WO2015182765A1 - 低分子化合物を用いた多能性幹細胞の心筋分化誘導法 - Google Patents

低分子化合物を用いた多能性幹細胞の心筋分化誘導法 Download PDF

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憲夫 中辻
南　一成
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing myocardial differentiation of pluripotent stem cells using a low molecular weight compound and a kit for promoting myocardial differentiation.
  • Heart disease is the world's leading cause of death, and heart transplantation is the only treatment for patients with severe heart failure, but there is a problem of insufficient donors.
  • transplantation of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells is regarded as promising, and immediate realization is desired.
  • ES cells and iPS cells transplantation of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells
  • cytokines and proteins contained in the current differentiation-inducing medium are problematic. All of these proteins are produced by animal cells, bacteria, yeast, and the like, and thus there is a risk of infection (viruses, mycoplasma, prions, etc.) from the original cells. Since myocardial differentiation induction is a step before the transplantation, the risk of infection here should be reduced as much as possible.
  • An object of the present invention is to provide a myocardial differentiation induction method using a low molecular weight compound.
  • the present invention provides the following. 1. A method for inducing myocardial differentiation of pluripotent stem cells, comprising the following steps: (1) culturing pluripotent stem cells in a medium containing a WNT signal activator and a PKC activator; and (2) A step of culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing a WNT signal inhibitor, a Src inhibitor, and an EGF receptor inhibitor. 2. 2.
  • the Wnt signal inhibitor is a compound of the following formula (I) or a salt thereof:
  • R 12 and R 13 are each independently a straight chain of 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or halogen atom, or Where two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), Although in two adjacent of R 6 -R 9 together O-CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms;
  • R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group,
  • R 7 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O)
  • A Is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is independently selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom A straight or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or
  • R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms;
  • R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group,
  • R 7 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O)
  • A Is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is independently selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom A straight or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen
  • Wnt signal inhibitor is a compound selected from the following or a salt thereof: KY02111 KY010104 T61164 KY02114 KY01045 KY01040 KY02109 KY010104 KY01043 KY01046 PB2852 N11474 PB2572 PB2570 KY02104 SO087 SO102 SO096 SO094 SO3031 (KY01-I) SO2031 (KY02-I) SO3042 (KY03-I) and, SO2077 . 8). 8.
  • the medium of step (2) contains two or more WNT signal inhibitors, and one of the two or more WNT signal inhibitors is the compound of formula (I) or a salt thereof according to any one of 2 to 9 above. 10. The method according to any one of 1 to 9, wherein the other WNT signal inhibitor is one or more compounds selected from IWP2, XAV939, and IWR1. 11.
  • the 11.2 or more WNT signal inhibitors are the compound of formula (I) or a salt thereof and XAV939 as described in any of 2 to 9 above. 12 12.
  • the Src inhibitor is A419259 or SU6656. 17.
  • the WNT signal activator is CHIR99021
  • the PKC activator is PMA
  • the WNT signal inhibitor is a compound selected from KY02111, SO3031 (KY01-I), SO2031 (KY02-I), and SO3042 (KY03-I) and XAV939,
  • the WNT signal inhibitor is SO3042 (KY03-I) and XAV939. 22.
  • 23. The method according to any one of 1 to 22, wherein the cells are cultured by suspension culture in the steps (1) and (2). 24.
  • 24. The method according to any one of 1 to 23, wherein step (1) is from 1 to 3 days and step (2) is from 2 to 13 days. 25.
  • the pluripotent stem cell is a monkey or human pluripotent stem cell. 26. 26.
  • the pluripotent stem cell is a monkey or human ES cell or iPS cell. 27. 27. The method according to any one of 1 to 26 above, which is a method for producing cardiomyocytes. 28. 28. A cardiomyocyte obtained by the method according to any one of 1 to 27 above. 29. A kit for promoting myocardial differentiation comprising a WNT signal activator, a PKC activator, a WNT signal inhibitor, a Src inhibitor, and an EGF receptor inhibitor. 30.
  • the WNT signal activator is CHIR99021
  • the PKC activator is PMA
  • * (P ⁇ 0.05, ttest), ** (P ⁇ 0.01, ttest), all n 3.
  • a protocol for induction of protein-free myocardial differentiation (PFCD) using six kinds of compounds is shown.
  • * (P ⁇ 0.05, ttest), all n 4.
  • APD90 action potential duration) of PFCD cardiomyocytes under adherent or suspension culture conditions.
  • INa voltage-dependent Na channel current of PFCD cardiomyocytes under adherent or suspension culture conditions. * (P ⁇ 0.05, ttest).
  • ICa voltage-dependent Ca channel current of PFCD cardiomyocytes under adherent or suspension culture conditions.
  • IKr HERG channel current
  • IKs KCQN1 channel current
  • APD increase increase rate of APD90
  • C293B Chromanol293B. * (P ⁇ 0.05, ttest).
  • the cardiomyocyte ratio (a) of cells obtained from the human iPS cell line (IMR90-1, 253G1) subcultured under feeder-free and xeno-free conditions by the floating-condition PFCD induction method and a graph (b) summarizing them. Dot data stained with cTnT antibody and analyzed by flow cytometry. Negative controls are differentiated cells stained without primary antibody. N 3 respectively. Photograph of cardiomyocytes 14 days after induction of PFCD under floating condition (a) or adhesion condition (b) from MEF feeder cultured human iPS cell line (IMR90-1), and feeder free xenofree cultured human iPS cell line in FIG. A photograph (c) of cardiomyocytes 14 days after PFCD induction under floating conditions from (253G1).
  • the term “pluripotent stem cell” means pluripotency capable of differentiating into all cells constituting an adult and self-replication capable of maintaining the pluripotency even after cell division. It means a cell having the ability.
  • the “pluripotent stem cell” includes embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the species of “pluripotent stem cells” is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a rodent or primate, and even more preferably a primate.
  • the present invention is suitable for monkey or human pluripotent stem cells, particularly monkey or human ES cells and iPS cells.
  • ES cells are pluripotent stem cells derived from early embryos, and can be established from the inner cell mass of blastocysts or epiblasts of early embryos after implantation.
  • ES cells include humans (Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998), Biochem Biophys Res Commun. 345 (3), 926-32 (2006); primates such as rhesus monkeys and marmosets (Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995); Thomson J. A. et al., Biol. Reprod.
  • CMK6.4, KhES-1, KhES-3, KhES-4, KhES-5, H1, H9, etc. can be used as ES cells.
  • EG cells are pluripotent stem cells derived from primordial germ cells.
  • human EG cells (Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) (this book by reference) Included in the specification).
  • iPS cell means a pluripotent stem cell derived from a cell other than a pluripotent stem cell such as a somatic cell or a tissue stem cell.
  • Methods for producing iPS cells include, for example, WO2007 / 069666, WO2009 / 006930, WO2009 / 006997, WO2009 / 007852, WO2008 / 118820, Cell Stem Cell 3 (5): 568-574 (2008), Cell Stem Cell 4 (5 ): 381-384 (2009), Nature 454: 646-650 (2008), Cell 136 (3): 411-419 (2009), Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008), Cell Stem Cell 3: 475- 479 (2008), Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009), Cell 133 (2): 250-264 (2008), Cell 131 (5): 861-72 (2007), Science 318 (5858): 1917 -20 (2007), which are incorporated herein by reference.
  • iPS cells cells produced by any method are included in the “iPS cells” of the present invention as long as they are artificially induced pluripotent stem cells.
  • iPS cells IMR90-1, IMR90-4, 201B7, 253G1, and the like can be used.
  • the “Wnt signal activator” in the present invention means a substance that activates the Wnt signal pathway.
  • Wnt signal activators include GIO3 ⁇ inhibitors such as BIO and CHIR99021 and TWS119.
  • the Wnt signal activator is CHIR99021 or BIO, preferably CHIR99021.
  • two or more Wnt signal activators may be used in combination, for example, both CHIR99021 and BIO may be used.
  • the “Wnt signal inhibitor” in the present invention means a substance that inhibits the Wnt signal pathway.
  • the Wnt signal inhibitor include compounds of the formula (I) described in International Publication No. 2012/026491 or a salt thereof, compounds such as IWP2, IWP4, XAV939, and IWR1.
  • two or more Wnt signal inhibitors may be used in combination.
  • one of the two or more Wnt signal inhibitors is a compound of formula (I) or a salt thereof as described in WO 2012/026491
  • the other Wnt signal inhibitor is IWP2, XAV939, and One or more compounds selected from IWR1, preferably XAV939.
  • Any of the two or more Wnt signal inhibitors may be a compound of the formula (I) described in International Publication No. 2012/026491 or a salt thereof.
  • R 1 to R 5 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a straight or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a straight chain having 1 to 5 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom.
  • R 12 and R 13 are each independently a straight chain of 1 to 5 carbon atoms substituted with a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or halogen atom, or Where two adjacent R 1 —R 5 together form —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O—.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; and a 1 to 5 carbon atom substituted with a group —C (O) A.
  • a straight-chain or branched alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is a nitrogen atom, an oxygen atom, And 1 or 2 atoms independently selected from a sulfur atom); a straight-chain or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom), Although in two adjacent of R 6 -R 9 together O-CH 2 -O- or -O- (CH 2) may form a 2 -O-, R 10 to R 11 are each independently
  • linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms examples include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, isopropoxy group, butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, and pentyloxy group. Can be mentioned.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and a pentyl group. .
  • linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms examples include formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, valeryl group, and isovaleryl group.
  • each of R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 1 to R 5 independently represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 carbon atom.
  • R 2 and R 3 are preferably straight-chain or branched alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, or together, —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —. O- is formed. More preferably, R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, and even more preferably a methoxy group.
  • R 1 , R 4 and R 5 are preferably hydrogen atoms.
  • R 6 to R 9 each independently represent a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms; Or a group —NR 12 R 13 (wherein R 12 and R 13 each independently represents a hydrogen atom, an oxygen atom, or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms) Where two adjacent R 6 —R 9 together are —O—CH 2 —O— or —O— (CH 2 ) 2 —O - May be formed.
  • R 6 and R 9 are preferably each independently a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; or an unsubstituted or substituted carbon atom having 1 to 5 carbon atoms.
  • 5 is a linear or branched alkyl group, and more preferably a hydrogen atom.
  • R 7 represents a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A.
  • An alkoxy group (A is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted by a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is formed from a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom; 1 or 2 atoms independently selected); a linear or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom; or a group —NR 12 R 13 (R 12 and R 13 are each independently a hydrogen atom, an oxygen atom, or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with a halogen atom, and R 8 is Hydrogen atom; halogen atom; hydroxyl group; carbon number 1 5 straight or branched alkoxy group; or unsubstituted or a straight-chain or branched alkyl group of
  • R 7 is a linear alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A, and the group —C (O) A is bonded to the terminal carbon atom of the alkoxy group. is doing.
  • A contains at least one nitrogen atom, and such A includes pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, pyrrolyl, imidazolyl, which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • Pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, and pyridazinyl groups are examples of the group.
  • A is a piperidinyl group, piperazinyl group, or morpholinyl group that is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • A is a piperidin-1-yl group, piperazin-1-yl group, or morpholin-4-yl group which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms. is there.
  • R 10 and R 11 are preferably a hydrogen atom.
  • n is an integer from 0 to 4, 1 to 4, or 1 to 3, or 2 or 3.
  • X is an oxygen atom; a sulfur atom; a group —NR 15 (wherein R 15 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a linear or branched acyl group having 1 to 5 carbon atoms). Is). X is preferably a sulfur atom.
