JP2009229103A

JP2009229103A - 金属コロイドの定量方法

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Publication number: JP2009229103A
Application number: JP2008071575A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Ikeda; 成池田; Hiroshi Kubota; 宏久保田; Yuki Kudo; 由紀工藤
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2008-03-19
Filing date: 2008-03-19
Publication date: 2009-10-08
Also published as: US20090238413A1

Abstract

【課題】検体試料中に検出対象分子を担持させた金属コロイド粒子を定量する方法を提供する。
【解決手段】検出対象分子を担持させた金属コロイド粒子を定量する方法であって、基板上に金属コロイド粒子を含む溶液を展開して観察試料を作製する試料作製工程と、試料を拡大撮影して同一視野について複数の画像データを生成する画像データ生成工程と、生成した複数の画像データを比較演算することによって基板に存在する不純物に由来する信号成分を画像データから除去する除去工程と、不純物に由来する信号成分を除去した画像データから金属コロイド粒子の個数を計測する計測工程とを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体関連分子や環境影響物質などの特定微量物質を選択的かつ高感度に検出する方法に関し、さらに詳細には、このような極微量の物質を金属コロイドに選択的に結合させ、光を照射した際の金属コロイドの局在プラズモン共鳴散乱現象を利用して微量物質を検出する金属コロイドの定量方法に関する。

悪性腫瘍等人命に関わるような疾病は、発見が早ければ早いほど治療効果が高いことが知られている。このような人体に対して重篤な疾病を早期に発見するためには、その疾病に特有な物質、例えば癌マーカーを、疾病発現の初期に極微量しか放出されない段階で検知することが必要である。このような特定微量物質は、例えば血液など検体試料の中に含まれるが、疾病発現の初期においてはその量は１ｐｇ／ｍｌオーダーあるいはそれ以下と極端に少なく、またこの検体試料中には諸々の蛋白質や脂質等生体に由来する物質が混在していて検出の妨害となっている。従って、この特定微量物質を検出するためには、不純物を排除する適切な分離手段に加え、１ｐｇ／ｍｌ程度以下を選択的かつ高感度で検出できる測定方法が必要である。

（光学活性プローブによる特定微量物質の検出）
このような特定微量物質を検出するには、抗原抗体反応などを利用して、光学的に活性なプローブ材料に微量物質を選択的に結合させ、この試料に光照射を行って蛍光や吸収／反射特性、あるいは散乱光などを測定するという光学的な検出方法が有効である。従来、このような光学活性プローブとして表面プラズモンセンサや局在プラズモン共鳴センサが用いられている。局在プラズモン共鳴センサは、典型的には特許文献１に示されるように、ガラス等の基板に金属微粒子を固定して膜状に形成したものをセンサに用い、検出したい微量物質を含む検体溶液等にこのセンサを浸漬して微量物質を金属微粒子に結合させ、結合前後におけるセンサの光透過率または光反射率等を測定することによって検体溶液中における微量物質の定量を行うよう構成されている。定量したい微量物質を選択的に金属微粒子に結合させるためには、抗体など微量物質に特異的に結合する物質で金属微粒子をあらかじめ修飾しておく。
特開２０００−３５６５８７

検体試料での特定微量物質の含有量あるいは濃度が極端に低い場合、検体試料の吸光度あるいは蛍光強度といったバルク量を測定するのでは、信号の変化量およびＳＮ比が低下し、有意な測定結果を得ることが難しくなる。例えば特許文献１に示されているような、ガラス基板上に金属微粒子を膜状に固定した局在プラズモン共鳴センサの場合、特定微量物質が結合した金属微粒子の金属微粒子膜全体に対する割合が小さくなると、センサの光透過率や反射率といった金属微粒子全体が関わる計測量の変化も小さくなってしまい、検出するのは困難である。これに対して、特定微量物質と金属微粒子を反応させ、結合した金属微粒子のみを適当な手段によって分離して、この金属微粒子が分散した溶液や、この金属微粒子を吸着させた基板の透過光強度を測定する方法がある。この方法では高感度な検出が可能であるが、特定微量物質の濃度が低くなると、結合している金属微粒子の粒子径のばらつきが測定に与える影響が無視できなくなる。例えば粒子径が数十ｎｍの金コロイドの場合、Ｍｉｅ理論によれば散乱光強度は粒子径の６乗に比例することが知られており、測定される透過光強度は粒子数よりも粒子径のばらつきによって影響される。従って金属微粒子の個数が少なくなってくると透過光強度と粒子の濃度との相関は低くなってしまう。

