JPWO2016063912A1 - 粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム - Google Patents

粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム Download PDF

Info

Publication number
JPWO2016063912A1
JPWO2016063912A1 JP2016555254A JP2016555254A JPWO2016063912A1 JP WO2016063912 A1 JPWO2016063912 A1 JP WO2016063912A1 JP 2016555254 A JP2016555254 A JP 2016555254A JP 2016555254 A JP2016555254 A JP 2016555254A JP WO2016063912 A1 JPWO2016063912 A1 JP WO2016063912A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
illumination light
particle detection
flow path
particle
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016555254A
Other languages
English (en)
Inventor
一木　隆範
隆範 一木
久皇 鈴木
久皇 鈴木
大士 田中
大士 田中
井上　次郎
次郎 井上
太田　和哉
和哉 太田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nikon Corp
University of Tokyo NUC
Original Assignee
Nikon Corp
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nikon Corp, University of Tokyo NUC filed Critical Nikon Corp
Publication of JPWO2016063912A1 publication Critical patent/JPWO2016063912A1/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G01N15/1433—
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1484—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers microstructural devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/49—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid
    • G01N21/53—Scattering, i.e. diffuse reflection within a body or fluid within a flowing fluid, e.g. smoke
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/025—Align devices or objects to ensure defined positions relative to each other
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0654—Lenses; Optical fibres
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/168—Specific optical properties, e.g. reflective coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
    • G01N15/01—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
    • G01N2015/1027—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N2015/1493—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/061—Sources
    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Abstract

試料中の粒子を検出する粒子検出方法は、粒子が移動可能な流路を備える流体デバイスをステージ部に設置する設置工程と、流路に照明光を照射する照射工程と、照明光の照射によって、粒子から生ずる散乱光を検出する検出工程と、を含む。照射工程において、照明光は、流路の照明光入射側の第１側面の位置における照明光の光束の通過領域が第１側面内に限定されるように収束する。

