WO2022014622A1 - 心筋細胞塊の製造方法 - Google Patents

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WO2022014622A1
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cardiomyocyte
mass
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cardiomyocytes
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義和 河井
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株式会社カネカ
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    • C12N2501/33—Insulin
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2521/00—Culture process characterised by the use of hydrostatic pressure, flow or shear forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties

Definitions

  • Cardiomyocyte transplantation has been proposed as a treatment for serious heart disease.
  • Examples of the morphology of the cardiomyocytes to be transplanted include sheet-like and cardiomyocyte mass-like ones, and among them, the cardiomyocyte mass can be directly injected into the heart with an injection needle, and is considered to have a high therapeutic effect. Since such transplantation requires a relatively large amount of cardiomyocytes, a method with a high possibility of mass preparation is desired.
  • Patent Document 1 reports a method of injecting a solution in which cardiomyocytes are suspended in a medium containing a special component into a round-bottomed 96-well plate as a method for preparing a cardiomyocyte mass again from single-celled cardiomyocytes. ing. However, it is not suitable as a manufacturing method for obtaining the required number of cardiomyocyte masses for treatment, and it takes 10 days from the start of preparation of the cardiomyocyte mass to the start of beating of the cardiomyocytes. It is stated in.
  • the present invention shown below has solved the above problems.
  • a method for producing a myocardial cell mass which comprises aggregating.
  • (2) A method for producing a cardiomyocyte mass which comprises flowing unicellular cardiomyocytes having a history of stabilized culture under suspension conditions and aggregating the cells.
  • the method for producing a cardiomyocyte mass which comprises a stabilized culture period of 4 hours or more.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass wherein the period for producing the cardiomyocyte mass is 216 hours or less.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass which comprises a substantially flat bottom of the container.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass which comprises a container having a volume of 0.5 mL or more.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass which comprises swirling the flow at 20 rpm or more and less than 200 rpm.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass, wherein the swirling range of the container is 10 mm or more.
  • a myocardial cell mass which comprises a period of 26 hours or more in which a medium containing the component of 1 (ET-1) is not used.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF-BB platelet-derived growth factor-BB
  • endoserin- The method for producing a myocardial cell mass, which comprises a period of 26 hours or more in which a medium containing the component of 1 (ET-1) is not used.
  • a method for producing a cardiomyocyte mass which is characterized in that the cardiomyocytes are derived from pluripotent stem cells.
  • a large amount of cardiomyocyte mass can be obtained easily and in a short period of time. It can contribute to the spread of cardiomyocyte transplantation.
  • Example 7 This is an example of a container having a single and single vertical and horizontal cross section of the wetted portion of the cell suspension and having a flat bottom. It is a phase contrast microscope observation image of Example 7 of this invention.
  • the present invention provides a method for producing a cardiomyocyte mass, which comprises flowing unicellularized cardiomyocytes in a container under suspension conditions and aggregating the cells.
  • a large amount of cardiomyocyte mass can be obtained easily and in a short period of time, and it is expected that it can contribute to the spread of cardiomyocyte transplantation.
  • the cardiomyocyte mass refers to a mass formed by three-dimensionally aggregating a plurality of cardiomyocytes.
  • the cardiomyocytes used in the present invention are not particularly limited, and cardiomyocytes collected from a living body may be used as they are, or purified or proliferated, or derived from stem cells or the like may be used. Preferably, as described later, it is a cardiomyocyte obtained by inducing differentiation from a pluripotent stem cell.
  • the method for unicellularizing cardiomyocytes is not particularly limited, and conventionally known methods can be used.
  • the unicellularized cardiomyocytes are preferably purified.
  • the method for purifying cardiomyocytes is not particularly limited, and a conventionally well-known method can be used.
  • Myocardial troponin T positivity can be mentioned as an index of cardiomyocyte purity.
  • the purity of cardiomyocytes that can be used in the cells is not particularly limited, but it is preferable that the cardiomyocytes show positive for myocardial troponin T 20 days after the start of differentiation induction.
  • the unicellularized cells used in the present invention are preferable as long as the percentage of myocardial troponin T-positive cells is 50% or more, because a high-quality cardiomyocyte mass can be obtained.
  • the more preferable myocardial troponin T-positive cell rate is 80% or more, and most preferably 95% or more.
  • the myocardial troponin T-positive cell rate can be determined by a conventionally known immunological method such as a flow cytometry method using a fluorescent label or an electrochemiluminescent immunoassay (ECLIA method). Further, it is more preferable that the cardiomyocytes used are ventricular muscle cells because of their high therapeutic effect. MLC2v can be mentioned as a marker for ventricular muscle cells.
  • cardiomyocyte masses When cardiomyocyte masses are formed using single-celled cardiomyocytes, it tends to be easy to obtain cardiomyocyte masses with good sphericity and a relatively narrow particle size distribution.
  • the shape of the cell mass at the time of differentiation induction tends to be low in sphericity, and the particle size distribution tends to be wide. If the sphericity is good and the particle size distribution is narrow, there are few troubles when injecting cardiomyocyte masses, and it is easy to obtain a homogeneous therapeutic effect.
  • the present invention is characterized in that cardiomyocytes and / or forming myocardial cell masses are under suspension conditions.
  • the suspension condition literally relates to a state in which cells are suspended in a liquid component such as a medium, but even if the cells are settled at the bottom of the container, the cells are based on a slight stimulus. Includes a state where you can leave the wood. From this point of view, it is preferable that the surface of the base material is not a material that adheres or fixes cells.
  • the density of myocardial cells in the suspension is not particularly limited, but 1 ⁇ 10 3 cells / mL or more is preferable because the cost of liquid components such as a medium is low and cells easily form aggregates.
  • ⁇ 10 4 cells / mL or more is more preferable, 1 ⁇ 10 5 cells / mL or more is particularly preferable, and 2 ⁇ 10 5 cells / mL or more is most preferable.
  • the density of cardiomyocytes is preferably 1 ⁇ 10 8 cells / mL or less because it easily suppresses overaggregation of cardiomyocytes, and more preferably 1 ⁇ 10 7 cells / mL or less, and 1 ⁇ 10 6 cells. It is particularly preferable if it is / mL or less, and most preferably if it is 5 ⁇ 10 5 cells / mL or less.
  • the method for producing a cardiomyocyte mass of the present invention is carried out in a container.
  • a container having a general-purpose structure for example, an aspherical container can be mentioned.
  • the non-annular container is a non-annular container having a structure in which the vertical and horizontal cross sections of the wetted portion of the cell suspension are single and single.
  • the vertical direction means a direction perpendicular to the liquid surface when the cell suspension is allowed to stand
  • the horizontal direction is parallel to the liquid level when the cell suspension is allowed to stand. Means the direction.
  • the aspherical container examples include a 6-well plate, a 12-well plate, a petri dish, a flask container, and the like, which have a simple structure that is easily available and has only an outer wall.
  • the container when the container is a well plate, the cross section of each well is one and single, which means that the cross section of each well is one and single.
  • the annular container is a container having a so-called annular structure, and corresponds to, for example, a donut-shaped (or floating ring-shaped) container.
  • the container used in the present invention has a substantially flat bottom. Substantially flat bottom means that 60% or more of the area of the bottom plate is flat.
  • examples of the container having a non-flat bottom include a round bottom plate (U bottom plate) and a V bottom plate.