（金属コロイドの個数カウント方法）
このように特定微量物質の含有量が小さな試料では、該物質が結合している光学活性プローブの個数を直接数え上げる方法が有効である。金属コロイドは、局在プラズモン共鳴散乱特性を利用することで、粒子径が数十ｎｍと照明光の波長よりも著しく小さいコロイド粒子であっても顕微鏡下で１個１個識別することが可能であるため、このような検出方法に適している。具体的には、例えば特定微量物質と結合させた金属コロイドの溶液を、適当な精製手段で分離した後にガラス基板上に、あるいはガラス基板を狭ギャップで張り合わせた光学セル中に展開し、これを暗視野照明の下で顕微鏡観察し、液中に分散しているコロイド粒子に対応する輝点の分布を画像として取得することによって、粒子個々を識別して個数を数えることができる。このようにして計測された金属コロイドの個数が元の検体試料中における特定微量物質の含有量をどの程度反映しているのかを考えた場合、金属コロイドの個数が少ない場合には統計誤差が無視できなくなるが、これは観察試料に対して複数の異なる位置を観測して計測個数を増やすことによって低減することができる。

ところがこの方法で特定微量物質を定量しようとする場合、顕微鏡の視野に粒子状の不純物、具体的には元々の検体試料に含まれる他の生体物質、あるいは分離精製工程の中で混入した不純物、さらにはガラス基板あるいは光学セルに固定されているガラス粉や埃等の無機または有機の汚れが認められることが多い。このような汚れは照明光を強く散乱するため測定試料の明暗コントラストを低下させたり視野中に明暗ムラを生じたりし、また観察している焦点深度の範囲に数μｍ以下の径をもつ汚れが存在すると測定された画像データでは金属コロイドと同様の輝点として現れ、識別が困難になるため、コロイド粒子の個数計測誤差が増大する。特定微量物質の量が少ないほど、つまり金属コロイドの個数が少ないほどこれらの汚れが測定に及ぼす影響は大きくなる。

これらの不純物は徹底した分離操作や機器類の洗浄、クリーンな測定環境や適切な取り扱い等によってある程度は取り除けるが、それにはコスト的にも時間的にも限度がある。測定時にこれら不純物の影響を排除するような計測方法を確立することが、簡便で高速、高感度な検出のためには重要である。

本発明は上記課題に鑑みてなされるもので、さまざまな不純物等によって観察視野中に定量したい金属コロイド以外の材料が見えていても、金属コロイドのみを高感度に検出できる、簡便で安価な金属コロイドの定量方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、検出対象分子を担持させた金属コロイド粒子を定量する方法であって、基板上に金属コロイド粒子を含む溶液を展開して観察試料を作製する試料作製工程と、試料を拡大撮影して同一視野について複数の画像データを生成する画像データ生成工程と、生成した複数の画像データを比較演算することによって基板に存在する不純物に由来する信号成分を画像データから除去する除去工程と、不純物に由来する信号成分を除去した画像データから金属コロイド粒子の個数を計測する計測工程と、からなることを特徴とする金属コロイドの定量方法を提供する。

本発明により、計測時に用いる基板等に不純物があっても、これら不純物が計測結果に与える影響を最小限に抑えることができ、検出対象分子が結合した金属コロイド粒子の個数を計測することで極微量の物質を高いＳＮ比で選択的かつ高感度に検出することができる。

以下に、第１の実施形態に係わる金属コロイドの定量方法について図面を参照しながら詳細に説明する。

第１の実施形態の説明に先立ってこの実施形態に係る金属コロイドの定量方法の原理を説明する。

ガラス製基板の上に、あるいはガラス製の光学セル中に金属コロイド溶液を展開あるいは注入した場合、例えば金コロイド粒子は負に帯電していることが知られており、室温ではコロイド粒子は基板には付着せず、液中で不規則なブラウン運動を行いながら漂っている様子が、暗視野顕微鏡によって確認できる。このような運動をしているコロイド粒子は、短い露光時間では輝点として画像データに残るが、十分長い露光時間で撮影を行うと、コロイド粒子の運動の軌跡が画像データとして得られる。このとき、コロイド粒子が動いているため、露光時間を長くしても運動の軌跡は明るくはならず、軌跡が不規則に伸びるだけである。