Description

本発明は、粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システムに関する。
本願は、２０１４年１０月２４日に出願された日本国特許出願２０１４−２１７８０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
媒質中を移動する粒子を顕微鏡観察により撮像し、撮像した画像情報に基づいて、粒子の数や移動速度を測定する技術が知られている。例えば、特許文献１には、毛管セル内の流路の両端に設けた電極と、レーザービームを照射するレーザーと、レーザー照射によって生じた散乱光を検出する検出装置とを備える測定器が開示されている。この測定器は、電極への印加により粒子が移動する媒質中へのレーザー照射によって生じた散乱光を検出することにより、粒子の移動速度等を測定する。
特開２００２−５８８８号公報
粒子の検出限界を向上させるためには、散乱光を検出した信号に含まれるノイズを低減することが重要である。ところが、特許文献１に記載された測定器は、流路に臨む側壁に入射したレーザービームの散乱光も検出する。側壁で発生する散乱光の強度は、観察対象の粒子からの散乱光の強度よりも数桁以上大きいため、側壁で発生する散乱光がノイズとなり観察対象の粒子検出の精度低下を招く可能性がある。
本発明の一態様に従えば、試料中の粒子を検出する粒子検出方法であって、前記粒子が移動可能な流路を備える流体デバイスをステージ部に設置する設置工程と、前記流路に照明光を照射する照射工程と、前記照明光の照射によって、前記粒子から生ずる散乱光を検出する検出工程と、を含み、前記照射工程において、前記照明光は、前記流路の照明光入射側の第１側面の位置における前記照明光の光束の通過領域が前記第１側面内に限定されるように収束する粒子検出方法が提供される。
本発明の一態様に従えば、試料中の粒子を検出する粒子検出装置であって、粒子を含む試料を導入可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうるステージ部と、前記流路に照明光を照射する照射部と、前記照明光を調整する調整部と、前記照明光の照射により、前記試料中の粒子から生ずる散乱光を検出する検出部と、を備え、前記調整部は、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に集光するような収束角に前記照明光を調整する、粒子検出装置が提供される。
本発明の一態様に従えば、粒子を含む試料を導入可能な流路を備えた流体デバイスと、本発明の第２の態様の粒子検出装置と、を備える粒子検出システムが提供される。
本発明の一実施形態に係る粒子検出装置の概略的な平面図。 本発明の一実施形態に係る粒子検出装置の概略的な正面図。 本発明の一実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図。 図３のＩＩ−ＩＩ線断面図。 本発明の一実施形態に係る流体デバイスの平面図。 チップをＹＺ平面で部分的に切断した部分断面図。 図６におけるＡ−Ａ線断面図。 照射部及び調整部の概略構成を示す図。 本発明の一実施形態に係る調整部および流体デバイスの部分詳細図。 本発明の一実施形態に係る照明光の光路を模式的に示す図。
以下、本発明の粒子検出方法および粒子検出装置の実施形態を、図１〜図１０を参照して説明する。
図１は、実施形態に係る粒子検出装置１の概略的な平面図である。図２は、実施形態に係る粒子検出装置１の概略的な正面図である。
粒子検出装置１は、流体デバイスＣを検出対象として流体デバイスＣに照明光Ｌ１を照射し、流体デバイスＣからの散乱光Ｌ２を観察することにより、流体デバイスＣ内の粒子に関する情報を検出する。粒子検出装置１は、光源部ＬＳ、照射部２０、調整部ＣＬ、ステージ部ＳＴ、検出部３０および制御部ＣＯＮＴを備えている。粒子検出装置１および流体デバイスＣによって粒子検出システム１００が構成される。
以下の説明においては、ステージ部ＳＴの設置面ＳＴａと直交する直交面（不図示）と直交する方向をｘ方向（ｘ軸；第３方向）、設置面ＳＴａと平行でｘ方向と直交する方向をｙ方向（ｙ軸）、ｘ方向およびｙ方向と直交する鉛直方向をｚ方向（ｚ軸；第２方向）として適宜説明する。
まず、検出対象である流体デバイスＣについて説明する。
本実施形態における流体デバイスＣは、一例として、検体を分析する際に用いられる電気泳動分析チップである。検体としては、細胞、細胞外小胞体、微粒子、ラテックス粒子（抗体で修飾され、さらに細胞で修飾されたラテックス粒子を含む）、高分子ミセル等が挙げられる。本実施形態では、電気泳動分析チップとして、細胞外小胞体を分析するための細胞外小胞体分析チップを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）について説明する。
［エクソソーム］
エクソソーム（エキソソーム）は、直径３０〜１００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
［エクソソームの分析］
細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、そのレセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
（エクソソームの精製）
本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料からそのエクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質−エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。
（ゼータ電位の計測）
一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
Ｕ＝（ε／η）ζ …（１）
式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、εはサンプル溶液の誘電率、ηはサンプル溶液の粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷのものが挙げられる。
［細胞外小胞体分析チップの基本構造］
図３は、実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。図４は、図３のＩＩ−ＩＩ線断面図である。細胞外小胞体分析チップ１０１は、第１リザーバー１１０と、第２リザーバー１２０と、第１リザーバー１１０と第２リザーバー１２０とを接続する泳動流路１５０と、基材１６０とを備えている。泳動流路１５０は、例えば、ミリ流路やマイクロ流路である。泳動流路１５０は、一例として、幅２００μｍ、高さ４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさである。泳動流路１５０は、細胞外小胞体、あるいは、細胞外小胞体の表面に存在する分子に特異的に結合する特異的結合物質と細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体（一例として、抗体−エクソソーム複合体）を電気泳動する流路である。特異的結合物質の一例として、抗体、アプタマー、または抗体とアプタマーとの組み合わせからなる物質が挙げられる。アプタマーは例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどである。特異的結合物質が認識する分子としては、例えば抗原、膜タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質等が挙げられる。
泳動流路１５０の第一端部は、第１リザーバー１１０と接続されている。泳動流路１５０の第二端部は、第２リザーバー１２０と接続されている。また、第１リザーバー１１０及び第２リザーバー１２０は、基材１６０に設けられる。第１リザーバー１１０は、電極１３０を有している。第２リザーバー１２０は、電極１４０を有している。例えば、電極１３０は第１リザーバー１１０の底部に設けられ、電極１４０は第２リザーバー１２０の底部に設けられている。図４に示すように、電極１３０は、泳動流路１５０の端部の近傍に設けられ、電極１４０は、泳動流路１５０の端部の近傍に設けられている。また、例えば、第１リザーバー１１０は検体（例、分析対象のエクソソーム）が導入され、第２リザーバー１２０は緩衝液が導入される。なお、その緩衝液は第１リザーバー１１０に導入されてもよい。