  • the volume of the container used in the present invention is preferably 0.5 mL or more. If it is 0.5 mL or more, it is preferable because a large amount of myocardial cell mass can be produced, 6.0 mL or more is more preferable, 15.0 mL or more is further preferable, and 100 mL or more is commercially available. It is particularly preferable to have 500 mL or more, preferably 1000 mL or more in terms of treatment for relatively small patients, and preferably 1000 mL or more in terms of treatment for relatively large patients.
  • the same volume is preferable if it is 70 L or less because it can produce a cell mass with good handleability, more preferably 15 L or less, further preferably 7 L or less, and particularly preferably 4 L or less. Most preferably, it is 3 L or less.
  • the volume of the container is preferably the recommended capacity of the container manufacturer in consideration of liquid splashing during flow. In the case of a well plate, it is the volume per well.
  • the container is preferably sterilized, and more preferably disposable. It is also preferable that the container can ensure sterility while producing a cardiomyocyte mass. For example, it is preferable to have a structure in which an air supply / exhaust filter and a water supply / exhaust filter having a small opening (eg, 0.2 ⁇ m or less) are provided, and the other parts are closed systems.
  • the method for producing a cardiomyocyte mass of the present invention is characterized in that it is carried out while flowing in the container.
  • it can be carried out by placing the container containing the suspension containing cardiomyocytes on a stage kept substantially horizontal and swirling the stage in the horizontal direction. By continuing to swirl, cells eventually aggregate to form a cell mass.
  • the swirling speed is not particularly limited, but 20 rpm or more is preferable because it is easy to suppress cell overaggregation, 46 rpm or more is more preferable, 62 rpm or more is further preferable, and 83 rpm or more is preferable. It is particularly preferable, and most preferably 90 rpm or more.
  • the same turning speed is preferable from the viewpoint of yield when it is less than 200 rpm, more preferably when it is less than 170 rpm, further preferably when it is less than 140 rpm, particularly preferably when it is less than 120 rpm, and most preferably 110. Less than rpm.
  • the range in which the container is swirled is not particularly limited, but is preferably 10 mm or more because cell-cell aggregation is likely to occur, particularly preferably 15 mm or more, and most preferably 20 mm or more. be.
  • the turning range is 100 mm or less, it is preferable because there is little cell death, when it is 80 mm or less, it is more preferable, when it is 60 mm or less, it is further preferable, and when it is 45 mm or less, it is particularly preferable, and most preferably. It is 30 mm or less.
  • cardiomyocytes are required for cardiomyocyte transplantation treatment.
  • a large amount of raw material cells are required.
  • pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) have the property of being able to proliferate indefinitely, they are also suitable as raw materials for myocardial cells used in the present invention, and are muses.
  • Non-neoplastic pluripotent stem cells such as cells are also preferred from the standpoint of safety.
  • the cardiomyocytes are preferably derived from human pluripotent stem cells.
  • the steps for cryopreservation are not particularly limited, and are, for example, during or after proliferation of pluripotent stem cells, during or after induction of cardiomyocyte differentiation, after monocellization of cardiomyocytes, during or after purification of cardiomyocytes, and cardiomyocytes. It is preferably cryopreserved in one or more steps, such as after mass formation. Since the period from thawing to the use of cardiomyocyte mass can be shortened, it is more preferable that the cardiomyocyte is cryopreserved in one or more steps after the induction of myocardial differentiation, and is cryopreserved in one or more steps after the induction of myocardial differentiation.
  • the cardiomyocytes are cryopreserved during or at one or more steps after purification, and one or more after obtaining the single-celled cardiomyocytes of the desired purity. Most preferably, it is cryopreserved in steps. From the viewpoint that the period from thawing to forming a myocardial cell mass and beating the cell mass can be rapidly used for transplantation treatment, etc., the cell mass can be quickly provided for myocardial cell transplantation treatment, etc. within 216 hours. It is preferably within 132 hours, more preferably within 108 hours, particularly preferably within 84 hours, and most preferably within 60 hours.
  • the cells to be frozen and thawed are unicellular.
  • the present inventor has found that when unicellular cardiomyocytes with a history of stabilized culture are used for the production of cardiomyocyte masses, cardiomyocytes with high sphericity and narrow particle size distribution can be obtained very efficiently.
  • the stabilized culture refers to a culture performed after thawing of cells and before the start of preparation of cardiomyocyte mass.
  • the operation performed during the stabilized culture is not particularly limited, but it is preferable that the state of the cells is not intentionally significantly changed. For example, it is preferable not to intentionally induce differentiation.
  • the step of performing the stabilized culture is not particularly limited, but it is preferable that the step is performed immediately before the start of preparation of the cardiomyocyte mass because it is easy to efficiently obtain a cardiomyocyte mass having a good shape.
  • the term "efficiently" as used herein includes the fact that dead cells are unlikely to occur. Further, it is also preferable to carry out the procedure immediately after the final thawing before preparing the cardiomyocyte mass because it is easy to efficiently obtain a cardiomyocyte mass having a good shape. Further, it is preferable that the stabilized culture is carried out by an adhesive method.
  • the culture by the adhesion method is performed in a state where the cells are fixed to some extent on the substrate, not under the suspension condition, and the surface of the substrate may contain a material that easily adheres to the cells. preferable.
  • a method of impregnating the surface of the base material with a material that easily adheres to cells it can be carried out by treating with a conventionally known coating agent by a known method. Further, at the end of the stabilized culture, a substrate that easily exfoliates cells from the surface of the substrate, or an exfoliating agent and / or a chelating agent is used.
  • the release agent is not limited, but for example, trypsin, collagenase, pronase, hyaluronidase, elastase, commercially available Accutase (trademark registration), Accumax (trademark registration), TrypLETM ExpressEnzyme (Life Technologies Japan Co., Ltd.), TrypLETM SelectEz.
  • the lower limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it can disperse the cell aggregate, but for example, 0.15% by volume or more, 0.18% by volume or more, 0.20 volume. It may be% or more, or 0.24% by volume or more.
  • the upper limit of the concentration in the solution is not particularly limited as long as it is not affected by the lysis of the cells themselves, but it is 0.30% by volume or less, 0.28% by volume or less, or 0.25% by volume or less. good.
  • the treatment time depends on the concentration of trypsin, but the lower limit thereof is not particularly limited as long as the cell aggregate is sufficiently dispersed by the action of trypsin, for example, 5 minutes or more, 8 minutes or more. It may be 10 minutes or more, 12 minutes or more, or 15 minutes or more.
  • the upper limit of the treatment time is not particularly limited as long as it is not affected by the action of trypsin, such as lysis of the cells themselves. For example, 30 minutes or less, 28 minutes or less, 25 minutes or less, 22 minutes or less. , 20 minutes or less, or 18 minutes or less.
  • a commercially available release agent it may be used at a concentration described in the attached protocol so that the cells can be dispersed into a single state.
  • Physically light treatment after treatment with the stripping agent and / or chelating agent can promote single cell formation.
  • This physical treatment is not limited, and examples thereof include a method of pipetting cells with a solution multiple times.
  • cells may be passed through a strainer or mesh, if desired.
  • the cells that have become single cells can be recovered by removing the supernatant containing the stripping agent by standing or centrifuging.
  • the collected cells may be washed if necessary.
  • the stabilized culture period is not particularly limited, but 4 hours or more is preferable from the viewpoint of the high sphericity of the cardiomyocyte mass and the narrow particle size distribution.
