WO2021251394A1 - 向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法、心筋細胞の純化方法、心筋細胞集団、および移植材料 - Google Patents

向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法、心筋細胞の純化方法、心筋細胞集団、および移植材料 Download PDF

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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity, a method for purifying cardiomyocyte, a cardiomyocyte population, and a material for transplantation.
  • pluripotent stem cells When differentiation is induced from pluripotent stem cells to myocardial cells, not all pluripotent stem cells can be induced to differentiate into myocardial cells, so undifferentiated stem cells remain or the differentiation efficiency varies between lots. It can be seen.
  • the low purity of cardiomyocytes and the variation in differentiation efficiency between lots are particularly problematic in terms of quality such as safety when cardiomyocytes are used as raw materials for transplant materials such as myocardial sheets.
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of improving the purity of cardiomyocytes by a simple operation without damaging the cardiomyocytes.
  • a cell population containing cardiomyocytes is cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • a method for producing a cardiomyocyte population having an improved cardiomyocyte purity including the above.
  • a cell population containing cardiomyocytes seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is cultivated with a WNT signal activator.
  • a method for producing a cardiomyocyte population having an improved cardiomyocyte purity which comprises culturing in the cell population to improve the purity of the cardiomyocyte in the cell population.
  • a cell population containing cardiomyocytes in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • Methods for purifying cardiomyocytes are provided, including.
  • a cell population containing cardiomyocytes seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was placed in a culture medium containing a WNT signal activator.
  • a method for purifying cardiomyocytes which comprises enhancing the purity of the cardiomyocytes in the cell population by culturing in.
  • a cardiomyocyte population produced by the method according to the first embodiment or a cardiomyocyte population produced by the method according to the second embodiment is provided.
  • the purity of cardiomyocytes can be improved by a simple method without damaging the cardiomyocytes.
  • the present invention is useful in any situation where cardiomyocytes are provided, and in particular, in a situation where a cell raw material for a transplant material such as a myocardial sheet is provided.
  • Graph showing cardiomyocyte purity A graph showing the proportion of multinuclei muscle cells. A graph showing the average maximum length of multinuclear muscle cells. Graph showing cardiomyocyte purity. Graph showing cardiomyocyte purity. Waveform diagram without addition of terphenazine. Waveform diagram when terfenazine is added at the final concentration of 100 nM. Waveform diagram when terfenazine is added at the final concentration of 300 nM. Waveform diagram when terfenazine is added at the final concentration of 500 nM. Waveform diagram when terfenazine is added at the final concentration of 900 nM. Microscopic image showing the heart of a rat with myocardial infarction after transplantation.
  • mice Microscopic image showing the heart of a rat with myocardial infarction after transplantation.
  • cardiomyocytes are cells that hardly proliferate even when cultured. Therefore, it is difficult to improve the purity of cardiomyocytes by the proliferation of cardiomyocytes, and in order to improve the purity of cardiomyocytes, as described in the column of background technology, the flow cytometer is used for other than cardiomyocytes and cardiomyocytes. Physical sorting with cells was performed.
  • the present inventors when a specific culture condition is adopted, proliferate cardiomyocytes while suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes, thereby improving the purity of cardiomyocytes. We have newly discovered that we can do this, and have completed the present invention.
  • the method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity comprises culturing a cell population containing cardiomyocytes in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • the "cell population including cardiomyocytes” is a cell population prepared as cardiomyocytes, but may contain cells other than cardiomyocytes.
  • the proportion of cardiomyocytes contained in the cell population ie, cardiomyocyte purity
  • cardiomyocyte purity is preferably 30-95%, more preferably 75-95%. That is, the cell population has a cardiomyocyte purity of preferably 30-95%, more preferably 75-95% at the start of culture.
  • the method of the first embodiment can proliferate myocardial cells while effectively suppressing the proliferation of cells other than myocardial cells by the action of an EGF receptor inhibitor.
  • the cardiomyocyte purity can be efficiently increased even if the cardiomyocyte purity is relatively low (for example, the cardiomyocyte purity of 30% or more and less than 75%).
  • the method of the first embodiment is also an effective method when the "cell population containing cardiomyocytes" has a relatively high cardiomyocyte purity (for example, 75 to 95% cardiomyocyte purity). In this case, the cardiomyocyte purity can be further improved.
  • cardiomyocyte purity represents the ratio (percentage) of the number of cardiomyocytes when the total number of cells is 100.
  • Cardiomyocyte purity can be determined by flow cytometry analysis using antibodies such as myocardial troponin T (cTnT), ⁇ -actinin, ⁇ -myocardial actin, and GATA-4, which are myocardial markers. Since the cardiomyocyte purity of the cell population can be increased by culturing the cell population according to the above method, the cell population may have a relatively low cardiomyocyte purity at the start of the culture.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” is, for example, a cell population obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” may be primary cultured cardiomyocytes isolated from the heart of an organism.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” may be commercially available pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (eg, CDI's iCell, Takara Bio's MiraCell, Axogenesis's Cor. 4U, etc.). good.
  • a “pluripotent stem cell” has pluripotency capable of differentiating into all cells constituting an adult and self-renewal ability capable of maintaining the pluripotency even after cell division. Means cells.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic reproductive stem cells (EG cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • the "cell population containing cardiomyocytes” is preferably a cell population obtained by inducing differentiation of iPS cells into cardiomyocytes (hereinafter, also referred to as iPS cell-derived cardiomyocytes).
  • Cardiomyocytes derived from iPS cells can be produced by a known cardiomyocyte differentiation induction method, for example, a protein-free cardiomyocyte differentiation induction (PFCD) method (see WO2015 / 182765).
  • PFCD protein-free cardiomyocyte differentiation induction
  • the protein-free cardiomyocyte differentiation induction (PFCD) method can generate a cell population containing high-purity cardiomyocytes, for example, a cell population containing cardiomyocytes with a purity of 75 to 95%.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” may be a cell population containing cardiomyocytes of any organism, but is preferably a cell population containing mammalian cardiomyocytes, and more preferably a cell containing human cardiomyocytes. It is a group.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” is preferably a cell population obtained by inducing differentiation of human iPS cells into cardiomyocytes (hereinafter, also referred to as human iPS cell-derived cardiomyocytes). More preferably, the "cell population containing cardiomyocytes” is a cell population obtained by inducing differentiation of human iPS cells into mature cardiomyocytes (hereinafter, also referred to as mature cardiomyocytes derived from human iPS cells). Since the maturity of cardiomyocytes can be increased by culturing the cell population according to the above method, the cell population may contain immature cardiomyocytes at the start of culturing.
  • mature cardiomyocytes derived from human iPS cells is a term used in the art in comparison with immature cardiomyocytes derived from human iPS cells, and is compared with immature cardiomyocytes derived from human iPS cells. , Has high ion channel function.
  • “Mature cardiomyocytes derived from human iPS cells” are, for example, cells 14 days or more after the start of induction of iPS cell differentiation.
  • the day when the differentiation induction of iPS cells is started is the day when the iPS cells maintained in the undifferentiated state are exposed to the treatment for shifting to the differentiated state, and this day is defined as the 0th day.
  • the “mature cardiomyocytes derived from human iPS cells” can be cultured for a long period of time while maintaining the state of differentiation, the “mature cardiomyocytes derived from human iPS cells” must be differentiated after the induction of differentiation is started.
  • the upper limit of the number of days elapsed is not particularly limited.
  • mature cardiomyocytes derived from human iPS cells may be cultured or stored for a long period of time while maintaining a differentiated state, and the cells may be used as seed cells.
  • the “mature cardiomyocyte derived from human iPS cells” may be a cell 365 days or more after the start of induction of differentiation of iPS cells.
  • the “mature cardiomyocyte derived from human iPS cells” preferably refers to cells 14 days or more (for example, 30 to 37 days) after the start of iPS cell differentiation induction by the protein-free myocardial differentiation induction (PFCD) method.
  • PFCD protein-free myocardial differentiation induction
  • a cell population containing cardiomyocytes is cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor.
  • a cell population containing cardiomyocytes is seeded in a culture vessel in a state of being suspended in a culture medium, and then cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor.
  • WNT signaling activators and EGF receptor inhibitors may be added to the cell suspension prior to seeding or to the cell suspension after seeding.
  • the cell population containing myocardial cells is seeded in a culture vessel in a state of being suspended as a single cell in the culture medium, and then adhered in the culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor. It can be cultivated by culturing. Cells in a single cell state can be prepared, for example, by treating the cell mass with a proteolytic enzyme (eg trypsin).
  • a proteolytic enzyme eg trypsin
  • the cell population containing cardiomyocytes can be seeded at any cell density. It has been demonstrated in the examples below that the method of the first embodiment can improve the cardiomyocyte purity regardless of the seeding density (see FIG. 4).
  • the cell population containing cardiomyocytes is, for example, 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5. It can be seeded at a cell density of cells / cm 2.
  • the culture broth can contain a base culture broth, a WNT signal activator, and an EGF receptor inhibitor.
  • the culture medium can be prepared by adding a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to the base culture medium.
  • the base culture medium a known culture medium for cardiomyocytes can be used.
  • the base culture solution contains an inorganic salt containing a calcium salt, a magnesium salt, a potassium salt, and a sodium salt as a basic component, and a buffer solution.
  • a basal medium such as DMEM, RPMI, IMDM, Ham-12 may be used.
  • the basal medium is available, for example, from Sigma-Aldrich Japan.
  • the base culture may use basic components having the following composition: 0.01-0.5 g / L (eg 0.182 g / L) CaCl 2 , 0 to 1.0 g / L (eg, 0.09767 g / L) silyl 4 , 0.1-1.0 g / L (eg 0.4 g / L) KCl, 0 to 10.0 g / L (eg, 3.362 g / L) of NaHCO 3 , 1.0 to 20.0 g / L (eg, 5.4525 g / L) NaCl, 0 to 1.0 g / L (eg, 0.109 g / L) of Na 2 HPO 4 and 0 to 20.0 g / L (eg, 5.958 g / L) of HEPES.
  • 0.01-0.5 g / L eg 0.182 g / L
  • CaCl 2 0 to 1.0 g / L (eg, 0.09767
  • the base culture medium may contain a conventional component conventionally added to the cell culture medium in addition to the basic component.
  • Conventional ingredients include, for example, serum and ROCK inhibitors.
  • the base culture medium may contain serum.
  • Serum is known to increase the rate of cell proliferation.
  • the serum is, for example, FBS (Fetal bovine serum).
  • FBS Fetal bovine serum
  • the base culture broth contains serum, it can contain 0.1 to 50% by mass of serum with respect to the base culture broth before the addition of the conventional component.
  • Serum has an effect of increasing the proliferation rate of cardiomyocytes, but when the serum concentration is high, the proliferation rate of cells other than cardiomyocytes also increases, so the concentration in the above range is preferable.
  • the base culture solution may contain a ROCK inhibitor.
  • ROCK inhibitors are known to suppress possible cell death when seeding cells in a single cell.
  • ROCK inhibitor refers to a substance that inhibits Rho kinase, for example, Y-27632 ((R)-(+)-trans-4- (1-aminoethyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride. Salt; CAS. No. 129830-38-2).
  • the base culture medium contains a ROCK inhibitor, it can contain the ROCK inhibitor at a concentration of 0.1-100 ⁇ M. Therefore, the ROCK inhibitor is preferably contained in the seeded cell-containing culture medium, but may not be contained in the new culture medium used in the culture medium exchange.
  • WNT signal activators refer to substances that activate the WNT signaling pathway, specifically GSK3 ⁇ inhibitors such as CHIR99021, BIO, TWS119, Kenpaullone, TCS2002, TC-G24, SB415286, NSC693868, A 1070722, AR-A014418, lithium chloride, etc. can be mentioned.
  • the WNT signal activator is preferably CHIR99021.
  • CHIR99021 is 6- [2-[[4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidine-2-yl] amino] ethylamino] pyridine-3- It is carbonitrile and has a CAS number of 252917-06-9.