一方、基板に存在する不純物、例えば径数μｍ以下のガラス粉などは、暗視野顕微鏡で観察すると金属コロイドと同様に輝点に見え、サイズが十分小さいと輝点の大きさでは金属コロイドと区別がつかないことがある。だがこれらの不純物は基板に固定されているため露光時間を長くしても軌跡にはならず、画像データ上では露光時間に比例して輝度が増大するのが確認される。従って、顕微鏡の観察視野を変えずに測定条件を変えて複数の画像データを取得することによって、データ中の輝点がコロイド粒子であるのか基板に存在する不純物であるのかを識別することが可能である。

次に、図１乃至図３を参照して第１の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を説明する。
図１には、第１の実施形態に従った金属コロイド粒子定量方法を実施する定量システムの概略が示されている。これによると、撮影装置１０１が顕微鏡１０２に装着される。この顕微鏡１０２に対面して、金属コロイドを含む溶液を展開して作製される試料を観察するために、基板を加工して構成された光学セル１１０が配置される。この光学セル１１０はグラスビーズなど適当なスペーサを挟んで２枚の基板を張り合わせ、周囲を樹脂等でシールした薄型光学セルにより構成される。即ち、光学セル１１０は図２に示されるように対面して配置される一対の矩形状透明基板１１１とこれら透明基板１１１の周縁部の間に介在されるスペーサ１１２とで構成される。

透明基板１１１にはソーダガラスやホウケイ酸ガラス、石英ガラスなど可視から近赤外にかけて光学的に透明で安定性に優れた各種ガラス材料や、アクリル樹脂やポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等光学的に透明で加工性・耐薬品性に優れた樹脂材料を用いることができる。スペーサ１１２は矩形状透明基板１１１の対向する辺部にわたり設けられるシール樹脂片１１２ａと他の対応する辺部に設けられ、一端部が対応するシール樹脂片１１２ａの端部に当接され、シール樹脂片１１２ａより短いシール樹脂片１１２ｂとで構成される。シール樹脂片１１２ａと１１２ｂの端の間に形成されるスペースは金属コロイド溶液の注入口１１４として使用される。この注入口１１４を介して注入器１２０によって金属コロイド溶液が注入される。

上述光学セル１１０はガラス材料や樹脂材料からなる基板上にエッチングやレーザ加工等によって微細な流路やリザーバ等を形成したマイクロ流路チップを用いることもできる。本明細書では、「基板」という語でこのような光学セルや流路チップも意味することとし、基板上に金属コロイド溶液を展開するために光学セルや流路チップの中に溶液を注入する。光学セルのギャップまたは流路チップの流路深さは、光学的に拡大する手段の焦点深度と同程度あるいはそれ以下であることが望ましく、具体的には１００μｍ以下であることが望ましい。また、金属コロイド粒子を含む溶液を基板上に展開した試料を光学的に拡大するには光学顕微鏡を用い、より望ましくは暗視野顕微鏡を用いることができる。

金属コロイド微粒子としては粒子径が１０ｎｍから１μｍの範囲にあるものが望ましく、材質としては、金や銀など可視から近赤外の波長帯にプラズモン共鳴特性をもつ金属が望ましい。微粒子のより詳細な構造としては、これらの金属単体または複合体の微粒子、あるいは樹脂ビーズなど他の材料にこれらの金属単体または複合体をコートした構造を持つ微粒子などが利用できる。

撮影装置１０１は複数の画像データを取得するには可視から近赤外領域の波長光に感度を持つ撮影デバイスを用いることが望ましく、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージセンサを利用できる。撮影装置１０１は画像データをデジタルデータに変換するＡＤ変換器１０３を介してメモリ１０４に接続される。メモリ１０４はデジタル画像データを電子ファイルとして保存する。メモリ１０４に画像処理装置１０５が接続され、メモリ１０４からデジタル画像データを読み出し、後述するように画像データに対して比較演算処理を行う。計測装置１０６は画像処理装置１０５によって処理された画像データに基づいて金属コロイド粒子の数を計数する。