  • the more preferable stabilized culture period is 12 hours or more, more preferably 24 hours or more, particularly preferably 48 hours or more, and most preferably 60 hours or more.
  • the period of the stabilized culture is 1000 hours or less, it is preferable from the viewpoint of economy, more preferably 500 hours or less, further preferably 240 hours or less, particularly preferably 150 hours or less, and most preferably 84 hours or less. ..
  • the composition of the liquid (medium) component may be changed during the stabilized culture period.
  • the liquid can usually be exchanged by an operation such as medium exchange in the art.
  • the frequency of replacement is not particularly limited, and may be performed regularly, such as every hour, every 4 hours, every 8 hours, every 12 hours, every 24 hours, every 48 hours, or irregularly.
  • the amount to be exchanged is not limited, and almost the entire amount may be exchanged, half the amount may be exchanged, or a predetermined amount may be exchanged at all times by perfusion.
  • the period for forming a cardiomyocyte mass by aggregating the single-celled cardiomyocytes under suspension conditions is not particularly limited, but if it is within 216 hours, it can be used for cardiomyocyte transplantation treatment or the like. It is preferable because the cell mass can be provided quickly, more preferably within 132 hours, further preferably within 108 hours, particularly preferably within 84 hours, and most preferably within 60 hours. Further, since it is easy to obtain a cardiomyocyte mass having a firm pulsation, the period for producing the cardiomyocyte mass is preferably 25 hours or more, particularly preferably 36 hours or more, and most preferably 48 hours or more.
  • the temperature at which the unicellularized myocardial cells are aggregated to form a myocardial cell mass under suspension conditions is higher than the temperature at which the cells or suspension does not freeze and the suspension is suspended. It is preferably equal to or lower than the boiling point of the turbid liquid. Since it is easy to obtain a pulsation in a short time, the temperature is preferably 4 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, further preferably 18 ° C. or higher, and more preferably 25 ° C. or higher. It is particularly preferable, and most preferably 32 ° C. or higher. Further, since cell death is unlikely to occur, the temperature is preferably 60 ° C. or lower, more preferably 50 ° C. or lower, further preferably 45 ° C. or lower, and particularly preferably 43 ° C. or lower. Most preferably, it is 40 ° C. or lower.
  • the gas composition and concentration in the environment when unicellularized cardiomyocytes are aggregated together to form a cardiomyocyte mass under suspension conditions there is no particular limitation on the gas composition and concentration in the environment when unicellularized cardiomyocytes are aggregated together to form a cardiomyocyte mass under suspension conditions, and carbon dioxide is usually used. It can also be carried out in an incubator in a gas atmosphere.
  • the carbon dioxide concentration in this case is also not particularly limited, but if it is 1% or more and 10% or less, the liquid property of the suspension can be easily maintained.
  • the range of more preferable carbon dioxide concentration is 2% or more and 8% or less, more preferably 3% or more and 7% or less, particularly preferably 4% or more and 6% or less, and most preferably 5%.
  • the oxygen concentration is also not particularly limited, but is preferably 5% or more because cell death is unlikely to occur, more preferably 10% or more, further preferably 15% or more, and 18% or more. It is particularly preferable to have it, and most preferably 20% or more. Further, 30% or less is preferable because it can suppress the oxidation of unnecessary cells, 27% or less is more preferable, 25% or less is further preferable, 22% or less is particularly preferable, and 21% or less. Most preferably.
  • the pH of the suspension when unicellularized cardiomyocytes are aggregated to form a myocardial cell mass under suspension conditions is not particularly limited, but the pH may be 2 or more. This is preferable because it is not easily affected by unnecessary oxidation and cell death is unlikely to occur when the pH is 12 or less.
  • the pH range is more preferably 3 or more and 11 or less, still more preferably 4 or more and 10 or less, particularly preferably 5 or more and 9 or less, and most preferably 6 or more and 8 or less.
  • the amount of dissolved oxygen in the suspension when unicellularized myocardial cells are aggregated together to form a myocardial cell mass under suspension conditions is not particularly limited, but the suspension When the amount of dissolved oxygen when the liquid component is sufficiently saturated with air is set to 100, cell death is easily suppressed when the amount is 10 or more, and it is preferable that the amount of dissolved oxygen is 100 or less because no extra ventilation is required. More than 95 is more preferable, 40 or more and 90 or less is more preferable, 50 or more and 85 or less is particularly preferable, and 60 or more and 80 or less is most preferable.
  • the components in the suspension liquid used when a single-celled cardiomyocyte is aggregated with each other to form a myocardial cell mass under suspension conditions but the cardiomyocyte. It is preferable to use a medium capable of stabilizing and culturing. Further, according to the present invention, since a good cardiomyocyte mass can be easily obtained, a special medium component is used for 26 hours or more when agglomerating unicellular cardiomyocytes to prepare a cardiomyocyte mass.
  • Special medium components include insulin, transferrin, selenium, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), endoserin-1 (ET-1). ) Etc. can be exemplified.
  • the liquid for suspension can usually be exchanged by an operation called medium exchange in the art.
  • the frequency of replacement is not particularly limited, and may be performed regularly, such as every hour, every 4 hours, every 8 hours, every 12 hours, every 24 hours, every 48 hours, or irregularly.
  • the amount to be exchanged is not limited, and almost the entire amount may be exchanged, half the amount may be exchanged, or a predetermined amount may be exchanged at all times by perfusion.
  • a cardiomyocyte mass having a good shape and high sphericality can be obtained.
  • Aspect ratio can be mentioned as an index of shape.
  • the aspect ratio can be obtained by the ratio of Minimum Feret Diameter and Maximum Feret Diameter.
  • the average value of the aspect ratio is 0.70 or more, more preferably 0.75 or more, still more preferably 0.80 or more, particularly preferably 0.85 or more, and most It is preferably 0.90 or more.
  • the production method of the present invention it is possible to provide a cardiomyocyte mass population having a relatively uniform size.
  • Standard deviation can be cited as an indicator of size homogeneity.
  • the standard deviation of the cell mass size is 30% or less of the average value, more preferably 25% or less, particularly preferably 20% or less, and most. It is preferably 15% or less.
  • the average value of the size of the cardiomyocyte mass is not particularly limited, but if it is 50 ⁇ m or more, it is preferable in terms of the expression of functions as cardiomyocytes (beating, etc.), more preferably 75 ⁇ m or more, still more preferably 100 ⁇ m or more, particularly.
  • the average value of the size of the cardiomyocyte mass is 2000 ⁇ m or less, it is preferable because it is easy to inject at the time of transplantation, more preferably 1500 ⁇ m or less, further preferably 1000 ⁇ m or less, particularly preferably 500 ⁇ m or less, and most preferably 300 ⁇ m or less. be.
  • the size of the cell mass referred to here is obtained by averaging the Minimum Feret Diameter and the Maximum Feret Diameter.
  • the cardiomyocyte mass obtained by the present invention can be transplanted into the heart tissue of an individual (living body).
  • cardiomyocytes can be injected directly into the heart tissue by injection.
  • the liquid component of the suspension can be used as it is for transplantation without replacement, but it is replaced with a liquid suitable for the individual (eg, physiological saline). It can also be transplanted after it has been done. Since the cardiomyocyte mass obtained by the present invention has a small size distribution and a good shape, problems such as clogging with an injection needle are unlikely to occur, but just in case, an injection smaller than the inner diameter of the injection needle used at the time of transplantation is performed.