細胞外小胞体分析チップ１０１は、細胞外小胞体のゼータ電位を計測することができる。以下に、検体又は細胞外小胞体としてエクソソームを分析する場合を例として、本細胞外小胞体分析チップを用いた、エクソソームのゼータ電位の測定方法について説明する。
まず、分析対象のエクソソームを含む試料液が、第１リザーバー１１０に導入される。
分析対象のエクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。エクソソームは例えば培養上清や血清から抽出したものであり、試料液は、例えば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）等の緩衝液にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液である。次に、エクソソームを含む試料液が泳動流路１５０に導入される。一例として、シリンジを第２リザーバー１２０に接続して試料液を吸引することにより、エクソソームを泳動流路１５０に導入することができる。次に、緩衝液を、第１リザーバー１１０及び第２リザーバー１２０に入れる。後述する液位調整手段により、第１リザーバー１１０と第２リザーバー１２０との液位（液面高）を調整して揃え、泳動流路１５０に生じる静水圧流の発生を防ぎ、ゼータ電位測定の精度を向上させることが可能となる。続いて、制御部（例、後述の制御部ＣＯＮＴ、又はコンピュータなど）によって電極１３０及び１４０の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。一例として、制御部は約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。
電気泳動中に、泳動流路１５０にレーザー光を照射し、泳動流路１５０からの出射光であるエクソソームを介した散乱光を、対物レンズ等を用いて集光し、受光センサ（例、高感度カメラ）を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体を撮影する。対物レンズの倍率は、一例として６０倍程度である。一例として、レーザーの波長は、４０５ｎｍであり、レーザーの強度は、１５０ｍＷである。
続いて、制御部は、撮影した画像をもとに、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体の電気泳動速度Ｓを算出する。そして、制御部は、電気泳動速度Ｓを電界強度で除して、電気泳動移動度Ｕを算出する。続いて、制御部は、上述したスモルコフスキーの式を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を算出する。
本実施形態における細胞外小胞体分析チップを用いることにより、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子（例えば、抗原等）を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、その抗原を有するエクソソームを検出することができる。
［流体デバイスＣの構造］
図５は、実施形態に係るステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに流体デバイスＣが設置された平面図である。図６は、実施形態に係る流体デバイスＣをｙｚ平面で部分的に切断した部分断面図である。図７は、図６におけるＡ−Ａ線断面図である。
図５に示すように、流体デバイスＣは、平面視で矩形形状に形成されている。図６に示すように、流体デバイスＣは、ｚ方向に順次積み重ねられたリザーバー部材（第１基材）１０および底板（第２基材）１１を備えている。例えば、本実施形態における流体デバイスＣは、少なくともリザーバー部材１０、底板１１で構成された、積層構造（積層体）である。
この場合、流体デバイスＣの積層構造は二層構造を有する。また、例えば、このような流体デバイスＣの積層構造は、リザーバー部材１０と、底板１１とを互いに貼りあわせて形成される。
リザーバー部材１０は、外力などによって少なくとも一方向に弾性変形可能な材料で形成される。リザーバー部材１０の材料には、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。底板１２は、照明光Ｌ１の照射によって発生した散乱光Ｌ２が透過する材料で形成されている。底板１２は、一例として、ガラス材で形成されている。
流体デバイスＣは、長さ方向（ｙ方向）に配列された複数（図５では３つ）のレーン２を備えている。各レーン２は、第１リザーバー１２Ａ、第２リザーバー１２Ｂ、流路１３および電極１８Ａ、１８Ｂを備えている。第１リザーバー１２Ａ及び第２リザーバー１２Ｂは、ｙ方向に間隔をあけて配置されている。例えば、第１リザーバー１２Ａ及び第２リザーバー１２Ｂは、流路１３の流路方向に間隔をあけて配置されている。なお、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
第１リザーバー１２Ａは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形の形状を有しｚ方向に延在する保持空間１４Ａと、保持空間１４Ａの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って径が漸次拡大する漏斗状の形状を有する導入部１５Ａとを備えている。保持空間１４Ａは、−ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ａは、流路１３と接続される。
第２リザーバー１２Ｂは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形の形状を有しｚ方向に延在する保持空間１４Ｂと、保持空間１４Ｂの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って径が漸次拡大する漏斗状の形状を有する導入部１５Ｂとを備えている。保持空間１４Ｂは、−ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ｂは、流路１３と接続される。
流路１３は、電気泳動用流路（電気泳動のための流路）である。流路１３は、流体デバイスＣの長さ方向であるｙ方向に延在する。流路１３は、底板１１と対向する側の面に保持空間１４Ａと保持空間１４Ｂとを接続するように設けられている。流路１３は、図７に示すように、リザーバー部材１０に形成された溝部１０Ａと、底板１１の表面（第２面）１１ａとで囲まれている。これにより、流路１３は、断面矩形形状に形成されている。溝部１０Ａは、ｘ方向に対向する側面（第１面）１６ａ、１６ｂと、底板１１の表面１１ａとｚ方向で対向する底面（第２面）１６ｃに囲まれて形成される。側面１６ａ、１６ｂ、底面１６ｃおよび溝部１０Ａを構成する表面１１ａは鏡面加工されている。第１面は、第１側面である側面１６ａと第２側面である側面１６ｂとを含む。側面１６ａと側面１６ｂとは、互いに向かい合っており、第１方向であるｘ方向に互いに離間している。
レーン２は、流体デバイスＣの幅方向である照明光Ｌ１の光軸方向（入射方向）について、中心よりも＋ｘ側の端面１７に近い側に偏って配置されている。レーン２は、入射する照明光Ｌ１の光軸方向である流体デバイスＣの幅方向（図５におけるｘ方向）について、中心よりも照明光Ｌ１の入射側の端面１７に近い側に偏って配置されている。端面１７は、ｙ方向に関して少なくともレーン２が設けられる範囲が鏡面加工されている。流路１３は、一例として、幅２００μｍ、高さ（溝部１０Ａの深さ）４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさに形成されている。
