WO2015199406A1 - L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 - Google Patents

L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 Download PDF

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tryptophan
gene
microorganism
escherichia
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정기용
김경림
이석명
이광호
이근철
홍형표
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씨제이제일제당 주식회사
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01012—Phosphogluconate dehydratase (4.2.1.12)

Definitions

  • the present invention relates to an Escherichia genus microorganism having L-tryptophan production ability, and a method for producing L-tryptophan using the microorganism.
  • L-tryptophan is one of the essential amino acids has been widely used as feed additives, etc., and also has been widely used as pharmaceutical raw materials and health food materials such as infusion solution. As such, L-tryptophan may be produced through chemical synthesis, enzyme reaction, fermentation, etc., but direct fermentation using microorganisms is currently used.
  • L-tryptophan-producing strains Development of L-tryptophan-producing strains is initially carried out by mutation screening (Korean Patent No. 1987-0001813), or with the development of genetic engineering to overcome tryptophan feedback inhibition of biosynthetic pathway enzymes, or tryptophan biosynthesis enzymes.
  • the development of tryptophan-producing strains was carried out through enhanced enzyme synthesis of metabolic processes, such as enhanced expression.
  • the US patent relates to a method for enhancing the production of L-amino acids produced by a biosynthetic pathway using pyruvic acid as an intermediate by enhancing the activity of enzymes involved in the Entner-Doudoroff pathway, specifically 6-phospho It is a key feature to enhance the activity of gluconate dehydrogenase or 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase.
  • the present invention relates to the Escherichia spp. Microorganism having improved L-tryptophan production capacity and a method for producing L-tryptophan using the same. It was completed.
  • An object of the present invention is to provide a microorganism having L-tryptophan production capacity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for efficiently producing L-tryptophan using a microorganism having the L-tryptophan production ability.
  • the present invention provides Escherichia microorganisms having L-tryptophan production ability by attenuating or inactivating 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase. By providing this, L-tryptophan can be used to produce a higher yield efficiently and economically.
  • the present invention is a weakened or inactivated activity of the intrinsic 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase, Provided is an Escherichia microorganism having L-tryptophan production ability.
  • L-tryptophan refers to an aromatic L-amino acid having one of ⁇ -amino acids and an essential amino acid not synthesized in the body and having a chemical formula of C 11 H 12 N 2 O 2 .
  • Entner-Doudoroff pathway is one of the carbon metabolic pathways present in the Escherichia microorganism, and the carbon source introduced into the pathway is 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3. Catalyzes the conversion to glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvate through a two-step series of enzymatic reactions with deoxy-6-phosphogluconate aldolase. Path.
  • 6-phosphogluconate dehydratase (Edd; EC 4.2.1.12) is an enzyme involved in the Entner-Doudoroff pathway, 6-phospho-D-gluconate Means an enzyme catalyzing the reaction of converting to 2-dihydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate.
  • the enzyme may be specifically represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, without limitation, any sequence having the activity of the enzyme is included.
  • the gene encoding the 6-phosphogluconate dehydrogenase may be represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is included without limitation as long as the sequence capable of encoding the enzyme.
  • the term "2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase; Eda; EC 4.1.2.14) means Entner.
  • an enzyme involved in the -Doudoroff pathway it refers to an enzyme that catalyzes the reaction of converting 2-dihydro-3-deoxy-6-phospho-D-gluconate into glyceraldehyde-3-phosphate and pyruvic acid.
  • the enzyme may be specifically represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and any sequence having the activity of the enzyme is included without limitation.
  • the gene encoding the 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase may be represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as a specific example, without limitation, as long as the sequence can encode the enzyme Included.
  • Each of the enzymes is 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more, even more specifically 95% or more, as well as the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 above. Specifically, any amino acid sequence showing at least 98%, even more specifically, at least 99% homology, and any enzyme having substantially the same or equivalent potency as each of the above enzymes is included without limitation. In addition, as long as it is an amino acid sequence having such homology and exhibiting efficacy corresponding to each enzyme, it is obvious that enzyme variants having amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present invention.
  • each of the enzymes is not only the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4, but also 80% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically A base sequence showing at least 98%, more specifically, at least 99% homology, without limitation, includes a gene sequence encoding an enzyme having substantially the same or equivalent potency as each of the above enzymes.
  • the base sequence having such homology it is obvious that the base sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included in the scope of the present invention.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology may be sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules, such as score, identity, and similarity, using a computer program that aligns the sequence information and is readily available. Parameters can be determined by direct alignment (eg BLAST 2.0). In addition, homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • intrinsic activity refers to the active state of an enzyme that a microorganism possesses in its natural state or before modification of the enzyme.
