WO2016038877A1 - マイコプラズマを検出する方法 - Google Patents

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WO2016038877A1
WO2016038877A1 PCT/JP2015/004535 JP2015004535W WO2016038877A1 WO 2016038877 A1 WO2016038877 A1 WO 2016038877A1 JP 2015004535 W JP2015004535 W JP 2015004535W WO 2016038877 A1 WO2016038877 A1 WO 2016038877A1
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seq
mycoplasma
nucleotide
oligonucleotide
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PCT/JP2015/004535
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清水　則夫
高橋　秀行
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国立大学法人東京医科歯科大学
株式会社リンフォテック
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting mycoplasma. More specifically, the present invention relates to a method for detecting mycoplasma that can detect more types of mycoplasma more quickly, simply, with high sensitivity, and with high accuracy, and a forward primer and reverse for such detection.
  • the present invention relates to a primer / probe set and a kit including such a set.
  • Mycoplasma is a genus of eubacteria classified in the class of Mollicutes. In a broad sense, in addition to the genus Mycoplasma, the genus Ureaplasma, the genus Mesoplasma, and the genus Entomoplasma The genus Spiroplasma, the genus Acholeplasma, the genus Asteroleplasma, and the genus Thermoplasma are sometimes called mycoplasmas. Mycoplasma is the smallest organism capable of self-propagation, and more than 200 species are currently known. Since mycoplasma does not have the peptidoglycan cell wall found in general eubacteria, the cell shape is irregular and plastic.
  • mycoplasma since mycoplasma has a small size of about 0.2 to 0.8 ⁇ m and an irregular shape, it can pass through a filter for filter sterilization of about 0.2 ⁇ m. Therefore, even if the cell culture medium is subjected to filter sterilization, mycoplasma cannot be removed. In particular, some types of mycoplasma are known as typical causative bacteria for microbial contamination in cell culture.
  • Mycoplasma is free from the effects of antibiotics such as penicillin and cephem that are commonly used for cell culture because it has no cell wall.
  • mycoplasma grows in cell culture supernatants without causing visible changes such as increased turbidity of the culture medium or degeneration of cultured cells. Therefore, unless the mycoplasma detection method is implemented, the mycoplasma contamination is overlooked and the contamination is enlarged.
  • Mycoplasma adsorbs on cell membranes to deplete cellular nutrients, inhibits cell growth, and alters gene expression, resulting in unreliable experimental results from infected cultures. Therefore, when conducting research, it is an important premise to ensure that there is no mycoplasma contamination.
  • the mycoplasma negative test is indispensable in the production of biological drugs, regenerative medicine, and cell therapy.
  • reference information of the Japanese Pharmacopoeia includes three methods: a culture method (agar and liquid medium method), a DNA staining method using indicator cells (index cell culture method), and a two-step PCR method.
  • the culture method has a problem that the culture period is too long, 28 days, the DNA staining method has a low sensitivity, and the two-step PCR method (Nested PCR method) involves carryover contamination of the amplification product.
  • the two-step PCR method (Nested PCR method) involves carryover contamination of the amplification product.
  • any of the three test methods has been insufficient in practicality as a safety test method for regenerative medicine and cell therapy. Therefore, more practical mycoplasma detection methods are being developed.
  • Patent Document 1 discloses a primer pair for specifically amplifying a mycoplasma gene by real-time PCR, a method for detecting mycoplasma using the primer pair, and the like.
  • the mycoplasma 23S rRNA gene is used as an amplification target.
  • Non-Patent Document 1 uses a primer pair for specifically amplifying a gene such as mycoplasma by real-time PCR, a probe for detecting an amplification product by the primer pair, and the primer pair and probe.
  • a method for detecting mycoplasma and the like is disclosed. In this method, a tuf gene such as mycoplasma is used as an amplification target.
  • Patent Document 2 discloses a primer set for specifically amplifying a mycoplasma gene by a special gene amplification method called LAMP (loop-mediated isothermal amplification) method, and an amplification product by the primer set. And a method for detecting mycoplasma using the primer set and the probe are disclosed. In this method, the mycoplasma 16S rRNA gene is used as an amplification target.
  • Patent Document 3 discloses a kit including a primer for specifically amplifying a mycoplasma gene by a real-time nucleic acid amplification reaction (real-time PCR), a method for detecting mycoplasma in a cell culture medium using the primer, and the like. Is disclosed.
  • the mycoplasma rpoB gene is used as an amplification target.
  • mycoplasma detection methods are being developed, but there is a need for a more practical mycoplasma detection method that can detect more types of mycoplasma more quickly, simply, with high sensitivity, and with high accuracy. Yes.
  • Non-Patent Document 2 discloses primers used in the conventional two-step PCR method for detecting mycoplasma, but primers that use the mycoplasma 16S rRNA gene, 23S rRNA gene, and a spacer region between both genes as amplification targets. Is disclosed. However, as described above, the conventional two-step PCR has a problem that false positives are easily generated due to carry-over contamination of amplification products.
  • Patent Document 4 discloses a method for detecting a pneumoniae by specifically amplifying a gene of pneumoniae such as Mycoplasma pneumoniae by PCR or the like when diagnosing a pneumonia patient. Primers and probes complementary to the amplification products generated by the method are disclosed. In this method, the amplification target for detecting Mycoplasma pneumoniae was the DnaJ1 gene. Thus, for the purpose of diagnosing pneumonia caused by mycoplasma, there is a need for a more practical mycoplasma detection method that can detect such mycoplasma more quickly, simply, with high sensitivity, and with high accuracy.
  • the object of the present invention is to provide a mycoplasma detection method capable of detecting a greater variety of mycoplasma more quickly, simply, with high sensitivity and high accuracy, a set of forward primer, reverse primer and probe, and a kit for such detection. There is to do.
  • the inventors of the present invention have made extensive investigations and dealt with a specific sequence among a 16S rRNA gene having a sequence specific to mycoplasma, a 23S rRNA gene and a spacer region between both genes.
  • a plurality of combinations of forward primer and reverse primer to be detected and a probe for detecting an amplification product by the primer pair were designed, and multiplex real-time quantitative PCR was performed using the plurality of combinations of the primer pair and the probe.
  • the inventors have found that various mycoplasmas can be detected quickly, simply, with high sensitivity and high accuracy, and have completed the present invention.
  • the present invention (1) A set of a forward primer, a reverse primer and a probe for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR,
  • the set comprises one or more forward primers, two or more reverse primers and one or more probes
  • the probe is a probe for specifically detecting an amplification product by the forward primer and the reverse primer
  • the forward primer is selected from the group consisting of 17 to 30 contiguous nucleotide sequences of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and comprises the nucleotide sequence (caaggtatccc) of nucleotide numbers 14 to 24 of SEQ ID NO: 1.
  • the oligonucleotide And wherein the, or set, (2)
  • One or more kinds of forward primers are selected from the group consisting of 17 to 30 consecutive nucleotide sequences among the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, and nucleotide numbers 14 to The set according to (1) above, wherein the set is one or more oligonucleotides comprising a nucleotide sequence comprising 27 nucle
  • the present invention also provides: (12) A kit for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR,
  • the kit includes the forward primer, the reverse primer and the probe set according to any one of (1) to (11) above, and a solid support, and the probe is fixed on the solid support.
  • the present invention relates to a kit.
  • the present invention provides (13) A method for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR, (A) Step of extracting DNA from a test sample a: (B) Using the DNA extracted in the above step a as a template, multiplex real-time using the forward primer and the reverse primer in the set according to any one of (1) to (11) or the kit according to (12) above Performing quantitative PCR step b: and (C) By detecting the amplification product by multiplex real-time quantitative PCR in the step b above using the probe in the set according to any one of (1) to (11) or the kit according to (12) above.
  • step c for detecting whether or not mycoplasma is present in the test sample: Including methods, (14)
  • the detection of the amplification product by multiplex real-time quantitative PCR in step c is specific to the probe in the set according to any one of (1) to (11) above or the kit according to (12) above.
  • the detection limit sensitivity of one or more mycoplasmas selected from the group consisting of Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma gallisepticum and Spiroplasma citri is 10 cfu / mL or less
  • the present invention relates to a method for detecting mycoplasma as described
  • a mycoplasma detection method capable of detecting more various mycoplasmas more quickly, simply, with high sensitivity and high accuracy, a set of forward primer, reverse primer and probe, and a kit for such detection are provided. can do.
  • the upper panel is a diagram showing which position on the mycoplasma genome each forward primer and each reverse primer in the present invention corresponds to.
  • the lower panel shows what kind of mycoplasma is targeted by each set (combination) of forward primer, probe, and reverse primer. It is a figure which shows the result of having measured the detection sensitivity with respect to various mycoplasmas with this detection method (detection method of this invention) and the detection method described in the reference paper (detection method of a nonpatent literature 1).
  • detection method of this invention detection method of this invention
  • the detection method described in the reference paper detection method of a nonpatent literature 1
  • the ct value is the number of cycles when the PCR amplification product reaches a certain amount. The smaller the ct value, the more sensitive the target is detected.
  • FIG. 1 A partial comparison of the genome sequences of Mycoplasma (Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma fermentans, Spiroplasma citri) and non-mycoplasma Clostridium sporogenes is shown.
  • FIG. The genomic sequences in the vicinity of the forward primer, probe, and reverse primer in the present invention are represented by Mycoplasma microti, Mycoplasma penetrans, Mycoplasma iowae, Mycoplasma muris, Urea.
  • the forward primer, reverse primer, and probe set of the present invention include a forward primer for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR.
  • a set of reverse primers and probes wherein the set comprises one or more kinds of forward primers, two or more kinds of reverse primers, and one or more kinds of probes.
  • oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence comprising one nucleotide number 14 to 24, wherein the reverse primer is 17 to 26 of one or more nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 14, 17 to 20
  • the oligonucleotide is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide comprising a nucleotide sequence to be synthesized or a complementary nucleotide sequence thereof.
  • 17 to 30 (preferably 17 to 26, more preferably 17 to 23, still more preferably 18 to 22, of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, More preferably 19 to 21) as long as it is an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of contiguous nucleotide sequences and comprising a nucleotide sequence of nucleotide numbers 14 to 24 of SEQ ID NO: 1, Among these oligonucleotides, from the viewpoint of detecting mycoplasma with higher sensitivity or higher accuracy, among these oligonucleotides, oligonucleotides containing the nucleotide sequences of nucleotide numbers 11 to 24 of SEQ ID NO: 1, and nucleotide numbers 14 to 27 of SEQ ID NO: 1 Oligonucleotides containing nucleotide sequences Preferably de, oligonucleotide comprising a nucleotide sequence of
  • the set of the present invention may contain only one kind of forward primer, but from the viewpoint of detecting more various mycoplasmas, at least two kinds of forward primers including the following two kinds (A) and (B): It preferably includes a primer, and more preferably includes the following two forward primers (A) and (B).
  • Forward primer which is an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence: (superordinate concept of F1 forward primer)
  • the one or more forward primers included in the set of the present invention include one or more oligos selected from the following (A1) to (A6) and (B1):
  • a nucleotide forward primer is preferable, and includes a forward primer for one or more oligonucleotides selected from the following (A1) to (A6), and an oligonucleotide forward primer for the following (B1): More preferably.
  • the following oligonucleotide (a1) is preferable as the above-mentioned oligonucleotide (A1), and the following oligonucleotide (a2) is preferable as the above-mentioned oligonucleotide (A2), and the above-mentioned oligonucleotide (A3)
  • the following (a3) oligonucleotide is preferable, the above (A4) oligonucleotide is preferably the following (a4) oligonucleotide, and the above (A5) oligonucleotide is the following (a5) Oligonucleotides are preferred, the following (A6) oligonucleotides are preferred as the (A6) oligonucleotides, and the following (b1) oligonucleotides are preferred as the (B1) oligonucleotides.