底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ａに臨んで電極１８Ａが設けられている。底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ｂに臨んで電極１８Ｂが設けられている。電極１８Ａ及び電極１８Ｂの素材としては、金、白金、カーボン等が挙げられる。図７に示すように、底板１１における照明光Ｌ１の入射側に位置する端面（第２端面）１９は、ｘ方向について、リザーバー部材１０の端面１７の位置よりも、照明光Ｌ１の入射側とは逆側である−ｘ側に離間している。
図１に戻り、光源部ＬＳは、粒子に対して悪影響を及ぼさない波長として、上述したように、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷでビーム径（ピーク値に対して1/e２となる径）０．８ｍｍでｚ方向を偏向方位とするレーザー光を照明光Ｌ１として発光する。なお、照明光Ｌ１は、偏光（例えば、直線偏光など）であっても、無偏光であってもよいが、本実施形態では、垂直偏光を用い、レイリー散乱の指向性が無い構成を採用する。
照明光Ｌ１は、上述した直交面と交差する方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。本実施形態では、照明光Ｌ１の光軸は、ｘ方向と平行である。本実施形態の照明光Ｌ１は、ｘ方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。
図８は、実施形態に係る照射部２０及び調整部ＣＬの概略構成を示す図である。照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸に沿って順次配置されたλ／２板２１およびエキスパンダレンズ２２を備えている。なお、図１に示される光源部ＬＳおよび照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸がｙ方向に延びているが、最終的に流体デバイスＣ（流路１３）を照射する照明光Ｌ１はｘ方向に沿った光軸を有する。このため、図８に示す照明光Ｌ１は、光軸がｘ方向に沿うものとして図示している。
光源部ＬＳが発光した照明光Ｌ１は、λ／２板２１を透過することで偏光方位がｙ方向に回転する。なお、光源部ＬＳがｙ方向を偏向方位とする照明光Ｌ１を発光する場合にはλ／２板２１は不要である。エキスパンダレンズ２２は、対向するシリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂを備える。シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂは、ｙ方向についてはパワーを有していないため、照明光Ｌ１はｙ方向の幅が一定である。照明光Ｌ１のｚ方向の幅は、シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂの光軸方向の距離に応じて拡大または縮小する。本実施形態では、エキスパンダレンズ２２は、照明光Ｌ１のｚ方向の幅を、一例として、２倍に拡大する。
調整部ＣＬは、エキスパンダレンズ２２でｚ方向の幅が拡大されて入射した照明光Ｌ１を調整する。調整部ＣＬは、光源部ＬＳと対物レンズ３１との間の光路に配置されている。また、調整部ＣＬは、λ／２板２１又はエキスパンダレンズ２２と対物レンズ３１との間の光路に配置されている。調整部ＣＬは駆動機構を備えていてもよく、調整部ＣＬが移動することで収光点を調整できてもよい。調整部ＣＬは例えばｘ方向に駆動可能である。
この場合、流路１３の位置が異なるチップを用いた場合であっても、流路１３内に収光点が位置するように調整することが可能である。また、収光点と流路１３の中心とが実質的に一致するように調整してもよく、検出部の中心部と収光点とが実質的に一致するように調整してもよい。図９は、実施形態に係る調整部ＣＬおよび流体デバイスＣの部分詳細図である。
調整部ＣＬは、一例として、シリンドリカルレンズで構成される。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する収束角度に照明光Ｌ１を調整している。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の照射領域が側面１６ａ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。また、調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の通過領域が側面１６ｂ内に限定されるように収束する収束角度に照明光Ｌ１を調整している。調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。また、調整部ＣＬは、リザーバー部材１０の端面１７の位置における照明光Ｌ１の照射領域が端面１７内に収束する収束角度に照明光Ｌ１を調整している。さらに、調整部ＣＬは、照明光Ｌ１が流路１３内の検出領域において収束点が存在するような収束角に照明光Ｌ１を調整している。
例えば、流路１３の検出領域において検出部３０の焦点深度外の照明光Ｌ１の照明光束は焦点深度内の照明光束よりも少なくなるような収束角を有する。なお、例えば、上述の直交面は、リザーバー部材１０の端面１７、流路１３の照射光入射側の側面１６ａ、又は流路１３の照射光射出側の側面１６ｂを含む。
ここで、照明光Ｌ１が光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の中央（ｘ＝０とする）でｚ方向の幅が最小幅ω０となる場合、照明光Ｌ１の流路１３内の媒質での収束角をθ、照明光Ｌ１の波長をλ、位置ｘおよび収束角θでのｚ方向のビーム幅をω（ｘ、θ）、照明光Ｌ１のビームプロファイルファクタをＭ２、最小幅ω０となるｘ方向の位置から側面１６ａまでの距離をｘＬとすると、下記の式（１）、式（２）において、式（３）を満足する必要がある。
Figure 2016063912
Figure 2016063912
Figure 2016063912
従って、調整部ＣＬとしては、少なくとも式（１）〜（３）を満足し、且つｘ＝ｘＬのときのビーム幅ω（ｘＬ、θ）が側面１６ａのｚ方向の長さよりも小さく、側面１６ａ内に収束する収束角θで照明光Ｌ１を収束させるように調整された光学特性を有する調整部ＣＬが設置される。
なお、照明光Ｌ１がガウシアン光である場合には、上記の式（１）〜（３）に含まれるビーム幅ω（ｘ、θ）は、照明光Ｌ１の強度がピーク値に対して1/e２となる幅で規定される。収束角θが式（１）〜（３）を満足する場合でも、ピーク値に対して1/e２以下となる強度の照明光Ｌ１がビーム幅ω（ｘＬ、θ）の外側で側面１６ａの位置に入射するため、収束角θを設定する際はピーク値に対して1/e２以下となる強度の照明光Ｌ１のビーム幅も考慮する。
また、検出部３０によって照明光Ｌ１の光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の全域を検出領域とするには、流路１３の全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る必要がある。照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、リザーバー部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａの光軸に対する傾きも考慮する必要がある。図１０は、実施形態に係る照明光Ｌ１がリザーバー部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａを通過する光路を模式的に示す図である。流路１３の幅全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦ（図９参照）が入るためには、下記の式（４）を満足する必要がある。
Figure 2016063912
 ここで、角度δ３は、焦点面Ｆから見た照明光軸の仰角であり、焦点面Ｆから反時計回り方向を正方向とする。一方で、界面での入射角・出射角、リザーバー部材１０の端面１７及び流路１３の側面１６ａのｙｚ平面に対する傾斜角、空気中・流体デバイスＣの材質中・流路中の照明光束の焦点面Ｆに対する仰角、および流体デバイスＣの外側の媒質・流体デバイスＣの材質・流路１３内の媒質の屈折率には以下の関係が成立している。
ｎ１ｓｉｎα１＝ｎ２ｓｉｎα２
ｎ２ｓｉｎα３＝ｎ３ｓｉｎα４
α１＋β１＝δ１
α２＋β１＝δ２
α３＋β２＝δ２