  • the "enzyme activity is weakened compared to the intrinsic activity” means that the activity of the original microorganisms compared to the activity of the enzyme possessed in the natural state or the state before the modification is reduced.
  • the weakening is due to mutation of the gene encoding the enzyme and the activity of the enzyme itself is reduced compared to the activity of the enzyme originally possessed by the microorganism, and the inhibition of expression or translation of the gene encoding the same in the cell. If the overall degree of enzymatic activity is low compared to the native strain or the strain before modification, the concept also includes a combination thereof.
  • activation refers to a case in which the expression of the gene encoding the enzyme is not expressed at all as compared to the natural type strain or the strain before modification, and a case in which the expression is inactivated.
  • Attenuation or inactivation of such enzymatic activity can be achieved by the application of various methods well known in the art.
  • the method include a method of replacing a gene encoding the enzyme on a chromosome with a mutated gene such that the activity of the enzyme is reduced, including when the activity of the enzyme is removed; Introducing a mutation into an expression control sequence of a gene on a chromosome encoding said enzyme; Replacing the expression control sequence of the gene encoding the enzyme with a sequence having weak or no activity; Deleting all or part of a gene on a chromosome that encodes the enzyme; Introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to a transcript of a gene on the chromosome to inhibit translation from the mRNA to an enzyme; The method of artificially adding a sequence complementary to the SD sequence in front of the SD sequence of the gene encoding the enzyme to form a secondary structure to make the attachment of
  • a method for deleting part or all of a gene encoding an enzyme replaces a polynucleotide encoding an endogenous target protein in a chromosome with a polynucleotide or marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted through a bacterial chromosome insertion vector. This can be done by.
  • a method of deleting part or all of such genes a method of deleting genes by homologous recombination may be used.
  • part may vary depending on the type of polynucleotide, but may be specifically 1 to 300, specifically 1 to 100, and more specifically 1 to 50, but is not particularly limited thereto.
  • homologous recombination refers to genetic recombination occurring through linkage exchange at the locus of gene chains having homology with each other.
  • the method of modifying an expression control sequence is carried out by inducing a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, in the nucleic acid sequence of the expression control sequence, or by replacement with a weaker promoter. It may be carried out by a method such as.
  • the expression control sequence includes a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls the termination of transcription and translation.
  • a method of modifying a gene sequence on a chromosome may be performed by inducing a mutation in the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further weaken the activity of the enzyme, or by performing weaker activity. It can be carried out by replacing with a gene sequence that has been improved to have or a gene sequence that has been improved so that there is no activity.
  • the attenuation or inactivation of the activity encodes the gene encoding the 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase.
  • a transition mutation by insertion of one or more base pairs, a deletion mutation with a deletion of one or more base pairs in the gene, and a base pair that introduces a nonsense codon or a different codon in the gene It has been confirmed that this can be accomplished by one or more mutation methods selected from the group consisting of mutations.
  • the Escherichia microorganism may be specifically Escherichia coli , but is not limited thereto.
  • Microorganism having L-tryptophan production ability by the weakening or inactivation of the activity of the edd and eda in the present invention is not particularly limited.
  • Microorganisms with tryptophan production capacity for example, to attenuate or inactivate the activity of genes of the competitive pathway, modulators of the directional pathway of tryptophan operon, tryptophan influx, tryptophan influx and degradation genes Or microorganisms that overexpress the activity of tryptophan operon.
  • the method of weakening or deactivating the activity is as described above, and known methods are included without limitation.
  • the overexpression of tryptophan operon activity includes a known method without limitation, for example, a method of additionally inserting a polynucleotide containing an expression control site introduced by itself or externally part or all of the nucleotide sequence of the operon gene to the chromosome , A method of increasing the number of copies by introducing into a vector system, substituting other regulatory sequences for expression control regions that control the expression of genes, modifications in which all or part of the nucleotide sequence of the expression control regions are induced, It may include a method such as enhancing the operon activity by introducing a mutation, but is not limited thereto. Specifically, all or part of the pheA, trpR, mtr and tnaAB genes may be E. coli, which is deleted and / or overexpressed tryptophan operon.
  • genes and protein sequences used in the present invention including the edd, eda, pheA, trpR, mtr, tnaAB gene and tryptophan operon and the protein sequences they encode can be obtained from known databases, for example NCBI It can be obtained from GenBank, etc., but is not limited thereto.
  • the details of the pheA, trpR, mtr and tnaAB gene can refer to the contents described in Korean Patent Registration No. 10-0792095, the entire specification of the patent may be included as a reference of the present invention.
  • Entner results in inactivating the activities of 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase in various parent strains.