  • the WNT signal activator can be contained in the culture broth at a concentration of preferably 1 to 5 ⁇ M, more preferably 2 to 5 ⁇ M, still more preferably 2 to 4 ⁇ M.
  • the WNT signal activator can increase the proliferation rate of cardiomyocytes.
  • the mechanism by which the WNT signal activator promotes the proliferation of cardiomyocytes is considered as follows. It is generally known that the WNT signal is a cell signal involved in cell proliferation and canceration. In addition, WNT signal activation is required for myocardial cells to differentiate into progenitor cells via mesoderm induction during their development, whereas WNT signal is inhibited during the process of differentiation from mesoderm to myocardium. It is necessary. From this, it is considered that cardiomyocytes are cells highly sensitive to WNT signals. Therefore, under appropriate conditions, myocardial cells are more prone to cell proliferation due to WNT signals than other cells such as fibroblasts. Therefore, by selectively activating WNT signals, myocardial cells It seems that efficient cell proliferation limited to the above will be possible.
  • EGF receptor inhibitors refer to substances that inhibit signal transduction from EGF receptors, such as AG1478, gefitinib, Afatinib, ARRY334543, AST1306, AZD8931, BIBU1361, BIBX 1382, BPDQ, BPIQ-I, BPIQ- II, Canertinib, CL-387,785, CUDC101, Dacomitanib, Vandetanib, EGFR Inhibitor III, EGFR / ErbB-2 Inhibitor, Erlotinib, GW 583340, GW2974, HDS029, Lapatinib, WHI-P154, OSI-420, PD153035, PD 168393, PD 174265, Pelitinib, Compound 56, XL647, PP3, AG-490, AG 555, Tyrphostin B42, Tyrphostin B44, AG 556, AG 494, AG 825, RG-13022, DAPH, Er
  • the EGF receptor inhibitor is preferably AG1478.
  • AG1478 is N- (3-chlorophenyl) -6,7-dimethoxy-4-quinazoline-4-amine and has a CAS number of 175178-82-2.
  • the EGF receptor inhibitor can be contained in the culture medium at a concentration of preferably 1 to 10 ⁇ M, more preferably 2 to 10 ⁇ M, still more preferably 4 to 8 ⁇ M.
  • the EGF receptor inhibitor can suppress the proliferation of cells other than cardiomyocytes (for example, fibroblasts). By suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes, the proportion of proliferated cardiomyocytes in the cell population (cardiomyocyte purity) can be increased. It is considered that the mechanism by which the EGF receptor inhibitor suppresses the proliferation of cells other than myocardial cells such as fibroblasts is that the signal of cell proliferation is suppressed by the inhibition of the EGF signal and the receptor tyrosine kinase.
  • the pH of the culture solution is not particularly limited, but is preferably 6.0 to 9.0, more preferably 7.0 to 8.0.
  • any container used for adhesion culture of cells can be used.
  • a flat-bottomed vessel for example, a culture flask, a culture dish, a culture plate, or the like can be generally used.
  • the culture vessel may be coated with one or more substances capable of promoting cardiomyocyte adhesion, proliferation, and / or maturation. Examples of such substances include extracellular substrates such as gelatin, laminin, fibronectin, collagen, vitronectin, and matrigel.
  • the culture vessel can be prepared by commercially obtaining a gelatin-coated culture vessel and coating the culture vessel with laminin.
  • laminin for example, iMatrix-511 (Nippi Co., Ltd.) can be used.
  • the culture can be performed under conditions suitable for culturing cardiomyocytes. Culturing can be carried out, for example, in an atmosphere of 5% CO 2 at a temperature of 30 to 43 ° C. for any period (eg, 1 to 1000 days). During the culture, the culture medium may be changed as needed (for example, every 1 to 14 days).
  • the culture is preferably carried out under the condition that the distance from the liquid surface of the culture solution to the bottom surface of the culture vessel in contact with the cardiomyocytes (hereinafter, also referred to as the liquid level distance) is 3 to 30 mm.
  • the liquid level distance is more preferably 5 to 10 mm.
  • a T25 flask area: 25 cm 2
  • the culture is carried out at a constant liquid level distance of the cardiomyocytes for the proliferation of the cardiomyocytes.
  • cardiomyocytes By culturing a cell population containing cardiomyocytes according to the above method, cardiomyocytes can be proliferated while suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes. Thereby, a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity (hereinafter, also simply referred to as a cardiomyocyte population) can be produced.
  • the above method is a simple and low-cost method because the cardiomyocyte purity can be improved only by culturing the cells in a culture medium containing a specific component.
  • a part of the cardiomyocyte population obtained by the above culture may be suspended in a new culture medium and cultured in the second and subsequent passages. That is, in the above method, the culture may be carried out by subculture. Subculture can be performed by repeating the above culture. Specifically, in the second and subsequent cultures, the myocardial cell population obtained by the previous culture is brought into a single cell state, and is suspended in a new culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor. It can be carried out by seeding and culturing the cell suspension obtained after turbidity in a culture vessel.
  • a culture medium having the same composition as the previous culture may be adopted, and if the culture medium contains a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor, it is different from the previous culture.
  • a culture solution having a composition may be adopted.
  • cardiomyocytes When subculture is performed, cardiomyocytes can be further proliferated while suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes. Thereby, when subculture is performed, the cardiomyocyte purity can be further improved. For example, at the start of culture, a cell population having 80% myocardial cell purity was used for culturing, and after the first passage culture, myocardial cells proliferated at a double growth rate, but cells other than myocardial cells proliferated completely. If the myocardial cells proliferated at a proliferation rate of 1.5 times after the second passage culture but no cells other than the myocardial cells proliferated, about 92% myocardial cell purity could be achieved. By performing subculture in this way, cardiomyocytes can be further proliferated while suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes, and even higher cardiomyocyte purity can be achieved.
  • the subculture can be carried out preferably over 2 to 5 subcultures, more preferably 2 to 4 subcultures.
  • the “cell population containing myocardial cells” is defined as 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm. It is preferable to inoculate the cells in a culture vessel in a state of being suspended in the culture medium so as to have a cell density of 2, and then incubate in the culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor. That is, in a preferred embodiment, a method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity is described.
  • Cells containing myocardial cells seeded at a cell density of 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2.
  • the population is cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the myocardial cells in the cell population.
  • the cell population containing myocardial cells has a cell density of 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2.
  • the cells are seeded in a culture vessel while being suspended in the culture medium, and the cell population is cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor.
  • WNT signaling activators and EGF receptor inhibitors may be added to the cell suspension prior to seeding or to the cell suspension after seeding.
  • the “cell population containing myocardial cells” is preferably 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , more preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2. , More preferably 0.3 ⁇ 10 5 to 4.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , and even more preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 3.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 .
  • the above-mentioned cell density is higher than the seeding density generally used when growing and culturing cells other than cardiomyocytes. Further, the cell density of 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is a value close to the upper limit of the cell density that can be disseminated. As described above, when the "cell population containing cardiomyocytes" is seeded at a relatively high cell density, the cardiomyocytes can proliferate efficiently. In this case, the cardiomyocytes do not have sufficient space for proliferation, but can proliferate so as to swell in the depth direction of the culture medium while being adhered to the bottom surface.
  • the above-mentioned cell density is higher than the seeding density generally used for proliferating and culturing cells other than cardiomyocytes, cells other than cardiomyocytes can proliferate when seeded at the above-mentioned cell density. Is not sufficiently secured and it is difficult to grow.
  • the proliferation effect of cardiomyocytes can be further enhanced, and the proliferation inhibitory effect of cells other than cardiomyocytes can be further enhanced.
  • the proliferation of cells other than cardiomyocytes was suppressed by the action of an EGF receptor inhibitor, but in the 2nd embodiment, the cells are seeded at a relatively high cell density to cause myocardium. It suppressed the growth of cells other than cells.
  • the method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity is A cell population containing cardiomyocytes seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was cultured in a culture medium containing a WNT signal activator, and the cells were cultured. It involves improving the purity of the cardiomyocytes in the population.
  • a method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity is described.
  • a cell population containing cardiomyocytes is seeded in a culture vessel in a state of being suspended in a culture medium so as to have a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2.
  • the cell population can be cultured in a culture medium containing a WNT signal activator to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • the WNT signal activator may be added to the cell suspension before seeding or may be added to the cell suspension after seeding.
  • the ratio of cardiomyocytes contained in the "cell population containing cardiomyocytes" is preferably 30 to 95%, more preferably 75 to 95%. That is, the cell population has a cardiomyocyte purity of preferably 30-95%, more preferably 75-95% at the start of culture.
  • the method of the second embodiment is a cardiomyocyte, especially when the "cell population containing cardiomyocytes" has a relatively high cardiomyocyte purity (eg, 75-95% cardiomyocyte purity). It is characterized by being able to efficiently increase the purity.
  • the "cell population containing cardiomyocytes” is seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2.
  • the “cell population containing cardiomyocytes” is preferably 0.3 ⁇ 10 5 to 4.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , more preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 3.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2. Seed at the cell density of.
  • the above-mentioned cell density is higher than the seeding density generally used when growing and culturing cells other than cardiomyocytes. Further, a cell density of 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is a value close to the upper limit of the seeding possible cell density.
  • the cardiomyocytes can proliferate efficiently. In this case, the cardiomyocytes do not have sufficient space for proliferation, but can proliferate so as to swell in the depth direction of the culture medium while being adhered to the bottom surface.
  • the above-mentioned cell density is higher than the seeding density generally used for proliferating and culturing cells other than cardiomyocytes, cells other than cardiomyocytes can proliferate when seeded at the above-mentioned cell density. Is not sufficiently secured and it is difficult to grow.
  • the proliferation effect of cardiomyocytes can be further enhanced, and the proliferation inhibitory effect of cells other than cardiomyocytes can be further enhanced.
  • the culture medium contains a WNT signal activator.
  • the culture broth can contain a base culture broth and a WNT signal activator.
  • the culture broth can be prepared by adding a WNT signal activator to the base culture broth. WNT signaling activators can increase the rate of cardiomyocyte proliferation.
  • the culture medium may further contain an EGF receptor inhibitor. It has been demonstrated in the examples below that the method of the second embodiment can improve cardiomyocyte purity even if the culture medium does not contain an EGF receptor inhibitor (see FIG. 5). However, when the culture medium contains an EGF receptor inhibitor, the proliferation of cells other than cardiomyocytes can be suppressed more effectively.
  • the culture may be carried out by subculture. Specifically, in the second and subsequent cultures, the myocardial cell population obtained by the previous culture is converted into a single cell state, and 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 It can be carried out by suspending the cells in a new culture medium containing a WNT signal activator at the cell density, and seeding and culturing the obtained cell suspension in a culture vessel.
  • a culture medium having the same cell density as the previous culture and the same composition as the previous culture may be adopted, or 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells /. If the cell density is within the range of cm 2, a cell density different from that of the previous culture may be adopted, and if the culture medium contains a WNT signal activator, a culture medium having a composition different from that of the previous culture may be adopted. You may.
  • the myocardial cell population obtained by the previous culture is 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.3 ⁇ 10 5 to 4.0.
  • Seed at a cell density of ⁇ 10 5 cells / cm 2 , more preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 3.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , in culture containing 1 to 5 ⁇ M WNT signal activator. It is preferable to culture.
  • cardiomyocytes By culturing a cell population containing cardiomyocytes according to the method of the second embodiment, cardiomyocytes can be proliferated while suppressing the proliferation of cells other than cardiomyocytes. Thereby, a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity (hereinafter, also simply referred to as a cardiomyocyte population) can be produced.
  • the above method is a simple and low-cost method because the cardiomyocyte purity can be improved only by culturing cells seeded at an appropriate cell density in a culture medium containing a specific component.
  • the method of the first embodiment is simple and low cost because it can be carried out by culturing the cells in a culture medium containing a specific component.
  • the method of the second embodiment can also be carried out by culturing cells seeded at an appropriate cell density in a culture medium containing a specific component, which is convenient and low cost.