  • the size of the cell aggregate is expressed by the number of cells constituting the aggregate, 100 or more is preferable because the engraftment rate to the heart is increased, more preferably 500 or more, still more preferably 750.
  • the above is particularly preferably 900 or more, most preferably 1000 or more, and 5000 or less is preferable because there is no variation in the quality of cells in the cell mass and it is easy to transplant using an injection needle.
  • the number is more preferably 3000 or less, more preferably 2000 or less, and most preferably 1500 or less.
  • Table 1 shows the materials and materials used.
  • the cardiomyocytes were frozen cells and were described as iPS cell-derived human cardiomyocytes.
  • the cell line of iPS cells was 253G1.
  • the myocardial troponin T-positive cell rate was 95.5%.
  • the basic composition of the maintenance medium for Carmy A is CaCl 2 : 0.182 g / L, DDL 4 : 0.09767 g / L, KCl: 0.439 g / L, ⁇ 3 : 3.362 g / L, NaCl: 5.4525 g / L, Na 2 HPO 4 : 0.109 g / L, HEPES: 5.958 g / L, Phonol red Na: 0.0134 g / L was described.
  • Y-27632 in Table 1 is a ROCK inhibitor.
  • Cell defrosting 1) 500 ⁇ L of gelatin solution was added to 1 well of a 24-well plate, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. 2) Y-27632 was added to the seeding medium for Carmy A to a final concentration of 10 ⁇ M, and the medium was used as a thawing medium and warmed to 37 ° C. 3) Two vials containing the cryopreserved Carmy A-Human were warmed in a 37 ° C water bath for 3 minutes. 4) Each cell suspension was transferred to a 50 mL centrifuge tube without pipetting.
  • the standard deviation of the cell mass size was taken as the positive square root of the root mean square of the difference between each numerical value and the average value included in the calculation of the average value of the cell mass size.
  • the aspect ratio was the ratio of Minimum Feret Diameter and Maximum Feret Diameter.
  • the pulsation confirmation time is the time from the start of cardiomyocyte mass formation to the time when the pulsation can be confirmed. In Examples 5 and 6, about 30% of the cells became dead cells, suggesting that the swirl was rather strong.
  • Example 14 After 24 hours, the entire supernatant was removed, and Y-27632 was added to a maintenance medium at 37 ° C to a final concentration of 5 ⁇ M, and the entire medium was replaced. 15) After 48 hours, the entire supernatant was removed, and Y-27632 was added to a maintenance medium at 37 ° C to a final concentration of 2 ⁇ M, and the entire medium was replaced. 16) Continued turning until 72 hours later. Table 3 shows the results. When the average value of the cell and cell mass size after 72 hours was 50 ⁇ m or more, it was judged that the cell mass was formed.
  • the pulsation confirmation time is the time from the start of cardiomyocyte mass formation to the time when the pulsation can be confirmed. In Example 7, the same operation as in Example 4 was performed except that the stabilized culture was performed, but the average value of the cell mass size could be made smaller than that in Example 4, and the number of dead cells was about 2 as a whole. It was about%.
  • the present invention can provide a cardiomyocyte mass by an extremely simple method.
  • the size of the cardiomyocyte mass can be freely controlled.
  • the shape and size distribution of cardiomyocyte masses are also good.

Abstract

特殊な培地成分を用いることなく、複雑な形状の容器、微小容器を用いることなく、単細胞化された心筋細胞から心筋細胞塊を大量、簡便、短期間で得る。　単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、非環状容器内で流動させ、当該細胞同士を凝集させることを特徴とする、心筋細胞塊の製造方法により上記課題を解決できる。また、当該単細胞化された心筋細胞が解凍後に安定化培養された履歴を持つことを特徴とする心筋細胞塊の製造方法によっても、上記課題を解決できる。

Description

心筋細胞塊の製造方法
　心筋細胞塊を作製する方法に関する。
　重篤な心疾患治療法として心筋細胞の移植が提唱されている。移植される心筋細胞の形態としてはシート状のものや心筋細胞塊状のものが挙げられ、なかでも心筋細胞塊は注射針で心臓に直接注入できることから、治療効果が高いとされている。このような移植には比較的大量の心筋細胞が必要であるため、大量調製の可能性が高い手法が望まれている。そのひとつとして、多能性幹細胞を分化誘導して心筋細胞を製造する技術に期待が寄せられている。多能性幹細胞の分化誘導時には細胞が凝集塊となっていることが多く、精製のためには一旦分散させて単細胞化する方法が一般的である。単細胞化した心筋細胞から再び心筋細胞塊を調製する方法として、特殊な成分を含有した培地に心筋細胞を懸濁させた液を丸底の96ウェルプレートに注入する方法が特許文献１で報告されている。しかしながら、治療に必要な数の心筋細胞塊を得るための製法としては不向きであるし、心筋細胞塊の調製開始から心筋細胞が拍動を開始するまで10日間を要していることが実施例で述べられている。