  • 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase activity was used regardless of the parent strain.
  • the activity of the intrinsic 6-phosphogluconate dehydrogenase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase of the present invention is weakened or inactivated, Culturing the Escherichia spp. Microorganism having L-tryptophan production capacity; And recovering L-tryptophan from the culture or the microorganism according to the culturing step of the microorganism.
  • the medium and other culture conditions used for the cultivation of the microorganism of the present invention may be any medium that is used for the cultivation of ordinary Escherichia microorganisms without particular limitation, but specifically, the microorganism of the present invention may be a suitable carbon source, nitrogen source. It can be cultured under aerobic conditions by adjusting the temperature, pH, etc. in a conventional medium containing the number of people, inorganic compounds, amino acids and / or vitamins.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, maltose, mannitol, sorbitol and the like; Alcohols such as sugar alcohols, glycerol, pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as organic acids, glutamic acid, methionine, lysine and the like.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winters, cassava, sugarcane residue and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (ie, reducing sugars).
  • Carbohydrates, such as molasses), and other appropriate amounts of carbon sources can be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extracts, malt extracts, corn steep liquor, casein hydrolysates, fish or their degradation products, skim soy cakes or their degradation products Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., peptones, NZ-amines, meat extracts, yeast extract
  • the personnel may include a first potassium phosphate, a second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • a first potassium phosphate sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like may be used, and other amino acids, vitamins and / or suitable precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture may specifically be from 30 ° C to 37 ° C, specifically, 27 ° C to 40 ° C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the desired amount of useful material is obtained, specifically, may be 10 hours to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the recovering L-tryptophan may be carried out using a suitable method known in the art according to the method of culturing the microorganism of the present invention, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method, to obtain the desired L-tryptophan from the culture solution. It can be recovered.
  • the recovery step may comprise a purification process.
  • pKD3 is used as a template, and about 1,100 pairs are obtained by PCR. Gene fragments were amplified. Then, the DNA fragments obtained through the PCR amplification were electrophoresed on a 0.8% agarose gel, eluted, and used as a template for the secondary PCR. Then, in order to obtain 5 'and 3' DNA fragments of the E. coli pheA gene, approximately 250 pairs of gene fragments were respectively generated by PCR using the chromosomes of E.
  • E. coli W3110 transformed with pKD46 was prepared as competent cells according to a method developed by Datsenko KA et al., followeded by introducing a 1,600 base pair sized gene fragment obtained by PCR to contain chloramphenicol (30 mg / L). Plated in LB solid medium. The obtained strain was further confirmed that pheA was inactivated with a size of 1,600 base pairs obtained by PCR using primers 3 and 6 to prepare a W3110 ⁇ pheA strain.
  • Proteins encoded by trpR having the sequence of SEQ ID NO: 8, mtr having the sequence of SEQ ID NO: 10, tnaAB genes having the sequences of SEQ ID NOs: 12 and 14 were inactivated using the primers of Table 3 below To prepare a W3110 ⁇ pheA ⁇ trpR ⁇ mtr ⁇ tnaAB strain.
  • a recombinant vector pCL1920-Ptrc-trpO was prepared by inserting the Ptrc promoter and tryptophan operon gene into the pCL1920 vector.
  • a plasmid of pCL1920 was recovered and treated with restriction enzymes HindIII and PstI, and the Ptrc promoter was composed of the pTrcHis B (invitrogen, USA) vector as a template, and primers 23 and 24. It was prepared by the PCR method of repeating the conditions of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 30 seconds. The prepared Ptrc promoter fragment was digested with restriction enzymes HindIII and PstI, and then ligated with pCL1920 to prepare pCL1920-Ptrc vector.
  • the pCL1920_Ptrc_trpO vector was prepared by treatment with PstI and alkaline phosphatase, and the tryptophan operon gene was amplified from chromosomal DNA of E. coli KCCM10812P (Korean Patent No. 10-0792095).
  • the first gene of the operon gene, trpE gene has a feedback resistant form.
  • PCR was performed by repeating 30 times the conditions of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 58 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 5 minutes using chromosomal DNA of E.
  • coli KCCM10812P as a template.
  • the obtained DNA fragment was ligated with the pCL1920_Ptrc vector prepared by treatment with PstI, and the resulting vector was named pCL1920_Ptrc_trpO (SEQ ID NO: 15).
  • PUCprmfmloxC was used as a template using primers 27 and primers 28 having a part of the edd-eda gene group and some nucleotide sequences of the chloramphenicol resistance gene of the pUCprmfmloxC gene, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C. About 1,200 pairs of gene fragments were amplified by a PCR method that repeated 30 times of polymerization conditions for 1 minute at.