  • a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity can be produced by a simple and low-cost method. Considering that it has been necessary to select cells by flow cytometry in order to increase the purity of cardiomyocytes, it can be said that the above method is a very simple method.
  • cardiomyocyte population with high cardiomyocyte purity has a low risk of tumorigenesis and high safety.
  • quality variation is unlikely to occur between lots. Therefore, the cardiomyocyte population having high cardiomyocyte purity is practically excellent, and in particular, it is excellent as a raw material cell for producing a transplant material such as a cardiomyocyte sheet.
  • the cardiomyocytes can be seeded in a state where the space where the cells can proliferate is relatively small (that is, a relatively high cell density), and the cardiomyocytes can be efficiently proliferated. rice field.
  • the general growth form of differentiated cells is that when the cells proliferate in a culture vessel and reach a two-dimensionally confluent state, the cell proliferation is stopped or the proliferation rate is significantly reduced.
  • the myocardial cells swell in the Z-axis direction from the bottom surface of the culture vessel without a foothold in a state of being adhered to the bottom surface even if there is not enough two-dimensional space for proliferation. It was observed to multiply three-dimensionally.
  • the above-mentioned method cannot be considered from the conventional technical wisdom in that it adopts a seeding density that is not used in the conventional growth culture and that the differentiated cells proliferate so as to swell on the bottom surface of the culture vessel.
  • the present inventors consider it to be an invention.
  • Method for producing cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity can also be said to be a cardiomyocyte purification method. That is, according to another aspect, a cell population containing cardiomyocytes is cultured in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population. A method for purifying cardiomyocytes is provided, including the above. According to another aspect, a cell population containing cardiomyocytes seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 is cultured with a WNT signal activator.
  • a method for purifying cardiomyocytes comprises culturing in a solution to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • the method for purifying cardiomyocytes can be carried out according to the description in the above-mentioned "1. Method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity”.
  • Cardiomyocyte population When a cell population containing cardiomyocytes is cultured according to the method described in the section of "1. Method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity" above, a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity is obtained. (Hereinafter, also simply referred to as a cardiomyocyte population) can be obtained. Therefore, according to another aspect, the cardiomyocyte population produced by the method described in the above-mentioned "1. Method for producing cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity" is provided.
  • cardiomyocyte purity Culturing a cell population containing cardiomyocytes according to the method described in the above section "1.
  • Method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity can increase cardiomyocyte purity as described above. can.
  • the culture medium contains an EGF receptor inhibitor, cardiomyocyte purity can be significantly increased. Therefore, the cardiomyocyte population has high cardiomyocyte purity.
  • the cardiomyocyte population has a higher cardiomyocyte purity than the pre-cultured cell population, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more. Have.
  • the cardiomyocyte purity can be brought close to 100%.
  • cardiomyocytes are cells that are difficult to develop into tumors, so a cardiomyocyte population with high cardiomyocyte purity has a low risk of tumorigenesis and high safety.
  • the cardiomyocyte population having high cardiomyocyte purity is practically excellent, and in particular, it is excellent as a raw material cell for producing a transplant material such as a cardiomyocyte sheet and a drug evaluation cell for cardiotoxicity evaluation.
  • the cardiomyocyte population can include polynuclear cardiomyocytes.
  • Multinucleated cardiomyocytes with 2 to 4 nuclei are also found in a certain proportion of cardiomyocytes in the actual human heart. The reason for the appearance of multinuclei cardiomyocytes is considered to be that mature cardiomyocytes increase protein expression and increase in size.
  • Pre-cultured cells are multinuclear cardiomyocytes, especially when prepared by inducing differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes or when commercially available. It is substantially free of polynuclear cardiomyocytes with three or more nuclei.
  • a multinucleated cardiomyocyte is a cardiomyocyte having two or more nuclei.
  • a multinucleied myocardial cell can have, for example, up to 8 nuclei.
  • the polynuclear myocardial cell is, for example, a dinuclear cell, a trinuclear cell, a tetranuclear cell, a 5-nuclear cell, a 6-nucleus cell, a 7-nucleus cell or an 8-nucleus cell.
  • Polynuclear cardiomyocytes are particularly prominent compared to mononuclear cardiomyocytes (that is, normal cardiomyocytes in which one nucleus is present in one cell).
  • the polynuclear myocardial cells can have an average maximum length of, for example, 50 to 1000 ⁇ m when measured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel.
  • the polynuclear myocardial cells may have an average maximum length of, for example, 100 to 1000 ⁇ m when measured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel. can.
  • the "average maximum length of polynuclear muscle cells” refers to the average value of the maximum lengths of five polynuclear muscle cells.
  • the “maximum length of polynuclear myocardial cells” can be measured by a two-dimensional image of the cells observed under a microscope. Further, when observed under a microscope, the multinuclei myocardial cells have a particularly large cell size, and a plurality of nuclei are present in one place, and the cytoplasm is particularly large. From these characteristics, polynuclear muscle cells can be clearly distinguished from mononuclear muscle cells under a microscope and observed.
  • the proportion of multinucleated cardiomyocytes and the number of nuclei of polynuclear cardiomyocytes increase, so that myocardial cells become multinucleated with proliferation. Therefore, by repeating the number of passages in the subculture, the proportion of polynuclear muscle cells and the number of nuclei of the polynuclear muscle cells can be increased, and the size of the polynuclear muscle cells can be increased.
  • the cardiomyocyte population obtained after the first subculture can contain multinucleated cardiomyocytes having 3 or more nuclei, for example, at a ratio of 0.001 to 0.5%, and has 5 or more nuclei.
  • Polynuclear cardiomyocytes can be contained, for example, in a proportion of 0.0001 to 0.05%.
  • the multinuclear myocardial cells can have an average maximum length of, for example, 20-200 ⁇ m.
  • the cardiomyocyte population can contain polynuclear cardiomyocytes having 3 or more nuclei, for example, at a ratio of 0.01 to 1%, and has 5 or more nuclei.
  • Multinucleated cardiomyocytes with polynuclear cells can be contained, for example, in a proportion of 0.001 to 0.1%. Also, after culturing the 2nd to 4th passages, the multinuclear myocardial cells can have an average maximum length of, for example, 50 to 1000 ⁇ m.
  • ratio of multinucleated cardiomyocytes refers to the ratio of polynuclear cardiomyocytes to 10,000 myocardial cells.
  • Multinuclear muscle cells are beating autonomously like mononuclear muscle cells and function in the same way as mononuclear muscle cells. Also, as mentioned above, it has been reported that the human heart contains 2-4 nuclei of polynuclear myocardial cells. Further, the polynuclear myocardial cells are particularly large compared to the mononuclear myocardial cells and have a large amount of muscle fibers in the cytoplasm, so that they have an advantage of strong muscle contractile force. Therefore, the cardiomyocyte population including multinucleated cardiomyocytes is excellent as a raw material cell for producing a transplantation material such as a cardiomyocyte sheet and a drug evaluation cell for cardiotoxicity evaluation.
  • cardiomyocytes By culturing a cell population containing cardiomyocytes according to the method described in the above-mentioned "1. Method for producing a cardiomyocyte population having improved cardiomyocyte purity", cardiomyocytes can be matured. Therefore, the cardiomyocyte population comprises mature cardiomyocytes. Mature cardiomyocytes can be identified by the fact that cardiomyocytes have developed muscle fibers. The developed muscle fibers can be observed in clear stripes when cardiomyocytes are stained with an antibody against the structural protein ( ⁇ -actinin) of muscle sarcomere. Long-term culture with repeated subcultures can further increase the maturity of cardiomyocytes.
  • ⁇ -actinin structural protein
  • Mature cardiomyocytes are expected to reduce the risk of arrhythmia and increase the therapeutic effect in transplantation as compared to immature cardiomyocytes. Therefore, the cardiomyocyte population including mature cardiomyocytes is excellent as a raw material cell for producing a transplant material such as a cardiomyocyte sheet and a drug evaluation cell for cardiotoxicity evaluation.
  • Lin28 is known to be an undifferentiated marker that is expressed in ES cells and iPS cells and whose expression is reduced in differentiated cells. Therefore, Lin28 is used as a marker for detecting iPS cells remaining in differentiated cells when iPS cells are induced to differentiate to produce differentiated cells. Since iPS cells have tumorigenicity, differentiated cells in which iPS cells remain need to be used as a transplant material after removing the iPS cells. The problem of iPS cells remaining in differentiated cells is recognized as an important issue from the viewpoint of safety of transplanted materials.
  • the newly created "cardiomyocyte population that does not express Lin28” contains almost no undifferentiated iPS cells, and is therefore excellent in that it does not easily become a tumor.
  • the cardiomyocyte population according to the first aspect is It contains human cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells and does not express Lin28.
  • the "human pluripotent stem cell-derived human cardiomyocyte” refers to "1. cardiomyocyte” obtained by inducing differentiation of human pluripotent stem cell (for example, human iPS cell) into cardiomyocyte. It can refer to cardiomyocytes obtained by culturing according to the method described in the section "Method for producing a population”.
  • not expressing Lin28 means that the gene expression of Lin28 is not detected when the gene expression of Lin28 is detected by the quantitative PCR method.
  • the cardiomyocyte population used for detecting the gene expression of Lin28 is preferably 1 ⁇ 10 7 or more, more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 , and for example, 5 ⁇ 10 7.
  • mRNA is collected from the myocardial cell population; cDNA is synthesized from the mRNA by the reaction of reverse transcriptase; and the PCR reaction (45 cycles) is carried out using the cDNA as a template and the following primer pair as a primer.
  • Lin28_Fw cacggtgcgggcatctg (SEQ ID NO: 1)
  • Lin28_Rv ccttccatgtgcagcttactc (SEQ ID NO: 2)
  • the quantitative PCR method can be performed as described in Example 6 below.
  • Example 6 described later it is shown that if the proportion of iPS cells remaining in the cardiomyocyte population is 0.0002% or more, it can be detected by the quantitative PCR method. For example, when the cardiomyocyte population has a cell number of 1 ⁇ 10 7 , if the number of iPS cells remaining in the cardiomyocyte population is 20 or more, it can be detected by a quantitative PCR method.
  • the cardiomyocyte population according to the first aspect has, for example, a cell number of 1 ⁇ 10 7 or more. More specifically, the cardiomyocyte population according to the first aspect has, for example, a cell number of 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10.
  • the cardiomyocyte population according to the first aspect has a cardiomyocyte purity of preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the cardiomyocyte population according to the first aspect includes, for example, human cardiomyocytes, preferably human cardiomyocytes having 3 or more nuclei, and more preferably human cardiomyocytes having 5 or more nuclei. More specifically, the cardiomyocyte population according to the first aspect is, for example, a human cardiomyocyte having 2 to 8 polynuclear cells, preferably a human cardiomyocyte having 3 to 8 polynuclear cells, and more preferably 5 to 8 cells. Includes human cardiomyocytes with polynuclear cells.
  • the cardiomyocyte population according to the first aspect can contain human polynuclear cardiomyocytes in any proportion. For example, when a cardiomyocyte population is obtained according to the method described in the column of "1. Method for producing a cardiomyocyte population", the cardiomyocyte population contains human polynuclear cardiomyocytes at a ratio of, for example, 0.0001 to 1%. be able to.
  • the human polynuclear myocardial cells have an average maximum length of, for example, 50 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 500 ⁇ m when measured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel.
  • the human polynuclear myocardial cells preferably have developed muscle fibers.
  • Cardiomyocyte population can be used as a raw material cell for producing a transplant material.
  • the transplant material include a cardiomyocyte sheet, a cardiomyocyte population for a single cell injection transplantation method, and the like. Therefore, according to another aspect, a transplant material containing a cardiomyocyte population produced by the method described in the above-mentioned "1. Method for producing cardiomyocyte population" is provided.
  • the transplant material according to the first aspect is Contains human cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells Includes a population of cardiomyocytes that do not express Lin28.
  • the cardiomyocyte population preferably has a cardiomyocyte purity of 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the cardiomyocyte population includes, for example, human cardiomyocytes, preferably human cardiomyocytes having 3 or more nuclei, and more preferably human cardiomyocytes having 5 or more nuclei. include.