特許第5523830号
　特殊な培地成分を用いることなく、複雑な形状の容器、微小容器を用いることなく、単細胞化された心筋細胞から心筋細胞塊を大量、簡便、短期間で得ることが本発明の目的である。
　以下に示す本発明にて、上記課題を解決できた。
（１）単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、細胞懸濁液の接液部の垂直方向および水平方向の断面が一つ且つ一重になる容器容器内で流動させ、当該細胞同士を凝集させることを特徴とする、心筋細胞塊の製造方法。
（２）安定化培養された履歴を持つ単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、流動させ、当該細胞同士を凝集させることを特徴とする、心筋細胞塊の製造方法。
（３）前記安定化培養が接着培養であることを特徴とする前記心筋細胞塊の製造方法。
（４）前記安定化培養期間が4時間以上であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（５）前記心筋細胞塊の作製期間が216時間以内であることを特徴とする前記心筋細胞塊の製造方法。
（６）前記容器が実質的に平底であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（７）前記容器の容積が0.5 mL以上であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（８）前記流動が20 rpm以上200 rpm未満で旋回させることによるものであることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（９）前記容器を旋回させる範囲が10 mm以上であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（１０）前記心筋細胞塊の製造時に、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、血小板由来成長因子-BB（PDGF-BB）及びエンドセリン-1（ET-1）の成分を含む培地を用いない期間が26時間以上であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（１１）前記心筋細胞が多能性幹細胞由来であることを特徴とする、前記心筋細胞塊の製造方法。
（１２）アスペクト比の平均値が０．７０以上である心筋細胞塊。
（１３）細胞塊のサイズの標準偏差が細胞塊のサイズの平均値の３０％以下である心筋細胞塊。
（１４）細胞塊のサイズの平均値が50μm以上2000μm以下である心筋細胞塊。
（１５）心筋細胞塊の作製開始から216時間以内に拍動を開始する心筋細胞塊。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-120695号の開示内容を包含する。
　心筋細胞塊を大量、簡便、短期間で得ることができる。心筋細胞移植の普及に貢献することができる。
細胞懸濁液の接液部の垂直方向および水平方向の断面が一つ且つ一重であり、且つ平底の容器の例である。 本発明の実施例７の位相差顕微鏡観察像である。
　本発明は、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、容器内で流動させ、当該細胞同士を凝集させることを特徴とする、心筋細胞塊の製造方法を提供するものである。これにより、心筋細胞塊を大量、簡便、短期間で得ることができ、心筋細胞移植の普及に貢献できることが期待できる。ここで心筋細胞塊とは、複数の心筋細胞が三次元的に凝集して形成される塊状体のことをいう。
　本発明に用いる心筋細胞に特に限定は無く、生体から採取した心筋細胞をそのまま、あるいは精製や増殖させたものを使用しても良く、また幹細胞などから誘導したものを用いても良い。好ましくは後述するように、多能性幹細胞から分化誘導して得られた心筋細胞である。心筋細胞の単細胞化の方法にも特に限定は無く、従来より公知の方法を用いることができる。単細胞化された心筋細胞は精製されたものであることが好ましい。心筋細胞の精製方法には特に限定は無く、従来からよく知られた方法を用いることができる。例えば、多能性幹細胞にとっての低栄養化培地を用いたり、比較的培養温度を高めたり、多能性幹細胞に特異的に作用する物質を添加する等の方法が挙げられる。心筋細胞の純度の指標として心筋トロポニンT陽性を挙げることができる。本細胞で用いることができる心筋細胞の純度に特に限定は無いが、分化誘導開始後20日時点で心筋トロポニンT陽性を示すことが好ましい。また本発明で用いる単細胞化された細胞は、心筋トロポニンT陽性細胞が50%以上であれば、品質の高い心筋細胞塊が得られることから好ましい。より好ましい心筋トロポニンT陽性細胞率は80%以上であり、最も好ましくは95%以上である。心筋トロポニンT陽性細胞率は、蛍光標識によるフローサイトメトリー法、電気化学発光免疫測定法（ECLIA法）等の、従来より公知の免疫学的手法で求めることができる。また、用いる心筋細胞が心室筋細胞であることが、治療効果の高さからより好ましい。心室筋細胞のマーカーとしてはMLC2vを挙げることができる。
　単細胞化された心筋細胞を用いて心筋細胞塊を形成させると、良好な真球性や比較的狭い粒径分布の心筋細胞塊が得られやすい傾向にある。通常、The Journal of Cell Biology 143(5):1341-52に見られるように、分化誘導時の細胞塊の形状は真球性が低い傾向にあるし、粒径分布も広くなる傾向にある。真球性が良好で、粒径分布が狭ければ、心筋細胞塊の注入時のトラブルが少なく、また均質な治療効果が得られやすい。
　本発明では心筋細胞および／または形成中の心筋細胞塊が懸濁条件下にあることを特徴とする。ここで、懸濁条件とは、文字通り培地等の液体成分に細胞が懸濁している状態に関するものであるが、たとえ細胞が容器の底に沈降していたとしても、少しの刺激で細胞が基材から離れることができる状態を含む。こうした観点から、基材表面は細胞を接着させたり、固定させたりするような材質ではないことが好ましい。懸濁液中の心筋細胞密度に特に限定は無いが、1×103cells/mL以上であれば、培地等の液体成分のコストが少なく、細胞が凝集塊を形成しやすいことから好ましく、1×104cells/mL以上であればより好ましく、1×105cells/mL以上であれば特に好ましく、2×105cells/mL以上であることが最も好ましい。また同心筋細胞密度は1×108cells/mL以下であれば、心筋細胞の過凝集を抑制しやすいことから好ましく、1×107cells/mL以下であれば更に好ましく、1×106cells/mL以下であれば特に好ましく、5×105cells/mL以下であれば最も好ましい。
　本発明の心筋細胞塊の製造方法は、容器内で行われる。その容器の形状に特に限定はないものの、市販されている汎用的な構造を用いることができる。汎用的な構造の容器として、例えば、非環状容器を挙げることができる。非環状容器とは、環状でない容器であって、細胞懸濁液の接液部の垂直方向および水平方向の断面が一つ且つ一重になるような構造を有する容器である。ここで、垂直方向とは細胞懸濁液を静置した際の液面に対して垂直な方向を意味し、水平方向とは、細胞懸濁液を静置した際の液面に対して平行な方向を意味する。非環状容器を用いることで、スケールアップ容易性も向上する。非環状容器の具体例として、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、シャーレ状、フラスコの容器など、壁が外壁のみで、入手が容易な簡便な構造のものを挙げることができる。ここで、容器がウェルプレートの場合の断面が一つ且つ一重とは、各ウェルの断面が一つ且つ一重であることを意味する。一方、環状容器とは、いわゆる環状体構造を有する容器であって、例えば、ドーナツ型（または浮き輪型）などの容器が該当する。また、本発明で用いる容器は実質的に平底であることが好ましい。実質的に平底とは、底板の面積中、6割以上が平面であることを指している。また平底ではない容器として、丸底プレート（Uボトムプレート）やVボトムプレート等を挙げることができる。また本発明で用いる容器の容積は0.5 mL以上であることが好ましい。0.5 mL以上であれば、大量に心筋細胞塊を作製することができるため好ましく、6.0 mL以上であることがより好ましく、15.0 mL以上であることが更に好ましく、商業生産的には100 mL以上であることが特に好ましく、500 mL以上であれば比較的小柄な患者への治療の面で好ましく、比較的大柄な患者への治療の面では1000 mL以上が好ましい。また同容積は70 L以下であれば良好なハンドリング性で細胞塊を作製できることから好ましく、15 L以下であればより好ましく、7 L以下であれば更に好ましく、4 L以下であれば特に好ましく、最も好ましくは3 L以下である。ここで容器の容積は、流動時の液はね等を考慮し、容器メーカーの推奨容量であることが好ましい。またウェルプレートの場合は1ウェルあたりの容積である。また、当該容器は滅菌されていることが好ましく、ディスポーザブルであれば尚好ましい。心筋細胞塊を作製している間に無菌性を担保できる容器であることも好ましい。例えば、目開きが小さい（例：0.2μm以下）給排気用フィルターや給排液フィルターを備えつつ、それ以外の部分は閉鎖系になっているような構造であることが好ましい。