  • DNA fragments obtained through PCR amplification were eluted after 0.8% agarose gel electrophoresis and used as a template for the second PCR.
  • Secondary PCR had 20 pairs of complementary sequences of the 5 'and 3' regions of the primary DNA fragment, eluting using primers 29 and 30 plus the 5 'and 3' regions of the edd-eda gene family.
  • Approximately 1,300 pairs of the gene fragments were amplified by PCR, which was repeated 30 times under conditions of denaturing the prepared primary PCR product at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and polymerizing at 72 ° C for 1 minute.
  • DNA fragments obtained through the above procedure were eluted after 0.8% agarose gel electrophoresis and used for recombination.
  • a target E. coli transformed with pKD46 was prepared in a competent state, and then a 1,300 base pair size gene fragment obtained by PCR was introduced and transformed.
  • the resulting strains were selected from LB with chloramphenicol resistance, and edd-eda with 1,626 base pairs in size obtained by PCR using primers 31 and 32 again. It was confirmed that the gene group was deleted.
  • the primary recombinant strain having chloramphenicol resistance removed pKD46 and then introduced pJW168 to remove the chloramphenicol marker gene from the cells (Gene, (2000) 247, 255-64). Finally, the obtained cells were confirmed to have been deleted as intended with 580 pairs of amplification products obtained by PCR with primers 31 and 32.
  • the vector prepared in Comparative Example 1 was introduced and transformed to produce strain W3110 ⁇ pheA ⁇ trpR ⁇ mtr ⁇ tnaAB ⁇ edd ⁇ eda / pCL1920-Ptrc-trpO having tryptophan production capacity.
  • the titer was evaluated using the strains prepared in Comparative Example 1 and Example 1. Cells were inoculated with platinum for titer evaluation, then incubated overnight in LB solid medium, and one platinum was inoculated in 25 ml flask titer medium having the composition of Table 1 below. After strain inoculation, the cells were incubated at 37 ° C. and 200 rpm for 42 hours, and the results obtained therefrom are shown in Table 2 below. All results used the average of three flask results.
  • the titer was evaluated using the deposited strain KCCM11166P and the strain prepared in Example 3.
  • the present inventors confirmed that tryptophan production increased in the inactivated strains of the edd-eda gene group based on the KCCM11166P strain, and named the strain "CA04-2800". KCCM) on November 15, 2013 and was given accession number KCCM11473P.

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Abstract

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 약화시키거나 불활성화시킴으로써, L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조 방법
본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.
L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제 등으로 널리 사용되어 왔으며, 또한 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 이와 같은, L-트립토판은 화학 합성법, 효소 반응법, 발효법 등을 통해 생산될 수 있으나, 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 주로 이용되고 있다.
L-트립토판 생산균주의 개발 방향은 초기에는 돌연변이 선별로 진행되거나(대한민국 등록특허 제1987-0001813호), 유전공학의 발달과 함께 생합성 경로 효소들의 트립토판 피드백 저해를 극복하는 방법, 혹은 트립토판 생합성 효소의 발현 강화와 같이 대사과정의 효소 합성 강화를 통해 트립토판 생산 균주의 개발이 진행되었다.
한편, L-아미노산의 생산을 향상시키고자 Entner-Doudoroff 경로를 이용하는 방법이 등장한 바 있다(US 등록특허 제7432085호). 상기 US 등록특허는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소의 활성을 증강시켜 피루브산을 중간물질로 사용하는 생합성 경로에 의해 생산되는 L-아미노산의 생산을 향상시키는 방법에 대한 것으로, 구체적으로 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 또는 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 증강시키는 것을 핵심 특징으로 하고 있다.
본 발명자들은 다른 L-아미노산들과 달리, L-트립토판의 경우에는 상기 Entner-Doudoroff 경로의 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 함께 약화시키거나 불활성화시키는 경우 L-트립토판 생산능이 현저히 향상된다는 것을 최초로 규명하였으며, 이를 이용하여 L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조 방법에 대한 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 L-트립토판을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 약화 또는 불활성화시킴으로써 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 제공하여, 이를 이용해 L-트립토판을 보다 고수율로 효율적이고 경제적으로 제조할 수 있는 효과를 나타낸다.