  • A1 oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 10 to 28 of SEQ ID NO: 2): (F1 forward primer)
  • A2 oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 11 to 29 of SEQ ID NO: 2): (M1 forward primer)
  • A3 oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 8 to 26 of SEQ ID NO: 2): (TF forward primer)
  • A4) oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 11 to 30 of SEQ ID NO: 2): (MyTF-1 forward primer) (A5): oligonucleotide
  • F1 forward primer M1 forward primer, TF forward primer, MyTF-1 forward primer, MyTF-5 forward primer, MyTF-6 forward primer (these are collectively referred to as “F1 forward primer”).
  • F1 forward primer M1 forward primer, TF forward primer, MyTF-1 forward primer, MyTF-5 forward primer, MyTF-6 forward primer
  • the F1 forward primer, the M1 forward primer, the TF forward primer, the MyTF-1 forward primer, and the MyTF-5 forward primer are preferable, and the F1 forward primer, the MyTF-1 forward primer, and the MyTF-5 forward primer are more preferable.
  • the forward primers (A), (A1) to (A6) and (a1) to (a6) are, for example, Mycoplasma arginini, Mycoplasma buchare, Mycoplasma faucium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma oleale, Mycoplasma salivalium, Suitable for detection of Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum, Mycoplasma hyorinis, Mycoplasma sinobiae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, Acoreplasma raidrawei, Ureaplasma ureariticam, Mycoplasma galepticum
  • the forward primers (B), (B1) and (b1) are, for example, spiroplasma cyto It is suitable for the detection of.
  • the reverse primer in the present invention is a group consisting of 17 to 26 (preferably 18 to 25) consecutive nucleotide sequences among one or more nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 14 and 17 to 20.
  • the oligonucleotide is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide consisting of a selected nucleotide sequence.
  • the set of the present invention may contain only one kind of reverse primer.
  • the following (C) to (G) [more preferably (C1), (C2 -1), (C2-2), (C2-3), (D), (E1), (E2), (F), (G)] selected from two or more (preferably three or more, More preferably 4 or more, more preferably 5 or more, more preferably 6 or more, still more preferably 7 or more, more preferably 8 or more, still more preferably 9 kinds of reverse primers are preferably included. .
  • Oligonucleotide consisting of: (superordinate concept of R2 reverse primer)
  • E an oligonucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 24 (preferably 18 to 22) consecutive nucleotide sequences among the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18: (R3 and R6 High-level concept of reverse primer)
  • F a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 25 (preferably 18 to 25, more preferably 20 to 25) consecutive nucleotide sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
  • Oligonucleotide consisting of: (superordinate concept of R5 reverse primer) (G): a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 23 (preferably 18 to 23, more preferably 20 to 23) consecutive nucleotide sequences in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 Oligonucleotide consisting of: (superordinate concept of R7 reverse primer)
  • oligonucleotide (C) As the oligonucleotide (C), the following oligonucleotides (C1) and (C2) are preferable.
  • C1 an oligonucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 26 (preferably 18 to 24) consecutive nucleotide sequences among the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15: High-level concept of reverse primer
  • C2 an oligonucleotide comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 26 (preferably 20 to 26) consecutive nucleotide sequences among the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16: (of R4 series) High-level concept of reverse primer)
  • the oligonucleotide (C1) the following oligonucleotides (c1-1), (c1-2) and (c1-3) are preferable, and among them, the oligonucleotide (c1-1) is more preferable.
  • C1-1) oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 23 of SEQ ID NO: 15): (R1 reverse primer)
  • C1-2 oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 22 of SEQ ID NO: 15): (M6-2 reverse primer)
  • C1-3 oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 3 to 20 of SEQ ID NO: 15): (TR-2 reverse primer)
  • oligonucleotide (C2) the following oligonucleotides (C2-1), (C2-2) and (C2-3) are preferable.
  • C2-1) a nucleotide sequence in which nucleotide number 20 m is a and nucleotide number 22 w is a in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 (nucleotide numbers 20 to 23 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16)
  • aaaa Oligonucleotide: (Overall concept of R4-1 reverse primer)
  • C2-2) a nucleotide sequence in which the nucleotide number 20 m is c and the nucleotide number 22 w is a in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 (nucle
  • oligonucleotide (C2-1) the following oligonucleotide (c2-1) is preferable.
  • oligonucleotide (C2-2) the following oligonucleotide (c2-2) is preferable.
  • oligonucleotide (C2-3) the following oligonucleotide (c2-3) is preferred.
  • oligonucleotide (D) As the oligonucleotide (D), the following oligonucleotide (d) is preferable. (D) an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17: (R2 reverse primer)
  • oligonucleotide As the oligonucleotide (E), the following oligonucleotides (E1) and (E2) are preferable.
  • Oligonucleotide) consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of consecutive nucleotide sequences): (superordinate concept of R3 reverse primer)
  • Oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of consecutive nucle
  • oligonucleotide (E1) the following (e1) oligonucleotide is preferable, and as the above-mentioned (E2) oligonucleotide, the following (e2) oligonucleotide is preferable.
  • E1 An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 (nucleotide sequence in which r of nucleotide number 9 is g in the nucleotide sequence of nucleotide numbers 5 to 24 of SEQ ID NO: 18): (R3 reverse primer)
  • E2 an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 (nucleotide sequence in which r of nucleotide number 9 is a in the nucleotide sequence of nucleotide numbers 5 to 24 of SEQ ID NO: 18): (R6 reverse primer)
  • oligonucleotide (F) As the oligonucleotide (F), the following oligonucleotide (f) is preferable. (F) an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19: (R5 reverse primer)
  • oligonucleotide (G) As the oligonucleotide (G), the following oligonucleotide (g) is preferable. (G) an oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20: (R7 reverse primer)
  • the reverse primers (C1), (c1-1), (c1-2) and (c1-3) are suitable for, for example, detection of Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae
  • the reverse primer (C2-1) And (c2-1) are suitable for detection of, for example, Mycoplasma arginini, Mycoplasma buchare, Mycoplasma faucium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma oleale, Mycoplasma salivalium
  • the reverse primer (C2-2) and ( c2-2) is suitable for detection of, for example, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum
  • the reverse primers (C2-3) and (c2-3) include, for example, Mycoplasma ha Suitable for the detection of Orinis
  • the reverse primers (D) and (d) are suitable for, for example, the detection of Acholplasma reidrawij
  • the reverse primers (E1) and (e1) are, for example, the
  • an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of 17 to 26 consecutive nucleotide sequences or a complementary nucleotide sequence thereof among the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33
  • an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence (sggrtggaty) of nucleotide numbers 7 to 16 of SEQ ID NO: 33 or a complementary nucleotide sequence thereof, including the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 44 to 48 or a complementary nucleotide sequence thereof Oligonucleotides are more preferred.
  • the set of the present invention may contain only one type of probe, but from the viewpoint of detecting a greater variety of mycoplasma, preferably two or more types selected from the following (H) to (L), more preferably It is preferable to include 3 or more types, more preferably 4 types or more, and still more preferably 5 types of probes.
  • oligonucleotide (H) As the above-mentioned oligonucleotide (H), the following oligonucleotide (h) is preferable, and as the above-mentioned (I) oligonucleotide, the following (i) oligonucleotide is preferable, and the above-mentioned (J) oligonucleotide:
  • the following (j) oligonucleotide is preferable, the above (K) oligonucleotide is preferably the following (k) oligonucleotide, and the above (L) oligonucleotide is the following (l) Are preferred.
  • oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 2 to 23 of SEQ ID NO: 34): (P1-1 probe)
  • I oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 2 to 23 of SEQ ID NO: 35): (P1-2 probe)
  • J oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 2 to 23 of SEQ ID NO: 36): (P1-3 probe)
  • K oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42 (nucleotide sequence of nucleotide numbers 2 to 23 of SEQ ID NO: 37): (P1-4 probe)
  • L oligonucleo
  • the probes (H) and (h) are, for example, Mycoplasma arginini, Mycoplasma buchare, Mycoplasma faucium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma orale, Mycoplasma salivalium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum.
  • Suitable for the detection of Mycoplasma hyorhinis, Acoleplasma reidrawii, Ureaplasma Ureaplasma cam, among others , Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma hyorhinis, Acolepraz ⁇ Reidorawii are more suitable detection of Ureaplasma urealyticum.
  • the probes (I) and (i) are suitable for detecting, for example, mycoplasma gallicepticum.
  • the probes (J) and (j) are, for example, Mycoplasma arginini, Mycoplasma bucare, Mycoplasma fabium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma orale, Mycoplasma salivalium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma -Suitable for detection of primatum, Mycoplasma sinobiae, and more suitable for detection of Mycoplasma oleale, Mycoplasma primatum, Mycoplasma sinobiae.
  • the probes (K) and (k) are suitable for detecting, for example, Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae.
  • the probes (L) and (l) are suitable for detecting spiroplasma citrus, for example.
  • the set of the present invention is selected from two types selected from such combinations CA to CI (preferably 3 types or more, more preferably 4 types or more, more preferably 5 types or more, more preferably Preferably 6 or more, more preferably 7 or more, more preferably 8 or more, particularly preferably 9).
  • the combination CA includes Mycoplasma arginini, Mycoplasma buchare, Mycoplasma fabisum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma oleale, Mycoplasma salivalium as detection targets.
  • the combination CB includes Mycoplasma fermenten as detection targets.
  • the combination CC includes Mycoplasma hyorhinis as the detection target, and the combination CD includes Mycoplasma sinobiae as the detection target.
  • the combination CC includes Mycoplasma lipophilum and Mycoplasma lipophilum.
  • CE includes Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae as detection targets, and the above-mentioned combination CF includes Acholplasma raid as detection targets.
  • the combination CG includes Mycoplasma gallicepticum as a detection target, the combination CH includes a ureaplasma / ureality cam as a detection target, and the combination CI includes a detection target. As spiroplasma citrus.
  • Each forward primer or each reverse primer described above has one or several (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleotide sequences. Even if nucleotides are deleted, substituted, or added, they can be used as primers in the present invention as long as each can amplify a target nucleic acid specific to the mycoplasma group to be detected.
  • the forward primer and reverse primer in the present invention can be synthesized by a commonly used method such as a triethyl phosphate method or a phosphate diester method using a DNA synthesizer or the like that is usually used.
  • the probe in the present invention is a single-stranded nucleic acid that can form a double-stranded molecule (hybrid) by specifically hybridizing to the amplification product (amplicon) by the corresponding primer pair.
  • a single-stranded nucleic acid is preferably a single-stranded DNA because of its excellent stability as a probe.
  • Each of the probes described above is a nucleotide sequence having a sequence identity of 85% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 98% or more) with each nucleotide sequence.
  • Any probe that can specifically hybridize to the amplification product of the target mycoplasma group can be used as a probe in the present invention.
  • the probe in the present invention can be synthesized by a commonly used method such as a triethyl phosphate method or a phosphoric acid diester method using a commonly used DNA synthesizer.
  • the probe in the present invention is preferably labeled with a labeling substance in order to detect the amplification product by the corresponding primer pair, and more preferably labeled with a fluorescent substance from the viewpoint of rapid and highly sensitive detection. More preferably, the fluorescent substance and the quencher are double-labeled, and a TaqMan (registered trademark) probe is more preferable.
  • the 5 'end of a nucleic acid probe is usually modified with a fluorescent substance (reporter fluorescent dye) and the 3' end is modified with a quenching substance (quencher fluorescent dye).
  • reporter fluorescent dyes examples include 6-FAM (6-carboxyfluorescein), TET (6-carboxy-4,7,2 ′, 7′-tetrachlorofluorescein), HEX (6-carboxy-2 ′, 4 ′, Fluorescein fluorescent dyes such as 7 ', 4,7-hexachlorofluorescein), and examples of quencher fluorescent dyes include 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX).
  • TAMRA 6-carboxytetramethylrhodamine
  • ROX 6-carboxy-X-rhodamine
  • the base sequence of SEQ ID NO: 5 is used.
  • Minor-groove-binder (MGB) which is a fluorescence quenching substance, is preferably used.
  • kits for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR of the present invention As a kit for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR of the present invention (hereinafter also simply referred to as “kit of the present invention”), a set of forward primer, reverse primer and probe, A solid support, and the probe is not particularly limited as long as the probe is fixed on the solid support. Use of a probe immobilized on a solid support is preferable in that an amplification product can be detected more rapidly.