  • the compound of formula (I) is: R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms; R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, R 7 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A (A Is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is independently selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom A straight or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted or substituted with
  • the compound of formula (I) is: R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms; R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, R 7 is a hydrogen atom; a halogen atom; a hydroxyl group; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms; a linear or branched alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms substituted with a group —C (O) A (A Is a saturated or unsaturated 5- or 6-membered ring which is unsubstituted or substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the ring is independently selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom A straight or branched alkyl group of 1 to 5 carbon atoms which is unsubstituted
  • the compound of formula (I) is: R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms; R 7 is a halogen atom; R 2 and R 3 are each independently a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group, X is a sulfur atom, and n is an integer of 0 to 4, preferably 1 to 4.
  • the compound of formula (I) is: R 1 , R 4 , R 5 , R 6 , R 8 , R 9 , R 10 and R 11 are hydrogen atoms; R 7 is a halogen atom; R 2 and R 3 are methoxy groups, X is a sulfur atom, and n is an integer of 0 to 4, preferably 1 to 4.
  • the compound of formula (I) is selected from: KY02111 KY010104 T61164 KY02114 KY01045 KY01040 KY02109 KY010104 KY01043 KY01046 PB2852 N11474 PB2572 PB2570 KY02104 SO087 SO102 SO096 SO094 SO3031 (KY01-I) SO2031 (KY02-I) SO3042 (KY03-I) SO2077 .
  • the compound of formula (I) is preferably KY02111, SO3031 (KY01-I), SO2031 (KY02-I), or SO3042 (KY03-I), more preferably KY02111 or SO3042 (KY03-I), Even more preferably, it is SO3042 (KY03-I).
  • Compounds of formula (I) can be prepared by known methods (J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735) (incorporated herein by reference) or in WO 2012/026491. Can be synthesized according to the method described in No. Pamphlet (included herein by reference). Alternatively, they can be obtained from UkrOrgSynthesis (PB2852, PB2572, PB2570), ENAMINE (T61164), and the like.
  • PKC activator means a substance that activates protein kinase C (PKC) or a signal transduction pathway downstream thereof.
  • PKC activators include phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), prostratin, bryostatin 1 (Bryostatin 1), bryostatin 2 (Bryostatin 2), FR236924, ( -)-Indolactam V ((-)-Indolactam V), PEP005, Phorbol 12,13-dibutyrate, SC-9, SC-10, 1-oleoyl-2-acetyl-sn 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol, 1-O-hexadecyl-2-O-arachidonyl-sn-glycerol, 1 , 2-Dioctanoyl-sn-glycerol, PIP2, Resiniferatoxin, Phorbol 12,13-dihexanoate (Phor
  • the PKC activator is a phorbol ester-based PKC activator, PMA, prostratin, PEP005, phorbol 12,13-dibutyrate, resiniferatoxin, phorbol 12,13-dihexanoate, Mezerein, or ingenol 3-angelate.
  • two or more PKC activators may be used in combination.
  • the PKC activator is PMA or prostratin, more preferably PMA.
  • Src inhibitor means a substance that inhibits Src, which is a tyrosine kinase, or a signal transduction pathway downstream thereof.
  • Src inhibitors include A419259, SU6656, PP1, 1-naphthyl PP1 (1-Naphthyl1PP1), PP2, indirubin-3 ′-(2,3-dihydroxypropyl) -oxime ether (Indirubin-3 ′-(2, 3-dihydroxypropyl) -oximether), TX-1123, Src Kinase Inhibitor I (CAS 179248-59-0), AZM475271, Bosutinib, Herbimycin A, KB SRC 4, MNS, PD166285, TC- S7003 and the like are exemplified.
  • the Src inhibitor is A419259, KB SRC 4, SU6656, or indirubin-3 '-(2,3-dihydroxypropyl) -oxime ether.
  • two or more Src inhibitors may be used in combination.
  • the Src inhibitor is A419259 or SU6656, more preferably A419259.
  • EGF receptor inhibitor (also referred to as EGFR inhibitor) means a substance that inhibits signal transduction from the EGF receptor.
  • EGF receptor inhibitors include AG1478, Gefitinib, Afatinib, ARRY334543, AST1306, AZD8931, BIBU1361, BIBX1382, BPQ, BPIQ-I, BPIQ-II, Canertinib5, Canertinib78 CUDC101, Dacomitinib, Vandetanib, EGFR Inhibitor III (N- (4-((3,4-dichloro-6-fluorophenyl) amino) -quinazolin-6-yl) -2-chloroacetamide, CAS 733009-42-2), EGFR / ErbB-2 Inhibitor (4- (4-benzyloxyanilino) -6,7-dimethoxyquinazoline, CAS 179248-61-4), Erlotinib, GW58340,
  • the EGF receptor inhibitor is an EGF receptor inhibitor having a quinazoline-based skeleton, such as AG1478, gefitinib, afatinib, ARRY334543, AST1306, AZD8931, BIBU1361, BIBX1382, BPDQ, BPIQ-I, BPIQ-II, Caneltinib CL-387,785, CUDC101, dacomitinib, vandetanib, EGFR Inhibitor III (CAS 733009-42-2), EGFR / ErbB-2 Inhibitor (CAS 179248-61-4), erlotinib, GW58340, GW2974, HDS029, lapatinib, WHI-P154, OSI-420, PD153035, PD168393, PD174265, peritinib, Compound 56, or XL657.
  • the EGF receptor inhibitor is AG1478 or gefitinib, more
  • the method for inducing cardiomyocytes of pluripotent stem cells of the present invention is performed in vitro.
  • the medium used in the method of the present invention may be a medium generally used for myocardial differentiation of pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as myocardial differentiation medium), and its composition is not particularly limited.
  • the medium used in the method of the present invention may contain a protein component or a peptide component, but preferably does not contain it.
  • the medium in the present invention includes, for example, IMDM medium and / or DMEM medium, MEM non-essential amino acid solution, and L-glutamine.
  • the medium may contain L-carnitine, ascorbic acid, and / or creatine in addition to IMDM medium and / or DMEM medium, MEM non-essential amino amino acid solution, and L-glutamine.
  • the medium may contain an antibiotic such as penicillin-streptomycin as necessary.
  • a medium used in the method of the present invention a medium based on IMDM and DMEM used in Examples (IMDM 242 ml, DMDM 242 ml, MEM non-essential amino acid solution ( ⁇ 100) 5 ml, penicillin-streptomycin ( ⁇ 100) 5 ml, 0.2 M L-glutamine 5 ml, 1 M L-carnitine 100 ⁇ l, ascorbic acid 50 mg, 0.5 M creatine 1 ml).
  • a myocardial differentiation medium based on a known IMDM medium for example, IMDM medium 200 ml, fetal calf serum 50 ml, MEM non-essential amino acid solution ( ⁇ 100) 2.5 ml, penicillin-streptomycin) ( ⁇ 100) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, 2-mercaptoethanol 2 ⁇ 1, 5N NaOH 255 ⁇ l), myocardial differentiation medium based on known DMEM medium (for example, DMEM / F12 medium 200 ml, fetal bovine Serum 50 ml, MEM non-essential amino acid solution ( ⁇ 100) 2.5 ml, penicillin-streptomycin ( ⁇ 100) 2.5 ml, 200 mM L-glutamine 2.5 ml, containing 2-mercaptoethanol), or StemPro (registered trademark) -34SFM (GIBCO)
  • IMDM medium for example, IMDM medium 200 ml, fetal cal
  • a culture method generally suitable for cardiac differentiation of pluripotent stem cells can be used.
  • the culture method include an adhesion culture method, a suspension culture method, and a suspension culture method.
  • the method of the present invention is performed by a suspension culture method.
  • the number of pluripotent stem cells at the start of culture is appropriately determined depending on the culture method, culture vessel, cell type, etc. If seeded at about 1 ⁇ 10 5 cells / ml to 10 ⁇ 10 5 cells / ml. Good.
  • the medium may be changed once every 1 to 3 days, for example once every 2 days.
  • Step (2) may be started immediately after the end of step (1), or may be started after a certain period from the end of step (1).
  • the cells are placed in a medium containing neither a WNT signal activator, a PKC activator, a WNT signal inhibitor, a Src inhibitor, or an EGF receptor inhibitor for 1-2 days.
  • the medium may be replaced with a medium containing a WNT signal inhibitor, a Src inhibitor, and an EGF receptor inhibitor, and step (2) may be started.
  • the step (1) is performed for 1 to 3 days, and then the step (2) is performed immediately after the completion of the step (1) or after 1 to 2 days after the completion of the step (1). It is carried out for ⁇ 13 days, preferably 3 to 10 days, more preferably 4 to 10 days, even more preferably 4 to 8 days.
  • step (1) is performed on days 0 to 1, 0 to 2, or 0 to 3, and immediately after the end of step (1) or 1-2 days after the end of (1), 2-10 days (8 days), 2-9 days (7 days), 2-8 days (6 days), 2-7 days (5 days) ) 2-6 days (4 days), 3-10 days (7 days), 3-9 days (6 days), 3-8 days (5 days), 3-7 days (4 days) )
  • Step (2) can be performed on days 4-10 (6 days), days 4-9 (5 days), or days 4-8 (4 days).
  • step (1) corresponds to the early stage of myocardial differentiation induction, which is the differentiation induction phase from pluripotent stem cells to mesoderm
  • the period of step (1) may be determined based on the expression of mesoderm-related genes. it can. Examples of mesoderm-related genes include T, MIXL1, NODAL, and the like.
  • Step (2) corresponds to a later stage of induction of myocardial differentiation in which mesoderm is differentiated into cardiomyocytes, and the period can be determined by confirming differentiation into cardiomyocytes. Differentiation into cardiomyocytes can be confirmed by the number of beating cardiomyocytes, expression of myocardial markers, expression of ion channels, response to electrophysiological stimulation, and the like.
  • Myocardial markers include ⁇ MHC, ⁇ MHC, cTnT, ⁇ -actinin, and NKX2.5.
  • Examples of the ion channel include HCN4, Nav1.5, Cav1.2, Cav3.2, HERG1b, and KCNQ1.
  • the concentration of the Wnt signal activator and the Wnt signal inhibitor can be appropriately changed according to the cells and drugs used.
  • BIO or CHIR99021 is used as the Wnt signal activator, it may be used, for example, at a final concentration of 100 nM to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the final concentration may be 0.5 to 20 ⁇ M, preferably 0.5 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to 10 ⁇ M.
  • a final concentration of 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to What is necessary is just to use at 10 micromol.
  • the concentration of the PKC activator can be changed as appropriate according to the cells and drugs used.
  • the final concentration is 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.03 to 1 ⁇ M, more preferably 0.1 to 1 ⁇ M.
  • the final concentration is 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 to 10 ⁇ M. And you can use it.
  • the concentration of the Src inhibitor can be appropriately changed according to the cells and drugs used.
  • the final concentration may be 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M, more preferably 0.3 to 3 ⁇ M.
  • the concentration of the EGF receptor inhibitor can be appropriately changed according to the cells and drugs used.
  • the final concentration may be 100 nM to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M, and in the case of PP3, the final concentration may be 1 ⁇ M to 1 mM, preferably 10 ⁇ M to 100 ⁇ M.
  • the method of the present invention can be used for the production of cardiomyocytes.
  • Obtaining cardiomyocytes can be confirmed by the number of beating cardiomyocytes, expression of myocardial markers, expression of ion channels, response to electrophysiological stimulation, and the like.
  • the cardiomyocytes obtained by the method of the present invention can be used for in vitro drug safety tests or as transplanted cardiomyocytes for heart disease and the like.