　本発明の心筋細胞塊の作製方法は、前記容器内で流動させながら実施することを特徴とする。例えば、ほぼ水平に保たれたステージ上に心筋細胞を含有する懸濁液が入った前記容器を載せ、水平方向にステージを旋回させることで実施できる。旋回を続けることで、やがて細胞同士が凝集し、細胞塊が形成される。旋回速度に特に限定はないが、20 rpm以上であれば細胞の過凝集を抑制しやすいことから好ましく、46 rpm以上であることがより好ましく、62 rpm以上であれば更に好ましく、83 rpm以上が特に好ましく、最も好ましくは90 rpm以上である。また同旋回速度は200 rpm未満であれば、収率の面から好ましく、170 rpm未満であればより好ましく、140 rpm未満であれば更に好ましく、120 rpm未満であれば特に好ましく、最も好ましくは110 rpm未満である。前記容器を旋回させる範囲について、特に限定は無いが、10 mm以上であれば、細胞同士の凝集が発生しやすいことから好ましく、15 mm以上であることが特に好ましく、最も好ましくは20 mm以上である。また同旋回範囲が100 mm以下であれば、細胞死が少ないことから好ましく、80 mm以下であればより好ましく、60 mm以下であれば更に好ましく、45 mm以下であれば特に好ましく、最も好ましくは30 mm以下である。
　心筋細胞移植治療には比較的大量の心筋細胞が必要とされている。また分化誘導を行って心筋細胞を得るためにも、大量の原料となる細胞が必要である。人工多能性幹細胞（iPS細胞）や胚性幹細胞（ES細胞）のような多能性幹細胞は無限に増殖できる性質を有することから、本発明で用いる心筋細胞の原料にも好適であり、ミューズ細胞のような非腫瘍性の多能性幹細胞であることも、安全性の観点から好ましい。また、ヒトへの治療に心筋細胞塊を用いる場合、心筋細胞はヒト多能性幹細胞由来であることが好ましい。
　多能性幹細胞から心筋細胞を得るには、数十日間もの分化誘導工程が必要になることが多い。また多能性幹細胞の増殖にも数週間必要な場合がある。多能性幹細胞の増殖期間と心筋分化誘導期間を合計すると、かなりの長期間となる。例えば、心筋細胞移植治療が決まった後に、多能性幹細胞の増殖から開始すると、心筋細胞塊の移植を受けるまでに数か月掛かる可能性がある。また、移植治療を行う施設内に大規模な細胞製造設備を設置することは困難な場合が多い。こうした問題を回避するため、あらかじめ細胞もしくは細胞塊を大量調整し、凍結保存しておくことが好ましい。凍結保存するステップについては特に限定は無く、例えば、多能性幹細胞の増殖途中または増殖後、心筋分化誘導途中または完了後、心筋細胞の単細胞化後、心筋細胞の精製中または精製後、心筋細胞塊形成後等の1つ以上のステップで凍結保存されていることが好ましい。解凍後から心筋細胞塊の使用までの期間を短縮できることから、心筋分化誘導開始後に1つ以上のステップで凍結保存されていることがより好ましく、心筋分化誘導後に1つ以上のステップで凍結保存されていることが更に好ましく、心筋細胞の精製中または精製後の１つ以上のステップで凍結保存されていることが特に好ましく、単細胞化された前記好ましい純度の心筋細胞を得た後に１つ以上のステップで凍結保存されていることが最も好ましい。解凍から心筋細胞塊を形成し細胞塊を拍動させるまでの期間は、迅速に移植治療等に用いることができるという観点から、216時間以内であれば心筋細胞移植治療等に早く細胞塊を提供できることから好ましく、132時間以内であることがより好ましく、108時間以内がさらに好ましく、84時間以内が特に好ましく、60時間以内が最も好ましい。
　また、凍結・解凍時に細胞が受ける温度履歴を均質化しやすいことから、凍結・解凍する細胞は単細胞化されていることが好ましい。
　安定化培養された履歴を持つ単細胞化された心筋細胞を心筋細胞塊の作製に用いると、非常に効率よく真球性が高く粒径分布の狭い心筋細胞塊が得られることを本発明者は見出した。ここで安定化培養とは、細胞の解凍後から心筋細胞塊の作製開始前までに行う培養のことを指す。安定化培養中に行われる操作について特に限定は無いが、細胞の状態を意図的に大きく変化させないことが好ましい。例えば、分化誘導を意図的に行わないことが好ましい。安定化培養を行うステップについて特に限定は無いが、心筋細胞塊の作製開始直前に行われていることが、形状が良好な心筋細胞塊を効率良く得やすいことから好ましい。ここでいう「効率良く」とは、死細胞が発生し難いことを含む。また、心筋細胞塊作製前の最後の解凍直後に行われることも、形状が良好な心筋細胞塊を効率良く得やすいことから好ましい。また、当該安定化培養は接着方式で行われることが好ましい。接着方式による培養（接着培養）とは、前記懸濁条件下ではなく、基材上に細胞がある程度固定された状態で行うものであり、基材表面に細胞と接着しやすい材質を含むことが好ましい。基材表面に細胞と接着しやすい材質を含ませる方法としては、従来より公知のコーティング剤を用いて公知の方法で処理することで実施できる。また、当該安定化培養終了時に、基材表面から細胞を剥離しやすい基材、或いは剥離剤及び／又はキレート剤を使用する。剥離剤は限定しないが、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼの他、市販のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標登録）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標登録）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ディスパーゼ（商標登録）等を利用することができる。例えば、単一細胞化にトリプシンを使用する場合、溶液中の濃度の下限は、細胞集合体を分散できる濃度であれば特に限定はされないが、例えば0.15体積％以上、0.18体積％以上、0.20体積％以上、又は0.24体積％以上であればよい。一方、溶液中の濃度の上限は、細胞そのものが溶解される等の影響を受けない濃度であれば特に限定はされないが、0.30体積％以下、0.28体積％以下、又は0.25体積％以下であればよい。また処理時間は、トリプシンの濃度によって左右されるものの、その下限は、トリプシンの作用によって細胞集合体が十分に分散される時間であれば特に限定はされず、例えば5分以上、8分以上、10分以上、12分以上、又は15分以上であればよい。一方、処理時間の上限は、トリプシンの作用によって細胞そのものが溶解される等の影響を受けない時間であれば特に限定はされず、例えば30分以下、28分以下、25分以下、22分以下、20分以下、又は18分以下であればよい。なお、市販の剥離剤を使用する場合には、添付のプロトコルに記載の、細胞を分散させて単一状態にできる濃度で使用すればよい。前記剥離剤及び／又はキレート剤による処理後に物理的に軽く処理することで、単一細胞化を促進できる。この物理的処理は限定しないが、例えば、細胞を溶液ごと複数回ピペッティングする方法が挙げられる。さらに、必要に応じて、細胞をストレーナーやメッシュに通過させてもよい。
　単一細胞化した細胞は、静置又は遠心分離により剥離剤を含む上清を除去して回収することができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄してもよい。
　前記安定化培養期間に特に限定は無いが、4時間以上であれば心筋細胞塊の真球性の高さや粒径分布の狭さの観点から好ましい。より好ましい安定化培養期間は12時間以上であり、更に好ましくは24時間以上であり、特に好ましくは48時間以上であり、最も好ましくは60時間以上である。また安定化培養の期間が1000時間以下であれば、経済性の観点から好ましく、より好ましくは500時間以下、更に好ましくは240時間以下、特に好ましくは150時間以下、最も好ましくは84時間以下である。安定化培養期間中に液体（培地）成分の組成を変えても良い。液体は通常、当分野で培地交換と呼ばれるような操作で交換を行うことができる。交換頻度に特に限定は無く、１時間毎、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎等、定期的に行っても良いし、不定期でも良い。また交換する量にも限定は無く、ほぼ全量を交換しても良いし、半量でも良いし、灌流にて常時所定量ずつ入れ替えても良い。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する期間に特に限定は無いが、216時間以内であれば心筋細胞移植治療等に早く細胞塊を提供できることから好ましく、132時間以内であることがより好ましく、108時間以内がさらに好ましく、84時間以内が特に好ましく、60時間以内が最も好ましい。