상기 과제를 해결하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "L-트립토판(L-tryptophan)"은 α-아미노산의 하나로, 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식이 C11H12N2O2인 방향족 L-아미노산을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "Entner-Doudoroff 경로"는 에스케리키아속 미생물 내 존재하는 탄소 대사 경로의 하나로서, 상기 경로로 유입된 탄소원이 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제에 의한 2단계의 일련의 효소 반응을 통하여, 글리세르알데하이드-3-포스페이트(Glyceraldehyde-3-phosphate) 및 피루브산(pyruvate)으로 전환되는 것을 촉매하는 경로이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "6-포스포글루코네이트 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydratase; Edd; EC 4.2.1.12)"는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소로서, 6-포스포-D-글루코네이트를 2-디하이드로-3-데옥시-6-포스포-D-글루코네이트로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소의 활성을 갖는 서열이라면 제한없이 포함된다. 또한, 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 2의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase; Eda; EC 4.1.2.14)"는 Entner-Doudoroff 경로에 관여하는 효소로서, 2-디하이드로-3-데옥시-6-포스포-D-글루코네이트를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 및 피루브산으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 구체적으로 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소의 활성을 갖는 서열이라면 제한없이 포함된다. 또한, 상기 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 4의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함된다.
상기 각 효소들은 상기 서열번호 1 또는 3으로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 더욱 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖으며 각 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 각 효소들을 코딩하는 유전자는 상기 서열번호 2 또는 4로 기재한 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.
상기 "효소의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것"은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 변형 전의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소된 것을 의미한다. 상기 약화는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.
상기 "불활성화"는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.
이러한 효소 활성의 약화 또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 구체적으로는 1 내지 100개, 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
구체적으로, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 상기 활성의 약화 또는 불활성화는 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자 내로, 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법을 통해 수행할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 상기 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로 본 발명에서 상기 edd 및 eda의 활성의 약화 또는 불활성화에 의하여 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물의 모균주는 트립토판 생산능을 가지는 에스케리키아속 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 트립토판 생산능을 가지는 미생물은, 그 예로, 트립토판 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, 트립토판 오페론의 방향성 경로의 조절자, 트립토판 유입유전자, 트립토판 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 트립토판 오페론의 활성을 과발현시킨 미생물일 수 있다. 상기 활성의 약화 또는 불활성화 방법은 상기에서 설명한 바와 같으며, 공지의 방법은 제한 없이 포함된다. 또한, 트립토판 오페론 활성의 과발현은 공지의 방법은 제한없이 포함되나, 그 예로 오페론 유전자의 염기서열 일부 또는 전부 그 자체 혹은 외부로부터 도입된 발현조절부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 유전자의 발현을 조절하는 발현조절부위를 다른 조절서열로 치환, 발현조절부위의 염기서열 전체 혹은 일부 돌연변이가 유발된 변형, 유전자 자체의 변이도입에 의한 오페론 활성 강화 등에 의한 방법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자의 전체 또는 일부가 결실, 및/또는 트립토판 오페론이 과발현된 대장균일 수 있다.
본 발명에서, edd, eda, pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 및 트립토판 오페론 및 이들이 코딩하는 단백질 서열을 비롯하여, 본 발명에서 사용되는 유전자 및 단백질 서열들은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자에 대한 구체적인 내용은 한국 특허등록 제10-0792095호에 기재되어 있는 내용을 참고할 수 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예들에 비추어, 다양한 모균주에서 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 불활성화시킨 결과, Entner-Doudoroff 경로를 갖고 있는 에스케리키아속 미생물이라면 모균주의 종류에 상관없이 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성을 함께 약화시키거나 불활성화시키는 경우에는 L-트립토판의 생산능이 유의적으로 향상되는 것으로 확인되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물의 배양 단계에 따른 배양물 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
본 발명에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 구체적으로는 27℃ 내지 40℃보다 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 L-트립토판을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-트립토판을 회수할 수 있다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
비교예 1: ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO인 모균주의 제작
(1) pheA , trpR , mtr 및 tnaAB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 불활성화된 야생형 균주의 제작
모균주의 트립토판 생합성경로를 강화하기 위해 경쟁경로의 유전자인 pheA, 트립토판 오페론과 방향성 경로의 조절자인 trpR, 트립토판 유입유전자인 mtr, 트립토판 유입 및 분해유전자인 tnaA 및 tnaB 를 모두 불활성화시켜 본 발명의 트립토판 생산능을 더욱 더 잘 확인할 수 있도록 하였다. 대장균 W3110 (ATCC®39936TM)에서 pheA 유전자에 의해 코딩되는 chorismate mutase/prephenate hydratase; trpR 유전자에 의해 코딩되는 trpR transcriptional repressor; mtr 유전자에 의해 코딩되는 tryptophan/Indole:H+ symporter; tnaA 및 tnaB 유전자에 의해 코딩되는 오페론 형태의 tryptophanase 및 trpytpophan:H+symporter를 유전자 상동 재조합에 의하여 모두 불활성화시켰다. 이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소(lambda Red recombinase)를 이용한 1단계 불활성화(one step inactivation) 방법을 사용하였으며(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, Jun 6;97(12):6640-5), 대한민국등록특허 제10-0792095호에 기반하여 불활성화를 진행하였다. 본 비교예 1을 포함하여, 후술하는 비교예 2 및 실시예 1, 3에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
구체적으로, 서열번호 6의 서열을 갖는 pheA 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜(Chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 프라이머 1 및 2를 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 1,100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 그 다음, 상기 PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 그 다음, 대장균 pheA 유전자의 5' 및 3' DNA 단편을 얻기 위하여, 프라이머 3과 4, 프라이머 5와 6을 이용하여 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 각각 증폭하였다. 그 다음, 상기 PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다.
