予め記憶されているとして説明するが、これに限られない。これらの各しきい値は、演算部５００が演算によって算出してもよいし、制御装置５の外部から供給されてもよい。
　次に、図２５を参照して、演算部５００による微粒子の物性評価の動作の一例を説明する。
　図２５は、本実施形態の演算部５００による微粒子の物性評価の動作の一例を示す図である。
　評価部５０７は、記憶部５２０から、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１及び上限しきい値Ｔｈｄ２と、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１及び上限しきい値Ｔｈζ２とを読み出す（ステップＳ２１０）。
　評価部５０７は、ステップＳ２１０において読み出した各しきい値に基づいて、ゲート領域を示す情報を、ディスプレイ（不図示）に表示する（図２４のゲート領域Ｇを参照）（ステップＳ２２０）。
　次に、ゼータ電位判定部５０３は、評価対象の微粒子のゼータ電位ζを判定する。また、粒子径判定部５０４は、評価対象の微粒子の粒子径ｄを判定する（ステップＳ２３０）。この具体例において、評価対象の微粒子とは、機能改変されたエクソソームである。
　次に、相関部５０５は、ステップＳ２３０において判定されたゼータ電位ζと、粒子径ｄとを、微粒子毎に関連付けする（ステップＳ２４０）。また、相関部５０５は、関連付けしたゼータ電位ζと、粒子径ｄとを、微粒子毎にディスプレイ（不図示）に表示する。
　計数部５０８は、ゲート領域Ｇ内に存在する微粒子の粒子数を計数する（ステップＳ２５０）。また、計数部５０８は、ゲート領域Ｇ外に存在する微粒子の粒子数を計数する（ステップＳ２６０）。
　比率算出部５０９は、計数部５０８が計数した粒子数に基づいて、ゲート領域Ｇ内の粒子数と、ゲート領域Ｇ外の粒子数との比率を算出して（ステップＳ２７０）、処理を終了する。
　次に、評価部５０７による評価の一例について、図２６を参照して説明する。
　図２６は、本実施形態の評価部５０７による評価の一例を示す図である。同図に示すように、評価部５０７は、ゲート領域Ｇ内に存在する粒子が比較的多い場合に、適合と判定し、ゲート領域Ｇ内に存在する粒子が比較的少ない場合に、不適合と判定する。つまり、評価部５０７は、ゲート領域Ｇ内の粒子数と、ゲート領域Ｇ外の粒子数に基づいて、評価対象の微粒子の適合性を判定する。
　ここで、エクソソームを疾病の治療目的に応じて、その機能を改変する技術が知られている。例えば、エクソソームをドラッグデリバリシステムにおける薬剤のキャリアとして利用することができる。一例として、遺伝子工学的手法を用いて、ウイルスベクターを用いて任意のタンパク質遺伝子を細胞に導入し、その細胞からエクソソームを回収する。このことによってｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどのデリバリーキャリアとしてエクソソームを利用することが可能である。また、例えばエクソソームに特異的結合物質を結合させた機能改変エクソソームを作製し、使用することも可能である。
　上述の評価部５０７によれば、機能改変したエクソソームが、上述のドラッグデリバリシステムに適合するものであるか否かについて、評価することができる。
［まとめ］
　以上説明したように、本実施形態に係る粒子検出システム１は、微粒子の粒子径と、ゼータ電位とを、微粒子毎に求めるとともに、求めた粒子径とゼータ電位とを相関づける。
これにより、粒子検出システム１によれば、粒子径又はゼータ電位のいずれか一方だけでは判定が困難であった微粒子の状態を判定することができる。
　また、本実施形態に係る粒子検出システム１は、照明光をレーン２の側面から入射させることにより、微粒子から生ずる散乱光を精度よく検出することができる。これにより、粒子検出システム１によれば、微粒子の粒子径やゼータ電位を精度よく判定することができる。したがって、粒子検出システム１によれば、微粒子の状態を精度よく判定することができる。
　なお、上記実施形態では、電界による力を付与して粒子に流路１３内を移動させる構成を例示したが、これに限定されるものではなく、媒質に流速を付与することにより、粒子を所定方向に移動させる構成、または粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。