  • the cardiomyocyte population has, for example, a cell number of 1 ⁇ 10 7 or more.
  • [A1] Improved, including culturing a cell population containing cardiomyocytes in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor to improve the purity of the cardiomyocytes in the cell population.
  • the cell population containing myocardial cells is 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 .
  • the seeding was 0.05 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , more preferably 0.
  • [A5] The method according to any one of [A1] to [A4], wherein the cell population has a cardiomyocyte purity of 30 to 95%, preferably 75 to 95% at the start of the culture.
  • [A6] The method according to any one of [A1] to [A5], wherein the WNT signal activator is CHIR99021 and the EGF receptor inhibitor is AG1478.
  • the WNT signal activator is contained in the culture solution at a concentration of 1 to 5 ⁇ M, preferably 2 to 5 ⁇ M, more preferably 2 to 4 ⁇ M, and the EGF receptor inhibitor is the culture solution.
  • a cell population containing cardiomyocytes seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 was cultured in a culture medium containing a WNT signal activator.
  • a method for producing a cardiomyocyte population having an improved cardiomyocyte purity which comprises improving the purity of the cardiomyocyte in the cell population.
  • the cell density is 0.3 ⁇ 10 5 to 4.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , preferably 1.0 ⁇ 10 5 to 3.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 [B1]. Or the method according to [B2].
  • [B5] The method according to any one of [B1] to [B4], wherein the WNT signal activator is CHIR99021.
  • the WNT signal activator is contained in any one of [B1] to [B5] contained in the culture medium at a concentration of 1 to 5 ⁇ M, preferably 2 to 5 ⁇ M, and more preferably 2 to 4 ⁇ M.
  • [B7] The method according to any one of [B1] to [B6], wherein the culture solution further contains an EGF receptor inhibitor.
  • [B8] The method according to any one of [B1] to [B7], wherein the EGF receptor inhibitor is AG1478.
  • the EGF receptor inhibitor is contained in any one of [B1] to [B8] contained in the culture medium at a concentration of 1 to 10 ⁇ M, preferably 2 to 10 ⁇ M, and more preferably 4 to 8 ⁇ M. The method described.
  • [C1] The method according to any one of [A1] to [A7] and [B1] to [B9], wherein the cell population containing cardiomyocytes is a cell population containing human cardiomyocytes.
  • [C2] A cell population obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells into myocardial cells, preferably a cell population obtained by inducing differentiation of iPS cells into myocardial cells, by the cell population containing myocardial cells. More preferably, the method according to any one of [A1] to [A7], [B1] to [B9] and [C1], which is a cell population obtained by inducing differentiation of human iPS cells into myocardial cells.
  • [C5] The method according to any one of [A1] to [A7], [B1] to [B9] and [C1] to [C4], wherein the culture solution contains serum.
  • [C6] The method according to any one of [A1] to [A7], [B1] to [B9] and [C1] to [C5], wherein the culture is performed by subculture.
  • [C7] Further comprising seeding at least a part of the myocardial cell population obtained by the culture and subculturing in a culture medium containing a WNT signal activator and an EGF receptor inhibitor [A1] to The method according to any one of [A7] and [C1] to [C6].
  • At least a part of the cardiomyocyte population obtained by the culture is seeded at a cell density of 0.1 ⁇ 10 5 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , and contains a WNT signal activator.
  • [C9] The method according to any one of [A1] to [A7], [B1] to [B9] and [C1] to [C8], wherein the culture is carried out by adhesive culture.
  • [D1] A cardiomyocyte population produced by the method according to any one of [A1] to [A7], [B1] to [B9], and [C1] to [C9].
  • [D2] The cardiomyocyte population according to [D1], wherein the cardiomyocyte population has a cardiomyocyte purity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the cardiomyocyte population has a multinucleated cardiomyocyte (for example, a cardiomyocyte having 2 to 8 polynuclear cells), preferably a cardiomyocyte having 3 or more nuclei (for example, 3 to 8 polynuclear cells).
  • the cardiomyocyte population according to [D1] or [D2] comprising cardiomyocytes), more preferably cardiomyocytes having 5 or more nuclei (eg, cardiomyocytes having 5 to 8 polynuclear cells).
  • the cardiomyocyte population according to [D3] which has an average maximum length of 50 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 500 ⁇ m when measured in a state where the polynuclear cardiomyocytes are adhered to the bottom surface of the culture vessel. ..
  • [D5] The cardiomyocyte population according to [D3] or [D4], wherein the multinuclear cardiomyocytes have developed muscle fibers.
  • [D6] The cardiomyocyte population according to any one of [D1] to [D5], wherein the cardiomyocyte population does not express Lin28.
  • [D7] The cardiomyocyte population according to any one of [D1] to [D5], wherein the gene expression of Lin28 is not detected when the cardiomyocyte population detects the gene expression of Lin28 by a quantitative PCR method.
  • [E1] A cardiomyocyte population containing human cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells and not expressing Lin28.
  • [E2] A cardiomyocyte population containing human cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells and in which Lin28 gene expression is not detected when Lin28 gene expression is detected using a quantitative PCR method.
  • the cardiomyocyte population used for the detection of the gene expression of Lin28 is 1 ⁇ 10 7 or more, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 , and for example, 5 ⁇ 10 7 cells.
  • the cardiomyocyte population according to [E2] having a number.
  • the cardiomyocyte population is set to any one of [E1] to [E3] having a cardiomyocyte purity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the described cardiomyocyte population includes human cardiomyocytes, preferably human cardiomyocytes having 3 or more nuclei, and more preferably human cardiomyocytes having 5 or more nuclei [E1] to [E4].
  • the cardiomyocyte population according to any one of.
  • the cardiomyocyte population includes human cardiomyocytes having 2 to 8 polynuclear cells, preferably human cardiomyocytes having 3 to 8 polynuclear cells, and more preferably human cardiomyocytes having 5 to 8 polynuclear cells.
  • the cardiomyocyte population according to any one of [E1] to [E5].
  • the human polynuclear cardiomyocytes When the human polynuclear cardiomyocytes are measured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel, they have an average maximum length of 50 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 500 ⁇ m to [E5] or [E6].
  • the described cardiomyocyte population [E8] The cardiomyocyte population according to any one of [E5] to [E7], wherein the human polynuclear cardiomyocyte has developed muscle fibers. [E9] The cardiomyocyte population according to any one of [E1] to [E8], wherein the cardiomyocyte population has a cell number of 1 ⁇ 10 7 or more, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10. .. [E10] The cardiomyocyte population according to any one of [E1] to [E9], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells.
  • the cardiomyocyte population used for the detection of the gene expression of Lin28 is 1 ⁇ 10 7 or more, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 , and for example, 5 ⁇ 10 7 cells.
  • the transplant material according to [F2] having a number.
  • the cardiomyocyte population is set to any one of [F1] to [F3] having a cardiomyocyte purity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the described transplant material includes human cardiomyocytes, preferably human cardiomyocytes having 3 or more nuclei, and more preferably human cardiomyocytes having 5 or more nuclei [F1] to [F4].
  • the transplant material according to any one of.
  • the cardiomyocyte population includes human cardiomyocytes having 2 to 8 polynuclear cells, preferably human cardiomyocytes having 3 to 8 polynuclear cells, and more preferably human cardiomyocytes having 5 to 8 polynuclear cells.
  • the transplant material according to any one of [F1] to [F5].
  • the human polynuclear myocardial cells When the human polynuclear myocardial cells are measured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel, they have an average maximum length of 50 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 500 ⁇ m to [F5] or [F6].
  • the described transplant material [F8] The transplant material according to any one of [F5] to [F7], wherein the human polynuclear myocardial cell has developed muscle fibers. [F9] The transplant material according to any one of [F1] to [F8], wherein the cardiomyocyte population has a cell number of 1 ⁇ 10 7 or more, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10. [F10] The transplant material according to any one of [F1] to [F9], wherein the pluripotent stem cell is an iPS cell.
  • the cardiomyocyte population has polynuclear cardiomyocytes (eg, cardiomyocytes having 2 to 8 polynuclear cells), preferably cardiomyocytes having 3 or more nuclei (eg, 3 to 8 polynuclear cells).
  • [G4] The transplant material according to [G3], which has an average maximum length of 50 to 1000 ⁇ m, preferably 50 to 500 ⁇ m when measured in a state where the multinuclear myocardial cells are adhered to the bottom surface of the culture vessel.
  • [G5] The transplant material according to [G3] or [G4], wherein the multinuclear myocardial cells have developed muscle fibers.
  • [G6] The transplant material according to any one of [G1] to [G5], wherein the cardiomyocyte population does not express Lin28.
  • [G7] The transplant material according to any one of [G1] to [G5], wherein the gene expression of Lin28 is not detected when the cardiomyocyte population detects the gene expression of Lin28 by a quantitative PCR method.
  • cardiomyocyte differentiation medium (cardiomyocyte lots No. 72, 73, 80, 81 contains 3 ⁇ M Y-27632, 3 ⁇ M CHIR 99021 and 6 ⁇ M AG 1478.
  • Cell lot No. 86 was suspended in the state of a single cardiomyocyte in 3 ⁇ M Y-27632 and 3 ⁇ M CHIR99021 but not AG1478).
  • Suspended cardiomyocytes were seeded in a T25 flask (Iwaki) coated with iMatrix laminin511 (Nippi Co., Ltd.). Cardiomyocytes were seeded to a cell density of 5.0 ⁇ 10 6 cells / T25 flask (ie, 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2).
  • the cell-containing culture solution was placed in a culture container so that the distance from the surface of the culture solution to the bottom surface of the culture container was 7 mm.
  • 2% FBS cardiomyocyte differentiation medium (cardiomyocyte lots No. 72, 73, 80, 81 contains 3 ⁇ M CHIR99021 and 6 ⁇ M AG1478. Cardiomyocyte lot No. 86 contains 3 ⁇ M CHIR99021. (Contains but does not contain AG1478), the medium was exchanged, and thereafter, the medium was exchanged every 3 to 4 days, and the cells were cultured for 2 weeks (first subculture).
  • Cardiomyocyte lot No. 73 was cultured until the 4th subculture. Specifically, the cells obtained in the previous culture were dispersed and treated with trypsin EDTA, and the obtained single cardiomyocytes were seeded in a flask at the same cell density as in the previous culture, and the same as above. Subculture was performed under the conditions.
  • the ratio of polynuclear cardiomyocytes was determined from the proportion of polynuclear cardiomyocytes in 10,000 myocardial cells.
  • the "average maximum length of polynuclear muscle cells” was obtained by measuring the maximum lengths of five polynuclear muscle cells from a two-dimensional image of a microscope and calculating the average of the measured values.
  • cardiomyocyte purity was 70-90% before culturing, but after the first subculture, the cardiomyocyte purity (cTnT positive rate) of cardiomyocyte lots No. 72, 73, 80, 81 was increased to 95% or more. I was able to do it (see Figure 1). On the other hand, after the first subculture, the cardiomyocyte purity (cTnT positive rate) of cardiomyocyte lot No. 86 was 90%. In addition, in cardiomyocyte lot No. 73, a cardiomyocyte population having a maximum cardiomyocyte purity of 98.5% could be obtained after the 3rd to 4th subcultures (see FIG. 1).
  • the myocardial cell population obtained after the first subculture contains polynuclear myocardial cells having trinuclear or tetranuclear polynuclear cells at a ratio of 0.21%, and has 5 or more nuclei. It contained 0.03% polynuclear myocardial cells with polynuclear cells (see FIG. 2). That is, the obtained cardiomyocyte population contained 0.24% of multinucleated cardiomyocytes having 3 or more multinuclei.
  • the multinucleated cardiomyocytes ie, cardiomyocytes having two or more multinuclei
  • had an average maximum length of 57 ⁇ m see FIG. 3
  • a striped sarcomere structure could be observed in the multinuclear myocardial cells.