また、拍動がしっかりした心筋細胞塊を得られやすいことから、当該心筋細胞塊を作製する期間は25時間以上が好ましく、36時間以上が特に好ましく、48時間以上が最も好ましい。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する温度に特に限定は無いが、細胞や懸濁液が凍結しない温度以上且つ懸濁液の沸点以下であることが好ましい。短時間で拍動を得やすいことから、当該温度が4℃以上であることが好ましく、10℃以上であることがより好ましく、18℃以上であることが更に好ましく、25℃以上であることが特に好ましく、最も好ましくは32℃以上である。また細胞死が起きにくいことから、当該温度は60℃以下であることが好ましく、50℃以下であることがより好ましく、45℃以下であることが更に好ましく、43℃以下であることが特に好ましく、最も好ましくは40℃以下である。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する時の環境中のガス組成や濃度に特に限定は無く、通常よく用いられる炭酸ガス雰囲気下のインキュベーター内で実施することもできる。この場合の炭酸ガス濃度についても特に限定は無いが、1％以上10％以下であれば、懸濁液の液性を保持しやすい。より好ましい炭酸ガス濃度の範囲は2％以上8％以下、更に好ましくは3％以上7％以下、特に好ましくは4％以上6％以下、最も好ましくは5％である。また酸素濃度についても特に限定は無いが、5％以上であれば細胞死が生じ難いことから好ましく、10％以上であることがより好ましく、15％以上であることが更に好ましく、18％以上であることが特に好ましく、最も好ましくは20％以上である。また30％以下であれば不要な細胞の酸化を抑制できることから好ましく、27％以下であればより好ましく、25％以下であれば更に好ましく、22％以下であることが特に好ましく、21％以下であることが最も好ましい。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する時の懸濁液のpHに特に限定はないが、pHが2以上であれば不要な酸化の影響を受け難く、pHが12以下であれば細胞死が起きにくいことから好ましい。より好ましい当該pHの範囲は3以上11以下、さらに好ましくは4以上10以下、特に好ましくは5以上9以下、最も好ましくは6以上8以下である。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する時の懸濁液の溶存酸素量に特に限定は無いが、懸濁液の液体成分に空気を充分量飽和させた時の溶存酸素量を100とした場合、10以上であれば細胞死を抑制しやすく、100以下であれば余計な通気の必要が無いことから好ましく、25以上95以下であればより好ましく、40以上90以下であればさらに好ましく、50以上85以下であれば特に好ましく、60以上80以下が最も好ましい。
　本発明において、単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、当該細胞同士を凝集させて心筋細胞塊を作製する際に用いる懸濁用の液体中の成分に特に限定は無いが、心筋細胞を安定化培養できる培地を使用することが好ましい。また、本発明によれば、良好な心筋細胞塊を簡便に得ることができることから、単細胞化された心筋細胞を凝集させて心筋細胞塊を作製する際に、特殊な培地成分を26時間以上用いないことが経済性、治療時の副作用、後処理の容易性の観点から好ましく、24時間以上用いないことがより好ましく、12時間以上用いないことが更に好ましく、6時間以上用いないことが特に好ましく、最も好ましくは一度も用いないことである。特殊な培地成分として、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、血小板由来成長因子-BB（PDGF-BB）、エンドセリン-1（ET-1）等を例示することができる。懸濁用の液体は通常、当分野で培地交換と呼ばれるような操作で交換を行うことができる。交換頻度に特に限定は無く、１時間毎、４時間毎、８時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎等、定期的に行っても良いし、不定期でも良い。また交換する量にも限定は無く、ほぼ全量を交換しても良いし、半量でも良いし、灌流にて常時所定量ずつ入れ替えても良い。
　本発明の製造方法によれば、形状が良好で真球性の高い心筋細胞塊を得ることができる。形状の指標としてアスペクト比を挙げることができる。アスペクト比はMinimum Feret DiameterとMaximum Feret Diameterの比で求めることができる。本発明で提供できる心筋細胞塊の好ましい態様としては、アスペクト比の平均値が0.70以上であり、より好ましくは0.75以上であり、さらに好ましくは0.80以上であり、特に好ましくは0.85以上であり、最も好ましくは0.90以上である。
　また、本発明の製造方法によれば、サイズが比較的均質な心筋細胞塊集団を提供することができる。サイズの均質性の指標として標準偏差を挙げることができる。本発明で提供できる心筋細胞塊の好ましい態様としては、細胞塊のサイズの標準偏差が平均値の３０％以下であり、さらに好ましくは２５％以下であり、特に好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１５％以下である。心筋細胞塊のサイズの平均値に特に限定は無いが、50μm以上であれば心筋細胞としての機能（拍動等）の発現の点で好ましく、より好ましくは75μm以上、更に好ましくは100μm以上、特に好ましくは150μm以上、最も好ましくは200μm以上である。また、心筋細胞塊のサイズの平均値が2000μm以下であれば、移植時に注入しやすいことから好ましく、より好ましくは1500μm以下、更に好ましくは1000μm以下、特に好ましくは500μm以下、最も好ましくは300μm以下である。ここでいう細胞塊のサイズはMinimum Feret DiameterとMaximum Feret Diameterの平均で求められるものである。
　本発明により得られた心筋細胞塊は個体（生体）の心臓組織に移植することができる。例えば、注射により心筋細胞を心臓組織中に直接注入することもできる。特殊な液体成分を用いずに心筋細胞塊を製造した場合、懸濁液の液体成分を置換せず、そのまま移植に用いることもできるが、個体に適切な液体（例：生理食塩水）に置換したうえで移植することもできる。本発明により得られる心筋細胞塊はサイズの分布が小さく、形状も良好であることから、注射針での詰まり等の不具合は発生し難いが、念のため移植時に用いる注射針の内径以下の注射針或いは流路や篩を通過できた心筋細胞塊のみを集めておくことが好ましい。特に３０Ｇ以下の低侵襲性の注射針を用いたい場合に、注射針を通過しない心筋細胞塊を除去しておくことは効果的である。また細胞凝集塊のサイズを、凝集塊を構成する細胞の個数で表す場合、100個以上であれば心臓への生着率が高まることから好ましく、より好ましくは500個以上、さらに好ましくは750個以上、特に好ましくは900個以上、最も好ましくは1000個以上であり、5000個以下であれば細胞塊中の細胞の品質にバラつきがなく、注射針を用いた移植がしやすいことから好ましく、4000個以下がより好ましく、3000個以下がさらに好ましく、2000個以下が特に好ましく、最も好ましくは1500個以下である。
　以上のように、本発明のように無数に好適な心筋細胞塊を一度に簡便に得られる例は知られておらず、非常に優れた画期的な発明であると言える。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　使用した材料、資材を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　使用した心筋細胞の添付資料によると、前記心筋細胞は凍結細胞であり、iPS細胞由来ヒト心筋細胞と記載されていた。またiPS細胞のCell lineは253G1であった。心筋トロポニンT陽性細胞率は95.5%であった。CarmyA用維持培地の基本組成はCaCl2：0.182 g/L, MgSO4:0.09767 g/L, KCl: 0.439 g/L, NaHCO3:3.362 g/L, NaCl: 5.4525 g/L, Na2HPO4:0.109 g/L, HEPES: 5.958 g/L, Phonol red Na: 0.0134 g/Lと記載されていた。表1中のY-27632はROCK阻害剤である。
　（ゼラチン溶液の調製）
　100 mgのGelatinを100mLの純水（メルク社製Milli-Qで調製）に溶解し、オートクレーブし、4℃で保存した。
　（細胞解凍）
1）　24-well plateの1ウェルにゼラチン溶液500 μLを添加し、３７℃で1時間インキュベートした。
2）　Carmy A用播種培地に終濃度10 μMとなるようにY-27632を添加したものを解凍培地とし、37℃に温めた。
3）　凍結保存されたCarmyA-Humanの入ったバイアル2本を37℃のウォーターバスで3分間温めた。
4）　ピペッティングを行わずに細胞懸濁液をそれぞれ50 mL遠沈管に移した。
5)　解凍培地1 mLでバイアルを洗い、その1 mLを1滴/5秒の速度で細胞懸濁液に添加し、振り混ぜた。