図１の定量システムを用いて実施する第１の実施形態に係る金属コロイドの定量方法を図３のフローチャートを参照して説明する。

まず、光学セル１１０の注入口１１４から検出対象分子を担持させた金属コロイドを含む溶液を注入器１２０によって注入することによってガラス基板１１１上に溶液を展開して観察試料を作製する（Ｓ１１）。照明器１４１によって暗視野照明される観測試料を顕微鏡１０２によって光学的に拡大して撮影装置１０１によって撮影し、（同一視野について）複数の画像データを生成し、ＡＤ変換器１０３によってデジタル画像データに変換する（Ｓ１２）。これら画像データをメモリ１０４に逐次記憶する（Ｓ１３）。

メモリ１０４のデジタル画像データを画像処理装置１０５によって読み出し、画像処理装置１０３において比較演算することによって透明基板１１１に存在する、例えば透明基板１１１に存在する不純物の輝点に由来する信号成分（データ成分）と金属コロイドに由来する信号成分（データ成分）とを判別する（Ｓ１４）。この場合、不純物は固定しており、金属コロイドは移動していることから輝点の動きの状態に基づいて不純物と金属コロイドとを判別できる。この判別結果に基づいて透明基板１１１に存在する不純物の輝点に由来するデータ成分を画像データから除去し（Ｓ１５）、金属コロイドを抽出する（Ｓ１６）。抽出された金属コロイドを計測する（Ｓ１７）。即ち、金属コロイドのデータ成分に基づいて金属コロイド粒子の個数を計測する。

金属コロイドデータ成分から金属コロイドの個数を計測するには、画像データに含まれ、金属コロイドに対応する輝点の個数を、所定の条件で抽出して数えることができる画像解析・処理ソフトウェアを用いればよく、例えばＩｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ（登録商標）（日本ローパー社）などを用いることができる。あるいは、処理画像データを表示器に表示し、金属コロイドに対応する輝点をカウントすることもできる。

次に、図４乃至図６を参照して第２の実施形態を説明する。本実施形態では第１の実施形態と同一部分については同一符号を使用して適宜説明を省略する。第２の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第１の実施形態の金属コロイドの定量方法を実施する定量システムに対して光学セル１１０に一対の電極１１５が設けられ、一対の電極に電圧源１３０から所定の電圧を印加した状態で複数の画像データを取得する。

この実施形態に係る一対の電極１１５は、金属コロイドを含む溶液によって腐食されないものであることが望ましく、白金などの不活性金属やＩＴＯなどの伝導性透明材料を用いることができる。一対の電極は基板上に蒸着やスパッタ法などによって形成され、光学セルの場合はセル内のコロイド溶液に接することができる位置に形成して、外部からコロイド溶液に電圧を印加できるように電極から基板またはセルの外部にリード線を設ければよく、例えば図５のように構成すればよい。即ち、一対の電極１１５は矩形状に形成され、対向するシール樹脂片１１２ａをそれぞれ貫通して対向配置され、リード線１１６によって外部へ引き出される。

一対の電極の間隔は、例えば光学顕微鏡の視野が各電極の間に入るように視野の長辺よりも大きいことが望ましい。また、一対の電極に印加する電圧は、溶液中の金属コロイド粒子が電気泳動している様子が複数の画像データに明瞭に記録され、電気泳動しない汚れ等と明確に区別できる程度の値に設定する。金属コロイド粒子を泳動させるためには電極間の溶液内に適当な電位勾配が生じることが望ましく、そのためコロイド溶液に適当な電解質を添加してもよい。その際、添加した電解質によって金属コロイドが凝集沈殿しないように電解質の種類と添加量を調節する。

図４の定量システムを用いて第２の実施形態に係る金属コロイドの定量方法を図６のフローチャートを参照して説明する。光学セル１１０へ金属コロイドを含む溶液の注入（Ｓ１１）後に一対の電極１１５に電圧源１３０によって所定の電圧を印加する（Ｓ２１）。このとき、溶液中の金属コロイド粒子が電気泳動するが顕微鏡１０２によって拡大された画像を撮影装置１０１によって複数枚撮影する（Ｓ１２）。撮影により得られる画像データを第１の実施形態と同様にＡＤ変換し、メモリ１０４に記憶し（Ｓ１３）、比較演算し（Ｓ１４）、不純物輝点データ成分を除去する（Ｓ１５）。このとき、電圧印加により溶液中を電気泳動している金属コロイド粒子と電気泳動しない汚れ等とが画像データにおいて明確に区別できるので不純物輝点データ成分を除去することができる。この後、金属コロイドを抽出し（Ｓ１６）、抽出された金属コロイドを計測する（Ｓ１７）。