  • the myocardial cell population obtained after the third subculture contains polynuclear myocardial cells having trinuclear or tetranuclear polynuclear cells at a ratio of 0.31%, and has 5 or more nuclei. It contained 0.08% polynuclear myocardial cells with polynuclear cells (see FIG. 2). That is, the obtained cardiomyocyte population contained 0.39% of multinucleated cardiomyocytes having 3 or more multinuclei. In this case, after the third subculture, the multinucleated cardiomyocytes (that is, cardiomyocytes having two or more multinuclei) had an average maximum length of 120 ⁇ m (see FIG. 3). In addition, the polynuclear myocardial cells after the third subculture could observe a clearer striped sarcomere structure than the polynuclear myocardies obtained after the first subculture.
  • Example 2 In Example 2, the effect of seeding density on cardiomyocyte purity in the method according to the first embodiment was investigated.
  • Cardiomyocytes (cTnT positive rate: about 87 to about 90%) were prepared according to the same procedure as in Example 1. Cardiomyocytes were suspended in the state of single cardiomyocytes in 20% FBS cardiomyocyte differentiation medium (containing 3 ⁇ M Y-27632, 3 ⁇ M CHIR 99021 and 6 ⁇ M AG 1478). Suspended cardiomyocytes were seeded in a T25 flask (Iwaki) coated with iMatrix laminin511 (Nippi Co., Ltd.). Cardiomyocytes were seeded to a cell density of 0.05 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , or 6.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2. The culture was carried out according to the same procedure as in Example 1.
  • Example 3 In Example 3, the effect of seeding density on cardiomyocyte purity in the method according to the second embodiment was investigated.
  • Cardiomyocytes (cTnT positive rate: about 90 to about 92%) were prepared according to the same procedure as in Example 1. Cardiomyocytes were suspended in a single cardiomyocyte state in 20% FBS cardiomyocyte differentiation medium (containing 3 ⁇ M Y-27632 and 3 ⁇ M CHIR99021 but not AG1478). Suspended cardiomyocytes were seeded in a T25 flask (Iwaki) coated with iMatrix laminin511 (Nippi Co., Ltd.). Cardiomyocytes were seeded to a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , 2.0 ⁇ 10 5 cells / cm 2 , or 3.2 ⁇ 10 5 cells / cm 2. The culture was carried out according to the same procedure as in Example 1.
  • Example 4 The drug responsiveness of the obtained cardiomyocyte population was confirmed.
  • Terphenazine was used as a drug.
  • Terphenazine is an anti-energy drug and is known to cause QT prolongation.
  • cardiomyocytes were cultured until the third subculture to produce a cardiomyocyte population.
  • the number of cardiomyocytes in the cardiomyocyte population increased about 15-fold from the start of the first subculture.
  • the cardiomyocyte population had a cardiomyocyte purity of 98.5%.
  • the drug responsiveness of the obtained cardiomyocyte population was tested.
  • the drug responsiveness test was performed by calcium imaging using a fluorescence microscope. Specifically, the drug responsiveness test was performed by acquiring a pulsatile calcium fluorescence moving image of cardiomyocytes with a fluorescence microscope Olympus IX83.
  • a culture medium having the following composition was adjusted to pH 7.4 and used as a culture medium for cardiomyocytes: 0.182 g / L CaCl 2 , 0.09767g / L ⁇ 4 , 0.4 g / L KCl, 3.362 g / L NaHCO 3 , 5.4525 g / L NaCl, 0.109 g / L Na 2 HPO 4 5.958 g / L HEPES and 10% by weight FBS (Fetal bovine serum, Invitrogen).
  • FBS Fetal bovine serum, Invitrogen
  • Terphenazine was added to the cell culture medium under a microscope, and 10 minutes later, the calcium signal was measured using the calcium sensor protein GCaMP or the calcium indicator Cal-520. ImageJ-based image analysis software was used for data analysis.
  • FIGS. 6A to 6E The measurement results are shown in FIGS. 6A to 6E.
  • FIG. 6A is a waveform diagram when terfenazine is not added
  • FIG. 6B is a waveform diagram when terfenazine is added at a final concentration of 100 nM
  • FIG. 6C is a waveform diagram when terfenazine is added at a final concentration of 300 nM.
  • FIG. 6D shows a waveform diagram when terfenazine is added at a final concentration of 500 nM
  • FIG. 6E shows a waveform diagram when terfenazine is added at a final concentration of 900 nM.
  • a QT prolongation response was detected by the addition of terfenazine (concentration in culture medium: 100 nM) (see FIG. 6B).
  • concentration in culture medium 100 nM
  • EAD early post-depolarization
  • Example 5 The engraftment of the obtained cardiomyocyte population was confirmed.
  • cardiomyocytes were cultured until the second subculture to produce a cardiomyocyte population.
  • the number of cardiomyocytes in the cardiomyocyte population increased about 4-fold from the start of the first subculture.
  • the cardiomyocyte population had a cardiomyocyte purity of 95%.
  • the obtained cardiomyocyte population was transplanted into myocardial infarcted rats.
  • FIGS. 7A and 7B Results The hearts of rats with myocardial infarction after transplantation are shown in FIGS. 7A and 7B.
  • the transplanted cardiomyocyte population has been previously introduced with the GFP gene.
  • FIG. 7A shows the results of staining using a GFP antibody.
  • the upper part of FIG. 7B shows the results of staining of cardiomyocytes using a myocardial marker, and the lower part shows the results of staining using a GFP antibody.
  • the obtained cardiomyocyte population when the obtained cardiomyocyte population was transplanted into a myocardial infarct rat, a large amount of cardiomyocytes were engrafted, and no engraftment of cells other than cardiomyocytes was observed. Therefore, the obtained cardiomyocyte population can be expected to have high safety and therapeutic effect in transplantation applications.
  • a cardiomyocyte population was produced according to the method of the present invention, and the expression levels of the cardiomyocyte marker gene (cTnT) and the undifferentiated iPS cell marker gene (Lin28) were examined. Expression of the undifferentiated iPS cell marker gene (Lin28) indicates that iPS cells remain in the cardiomyocyte population.
  • a cardiomyocyte population was subcutaneously transplanted into mice to evaluate tumorigenicity.
  • Cardiomyocytes were dispersed with trypsin (Life Technology) and then suspended in 20% FBS cardiomyocyte differentiation medium (containing 3 ⁇ M Y-27632, 2 ⁇ M CHIR99021, and 4 ⁇ M AG1478) in the form of single cardiomyocytes.
  • FBS cardiomyocyte differentiation medium containing 3 ⁇ M Y-27632, 2 ⁇ M CHIR99021, and 4 ⁇ M AG1478, in the form of single cardiomyocytes.
  • FBS cardiomyocyte differentiation medium containing 3 ⁇ M Y-27632, 2 ⁇ M CHIR99021, and 4 ⁇ M AG1478, in the form of single cardiomyocytes.
  • FBS cardiomyocyte differentiation medium containing 3 ⁇ M Y-27632, 2 ⁇ M CHIR99021, and 4 ⁇ M AG1478, in the form of single cardiomyocytes.
  • FBS cardiomyocyte differentiation medium containing 3 ⁇ M Y-27632, 2 ⁇ M CHIR99021, and 4 ⁇ M AG14728
  • the medium On the day after sowing (day 1), the medium was exchanged with 2% FBS myocardial differentiation medium (including 2 ⁇ M CHIR99021 and 4 ⁇ M AG1478), and thereafter the medium was exchanged every 3 to 4 days, and the cells were cultured for 2 weeks.
  • this culture is referred to as "expansion culture”.
  • the cells After the expansion culture, the cells were dispersed and treated with trypsin EDTA to obtain cardiomyocytes in a single cell state.
  • FACS analysis For the obtained cardiomyocytes, the number of cells was counted and FACS analysis of cTnT was performed. The number of cells was 18.5 ⁇ 10 6 per T25 flask. The cTnT-positive cell rate was 92.6%.
  • RNA recovery kit (Analysis of marker gene expression) Furthermore, mRNA was recovered from the obtained cardiomyocytes (5 ⁇ 10 7 cells) using an RNA recovery kit (miRNeasy Mini Kit, Qiagen). As comparative control 1, mRNA was recovered from undifferentiated iPS cells (1 ⁇ 10 7 cells) using an RNA recovery kit (miRNeasy Mini Kit, Qiagen). As comparative control 2, mRNA was recovered from cardiomyocytes (without expanded culture) (5 ⁇ 10 7 cells) 21 days after the start of the above differentiation induction using an RNA recovery kit (miRNeasy Mini Kit, Qiagen). .. As comparative control 3, mRNA was recovered from cardiomyocytes (without expanded culture) (5 ⁇ 10 7 cells) 28 days after the start of the above differentiation induction using an RNA recovery kit (miRNeasy Mini Kit, Qiagen). ..
  • the sequence of primers used for quantitative PCR is as follows: Lin28_Fw: cacggtgcgggcatctg (SEQ ID NO: 1) Lin28_Rv: ccttccatgtgcagcttactc (SEQ ID NO: 2) cTnT_Fw: gaaggacctgaatgagttgcag (SEQ ID NO: 3) cTnT_Rv: acgtsctctcgatcctgtctttg (SEQ ID NO: 4) In SEQ ID NO: 4, s represents g or c.
  • iPS iPS cells (comparative control 1)
  • d21CM Cardiomyocytes 21 days after the start of differentiation induction (Comparative Control 2)
  • Expanded CM1 Cardiomyocytes obtained by expanding culture for 2 weeks
  • Expanded CM2 Cardiomyocytes obtained by performing expanded culture for 2 weeks
  • d28CM Cardiomyocytes 28 days after the start of differentiation induction (comparative control) 3)
  • the graph above shows the relative cTnT expression level when the cTnT expression level in d21CM (Comparative Control 3) is 1.
  • the graph below shows the relative Lin28 expression level when the Lin28 expression level in iPS (Comparative Control 1) is 1.
  • the graph below is a logarithmic display graph.
  • RNA samples from undifferentiated iPS cells are diluted to correspond to a given cell number (ie 1 ⁇ 10 2 , 1 ⁇ 10 3 , 1 ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 7 ) and subjected to quantitative PCR.
  • the expression level of Lin28 was analyzed. This analysis was performed while simultaneously comparing with RNA samples from cardiomyocytes (cell number of 5 ⁇ 10 7) obtained by expansion culture.
  • FIG. 18 The analysis result of the gene expression of Lin28 is shown in FIG. The graph of FIG. 18 shows the results of the following samples in order from the left.
  • Control PCR buffer only sample (without cells)
  • Expanded CM3 RNA sample from myocardial cells obtained by expanded culture for 2 weeks
  • iPS (1 ⁇ 10 e2) RNA sample from iPS cells was diluted to correspond to the number of iPS cells of 1 ⁇ 10 2.
  • RNA sample from iPS cells diluted to correspond to the number of iPS cells of 1 ⁇ 10 3
  • iPS (1 ⁇ 10 e4) RNA sample from iPS cells, 1 ⁇ 10 Samples diluted to correspond to the number of iPS cells of 4 iPS (1 ⁇ 10e7): RNA samples from iPS cells (comparative control 1)
  • the graph in FIG. 18 shows the relative Lin28 expression level when the Lin28 expression level in iPS cells (comparative control 1) is 1. This graph is a logarithmic display graph.
  • Lin 28 could be detected even when the RNA sample from iPS cells was diluted to correspond to the number of iPS cells of 1 ⁇ 10 2. On the other hand, Lin28 was not detected in cardiomyocytes after control and expansion culture (Fig. 18). From these results, it can be seen that the remaining number of iPS cells is less than 1 ⁇ 10 2 in the cardiomyocytes obtained by expanding the culture for 2 weeks. The remaining number, when converted to a percentage of myocardial cell number (i.e. the number of cells 5 ⁇ 10 7), is less than 0.0002%.
  • the cardiomyocyte population produced by the method of the present invention contains almost no undifferentiated iPS cells and is unlikely to become a tumor.