α４＋β２＝δ３
ここで、
α１：自由空間からリザーバー部材１０の端面１７への照明光Ｌ１の入射角
α２：端面１７からリザーバー部材１０内の照明光Ｌ１の出射角
α３：リザーバー部材１０内から流路１３の側面（壁面）１６ａへの照明光Ｌ１の入射角
α４：側面１６ａから流路１３内部への照明光Ｌ１の出射角
β１：端面１７の傾斜角
β２：側面１６ａの傾斜角
δ１：自由空間においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
δ２：リザーバー部材１０内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
δ３：流路１３内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
ｎ１：自由空間媒質の屈折率
ｎ２：リザーバー部材１０材質の屈折率
ｎ３：流路１３内の媒質の屈折率
であり、
入射角・出射角：端面１７および側面１６ａへの垂線からの角度
傾斜角：焦点面Ｆの垂線からの角度
仰角：焦点面Ｆからの角度
としている。また、符号は全て反時計回り方向を正とする。
上記の式から流路１３における照明光Ｌ１の仰角δ３は、以下の式（５）で表される。
Figure 2016063912
 従って、流路１３のｘ方向の幅全体に亘って、照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、以下の式（６）を満足する必要がある。
Figure 2016063912
 従って、リザーバー部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａの傾斜角、照明光Ｌ１の仰角δ３は、自由空間媒質の屈折率ｎ１、リザーバー部材１０の材質の屈折率ｎ２および流路１３内の媒質の屈折率ｎ３に応じて、式（６）を満足するように、選択・製造・調整されている必要がある。
ステージ部ＳＴは、図２に示すステージ駆動部６０の駆動によって、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向に移動する。ステージ駆動部６０の駆動は、制御部ＣＯＮＴによって制御される。図５に示すように、ステージ部ＳＴは、流体デバイスＣが設置される設置面ＳＴａを備える。設置面ＳＴａは、ｘｙ平面と平行の面である。設置面ＳＴａは、ｙ方向に間隔をあけて配置されている。設置面ＳＴａは、流路デバイスＣのレーン２が設けられていないｙ方向の両端部を−Ｚ側から支持する。流体デバイスＣは、レーン２が配される領域が検出部３０による−Ｚ側からの観察に支障を来すことなく設置面ＳＴａに支持される。また、流体デバイスＣにおけるレーン２に照射されるまでの照明光Ｌ１の光路にステージ部ＳＴが存在しないため、流体デバイスＣに入射する照明光Ｌ１の一部がステージ部ＳＴに入射して、後述する粒子検出に悪影響を及ぼすことを抑制できる。
設置面ＳＴａには、固定ピン５１が突出して設けられている。固定ピン５１は、流体デバイスＣの長辺に当接する二つの固定ピン５１ａと、流体デバイスＣの短辺に当接する一つの固定ピン５１ｂとから構成される。固定ピン５１ａは流体デバイスＣのｙ方向の両側の近傍にそれぞれ配置される。固定ピン５１ｂは、＋ｙ側に位置する短辺に当接する。その＋ｙ側に位置する固定ピン５１ａと固定ピン５１ｂとが配置された角部と対角に位置する角部には、押し付けコマ５２が設けられている。押し付けコマ５２は、ステージ部ＳＴに対して流体デバイスＣを対角方向に押し付ける。押し付けられた流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに当接することで、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ｘｙ方向に関してステージ部ＳＴに位置決めされた状態で固定される。
検出部３０は、対物レンズ３１、撮像部３２を備えている。対物レンズ３１は、ステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの−Ｚ側に配置されている。図９に示すように、対物レンズ３１は、検出軸３１ａがｘ方向について流路１３の中心を通る位置に配置される。検出軸３１ａは、照明光Ｌ１の光軸と直交する。撮像部３２は、一例として、ＥＭＣＣＤ（Electron Multiplying Charge Coupled Device）カメラを備えており、入射する光の画像を撮像する。撮像部３２は、対物レンズ３１を介して入射する側方散乱光の画像情報を取得する。
制御部ＣＯＮＴは、粒子検出装置１および粒子検出システム１００を統括的に制御する。制御部ＣＯＮＴは、ステージ駆動部６０を介してステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの移動を制御する。制御部ＣＯＮＴは、電源部（印加部）ＢＴを制御して、電極１８Ａ、１８Ｂに流路１３に沿った方向の電界を印加させる。制御部ＣＯＮＴは、検出部３０の判定部として、撮像部３２で撮像された画像情報に基づいて、流路１３内の粒子に関する情報を判定する。
上記構成の粒子検出装置１および粒子検出システム１００を用いて粒子検出する方法について説明する。
本実施形態の粒子検出方法は、設置工程、導入工程、照射工程、検出工程を含む。
設置工程は、流体デバイスＣをステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに設置する工程である。
具体的には、図５に示したように、押し付けコマ５２により流体デバイスＣを対角方向に押し付けることにより、流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに押し付けられ、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ステージ部ＳＴに位置決めされた状態で設置面ＳＴａに設置される。
導入工程は、粒子を含む試料を流体デバイスＣの保持空間１４Ａ、１４Ｂおよび流路１３に導入する工程である。試料としては、一例として、リン酸緩衝液等の緩衝液（媒質）にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液を用いることができる。
試料が流路１３に導入されたら、制御部ＣＯＮＴはステージ駆動部６０を駆動して、検出対象となるレーン２を照明光Ｌ１の光路および検出部３０の検出軸３１ａ上に位置させる。検出対象となるレーン２が検出位置に移動すると、制御部ＣＯＮＴは、電源部ＢＴを制御して電極１８Ａ及び電極１８Ｂに電界を印加させ、エクソソームを流路１３に沿って電気泳動させる力を付与する。一例として、制御部ＣＯＮＴは、約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。エクソソームの移動方向は、ｙ方向と平行である。
照射工程は、照明光Ｌ１をｘ方向と平行に流路デバイスＣの流路１３に照射する工程である。
照明光Ｌ１を照射する照射部２０および調整部ＣＬは、ｙ方向の幅が一定で、上述した式（１）〜式（６）を満足する収束角θでｚ方向に収束するシートビーム状の照明光Ｌ１を照射する。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）は、一例として、１０μｍである。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、図７および図９のｚ方向またはｚ方向と平行な方向である。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、入射面（端面１７および側面１６ａ）における照明光Ｌ１の光軸方向及び流路方向とは異なる方向であり、その光軸方向及び流路方向と直交する方向である。流路方向は、流路１３が延在する方向である。流路方向は、流路１３を流体が流れる方向である。
照射された照明光Ｌ１は、流体デバイスＣの第一端面（照明光入射側端面）１７、流路１３の側面（照明光入射側側面）１６ａ、流路１３の内部、流路１３の側面（照明光射出側側面）１６ｂ、流体デバイスＣの第二端面（照明光射出側端面）２７（図５参照）を順次通過する。照明光Ｌ１は、エクソソームの移動方向と直交する方向に照射される。