第２の実施形態によると、光学セルに設けた電極に電圧を印加することによって金属コロイド粒子が電気泳動するので画像データから金属コロイド粒子と汚れとを明確に識別することができる。

次に、図７乃至図１０を参照して第３の実施形態を説明する。本実施形態では第１及び第２実施形態と同一部分については同一符号を使用して適宜説明を省略する。第３の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第１及び第２の実施形態の金属コロイドの定量方法において、更に露光時間を変更して試料を撮影して得られた画像データに基づいて金属コロイドの粒子を計測することを更に含んでいる。即ち、第３の実施形態では、図７に示されるように光学セル１１０を暗視野照明する、即ち光学セル１１０を斜め上から照明する照明器１４１に露光時間設定器１４２が接続され、第１の露光時間で溶液の所定視野を撮影して第１の画像データを取得し、第１の露光時間より長い第２の露光時間で前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影して第２の画像データを取得する。これら異なる露光時間の画像データを用いて金属コロイドの定量を行う。なお、露光時間設定器１４２は撮影装置１０１に接続され、撮影装置１０１において所定の露光時間だけシャッターを開放するように設定してもよい。

第３の実施形態に係る第１の画像データの取得における第１の露光時間は、この露光時間内で得られる第１の画像データにおいて金属コロイドが実質的に動かない程度の長さであることが望ましく、より具体的には、金属コロイドの動く距離が光学的な空間分解能以下、例えば１μｍ以下になる程度の時間に設定することが望ましい。また、本実施形態に係る第２の画像データの取得における第２の露光時間は、第１の露光時間よりも長く、この露光時間内で得られる第２の画像データにおいて金属コロイドが動いた軌跡が明確に確認できる程度の長さであることが望ましい。

図７の定量システムを用いて第３の実施形態に係る金属コロイドの定量方法を図８のフローチャートを参照して説明する。光学セル１１０へ金属コロイドを含む溶液の注入（Ｓ１１）後に露光時間設定器１４２によって第１の露光時間を設定し、この第１の露光時間だけ照明器１４１によって光学セル１１０の溶液を露光する（Ｓ３１）。このとき、顕微鏡１０２によって拡大された画像を撮影装置１０１によって撮影し（Ｓ１２）、第１の画像データを取得する。この第１の画像データを上記実施形態と同様にＡＤ変換し、メモリ１０４に記憶する（Ｓ１３）。

次に、２回目の露光か否かが判定される（Ｓ３２）。この判定はＮＯであるので、第１の露光時間より長い第２の露光時間を露光時間設定器１４２によって設定する（Ｓ３３）。この第２の露光時間だけ照明器１４１によって再び溶液を露光し（Ｓ３１）、撮影し（Ｓ１２）、第２の画像データを取得する。この第２の画像データをＡＤ変換し、メモリ１０４に記憶する（Ｓ１３）。メモリ１０４に記憶された第１の画像データと第２の画像データを比較演算する（Ｓ１４）。比較結果に基づいて不純物輝点に由来するデータ成分を除去する（Ｓ１５）。即ち、第１の画像データは金属コロイドが実質的に動かない程度の長さに設定された第１の露光時間の撮影画像に対応し、第２の画像データは金属コロイドが動いたことを確認できる長さに設定された第２の露光時間の撮影画像に対応しているので、第２の画像データにおいて金属コロイドが動いた軌跡が明確に確認できる。これにより不純物輝点に由来するデータ成分を除去することができる。この後、金属コロイドを抽出し（Ｓ１６）、抽出した金属コロイドを計測する（Ｓ１７）。

具体的には、第１の露光時間でコロイド溶液の所定視野を撮影することによって図９に示す第１の画像データ（２００）を取得する。この撮影における露光時間は、金属コロイド粒子が画像２００において輝点２０１が生成されるような程度の長さに設定する。次に、第１の露光時間より長い第２の露光時間で前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影して第２の画像データ（２００’）を取得する。画像２００’の撮影時における露光時間は、基板に存在する不純物に対応する輝点の明るさが、第１の画像２００の輝点２０２と画像２００’の輝点２０２’とで有意な差を示すように設定する。