  • the “solid support” in the present invention means a substrate to which probe oligonucleotides can be bound.
  • microplate microtiter plate
  • membrane nylon, nitrocellulose, etc.
  • beads resin, etc.
  • metal examples thereof include fine particles and substrates (glass, silicon, resin, etc.).
  • the method for detecting mycoplasma of the present invention is a method for detecting mycoplasma in a test sample by multiplex real-time quantitative PCR, (A) Step of extracting DNA from a test sample a: (B) Step b of performing multiplex real-time quantitative PCR using the DNA extracted in the above step a as a template and using the set of primer pairs of the present invention or the kit of the present invention; and (C) Step c for detecting whether or not mycoplasma is present in the test sample by detecting an amplification product by multiplex real-time quantitative PCR in step b above: As long as the method includes: By such a method, a greater variety of mycoplasma can be detected more quickly, simply, with high sensitivity and with high accuracy.
  • the “mycoplasma” in the present invention is not only a bacterium belonging to the genus Mycoplasma, but also a genus Mycoplasma, a ureaplasma genus, a mesoplasma genus, an entomoplasma genus, a spiroplasma, It means bacteria belonging to the genus Morlicutes including the genus (Spiroplasma), the genus Acholplasma, the genus Asteroleplasma, and the Thermoplasma, among which the genus Mycoplasma and Ureaplasma Bacteria belonging to the genus Spiroplasma and Acolplasma are preferred.
  • Bacteria belonging to the Ma genus may be mentioned more preferably.
  • Mycoplasma arginini Mycoplasma arginini
  • Mycoplasma buccale Mycoplasma faucium
  • Mycoplasma hominis Mycoplasma orale (Mycoplasma orale)
  • Mycoplasma salivarium Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum, Mycoplasma primatum, Mycoplasma plasma ), Mycoplasma genitalium, Mycoplasma pneumoniae, One or more selected from the group consisting of Acholeplasma laidlawii, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma gallisepticum, and Spiroplasma citri Of mycoplasma.
  • test sample in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cultured cells such as mammals, reptiles, amphibians, and birds, such as animals and plants, cell culture supernatants, and biological samples.
  • pretreatment such as filtration and impurity removal may be performed as necessary.
  • the step a is not particularly limited as long as it is a step of extracting DNA from a test sample.
  • a method for extracting DNA from a test sample a conventional method can be used.
  • a liquid-liquid extraction method such as a phenol / chloroform method or a solid-liquid extraction method using a carrier can be used.
  • various DNA extraction kits such as QIAamp (registered trademark) DNA-Mini Kit (available from QIAGEN) and Loopamp (registered trademark) SR DNA extraction kit (produced by Eiken Chemical Co., Ltd.) marketed by reagent manufacturers can be used. Good.
  • the sample is transferred to a QIAamp Mini spin Column (attached to a 2 mL collection tube) and then centrifuged at room temperature and 6000 ⁇ g for 1 minute. Transfer the above QIAamp Mini spin Column to a new 2mL collection tube and add 500 ⁇ L Buffer AW1 to the sample. Centrifuge for 1 minute at room temperature and 6000 ⁇ g. Transfer the above QIAamp Mini spin Column to a new 2 mL collection tube and add 500 ⁇ L Buffer AW2 to the sample. Centrifuge for 3 minutes at room temperature and 20000 ⁇ g. Transfer the above QIAamp Mini spin Column to a new 2mL collection tube and then centrifuge at room temperature and 20000 xg for 1 minute.
  • the step b is not particularly limited as long as it is a step of performing multiplex real-time quantitative PCR using the DNA extracted in the step a as a template and using the primer pair set of the present invention or the kit of the present invention.
  • Multiplex real-time quantitative PCR is PCR in which multiple (two or more or three or more pairs) primer pairs are simultaneously used in one amplification reaction field in real-time quantitative PCR.
  • Real-time quantitative PCR (real-time PCR) is PCR This is a technique for monitoring and analyzing the amount of amplification product produced by the method in real time. Multiplex real-time quantitative PCR does not require electrophoresis and is excellent in rapidity and quantitativeness.
  • multiplex real-time quantitative PCR the usual method of multiplex real-time quantitative PCR can be used except that the DNA extracted in the above step a is used as a template and the primer pair set of the present invention or the kit of the present invention is used. it can.
  • Common methods for multiplex real-time quantitative PCR include, for example, “Molecular Cloning, 4th edition” (Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 2012) and kits for multiplex real-time quantitative PCR (eg Brilliant Multiplex QPCR). Master Mix (manufactured by Agilent Technologies) etc.)
  • the intercalator method and the probe method are mainly known as methods for detecting amplification products. From the viewpoint of detecting mycoplasma with higher sensitivity and accuracy, amplification products can be detected using probes.
  • the probe method to detect is mentioned preferably.
  • the concentration of the forward primer, reverse primer, and probe used in the present invention is not particularly limited as long as mycoplasma can be detected, and those skilled in the art can adjust the concentration to be used as appropriate. Within the range of 0.005 to 3 ⁇ M, preferably within the range of 0.01 to 1 ⁇ M.
  • PCR reaction can be carried out in a total of 50 ⁇ L by adding 40 ⁇ L of the reaction solution to a 0.2 mL tube and 10 ⁇ L of the DNA solution derived from the test sample.
  • the reaction solution for PCR was 1 ⁇ PCR Gold Buffer (15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl) (ABI), 3 mM MgCl 2 (ABI), 60 mM trehalose, 200 ⁇ M each dNTPs (Trilink) )), 1.25 U amplitaq Gold DNA polymerase, forward primer (0.5 ⁇ M F1, 0.2 ⁇ M F2) (manufactured by Tsukuba Oligo Service), reverse primer (0.5 ⁇ M R1, 0.3 ⁇ M) R2, 0.15 ⁇ M R3, 0.125 ⁇ M R4-1, 0.125 ⁇ M R4-2, 0.125 ⁇ M R4-3, 0.2 ⁇ M R5, 0.15 ⁇ M R6, 0.125 ⁇ M R6, 0.125
  • 0.002 ⁇ M consignment can be prepared by mixing. PCR can be performed at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 45 cycles of 95 ° C., 15 seconds of denaturation, 60 ° C., 1 minute of annealing and extension (signal detection). The concentration of the PCR product can be calculated by detecting the signal of the fluorescent probe.
  • a real-time PCR system called LightCycler 480 (Roche diagnostics) can be used. Distilled Water Deionized, Sterile (Nippon Gene Co., Ltd.) can be used for negative control.
  • PCR reaction can be carried out in a total of 50 ⁇ L by adding 40 ⁇ L of the reaction solution to a 0.2 mL tube and 10 ⁇ L of the DNA solution derived from the test sample.
  • the reaction solution for PCR was 1 ⁇ PCR Buffer (75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 3 mM MgCl 2 , 0.01% (v / v) Tween 20, 250 ⁇ M each dNTPs) 1.25U Taq DNA polymerase (Thermo scientific), 5 ⁇ g anti-taq high (TOYOBO), forward primer (0.5 ⁇ M F1, 0.2 ⁇ M F2) (manufactured by Tsukuba Oligo Service) ), Reverse primer (0.5 ⁇ M R1, 0.3 ⁇ M R2, 0.15 ⁇ M R3, 0.125 ⁇ M R4-1, 0.125 ⁇ M R4-2, 0.125 ⁇ M R4-3, 0.2 ⁇
  • PCR conditions can include 45 cycles of 95 ° C, 1 minute PreDenature, 95 ° C, 5 seconds denaturation, 60 ° C, 1 minute annealing and extension (signal detection).
  • concentration of the PCR product can be calculated by detecting the signal of the fluorescent probe.
  • a real-time PCR system called LightCycler 480 (Roche diagnostics) can be used. Distilled Water Deionized, Sterile (Nippon Gene Co., Ltd.) can be used for negative control.
  • the multiplex real-time quantitative PCR and the detection of the amplification product can be performed using a commercially available real-time PCR system such as LightCycler 480 (Roche Diagnostics).
  • the detection limit sensitivity of mycoplasma is usually 100 cfu / mL or less, preferably 10 cfu / mL or less, more preferably 5 cfu / mL or less.
  • Mycoplasma arginini (preferably ATCC 23838), Mycoplasma fermentans (preferably NBRC15854), Mycoplasma gallicepticum (preferably NBRC14855), Mycoplasma hyorhinis (preferably NBRC14858), Mycoplasma orale (preferably NBRC14477),
  • the detection limit sensitivity for Mycoplasma pneumoniae (preferably NBRC 14401), Mycoplasma sinobiae (preferably ATCC 25204), Acoleplasma radrawij (preferably NBRC14400), Spiroplasma citri is preferably 10 cfu / mL or less, more preferably 5 cfu / ML or less.
  • a sequence that is expected to anneal to the genomic sequence of that specific region of mycoplasma or its complementary sequence but not to those sequences of other bacteria (many mismatches) is used as a forward primer or reverse primer
  • the probe was probed with a sequence expected to hybridize to the sequence of another specific region or its complementary sequence contained in the amplification product of these primers but not to the sequence of other bacteria. (See the upper panel in FIG. 1 and FIGS. 7-1 to 7-3).
  • F1 forward primer (SEQ ID NO: 4), R4-1 reverse primer (SEQ ID NO: 25), and P1-1 (SEQ ID NO: 39) or P1-3 (SEQ ID NO: 41) probe Is a set (combination A) (targeting Group 1a mycoplasma), F1 forward primer (SEQ ID NO: 4), R4-2 reverse primer (SEQ ID NO: 26), P1-1 (SEQ ID NO: 39) or P1- 3 (SEQ ID NO: 41) probe as a set (combination B) (for group 1b mycoplasma), F1 forward primer (SEQ ID NO: 4), R4-3 reverse primer (SEQ ID NO: 27), and P1-1 probe (SEQ ID NO: 39) is a set (combination C) (targeting Group 1c mycoplasma) and F1 forward primer (SEQ ID NO: ), R7 reverse primer (SEQ ID NO: 20), and P1-3 probe (SEQ ID NO: 41) are set (combination D)
  • the P1-1 probe (SEQ ID NO: 39) are a set (combination F (targeting mycoplasma of Group IV 4)), F1 forward primer (SEQ ID NO: 4), R3 reverse primer (SEQ ID NO: 28), , P1-1 probe (SEQ ID NO: 39) and set (combination G) (for group 3a mycoplasma)
  • F1 forward primer (SEQ ID NO: 4), R6 reverse primer (SEQ ID NO: 29), and P1-2 probe (SEQ ID NO: 40) are set (combination H) (targeting Group 3b mycoplasma) and F2 forward A primer (SEQ ID NO: 13), an R5 reverse primer (SEQ ID NO: 19), and a P2 probe (SEQ ID NO: 43) constitute a set (combination I) (for a group 5 mycoplasma).
  • the above combination A has Mycoplasma Arginini, Mycoplasma Buchare, Mycoplasma Fabium, Mycoplasma Hominis, Mycoplasma Orale, and Mycoplasma Salivarum as detection targets.
  • B is a detection target of Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, and Mycoplasma primatum.
  • the above combination C is a detection target of Mycoplasma hyorhinis
  • the above combination D is a detection target of Mycoplasma sinobiae.
  • the above combination E uses Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae as detection targets
  • the above combination F includes
  • the combination G is the detection target Mycoplasma gallicepticum
  • the combination H is the detection target Ureaplasma / Ureaitycam
  • the combination I is the spiroplasma citri The detection target.
  • Each primer and probe of the above sets A to I were synthesized by an oligonucleotide synthesizer.
  • Mycoplasma arginini (ATCC 23838), Mycoplasma fermentans (NBRC15854), Mycoplasma gallicepticum (NBRC14855), Mycoplasma hyorhinis (NBRC14858), Mycoplasma oleale (NBRC14477), Mycoplasma pneumoniae (NBRC14, NBRC14401) Acoleplasma Rajdrawii (NBRC14400), Spiroplasma Citri (ATCC 27556). 5 Units / ⁇ L Amplitaq Gold DNA polymerase (ABI).