　なお、上記実施形態では、粒子から－Ｚ側に向けて発生する散乱光を検出する構成としたが、これに限られず、例えば、＋ｙ側または－ｙ側または＋ｚ側に向けて散乱する散乱光を検出する構成であってもよい。検出部は流路の底面側に限られず、流路の側面側でもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の底面側から側方散乱光を検出してもよいし、流路の上面側から側方散乱光を検出してもよい。また、前方散乱光を検出する構成であってもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の照明光出射側から後方散乱光を検出してもよく、流路の照明光出射側から前方散乱光を検出してもよい。
　なお、上記実施形態では、長さ方向（ｙ方向）に配列された複数のレーン２を備えた流体デバイスＣを例示したが、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
　なお、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が最小サイズとなる位置を調整するには、例えば、第２調整部として、焦点距離が異なる複数の調整部ＣＬ（レンズ）をターレット板に設け、ターレット板を回転させて所望の焦点距離を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採ることができる。また、有効径の異なる調整部ＣＬを複数用い、所望の有効径を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や可変ＮＡ絞りを用いて集光レンズの有効径を可変としてもよい。さらに、倍率の異なるエキスパンダレンズ２２を複数用い、所望の有効径を有するエキスパンダレンズ２２照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採って、倍率を可変としてもよい。
　なお、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行である構成を例示したが、これに限定されるものではなく、上述した直交面と交差する範囲であれば、例えば、ｘ軸に対して±１０度、または±５度で傾いてもよい。照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行で側面１６ａと直交して入射した場合には、原理的にはレイリー散乱光の散乱角依存性が最も弱くなるが、上述したように、測定対象の粒子よりも大きい粒子からのミー散乱光をカットした場合にはノイズが低減され、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸に対して傾いていた方がレイリー散乱光の信号強度が高くなる可能性がある。
　なお、上記実施形態では、粒子としてエクソソームを用いる構成を例示したが、本装置および本システムは、エクソソーム以外にも適用できることは言うまでもない。例えば、本装置および本システムは、エクソソーム（細胞外小胞体）のような自己細胞由来粒子、細菌・ウィルスのような外来粒子、に代表される有機物粒子のみならず、金属・シリカのような無機物粒子まで適用範囲を広げることが可能である。
　なお、上記実施形態では、粒子検出システム１が、微粒子の状態の判定と、微粒子の種類の特定を行う場合について例示した。ここで、粒子検出システム１が判定する微粒子の状態には、微粒子どうしの凝集や、微粒子と抗体との結合状態等が含まれる。また、粒子検出システム１が特定する微粒子の種類には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体、細胞、高分子ミセル等が含まれる。