このようにして得られた画像２００と画像２００’から不純物輝点に由来する信号を除去するには、画像２００と画像２００’とで位置変化がある設定値よりも小さい輝点を比較し、第１の画像２００に対して第２の画像２００’における輝度の増加率が所定閾値よりも大きい輝点を不純物輝点に由来するデータ成分と判定し、信号の位置情報を用いて第１の画像データから不純物輝点に由来するデータ成分を除去する。第１の画像２００から不純物輝点に由来するデータ成分を取り除く画像処理を例えばソフトウェアによって行う。この画像処理が施された画像２００に含まれる輝点の数を、所定の輝度と輝点の面積を閾値としてカウントすることによって、金属コロイド粒子の個数を計測することができる。

ここで、第２の実施形態に示したように、あらかじめ基板上に一対の電極を形成し、金属コロイド粒子を含む溶液がこの一対の電極に接するように溶液を基板上に展開した上で、この試料を光学的に拡大して複数の画像データを取得する際に、この一対の電極に所定の電圧を印加することができる。この方法を用いると、電極間の電位勾配によって例えば負に帯電した金コロイド粒子を高電位側に泳動させることができるため、第３の実施形態に示すように露光時間を変えて画像データを複数取得すると、例えば図１０に示すように画像データ２（２００”）における金属コロイド粒子の運動の軌跡は直線に近くなり、ブラウン運動によるランダムな軌跡に比べてさらに明瞭に金属コロイドと基板に存在する不純物とを識別することができる。この方法によれば、基板に固定されていない不純物であっても金属コロイドと帯電特性や質量が異なっていれば運動の軌跡の長さや向きが異なるため、金属コロイドと区別することができる。

図１１乃至図１３を参照して第４の実施形態を説明する。本実施形態では第２の実施形態と同一部分については同一符号を使用して適宜説明を省略する。第４の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第２の実施形態の金属コロイドの定量方法において、一対の電極１１５に印加する電圧を変更して第１及び第２の画像データを取得する。即ち、一対の電極１１５に第１の所定電圧を印加して溶液の所定視野を撮影して第１の画像データを取得し、一対の電極に第１の所定電圧よりも絶対値の大きい第２の所定電圧を印加して、前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影する第２の画像データを取得する。即ち、第４の実施形態では、第２の実施形態の電圧源が可変電圧源１５０により構成される。

本実施形態に係る一対の電極の材料、形成法、形成位置は、第２の実施形態に係る一対の電極に準ずる。また本実施形態に係る第１の画像データの取得における第１の所定電圧は、所定の露光時間で得られる第１の画像データにおいて金属コロイドが実質的に動かない程度の電圧値であることが望ましい。より具体的には、金属コロイドの動く距離が光学的な空間分解能以下、例えば１μｍ以下になる程度の電圧値に設定することが望ましく、典型的には０Ｖであることが望ましい。さらに本発明に係る第２の画像データの取得における第２の所定電圧は、第１の所定電圧よりも絶対値が大きいために金属コロイドが電気泳動し、所定の露光時間で得られる第２の画像データにおいて金属コロイドが動いた軌跡が明確に確認できる程度の電圧値であることが望ましい。

図１１の定量システムを用いて実施される第４の実施形態に係る金属コロイドの定量方法を図１２のフローチャートを参照して説明する。光学セル１１０へ金属コロイドを含む溶液の注入（Ｓ１１）後に可変電圧器１５０によって設定された第１の所定電圧を一対の電極１１５に印加する（Ｓ４１）。このとき、顕微鏡１０２によって拡大された画像を撮影装置１０１によって撮影し（Ｓ１２）、第１の画像データを取得する。この第１の画像データを上記実施形態と同様にＡＤ変換し、メモリ１０４に記憶する（Ｓ１３）。