照射された照明光Ｌ１は、図９に示すように、流路１３の内部においてｚ方向の幅が最小となるように収束し、且つ、流路１３の側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。さらに、照射された照明光Ｌ１は、流路１３の照明光射出側の側面１６ｂの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。照明光Ｌ１は、側面１６ａの位置における照射領域が側面１６ａ内に集光し、側面１６ｂの位置における照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角に調整されている。また、照射された照明光Ｌ１は、流路１３における検出部３０の検出領域において収束点が存在する。
検出工程は、照明光Ｌ１のｘ方向と平行な照射によって流路１３内部の粒子から生じる散乱光を検出部３０によって観察（イメージング）し検出する。検出部３０における対物レンズ３１の検出軸３１ａが照明光Ｌ１の光軸と直交しているため、検出部３０は粒子から生じる側方散乱光を検出する。検出部３０は、ｘ方向と平行に照射された照明光Ｌ１の照射によって、ｘ方向と垂直なｚ方向に向かって散乱した光を検出する。散乱光が観察された粒子の像は撮像部３２で撮像される。制御部ＣＯＮＴは、撮像部３２で撮像された画像情報に基づいて粒子に関する情報（例えば粒径や粒子の移動速度）を判定する。
例えば、時間差をもって撮像された２つの画像からエクソソームの電気泳動移動速度が求められる。制御部ＣＯＮＴは、求めた電気泳動移動速度および電極１８Ａ、１８Ｂに印加した電界強度（流路１３内の電界強度）を用いて電気泳動移動度を算出する。さらに、制御部ＣＯＮＴは、算出した電気泳動移動度と、流路１３内の媒質の誘電率および粘性係数とを用いてエクソソームのゼータ電位を判定することができる。
本実施形態では、粒子から生じる側方散乱光を検出しているため、前方散乱光を受光した場合と比較してノイズの少ない画像情報が得られる。また、例えば、照明光Ｌ１が側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されずに、照明光Ｌ１の一部Ｋが底板１１を介して流路１３の内部に入射した場合には、側面１６ｂまたは底面１６ｃで散乱光が発生する可能性がある。側面１６ｂまたは底面１６ｃで発生した散乱光の信号強度は、観察対象の粒子で発生した散乱光の信号強度よりも数桁以上大きく、撮像部３２のダイナミックレンジを超えてしまう。粒子を観察する状態においては、側面１６ｂまたは底面１６ｃ（以下、壁面と称する）で発生した散乱光は撮像部３２を飽和させる可能性がある。そして、この散乱光がｚ方向について広範囲から発生する場合、デフォーカスによる拡がりの発生のため、撮像部３２上において散乱光が流路１３内の観察領域を大きく浸食することになる。本実施形態では、側面１６ａの位置において照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定され、且つ、端面１７の位置において照明光Ｌ１の通過領域が端面１７内に限定されるように照明光Ｌ１を収束させているため、信号強度の大きい散乱光の発生を抑制することができる。そのため、本実施形態では、流路１３内の粒子に関する情報を高精度で検出することができる。
また、検出部３０の焦点深度ＤＯＦの外側の粒子からの散乱光は、デフォーカスのためにバックグラウンド光となり、粒子状の形状として検出することができない。本実施形態では、流路１３の内部でｚ方向の幅が最小となり、流路１３内の観察領域外におけるバックグラウンド光を抑えているため、照明光Ｌ１で照明された粒子を高精度に検出することが可能になる。また、本実施形態では、端面１７が鏡面加工されているため、端面１７で散乱光がノイズとなり粒子検出精度に悪影響が及ぶことを抑制できる。また、本実施形態では、照明光Ｌ１が端面１７に直交して入射しているため、光軸調整が容易になる。さらに、本実施形態では、底板１１の端面１９がリザーバー部材１０の端面１７よりも照明光Ｌ１の入射側と逆側に離間しているため、照明光Ｌ１の一部が端面１７に入射する前に端面１９に入射することを回避できる。
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
例えば、上記実施形態では、電界による力を付与して粒子に流路１３内を移動させる構成を例示したが、これに限定されるものではなく、媒質に流速を付与することにより、粒子を所定方向に移動させる構成、または粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。
また、上記実施形態では、粒子から−Ｚ側に向けて発生する散乱光を検出する構成としたが、これに限られず、例えば、＋ｙ側または−ｙ側または＋ｚ側に向けて散乱する散乱光を検出する構成であってもよい。検出部は流路の底面側に限られず、流路の側面側でもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の底面側から側方散乱光を検出してもよいし、流路の上面側から側方散乱光を検出してもよい。また、前方散乱光を検出する構成であってもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の照明光出射側から後方散乱光を検出してもよく、流路の照明光出射側から前方散乱光を検出してもよい。
また、上記実施形態では、長さ方向（ｙ方向）に配列された複数のレーン２を備えた流体デバイスＣを例示したが、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
上記実施形態において、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が最小サイズとなる位置を調整するには、例えば、第２調整部として、焦点距離が異なる複数の調整部ＣＬ（レンズ）をターレット板に設け、ターレット板を回転させて所望の焦点距離を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採用することができる。また、有効径の異なる調整部ＣＬを複数用い、所望の有効径を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や可変ＮＡ絞りを用いて集光レンズの有効径を可変としてもよい。さらに、倍率の異なるエキスパンダレンズ２２を複数用い、所望の有効径を有するエキスパンダレンズ２２を照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採用して、倍率を可変としてもよい。
また、上記実施形態では、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行である構成を例示したが、これに限定されるものではなく、上述した直交面と交差する範囲であれば、例えば、ｘ軸に対して±１０度、または±５度で傾いてもよい。照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行で側面１６ａと直交して入射した場合には、原理的にはレーリー散乱光の散乱角依存性が最も弱くなるが、上述したように、測定対象の粒子よりも大きい粒子からのミー散乱光をカットした場合にはノイズが低減され、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸に対して傾いていた方がレーリー散乱光の信号強度が高くなる可能性がある。
また、上記実施形態では、粒子としてエクソソームを用いる構成を例示したが、本装置および本システムは、エクソソーム以外にも適用できる。例えば、本装置および本システムは、エクソソーム（細胞外小胞体）のような自己細胞由来粒子、細菌・ウィルスのような外来粒子、に代表される有機物粒子のみならず、金属・シリカのような無機物粒子まで適用範囲を広げることが可能である。
１…粒子検出装置、１０…リザーバー部材（第１基材）、１０Ａ…溝部、１１…底板（第２基材）、１１ａ…表面（第２面）、１３…流路、１６ａ、１６ｂ…側面（第１面）、１６ｃ…底面（第２面）、１７…端面、１９…第２端面、２０…照射部、３０…検出部、１００…粒子検出システム、ＢＴ…電源部（印加部）、Ｃ…流体デバイス、ＣＬ…調整部（シリンドリカルレンズ）、Ｌ１…照明光、Ｌ２…散乱光、ＳＴ…ステージ部、ＳＴａ…設置面。