  • the myocardial differentiation kit of the present invention includes a WNT signal activator, a PKC activator, a WNT signal inhibitor, a Src inhibitor, and an EGF receptor inhibitor, and further includes a medium, a culture container, and the like used in the method of the present invention. May be included.
  • the WNT signal activator, PKC activator, WNT signal inhibitor, Src inhibitor, and EGF receptor inhibitor used in the kit of the present invention are as described for the myocardial differentiation inducing method of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises CHIR99021 as a WNT signal activator, PMA as a PKC activator, SO3042 (KY03-I) and XAV939 as WNT signal inhibitors, A419259 as an Src inhibitor, and EGF receptor inhibition.
  • AG1478 is included as an agent.
  • the present invention also includes a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter containing a PKC activator, use of a PKC activator for the production of a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter, and a medium containing a PKC activator
  • a method for inducing cardiac differentiation of pluripotent stem cells comprising culturing pluripotent stem cells therein.
  • the PKC activator may be used in the early stage of induction of myocardial differentiation, for example, for 1 to 3 days from the start of culture in myocardial differentiation medium.
  • the present invention also relates to a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter containing a Src inhibitor, the use of a Src inhibitor for the production of a pluripotent stem cell myocardial differentiation promoter, and a medium containing a Src inhibitor.
  • a method for inducing cardiac differentiation of pluripotent stem cells comprising culturing pluripotent stem cells.
  • the Src inhibitor is used at a later stage of induction of myocardial differentiation, for example, 2 to 13 days, preferably 3 to 10 days, more preferably 4 to 10 days from the second, third, or fourth day of culture in myocardial differentiation medium. More preferably, it may be used for 4 to 8 days.
  • the pluripotent stem cells and medium described above can be used.
  • the addition condition of a compound (a compound that promotes myocardial differentiation in addition to KY02111) in which the amount of GFP fluorescence increases three times or more than the condition of KY02111 alone is shown in gray.
  • the PKC activator Prostratin, the Src inhibitor A419259, and the EGF inhibitor AG1478 each promoted myocardial differentiation under appropriate conditions.
  • FIG. 1a shows an outline of chemical screening.
  • GFP in addition to KY02111 compound treatment
  • Compounds that increase the amount of fluorescence were screened.
  • IMDM medium fetal bovine serum
  • a screening compound was added in a concentration-dependent manner for the early stage of myocardial differentiation (day 0-3, Early) and late stage of differentiation (day 4-7, Late), and the amount of GFP fluorescence was increased on day 9 of myocardial differentiation culture. Analyzed with Metamorph imaging system.
  • Prostratin ⁇ ⁇ (Fig. 1b) and PMA (Fig. 1c), which are PKC activators, promoted myocardial differentiation in a concentration-dependent manner in the early stage of myocardial differentiation.
  • Prostratin (3-10uM) and PMA (0.03-0.3 uM) promoted myocardial differentiation either alone or in combination with KY02111 (10uM, late differentiation) (KY + Prost, KY + PMA) (3-8 times).
  • the EGF inhibitors AG1478 and gefitinib promoted myocardial differentiation in a concentration-dependent manner during the late stage of myocardial differentiation (FIG. 1d).
  • AG1478 (10-30uM) and gefitinib (10-30uM), either alone or in combination with KY02111 (10uM, late differentiation) (KY + AG, KY + Gef) promoted myocardial differentiation (2 ⁇ 3 times).
  • A419259 and SU6656 promoted myocardial differentiation in a concentration-dependent manner during the late stage of myocardial differentiation.
  • A419259 (1-3uM) and SU6656 (1-3uM) either alone or in combination with KY02111 (10uM, late differentiation) (KY + A419, KY + SU66) promoted myocardial differentiation (2 ⁇ 5 times).
  • Myocardial differentiation was induced in a GFP gene-introduced monkey ES cell line (CMK6.4) using 6 types of compounds, CHIR99021, PMA, KY03-I, XAV939, AG1478, and A419259.
  • GFP fluorescence when 1 uM CHIR99021 and 0.1 uM PMA are added in early differentiation (day0-2), 3 uM KY03-I, 1 uM XAV939, 10 uM AG1478 and 0.3 uM A419259 are added in late differentiation (day3-7) was analyzed.
  • the administration of these 6 kinds of compounds showed a significant effect of promoting myocardial differentiation (approximately 750 times that of DMSO addition) (FIG. 1f).
  • FIG. 2a shows a protocol for induction of protein-free myocardial differentiation (PFCD) using six kinds of compounds.
  • PFCD protein-free myocardial differentiation
  • Wnt signal inhibitor (3uM KY03-I and 1uM XAV939) and EGFR inhibitor (10uM) in late differentiation (day-3-7) AG1478) and Src inhibitor (0.3 uM A419259) were added in PFCD medium under suspension culture conditions or adhesion culture conditions.
  • suspension culture conditions the cells were cultured in a low adhesion dish (Wako 641-07391 or Corning YO-01835-24), and in adhesion culture conditions, they were cultured in a normal dish (Falcon 353004). Even under adhesion conditions, the adhesion culture was performed under protein-free conditions without coating the dish. Pulsating myocardial colonies were usually observed from day 7-9. Differentiated cardiomyocytes could be maintained in PFCD medium for 1-2 months under floating / adhesive conditions.
  • Table 2 shows the medium components of the PFCD medium and their purchase prices. It is composed of low molecular weight compounds and amino acids that do not contain proteins or peptides and can be synthesized. It can be manufactured for 1,200 yen or less per 500ml, and it is very inexpensive.
  • FIG. 2d shows the results of total cell number analysis of cardiomyocytes induced from PFCD under suspension or adhesion culture conditions from the above pluripotent stem cell lines. The number of differentiated cells obtained from 2 ⁇ 10 6 undifferentiated pluripotent stem cells is shown. For most cell lines, more cells were obtained under suspension culture conditions. Flow cytometric analysis and cell count were all performed on day 14.
  • FIG. 3a shows PMA added (left photo, all 6 compounds) Added) and without PMA addition (right photo, addition of 5 compounds other than PMA) GFP when PFCD induction (Fig. 2a) was performed under floating conditions from ⁇ MHC promoter-driven GFP gene-introduced monkey ES cell lines A fluorescent photograph is shown. Almost all colonies were GFP positive in the condition with PMA, whereas almost no GFP fluorescence was seen in the condition without PMA.
  • PFCD MEF feeder cultured IMR90-1 strain
  • FIG. 3d shows the result of total cell number analysis of cardiomyocytes induced by PFCD under the same conditions as FIG. 3c.
  • CHIR99021 and PMA were each removed, the number of cells decreased significantly.
  • Flow cytometric analysis and cell count were all performed on day 14.
  • each of these four compounds decreased the gene expression level of MSGN1, T, and MIXL1, and the expression level thereof was most significantly decreased by the simultaneous addition of the four compounds.
  • NODAL no significant change in the expression level was observed with the addition of each of the four compounds, but the expression level was significantly increased by the simultaneous addition of the four compounds.
  • Coordinated changes in mesoderm gene expression due to the addition of these four compounds may contribute to efficient PFCD. In general, it is known that the expression of mesoderm-related genes increases during the early stage of myocardial differentiation and decreases during the late stage of differentiation.
  • PFCD induction method Expression of myocardial markers and channels in cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells by PFCD induction method.
  • the gene expression of PFCD cardiomyocytes was analyzed by quantitative PCR.
  • total mRNA was collected from PFCD cardiomyocytes (derived from MEF feeder culture IMR90-1) under floating and adhesion conditions, and myocardial markers and channel genes were expressed by quantitative PCR. Compared.
  • the expression level tends to increase, and it can be said that the myocardial maturation has progressed over time.
  • the expression levels of ⁇ MHC, ⁇ Actinin, and KCNQ1 were significantly higher in PFCD cardiomyocytes in floating conditions than in adhesion conditions. This suggests that PFCD cardiomyocytes in floating conditions have a higher degree of myocardial maturity than adhesion conditions.
  • PFCD cardiomyocytes were analyzed by flow cytometry using antibody staining of MLC2v, a ventricular muscle marker, MLC2a, an atrial muscle marker, HCN4, a pacemaker marker, and cTnT, a marker for all myocardial cells.
  • MLC2v a ventricular muscle marker
  • MLC2a a ventricular muscle marker
  • HCN4 a pacemaker marker
  • cTnT a marker for all myocardial cells.
  • MLC2v single positive cells about 70% of MLC2v single positive cells and 0.2-0.3% of MLC2a single positive cells were not different between the floating condition and the adhesion condition, but MLC2v / MLC2a The percentage of the double positive cells was about 9% in suspension and 13% in adhesion, which was significantly lower in the suspension conditions (FIGS. 4b and 4c).
  • the double positive cells of MLC2v / MLC2a are said to be immature ventricular myocytes, which indicates that there are fewer immature ventricular myocytes in the PFCD cells in the floating condition than in the adhesion condition.
  • HCN4 positive cells pacemaker
  • cTnT positive cells were about 90% (FIG. 4c). Cells stained without primary antibody served as a negative control. For each sample, 30,000 cells were analyzed with FACSCantoII.
  • Electrophysiological analysis of PFCD cardiomyocytes was performed by whole cell patch clamp method.
  • PFCD cardiomyocytes derived from MEF feeder cultured IMR90-1
  • RP resting membrane potential
  • APD90 action potential duration
  • Fig. 4d, g there was no significant difference, but with respect to Amplitude (action potential amplitude)
  • the floating condition was about 105 mV
  • the adhesion condition was about 90 mV
  • the RP of mature human adult ventricular myocytes is -80 to -90 mV
  • the RP of PFCD cardiomyocytes is about -60 mV, which is a relatively immature shallow RP.
  • FIG. This is consistent with the fact that the expression level of Kir2.1, which is important for the formation of, is generally low in PFCD cardiomyocytes (approximately one-tenth that of human mature myocardial tissue).
  • RP is shallow, it is immature cardiomyocyte compared to human mature cardiomyocyte, but in terms of both gene expression level and electrophysiological analysis result, floating PFCD cardiomyocyte adheres more It can be said that maturation is progressing more than the condition cardiomyocytes.
  • PFCD cardiomyocytes derived from MEF feeder cultured IMR90-1) 30 days after differentiation induction, the floating conditions and the adhesion conditions were compared. As a result, two types of cardiomyocytes were observed: cardiomyocytes with clear ⁇ Actinin staining pattern (patterned ⁇ Actinin, white arrow) and cardiomyocytes without clear pattern (un-patterned ⁇ Actinin, white triangle). It was done. A lot of patterned cells were observed in PFCD cardiomyocytes under floating conditions, whereas PFCD cardiomyocytes under adhesion conditions had few patterned cells and many un-patterned cells.
  • the ratio of patterned cells when PFCD cardiomyocytes were stained with ⁇ -Actinin® was compared between the floating conditions and the adhesion conditions (FIG. 5c). About 80% of myocardial cells were patterned cells in the floating condition, whereas only about 50% of the patterned cells were observed in the adhesion condition, indicating a significantly higher value in the floating condition.
  • FIGS. 7a and b show photographs of myocardial cells 14 days after induction of PFCD under floating conditions and 14 days after induction of PFCD under adhesion conditions from MEF feeder cultured human iPS cell line (IMR90-1).
  • FIG. 7c shows a photograph of cardiomyocytes 14 days after induction of PFCD under floating conditions from the feeder-free xenofree cultured human iPS cell line (253G1) of FIG.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 167 mg of 2- (2- (3,4-dimethoxyphenyl) acetamido) -6-iodobenzothiazole in a yield of 50%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 83 mg of 2- (3- (3,4-dimethoxyphenyl) propanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 48%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 131 mg of 2- (4- (3,4-dimethoxyphenyl) butanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 30%.