  • Ampitaq Gold attached reagent (ABI): 10 ⁇ PCR Buffer (150 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM KCl), 25 mM MgCl 2 , 10 mM each dNTP mix. Distilled Water, Deionized, Sterile (manufactured by Nippon Gene).
  • Method A 40 ⁇ L of the reaction solution was added to a 0.2 mL tube, and 10 ⁇ L of any of the above mycoplasma DNA solutions (5, 10, 100, or 1000 cfu / reaction) was added, and the PCR reaction was performed with a total of 50 ⁇ L.
  • the reaction solution for PCR was 1 ⁇ PCR Gold Buffer (15 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl) (ABI), 3 mM MgCl 2 (ABI), 60 mM trehalose, 200 ⁇ M each dNTPs ( ABI)), 1.25U amplitaq Gold DNA polymerase, forward primer (0.5 ⁇ M F1, 0.2 ⁇ M F2) (manufactured by Tsukuba Oligo Service), reverse primer (0.5 ⁇ M R1, 0) .3 ⁇ M R2, 0.15 ⁇ M R3, 0.125 ⁇ M R4-1, 0.125 ⁇ M R4-2, 0.125 ⁇ M R4-3, 0.2 ⁇ M R5, 0.15 ⁇ M R6, 0.125 ⁇ M R7) (manufactured by Tsukuba Oligo Service), fluorescent probe (0.045 ⁇ M P1-1, 0.045 ⁇ M P1-2, 0.045 ⁇ M P1-3, 0.045 ⁇ M P1-4 00
  • the PCR was performed at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 45 cycles of 95 ° C., 15 seconds of denaturation, 60 ° C., 1 minute of annealing and extension (signal detection). The concentration of the PCR product was calculated by detecting the signal of the fluorescent probe.
  • a real-time PCR system called LightCycler 480 (Roche diagnostics) was used.
  • this detection method is shown on the left side of FIG. 2 (“this detection method”). Further, as a comparative method, a conventionally known multiplex real-time quantitative PCR method (Non-patent Document 1) using a conserved region of the tuf gene was performed. The results are shown on the right side of FIG. 2 (“detection method described in reference paper”). From these results, it was shown that the detection method of the present invention can obtain detection sensitivity equivalent to or better than that of a similar conventional detection method. For example, in the comparative method, 5 cfu / reaction mycoplasma fermentans could not be detected in all three samples (0/3), but in the detection method of the present invention, all three samples could be detected (3 / 3).
  • the detection method of the present invention can provide detection sensitivity far superior to that of the comparison target method for Mycoplasma galicepticum, Mycoplasma oleale, Mycoplasma sinobiae, Acoleplasma raidrawei, and Spiroplasma citri. Indicated.
  • Bacillus anthracis Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bartonella bacilliformis, Bartonella grahamii, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis, Campylobacter curvus, Campylobacter hominis, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachoophilia, Chlamydia trachoophilia, Chlamydia trachoophilia, , Corynebacterium diphtheriae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Fusobacterium necrophorum, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Kineococcus radiotolerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Listeria monocytogenes, Listeria welshimeri serovar6b str, Micrococcus luteus,
  • the multiplex real-time quantitative PCR method of the present invention is estimated to have no or no cross-reactivity with respect to a very wide variety of bacteria other than mycoplasma, and has a very high specificity for mycoplasma. It has been shown.
  • the forward primers shown in Table 2 below were designed and synthesized by an oligonucleotide synthesizer.
  • the following table shows the number of nucleotides of the primers of these variations and the relationship with the F1 forward primer (how many nucleotides were extended or shortened to the 5 ′ end side or 3 ′ end side with respect to the F1 forward primer). Show.
  • R1 reverse primers shown in Table 3 below were designed and synthesized by an oligonucleotide synthesizer. Table 3 below shows the number of nucleotides of the primers of these variations and the relationship with the R1 reverse primer (how many nucleotides were extended or shortened to the 5 ′ end side or 3 ′ end side with respect to the R1 reverse primer). Shown in
  • FIG. 4 shows the positional relationship of each sequence of the F1 forward primer and its variation primer or the variation primer of the R1 reverse primer.
  • the mobility in FIG. 4 is the position of the nucleotide at the 3 ′ end of the variation primer relative to the 3 ′ end nucleotide of the reference primer (F1 for the forward primer and R1 for the reverse primer). It shows how many nucleotides moved to which side. For example, since the M1 forward primer extends one nucleotide on the 3 ′ end side of the F1 forward primer, the mobility is “+1”, and the MyTF-6 forward primer is a nucleotide on the 3 ′ end side of the F1 forward primer. Is shortened by one, the mobility is “ ⁇ 1”.
  • the multiplex real-time quantitative PCR method (see Example 2 above) of the present invention was performed for all combinations (see Table 4 below) of the F1 forward primer and its variation primer and the R1 reverse primer and its variation primer.
  • Mycoplasma genitalium about 10 6 cfu / reaction
  • Lactobacillus bulgaricus about 10 6 cfu / reaction
  • P1-1, P1-2, and P1 are used as fluorescent probes.
  • a mixture of -3, P1-4 and P2 was used.
  • Distilled Water Deionized, Sterile manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. was used for negative control.
  • FIG. 5 shows the detection results of each sample in this multiplex real-time quantitative PCR test. When it was not detected, it was represented by “ ⁇ ”, and when it was detected, a ct value was shown. The ct value is the number of cycles when the PCR amplification product reaches a certain amount. The smaller the ct value, the more sensitive the target is detected. As can be seen from the results in FIG. 5, when M1, F1, TF, MyTF-1, and MyTF-5 are used as forward primers, any of M6-2, TR, TR-2, and R1 is used as a reverse primer. Even if it was, Mycoplasma genitalium was detected with high sensitivity without detecting Lactobacillus bulgaricus which is not Mycoplasma.
  • the forward primers are preferably F1, M1, TF, MyTF-1, MyTF-5 and MyTF-6.
  • the F1 forward primer, MyTF-1 forward primer, MyTF-5 forward primer Has been shown to be more preferred.
  • a mycoplasma detection method capable of detecting more various mycoplasmas more quickly, simply, with high sensitivity and high accuracy, a set of forward primer, reverse primer and probe, and a kit for such detection are provided. can do.
  • the present invention can be used not only for detection of mycoplasma contamination in the field of cell culture for biological drugs, regenerative medicine and cell therapy, but also for diagnosis of mycoplasma infections.

Abstract

　本発明は、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、かかるセットを含むキットを提供することを目的とする。　配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである１種又は２種以上のフォワードプライマーと、配列番号１４、１７～２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるリバースプライマーと、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるプローブとを用いて、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する。

Description

マイコプラズマを検出する方法
　本発明は、マイコプラズマを検出する方法に関し、より詳細には、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、かかるセットを含むキットに関する。
　マイコプラズマ(Mycoplasma)は、モリクテス（Mollicutes）綱に分類される真正細菌の一属で、広義では、マイコプラズマ属の他、ウレアプラズマ（Ureaplasma）属、メソプラズマ（Mesoplasma）属、エントモプラズマ（Entomoplasma）属、スピロプラズマ（Spiroplasma）属、アコレプラズマ（Acholeplasma）属、アステロプラズマ（Asteroleplasma）属、及びサーモプラズマ（Thermoplasma）属も含めてマイコプラズマと呼ばれることもある。マイコプラズマは、自己増殖可能な最小の生物であり、現在、２００種類以上の種が知られている。マイコプラズマは、一般の真正細菌に見られるペプチドグリカン細胞壁を持たないため、細胞の形状は不定形で可塑性を有している。また、マイコプラズマは大きさが約０．２～０．８μｍと小さく、また、形状も不定形であるので、０．２μｍ程度の濾過滅菌用フィルターを通過することができる。そのため、細胞培養用培地について濾過滅菌を行っても、マイコプラズマを除去することはできず、特に一部の種のマイコプラズマは、細胞培養における微生物汚染の代表的な原因菌として知られている。
　マイコプラズマは、細胞壁がないため、細胞培養に通常使用されるペニシリン系、セフェム系等の抗生物質による影響を受けない。また、マイコプラズマは、他の細菌汚染物質とは異なり、培地の濁度の上昇や培養細胞の変性等の可視的な変化を引き起こすことなく細胞培養上清中で増殖する。そのため、マイコプラズマの検出方法が実施されない限り、マイコプラズマ汚染は看過され、汚染を拡大させてしまう。マイコプラズマは、細胞膜に吸着して細胞の栄養素を枯渇させ、細胞の増殖を阻害したり、遺伝子発現を変化させるため、感染した培養物からの実験結果は信頼性の低いものとなる。したがって、研究を行う際には、マイコプラズマ汚染がないことを確認することは、重要な前提となる。また、細胞の培養を伴う再生医療、細胞治療の分野では、マイコプラズマに感染した細胞を治療に用いた場合、免疫系に悪影響を与えたり、肺炎、尿道炎、関節炎を引き起こす恐れもある。したがって、生物由来医薬品の製造や、再生医療、細胞治療の現場において、マイコプラズマ否定試験は必須とされている。
　マイコプラズマ否定試験法として、日本薬局方の参考情報には、培養法（寒天及び液体培地法）、指標細胞を用いたＤＮＡ染色法（指標細胞培養法）、２段階ＰＣＲ法、の３種類方法が提示されている。しかし、培養法には培養期間が２８日と長すぎるという問題点、ＤＮＡ染色法には低感度であるという問題点、２段階ＰＣＲ法（Nested PCR法）には増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性が生じ易いという問題点があり、３種類のいずれの試験法も、再生医療、細胞治療の安全性試験法としては実用性が不十分であった。したがって、より実用的なマイコプラズマの検出法の開発が進められている。
　例えば、特許文献１には、リアルタイムＰＣＲによりマイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー対や、該プライマー対を用いてマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマの２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅ターゲットとしている。また、非特許文献１には、リアルタイムＰＣＲによりマイコプラズマ等の遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー対や、該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブや、該プライマー対及びプローブを用いてマイコプラズマ等を検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマ等のtuf遺伝子を増幅ターゲットとしている。さらに、特許文献２には、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法という特殊な遺伝子増幅法により、マイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセットや、該プライマーセットによる増幅産物を検出するためのプローブや、該プライマーセット及びプローブを用いてマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅ターゲットとしている。さらに、特許文献３には、リアルタイム核酸増幅反応（リアルタイムＰＣＲ）によりマイコプラズマの遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを含むキットや、該プライマーを用いて細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法などが開示されている。この方法では、マイコプラズマのｒｐｏＢ遺伝子を増幅ターゲットとしている。これらのように、マイコプラズマの検出法については開発が進められているが、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できる、より実用的なマイコプラズマ検出法が求められている。
　なお、非特許文献２には、マイコプラズマを検出するための旧来の２段階ＰＣＲ法に用いるプライマーではあるが、マイコプラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域を増幅ターゲットとするプライマーが開示されている。しかし、旧来の２段階ＰＣＲは前述したように、増幅産物のキャリーオーバーコンタミネーションによる擬陽性が生じ易いという問題があった。
　ところで、一部の種のマイコプラズマは、肺炎の原因菌ともなることが知られている。そのため、例えば特許文献４には、肺炎患者の診断に際して、ＰＣＲなどにより、マイコプラズマ・ニューモニエなどの肺炎菌類の遺伝子を特異的に増幅して該肺炎菌類を検出する方法や、該方法に用いるためのプライマーや、該方法で生じる増幅産物に相補的なプローブなどが開示されている。この方法において、マイコプラズマ・ニューモニエを検出する際の増幅ターゲットは、ＤｎａＪ１遺伝子であった。このように、マイコプラズマを原因とする肺炎を診断する目的においても、かかるマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できる、より実用的なマイコプラズマ検出法が求められている。
特開２００４－３０５２０７号公報 特開２０１２－６０９２５号公報 特開２０１３－５１５４５８号公報 国際公開２０１１／１２２０３４号パンフレット
International Journal of Medical Microbiology (2009) 299, 291-300 Res. Microbiol. (1993) 144, 489-493
　本発明の課題は、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討する中で、マイコプラズマに特異的な配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域のうち、特定の配列に対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーと、該プライマー対による増幅産物を検出するためのプローブとの組合せを複数設計し、かかるプライマー対とプローブとの複数の組合せを用いて、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行ったところ、多種のマイコプラズマを、迅速、簡便、高感度及び高精度に検出することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