상기에서, 프라이머 1과 4의 18쌍의 염기서열이 상보적이며, 프라이머 2와 5의 20 쌍의 염기서열이 상보적이기 때문에, 프라이머 1과 2를 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 3과 4로 얻어진 단편, 프라이머 5와 6으로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 상기 얻어진 PCR 단편들을 프라이머 없이 5회 PCR법으로 증폭한 다음, 프라이머 3과 6를 첨가한 후 다시 25회 PCR법으로 증폭하였다. 그 결과 약 1,600 염기쌍 크기의 유전자 단편이 증폭되었다.
그 다음, Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대장균 W3110을 컴피턴트 세포로 제작한 후, PCR로 얻어진 1,600 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된(30 ㎎/L) LB 고체 배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 다시 프라이머 3과 6을 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 1,600 염기쌍으로 pheA가 불활성화되었다는 것을 확인하고, W3110 ΔpheA 균주를 제작하였다.
위와 같은 방법으로 서열번호 8의 서열을 갖는 trpR, 서열번호 10의 서열을 갖는 mtr, 서열번호 12와 14의 서열을 갖는 tnaAB 유전자들에 의해 코딩되는 단백질들을 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 불활성화시켜, W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB 균주를 제작하였다.
(2) 트립토판 생산능을 나타내는 유전자들이 도입된 벡터의 제작
상기 제조된 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB 야생형 균주에 트립토판 생산능을 부여하기 위하여 pCL1920 벡터에 Ptrc 프로모터 및 트립토판 오페론 유전자를 삽입하여 재조합 벡터 pCL1920-Ptrc-trpO를 제작하였다.
구체적으로는, Ptrc 프로모터를 pCL1920 벡터로 삽입하기 위하여 pCL1920의 플라스미드를 회수하여 제한효소 HindⅢ 및 PstI로 처리하여 준비하고, Ptrc 프로모터는 pTrcHis B (invitrogen, USA) 벡터를 주형으로 하고, 프라이머 23과 24를 이용해 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 준비하였다. 상기 준비된 Ptrc 프로모터 단편은 제한효소 HindⅢ 및 PstI로 절단한 후, pCL1920과 라이게이션하여 pCL1920-Ptrc 벡터를 제작하였다.
그 다음, pCL1920_Ptrc_trpO 벡터를 제작하기 위하여 pCL1920_Ptrc 벡터는 PstI 및 알칼리 포스파타아제(Alkaline phosphatase) 처리하여 준비하였고, 트립토판 오페론 유전자는 대장균 KCCM10812P(대한민국등록특허 제10-0792095호)의 염색체 DNA로부터 증폭하였다. 해당 오페론 유전자의 첫 번째 유전자인 trpE 유전자는 피드백 저항성 형태를 갖는다. 증폭을 위하여 대장균 KCCM10812P의 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 25와 26을 이용해 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 5분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법을 수행하였다. 상기 얻어진 DNA 단편은 PstI로 처리하여 준비된 pCL1920_Ptrc 벡터와 라이게이션하였고, 그 결과 얻어진 벡터를 pCL1920_Ptrc_trpO(서열번호 15)로 명명하였다.
(3) 트립토판 오페론을 포함하는 벡터가 삽입된 균주의 제작
비교예 1의 (1)에서 제작된 균주를 컴피턴트 세포로 제작한 후, 비교예1의 (2)에서 만든 벡터를 도입하여 트립토판 생산능을 가지는 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO 야생형 균주를 제작하였다.
실시예 1: 비교예 1의 모균주로부터 ΔeddΔeda인 균주의 제작
상기 비교예 1에서 제작된 W3110 ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO 야생형 균주에 있어서, edd 및 eda 유전자군을 상동 재조합에 의하여 동시에 결실시킴으로써 edd(서열번호 2) 및 eda 유전자(서열번호 4)에 의해 코딩되는 6-포스포글루코네이트 탈수소효소 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트가 모두 불활성화된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 상기 균주를 제작하기 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합 효소를 이용한 돌연변이 제작 기법인 1단계 불활성화 방법을 사용하였다. 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 pUCprmfmloxC의 클로람페니콜 유전자를 사용하였다(대한민국공개특허 2009-007554). 상기 edd-eda 유전자군의 일부분과 pUCprmfmloxC 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 프라이머 27과 프라이머 28을 이용하여 pUCprmfmloxC를 주형으로 하고 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 약 1,200쌍의 유전자 단편을 증폭하였다.