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Abstract

心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。

Description

向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法、心筋細胞の純化方法、心筋細胞集団、および移植材料
　本発明は、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法、心筋細胞の純化方法、心筋細胞集団、および移植材料に関する。
　多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導を行った場合、すべての多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導することはできないため、未分化な幹細胞が残存したり、ロット間で分化効率にバラツキがみられたりする。心筋細胞の純度の低さや分化効率のロット間のバラツキは、心筋細胞を心筋シートなどの移植材料の原料として使用する場合、安全性などの品質の面で特に問題である。
　このため、これまでに、多能性幹細胞由来の心筋細胞の純度を向上させる方法が提案されている。例えば、心筋細胞を心筋細胞に特異的なマーカーで標識し、フローサイトメーターで心筋細胞を選別する方法が報告されている（特許文献１）。しかし、この方法は、心筋細胞を標識する操作や心筋細胞を選別する操作を必要とするため、手間がかかるともに、心筋細胞に対するダメージが懸念される。また、この方法は、純度の高い心筋細胞集団を大量に調製する場合には、手間や時間がかかるため不向きである。
国際公開第２０１４／０１４１１９号
　本発明は、心筋細胞にダメージを与えることなく、簡便な操作で心筋細胞の純度を向上させることができる技術を提供することを目的とする。
　第１実施形態によれば、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法が提供される。
　第２実施形態によれば、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法が提供される。
　別の側面によれば、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法が提供される。
　別の側面によれば、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法が提供される。
　別の側面によれば、第１実施形態に記載の方法により製造された心筋細胞集団、または第２実施形態に記載の方法により製造された心筋細胞集団が提供される。
　本発明によれば、心筋細胞にダメージを与えることなく、簡便な方法で心筋細胞の純度を向上させることができる。本発明は、心筋細胞を提供する任意の場面で有用であり、とりわけ、心筋シートなどの移植材料の細胞原料を提供する場面で有用である。
心筋細胞純度を示すグラフ。 多核心筋細胞の割合を示すグラフ。 多核心筋細胞の平均最大長さを示すグラフ。 心筋細胞純度を示すグラフ。 心筋細胞純度を示すグラフ。 テルフェナジンを添加しなかった場合の波形図。 100 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図。 300 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図。 500 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図。 900 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図。 移植後の心筋梗塞ラットの心臓を示す顕微鏡画像。 移植後の心筋梗塞ラットの心臓を示す顕微鏡画像。 心筋細胞マーカー遺伝子（cTnT）および未分化ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（Lin28）の発現量を示すグラフ。 ｉＰＳ細胞の検出限界を示すグラフ。
　以下、本発明について説明する。ただし、以下の説明は、本発明を詳説することを目的とし、本発明を限定することを意図していない。
　１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法
　心筋細胞は、培養してもほとんど増殖しない細胞であるとこれまで考えられていた。このため、心筋細胞の増殖により心筋細胞の純度を向上させることが難しく、心筋細胞の純度を向上させるためには、背景技術の欄に記載したとおり、フローサイトメーターで心筋細胞と心筋細胞以外の細胞とを物理的に選別することが行われていた。
　このような技術常識に反し、本発明者らは、特定の培養条件を採用した場合、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制しながら心筋細胞を増殖させ、これにより心筋細胞の純度を向上させることができることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
　１－１．第１実施形態
　第１実施形態によれば、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法は、
　心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させること
を含む。
　（心筋細胞を含む細胞集団）
　「心筋細胞を含む細胞集団」は、心筋細胞として準備された細胞集団であるが、心筋細胞以外の細胞を含んでいてもよい。細胞集団に含まれる心筋細胞の割合（すなわち、心筋細胞純度）は、好ましくは３０～９５％、より好ましくは７５～９５％である。すなわち、細胞集団は、培養の開始時に、好ましくは３０～９５％、より好ましくは７５～９５％の心筋細胞純度を有する。
　第１実施形態の方法は、ＥＧＦ受容体阻害剤の作用により心筋細胞以外の細胞の増殖を効果的に抑制しながら心筋細胞を増殖させることができるため、「心筋細胞を含む細胞集団」が、比較的低い心筋細胞純度（例えば３０％以上７５％未満の心筋細胞純度）を有していても、心筋細胞純度を効率良く高めることができることを特徴としている。もちろん、第１実施形態の方法は、「心筋細胞を含む細胞集団」が、比較的高い心筋細胞純度（例えば７５～９５％の心筋細胞純度）を有している場合にも有効な方法であり、この場合、心筋細胞純度を更に向上させることができる。
　本明細書において、心筋細胞純度は、全細胞の数を１００とした時の心筋細胞の数の割合（百分率）を表す。心筋細胞純度は、心筋マーカーである心筋トロポニンT (cTnT)、α－アクチニン、α－心筋アクチン、GATA-4などの抗体を用いてフローサイトメトリーで解析することにより求めることができる。なお、細胞集団の心筋細胞純度は、上記方法に従って細胞集団を培養することにより高めることができるため、細胞集団が、培養の開始時に、比較的低い心筋細胞純度を有していても差し支えない。
　「心筋細胞を含む細胞集団」は、例えば、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団である。あるいは、「心筋細胞を含む細胞集団」は、生物の心臓から単離された初代培養心筋細胞であってもよい。あるいは、「心筋細胞を含む細胞集団」は、市販されている多能性幹細胞由来の心筋細胞（例えば、CDI社のiCell、タカラバイオ社のMiraCell、Axogenesis社のCor.4Uなど）であってもよい。
　「多能性幹細胞」は、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能（pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能とを有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。
　「心筋細胞を含む細胞集団」は、好ましくは、ｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団（以下、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞ともいう）である。ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞は、公知の心筋分化誘導法、例えば、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法（ＷＯ２０１５／１８２７６５を参照）により作製することができる。プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法は、高純度の心筋細胞を含む細胞集団、例えば７５～９５％の純度で心筋細胞を含む細胞集団を作製することができる。
　「心筋細胞を含む細胞集団」は、任意の生物の心筋細胞を含む細胞集団であってもよいが、好ましくは、哺乳類の心筋細胞を含む細胞集団、より好ましくは、ヒトの心筋細胞を含む細胞集団である。
　以上より、「心筋細胞を含む細胞集団」は、好ましくは、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団（以下、ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞ともいう）である。より好ましくは、「心筋細胞を含む細胞集団」は、ヒトｉＰＳ細胞を成熟心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団（以下、ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞ともいう）である。なお、心筋細胞の成熟度は、上記方法に従って細胞集団を培養することにより高めることができるため、細胞集団が、培養の開始時に、未熟心筋細胞を含んでいても差し支えない。
　ここで、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、当該技術分野で、ヒトｉＰＳ細胞由来の未熟心筋細胞と対比して使用される用語であり、ヒトｉＰＳ細胞由来の未熟心筋細胞と比べて、高いイオンチャネル機能を有する。
　「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、例えば、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから１４日以上経過した細胞である。ここで、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始した日は、未分化状態で維持されたｉＰＳ細胞を、分化状態に移行させるための処理に晒した日であり、この日を０日目とする。また、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、分化状態を維持したまま長期間培養することが可能であるため、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」において、分化誘導を開始してからの経過日数の上限は特に限定されない。すなわち、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」を、分化状態を維持したまま長期間培養ないし保管し、それを播種細胞として使用してもよい。例えば、「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、ｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから３６５日以上経過した細胞であっても問題ない。「ヒトｉＰＳ細胞由来の成熟心筋細胞」は、好ましくは、プロテインフリー心筋分化誘導（ＰＦＣＤ）法によりｉＰＳ細胞の分化誘導を開始してから１４日以上（例えば、３０～３７日）経過した細胞をいう。
　（培養）
　第１実施形態の方法では、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養する。具体的には、心筋細胞を含む細胞集団を、培養液に懸濁された状態で、培養容器に播種した後、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養することができる。ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤は、播種前に細胞懸濁液に添加されてもよいし、播種後に細胞懸濁液に添加されてもよい。好ましくは、心筋細胞を含む細胞集団を、培養液に単一細胞として懸濁された状態で、培養容器に播種した後、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で接着培養により培養することができる。単一細胞の状態の細胞は、例えば、細胞塊を蛋白質分解酵素（例えばトリプシン）で処理することにより準備することができる。
　第１実施形態の方法では、心筋細胞を含む細胞集団は、任意の細胞密度で播種することができる。第１実施形態の方法では、播種密度に関わらず、心筋細胞純度を向上させることができることが後述の実施例で実証されている（図４参照）。第１実施形態の方法では、心筋細胞を含む細胞集団は、例えば０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種することができる。
　培養液は、具体的には、ベース培養液とＷＮＴシグナル活性化剤とＥＧＦ受容体阻害剤とを含むことができる。例えば、培養液は、ベース培養液に、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を添加することにより準備することができる。
　ベース培養液は、心筋細胞の培養液として公知のものを使用することができる。好ましくは、ベース培養液は、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、およびナトリウム塩を含む無機塩類と、緩衝液とを基本成分として含む。基本成分は、DMEM、RPMI、IMDM、Ham-12などの基礎培地を用いてもよい。基礎培地は、例えばシグマアルドリッチジャパンより入手可能である。
　例えば、ベース培養液は、下記組成を有する基本成分を用いてもよい：
０．０１～０．５ｇ／Ｌ（例えば、０．１８２ｇ／Ｌ）のＣａＣｌ2、
０～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．０９７６７ｇ／Ｌ）のＭｇＳＯ4、
０．１～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．４ｇ／Ｌ）のＫＣｌ、
０～１０．０ｇ／Ｌ（例えば、３．３６２ｇ／Ｌ）のＮａＨＣＯ3、
１．０～２０．０ｇ／Ｌ（例えば、５．４５２５ｇ／Ｌ）のＮａＣｌ、
０～１．０ｇ／Ｌ（例えば、０．１０９ｇ／Ｌ）のＮａ2ＨＰＯ4、および
０～２０．０ｇ／Ｌ（例えば、５．９５８ｇ／Ｌ）のＨＥＰＥＳ。
　ベース培養液は、基本成分に加えて、細胞培養液に慣用的に添加される慣用成分を含んでいてもよい。慣用成分として、例えば、血清、ＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。
　すなわち、ベース培養液は、血清を含んでいてもよい。血清は、細胞の増殖率を高めることが知られている。血清は、例えばＦＢＳ（Fetal bovine serum）である。ベース培養液が血清を含んでいる場合、慣用成分添加前のベース培養液に対して、０．１～５０質量％の血清を含むことができる。血清は、心筋細胞の増殖率を高める作用を有するが、血清濃度が高いと、心筋細胞以外の細胞の増殖率も高まるため、上記範囲の濃度が好ましい。