　粒子検出装置１００は、粒子から生じる側方散乱光を検出しているため、前方散乱光を受光した場合と比較してノイズの少ない画像情報が得られる。また、例えば、照明光Ｌ１が側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されずに、照明光Ｌ１の一部Ｋが底板１１を介して流路１３の内部に入射した場合には、側面１６ｂまたは底面１６ｃで散乱光が発生する可能性がある。側面１６ｂまたは底面１６ｃで発生した散乱光の信号強度は、観察対象の粒子で発生した散乱光の信号強度よりも数桁以上大きく、撮像部３２のダイナミックレンジを超えてしまう。粒子を観察する状態においては、側面１６ｂまたは底面１６ｃ（以下、壁面と称する）で発生した散乱光は撮像部３２を飽和させる可能性がある。そして、この散乱光がｚ方向について広範囲から発生する場合、デフォーカスによる拡がりの発生のため、撮像部３２上において散乱光が流路内の観察領域を大きく浸食することになる。本実施形態では、側面１６ａの位置において照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定され、且つ、端面１７の位置において照明光Ｌ１の通過領域が端面１７内に限定されるように照明光Ｌ１を収束させているため、信号強度の大きい散乱光の発生を抑制することができる。そのため、粒子検出装置１００は、流路１３内の粒子に関する情報を高精度で検出することができる。
　また、検出部３０の焦点深度ＤＯＦの外側の粒子からの散乱光は、デフォーカスのためにバックグラウンド光となり、粒子状に検出することができない。本実施形態では、流路１３の内部でｚ方向の幅が最小となり、流路１３内の観察領域外におけるアックグラウンド光を抑えているため、照明光Ｌ１で照明された粒子を高精度に検出することが可能になる。また、本実施形態では、端面１７が鏡面加工されているため、端面１７で散乱光がノイズとなり粒子検出精度に悪影響が及ぶことを抑制できる。また、本実施形態では、照明光Ｌ１が端面１７に直交して入射しているため、光軸調整が容易になる。さらに、本実施形態では、底板１１の端面１９がリザーバ部材１０の端面１７よりも照明光Ｌ１の入射側とが逆側に離間しているため、照明光Ｌ１の一部が端面１７に入射する前に端面１９に入射することを回避できる。
　なお、上述した実施形態における粒子検出装置１００において、電気泳動によって微粒子を所定方向に移動させる場合について説明したが、これに限られない。例えば、粒子検出装置１００は、媒質に流速を与えることによって、微粒子を所定方向に移動させてもよい。また、粒子検出装置１００は、微粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。
　また、上述した実施形態において、粒子検出装置１００と制御装置５とが別体である場合について説明したが、これに限られない。粒子検出システム１において、粒子検出装置１００と制御装置５とが、一体の装置であってもよい。例えば、粒子検出システム１において、制御装置５が粒子検出装置１００に組み込まれるコンピュータとして構成されていてもよい。このように構成することにより、粒子検出システム１は、別体構成の場合に比較して、装置の大きさや設置面積を低減することができる。
　なお、上述した実施形態における粒子検出装置１００の一部をコンピュータで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、粒子検出装置１００に内蔵されたコンピュータシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。また、上述した実施形態における粒子検出装置１００の各機能ブロックの一部、または全部を、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等の集積回路として実現してもよい。粒子検出装置１００の各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、または全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、または汎用プロセッサで実現してもよい。
また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、当該技術による集積回路を用いてもよい。
　以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
　１…粒子検出システム、５…制御装置、１００…粒子検出装置、５０１…取得部、５０２…識別部、５０３…ゼータ電位判定部、５０４…粒子径判定部、５０５…相関部、５０６…状態判定部、５０７…評価部