（１）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、
　前記セットが、１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、
　前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、
　前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列（caaggtatccc）を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７～２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、セットや、
（２）１種又は２種以上のフォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２７のヌクレオチド配列（caaggtatccctac）を含むヌクレオチド配列からなる１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）に記載のセットや、
（３）１種又は２種以上のフォワードプライマーが、以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のセット：
（Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
（Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：や、
（４）２種のフォワードプライマーを含み、前記２種のフォワードプライマーが、配列番号４～７、１１及び１２から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれかに記載のセットや、
（５）リバースプライマーの少なくとも１種が、配列番号１４のヌクレオチド番号３～２０のヌクレオチド配列（wsccaaggcatccaccah）を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（４）のいずれかに記載のセットや、
（６）２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下の（Ｃ１）、（Ｃ２－１）、（Ｃ２－２）、（Ｃ２－３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）及び（Ｇ）から選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（５）のいずれかに記載のセット：
（Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２－１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２－２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｃ２－３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個～２５個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 
（Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個～２３個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（７）２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下のオリゴヌクレオチドから選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（６）のいずれかに記載のセット：
配列番号２１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２４のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（８）プローブが、配列番号３３のヌクレオチド番号７～１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（７）のいずれかに記載のセットや、
（９）１種又は２種以上のプローブが、以下の（Ｈ）～（Ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（８）のいずれかに記載のセット：
（Ｈ）配列番号３４のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｉ）配列番号３５のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｊ）配列番号３６のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｋ）配列番号３７のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（Ｌ）配列番号３８のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（１０）１種又は２種以上のプローブが、以下の（ｈ）～（ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする上記（１）～（９）のいずれかに記載のセット：
（ｈ）配列番号３９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｉ）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｊ）配列番号４１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｋ）配列番号４２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
（ｌ）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：や、
（１１）プローブが、５’末端を蛍光物質で、３’末端を消光物質で修飾されているTaqMan（登録商標）プローブであることを特徴とする上記（１）～（１０）のいずれかに記載のセットに関する。
　また、本発明は、
（１２）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキットであって、
　前記キットが、上記（１）～（１１）のいずれかに記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されていることを特徴とする、キットに関する。
　さらに、本発明は、
（１３）マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
（ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
（ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記（１）～（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
（ｃ）上記（１）～（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるプローブを用いて、上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在しているか否かを検出する工程ｃ：
を含む方法や、
（１４）工程ｃにおける、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物の検出が、上記（１）～（１１）のいずれかに記載のセット又は上記（１２）に記載のキットにおけるプローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じるか否かを検出することによりなされることを特徴とする上記（１３）に記載のマイコプラズマを検出する方法や、
（１５）マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマの検出限界感度が１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であることを特徴とする上記（１３）又は（１４）に記載のマイコプラズマを検出する方法に関する。
　本発明によれば、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することができる。
上パネルは、本発明における各フォワードプライマーや各リバースプライマーが、マイコプラズマのゲノム上でどの位置に対応するかを示す図である。下パネルは、フォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーからなる各セット（組合せ）が、それぞれどのような種類のマイコプラズマをターゲットとしているかを示す図である。 本検出法（本発明の検出方法）と、参考論文記載の検出法（非特許文献１記載の検出法）とで、各種マイコプラズマに対する検出感度を測定した結果を示す図である。 本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法において、交差反応性が実際に否定された細菌、真菌及び哺乳類由来細胞を示す。 Ｆ１フォワードプライマー、そのバリエーションプライマー、Ｒ１リバースプライマー、及びそのバリエーションプライマーの各配列の位置関係を示す図である。 Ｆ１フォワードプライマーやそのバリエーションプライマーと、Ｒ１リバースプライマーやそのバリエーションプライマーとの組合せについて、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法を行った結果を示す図である。ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数であり、ｃｔ値が小さいほどその対象をより高感度で検出していることを表す。 マイコプラズマ（マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、スピロプラズマ・シトリ）と、マイコプラズマではないクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）とのゲノム配列を比較した結果の一部を示す図である。 本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。 本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。 本発明におけるフォワードプライマー、プローブ、リバースプライマーの近辺のゲノム配列を、マイコプラズマ・ミクロティ（Mycoplasma microti）、マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）、マイコプラズマ・アイオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasmapneumoniae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）で比較した結果を表す図である。
（本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセット）
　本発明のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセット（以下、単に「本発明のセット」とも表示する。）としては、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、前記セットが１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、前記プローブは、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７～２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されない。
　本発明におけるフォワードプライマーとしては、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個（好ましくは１７個～２６個、より好ましくは１７個～２３個、さらに好ましくは１８個～２２個、さらにより好ましくは１９～２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されないが、マイコプラズマをより高感度又はより高精度に検出する観点から、これらのオリゴヌクレオチドの中でも、配列番号１のヌクレオチド番号１１～２４のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドや、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２７のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号１のヌクレオチド番号１１～２７のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドがより好ましい。配列番号１のヌクレオチド番号２７のヌクレオチド「ｃ」は、マイコプラズマではきわめて高く保存されており、かつ、マイコプラズマ以外の細菌では「ｃ」以外のヌクレオチドであることが多いため、マイコプラズマに特徴的な配列となっている。
　本発明のセットは、フォワードプライマーを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、少なくとも以下の（Ａ）、（Ｂ）の２種を含む、２種以上のフォワードプライマーを含んでいることが好ましく、以下の（Ａ）、（Ｂ）の２種のフォワードプライマーを含んでいることがより好ましい。
（Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド番号２４のヌクレオチドｓがｃであるヌクレオチド配列）のうち、１７個～３０個（好ましくは１７個～２６個、より好ましくは１７個～２３個、さらに好ましくは１８個～２２個、さらにより好ましくは１９～２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：（Ｆ１系のフォワードプライマーの上位概念）
（Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列（配列番号１のヌクレオチド番号２４のヌクレオチドｓがｇであるヌクレオチド配列）のうち、１７個～３０個（好ましくは１７個～２６個、より好ましくは１７個～２３個、さらに好ましくは１８個～２２個、さらにより好ましくは１９～２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：（Ｆ２フォワードプライマーの上位概念）
　本発明のセットが含む上記１種又は２種以上のフォワードプライマーのより具体的な例としては、以下の（Ａ１）～（Ａ６）及び（Ｂ１）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーが好ましく、中でも、以下の（Ａ１）～（Ａ６）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーと、以下の（Ｂ１）のオリゴヌクレオチドのフォワードプライマーとを含んでいることがより好ましい。
（Ａ１）：配列番号２のヌクレオチド番号８～３０のヌクレオチド配列（Ｆ１フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個～２１個（好ましくは１８個～２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ２）：配列番号２のヌクレオチド番号９～３０のヌクレオチド配列（Ｍ１フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に１塩基延ばした配列）のうち、１７個～２１個（好ましくは１８個～２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ３）：配列番号２のヌクレオチド番号６～２８のヌクレオチド配列（ＴＦフォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個～２１個（好ましくは１８個～２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＦフォワードプライマーの上位概念）
（Ａ４）：配列番号２のヌクレオチド番号９～３０のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ－１フォワードプライマーの５’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１８個～２２個（好ましくは１９個～２１個、より好ましくは２０個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－１フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ５）：配列番号２のヌクレオチド番号４～２６のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ－５フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個～２１個（好ましくは１８個～２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－５フォワードプライマーの上位概念）
（Ａ６）：配列番号２のヌクレオチド番号５～２９のヌクレオチド配列（ＭｙＴＦ－６フォワードプライマーの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１９個～２３個（好ましくは２０個～２２個、より好ましくは２１個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－６フォワードプライマーの上位概念）
（Ｂ１）：配列番号３のヌクレオチド番号８～３０のヌクレオチド配列（Ｆ２プライマーフォワードの５’末端に２塩基、３’末端に２塩基延ばした配列）のうち、１７個～２１個（好ましくは１８個～２０個、より好ましくは１９個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ２フォワードプライマーの上位概念）
　上記の（Ａ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ２）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ２）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ３）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ３）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ４）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ４）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ５）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ５）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ａ６）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ａ６）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ｂ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ｂ１）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ａ１）：配列番号４のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１０～２８のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ１フォワードプライマー）
（ａ２）：配列番号５のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１１～２９のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ１フォワードプライマー）
（ａ３）：配列番号６のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号８～２６のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＦフォワードプライマー）
（ａ４）：配列番号７のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号１１～３０のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－１フォワードプライマー）
（ａ５）：配列番号１１のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号６～２４のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－５フォワードプライマー）
（ａ６）：配列番号１２のヌクレオチド配列（配列番号２のヌクレオチド番号７～２７のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＭｙＴＦ－６フォワードプライマー）
（ｂ１）：配列番号１３のヌクレオチド配列（配列番号３のヌクレオチド番号１０～２８のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｆ２フォワードプライマー）
　上記のＦ１フォワードプライマー、Ｍ１フォワードプライマー、ＴＦフォワードプライマー、ＭｙＴＦ－１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－５フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－６フォワードプライマー（これらをまとめて、「Ｆ１系フォワードプライマー」とも表示する。）の中では、Ｆ１フォワードプライマー、Ｍ１フォワードプライマー、ＴＦフォワードプライマー、ＭｙＴＦ－１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－５フォワードプライマーが好ましく、中でも、Ｆ１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－５フォワードプライマーがより好ましい。
　上記フォワードプライマー（Ａ）、（Ａ１）～（Ａ６）及び（ａ１）～（ａ６）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・シノビアエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエ、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカム、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適しており、上記フォワードプライマー（Ｂ）、（Ｂ１）及び（ｂ１）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適している。