　また、ベース培養液は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞を単一細胞で播種する際に起こり得る細胞死を抑制することが知られている。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼを阻害する物質を指し、例えば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－trans－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩；ＣＡＳ．Ｎｏ．１２９８３０－３８－２）が挙げられる。ベース培養液がＲＯＣＫ阻害剤を含んでいる場合、０．１～１００μＭの濃度でＲＯＣＫ阻害剤を含むことができる。したがって、ＲＯＣＫ阻害剤は、播種される細胞含有培養液に含まれていることが好ましいが、培養液交換で使用される新たな培養液には含まれていなくてもよい。
　ＷＮＴシグナル活性化剤は、ＷＮＴシグナル経路を活性化する物質を指し、具体的にはＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＴＷＳ１１９、Kenpaullone、TCS 2002、TC-G 24、SB 415286、NSC 693868、A 1070722、AR-A014418、リチウムクロライドなどが挙げられる。
　ＷＮＴシグナル活性化剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。ＣＨＩＲ９９０２１は、６－［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル］アミノ］エチルアミノ］ピリジン－３－カルボニトリルであり、ＣＡＳ番号は２５２９１７－０６－９である。
　ＷＮＴシグナル活性化剤は、培養液中に、好ましくは１～５μＭ、より好ましくは２～５μＭ、更に好ましくは２～４μＭの濃度で含むことができる。
　ＷＮＴシグナル活性化剤は、心筋細胞の増殖率を高めることができる。ＷＮＴシグナル活性化剤が心筋細胞の増殖を促進するメカニズムは、以下のように考えられる。ＷＮＴシグナルは細胞増殖や癌化に関わる細胞シグナルであることが一般に知られている。また、心筋細胞はその発生過程において、中胚葉誘導を介して前駆細胞に分化するためにＷＮＴシグナル活性化が必要であるのに対し、中胚葉から心筋へ分化する過程ではＷＮＴシグナルが阻害されることが必要である。このことから、心筋細胞はＷＮＴシグナルに感受性が高い細胞であると考えられる。したがって、心筋細胞は適切な条件下において、線維芽細胞等の他の細胞より、ＷＮＴシグナルによる細胞増殖が起こりやすい細胞となっているため、ＷＮＴシグナルを選択的に活性化することにより、心筋細胞に限定した効率的な細胞増殖が可能になると思われる。
　ＥＧＦ受容体阻害剤は、ＥＧＦ受容体からのシグナル伝達を阻害する物質を指し、例えば、ＡＧ１４７８、ゲフィチニブ、Afatinib、ARRY334543、AST 1306、AZD8931、BIBU 1361、BIBX 1382、BPDQ、BPIQ-I、BPIQ-II、Canertinib、CL-387,785、CUDC 101、Dacomitanib、Vandetanib、EGFR Inhibitor III、EGFR/ErbB-2 Inhibitor、Erlotinib、GW 583340、GW2974、HDS 029、Lapatinib、WHI-P 154、OSI-420、PD 153035、PD 168393、PD 174265、Pelitinib、Compound 56、XL647、PP3、AG-490、AG 555、Tyrphostin B42 、Tyrphostin B44、AG 556、AG 494、AG 825、RG-13022、DAPH、Erbstatin Analog、JNJ 28871063、Tyrphostin 47、Lavendustin A、Lavendustin C、Lavendustin C methyl ester、LFM-A12、TAK 165、TAK 285、Tyrphostin 51、Tyrphostin AG 183、Tyrphostin AG 528、Tyrphostin AG 99、Tyrphostin RG 14620 、WZ3146、WZ4002、WZ8040、Butein、Tyrphostin AG 112などが挙げられる。
　ＥＧＦ受容体阻害剤は、好ましくはＡＧ１４７８である。ＡＧ１４７８は、Ｎ－（３－クロロフェニル）－６，７－ジメトキシ－４－キナゾリン－４－アミンであり、ＣＡＳ番号は１７５１７８－８２－２である。
　ＥＧＦ受容体阻害剤は、培養液中に、好ましくは１～１０μＭ、より好ましくは２～１０μＭ、更に好ましくは４～８μＭの濃度で含むことができる。
　ＥＧＦ受容体阻害剤は、心筋細胞以外の細胞（例えば、線維芽細胞）の増殖を抑えることができる。心筋細胞以外の細胞の増殖を抑えると、増殖した心筋細胞が細胞集団に占める割合（心筋細胞純度）を高めることができる。ＥＧＦ受容体阻害剤が線維芽細胞などの心筋細胞以外の細胞の増殖を抑えるメカニズムは、ＥＧＦシグナルや受容体チロシンキナーゼの阻害により、細胞増殖のシグナルが抑制されるためと考えられる。つまり、心筋細胞以外の細胞はＥＧＦ受容体などの受容体チロシンキナーゼからのシグナルに依存して増殖するが、心筋細胞の増殖はＷＮＴシグナルに依存しているため、受容体チロシンキナーゼの阻害は心筋細胞以外の細胞の増殖のみを抑えると考えられる。
　培養液のｐＨは特に限定されないが、好ましくは６．０～９．０、より好ましくは７．０～８．０である。
　培養容器としては、細胞の接着培養のために使用される任意の容器を使用することができる。培養容器は、一般には平底容器、例えば培養フラスコ、培養皿、培養プレートなどを使用することができる。培養容器は、心筋細胞の接着、増殖、および／または成熟を促進することができる一以上の物質でコーティングされていてもよい。かかる物質として、細胞外基質、例えばゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、マトリゲルなどが挙げられる。一例として、培養容器は、ゼラチンでコーティングされた培養容器を商業的に入手し、この培養容器にラミニンをコーティングすることにより準備することができる。ラミニンは、例えばｉＭａｔｒｉｘ－５１１（株式会社ニッピ）を使用することができる。
　培養は、心筋細胞の培養に適した条件下で行うことができる。培養は、例えば、５％ＣＯ2の雰囲気下で、３０～４３℃の温度で、任意の期間（例えば１～１０００日間）にわたって行うことができる。培養の間、必要に応じて（例えば１～１４日ごとに）培養液の交換を行ってもよい。
　培養は、培養液の液面から心筋細胞が接している培養容器底面までの距離（以下、液面距離ともいう）が３～３０ｍｍである条件下で行うことが好ましい。液面距離は、５～１０ｍｍであることがより好ましい。例えば、培養容器としてＴ２５フラスコ（面積：２５ｃｍ2）を用いた場合、１２．５～２５ｍＬの培養液を培養容器に入れた状態で行うことが好ましい。このように、培養は、心筋細胞が一定の液面距離で行うことが、心筋細胞の増殖にとって好ましい。
　心筋細胞の増殖効果および心筋細胞以外の細胞の増殖抑制効果を最大限に発揮するために、心筋細胞の増殖および心筋細胞以外の細胞の増殖抑制に適した培養条件を選択することが望ましく、例えば、培養温度、培養液交換のタイミング、液面距離などを、上記範囲内で適宜選択することが望ましい。
　上記方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制しながら心筋細胞を増殖させることができる。これにより、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団（以下、単に心筋細胞集団ともいう）を製造することができる。上記方法は、特定の成分を含む培養液中で細胞を培養するだけで心筋細胞純度を向上させることができるため、簡便で低コストの方法である。
　（継代培養）
　上記培養により得られた心筋細胞集団の一部を新しい培養液に懸濁し、２継代目以降の培養を行ってもよい。すなわち、上記方法において培養は、継代培養により行われてもよい。継代培養は、上記培養を繰り返すことにより行うことができる。具体的には、２継代目以降の培養は、前回の培養により得られた心筋細胞集団を、単一細胞の状態にし、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む新しい培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種し培養することにより行うことができる。
　２継代目以降の培養は、前回の培養と同じ組成の培養液を採用してもよいし、培養液がＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含んでいれば、前回の培養と異なる組成の培養液を採用してもよい。２継代目以降の培養では、前回の培養により得られた心筋細胞集団を、１～５μＭのＷＮＴシグナル活性化剤および１～１０μＭのＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養することが好ましい。
　継代培養を行った場合、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制しながら心筋細胞を更に増殖させることができる。これにより、継代培養を行った場合、心筋細胞純度を更に向上させることができる。例えば、培養の開始時に８０％の心筋細胞純度を有する細胞集団を使用して培養を行い、１継代目の培養後に心筋細胞が２倍の増殖率で増殖したが心筋細胞以外の細胞が全く増殖せず、２継代目の培養後に心筋細胞が１．５倍の増殖率で増殖したが心筋細胞以外の細胞が全く増殖しなかった場合、約９２％の心筋細胞純度を達成することができる。このように、継代培養を行うことにより、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制しながら心筋細胞を更に増殖させることができ、更に高い心筋細胞純度を達成することができる。
　ただし、継代回数を重ねると、各継代の培養で得られる心筋細胞増殖率は減少する傾向がみられる。これは、心筋細胞が、培養を継続すると成熟したり多核化したりして、増殖し難くなるためであると考えられる。したがって、継代培養は、好ましくは２～５回の継代、より好ましくは２～４回の継代にわたって行うことができる。
　（好ましい態様）
　以下、上記方法の好ましい態様を説明する。以下の説明では、好ましい態様に特徴的な部分のみを説明し、上記方法の説明と重複する部分についての説明は省略する。
　上記方法では、「心筋細胞を含む細胞集団」を、０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度になるように、培養液に懸濁された状態で、培養容器に播種した後に、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養することが好ましい。すなわち、好ましい態様において、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法は、
　０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させること
を含む。
　より具体的には、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法は、
　心筋細胞を含む細胞集団を、０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度になるように、培養液に懸濁された状態で、培養容器に播種すること、および
　前記細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させること
を含むことができる。ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤は、播種前に細胞懸濁液に添加されてもよいし、播種後に細胞懸濁液に添加されてもよい。
　「心筋細胞を含む細胞集団」は、好ましくは０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2、更に好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、更に好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種される。
　上述の細胞密度は、心筋細胞以外の細胞を増殖培養する際に一般に使用される播種密度より高い。また、６．０×１０5細胞／ｃｍ2または５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度は、播種可能な細胞密度の上限に近い値である。このように、「心筋細胞を含む細胞集団」は、比較的高い細胞密度で播種された場合、心筋細胞は、効率良く増殖することができる。この場合、心筋細胞は、増殖可能なスペースが十分に確保されていないが、底面に接着した状態で培養液の深さ方向に盛り上がるように増殖することができる。
　また、上述の細胞密度は、心筋細胞以外の細胞を増殖培養する際に一般に使用される播種密度より高いため、心筋細胞以外の細胞は、上述の細胞密度で播種されると、増殖可能なスペースが十分に確保されておらず、増殖し難い。
　したがって、上述の細胞密度を採用すると、心筋細胞の増殖効果を更に高めることができるとともに、心筋細胞以外の細胞の増殖抑制効果を更に高めることができる。
　１－２．第２実施形態
　第１実施形態では、ＥＧＦ受容体阻害剤の作用により心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制したが、第２実施形態では、比較的高い細胞密度で細胞を播種することにより、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制した。
　すなわち、第２実施形態によれば、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法は、
　０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させること
を含む。
　より具体的には、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法は、
　心筋細胞を含む細胞集団を、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度になるように、培養液に懸濁された状態で、培養容器に播種することと、
　前記細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させること
を含むことができる。ＷＮＴシグナル活性化剤は、播種前に細胞懸濁液に添加されてもよいし、播種後に細胞懸濁液に添加されてもよい。
　以下、第２実施形態の方法を説明する。以下の説明では、第２実施形態の方法に特徴的な部分のみを説明し、第１実施形態の説明と重複する部分についての説明は省略する。
　第２実施形態では、「心筋細胞を含む細胞集団」に含まれる心筋細胞の割合（すなわち、心筋細胞純度）は、好ましくは３０～９５％、より好ましくは７５～９５％である。すなわち、細胞集団は、培養の開始時に、好ましくは３０～９５％、より好ましくは７５～９５％の心筋細胞純度を有する。このように、第２実施形態の方法は、「心筋細胞を含む細胞集団」が、比較的高い心筋細胞純度（例えば７５～９５％の心筋細胞純度）を有している場合に特に、心筋細胞純度を効率良く高めることができることを特徴としている。
　第２実施形態では、「心筋細胞を含む細胞集団」を、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種する。「心筋細胞を含む細胞集団」は、好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種される。