Claims (21)

  1. 　微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、
    　前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、
    　前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、
    　前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、
    　を備える微粒子検出システム。
  2. 　前記流路に照明光を照射する照射部と、
    　前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、
    　前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、
    　を更に備え、
    　前記粒子径判定部と前記ゼータ電位判定部は、それぞれ、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記粒子径と前記ゼータ電位とを判定する、請求項１に記載の微粒子検出システム。
  3. 　前記粒子径の基準範囲と、前記ゼータ電位の基準範囲とをそれぞれ示す基準範囲情報を記憶する基準記憶部
    　を更に備える請求項１又は請求項２に記載の微粒子検出システム。
  4. 　前記相関部が前記微粒子毎に前記粒子径と前記ゼータ電位とを関連付けて得た相関情報と、前記基準記憶部が記憶する前記基準範囲情報とに基づいて、前記微粒子の状態を判定する状態判定部
    　を更に備える請求項３に記載の微粒子検出システム。
  5. 　前記状態判定部は、
    　前記相関情報が、前記基準範囲情報が示す基準範囲に含まれるか否かに基づいて、前記相関情報に対応する前記微粒子の種類を特定する
    　請求項４に記載の微粒子検出システム。
  6. 　前記微粒子は、表面の生体分子と別の物質が結合した複合体を含み、
    　前記状態判定部は、
    　前記相関情報と前記基準範囲情報とに基づいて、前記複合体の種類を特定する
    　請求項４又は請求項５に記載の微粒子検出システム。
  7. 　前記状態判定部の判定に基づいて前記微粒子の状態の分布を評価する評価部
    　を更に備える請求項４から請求項６のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  8. 　前記基準範囲情報は、前記状態判定部の判定に基づいて前記微粒子の状態の前記分布毎に予め記憶される
    　請求項４から請求項７のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  9. 　前記基準範囲情報は、表面の生体分子に物質が結合していない複数の前記微粒子の前記粒子径及び前記ゼータ電位の分布に基づいて定められる
    　請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  10. 　前記基準範囲情報が示す前記粒子径のしきい値及び前記ゼータ電位のしきい値によって区分される領域毎に、当該領域に含まれる前記微粒子の数を計数する計数部
    　を更に備える請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  11. 　前記計数部が計数する前記微粒子の数の、前記領域間の比率を算出する比率算出部と、
    　ある物質と反応させる前の前記微粒子について、前記比率算出部が算出する前記領域間の前記微粒子の数の比率と、前記物質と反応させた後の前記微粒子について、前記比率算出部が算出する前記領域間の前記微粒子の数の比率との変化率を算出する変化率算出部と
    　を更に備える請求項１０に記載の微粒子検出システム。
  12. 　前記粒子径判定部は、
    　前記識別部が識別した前記微粒子のブラウン運動に基づいて前記粒子径を判定する
    　請求項２から請求項１１のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  13. 　前記ゼータ電位判定部は、
    　前記識別部が識別した前記微粒子の移動速度に基づいて前記ゼータ電位を判定する
    　請求項２から請求項１２のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  14. 　前記照射部は、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射し、
    　前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部
    　を更に備える請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  15. 　前記微粒子は、細胞、細胞外小胞体、合成高分子若しくは金属を基材とする微粒子、磁性微粒子、及び、高分子ミセル構造を有する微粒子からなる群より選択される、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  16. 　前記細胞外小胞体は、別の物質が結合していない又は結合しているエクソソームである
    　請求項１５に記載の微粒子検出システム。
  17. 　前記識別部は、識別した前記微粒子毎に、固有の微粒子識別子を付与し、
    　前記相関部は、前記粒子径判定部が粒子径を判定する前記微粒子に対して付与された前記微粒子識別子と、前記ゼータ電位判定部がゼータ電位を判定する前記微粒子に対して付与された前記微粒子識別子との一致に基づいて、前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする
    　請求項２から請求項１４のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
  18. 　微粒子を含む試料を移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部を備えるコンピュータに、
    　前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定ステップと、
    　前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定ステップと、
    　前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関ステップと、
    　を実行させるための微粒子検出プログラム。
  19. 　前記流路に照明光を照射する照射ステップと、
    　前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像ステップと、
    　前記撮像ステップにおいて撮像された画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別ステップと、
    　を更に実行させ、
    　前記粒子径判定ステップと前記ゼータ電位判定ステップは、それぞれ、前記識別ステップで識別された前記微粒子毎に、前記粒子径と前記ゼータ電位とを判定する、請求項１８に記載の微粒子検出プログラム。
  20. 　前記照射ステップは、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射し、
    　前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を調整する、
    　請求項１９に記載の微粒子検出プログラム。
  21. 　微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、
    　前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射する照射部と、
    　前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部と、
    　前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、
    　前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、
    　前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、
    　前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、
    　前記粒子径判定部が判定した前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、
    　を備える微粒子検出システム。
PCT/JP2016/062591 2015-04-21 2016-04-21 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム WO2016171198A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017514177A JP6781989B2 (ja) 2015-04-21 2016-04-21 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
US15/786,450 US10295454B2 (en) 2015-04-21 2017-10-17 Microparticle detection system and microparticle detection program