Claims (31)

  1. 試料中の粒子を検出する粒子検出方法であって、
    前記粒子が移動可能な流路を備える流体デバイスをステージ部に設置する設置工程と、
    前記流路に照明光を照射する照射工程と、
    前記照明光の照射によって、前記粒子から生ずる散乱光を検出する検出工程と、
    を含み、
    前記照射工程において、前記照明光は、前記流路の照明光入射側の第１側面の位置における前記照明光の光束の通過領域が前記第１側面内に限定されるように収束する粒子検出方法。
  2. 前記照射工程において、前記照明光は前記第１側面内に集光するような収束角で照射される請求項１に記載の粒子検出方法。
  3. 前記照射工程において、前記照射光は、前記流体デバイスが設置されるステージ部の設置面に対し直交する直交面と交差する第１方向に延びる光軸に沿って照射され、前記第１方向と直交する第２方向の幅が前記流路内部において最小となるように収束する請求項１に記載の粒子検出方法。
  4. 前記照射工程において、前記照明光の収束角は、前記流路の照明光射出側の第２側面の位置における前記照明光の光束の通過領域が前記第２側面内に限定される、
    請求項１に記載の粒子検出方法。
  5. 前記流路は、前記直交面と直交する第３方向に互いに離間した一対の第１面と、前記第３方向と直交する第４方向に互いに離間した一対の第２面とに囲まれた断面矩形形状に形成されており、
    前記第１方向は、前記第３方向と平行であり、
    前記照明光は前記第１面について直交して入射する、
    請求項１または請求項４に記載の粒子検出方法。
  6. 前記流体デバイスは、前記一対の第１面と、前記一対の第２面と、を有する流路部と、
    前記第１面よりも前記照明光の入射側に位置し前記第１面と平行な端面とを備え、
    前記照射工程において、前記照明光は、前記端面に直交して入射するとともに、前記第３方向について前記端面の位置における前記照明光の通過領域が前記端面内に限定されるように収束する
    請求項５記載の粒子検出方法。
  7. 前記流体デバイスは、前記第４方向に積層され屈折率が互いに異なる材料で形成された第１基材と第２基材とを備え、
    前記第１基材は、前記一対の第１面と、前記一対の第２面のうちの一方と、を有する溝部と、前記端面とを備える
    請求項６に記載の粒子検出方法。
  8. 前記端面は、鏡面加工されている
    請求項６または請求項７に記載の粒子検出方法。
  9. 前記検出工程において、前記散乱光は側方散乱光である
    請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  10. 前記流体デバイスをステージ部に保持させて移動させる工程を含む
    請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  11. 前記照明光の前記第２方向の幅が最小となる前記第３方向の位置を調整する工程を含む
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  12. 前記散乱光の画像情報を取得することと、
    取得した前記画像情報に基づいて、前記粒子に関する情報を判定することと、を含む
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  13. 前記粒子に前記流路内を移動させる力を付与する工程を含む
    請求項１２記載の粒子検出方法。
  14. 前記媒質中に印加される電界による力を前記粒子に付与する
    請求項１３記載の粒子検出方法。
  15. 前記画像情報に基づいて前記粒子の移動速度を判定する
    請求項１３または請求項１４に記載の粒子検出方法。
  16. 前記画像情報に基づいて前記粒子の粒径を判定する
    請求項１２から請求項１５のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  17. 前記粒子は、エクソソームである
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の粒子検出方法。
  18. 試料中の粒子を検出する粒子検出装置であって、
    粒子を含む試料を導入可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうるステージ部と、
    前記流路に照明光を照射する照射部と、
    前記照明光を調整する調整部と、
    前記照明光の照射により、前記試料中の粒子から生ずる散乱光を検出する検出部と、
    を備え、
    前記調整部は、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に集光するような収束角に前記照明光を調整する、粒子検出装置。
  19. 前記照射部は、前記照明光を前記設置面と直交する直交面と交差する第１方向に延びる光軸に沿って前記流路に照射し、
    前記調整部は、前記照明光が前記第１方向と直交する第２方向の幅が前記流路内部において最小となるように収束するような収束角に前記照明光を調整する、請求項１８に記載の粒子検出装置。
  20. 前記検出部は、前記散乱光の画像情報を取得する取得部と、
    前記取得部で取得された前記画像情報に基づいて、前記粒子に関する情報を判定する判定部とを備える
    請求項１８記載の粒子検出装置。
  21. 前記流路に沿った方向の電界を印加する印加部を備える
    請求項２０に記載の粒子検出装置。
  22. 前記判定部は、前記画像情報に基づいて前記粒子の移動速度を判定する
    請求項２０または請求項２１に記載の粒子検出装置。
  23. 前記判定部は、前記画像情報に基づいて前記粒子の大きさを判定する
    請求項２０から請求項２２のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
  24. 前記照明光の前記第２方向の幅が最小となる前記直交面と直交する第３方向の位置を調整する第２調整部を備える
    請求項１８から請求項２３のいずれか一項に記載の粒子検出装置。
  25. 粒子を含む試料を導入可能な流路を備えた流体デバイスと、
    請求項１８から請求項２４のいずれか一項に記載の粒子検出装置と、
    を備える粒子検出システム。
  26. 前記流体デバイスの流路は、前記直交面と直交する第３方向に互いに離間した一対の第１面と、前記第３方向と直交する第４方向に互いに離間した一対の第２面とに囲まれた断面矩形形状に形成されており、
    前記第１方向は、前記第３方向と平行であり、
    前記照射部は、前記照明光を前記第１面について直交して入射させる
    請求項２５に記載の粒子検出システム。
  27. 前記流体デバイスは、前記一対の第１面と、前記一対の第２面と、を有する流路部と、
    前記第１面よりも前記照明光の入射側に位置し前記第１面と平行な端面とを備え、
    前記照明光は、前記端面に直交して入射するとともに、前記第３方向について前記端面の位置における照射領域が前記端面内に集光するような収束角に調整されている
    請求項２６に記載の粒子検出システム。
  28. 前記流体デバイスは、前記第４方向に積層され屈折率が互いに異なる材料で形成された第１基材と第２基材とを備え、
    前記第１基材は、前記一対の第１面と、前記一対の第２面のうちの一方と、を有する溝部と、前記端面とを備える
    請求項２７に記載の粒子検出システム。
  29. 前記端面は、鏡面加工されている
    請求項２８記載の粒子検出システム。
  30. 前記第２基材は、前記照明光の入射側に位置する第２端面が前記第３方向について前記第１基材の端面の位置よりも前記入射側とは逆側に離間する
    請求項２８または請求項２９に記載の粒子検出システム。
  31. 前記粒子は、エクソソームである
    請求項２５から３０のいずれか一項に記載の粒子検出システム。
JP2016555254A 2014-10-24 2015-10-21 粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム Pending JPWO2016063912A1 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014217807 2014-10-24
JP2014217807 2014-10-24
PCT/JP2015/079699 WO2016063912A1 (ja) 2014-10-24 2015-10-21 粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPWO2016063912A1 true JPWO2016063912A1 (ja) 2017-08-03