　本発明におけるリバースプライマーとしては、配列番号１４、１７～２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７～２６個（好ましくは１８個～２５個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されない。本発明のセットは、リバースプライマーを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、好ましくは以下の（Ｃ）～（Ｇ）［より好ましくは（Ｃ１）、（Ｃ２－１）、（Ｃ２－２）、（Ｃ２－３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）、（Ｇ）］から選択される２種以上（好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、より好ましくは６種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種以上、さらに好ましくは９種のリバースプライマーを含んでいることが好ましい。
（Ｃ）：配列番号１４のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１系及びＲ４系のリバースプライマーの上位概念）
（Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２６個、より好ましくは２０個～２６個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ２リバースプライマーの上位概念）
（Ｅ）：配列番号１８のヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個（好ましくは１８個～２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３及びＲ６のリバースプライマーの上位概念）
（Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個～２５個（好ましくは１８個～２５個、より好ましくは２０個～２５個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ５リバースプライマーの上位概念）
（Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個～２３個（好ましくは１８個～２３個、より好ましくは２０個～２３個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ７リバースプライマーの上位概念）
　上記の（Ｃ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｃ１）や（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１系のリバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２）：配列番号１６のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個（好ましくは２０個～２６個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４系のリバースプライマーの上位概念）
　上記（Ｃ１）のオリゴヌクレオチドとしては以下の（ｃ１－１）や、（ｃ１－２）や、（ｃ１－３）のオリゴヌクレオチドが好ましく、中でも、（ｃ１－１）のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
（ｃ１－１）：配列番号２１のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号１～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ１リバースプライマー）
（ｃ１－２）：配列番号２２のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号１～２２のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｍ６－２リバースプライマー）
（ｃ１－３）：配列番号２４のヌクレオチド配列（配列番号１５のヌクレオチド番号３～２０のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（ＴＲ－２リバースプライマー）
　上記（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｃ２－１）や、（Ｃ２－２）や、（Ｃ２－３）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｃ２－１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０～２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３０（aaaa）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－１リバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２－２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０～２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３１（caaa）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－２リバースプライマーの上位概念）
（Ｃ２－３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０～２３のヌクレオチド配列（mawa）が、配列番号３２（aata）であるヌクレオチド配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１８個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－３リバースプライマーの上位概念）
　上記（Ｃ２－１）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２－１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｃ２－２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２－２）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｃ２－３）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｃ２－３）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｃ２－１）：配列番号２５のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３～２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－１リバースプライマー）
（ｃ２－２）：配列番号２６のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３～２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－２リバースプライマー）
（ｃ２－３）：配列番号２７のヌクレオチド配列（配列番号１６のヌクレオチド番号３～２６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ４－３リバースプライマー）
　上記の（Ｄ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｄ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｄ）配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ２リバースプライマー）
　上記の（Ｅ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（Ｅ１）や、（Ｅ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個（好ましくは１８個～２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３リバースプライマーの上位概念）
（Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個（好ましくは１８個～２２個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ６リバースプライマーの上位概念）
　上記の（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｅ１）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記の（Ｅ２）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｅ２）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｅ１）：配列番号２８のヌクレオチド配列（配列番号１８のヌクレオチド番号５～２４のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号９のｒがｇであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ３リバースプライマー）
（ｅ２）：配列番号２９のヌクレオチド配列（配列番号１８のヌクレオチド番号５～２４のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号９のｒがａであるヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ６リバースプライマー）
　上記の（Ｆ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｆ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｆ）配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ５リバースプライマー）
　上記の（Ｇ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｇ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｇ）配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｒ７リバースプライマー）
　上記リバースプライマー（Ｃ１）、（ｃ１－１）、（ｃ１－２）及び（ｃ１－３）は、例えば、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２－１）及び（ｃ２－１）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２－２）及び（ｃ２－２）は、例えば、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｃ２－３）及び（ｃ２－３）は、例えば、マイコプラズマ・ハイオリニスの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｄ）及び（ｄ）は、例えば、アコレプラズマ・レイドラウィイの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｅ１）及び（ｅ１）は、例えば、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｅ２）及び（ｅ２）は、例えば、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｆ）及び（ｆ）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適しており、上記リバースプライマー（Ｇ）及び（ｇ）は、例えば、マイコプラズマ・シノビアエの検出に適している。
　本発明におけるプローブとしては、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドである限り特に制限されないが、配列番号３３のヌクレオチド番号７～１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましく、配列番号４４～４８のヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドがより好ましい。本発明のセットは、プローブを１種のみ含んでいてもよいが、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、好ましくは以下の（Ｈ）～（Ｌ）から選択される２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上、さらにより好ましくは５種のプローブを含んでいることが好ましい。
（Ｈ）：配列番号３４のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがａであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１９個～２５個、より好ましくは２０個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－１プローブの上位概念）
（Ｉ）：配列番号３５のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがｇであり、ｙがｔである配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１９個～２５個、より好ましくは２０個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－２プローブの上位概念）
（Ｊ）：配列番号３６のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがａであり、ｙがｔである配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１９個～２５個、より好ましくは２０個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－３プローブの上位概念）
（Ｋ）：配列番号３７のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｇであり、ｒがｇであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１９個～２５個、より好ましくは２０個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－４プローブの上位概念）
（Ｌ）：配列番号３８のヌクレオチド配列（配列番号３３のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号３３のｓがｃであり、ｒがａであり、ｙがｃである配列）のうち、１７個～２６個（好ましくは１９個～２５個、より好ましくは２０個～２４個）の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ２プローブの上位概念）
　上記の（Ｈ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｈ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｉ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｊ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｊ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｋ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｋ）のオリゴヌクレオチドが好ましく、上記（Ｌ）のオリゴヌクレオチドとしては、以下の（ｌ）のオリゴヌクレオチドが好ましい。
（ｈ）：配列番号３９のヌクレオチド配列（配列番号３４のヌクレオチド番号２～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－１プローブ）
（ｉ）：配列番号４０のヌクレオチド配列（配列番号３５のヌクレオチド番号２～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－２プローブ）
（ｊ）：配列番号４１のヌクレオチド配列（配列番号３６のヌクレオチド番号２～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－３プローブ）
（ｋ）：配列番号４２のヌクレオチド配列（配列番号３７のヌクレオチド番号２～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ１－４プローブ）
（ｌ）：配列番号４３のヌクレオチド配列（配列番号３８のヌクレオチド番号２～２３のヌクレオチド配列）からなるオリゴヌクレオチド：（Ｐ２プローブ）
　上記プローブ（Ｈ）及び（ｈ）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・ハイオリニス、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出に適しており、中でも、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・ハイオリニス、アコレプラズマ・レイドラウィイ、ウレアプラズマ・ウレアリティカムの検出により適している。また、上記プローブ（Ｉ）及び（ｉ）は、例えば、マイコプラズマ・ガリセプティカムの検出に適している。また、上記プローブ（Ｊ）及び（ｊ）は、例えば、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・シノビアエの検出に適しており、中でも、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・プリマタム、マイコプラズマ・シノビアエの検出により適している。また、上記プローブ（Ｋ）及び（ｋ）は、例えば、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエの検出に適している。
　上記プローブ（Ｌ）及び（ｌ）は、例えば、スピロプラズマ・シトリの検出に適している。
　本発明におけるフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブの好ましい組合せとしては、以下の表１の組合せＣＡ～ＣＩを挙げることができる。本発明のセットは、より多種のマイコプラズマを検出する観点から、かかる組合せＣＡ～ＣＩから選択される２種（好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、より好ましくは６種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種以上、特に好ましくは９種）の組合せを含んでいることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記組合せＣＡは、検出対象として、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・サリバリウムを含んでおり、上記組合せＣＢは、検出対象として、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、マイコプラズマ・プリマタムを含んでおり、上記組合せＣＣは、検出対象として、マイコプラズマ・ハイオリニスを含んでおり、上記組合せＣＤは、検出対象として、マイコプラズマ・シノビアエを含んでおり、上記組合せＣＥは、検出対象として、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・ニューモニアエを含んでおり、上記組合せＣＦは、検出対象として、アコレプラズマ・レイドラウィイを含んでおり、上記組合せＣＧは、検出対象として、マイコプラズマ・ガリセプティカムを含んでおり、上記組合せＣＨは、検出対象として、ウレアプラズマ・ウレアリティカムを含んでおり、上記組合せＣＩは、検出対象として、スピロプラズマ・シトリを含んでいる。
　上記の各フォワードプライマーや各リバースプライマーは、それぞれのヌクレオチド配列において、１又は数個（例えば１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されていても、それぞれが検出対象とするマイコプラズマ群に特異的な標的核酸を増幅することができるものであれば、本発明におけるプライマーとして使用することができる。本発明におけるフォワードプライマーやリバースプライマーは、リン酸トリエチル法や、リン酸ジエステル法等の常法により、通常用いられるＤＮＡ合成装置等を利用して合成することができる。
　本発明におけるプローブは、対応するプライマー対による増幅産物（アンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることによって、二重鎖分子（ハイブリッド）を形成し得る一本鎖核酸である。かかる一本鎖核酸としては、プローブとしての安定性に優れていることから、一本鎖ＤＮＡが好ましく挙げられる。上記の各プローブは、それぞれのヌクレオチド配列と８５％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、それぞれが検出対象とするマイコプラズマ群の増幅産物に特異的にハイブリダイズすることができるものであれば、本発明におけるプローブとして使用することができる。本発明におけるプローブは、リン酸トリエチル法や、リン酸ジエステル法等の常法により、通常用いられるＤＮＡ合成装置等を利用して合成することができる。
　本発明におけるプローブは、対応するプライマー対による増幅産物を検出するために標識物質で標識されていることが好ましく、迅速、高感度で検出する観点から、蛍光物質で標識されていることがより好ましく、蛍光物質と消光物質で二重標識されていることがより好ましく、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブであることがさらに好ましい。ＴａｑＭａｎプローブは、通常、核酸プローブの５’末端を蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾し、３’末端を消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾する。レポーター蛍光色素の例としては６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６－カルボキシ－４，７，２’，７’－テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン）等のフルオレッセイン系蛍光色素が挙げられ、クエンチャー蛍光色素の例としては、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）等のローダミン系蛍光色素が挙げられるが、本発明においては、配列番号５の塩基配列を用いつつ、Ｔｍ値を対応するプライマー対のＴｍ値よりも８～１０℃程度高くするために、非蛍光消光物質であるminor groove binder （ＭＧＢ）が好適に用いられる。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイムＰＣＲ用キットに含まれているのでそれを用いることができる。