次に、２回目の撮影か否かが判定される（Ｓ４２）。この判定はＮＯであるので、第２の所定電圧を可変電圧器１５０によって設定する（Ｓ４３）。この第２の所定電圧を一対の電極に印加し（Ｓ４１）、撮影し（Ｓ１２）、第２の画像データを取得する。この第２の画像データをＡＤ変換し、メモリ１０４に記憶する（Ｓ１３）。メモリ１０４に記憶された第１の画像データと第２の画像データを比較演算する（Ｓ１４）。比較演算結果に基づいて不純物輝点に由来するデータ成分を除去する（Ｓ１５）。即ち、第１の画像データは金属コロイドが実質的に動かない程度の値に設定された第１の所定電圧の撮影画像に対応し、第２の画像データは金属コロイドが動いたことを確認できる値に設定された第２の所定電圧の撮影画像に対応しているので、第２の画像データにおいて金属コロイドが動いた軌跡が明確に確認できる。これにより不純物輝点に由来するデータ成分を除去することができる。この後、金属コロイドを抽出し（Ｓ１６）、抽出した金属コロイドを計測する（Ｓ１７）。

第５の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第４の実施形態の金属コロイドの定量方法において、試料を光学的に拡大して複数の画像データを取得するときに、第１の画像データの取得と第２の画像データの取得とで露光時間を実質的に等しくするものである。第４の実施形態において、まず一対の電極に第１の所定電圧を印加して所定の露光時間で溶液の所定視野を撮影して第１の画像データ（図１３の画像３００）を取得し、次に一対の電極に第１の所定電圧よりも絶対値の大きい第２の所定電圧を印加して、前記所定の露光時間と実質的に等しい露光時間で前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影して第２の画像データ（３００’）を取得する。このように、撮影する露光時間を両者で等しくしておけば、基板に固定されている成分は画像３００と輝点３００’とで輝度や形、位置が変化せずに写るため、第１の画像データと、第２の画像データとの差を求める演算を行い、第１及び第２の画像データの間で基板に存在する不純物に由来するデータ成分を除去することができる。

第６の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第１乃至第５のいずれかの金属コロイドの定量方法において、さらに金属コロイドを基板と同符号の帯電特性を持つように化学修飾して金属コロイド粒子が基板に付着固定されないようにする。金属コロイドを化学修飾する材料としては、一方にチオール基やスルフィド基など金属コロイド粒子表面と化学結合できる官能基Iを持ち、他方に基板の表面荷電状態と同符号の荷電状態を示す官能基IIを持つ化学修飾剤を用いればよく、例えば基板が石英ガラスなど負に帯電している場合は官能基IIとしてはカルボキシル基、水酸基、スルホン酸基などがあるが、ここに挙げた材料に限定されるものではない。

第７の実施形態に係る金属コロイドの定量方法は、第１乃至第６の実施形態のいずれかの金属コロイドの定量方法において、さらに基板を金属コロイドと同符号の帯電特性を持つように化学修飾するかあるいは撥水処理をして金属コロイド粒子が基板に付着固定されないようにすることを特徴とするものである。基板を化学修飾する材料としては、例えば基板が樹脂製で金属コロイドが負に帯電している場合は、カルボキシル基や水酸基、スルホン酸基などの官能基を持つコーティング材料を用いればよい。また、基板を撥水処理するには、フッ素系シランカップリング剤などを用いることができる。

以上に説明した定量方法によれば、金属コロイド粒子を基板上に展開しても基板に付着しない状態を保つことができ、金属コロイド粒子のブラウン運動や、電圧印加による泳動の軌跡を画像データとして得ることができ、印加電圧や露光時間を変えることによって基板に存在する不純物と溶液中を運動する金属コロイド粒子とを区別することができるため、コロイド溶液濃度が非常に小さい場合であっても個数を数えることによってコロイド粒子を定量することが可能である。この方法によれば、疾病に関わる特定微量物質を金属コロイドに選択的に結合させ、結合したコロイド粒子を分離した上で本発明に係る定量方法を用いることによって、非常に低濃度の物質であっても定量することができる。本発明に係る金属コロイドの定量方法の適用は疾病に関わる特定微量物質の検出だけに限定されるものではなく、検出したい化学物質を金属コロイドに選択的に結合させることができればよいため、金属コロイドに適切な化学修飾を施すことによって環境ホルモンの検出などさまざまな分野に適用可能である。

本発明の第１の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を実施する定量システムの概略構成を示す。図１の光学セルの斜視図である。第１の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を説明するフローチャートである。本発明の第２の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を実施する定量システムの概略構成を示す。図４の光学セルの斜視図である。第２の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を説明するフローチャートである。本発明の第３の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を実施する定量システムの概略構成を示す。第３の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を説明するフローチャートである。第３の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する際に露光時間を変えて測定した画像の模式図である。本発明の第３の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する際に電極間に電圧を印加した状態で露光時間を変えて測定した画像の模式図である。本発明の第４の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を実施する定量システムの概略構成を示す。第４の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する方法を説明するフローチャートである。本発明の第４の実施形態および第５の実施形態に係る金属コロイド粒子を定量する際に印加電圧を変えて測定した画像の模式図である。