  • reaction mixture was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated aqueous sodium chloride solution.
  • the extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure. The residue was recrystallized from ethanol to obtain 217 mg of 2- (3- (3-methoxy-4-propoxyphenyl) propanamide) -6-iodobenzothiazole in a yield of 60%.

Abstract

　本発明は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程、を含む方法を提供する。

Description

低分子化合物を用いた多能性幹細胞の心筋分化誘導法
　本発明は、低分子化合物を用いた多能性幹細胞の心筋分化誘導法および心筋分化促進用キットに関する。
　心臓疾患は世界の死因1位であり、重症心不全患者においては心移植が唯一の治療法であるが、ドナー不足という問題を抱えている。心移植に代わる治療法として、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞由来の心筋細胞移植が有望視されており、早急な実現化が望まれている。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を再生医療に応用するためには、生産コストと安全性という大きな課題を解決しなければならない。
　心筋細胞をヒトに移植するには、少なくとも10億個（10の9乗個）もの大量の細胞が必要と考えられている。しかしながら、現行の多能性幹細胞-心筋分化誘導法は、成長因子やサイトカイン、血清アルブミンなどの蛋白質を大量に必要とするため、非常にコストが高い。具体的には、10の9乗個の心筋細胞を生産するのに最低限必要な培地（10リットル）だけで、1千万円以上のコストがかかる見積りとなる。事実、現在一部で市販されているヒト多能性幹細胞由来心筋細胞は非常に小容量かつ高価（10の6乗スケールで数十万円）であり、移植に必要な10の9乗個の細胞となると数億円になる計算である。そのため、心筋分化誘導培地のコストを削減することは、心臓再生医療の実現化において非常に重要な課題となっている。
　また、安全性の面においても、現行の分化誘導培地に含まれるサイトカインや蛋白質が問題となる。これらの蛋白質はすべて、動物細胞や細菌、酵母などによって作られているため、その元の細胞からの感染リスク（ウイルス、マイコプラズマ、プリオンなど）が生じる。心筋分化誘導は特に、移植の一歩手前のステップであるため、ここでの感染リスクは可能な限り減らさなければならない。
国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット（引用により本明細書に含まれる） 国際公開第２０１３／１１１８７５号パンフレット（引用により本明細書に含まれる） 米国特許出願公開第２０１３／０１８３７５３号明細書（引用により本明細書に含まれる） 米国特許第８６５８４２５号明細書（引用により本明細書に含まれる） 米国特許出願公開第２０１４／０１２７８０７号明細書（引用により本明細書に含まれる）
Minami, I. et al., Cell reports 2, 1448-1460 (2012). （引用により本明細書に含まれる）
　本発明は、低分子化合物を用いた心筋分化誘導法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下を提供する。
１．多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法：
（１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
（２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
２．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、前記１に記載の方法：
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］。
３．Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であり、
　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
　Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成しており、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４の整数である、前記２に記載の方法。
４．Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）であり、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４の整数である、前記２に記載の方法。
５．Ｒ７が、ハロゲン原子である、前記４に記載の方法。
６．ｎが、１から４の整数である、前記３～５のいずれかに記載の方法。
７．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下から選択される化合物またはその塩である、前記１に記載の方法：
　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　ＫＹ０１０４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　Ｔ６１１６４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　ＫＹ０１０４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　ＫＹ０１０４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　ＫＹ０２１０９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　ＫＹ０１０４２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　ＫＹ０１０４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　ＫＹ０１０４６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　ＰＢ２８５２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　Ｎ１１４７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　ＰＢ２５７２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 　ＰＢ２５７０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 　ＫＹ０２１０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　ＳＯ０９６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ＳＯ０９４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 および、
　ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 。
８．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）である、前記７に記載の方法。
９．Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）である、前記８に記載の方法。
１０．工程（２）の培地が２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含み、前記２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤の１つが前記２～９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物である、前記１～９のいずれかに記載の方法。
１１．２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、前記２～９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩およびＸＡＶ９３９である、前記１０に記載の方法。
１２．ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１である、前記１～１１のいずれかに記載の方法。
１３．ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、前記１～１２のいずれかに記載の方法。
１４．ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡまたはプロストラチンである、前記１～１３のいずれかに記載の方法。
１５．ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡである、前記１～１４のいずれかに記載の方法。
１６．Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６である、前記１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９である、前記１～１６のいずれかに記載の方法。
１８．ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブである、前記１～１７のいずれかに記載の方法。
１９．ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８である、前記１～１８のいずれかに記載の方法。
２０．ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、
　ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、
　ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、
　Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、および
　ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、前記１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、前記２０に記載の方法。
２２．工程（１）および（２）における培地が蛋白質成分およびペプチド成分を含まない、前記１～２１のいずれかに記載の方法。
２３．工程（１）および（２）において細胞を浮遊培養により培養する、前記１～２２のいずれかに記載の方法。
２４．工程（１）が１～３日間であり、工程（２）が２～１３日間である、前記１～２３のいずれかに記載の方法。
２５．多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、前記１～２４のいずれかに記載の方法。
２６．多能性幹細胞がサルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、前記２５に記載の方法。
２７．心筋細胞の製造方法である、前記１～２６のいずれかに記載の方法。
２８．前記１～２７のいずれかに記載の方法により得られた心筋細胞。
２９．ＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット。
３０．ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、
　ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、
　ＷＮＴシグナル阻害剤が、
　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 および、
　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、
　Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、および
　ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、前記２９に記載の心筋分化促進用キット。
３１．ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、前記３０に記載の心筋分化促進用キット。
　本発明により、低分子化合物を用いた高効率かつ低コストな心筋分化誘導が可能となる。
ケミカルスクリーニングの概略図。 PKC活性剤であるプロストラチンの心筋分化に対する効果。＊（P<0.05, ttest）、すべてn=3。 PKC活性剤であるPMAの心筋分化に対する効果。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 EGF阻害剤であるAG1478およびゲフィチニブの心筋分化に対する効果。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 Src阻害剤であるA419259およびSU6656の心筋分化に対する効果。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 CHIR99021、PMA、KY03-I、XAV939、AG1478、およびA419259の6種類の化合物を用いたサルES細胞における心筋分化誘導。CHIR: CHIR99021、KY: KY03-I、XAV: XAV939、AG: AG1478、A419: A419259。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 6種類の化合物を用いた蛋白質フリー心筋分化（PFCD）誘導のプロトコールを示す。 MEFフィーダー細胞上で培養したヒト多能性幹細胞株から浮遊または接着培養条件下でPFCD誘導した分化細胞の心筋細胞率。心筋マーカーであるcTnT抗体で染色しフローサイトメトリー解析したドットデータ。 図２ｂのドットデータをまとめたグラフ。括弧内にそれぞれのn数を示す。 MEFフィーダー細胞上で培養したヒト多能性幹細胞株から浮遊または接着培養条件下でPFCD誘導した心筋細胞の全細胞数解析。2×106の未分化多能性幹細胞から得られた分化細胞数を示す。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 PMA添加あり（左写真、6化合物すべて添加）とPMA添加なし（右写真、PMA以外の5化合物添加）の条件下において、α-MHC プロモーター駆動GFP遺伝子導入サルES細胞株から、浮遊条件下でPFCD誘導（図２ａ）を行った際のGFP蛍光写真。 PFCDに使用している6種類の化合物(CHIR99021, PMA, KY03-I, XAV939, AG1478, A419259) からそれぞれの化合物を一つずつ除いた際の心筋細胞率。心筋マーカーであるcTnT抗体で染色しフローサイトメトリー解析したドットデータ。 図３ｂのドットデータをまとめたグラフ。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 図３ｃと同じ条件下でPFCD誘導した心筋細胞の全細胞数解析。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 心筋分化前期（day0-2）におけるCHIR99021およびPMAによる中胚葉関連遺伝子（MSGN1, T, MIXL1, NODAL）の発現量変化。コントロールとしてDMSO溶媒のみを添加し、その遺伝子発現レベルの値を１とした。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 心筋分化後期（day3-4）におけるXAV939、A419259、AG1478、およびKY03-Iによる中胚葉関連遺伝子（MSGN1, T, MIXL1, NODAL）の発現量変化。＊（P<0.05, ttest）、＊＊（P<0.01, ttest）、すべてn=3。 定量的PCR法によるPFCD心筋細胞の遺伝子発現解析。＊（P<0.05, ttest）、すべてn=3。 心室筋マーカーであるMLC2vおよび心房筋マーカーであるMLC2aの抗体染色によるフローサイトメトリー解析。 心室筋マーカーであるMLC2v、心房筋マーカーであるMLC2a、ペースメーカーマーカーであるHCN4、および全心筋細胞のマーカーであるcTnTの抗体染色によるフローサイトメトリー解析のドットデータをまとめたグラフ。＊（P<0.05, ttest）、すべてn=4。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のホールセルパッチクランプ法による電気生理学的解析。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のRP（静止膜電位）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のAmplitude（活動電位の振幅）。＊＊（P<0.01, ttest）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のAPD90（活動電位の持続時間）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のINa（電位依存性Naチャネル電流）。＊（P<0.05, ttest）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のICa（電位依存性Caチャネル電流）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のIKr（HERGチャネル電流）およびIKs（KCQN1チャネル電流）。＊（P<0.05, ttest）。 接着または浮遊培養条件下のPFCD心筋細胞のAPD increase（APD90の増加率）。C293B: Chromanol293B。＊（P<0.05, ttest）。 浮遊条件のPFCD心筋細胞のαActininおよびNKX2.5の免疫染色写真。 接着条件のPFCD心筋細胞のαActininおよびNKX2.5の免疫染色写真。 浮遊条件および接着条件のPFCD心筋細胞をαActinin 染色した際のpatterned細胞の割合。3回の独立した実験を行い、それぞれの実験において30～50個の心筋細胞についてαActinin染色パターンを図５ａおよびｂと同じ基準に従って判定し解析した。＊＊（P<0.01, ttest）。 浮遊条件および接着条件のPFCD心筋細胞の電子顕微鏡写真。 フィーダーフリーおよびゼノフリー条件で継代培養したヒトiPS細胞株(IMR90-1、253G1)から浮遊条件PFCD誘導法により得られた細胞の心筋細胞率（ａ）およびそれをまとめたグラフ（ｂ）。cTnT抗体で染色しフローサイトメトリー解析したドットデータ。ネガティブコントロールは一次抗体なしで染色した分化細胞である。それぞれn=3。 MEFフィーダー培養ヒトiPS細胞株（IMR90-1）から浮遊条件（ａ）または接着条件（ｂ）のPFCD誘導後14日目の心筋細胞の写真、および図６のフィーダーフリー・ゼノフリー培養ヒトiPS細胞株（253G1）から浮遊条件のPFCD誘導後14日目の心筋細胞の写真（ｃ）。