（本発明におけるキット）
　本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキット（以下、単に「本発明のキット」とも表示する。）としては、フォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されている限り特に制限されない。固体支持体上に固定されているプローブを用いると、増幅産物をより迅速に検出し得る点で好ましい。本発明における「固体支持体」とは、プローブのオリゴヌクレオチドを結合できる基材を意味し、例えば、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、膜（ナイロン、ニトロセルロースなど）、ビーズ（樹脂など）、金属微粒子、基板（ガラス、シリコン、樹脂など）などが挙げられる。固体支持体上へのプローブの固定化は、共有結合、非共有結合のいずれを利用してもよく、マイクロプレートを用いる場合、そのウェル内にプローブ溶液を滴下して単に乾燥させるだけであってもよい。
（マイコプラズマを検出する方法）
　本発明のマイコプラズマを検出する方法は、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
（ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
（ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
（ｃ）上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在するか否かを検出する工程ｃ：
を含む方法である限り特に制限されない。かかる方法によって、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出することができる。
　本発明における「マイコプラズマ」とは、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属に属する細菌だけでなく、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、メソプラズマ（Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ）属、エントモプラズマ（Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａ）属、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属、アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）属、アステロプラズマ（Ａｓｔｅｒｏｌｅｐｌａｓｍａ）属、及びサーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属を包含するモリクテス（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）綱に属する細菌を意味するが、中でも、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、スピロプラズマ属、アコレプラズマ属に属する細菌が好ましく挙げられ、中でも、マイコプラズマ属に属する細菌がより好ましく挙げられる。本発明の検出対象として特に好ましいマイコプラズマとしては、マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）、及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマが挙げられる。
　本発明における「被検試料」としては特に制限されず、哺乳類、爬虫類、両生類、鳥類等の動物や植物などの培養細胞、細胞培養上清、生体試料などが挙げられる。なお、被検試料からＤＮＡを抽出する前に、必要に応じて、濾過、不純物除去などの前処理を行ってもよい。
　上記工程ａとしては、被検試料からＤＮＡを抽出する工程である限り特に制限されない。被検試料からＤＮＡを抽出する方法としては、常法を用いることができ、例えば、フェノール／クロロホルム法等の液－液抽出法や、担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、試薬メーカーにより市販されているQIAamp（登録商標）DNA Mini Kit（QIAGEN社製）、Loopamp（登録商標）SR DNA抽出キット（栄研化学株式会社製）等の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。
　QIAamp（登録商標）DNA Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて被検試料からＤＮＡを抽出する方法の一例を以下に説明する。
　マイクロチューブに、被検試料を２００μＬ採取する。マイクロチューブ内のサンプルに、２０μＬのプロテイナーゼＫ、及び、２００μＬのBuffer ALを添加した後、ボルテックスを用いて１５秒間撹拌する。マイクロチューブを、５６℃で１０分間保温する。サンプルに２００μＬのエタノール（１００％）を添加した後、ボルテックスを用いて１５秒間攪拌する。サンプルをQIAamp Mini spin Column（2mL collection tube付属）に移した後、室温及び６０００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移し、サンプルに５００μＬのBuffer AW1を加える。室温及び６０００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移し、サンプルに５００μＬのBuffer AW2を加える。室温及び２００００×ｇで３分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを新しい2mL collection tubeに移した後、室温及び２００００×ｇで１分間遠心する。前述のQIAamp Mini spin Columnを1.5 mL tubeに移し、メンブレンに２００μＬのBuffer AEを加える。室温で１分間保温した後、室温及び６０００×ｇで１分間遠心し、ＤＮＡ抽出液を得る。カラムは廃棄する。
　上記工程ｂとしては、上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程である限り特に制限されない。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲとは、リアルタイム定量ＰＣＲにおいて、複数（２対以上又は３対以上）のプライマー対を１つの増幅反応場において同時に用いるＰＣＲであり、リアルタイム定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）とは、ＰＣＲによる増幅産物の量をリアルタイムでモニターし解析する手法である。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲは、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。かかるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲは、上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマー対のセット又は本発明のキットを用いること以外は、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの通常の方法を用いることができる。マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの通常の方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第４版」（Green及びSambrook、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２０１２年）や、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ用のキット（例えばBrilliant Multiplex QPCR Master Mix（アジレントテクノロジー社製）等）の取扱説明書などで説明されている。リアルタイム定量ＰＣＲにおいて、増幅産物を検出する方法としては、インターカレーター法とプローブ法が主に知られているが、マイコプラズマをより高感度、高精度に検出する観点から、プローブを用いて増幅産物を検出するプローブ法が好ましく挙げられる。
　本発明におけるフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブの使用濃度としては、マイコプラズマの検出が可能である限り特に制限されず、当業者であれば使用濃度を適宜調整して用いることができるが、例えば、０．００５～３μＭの範囲内を挙げることができ、０．０１～１μＭの範囲内を好ましく挙げることができる。
　マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法の好ましい方法として、例えば以下のＡ法やＢ法を挙げることができる。
（Ａ法）
　０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、被検試料由来のＤＮＡ溶液を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行うことができる。ＰＣＲ用の反応液は、1×PCR Gold Buffer (１５ｍＭ Tris-HCl (ｐＨ８．０),　５０ｍＭ　ＫＣｌ)（ＡＢＩ社製）、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２ （ＡＢＩ社製）、６０ｍＭトレハロース、２００μＭ each dNTPs（Trilink社製））、１．２５Ｕのamplitaq Gold DNA polymerase、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４－１、０．１２５μＭのＲ４－２、０．１２５μＭのＲ４－３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１－１、０．０４５μＭのＰ１－２、０．０４５μＭのＰ１－３、０．０４５μＭのＰ１－４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製することができる。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の活性化の後、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）というサイクルを４５サイクル行うことができる。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出することができる。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いることができる。ネガティブコントロールにはDistilled WaterDeionized, Sterile（ニッポンジーン社製）を用いることができる。
（Ｂ法）
　０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、被検試料由来のＤＮＡ溶液を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行うことができる。ＰＣＲ用の反応液は、1× PCR Buffer (７５ｍＭTris-HCl (ｐＨ８．８), ２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４,３ｍＭ　ＭｇＣｌ２, ０．０１％ (v/v) Tween 20, ２５０μＭ each dNTPs)、１．２５ＵのTaq DNA polymerase (Thermo scientific社製) 、５μｇのanti-taq high (TOYOBO社製)、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４－１、０．１２５μＭのＲ４－２、０．１２５μＭのＲ４－３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１－１、０．０４５μＭのＰ１－２、０．０４５μＭのＰ１－３、０．０４５μＭのＰ１－４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製することができる。ＰＣＲ条件は、９５℃、１分間のPreDenatureの後、９５℃、５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）を４５サイクル行うことができる。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出することができる。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いることができる。ネガティブコントロールにはDistilled WaterDeionized, Sterile（ニッポンジーン社製）を用いることができる。
　マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲの実施や、その増幅産物の検出は、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)などの、市販されているリアルタイムＰＣＲシステムを用いて行うことができる。
　本発明のマイコプラズマを検出する方法における、マイコプラズマの検出限界感度は、通常１００ｃｆｕ／ｍＬ以下であり、好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｃｆｕ／ｍＬ以下である。特に、マイコプラズマ・アルギニニ（好ましくはＡＴＣＣ ２３８３８）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（好ましくはＮＢＲＣ１５８５４）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（好ましくはＮＢＲＣ１４８５５）、マイコプラズマ・ハイオリニス（好ましくはＮＢＲＣ１４８５８）、マイコプラズマ・オラーレ（好ましくはＮＢＲＣ１４４７７）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（好ましくはＮＢＲＣ１４４０１）、マイコプラズマ・シノビアエ（好ましくはＡＴＣＣ２５２０４）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（好ましくはＮＢＲＣ１４４００）、スピロプラズマ・シトリについての検出限界感度は、好ましくは１０ｃｆｕ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｃｆｕ／ｍＬ以下である。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［マイコプラズマを検出するためのプライマー及びプローブの設計］
　極めて多種のマイコプラズマを特異的に検出し得るプライマー及びプローブを設計するために、図１の下パネルの“Mollicutes species”に記載のマイコプラズマのゲノム配列と、図３に記載の他の細菌、真菌及び哺乳類のゲノム配列を収集してアラインメントを作成し、解析を行った。そして、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び両遺伝子間のスペーサー領域のうち、特定の領域が、細菌の種類毎に特有な配列を有していながらも、マイコプラズマ間では比較的高度に保存されていることを見いだし、この特定の領域に基づいて、多種のマイコプラズマを特異的に検出し得るプライマー及びプローブの設計を行った。すなわち、マイコプラズマのその特定の領域のゲノム配列又はその相補配列にはアニールするが、他の細菌のそれらの配列にはアニールしない（ミスマッチが多い）と予想される配列をフォワードプライマー又はリバースプライマーとし、また、それらのプライマーによる増幅産物に含まれる別の特定の領域の配列又はその相補配列にはハイブリダイズするが、他の細菌のそれらの配列にはハイブリダイズしないと予想される配列をプローブとした（図１の上パネルや、図７－１～図７－３参照）。一例として、マイコプラズマ（マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ハイオリニス、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・フェルメンタンス、スピロプラズマ・シトリ）と、マイコプラズマではないクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）とのゲノム配列を比較した結果の一部を図６に示す。
　図１の下パネルに示すように、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４－１リバースプライマー（配列番号２５）と、Ｐ１－１（配列番号３９）又はＰ１－３（配列番号４１）プローブとがセット（組合せＡ）（Group 1aのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４－２リバースプライマー（配列番号２６）と、Ｐ１－１（配列番号３９）又はＰ１－３（配列番号４１）プローブとがセット（組合せＢ）（Group 1bのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ４－３リバースプライマー（配列番号２７）と、Ｐ１－１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＣ）（Group 1cのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ７リバースプライマー（配列番号２０）と、Ｐ１－３プローブ（配列番号４１）とがセット（組合せＤ）（Group 6のマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ１リバースプライマー（配列番号２１）と、Ｐ１－４プローブ（配列番号４２）とがセット（組合せＥ）（Group 2のマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ２リバースプライマー（配列番号１７）と、Ｐ１－１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＦ（Group 4のマイコプラズマを対象））となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ３リバースプライマー（配列番号２８）と、Ｐ１－１プローブ（配列番号３９）とがセット（組合せＧ）（Group 3aのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ１フォワードプライマー（配列番号４）と、Ｒ６リバースプライマー（配列番号２９）と、Ｐ１－２プローブ（配列番号４０）とがセット（組合せＨ）（Group 3bのマイコプラズマを対象）となり、Ｆ２フォワードプライマー（配列番号１３）と、Ｒ５リバースプライマー（配列番号１９）と、Ｐ２プローブ（配列番号４３）とがセット（組合せＩ）（Group 5のマイコプラズマを対象）となる。なお、図１の下パネルから分かるように、上記組合せＡは、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ブカーレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・オラーレ、及び、マイコプラズマ・サリバリウムを検出ターゲットとしており、上記組合せＢは、マイコプラズマ・フェルメンタンス、マイコプラズマ・リポフィラム、及び、マイコプラズマ・プリマタムを検出ターゲットとしており、上記組合せＣは、マイコプラズマ・ハイオリニスを検出ターゲットとしており、上記組合せＤは、マイコプラズマ・シノビアエを検出ターゲットとしており、上記組合せＥは、マイコプラズマ・ゲニタリウム、及び、マイコプラズマ・ニューモニアエを検出ターゲットとしており、上記組合せＦは、アコレプラズマ・レイドラウィイを検出ターゲットとしており、上記組合せＧは、マイコプラズマ・ガリセプティカムを検出ターゲットとしており、上記組合せＨは、ウレアプラズマ・ウレアリティカムを検出ターゲットとしており、上記組合せＩは、スピロプラズマ・シトリを検出ターゲットとしている。上記セットＡ～Ｉの各プライマー及びプローブを、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。
［プライマー及びプローブのセットによるマイコプラズマ検出の感度測定試験］
　実施例１で作製したセットＡ～Ｉの各プライマー及びプローブが、各種マイコプラズマをどの程度の感度で測定し得るかを確認するために、以下のような、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験を行った。
（材料）
マイコプラズマ・アルギニニ（ＡＴＣＣ２３８３８）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（ＮＢＲＣ１５８５４）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（ＮＢＲＣ１４８５５）、マイコプラズマ・ハイオリニス（ＮＢＲＣ１４８５８）、マイコプラズマ・オラーレ（ＮＢＲＣ１４４７７）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（ＮＢＲＣ１４４０１）、マイコプラズマ・シノビアエ（ＡＴＣＣ２５２０４）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（ＮＢＲＣ１４４００）、スピロプラズマ・シトリ（ＡＴＣＣ２７５５６）。
5 Units/μLのAmplitaq Gold DNA polymerase （ＡＢＩ社製）。
Ampitaq Gold付属試薬(ABI)：10×PCR Buffer (150 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM KCl), 25 mM MgCl2, 10 mM each dNTP mix。
Distilled Water, Deionized, Sterile（ニッポンジーン社製）。
（方法：Ａ法）