Family

ID=55760943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016555254A Pending JPWO2016063912A1 (ja) 2014-10-24 2015-10-21 粒子検出方法、粒子検出装置および粒子検出システム

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10113948B2 (ja)
JP (1) JPWO2016063912A1 (ja)
WO (1) WO2016063912A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10324021B2 (en) 2016-11-16 2019-06-18 Chung Yuan Christian University Magnetophorisis measuring system for determining motion status of object and quantifying amount of magnetic particles contained therein

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6781989B2 (ja) * 2015-04-21 2020-11-11 国立大学法人 東京大学 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
CN113866158B (zh) * 2021-08-30 2024-02-09 上海睿钰生物科技有限公司 一种微粒检测装置及其操作方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05240872A (ja) * 1991-11-29 1993-09-21 Canon Inc サンプル測定デバイス及びサンプル測定システム
JPH06229904A (ja) * 1993-02-01 1994-08-19 Hitachi Ltd 粒子分析方法及び粒子分析装置
JP2003279471A (ja) * 2002-03-20 2003-10-02 Nippon Sheet Glass Co Ltd マイクロ化学システム用チップ及びマイクロ化学システム
JP2006276000A (ja) * 2005-03-04 2006-10-12 Hitachi High-Technologies Corp 蛍光分子計測システム
JP2008261740A (ja) * 2007-04-12 2008-10-30 Univ Of Electro-Communications 粒子計測装置
WO2012147426A1 (ja) * 2011-04-26 2012-11-01 大塚電子株式会社 電気泳動移動度測定用セル並びにそれを用いた測定装置及び測定方法
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ
JP2014521110A (ja) * 2011-07-22 2014-08-25 モレキュラー・ビジョン・リミテッド アッセイ実行用光学デバイス

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5370842A (en) 1991-11-29 1994-12-06 Canon Kabushiki Kaisha Sample measuring device and sample measuring system
GB2361772B (en) 2000-04-29 2004-05-19 Malvern Instr Ltd Mobility and effects arising from surface charge
US20050140971A1 (en) 2002-03-20 2005-06-30 Nippon Sheet Glass Company, Limited Microchemical system chip and microchemical system
US7511808B2 (en) * 2006-04-27 2009-03-31 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Analyte stages including tunable resonant cavities and Raman signal-enhancing structures
US9063117B2 (en) * 2007-02-21 2015-06-23 Paul L. Gourley Micro-optical cavity with fluidic transport chip for bioparticle analysis
US8218132B2 (en) 2007-04-12 2012-07-10 The University Of Electro-Communications Particle measuring device and particle size measure device
GB0803257D0 (en) * 2008-02-22 2008-04-02 Univ Leeds Apparatus for inspection of a fliuid and method

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05240872A (ja) * 1991-11-29 1993-09-21 Canon Inc サンプル測定デバイス及びサンプル測定システム
JPH06229904A (ja) * 1993-02-01 1994-08-19 Hitachi Ltd 粒子分析方法及び粒子分析装置
JP2003279471A (ja) * 2002-03-20 2003-10-02 Nippon Sheet Glass Co Ltd マイクロ化学システム用チップ及びマイクロ化学システム
JP2006276000A (ja) * 2005-03-04 2006-10-12 Hitachi High-Technologies Corp 蛍光分子計測システム
JP2008261740A (ja) * 2007-04-12 2008-10-30 Univ Of Electro-Communications 粒子計測装置
WO2012147426A1 (ja) * 2011-04-26 2012-11-01 大塚電子株式会社 電気泳動移動度測定用セル並びにそれを用いた測定装置及び測定方法
JP2014521110A (ja) * 2011-07-22 2014-08-25 モレキュラー・ビジョン・リミテッド アッセイ実行用光学デバイス
WO2014030590A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人東京大学 エキソソームの分析方法、エキソソーム分析装置、抗体－エキソソーム複合体、及びエキソソーム電気泳動チップ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEINHART, C. D. ET AL.: "PIV measurements of a microchannel flow", EXPERIMENTS IN FRUIDS, vol. 27, JPN6020004475, October 1999 (1999-10-01), pages 414 - 419, ISSN: 0004434724 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10324021B2 (en) 2016-11-16 2019-06-18 Chung Yuan Christian University Magnetophorisis measuring system for determining motion status of object and quantifying amount of magnetic particles contained therein

Also Published As

Publication number Publication date
US10113948B2 (en) 2018-10-30
US20170219477A1 (en) 2017-08-03
WO2016063912A1 (ja) 2016-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6781989B2 (ja) 微粒子検出システム及び微粒子検出プログラム
US9952215B2 (en) Exosome analysis method, exosome analysis apparatus, antibody-exosome complex, and exosome electrophoresis chip
US9409172B2 (en) Microchip and channel structure for the same
US8928875B2 (en) Methods and systems for optical characterisation
Lincoln et al. Reconfigurable microfluidic integration of a dual-beam laser trap with biomedical applications
JP6337295B2 (ja) 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
WO2019196270A1 (zh) 微纳粒子检测系统及方法
US10113948B2 (en) Particle detection method, particle detection device and particle detection system
US20140370586A1 (en) Microchip and microchip-type fine-particle measuring device
WO2016009467A1 (ja) マルチチャンネル分析装置
US20240027325A1 (en) Method and apparatus for flow-based, single-particle and/or single-molecule analysis
US20210010920A1 (en) Spectroscopic analysis device, spectroscopic analysis method, program, recording medium, and microscope
WO2018159264A1 (ja) 電気泳動分析チップおよび電気泳動分析装置
WO2015163194A1 (ja) 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置
WO2018147462A1 (ja) 粒子検出装置及び粒子検出方法
JP2010223756A (ja) 凝集反応を利用した測定装置および測定方法
JPWO2018198470A1 (ja) 撮像対象分析用装置、流路構造、撮像用部材、撮像方法、及び撮像対象分析用システム
WO2016031980A1 (ja) 電気泳動デバイス、電気泳動デバイス製造方法および細胞外小胞体分離装置
JPWO2014017433A1 (ja) 光学式検体検出装置
JP6482774B2 (ja) 生体分析用のデバイス、分析装置および分析方法
CN113109297A (zh) 一种基于全内反射共振原理的小型多功能生化分析仪
JP2012233860A (ja) 生体試料中の分析対象物のアッセイ方法及びそれに用いたｐｏｃｔ装置
JP2009276119A (ja) 流路構造及びマイクロチップ
JP2015078933A (ja) イムノアッセイ方法
Isoda et al. Factors influencing the capillary separation of leukocytes from whole blood in a plastic-based microfluidic chip

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170303

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180601

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180601

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20180601

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20181026

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190723

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190919

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200212

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200407

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200611

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20201222

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20201222

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20210202