6)　解凍培地1 mLを細胞懸濁液に1滴/2秒で加え振り混ぜた。
7)　解凍培地8 mLを細胞懸濁液に1滴/1秒で加え振り混ぜた。
8)　300 x gで5分間遠心後、上清を除去した。
9)　500 μLの解凍培地に懸濁後、2本分を1つにまとめ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Countess II FL自動セルカウンターを用いて細胞数カウントを行った。
10）　細胞数カウント結果を基に、2×106 cells/mLの細胞懸濁液500 μLと2×105 cells/mLの細胞懸濁液5 mLを解凍培地を使って調整した。
　（心筋細胞塊の作製―安定化培養無し）
　2×105 cells/mLの前記細胞懸濁液と解凍培地を、表2の播種細胞数となるように各容器に加え、蓋をした。37℃、5％CO2下のインキュベーターにオプティマ社製Orbital Shaker OS-762（旋回幅（直径）25 mmで水平面に沿って円を描くように旋回する）を設置し、このシェーカーのステージに心筋細胞懸濁液の入った容器を載せ、所定の回転数でステージを旋回し、心筋細胞塊作製を開始した。48時間後に上清を全量除去し、37℃の維持培地に終濃度5 μMとなるようにY-27632を添加したもので培地の全量交換を実施し、72時間後まで旋回を続けた。表2に結果を示す。72時間後の細胞及び細胞塊のサイズの平均値が50 μm以上の場合に、細胞塊を形成したと判断した。細胞および細胞塊の個々のサイズは、ZEISS社製ルーチン倒立顕微鏡 Primovertで撮影した細胞および細胞塊の画像から、顕微鏡に付属のソフトウェア・ZENの計測機能を用いてMinimum Feret DiameterとMaximum Feret Diameterを求め、両者の平均値とした。細胞塊のサイズの平均値は、50μm以上の細胞塊のサイズの平均値とした。細胞塊サイズの標準偏差は、細胞塊のサイズの平均値を求める際に含めたそれぞれの数値と平均値の差の二乗平均の正の平方根とした。アスペクト比はMinimum Feret DiameterとMaximum Feret Diameterの比とした。拍動確認時間は、心筋細胞塊作製開始から、拍動を確認できた時点の時間である。実施例５，６では全体の約30％の細胞が死細胞となり、旋回がやや強いことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（心筋細胞塊の作製―安定化培養有り）
1）　ゼラチン溶液を各容器の推奨容量まで加え、37℃で1時間静置し、ゼラチン溶液を除去した。
2)　（細胞解凍）で2×106 cells/mLに調製した細胞懸濁液をゼラチンコートしたウェルに500 μL播種した。
3)　細胞接着の偏りをなくすため、クリーンベンチ内で15分間静置した後、37℃、5％CO2下のインキュベーター内に移した。
4)　24時間毎に上清を全量除去し、37℃の維持培地で培地の全量交換を実施しながら安定化培養を72時間続けた。
5)　上清を吸引除去した後、1 mLのPBSを加えた。
6)　PBSを除去後、0.25 mLのAccumaxを添加し、37℃で20分間インキュベートした。
7)　播種用培地（3 μM Y-27632含有）を1 mL加えた後、5分間静置した。
8)　目視で細胞塊が見えなくなるまでピペッティングした後、15 mL遠沈管に移した。
9)　300 x gで5分間遠心後、上清を除去した。
10)　播種用培地（10 μM Y-27632含有）を1 mL添加し、細胞数カウントを行った。
11)　カウント結果を基に、2×105cells/mLの細胞懸濁液2.5 mLを調整した。
12）　11)で作製した2×105 cells/mLの細胞懸濁液と解凍培地を、表3の播種細胞数となるように各容器に加え、蓋をした。
13）　37℃、5％CO2下のインキュベーターにオプティマ社製Orbital Shaker OS-762（旋回範囲25 mm）を設置し、このシェーカーのステージに心筋細胞懸濁液の入った容器を載せ、所定の回転数でステージを旋回し、心筋細胞塊作製を開始した。
14）　24時間後に上清を全量除去し、37℃の維持培地に終濃度5 μMとなるようにY-27632を添加したもので培地の全量交換を実施した。
15）　48時間後に上清を全量除去し、37℃の維持培地に終濃度2 μMとなるようにY-27632を添加したもので培地の全量交換を実施した。
16)　72時間後まで旋回を続けた。表3に結果を示す。72時間後の細胞及び細胞塊のサイズの平均値が50 μm以上の場合に、細胞塊を形成したと判断した。拍動確認時間は、心筋細胞塊作製開始から、拍動を確認できた時点の時間である。実施例７は、安定化培養を行ったこと以外は、実施例４と同様の操作を行ったが、実施例４に比べて細胞塊サイズの平均値を小さくでき、死細胞も全体の約２％程度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表2と表3の結果から、本発明は極めて簡便な方法で心筋細胞塊を提供できることが分かる。また、従来の心筋細胞塊の製造方法に比べて、極めて短期間に拍動を開始させることができた。また本発明によれば、心筋細胞塊のサイズを自在に制御できることが分かる。また心筋細胞塊の形状や、サイズの分布も良好であることが分かる。これらの実施例は本発明の一部に過ぎないが、大量の心筋細胞塊を極めて簡便に短期間で作製できることを十分に示している。よって、本発明は移植治療等に大きく貢献できると期待できる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　安定化培養された履歴を持つ単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下で流動し、当該細胞同士を凝集させる凝集工程を含む、心筋細胞塊の製造方法。
  2. 　単細胞化された心筋細胞を、懸濁条件下、非環状容器内で流動させ、当該細胞同士を凝集させる凝集工程を含む、心筋細胞塊の製造方法。
  3. 　前記安定化培養が接着培養である、請求項１又は２に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  4. 　前記安定化培養期間が4時間以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  5. 　単細胞から心筋細胞塊を製造するまでの期間が216時間以内である、請求項１～４のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  6. 　前記容器が実質的に平底である、請求項１～５のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  7. 　前記容器の容積が0.5 mL以上である、請求項１～６のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  8. 　前記流動が20 rpm以上200 rpm未満の旋回速度で行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  9. 　前記容器を旋回させる範囲が10 mm以上である、請求項８に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  10. 　前記懸濁に用いる液体としてインスリン、トランスフェリン、セレニウム、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、上皮細胞増殖因子（EGF）、血小板由来成長因子-BB（PDGF-BB）及びエンドセリン-1（ET-1）からなる群から選択されるいずれか一以上の成分を含む培地を26時間以上使用しない、請求項１～９のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  11. 　前記心筋細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の心筋細胞塊の製造方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で製造され、アスペクト比の平均値が０．７０以上である心筋細胞塊。
  13. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で製造される心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズにおける標準偏差が平均値の３０％以下である前記心筋細胞塊。
  14. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で製造される心筋細胞塊であって、細胞塊のサイズの平均値が50μm以上2000μm以下である前記心筋細胞塊。
  15. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で製造され、作製開始から216時間以内に拍動を開始する心筋細胞塊。
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