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-087021 2015-04-21
JP2015087021 2015-04-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/786,450 Continuation US10295454B2 (en) 2015-04-21 2017-10-17 Microparticle detection system and microparticle detection program

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016171198A1 true WO2016171198A1 (ja) 2016-10-27

Family

ID=57143119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/062591 WO2016171198A1 (ja) 2015-04-21 2016-04-21 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10295454B2 (ja)
JP (1) JP6781989B2 (ja)
WO (1) WO2016171198A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018159264A1 (ja) * 2017-02-28 2018-09-07 国立大学法人東京大学 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
JP2020204604A (ja) * 2019-06-12 2020-12-24 株式会社堀場製作所 粒子分析装置及び粒子分析方法
WO2021187122A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23 リオン株式会社 粒子測定装置及び粒子測定方法
JP2022110137A (ja) * 2019-03-23 2022-07-28 ホリバ インスツルメンツ インコーポレイテッド コロイド中のナノ粒子のサイズを決定するための改良された方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016013236B4 (de) * 2016-11-07 2020-07-16 Particle Metrix Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Messen der Konzentration, der Größe und des Zetapotentials von Nanopartikeln in Flüssigkeiten im Streulichtmodus und im Fluoreszenzmodus
KR102565327B1 (ko) * 2016-11-07 2023-08-08 어플라이드 머티어리얼스, 인코포레이티드 반도체 챔버 부품들로부터의 나노입자들의 검출 및 분석을 위한 방법들 및 장치
GB2571477B (en) * 2016-12-06 2022-05-11 Aist Flow velocity distribution measuring method and particle size measuring method
US11665929B2 (en) * 2019-06-13 2023-05-30 Intel Corporation Micro light-emitting diode displays with improved power efficiency
US20220067953A1 (en) * 2020-09-02 2022-03-03 International Business Machines Corporation Reflection-based monoscopic depth perception