　本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類、さらにより好ましくは霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に、特にサルまたはヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に、好適である。
　ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3),  926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００－５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)）などのＥＳ細胞が挙げられる（これらの文献は引用により本明細書に含まれる）。例えば、ＥＳ細胞としては、ＣＭＫ６．４、ＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－３、ＫｈＥＳ－４、ＫｈＥＳ－５、Ｈ１、Ｈ９などを使用できる。
　ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 13726-13731 (1998)) （引用により本明細書に含まれる）が挙げられる。
　本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007) （これらの文献は引用により本明細書に含まれる）に記載される。しかしながら、人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。ｉＰＳ細胞としては、ＩＭＲ９０－１、ＩＭＲ９０－４、２０１Ｂ７、２５３Ｇ１などを使用できる。
　本発明における「Ｗｎｔシグナル活性化剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、ＢＩＯおよびＣＨＩＲ９９０２１、ＴＷＳ１１９などのＧＳＫ３β阻害剤が例示される。ある態様において、Ｗｎｔシグナル活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯであり、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。本発明においては、２種以上のＷｎｔシグナル活性化剤を併用してもよく、例えばＣＨＩＲ９９０２１とＢＩＯの両方を使用してもよい。
　本発明における「Ｗｎｔシグナル阻害剤」とは、Ｗｎｔシグナル経路を阻害する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル阻害剤には、例えば、国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩、ＩＷＰ２、ＩＷＰ４、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１などの化合物が含まれる。本発明においては、２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤を併用してもよい。ある態様において、２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤の１つが国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷｎｔシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物、好ましくはＸＡＶ９３９、である。２種以上のＷｎｔシグナル阻害剤がいずれも国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレットに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であってもよい。
　国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット（引用により本明細書に含まれる）に記載の式（Ｉ）の化合物は以下のとおりである：
　式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ［式中、
　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
　ｎは、０から６の整数である］。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基が挙げられる。
　炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基が挙げられる。
　ハロゲン原子としては、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦが挙げられる。
　好ましい態様において、Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ２及びＲ３は、好ましくは、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基であるか、又は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。さらに好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、さらにより好ましくはメトキシ基である。
　Ｒ１、Ｒ４及びＲ５は、好ましくは、水素原子である。
　ある態様において、Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐のアルキル基である）であり、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい。
　Ｒ６及びＲ９は、好ましくは、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、より好ましくは、水素原子である。
　好ましい態様において、Ｒ７は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であって、Ｒ８は、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であるか、又は、Ｒ７及びＲ８は、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成している。
　ある態様において、Ｒ７は、基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖アルコキシ基であり、基－Ｃ（Ｏ）Ａは前記アルコキシ基の末端の炭素原子に結合している。
　好ましい態様において、Ａは窒素原子を少なくとも１つ含み、そのようなＡとしては、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、及びピリダジニル基が例示される。より好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジニル基、ピペラジニル基、又はモルホリニル基である。さらに好ましい態様において、Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された、ピペリジン－１－イル基、ピペラジン－１－イル基、又はモルホリン－４－イル基である。
　Ｒ１０及びＲ１１は、好ましくは、水素原子である。
　ある態様において、ｎは、０から４、１から４、もしくは１から３の整数、または２もしくは３である。
　ある態様において、Ｘは、酸素原子；硫黄原子；基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である。Ｘは、好ましくは、硫黄原子である。
　ある態様において、式（I）の化合物は、
　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であり、
　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
　Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成しており、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
　ある態様において、式（I）の化合物は、
　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）であり、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
　ある態様において、式（I）の化合物は、
　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ７が、ハロゲン原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
　ある態様において、式（I）の化合物は、
　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
　Ｒ７が、ハロゲン原子であり、
　Ｒ２及びＲ３が、メトキシ基であり、
　Ｘが、硫黄原子であり、および
　ｎが、０から４、好ましくは１から４の整数である。
　ある態様において、式（Ｉ）の化合物は、以下から選択される：
　ＫＹ０２１１１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 　ＫＹ０１０４１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 　Ｔ６１１６４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　ＫＹ０２１１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 　ＫＹ０１０４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 　ＫＹ０１０４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 　ＫＹ０２１０９
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 　ＫＹ０１０４２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 　ＫＹ０１０４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 　ＫＹ０１０４６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 　ＰＢ２８５２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　Ｎ１１４７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 　ＰＢ２５７２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 　ＰＢ２５７０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 　ＫＹ０２１０４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 　ＳＯ０８７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 　ＳＯ１０２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 　ＳＯ０９６
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 　ＳＯ０９４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 　ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 。
　式（Ｉ）の化合物は、好ましくはＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）であり、より好ましくはＫＹ０２１１１またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）であり、さらにより好ましくはＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）である。
　式（Ｉ）の化合物は、公知の方法（J. Med. Chem., 1965, 8 (5), pp 734-735）（引用により本明細書に含まれる）により、あるいは国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット（引用により本明細書に含まれる）に記載の方法に準じて、合成することができる。あるいは、UkrOrgSynthesis社（ＰＢ２８５２、ＰＢ２５７２、ＰＢ２５７０）やENAMINE社（Ｔ６１１６４）などから入手可能である。
　「ＰＫＣ活性化剤」は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはその下流のシグナル伝達経路を活性化する物質を意味する。ＰＫＣ活性化剤としては、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（Phorbol 12-myristate 13-acetate）（ＰＭＡ）、プロストラチン、ブリオスタチン１（Bryostatin 1）、ブリオスタチン２（Bryostatin 2）、ＦＲ２３６９２４、（－）－インドラクタムＶ（(-)-Indolactam V）、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３－ジブチラート（Phorbol 12,13-dibutyrate）、ＳＣ－９、ＳＣ－１０、１－オレオイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロール（1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol）、１－Ｏ－ヘキサデシル－２－Ｏ－アラキドニル－ｓｎ－グリセロール（1-O-Hexadecyl-2-O-arachidonyl-sn-glycerol）、１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロール（1,2-Dioctanoyl-sn-glycerol）、ＰＩＰ２、レシニフェラトキシン（Resiniferatoxin）、ホルボール１２，１３－ジヘキサノアート（Phorbol 12,13-Dihexanoate）、メゼレイン（Mezerein）、インゲノール３－アンゲラート（Ingenol 3-Angelate）、ＲＨＣ－８０２６７、ＤＣＰ－ＬＡ、リポキシンＡ４（Lipoxin A4）などが例示される。ある態様において、ＰＫＣ活性化剤は、ホルボルエステル系ＰＫＣ活性化剤である、ＰＭＡ、プロストラチン、ＰＥＰ００５、ホルボール１２，１３－ジブチラート、レシニフェラトキシン、ホルボール１２，１３－ジヘキサノアート、メゼレイン、またはインゲノール３－アンゲラートである。本発明においては、２種以上のＰＫＣ活性化剤を併用してもよい。好ましい態様において、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＭＡまたはプロストラチンであり、より好ましくはＰＭＡである。
　「Ｓｒｃ阻害剤」は、チロシンキナーゼであるＳｒｃまたはその下流のシグナル伝達経路を阻害する物質を意味する。Ｓｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９２５９、ＳＵ６６５６、ＰＰ１、１－ナフチルＰＰ１（1-Naphthyl PP1）、ＰＰ２、インジルビン－３’－（２，３－ジヒドロキシプロピル）－オキシムエーテル（Indirubin-3'-(2,3-dihydroxypropyl)-oximether）、ＴＸ－１１２３、Src Kinase Inhibitor I（CAS 179248-59-0）、ＡＺＭ４７５２７１、ボスチニブ（Bosutinib）、ハービマイシンＡ（Herbimycin A）、ＫＢ　ＳＲＣ　４、ＭＮＳ、ＰＤ１６６２８５、ＴＣ－Ｓ７００３などが例示される。ある態様において、Ｓｒｃ阻害剤は、Ａ４１９２５９、ＫＢ　ＳＲＣ　４、ＳＵ６６５６、またはインジルビン－３’－（２，３－ジヒドロキシプロピル）－オキシムエーテルである。本発明においては、２種以上のＳｒｃ阻害剤を併用してもよい。好ましい態様において、Ｓｒｃ阻害剤は、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６であり、より好ましくはＡ４１９２５９である。