또한, PCR 증폭을 통하여 얻어진 DNA 단편은 0.8% agarose겔 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 DNA 단편의 5' 및 3' 영역의 20쌍의 상보적 염기서열을 갖도록 하였고, edd-eda 유전자군의 5' 및 3' 영역을 더한 프라이머 29과 프라이머 30을 이용하여 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법에 의해 약 1,300쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 상기 과정을 거쳐 얻어진 DNA단편은 0.8% 아가로스 겔 전기영동 후 용리하여 재조합에 사용하였다.
Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대상 대장균을 컴피턴트한 상태로 제조 후, PCR법으로 얻어진 1,300 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 형질전환시켰다. 얻어진 균주는 클로람페니콜 내성을 갖는 LB에서 선별하였으며, 다시 프라이머 31과 프라이머 32를 이용한 PCR로 얻어진 크기가 1,626 염기쌍으로 edd-eda 유전자군이 결실되었다는 것을 확인하였다.
클로람페니콜 내성을 가진 1차 재조합 균주는 pKD46을 제거한 후, pJW168을 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) 247, 255-64). 최종적으로 얻어진 균체는 프라이머 31과 32로 PCR을 통해 얻어진 580쌍의 증폭 산물로 의도한 대로 결실이 이루어졌음을 확인하였다. 그리고 이 균주를 컴피턴트한 상태로 제조 후, 비교예 1에서 제작된 벡터를 유입하여 형질전환시켜 트립토판 생산능을 가지는 균주 W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO을 제작하였다.
실시예 2: ΔeddΔeda 균주의 트립토판 생산능 확인
상기 비교예 1 및 실시예 1에서 제작된 균주를 이용하여 역가 평가를 진행하였다. 역가 평가를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 1의 조성을 갖는 25 ㎖의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200 rpm에서 42시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.
조성물 농도(리터당)
글루코스 30 g
K2HPO4 1 g
(NH4)2SO4 10 g
NaCl 1 g
MgSO4ㆍ7H2O 1 g
구연산나트륨 5 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 40 g
구연산나트륨 5 g
페닐알라닌 0.15 g
타이로신 0.1 g
pH 6.8 g
균주 OD 소모당 (g/L)* L-트립토판(g/L)**
W3110ΔpheAΔtrpRΔmtr ΔtnaAB/pCL1920-Ptrc-trpO 30.1 24.7 0.78
실시예 1(W3110ΔpheAΔtrpRΔmtrΔtnaABΔeddΔeda/pCL1920-Ptrc-trpO) 29.5 25.1 1.03
* 22시간 측정치
** 42시간 측정치
상기 실험 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제시한 edd-eda 유전자군의 결실시, 당 소모 속도는 모균주인 비교예 1과 유의차가 없었으나, 트립토판 생산량은 모균주 대비 약 32% 이상 향상된 것으로 확인되었다. 이 결과는 Enter Doudoroff 경로의 결실에 의해 기질인 6-포스포글루코네이트의 손실없이 루불로오스 5-포스페이트(Rubulose 5-phosphate)까지 반응이 이루어졌기 때문에 NADPH는 물론, PRPP (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate) 및 E4P (Erythrose 4-phosphate)의 양이 증가하여 결과적으로 트립토판 생산능력이 증가된 것으로 여겨진다.
실시예 3: 기탁된 모균주로부터 ΔeddΔeda인 균주의 제작
한국미생물보존센터에 기탁된 L-트립토판 생산 대장균 KCCM11166P(대한민국등록특허 제10-1261147호)를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하여, edd-eda 유전자군이 결실된 KCCM11166PΔeddΔeda 균주를 제작하였다.