　０．２ｍＬチューブに反応液を４０μＬと、上記のいずれかのマイコプラズマのＤＮＡ溶液（５，１０，１００，又は１０００ｃｆｕ／reaction）を１０μＬ加え、トータル５０μＬでＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ用の反応液は、1×PCR Gold Buffer (15 mM Tris-HCl (pH8.0),50 mM KCl)（ＡＢＩ社製）、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ＡＢＩ社製）、６０ｍＭトレハロース、２００μＭ each dNTPs（ＡＢＩ社製））、１．２５Ｕのamplitaq Gold DNA polymerase、フォワードプライマー（０．５μＭのＦ１、０．２μＭのＦ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、リバースプライマー（０．５μＭのＲ１、０．３μＭのＲ２、０．１５μＭのＲ３、０．１２５μＭのＲ４－１、０．１２５μＭのＲ４－２、０．１２５μＭのＲ４－３、０．２μＭのＲ５、０．１５μＭのＲ６、０．１２５μＭのＲ７）（筑波オリゴサービス社に製造委託）、蛍光プローブ（０．０４５μＭのＰ１－１、０．０４５μＭのＰ１－２、０．０４５μＭのＰ１－３、０．０４５μＭのＰ１－４及び０．００２μＭのＰ２）（筑波オリゴサービス社に製造委託）を混合して調製した。ＰＣＲ条件は、９５℃、１０分間の活性化の後、９５℃、１５秒間の変性、６０℃、１分間のアニールと伸張（シグナル検出）というサイクルを４５サイクル行った。ＰＣＲ産物の濃度は、蛍光プローブのシグナルを検出することによって算出した。これらのマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験には、LightCycler 480 (Roche diagnostics社製)というリアルタイムＰＣＲシステムを用いた。
　この試験の結果を図２の左側（「本検出法」）に示す。また、比較対象方法として、tuf遺伝子の保存領域を利用した従来公知のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法（非特許文献１）を実施した。その結果を図２の右側（「参考論文記載の検出法」）に示す。これらの結果から、本発明の検出法は、類似する従来の検出法と比較して、同等か又はそれより優れた検出感度が得られることが示された。例えば、比較対象方法では、５ｃｆｕ／reactionのマイコプラズマ・フェルメンタンスを３サンプルとも検出できなかったが（０／３）、本発明の検出法では、３サンプルとも検出することができた（３／３）。また、本発明の検出法では、マイコプラズマ・ガリセプティカム、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・シノビアエ、アコレプラズマ・レイドラウィイ及びスピロプラズマ・シトリに対して、比較対象方法よりも格段に優れた検出感度が得られることが示された。
［マイコプラズマ以外の細菌との交差反応性の確認］
　本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法におけるフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブについて、マイコプラズマ以外の他の種類の細菌、真菌及び哺乳類由来細胞に対する交差反応性を確認した。かかる他の種類の細菌等として、図３に列挙された細菌等について、実施例２の方法と同様の方法で本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法を行ったところ、蛍光プローブのシグナルは検出されなかった。このように、図３に列挙された細菌、真菌及び哺乳類由来細胞に対する交差反応性は否定された。また、この他に、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bartonella bacilliformis、Bartonella grahamii、Borrelia duttonii、Borrelia recurrentis、Campylobacter curvus、Campylobacter hominis、Chlamydia muridarum、Chlamydia trachomatis、Chlamydophilia pneumonia、Clostridium botulinum、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Corynebacterium diphtheriae、Erysipelothrix rhusiopathiae、Fusobacterium necrophorum、Haemophilus influenza、Helicobacter pylori、Kineococcus radiotolerans、Lactobacillus brevis、Lactobacillus helveticus、Listeria monocytogenes、Listeria welshimeri serovar6b str、Micrococcus luteus、Moraxella catarrhalis、Moraxella lacunata、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis alpha 14、Nocardia carnea、Nocardia farcinica、Pediococcus pentosaceus、Pseudomonas putida、Rhodococcus jostii、Rickettsia africae、Rickettsia peacockii、Streptococcus sanguinis、Streptococcus suis、Streptococcus thermophilus、Treponema denticola、Treponema pallidumについて、公知の配列データベースから入手したそれらの細菌の遺伝子配列情報と、本発明のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの配列とを比較した結果、これらの細菌は、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法における、マイコプラズマに対する交差反応性が否定されると推定された。図３に示されるように、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法は、マイコプラズマ以外のきわめて多種の細菌等に対して交差反応性がない、あるいはないと推定され、マイコプラズマに対する特異性がきわめて高いことが示された。
［バリエーションプライマーの感度及び交差反応性の確認］
　Ｆ１フォワードプライマー、Ｒ１リバースプライマー、あるいはこれらを改変したバリエーションプライマーについて、マイコプラズマ検出の感度、及び、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）に対する交差反応性の確認を試みた。
　また、Ｆ１フォワードプライマーのバリエーションとして、以下の表２記載のフォワードプライマーを設計し、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。なお、これらのバリエーションのプライマーのヌクレオチド数や、Ｆ１フォワードプライマーとの関係（Ｆ１フォワードプライマーに対して、５’末端側又は３’末端側に、何ヌクレオチド延伸又は短縮したか）を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、Ｒ１リバースプライマーのバリエーションとして、以下の表３記載のリバースプライマーを設計し、オリゴヌクレオチド合成装置により合成した。なお、これらのバリエーションのプライマーのヌクレオチド数や、Ｒ１リバースプライマーとの関係（Ｒ１リバースプライマーに対して、５’末端側又は３’末端側に、何ヌクレオチド延伸又は短縮したか）を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記のＦ１フォワードプライマーやそのバリエーションプライマー、あるいは、上記のＲ１リバースプライマーのバリエーションプライマーの各配列の位置関係を図４に示す。なお、図４における移動度とは、基準となるプライマー（フォワードプライマーの場合はＦ１、リバースプライマーの場合はＲ１）の３’末端のヌクレオチドに対して、バリエーションプライマーの３’末端のヌクレオチドの位置がどちら側に何ヌクレオチド移動したかを表している。例えば、Ｍ１フォワードプライマーは、Ｆ１フォワードプライマーの３’末端側のヌクレオチドを１つ延伸しているため、移動度「＋１」となり、ＭｙＴＦ－６フォワードプライマーは、Ｆ１フォワードプライマーの３’末端側のヌクレオチドを１つ短縮しているため、移動度「－１」となる。
　Ｆ１フォワードプライマー及びそのバリエーションプライマーと、Ｒ１リバースプライマー及びそのバリエーションプライマーとの全ての組合せ（以下の表４参照）について、本発明のマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ法（上記実施例２参照）を行った。その際、細菌としては、マイコプラズマ・ゲニタリウム（約１０６ｃｆｕ／reaction）や、ラクトバチルス・ブルガリクス（約１０６ｃｆｕ／reaction）を用い、蛍光プローブとしては、Ｐ１－１，Ｐ１－２，Ｐ１－３，Ｐ１－４及びＰ２を混合したものを用いた。また、ネガティブコントロールには、Distilled WaterDeionized, Sterile (ニッポンジーン社製)を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　このマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲ試験における各サンプルの検出結果を図５に示す。未検出の場合は「－」で表し、検出の場合はｃｔ値を示した。ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数であり、ｃｔ値が小さいほどその対象をより高感度で検出していることを表す。図５の結果から分かるように、フォワードプライマーとして、Ｍ１、Ｆ１、ＴＦ、ＭｙＴＦ－１、ＭｙＴＦ－５を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６－２、ＴＲ、ＴＲ－２、Ｒ１のいずれを用いた場合であっても、マイコプラズマではないラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなく、マイコプラズマ・ゲニタリウムを高感度で検出した。一方、フォワードプライマーとしてＭｙＴＦ－３、ＭｙＴＦ－４、ＭｙＴＦ－６を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６－２、ＴＲ－２、Ｒ１を用いた際にはラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなかったが、リバースプライマーとしてＴＲを用いた場合は、ラクトバチルス・ブルガリクスと交差反応性を示した。ただし、ＭｙＴＦ－３、ＭｙＴＦ－４、ＭｙＴＦ－６の３種のフォワードプライマーの中では、ラクトバチルス・ブルガリクスに対するＭｙＴＦ－６のｃｔ値は比較的高く（４２．２５）、ＭｙＴＦ－６はこれら３種のフォワードプライマーの中ではラクトバチルス・ブルガリクスに対する交差反応性が最も低かった。また、フォワードプライマーとしてＭｙＴＦ－２を用いた場合は、リバースプライマーとしてＭ６－２を用いた際にはラクトバチルス・ブルガリクスを検出することはなかったものの、リバースプライマーとしてＴＲ、ＴＲ－２、Ｒ１を用いた場合は、ラクトバチルス・ブルガリクスと交差反応性を示した。
　以上の図５の結果から、フォワードプライマーとしては、Ｆ１、Ｍ１、ＴＦ、ＭｙＴＦ－１、ＭｙＴＦ－５及びＭｙＴＦ－６が好ましく、中でも、Ｆ１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－１フォワードプライマー、ＭｙＴＦ－５フォワードプライマーがより好ましいことが示された。
　本発明によれば、より多種のマイコプラズマを、より迅速・簡便・高感度・高精度に検出できるマイコプラズマの検出方法や、かかる検出のためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットや、キットを提供することができる。本発明は、生物由来医薬品や再生医療や細胞治療のための細胞培養の現場におけるマイコプラズマ汚染の検出の他、マイコプラズマ感染症の診断などにも利用することができる。

Claims (15)

  1. 　マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットであって、
    　前記セットが、１種又は２種以上のフォワードプライマーと、２種又は３種以上のリバースプライマーと、１種又は２種以上のプローブとを含み、
    　前記プローブが、前記フォワードプライマー及び前記リバースプライマーによる増幅産物を特異的に検出するためのプローブであり、
    　前記フォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列（caaggtatccc）を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号１４、１７～２０の１種又は２種以上のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであり、前記プローブが、配列番号３３のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、セット。
  2. 　１種又は２種以上のフォワードプライマーが、配列番号１のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号１４～２７のヌクレオチド配列（caaggtatccctac）を含むヌクレオチド配列からなる１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のセット。
  3. 　１種又は２種以上のフォワードプライマーが、以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載のセット：
    （Ａ）：配列番号２のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号２のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
    （Ｂ）：配列番号３のヌクレオチド配列のうち、１７個～３０個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択され、かつ、配列番号３のヌクレオチド番号１４～２４のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであるフォワードプライマー：
  4. 　２種のフォワードプライマーを含み、前記２種のフォワードプライマーが、配列番号４～７、１１及び１２から選択されるいずれかのヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のセット。
  5. 　リバースプライマーの少なくとも１種が、配列番号１４のヌクレオチド番号３～２０のヌクレオチド配列（wsccaaggcatccaccah）を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のセット。
  6. 　２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下の（Ｃ１）、（Ｃ２－１）、（Ｃ２－２）、（Ｃ２－３）、（Ｄ）、（Ｅ１）、（Ｅ２）、（Ｆ）及び（Ｇ）から選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のセット：
    （Ｃ１）：配列番号１５のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｃ２－１）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｃ２－２）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがｃで、ヌクレオチド番号２２のｗがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｃ２－３）：配列番号１６のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２０のｍがａで、ヌクレオチド番号２２のｗがｔであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｄ）：配列番号１７のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｅ１）：配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｇであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがｇであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｅ２）配列番号１８のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド番号２のｓがｃであり、ヌクレオチド番号４及び９のｒがａであるヌクレオチド配列のうち、１７個～２４個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｆ）：配列番号１９のヌクレオチド配列のうち、１７個～２５個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｇ）：配列番号２０のヌクレオチド配列のうち、１７個～２３個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
  7. 　２種又は３種以上のリバースプライマーが、以下のオリゴヌクレオチドから選択される２種又は３種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載のセット：
    配列番号２１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２４のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２５のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２６のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号１７のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２８のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号１９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    配列番号２０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
  8. 　プローブが、配列番号３３のヌクレオチド番号７～１６のヌクレオチド配列（sggrtggaty）又はその相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載のセット。
  9. 　１種又は２種以上のプローブが、以下の（Ｈ）～（Ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載のセット：
    （Ｈ）配列番号３４のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｉ）配列番号３５のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｊ）配列番号３６のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｋ）配列番号３７のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （Ｌ）配列番号３８のヌクレオチド配列のうち、１７個～２６個の連続するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列又はその相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
  10. 　１種又は２種以上のプローブが、以下の（ｈ）～（ｌ）から選択される１種又は２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載のセット：
    （ｈ）配列番号３９のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （ｉ）配列番号４０のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （ｊ）配列番号４１のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （ｋ）配列番号４２のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド：
    （ｌ）配列番号４３のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
  11. 　プローブが、５’末端を蛍光物質で、３’末端を消光物質で修飾されているTaqMan（登録商標）プローブであることを特徴とする請求項１～１０のいずれかに記載のセット。
  12. 　マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出するためのキットであって、
    　前記キットが、請求項１～１１のいずれかに記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとプローブのセットと、固体支持体とを備え、前記プローブが前記固体支持体上に固定されていることを特徴とする、キット。
  13. 　マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲにより被検試料中のマイコプラズマを検出する方法であって、
    （ａ）被検試料からＤＮＡを抽出する工程ａ：
    （ｂ）上記工程ａで抽出したＤＮＡを鋳型とし、請求項１～１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲを行う工程ｂ：及び、
    （ｃ）請求項１～１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるプローブを用いて、上記工程ｂにおけるマルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物を検出することにより、前記被検試料中にマイコプラズマが存在しているか否かを検出する工程ｃ：
    を含む方法。
  14. 　工程ｃにおける、マルチプレックスリアルタイム定量ＰＣＲによる増幅産物の検出が、請求項１～１１のいずれかに記載のセット又は請求項１２に記載のキットにおけるプローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じるか否かを検出することによりなされることを特徴とする請求項１３に記載のマイコプラズマを検出する方法。
  15. 　マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニアエ（Mycoplasma pneumoniae）、アコレプラズマ・レイドラウィイ（Acholeplasma laidlawii）、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）及びスピロプラズマ・シトリ（Spiroplasma citri）からなる群から選択される１種又は２種以上のマイコプラズマの検出限界感度が１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のマイコプラズマを検出する方法。
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