　「ＥＧＦ受容体阻害剤」（ＥＧＦＲ阻害剤とも記載する）は、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質を意味する。ＥＧＦ受容体阻害剤としては、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ（Gefitinib）、アファチニブ（Afatinib）、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ－Ｉ、ＢＰＩＱ－ＩＩ、カネルチニブ（Canertinib）、ＣＬ－３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ（Dacomitinib）、バンデタニブ（Vandetanib）、EGFR Inhibitor III（Ｎ－（４－（（３，４－ジクロロ－６－フルオロフェニル）アミノ）－キナゾリン－６－イル）－２－クロロアセトアミド、CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（４－（４－ベンジルオキシアニリノ）－６，７－ジメトキシキナゾリン、CAS 179248-61-4）、エルロチニブ（Erlotinib）、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ（Lapatinib）、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＯＳＩ－４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ（Pelitinib）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　５６、ＸＬ６５７、ＰＰ３、ＡＧ－４９０、ＡＧ５５５、チロホスチン（Tyrphostin）Ｂ４２、チロホスチンＢ４４、ＡＧ５５６、ＡＧ４９４、ＡＧ８２５、ＲＧ－１３０２２、ＤＡＰＨ、EGFR Inhibitor（シクロプロパンカルボン酸－（３－（６－（３－トリフルオロメチル－フェニルアミノ）－ピリミジン－４－イルアミノ）－フェニル）－アミド、CAS 879127-07-8）、エルブスタチンアナログ（Erbstatin Analog）（メチル　２，５－ジヒドロキシシナマート、CAS 63177-57-1）、ＪＮＪ２８８７１０６３、チロホスチン４７、ラベンダスチン（Lavendustin）Ａ、ラベンダスチンＣ、ラベンダスチンＣメチルエステル、ＬＦＭ－Ａ１２、ＴＡＫ１６５、ＴＡＫ２８５、チロホスチン５１、チロホスチンＡＧ１８３、チロホスチンＡＧ５２８、チロホスチンＡＧ９９、チロホスチンＲＧ１４６２０、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ブテイン、チロホスチンＡＧ１１２などが例示される。ある態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、キナゾリン系骨格を有するＥＧＦ受容体阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＳＴ１３０６、ＡＺＤ８９３１、ＢＩＢＵ１３６１、ＢＩＢＸ１３８２、ＢＰＤＱ、ＢＰＩＱ－Ｉ、ＢＰＩＱ－ＩＩ、カネルチニブ、ＣＬ－３８７，７８５、ＣＵＤＣ１０１、ダコミチニブ、バンデタニブ、EGFR Inhibitor III（CAS 733009-42-2）、EGFR/ErbB-2 Inhibitor（CAS 179248-61-4）、エルロチニブ、ＧＷ５８３３４０、ＧＷ２９７４、ＨＤＳ０２９、ラパチニブ、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＯＳＩ－４２０、ＰＤ１５３０３５、ＰＤ１６８３９３、ＰＤ１７４２６５、ペリチニブ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　５６、もしくはＸＬ６５７である。好ましい態様において、ＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブ、より好ましくはＡＧ１４７８である。ＥＧＦ受容体阻害剤は、Santa Cruz Biotechなどから入手可能である。
　本発明の多能性幹細胞の心筋細胞誘導方法は、インビトロで実施される。本発明の方法に用いる培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される培地（以下、心筋分化培地ともいう）であればよく、その組成は特に限定はされない。本発明の方法に用いる培地は、タンパク質成分やペプチド成分を含んでいてもよいが、含まないことが好ましい。本発明における培地は、例えば、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ－グルタミンを含む。ある態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ－グルタミンを含む。培地は、ＩＭＤＭ培地および／またはＤＭＥＭ培地、MEM non-essential amino acid solution、並びにＬ－グルタミンに加えて、Ｌ－カルニチン、アスコルビン酸、および／またはクレアチンを含んでもよい。好ましい態様において、培地は、ＩＭＤＭ培地およびＤＭＥＭ培地（好ましくはＩＭＤＭ：ＤＭＥＭ=１：１）、MEM non-essential amino acid solution、Ｌ－グルタミン、Ｌ－カルニチン、アスコルビン酸、およびクレアチンを含む。また、培地は、必要に応じてペニシリン-ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでもよい。本発明の方法に用いる培地としては、実施例で使用しているＩＭＤＭおよびＤＭＥＭを基本とした培地（ＩＭＤＭ　２４２ｍｌ、ＤＭＤＭ　２４２ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）　５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（×１００）　５ｍｌ、０．２Ｍ　Ｌ－グルタミン　５ｍｌ、１Ｍ　Ｌ－カルニチン　１００μｌ、アスコルビン酸　５０ｍｇ、０．５Ｍクレアチン　１ｍｌ含有）が例示される。
　また、本発明の方法には、公知のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、ＩＭＤＭ培地　２００ｍｌ、ウシ胎児血清　５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）　２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（×１００）　２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール　２μ１、５Ｎ　ＮａＯＨ　２５５μｌ含有）、公知のＤＭＥＭ培地を基本とした心筋分化培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地　２００ｍｌ、ウシ胎児血清　５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution（×１００）　２．５ｍｌ、ペニシリン－ストレプトマイシン（×１００）　２．５ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ－グルタミン　２．５ｍｌ、２－メルカプトエタノール含有）、またはStemPro（登録商標）-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）などの培地を使用可能である。
　本発明の方法においては、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に適した培養方法を用いることができる。培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法等が挙げられる。好ましい態様において、本発明の方法は、浮遊培養法で実施する。培養開始時の多能性幹細胞の細胞数は、培養方法、培養容器、細胞の種類等によって適宜決定されるが、１×１０５細胞／ｍｌ～１０×１０５細胞／ｍｌ程度で播種すればよい。培地の交換は、１～３日に１回、例えば２日に一回、行えばよい。
　本発明の方法において、工程（１）および工程（２）の期間、および工程（１）の終了から工程（２）の開始までの期間は、細胞の種類等に応じて適宜変更されうる。工程（２）は、工程（１）の終了直後から開始してもよいし、工程（１）の終了から一定期間後に開始してもよい。例えば、工程（１）の終了後、ＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤のいずれも含まない培地中で細胞を１～２日間、好ましくは１日間培養した後、培地をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地に交換し、工程（２）を開始してもよい。
　例えば、本発明の方法では、工程（１）を１～３日間実施し、次いで、工程（２）を、工程（１）の終了直後または工程（１）の終了の１～２日後から、２～１３日間、好ましくは３～１０日間、より好ましくは４～１０日間、さらに好ましくは４～８日間、実施する。例えば、工程（１）の開始日を０日目として、０～１日目、０～２日目または０～３日目に工程（１）を実施し、工程（１）の終了直後または工程（１）の終了の１～２日後から、２～１０日目（８日間）、２～９日目（７日間）、２～８日目（６日間）、２～７日目（５日間）、２～６日目（４日間）、３～１０日目（７日間）、３～９日目（６日間）、３～８日目（５日間）、３～７日目（４日間）、４～１０日目（６日間）、４～９日目（５日間）、または４～８日目（４日間）に、工程（２）を実施することができる。
　工程（１）は、多能性幹細胞から中胚葉への分化誘導期である心筋分化誘導の前期段階にあたることから、工程（１）の期間は、中胚葉関連遺伝子の発現に基づき決定することもできる。中胚葉関連遺伝子としては、Ｔ、ＭＩＸＬ１、ＮＯＤＡＬ等が挙げられる。工程（２）は中胚葉から心筋細胞へ分化する心筋分化誘導の後期段階にあたり、その期間は、心筋細胞への分化を確認することによって決定することができる。心筋細胞への分化は、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。心筋マーカーとしては、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、およびＮＫＸ２．５が挙げられる。また、イオンチャネルとしては、ＨＣＮ４、Ｎａｖ１．５、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ３．２、ＨＥＲＧ１ｂ、およびＫＣＮＱ１が挙げられる。
　Ｗｎｔシグナル活性化剤およびＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。Ｗｎｔシグナル活性化剤としてＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合、例えば最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、またはＩＷＲ１を用いる場合、例えば最終濃度０.５～２０μＭ、好ましくは０.５～１０μＭ、より好ましくは１～１０μＭで使用すればよい。Ｗｎｔシグナル阻害剤として式（Ｉ）の化合物またはその塩を用いる場合、使用する化合物またはその塩に応じて、例えば最終濃度０.１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは１～１０μＭで使用すればよい。
　ＰＫＣ活性化剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。ＰＭＡの場合、例えば最終濃度０．０１μＭ～１０μＭ、好ましくは０．０３～１μＭ、より好ましくは０．1～１μＭで、プロストラチンの場合、例えば最終濃度０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは１～１０μＭで、使用すればよい。
　Ｓｒｃ阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。Ａ４１９２５９およびＳＵ６６５６の場合、例えば最終濃度０．１μＭ～１０μＭ、好ましくは０．１μＭ～３μＭ、より好ましくは０．３～３μＭで使用すればよい。
　ＥＧＦ受容体阻害剤の濃度は、使用する細胞および薬剤等に応じて適宜変更されうる。ゲフィチニブまたはＡＧ１４７８の場合、例えば最終濃度１００ｎＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～２０μＭで、ＰＰ３の場合、例えば最終濃度１μＭ～１ｍＭ、好ましくは１０μＭ～１００μＭで使用すればよい。
　本発明の方法は、心筋細胞の製造に用いることができる。心筋細胞が得られたことは、拍動心筋細胞の数、心筋マーカーの発現、イオンチャネルの発現、電気生理学的刺激に対する反応等により確認することができる。本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
　本発明の心筋分化用キットは、ＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含み、さらに本発明の方法に用いる培地や培養容器等を含んでもよい。本発明のキットに用いられるＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤は、本発明の心筋分化誘導方法について記載したとおりである。好ましい態様において、本発明のキットは、ＷＮＴシグナル活性化剤としてＣＨＩＲ９９０２１、ＰＫＣ活性化剤としてＰＭＡ、ＷＮＴシグナル阻害剤としてＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）およびＸＡＶ９３９、Ｓｒｃ阻害剤としてＡ４１９２５９、およびＥＧＦ受容体阻害剤としてＡＧ１４７８を含む。
　本発明はまた、ＰＫＣ活性化剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤、多能性幹細胞の心筋分化促進剤の製造のためのＰＫＣ活性化剤の使用、およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む多能性幹細胞の心筋分化誘導法を提供する。ＰＫＣ活性化剤は、心筋分化誘導の前期段階に、例えば心筋分化培地での培養開始から１～３日間、使用すればよい。本発明はまた、Ｓｒｃ阻害剤を含む多能性幹細胞の心筋分化促進剤、多能性幹細胞の心筋分化促進剤の製造のためのＳｒｃ阻害剤の使用、およびＳｒｃ阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む多能性幹細胞の心筋分化誘導法を提供する。Ｓｒｃ阻害剤は、心筋分化誘導の後期段階に、例えば心筋分化培地での培養の２、３、または４日目から２～１３日間、好ましくは３～１０日間、より好ましくは４～１０日間、さらに好ましくは４～８日間、使用すればよい。これら態様においては、前述の多能性幹細胞および培地を用いることができる。
　以下、実施例によりさらに本発明を説明するが、本発明は如何なる意味においても本実施例により限定されない。
スクリーニングした化合物
　本発明でスクリーニングを行った20種類の化合物とそれらの心筋分化促進効果を表１に示す。それぞれの化合物について、心筋分化の前期（Early）と後期（Late）において濃度依存的（0.3uM, 1uM, 3uM, 10uM）に培養液に添加し、図１aの心筋分化プロトコールに従いGFP蛍光量の解析を行った。すべての条件において分化後期に10uMのKY02111を添加しており、このKY02111のみの条件におけるGFP蛍光量を１とした。KY02111のみの条件よりも3倍以上GFP蛍光量が増えている化合物（KY02111に対し加算的に心筋分化を促進している化合物）の添加条件をグレーで示している。PKC活性剤のプロストラチン（Prostratin）、Src阻害剤のA419259、およびEGF阻害剤のAG1478が、それぞれ適切な条件において心筋分化を促進していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
PKC活性化剤、EGFR阻害剤、およびSrc阻害剤による心筋分化促進。
　図１ａにケミカルスクリーニングの概略を示す。αMHCプロモーター駆動GFP遺伝子導入サルES細胞株（Minami et al., Cell Reports 2, 1448-1460, 2012）（引用により本明細書に含まれる）を用いて、KY02111化合物処理に対して加算的にGFP蛍光量が増加する化合物をスクリーニングした。サルES細胞株（カニクイザルCMK6.4株）に、心筋分化マーカーであるαMHC遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光蛋白質（GFP）を発現するベクターを導入し、6ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に4.0×105細胞／ウェルにて播種し、IMDM培地を基本とした心筋分化培地（IMDM培地（Sigma l3390） 200 ml、ウシ胎児血清（GIBCO 10099-141） 50 ml、MEM non-essential amino acid solution （Sigma M7145） 2.5 ml、ペニシリン－ストレプトマイシン（GIBCO 15140） 2.5 ml、200 mM L-グルタミン 2.5 ml、2-メルカプトエタノール（Sigma M7522） 2u1、5N NaOH 255ulを混合したもの）で9日間培養した。心筋分化前期（day 0-3、Early）と分化後期（day 4-7、Late）に対し、スクリーニング化合物を濃度依存的に添加し、心筋分化培養9日目(day 9)にGFP蛍光量をMetamorph イメージングシステムで解析した。
　PKC活性剤であるプロストラチン (図１ｂ)とPMA (図１ｃ)が心筋分化前期において濃度依存的に心筋分化を促進した。プロストラチン（3-10uM）およびPMA（0.03-0.3 uM）は、単独でも、KY02111（10uM、分化後期）との組み合わせ投与（KY+Prost、KY+PMA）においても、心筋分化を促進してした（3～8倍）。
　EGF阻害剤であるAG1478とゲフィチニブが心筋分化後期において濃度依存的に心筋分化を促進した（図１ｄ）。AG1478（10-30uM）およびゲフィチニブ（10-30uM）は、単独でも、KY02111（10uM、分化後期）との組み合わせ投与（KY+AG、KY+Gef）においても、心筋分化を促進していた（2～3倍）。
　Src阻害剤であるA419259とSU6656が心筋分化後期において濃度依存的に心筋分化を促進した。A419259（1-3uM）およびSU6656（1-3uM）は、単独でも、KY02111（10uM、分化後期）との組み合わせ投与（KY+A419、KY+SU66）においても、心筋分化を促進していた（2～5倍）。
　CHIR99021、PMA、KY03-I、XAV939、AG1478、およびA419259の6種類の化合物を用いて、GFP遺伝子導入サルES細胞株（CMK6.4）での心筋分化誘導を行った。1 uM CHIR99021と 0.1 uM PMAを分化初期（day0-2）に、3 uM KY03-I、1 uM XAV939、10 uM AG1478、 0.3 uM  A419259を分化後期（day3-7）に添加した際のGFP蛍光量を解析した。これら6種類の化合物組み合わせ投与により、著しい心筋分化促進効果が見られた（DMSO添加に比べて約750倍）（図１ｆ）。
蛋白質フリーのヒト多能性幹細胞の心筋分化
　6種類の化合物を用いた蛋白質フリー心筋分化（PFCD）誘導法プロトコールを図２ａに示す。まず、心筋分化前期（day 0-2）において、多能性幹細胞の浮遊コロニー（Minami, I. et al., Cell reports 2, 1448-1460 (2012)および国際公開第２０１３／１１１８７５号パンフレットに記載のとおり調製）（これら文献は引用により本明細書に含まれる）をGSK3β阻害剤(2 uM CHIR99021) とPKC 活性剤 (0.3 uM PMA または 3 uM プロストラチン)を添加したPFCD培地（表２）により、浮遊培養条件下で培養した。次に、1日間（day 2-3）化合物なしのPFCD培地で培養した後、分化後期（day-3-7）にWntシグナル阻害剤（3uM KY03-Iおよび1uM XAV939）とEGFR阻害剤（10uM AG1478）、Src阻害剤（0.3 uM A419259）を添加したPFCD培地中で、浮遊培養条件下あるいは接着培養条件下で培養した。浮遊培養条件では低接着ディッシュ（和光641-07391またはコーニングYO-01835-24）で、接着培養条件では通常のディッシュ（ファルコン 353004）上で培養した。接着条件においても、ディッシュをコーティングすることなしに、蛋白質フリーの条件下で接着培養した。拍動心筋コロニーは通常day7～9から観察された。分化した心筋細胞はPFCD培地中、浮遊/接着条件下で1～2か月間維持できた。