유전자 프라이머번호 서열 (5'→3') 서열번호
pheA 1 AGGCAACACTATGACATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 16
2 GGTCGCCATTAACAACGTGGCATATGAATATCCTCCTTAG 17
3 TATTGAGTGTATCGCCAAC 18
4 CGATGTCATAGTGTTGCC 19
5 CCACGTTGTTAATGGCGACC 20
6 TTCATTGAACGGGTGATTTC 21
trpR 7 TCCGCACGTTTATGATATGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACCGGGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 22
8 GCCACGTCTTATCAGGCCTACAAAATCAATCGCTTTTCAGCAACACCTCTCATATGAATATCCTCCTTAG 23
9 GCGCCGGGCGTATCGACGCA 24
10 GCATATCATAAACGTGCGGA 25
11 TGTAGGCCTGATAAGACGTG 26
12 AAGGGGCGATCGGCGTGTTT 27
mtr 13 ATGGCAACACTAACCACCACCCAAACGTCACCGTCGCTGCTTGGCGGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 28
14 TTACTGATACACCGGCAGTAAATTAAAGCTCGATAAAATATGCACCAGTGCATATGAATATCCTCCTTAG 29
15 GCAGCCGTTACATTGGTAAC 30
16 GTGGTGGTTAGTGTTGCCAT 31
17 TACTGCCGGTGTATCAGTAA 32
18 TCAAACCGTCAGCACGGCTG 33
tnaAB 19 ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 34
20 TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCAGCACAAAACATATGAATATCCTCCTTAG 35
21 TTAAGCGAAATCACCGGGGAA 36
22 ATGTCCGAGCACTGGCGC 37
pCL1920-Ptrc-trpO 23 CCCAAGCTTGCTGTTGACAATTAATCAT 38
24 AAAACTGCAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT 39
25 AAAACTGCAGATGCAAACACAAAAACCGACT 40
26 AAAACTGCAGTTAACTGCGCGTCGCCGCTTTC 41
Edd-eda 27 AAACGCGTTGTGAATCATCCTGCTCTGACAACTCAATTTCAGGAGCCTTTGCCGCCAGCTGAAGCTTTAC 42
28 ACAGCACGCTTTTCAGCGCCAGGTAGTCACGGTAGTTAGCCGGAGAAATATAGTGGATCTGATGGGTACC 43
29 TGCCCTATGAGCTCCGGTTACAGGCGTTTCAGTCATAAATCCTCTGAATGAAACGCGTTGTGAATCATCC 44
30 ATCGCCCGCTTCCAGCGCATCTGCCGGAACCAGCCAGGAACCACCGATGCACAGCACGCTTTTCAGCGCC 45
31 CATGATCTTGCGCAGATTGTA 46
32 CATGATCTTGCGCAGATTGTA 47
실시예 4: ΔeddΔeda 균주의 트립토판 생산능 확인
상기 기탁균주 KCCM11166P 및 실시예 3에서 제작된 균주를 이용하여 역가 평가를 진행하였다.
역가 평가를 위하여 균체를 백금이로 접종한 후, LB 고체 배지에서 밤새 배양하고, 하기 표 4의 조성을 갖는 25 ㎖의 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200 rpm에서 42시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 모든 결과는 3개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.
조성물 농도(리터당)
글루코스 60 g
K2HPO4 1 g
(NH4)2SO4 10 g
NaCl 1 g
MgSO4ㆍ7H2O 1 g
구연산나트륨 5 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 40 g
구연산나트륨 5 g
페닐알라닌 0.15 g
타이로신 0.1 g
pH 6.8 g
균주 OD 소모당 (g/L)* L-트립토판(g/L)**
KCCM11166P 22.9 31.0 5.7
KCCM11166PΔeddΔeda 23.6 30.7 6.9
* 33시간 측정치
** 48간 측정치
상기 실험 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이 본 발명에서 제시한 edd-eda 유전자군의 결실시, 당 소모 속도는 모균주와 유의한 차이가 없었으나, 트립토판 생산량은 모균주 대비 약 21% 이상 향상된 것으로 확인되었다. 이 결과는 상기 실시예 2에서 언급한 것과 같은 이유로 트립토판 생산능력이 증가된 것이라고 할 수 있다.
본 발명자들은 KCCM11166P 균주 기반, edd-eda 유전자군의 불활성화 균주에서 트립토판 생산능력이 증가함을 확인하고, 상기 균주를 "CA04-2800"으로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2013년 11월 15일에 기탁하여 수탁번호 KCCM11473P를 부여받았다.
상기와 같은 결과들은 Entner-Doudoroff 경로를 갖고 있는 에스케리키아속 미생물에 있어서, edd-eda 활성을 동시에 불활성화시킬 경우, 불활성화시키지 않은 미생물에 비해 트립토판 생산능이 증가되는 것을 시사하는 것이다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
Figure PCTKR2015006350-appb-I000001

Claims (6)

  1. 내재적 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydratase; edd) 및 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase; eda)의 활성이 약화 또는 불활성화되는, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 6-포스포글루코네이트 탈수소효소는 서열번호 1의 아미노산 서열인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 추가로 pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자의 전체 또는 일부가 결실된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 에스케리키아속 미생물을 배양하는 단계, 및
    상기 배양에 따른 배양물 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법.
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