符号の説明

１０１…撮影デバイス、１０２…顕微鏡、１０３…ＡＤ変換器、１０４…メモリ、１０５…画像処理装置、１０６…計測装置、１１０…光学セル、１１１…ガラス基板、１１２…スペーサ、１１４…注入口、１１５…電極、１２０…注入器、１３０…電圧源、１４１…照明器、１４２…露光時間設定器、１５０…可変電圧器、２００…露光時間が短い場合の画像データ、２０１…金属コロイドに相当する輝点、２０２…基板に存在する不純物に相当する輝点、２００’…露光時間が長い場合の画像データ、２０１’…金属コロイドに相当する運動の軌跡、２０２’…基板に存在する不純物に相当する輝点、２００”…露光時間が長い場合の画像データ、２０１”…金属コロイドに相当する電気泳動の軌跡、２０２”…基板に存在する不純物に相当する輝点、３００…印加電圧値が小さい場合の画像データ、３０１…金属コロイドに相当する輝点、３０２…基板に存在する不純物に相当する輝点、３００’…印加電圧値が大きい場合の画像データ、３０１’…金属コロイドに相当する電気泳動の軌跡、３０２’…基板に存在する不純物に相当する輝点

Claims

検出対象分子を担持させた金属コロイド粒子を定量する方法であって、
基板上に前記金属コロイド粒子を含む溶液を展開して観察試料を作製する試料作製工程と、
前記試料を拡大撮影して同一視野について複数の画像データを生成する画像データ生成工程と、
生成した前記複数の画像データを比較演算することによって前記基板に存在する不純物に由来する信号成分を前記画像データから除去する除去工程と、
前記不純物に由来する信号成分を除去した画像データから前記金属コロイド粒子の個数を計測する計測工程と、
からなることを特徴とする金属コロイドの定量方法。
請求項１に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記試料作製工程は、前記基板上に一対の電極を形成する工程と、前記金属コロイド粒子を含む溶液が前記一対の電極に接するように前記溶液を前記基板上に展開する工程からなり、
前記画像データ生成工程は、前記一対の電極に所定の電圧を印加した状態で前記試料を撮影して前記複数の画像データを取得することを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項１または２に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記画像データ生成工程は、第１の露光時間で前記試料の所定視野を撮影して第１の画像データを取得する工程と、
前記第１の露光時間より長い第２の露光時間で前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影して第２の画像データを取得する工程とからなることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項１に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記試料作製工程は、前記基板上に一対の電極を形成する工程と、前記金属コロイド粒子を含む溶液が前記一対の電極に接するように前記溶液を前記基板上に展開する工程からなり、
前記画像データ生成工程は、前記一対の電極に第１の所定電圧を印加して前記試料の所定視野を撮影して第１の画像データを取得する工程と、前記一対の電極に前記第１の所定電圧よりも絶対値の大きい第２の所定電圧を印加して前記所定視野と実質的に同一の視野を撮影して第２の画像データの取得する工程からなることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項３に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記除去工程は、前記第１の画像データに対して前記第２の画像データにおける輝度の増加率が所定閾値以上である信号を不純物に由来する信号成分と判定し、前記信号成分の位置情報を用いて前記第１の画像データから前記不純物に由来するデータ成分を除去する工程からなることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項４に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記画像データ生成工程では、前記第１の画像データの取得工程と前記第２の画像データの取得工程とで露光時間を実質的に等しくし、
前記除去工程は前記第１の画像データと前記第２の画像データとの差を求める演算を行い、前記第１及び第２の画像データの間で実質的に等しい信号成分を除去する工程からなることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記金属コロイドを前記基板と同符号の帯電特性を持つように化学修飾して前記金属コロイド粒子が前記基板に付着固定されないようにすることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の金属コロイドの定量方法において、
前記基板を前記金属コロイドと同符号の帯電特性を持つように化学修飾するかあるいは撥水処理をして前記金属コロイド粒子が前記基板に付着固定されないようにすることを特徴とする、金属コロイドの定量方法。