　表２に、PFCD培地の培地成分とそれぞれの購入価格を示す。蛋白質やペプチドを含まず、すべて合成可能な低分子化合物やアミノ酸で構成されている。500mlあたり1200円以下で作製可能で、非常に低価格である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
　MEFフィーダー細胞上で培養したヒト多能性幹細胞株から浮遊または接着培養条件下でPFCD誘導した分化細胞の心筋細胞率について、心筋マーカーであるcTnT抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析した（図２ｂ）。ネガティブコントロールは一次抗体なしで染色した分化細胞とした。それぞれのサンプルについて30,000個の細胞をFACSCantoIIで解析した。ヒトiPS細胞株（IMR90-1, 201B7, 253G1）およびヒトES細胞株（KhES-1, KhES-3, H9）からPFCD分化誘導した細胞について、それぞれn=3以上でフローサイトメトリー解析を行ったところ、すべての細胞株で平均約90%の心筋細胞率を示した（図２ｃ）。
　図２ｄは、上記の多能性幹細胞株から浮遊または接着培養条件下でPFCD誘導した心筋細胞の全細胞数解析の結果を示す。2×106の未分化多能性幹細胞から得られた分化細胞数を示す。ほとんどの細胞株において、浮遊培養条件の方が得られた細胞数が多かった。フローサイトメトリー解析と細胞数測定はすべてday14に行った。
蛋白質フリー条件下での心筋分化における、WNTシグナル活性化剤、PKC活性化剤、WNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGFR阻害剤の影響
　図３ａは、PMA添加あり（左写真、6化合物すべて添加）とPMA添加なし（右写真、PMA以外の5化合物添加）の条件下において、αMHC プロモーター駆動GFP遺伝子導入サルES細胞株から、浮遊条件下でPFCD誘導（図２ａ）を行った際のGFP蛍光写真を示す。PMAありの条件ではほとんどすべてのコロニーがGFP陽性であるのに対し、PMAなしの条件ではGFP蛍光がほとんど見られなかった。
　PFCDに使用している6種類の化合物(CHIR99021, PMA, KY03-I, XAV939, AG1478, A419259) からそれぞれの化合物を一つずつ除いた際の浮遊条件下PFCD（MEFフィーダー培養IMR90-1株）に対する影響を、cTnT抗体染色によるフローサイトメトリーで解析した。ネガティブコントロールは一次抗体なしで染色した分化細胞とした。それぞれのサンプルについて30,000個の細胞をFACSCantoIIで解析した。上記6種類の化合物のうち、どれを除いてもcTnT陽性心筋細胞率は低下した（図３ｂ、ｃ）。
　図３ｄは、図３ｃと同じ条件下でPFCD誘導した心筋細胞の全細胞数解析の結果を示す。CHIR99021とPMAをそれぞれ除くと細胞数が顕著に減少した。フローサイトメトリー解析と細胞数測定はすべてday14に行った。
　心筋分化前期（day0-2）において、ヒトiPS細胞株（MEFフィーダー培養IMR90-1）に対し、2uM CHIR99021もしくは0.3uM PMA、またはその両方（CHIR99021+PMA）をPFCD培地中に添加し、day 2 にmRNAを回収して、定量的PCR 法により中胚葉関連遺伝子（MSGN1, T, MIXL1, NODAL）の発現量変化を解析した（図３ｅ）。 コントロールとしてDMSO溶媒のみを添加し、その遺伝子発現レベルの値を１とした。その結果、CHIR99021の添加により中胚葉関連遺伝子の発現量は顕著に増加したが、PMAを添加するとそれらの発現量が逆に減少していた。しかしながら、CHIR99021とPMAを同時に添加（通常の高効率なPFCD条件）すると、PMAによる中胚葉関連遺伝子の発現量低下がキャンセルされており、さらにMSGN1については、同時添加することでCHIR99021単独投与よりも約6倍に発現量が増加していた。CHIR99021とPMAの同時添加によるMSGN1の発現量増加が効率的なPFCDに寄与している可能性がある。
　心筋分化後期（day3-4）において、ヒトiPS細胞株（MEFフィーダー培養IMR90-1）に対し、1uM XAV939、0.3uM A419259、10uM AG1478、もくしは3uM KY03-I、またはそれら4化合物すべて（XAV939+ A419259+ AG1478+ KY03-I）をPFCD培地中に添加し、day 4 にmRNAを回収して、定量的PCR 法により中胚葉関連遺伝子（MSGN1, T, MIXL1, NODAL）の発現量変化を解析した（図３ｆ）。その結果、これら4化合物のそれぞれがMSGN1、T、MIXL1の遺伝子発現量を低下させており、さらに4化合物の同時添加で最も顕著にそれらの発現量を低下させていた。NODALに関しては、4化合物それぞれの添加では有意な発現量変化は見られなかったが、4化合物の同時添加により発現量が有意に増加していた。これら4化合物の添加による協調的な中胚葉遺伝子発現の変化が、効率的なPFCDに寄与している可能性がある。一般的に、心筋分化前期には中胚葉関連遺伝子の発現が増加し、分化後期にはそれらが減少することが知られている。
PFCD誘導法によりヒト多能性幹細胞から誘導された心筋細胞における心筋マーカーおよびチャンネルの発現。
　定量的PCR法により、PFCD心筋細胞の遺伝子発現を解析した。誘導後7、14、30、60日目において、浮遊条件と接着条件のPFCD心筋細胞（MEFフィーダー培養IMR90-1由来）からトータルmRNAを回収し、定量的PCR法で心筋マーカーとチャネル遺伝子の発現を比較した。心筋マーカー (αMHC, βMHC, cTnT, αActinin, NKX2.5)と 心筋チャネル (KCNQ1, HERG1b, Nav1.5, Cav1.2, Kir2.1)について、すべてのサンプルで遺伝子発現が見られた（ヒト成人心臓由来mRNAにおける各心筋関連遺伝子の発現レベルを１とした）（図４ａ）。ヒト心筋成熟マーカーとして知られるβMHC や心筋静止膜電位の形成に重要であるKir2.1がヒト成人心臓の発現レベルに比べて1/10程度と低く、このPFCD心筋細胞は実際の成人心臓組織に比べてまだ十分に成熟していないと考えられるが、培養日数と共に発現量が増加する傾向が見られおり、経時的には心筋成熟が進んでいると言える。また、βMHC、αActinin、およびKCNQ1について、接着条件よりも浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が、発現量が有意に高かった。このことは、浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が接着条件よりも心筋成熟度が進んでいることを示唆している。
　心室筋マーカーであるMLC2v、心房筋マーカーであるMLC2a、ペースメーカーマーカーであるHCN4、および全心筋細胞のマーカーであるcTnTの抗体染色によるフローサイトメトリーによってPFCD心筋細胞を解析した。分化誘導後30日目のPFCD心筋細胞（MEFフィーダー培養IMR90-1由来）について、浮遊条件と接着条件の比較を行った。MLC2vとMLC2aの2重染色を行った（図４ｂ）ところ、MLC2v単体陽性細胞は約70%、MLC2a単体陽性細胞は0.2-0.3％と浮遊条件と接着条件で差がなかったが、MLC2v/MLC2aの２重陽性細胞は浮遊で約9%、接着で13%と浮遊条件で有意に割合が低かった（図４ｂ、ｃ）。MLC2v/MLC2aの２重陽性細胞は未熟な心室筋細胞と言われており、このことは浮遊条件のPFCD細胞では接着条件に比べて未熟な心室筋細胞が少ないことを示している。また、HCN4陽性細胞（ペースメーカー）は約10%であり、cTnT陽性細胞は約90%であった（図４ｃ）。一次抗体なしで染色した細胞をネガティブコントロールとした。それぞれのサンプルについて30,000個の細胞をFACSCantoIIで解析した。
　ホールセルパッチクランプ法によりPFCD心筋細胞の電気生理学的解析を行った。分化誘導後30日目のPFCD心筋細胞（MEFフィーダー培養IMR90-1由来）について、浮遊条件と接着条件の比較を行った。まず、活動電位の波形を解析したところ、浮遊条件・接着条件の両方で、RP（静止膜電位）は約-60mV前後 （図４ｄ、ｅ）、APD90（活動電位の持続時間）は約0.7 sec （図４ｄ、ｇ）であり有意な差は無かったが、Amplitude（活動電位の振幅）については浮遊条件が約105mV、接着条件が約90mVであり （図４ｄ、ｆ）、浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が有意に高い値を示した。また、INa（電位依存性Naチャネル電流）とICa（電位依存性Caチャネル電流）を比較したところ、INaに関しては浮遊条件の方が有意に高い値を示し （図４ｈ）、ICaについても浮遊条件の方が高い傾向があったが、有意な差は見られなかった （図４ｉ）。さらに、IKr（HERGチャネル電流）とIKs（KCQN1チャネル電流）を解析したところ、IKrには有意な差が見られなかったがIKsに関しては浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が高い値を示した （図４ｊ）。また、HERGチャネルの阻害剤であるE4031とKCNQ1チャネル阻害剤であるChromanol293B（C293B）を添加した際の活動電位の持続時間（APD90）の変化を比較解析したところ、E4031を添加した際のAPD90の増加率（APD increase %）には有意な差がなかったが、C293Bを添加した際のAPD90の増加率については、浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が接着条件の心筋細胞よりも有意に高い値を示した（図４ｋ）。
　浮遊条件で有意に値が高かった測定値のうち、AmplitudeとINaは電位依存性Naチャネルの発現量に依存していると考えられ、図４ａにおいてNav1.5チャネル（電位依存性Naチャネルのサブタイプ）の発現量が浮遊条件で高い傾向があることと一致した結果となっている。次にIKsはKCQN1チャネル電流であり、APD increase (C293B)もKCNQ1阻害剤であるC293Bの影響であるため、これらの値が浮遊条件で高い値を示すことは、図４ａのKCNQ1発現レベルが浮遊条件で有意に高いことと一致している。また、成熟したヒト成人心室筋細胞のRPは-80～-90mVであり、一方PFCD心筋細胞のRPは-60mV程度で、比較的未成熟な浅いRPであったが、これは図４ａにおいてRPの形成に重要であるKir2.1の発現量がPFCD心筋細胞において全体的に低い値（ヒト成熟心筋組織の約十分の1）を示していることと一致している。結論としては、RPが浅いなど、ヒト成熟心筋細胞に比べて未成熟な心筋細胞であるものの、遺伝子発現レベルと電気生理学的解析結果の両方の点において、浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が接着条件の心筋細胞よりも成熟化が進んでいると言える。
PFCD心筋細胞のサルコメア構造の解析
　心筋サルコメアのZ盤マーカーであるαActininと、心筋細胞の転写因子マーカーであるNKX2.5について免疫染色を行った（図５ａ、ｂ）。細胞核はDAPIにより染色した。分化誘導後30日目のPFCD心筋細胞（MEFフィーダー培養IMR90-1由来）について、浮遊条件と接着条件の比較を行った。その結果、αActinin の明瞭な縞模様状の染色パターンが見られる（patterned αActinin、白矢印）心筋細胞と、明瞭なパターンが見られない（un-patterned αActinin、白三角）心筋細胞の2種類が観察された。浮遊条件のPFCD心筋細胞にはpatterned細胞が多く観察されたのに対し、接着条件のPFCD心筋細胞にはpatterned細胞が少なく、un-patterned細胞が多く観察された。
　PFCD心筋細胞をαActinin 染色した際のpatterned細胞の割合を浮遊条件と接着条件の間で比較した（図５ｃ）。浮遊条件では約80%の心筋細胞がpatterned細胞であったのに対し、接着条件では約50%しかpatterned細胞が見られず、浮遊条件で有意に高い値を示した。
　電子顕微鏡で細胞内サルコメア構造を確認したところ、Z盤 (黒矢印)、M帯(白矢印)、筋フィラメント (右パネル) が浮遊培養条件の心筋細胞で、整列したより明瞭な構造として観察された（図５ｄ）。これはαActininの免疫染色データと一致した結果となっている。
　明瞭なサルコメア構造の形成は心筋繊維の成熟化基準の一つであり、これらのデータは、浮遊条件のPFCD心筋細胞の方が、接着条件のPFCD心筋細胞よりも筋繊維構造が成熟していることを示唆している。また、図４aのαActininの遺伝子発現レベルについて、接着条件よりも浮遊条件のPFCD心筋細胞で高い値を示したが、これは浮遊条件のPFCD心筋細胞の方がサルコメア構造が成熟していることによるものである可能性が高いと考えられる。
フィーダーフリーおよびゼノフリー条件のヒト多能性幹細胞からの蛋白質フリー心筋分化
　フィーダーフリー（ラミニンフラグメント接着法、Miyazaki, T. et al. Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun 3, 1236 (2012) （引用により本明細書に含まれる））、かつゼノフリー（Essential8培地、Chen, G. et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods 8, 424-429 (2011) （引用により本明細書に含まれる））の条件で継代培養したヒトiPS細胞株(IMR90-1、253G1)から浮遊条件PFCD誘導法により得られた細胞の心筋細胞率を調べた（図６ａ、ｂ）。心筋マーカーであるcTnT抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。それぞれのサンプルについて30,000個の細胞をFACSCantoIIで解析した。MEFフィーダー細胞を用いず、動物由来成分を含まないゼノフリーのEssential8培地で培養した未分化iPS細胞株からでも、PFCD誘導が約85%の心筋細胞率で可能であった。上記のフィーダーフリー・ゼノフリーの多能性幹細胞培養法は蛋白質フリーではない（5種類の蛋白質を使用している、上記論文Chen,G. et al参照）ものの、現時点で最も臨床に適した未分化多能性幹細胞の培養法であり、この条件のiPS細胞からPFCD誘導によって得られたこれらの心筋細胞は、現時点で最も臨床グレードの条件を満たしている。
　図７ａおよびｂは、MEFフィーダー培養ヒトiPS細胞株（IMR90-1）から浮遊条件のPFCD誘導後14日目の心筋細胞と接着条件のPFCD誘導後14日目の心筋細胞の写真を示す。図７ｃは、図６のフィーダーフリー・ゼノフリー培養ヒトiPS細胞株（253G1）から浮遊条件のPFCD誘導後14日目の心筋細胞の写真を示す。
製造例
ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３，４－ジメトキシフェニル酢酸（１５７ｍｇ，０．７９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３９μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（２－（３，４－ジメトキシフェニル）アセトアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを１６７ｍｇ、収率５０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.61 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.73-7.69 (m ,1H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97-6.84 (m, 3H), 3.75-3.72 (m, 8H).
MS (ESI) Found; 455 [M+H]+
ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 　４－ヨードアニリン（１．００ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３ｍｌ）溶液に、チオカルボニルジイミダゾール（９７６ｍｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を加えて１．５時間、室温にて攪拌した。２５％アンモニア水（３ｍｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去し、析出物を濾過して１－（４－ヨードフェニル）チオウレアを８８９ｍｇ、収率５９％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 　１－（４－ヨードフェニル）チオウレア（８８９ｍｇ，３．１９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７ｍｌ）懸濁液に、臭素（３２８μｌ，６．４０ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流し、６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を留去し、ジクロロメタンを加えて、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去後、析出物を濾過して２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾールを６５０ｍｇ、収率７３％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（１００ｍｇ，０．３６２ｍｍｏｌ）、３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロピオン酸（９１．４ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６９．４μｌ，０．３９８ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（１８０ｍｇ，０．４３５ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを８３ｍｇ、収率４８％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.85-6.83 (m, 2H), 6.75-6.72 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 2.90-2.76 (m, 4H).
MS (ESI) Found; 469 [M+H]+
ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２５０ｍｇ，０．９０５ｍｍｏｌ），４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタン酸（２２４ｍｇ，０．９９５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７４μｌ，０．９９５ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（４５０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（４－（３，４－ジメトキシフェニル）ブタンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを１３１ｍｇ、収率３０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.37 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.70 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.58-2.48 (m, 4H), 1.96-1.86 (m, 2H).
MS (ESI) Found; 483 [M+H]+
ＳＯ２０７７
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 　４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニルプロピオン酸（５００ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）溶液に、炭酸カリウム（８８１ｍｇ，６．３７ｍｍｏｌ）、１－ブロモプロパン（６９２μｌ，７．６５ｍｍｏｌ）を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて精製し、プロピル　３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパノエートを５９０ｍｇ、収率８２％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 　プロピル　３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパノエート（５９０ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサンに溶かし、５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．６８ｍｌ）を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、６ｍｏｌ／ｌ塩酸を加えて、酢酸エチルにて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロピオン酸を４３８ｍｇ、収率８７％で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 　２－アミノ－６－ヨードベンゾチアゾール（２００ｍｇ，０．７２３ｍｍｏｌ）、３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロピオン酸（２００ｍｇ，０．８３９ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４０μｌ，０．８０３ｍｍｏｌ）、Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（３６０ｍｇ，０．８７０ｍｍｏｌ）を加えて終夜、室温にて攪拌した。反応終了後、酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。残渣をエタノールにて再結晶し、２－（３－（３－メトキシ－４－プロポキシフェニル）プロパンアミド）－６－ヨードベンゾチアゾールを２１７ｍｇ、収率６０％で得た。

1H NMR (DMSO-d6): δ 12.42 (s, 1H), 8.38-8.37 (m, 1H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.54-7.51 (m, 1H), 6.85-6.82 (m, 2H), 6.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.87-2.78 (m, 4H), 1.72-1.65 (m, 2H), 094 (t, J = 7.3 Hz, 3H).
MS (ESI) Found; 497 [M+H]+
　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）、およびＳＯ２０７７が心筋分化効果を有することを、国際公開第２０１２／０２６４９１号パンフレット（引用により本明細書に含まれる）に記載の実施例と同様の方法により確認した。

Claims (31)

  1. 　多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法：
    （１）多能性幹細胞をＷＮＴシグナル活性化剤およびＰＫＣ活性化剤を含む培地中で培養する工程、および；
    （２）工程（１）で得られた細胞をＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。
  2. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下の式（Ｉ）の化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法：
    　式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｒ１－Ｒ５は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ１－Ｒ５のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ６－Ｒ９は、各々独立して、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）である、ここでＲ６－Ｒ９のうち隣接する２つが一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成していてもよい、
    　Ｒ１０－Ｒ１１は、各々独立して、水素原子；又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である、
    　Ｘは、－ＣＲ１４（Ｒ１４は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）；酸素原子；硫黄原子；セレン原子；又は基－ＮＲ１５（Ｒ１５は、水素原子、炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数１～５の直鎖又は分岐アシル基である）である、および
    　ｎは、０から６の整数である］。
  3. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
    　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
    　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基である）であり、
    　Ｒ８が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
    　Ｒ７及びＲ８が、一緒になって－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－を形成しており、
    　Ｘが、硫黄原子であり、および
    　ｎが、０から４の整数である、請求項２に記載の方法。
  4. 　Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ１１が水素原子であり、
    　Ｒ２及びＲ３が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
    　Ｒ７が、水素原子；ハロゲン原子；水酸基；炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基；基－Ｃ（Ｏ）Ａで置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルコキシ基（Ａは、非置換又は炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和５または６員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される１または２個の原子を含んでいてもよい）；非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖又は分岐アルキル基；又は基－ＮＲ１２Ｒ１３（Ｒ１２及びＲ１３は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数１～５の直鎖または分岐アルキル基である）であり、
    　Ｘが、硫黄原子であり、および
    　ｎが、０から４の整数である、請求項２に記載の方法。
  5. 　Ｒ７が、ハロゲン原子である、請求項４に記載の方法。
  6. 　ｎが、１から４の整数である、請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が、以下から選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法：
    　ＫＹ０２１１１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　ＫＹ０１０４１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　Ｔ６１１６４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　ＫＹ０２１１４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　ＫＹ０１０４５
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　ＫＹ０１０４０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     　ＫＹ０２１０９
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     　ＫＹ０１０４２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     　ＫＹ０１０４３
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     　ＫＹ０１０４６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     　ＰＢ２８５２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     　Ｎ１１４７４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     　ＰＢ２５７２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     　ＰＢ２５７０
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     　ＫＹ０２１０４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     　ＳＯ０８７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     　ＳＯ１０２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     　ＳＯ０９６
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     　ＳＯ０９４
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     および、
    　ＳＯ２０７７
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     。
  8. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、またはＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）である、請求項７に記載の方法。
  9. 　Ｗｎｔシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）である、請求項８に記載の方法。
  10. 　工程（２）の培地が２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤を含み、前記２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤の１つが請求項２～９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩であり、他のＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＰ２、ＸＡＶ９３９、およびＩＷＲ１から選択される１種以上の化合物である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　２種以上のＷＮＴシグナル阻害剤が、請求項２～９のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩およびＸＡＶ９３９である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　ＷＮＴシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡまたはプロストラチンである、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　ＰＫＣ活性化剤が、ＰＭＡである、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９またはＳＵ６６５６である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 　Ｓｒｃ阻害剤が、Ａ４１９２５９である、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 　ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８またはゲフィチニブである、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。
  19. 　ＥＧＦ受容体阻害剤が、ＡＧ１４７８である、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
  20. 　ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、
    　ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、
    　ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、およびＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、
    　Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、および
    　ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、請求項１～１９のいずれかに記載の方法。
  21. 　ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　工程（１）および（２）における培地が蛋白質成分およびペプチド成分を含まない、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 　工程（１）および（２）において細胞を浮遊培養により培養する、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 　工程（１）が１～３日間であり、工程（２）が２～１３日間である、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 　多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 　多能性幹細胞がサルまたはヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　心筋細胞の製造方法である、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  28. 請求項１～２７のいずれかに記載の方法により得られた心筋細胞。
  29. 　ＷＮＴシグナル活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＷＮＴシグナル阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット。
  30. 　ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、
    　ＰＫＣ活性化剤がＰＭＡであり、
    　ＷＮＴシグナル阻害剤が、
    　ＫＹ０２１１１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     　ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     　ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     および、
    　ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     　から選択される化合物並びにＸＡＶ９３９であり、
    　Ｓｒｃ阻害剤がＡ４１９２５９であり、および
    　ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である、請求項２９に記載の心筋分化促進用キット。
  31. 　ＷＮＴシグナル阻害剤が、ＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）およびＸＡＶ９３９である、請求項３０に記載の心筋分化促進用キット。
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