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004503779A (ja) * 2000-06-12 2004-02-05 シスメックス株式会社 免疫測定方法及び免疫測定装置
JP2006276000A (ja) * 2005-03-04 2006-10-12 Hitachi High-Technologies Corp 蛍光分子計測システム
JP2007322329A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Univ Of Tsukuba 粒子特性計測装置および粒子特性計測方法
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2832117B2 (ja) * 1991-11-29 1998-12-02 キヤノン株式会社 サンプル測定デバイス及びサンプル測定システム
JP4982697B2 (ja) * 2007-04-12 2012-07-25 興和株式会社 粒子計測装置
JP2009229103A (ja) 2008-03-19 2009-10-08 Toshiba Corp 金属コロイドの定量方法
US20120135054A1 (en) * 2009-06-29 2012-05-31 Cornell University Poly (Ester Ether Amide)s and Uses Thereof
WO2011082363A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-07 Cargill, Incorporated Membrane separation and purification of monatin
JP2011149793A (ja) * 2010-01-21 2011-08-04 Ihi Corp ゼータ電位測定装置
WO2013056113A1 (en) * 2011-10-13 2013-04-18 The Johns Hopkins University Nanocomposites of gold and polymers
WO2015099985A2 (en) * 2013-12-23 2015-07-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Cationic materials and formulations for drug delivery
WO2015108023A1 (ja) * 2014-01-17 2015-07-23 株式会社ニコン 微粒子分析装置、観察装置、微粒子分析プログラムおよび微粒子分析方法
AT515577B1 (de) * 2014-03-12 2018-06-15 Anton Paar Gmbh Gemeinsamer Strahlungspfad zum Ermitteln von Partikel-information durch Direktbildauswertung und durch Differenzbildanalyse
JPWO2016063912A1 (ja) * 2014-10-24 2017-08-03 国立大学法人 東京大学 粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム
US9561286B2 (en) * 2015-03-06 2017-02-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Sterically stabilized cationic nanocarrier, kits and method of use
EP3939571A1 (en) * 2015-05-21 2022-01-19 Ohio State Innovation Foundation Benzene-1,3,5-tricarboxamide derivatives and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004503779A (ja) * 2000-06-12 2004-02-05 シスメックス株式会社 免疫測定方法及び免疫測定装置
JP2006276000A (ja) * 2005-03-04 2006-10-12 Hitachi High-Technologies Corp 蛍光分子計測システム
JP2007322329A (ja) * 2006-06-02 2007-12-13 Univ Of Tsukuba 粒子特性計測装置および粒子特性計測方法
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018159264A1 (ja) * 2017-02-28 2018-09-07 国立大学法人東京大学 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
JP2018141760A (ja) * 2017-02-28 2018-09-13 国立大学法人 東京大学 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
EP3591391A4 (en) * 2017-02-28 2020-12-16 The University of Tokyo ELECTROPHORETIC ANALYSIS CHIP AND ELECTROPHORETIC ANALYSIS DEVICE
JP2022110137A (ja) * 2019-03-23 2022-07-28 ホリバ インスツルメンツ インコーポレイテッド コロイド中のナノ粒子のサイズを決定するための改良された方法
JP7182741B2 (ja) 2019-03-23 2022-12-02 ホリバ インスツルメンツ インコーポレイテッド コロイド中のナノ粒子のサイズを決定するための改良された方法
JP2020204604A (ja) * 2019-06-12 2020-12-24 株式会社堀場製作所 粒子分析装置及び粒子分析方法
JP7356891B2 (ja) 2019-06-12 2023-10-05 株式会社堀場製作所 粒子分析装置及び粒子分析方法
WO2021187122A1 (ja) * 2020-03-17 2021-09-23 リオン株式会社 粒子測定装置及び粒子測定方法
JP7421968B2 (ja) 2020-03-17 2024-01-25 リオン株式会社 粒子測定装置及び粒子測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10295454B2 (en) 2019-05-21
US20180100793A1 (en) 2018-04-12
JP6781989B2 (ja) 2020-11-11
JPWO2016171198A1 (ja) 2018-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016171198A1 (ja) 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
US9952215B2 (en) Exosome analysis method, exosome analysis apparatus, antibody-exosome complex, and exosome electrophoresis chip
Yoshioka et al. Ultra-sensitive liquid biopsy of circulating extracellular vesicles using ExoScreen
Akagi et al. On-chip immunoelectrophoresis of extracellular vesicles released from human breast cancer cells
Khatun et al. Elucidating diversity of exosomes: biophysical and molecular characterization methods
Undvall Anand et al. Two-step acoustophoresis separation of live tumor cells from whole blood
US20200055048A1 (en) Optofluidic device and method for detecting circulating tumour cells
JPWO2017217406A1 (ja) 液体試料検査キット用膜担体、液体試料検査キット及び液体試料検査キットの製造方法
US10113948B2 (en) Particle detection method, particle detection device and particle detection system
Kwon et al. Methods to analyze extracellular vesicles at single particle level
Kirmani et al. Negative dielectrophoresis spectroscopy for rare analyte quantification in biological samples
US8293089B1 (en) Portable dual field gradient force multichannel flow cytometer device with a dual wavelength low noise detection scheme
US20190369046A1 (en) Electrophoretic analysis chip and electrophoretic analysis apparatus
Zheng et al. Whole slide imaging of circulating tumor cells captured on a capillary microchannel device
WO2018147462A1 (ja) 粒子検出装置及び粒子検出方法
WO2015163194A1 (ja) 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
JPWO2018198470A1 (ja) 撮像対象分析用装置、流路構造、撮像用部材、撮像方法、及び撮像対象分析用システム
WO2016031980A1 (ja) 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
JP6482774B2 (ja) 生体分析用のデバイス、分析装置および分析方法
JP2010032327A (ja) 被検出物質検出方法および被検出物質検出装置ならびに深さ位置計測方法および深さ位置計測装置
Kirmani et al. Dielectrophoretic spectroscopy using a microscopic electrode array
Ohayon et al. Full‐Length Single Protein Molecules Tracking and Counting in Thin Silicon Channels
Isoda et al. Factors influencing the capillary separation of leukocytes from whole blood in a plastic-based microfluidic chip
JP5812469B2 (ja) 細胞分離チップ
Lin Rapid Label-Free Electronic Detection of Biomarker Using Miniturized Microfluidic System

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16783219

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017514177

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16783219

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1