　第１実施形態の欄で説明したとおり、上述の細胞密度は、心筋細胞以外の細胞を増殖培養する際に一般に使用される播種密度より高い。また、５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度は、播種可能な細胞密度の上限に近い値である。このように、「心筋細胞を含む細胞集団」は、比較的高い細胞密度で播種された場合、心筋細胞は、効率良く増殖することができる。この場合、心筋細胞は、増殖可能なスペースが十分に確保されていないが、底面に接着した状態で培養液の深さ方向に盛り上がるように増殖することができる。
　また、上述の細胞密度は、心筋細胞以外の細胞を増殖培養する際に一般に使用される播種密度より高いため、心筋細胞以外の細胞は、上述の細胞密度で播種されると、増殖可能なスペースが十分に確保されておらず、増殖し難い。
　したがって、上述の細胞密度を採用すると、心筋細胞の増殖効果を更に高めることができるとともに、心筋細胞以外の細胞の増殖抑制効果を更に高めることができる。
　第２実施形態において、培養液は、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む。培養液は、具体的には、ベース培養液とＷＮＴシグナル活性化剤とを含むことができる。例えば、培養液は、ベース培養液に、ＷＮＴシグナル活性化剤を添加することにより準備することができる。ＷＮＴシグナル活性化剤は、心筋細胞の増殖率を高めることができる。
　第２実施形態において、培養液は、ＥＧＦ受容体阻害剤を更に含んでいてもよい。第２実施形態の方法では、培養液がＥＧＦ受容体阻害剤を含んでいなくても、心筋細胞純度を向上させることができることが後述の実施例で実証されている（図５参照）。ただし、培養液がＥＧＦ受容体阻害剤を含むと、心筋細胞以外の細胞の増殖を、より効果的に抑制することができる。
　ベース培養液、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤については、第１実施形態の欄の説明を参照することができる。
　第２実施形態の方法においても、培養は、継代培養により行われてもよい。具体的には、２継代目以降の培養は、前回の培養により得られた心筋細胞集団を、単一細胞の状態にし、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む新しい培養液に懸濁し、得られた細胞懸濁液を培養容器に播種し培養することにより行うことができる。
　２継代目以降の培養は、前回の培養と同じ細胞密度および前回の培養と同じ組成の培養液を採用してもよいし、あるいは、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の範囲内であれば、前回の培養と異なる細胞密度を採用してもよいし、培養液がＷＮＴシグナル活性化剤を含んでいれば、前回の培養と異なる組成の培養液を採用してもよい。２継代目以降の培養では、前回の培養により得られた心筋細胞集団を、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種し、１～５μＭのＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養することが好ましい。
　第２実施形態の方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、心筋細胞以外の細胞の増殖を抑制しながら心筋細胞を増殖させることができる。これにより、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団（以下、単に心筋細胞集団ともいう）を製造することができる。上記方法は、適切な細胞密度で播種された細胞を、特定の成分を含む培養液中で培養するだけで心筋細胞純度を向上させることができるため、簡便で低コストの方法である。
　１－３．効果
　上述のとおり、第１実施形態の方法は、特定の成分を含む培養液中で細胞を培養することにより実施することができるため、簡便であるとともに低コストである。また、第２実施形態の方法も、適切な細胞密度で播種された細胞を、特定の成分を含む培養液中で培養することにより実施することができるため、簡便であるとともに低コストである。いずれの実施形態も、簡便かつ低コストの方法により、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団を製造することができる。従来、心筋細胞純度を高めるためには、フローサイトメトリーにより細胞の選別を行うことが必要であったことを考えると、上記方法は非常に簡便な方法であるといえる。
　心筋細胞は、基本的に、腫瘍化した例がほとんど報告されていないため、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、腫瘍化リスクが低く安全性が高いと考えられる。また、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、ロット間で品質のバラつきが出にくい。このため、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、実用的に優れており、とりわけ、心筋細胞シートなどの移植材料を製造するための原料細胞として優れている。
　また、従来、細胞の増殖培養を行う場合には、細胞が増殖できるスペースを確保して、低い細胞密度で細胞を播種するのが一般的であったのに対し、第１実施形態の好ましい態様に係る方法および第２実施形態に係る方法では、細胞が増殖できるスペースが比較的少ない状態（すなわち、比較的高い細胞密度）で心筋細胞を播種して、心筋細胞を効率良く増殖させることができた。また、従来、一般的な分化細胞の増殖形態は、培養容器中で増殖して２次元的にコンフルエントな状態に達すると、細胞増殖が停止するか、あるいは増殖率が非常に低下すると考えられていたのに対し、上述の方法では、心筋細胞は、増殖可能な２次元的なスペースが十分になくても、底面に接着した状態で、足場のない培養容器底面からＺ軸方向に盛り上がるように３次元的に増殖することが観察された。このように、上述の方法は、従来の増殖培養で使用されない播種密度を採用した点と、分化した細胞が培養容器底面で盛り上がるように増殖した点において、これまでの技術常識からは考えられない発明であると本発明者らは考えている。
　２．心筋細胞の純化方法
　別の側面によれば、上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄に記載される方法は、心筋細胞の純化方法ということもできる。すなわち、別の側面によれば、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法が提供される。また、別の側面によれば、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法が提供される。心筋細胞の純化方法は、上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄の記載に従って実施することができる。
　３．心筋細胞集団
　上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団（以下、単に心筋細胞集団ともいう）を得ることができる。したがって、別の側面によれば、上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄に記載される方法により製造された心筋細胞集団が提供される。
　（心筋細胞純度の増大）
　上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、既に述べたとおり、心筋細胞純度を増大させることができる。とりわけ、培養液がＥＧＦ受容体阻害剤を含むと、心筋細胞純度を顕著に増大させることができる。したがって、心筋細胞集団は、高い心筋細胞純度を有する。心筋細胞集団は、培養前の細胞集団より高い心筋細胞純度を有し、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する。また、継代培養の継代回数を重ねると、心筋細胞純度を１００％に近づけることができる。
　上述のとおり、心筋細胞は、腫瘍化しにくい細胞であるため、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、腫瘍化リスクが低く安全性が高い。また、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、ロット間で品質のバラつきが出にくい。このため、心筋細胞純度が高い心筋細胞集団は、実用的に優れており、とりわけ、心筋細胞シートなどの移植材料を製造するための原料細胞や心毒性評価等の薬剤評価細胞として優れている。
　（心筋細胞の多核化）
　上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、多核心筋細胞が出現し得る。したがって、心筋細胞集団は、多核心筋細胞を含むことができる。２～４核の多核心筋細胞は、実際のヒト心臓内の心筋細胞にも一定の割合でみられる。多核心筋細胞が出現する理由は、成熟した心筋細胞がタンパク質発現量を増やし大型化するためと考えられる。なお、培養前の細胞（すなわち、心筋細胞を含む細胞集団）は、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより準備した場合も、商業的に入手した場合も、多核心筋細胞、特に３核以上の多核心筋細胞を実質的に含んでいない。
　多核心筋細胞は、２核以上の多核を有する心筋細胞である。多核心筋細胞は、例えば、最大で８核を有することができる。多核心筋細胞は、例えば、２核細胞、３核細胞、４核細胞、５核細胞、６核細胞、７核細胞または８核細胞である。
　多核心筋細胞は、単核心筋細胞（すなわち、１つの細胞に１つの核が存在する通常の心筋細胞）と比べて、とりわけ大きく目立つ。具体的には、多核心筋細胞は、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、例えば５０～１０００μｍの平均最大長さを有することができる。本発明の方法に従って３回以上の継代培養を行うと、多核心筋細胞は、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、例えば１００～１０００μｍの平均最大長さを有することができる。本明細書において、「多核心筋細胞の平均最大長さ」は、５個の多核心筋細胞の最大長さの平均値を指す。「多核心筋細胞の最大長さ」は、顕微鏡で観察される細胞の二次元画像により測定することができる。また、多核心筋細胞は、顕微鏡で観察すると、細胞サイズがとりわけ大きいことに加えて、複数個の核が１箇所に集まって存在し、細胞質がとりわけ大きい。これらの特徴から、多核心筋細胞は、顕微鏡により単核心筋細胞とは明らかに識別して観察することができる。
　本発明の手法により心筋細胞が増殖する過程において、多核心筋細胞の割合や多核心筋細胞の核の数が増大するため、増殖に伴って心筋細胞の多核化が起こっている。したがって、継代培養の継代回数を重ねると、多核心筋細胞の割合や多核心筋細胞の核の数を増加させることができるとともに、多核心筋細胞のサイズを増大させることができる。
　第１継代培養後に得られた心筋細胞集団は、３核以上の多核を有する多核心筋細胞を例えば０．００１～０．５％の割合で含むことができ、５核以上の多核を有する多核心筋細胞を例えば０．０００１～０．０５％の割合で含むことができる。また、第１継代培養後に、多核心筋細胞は、例えば２０～２００μｍの平均最大長さを有することができる。これに対し、２～４継代目の培養後には、心筋細胞集団は、３核以上の多核を有する多核心筋細胞を例えば０．０１～１％の割合で含むことができ、５核以上の多核を有する多核心筋細胞を例えば０．００１～０．１％の割合で含むことができる。また、２～４継代目の培養後には、多核心筋細胞は、例えば５０～１０００μｍの平均最大長さを有することができる。
　本明細書において「多核心筋細胞の割合（％）」は、心筋細胞１００００個に占める多核心筋細胞の割合を指す。
　多核心筋細胞は、単核心筋細胞と同様、自律的に拍動しており、単核心筋細胞と同様に機能する。また、上述のとおり、ヒトの心臓は、２～４核の多核心筋細胞を含むことが報告されている。更に、多核心筋細胞は、単核心筋細胞と比べて、とりわけ大きく、細胞質に多量の筋繊維を有しているため、筋収縮力が強いという利点を有する。したがって、多核心筋細胞を含む心筋細胞集団は、心筋細胞シートなどの移植材料を製造するための原料細胞や心毒性評価等の薬剤評価細胞として優れている。
　（心筋細胞の成熟化）
　上述の「１．向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養すると、心筋細胞を成熟させることができる。したがって、心筋細胞集団は、成熟した心筋細胞を含む。成熟した心筋細胞は、心筋細胞が、発達した筋繊維を有することにより確認することができる。発達した筋繊維は、心筋細胞を、筋サルコメアの構造タンパク質（α－アクチニン）に対する抗体で染色すると、明瞭な縞模様で観察することができる。継代培養の継代回数を重ねて長期培養すると、心筋細胞の成熟度を更に高めることができる。
　成熟した心筋細胞は、成熟していない心筋細胞と比較して、移植において不整脈リスクを減らし、治療効果を増大させることが期待される。したがって、成熟した心筋細胞を含む心筋細胞集団は、心筋細胞シートなどの移植材料を製造するための原料細胞や心毒性評価等の薬剤評価細胞として優れている。
　（未分化ｉＰＳ細胞マーカーLin28の発現の消失）
　上述の「１．心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って、心筋細胞を含む細胞集団を培養して心筋細胞集団を製造すると、未分化ｉＰＳ細胞マーカーLin28の発現が消失することを本発明者らは新たに見出した。
　Lin28は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞で発現し、分化細胞で発現が低下する未分化マーカーであることが知られている。このため、Lin28は、ｉＰＳ細胞を分化誘導して分化細胞を作製した際に、分化細胞に残存するｉＰＳ細胞を検出するためのマーカーとして使用されている。ｉＰＳ細胞は、造腫瘍性を有するため、ｉＰＳ細胞が残存している分化細胞は、ｉＰＳ細胞を除去してから移植材料として使用する必要がある。分化細胞にｉＰＳ細胞が残存する問題は、移植材料の安全性の観点から重要な課題として認識されている。
　したがって、本発明者らが新たに作り出した「Lin28を発現していない心筋細胞集団」は、未分化のｉＰＳ細胞をほとんど含んでいないため、腫瘍化しにくいという点で優れている。
　（具体的な態様）
　第１態様に係る心筋細胞集団は、
　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、且つ
　Lin28を発現していない。
　第１態様において、「多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞」とは、ヒト多能性幹細胞（例えばヒトｉＰＳ細胞）を心筋細胞へ分化誘導し、得られた心筋細胞を「１．心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って培養することにより得られた心筋細胞を指すことができる。
　第１態様において、「Lin28を発現していない」とは、定量的ＰＣＲ法を用いてLin28の遺伝子発現を検出した場合にLin28の遺伝子発現が検出されないことを指す。ここで、Lin28の遺伝子発現の検出に使用される心筋細胞集団は、好ましくは１×１０7個以上、より好ましくは１×１０7～１×１０10個、一例を挙げると５×１０7個の細胞数を有する。定量的ＰＣＲ法は、心筋細胞集団からｍＲＮＡを回収し；ｍＲＮＡから逆転写酵素の反応によりｃＤＮＡを合成し；ｃＤＮＡを鋳型として用いるとともに下記プライマー対をプライマーとして用いてＰＣＲ反応（４５サイクル）を行ってLin28の遺伝子領域を増幅し；Lin28の遺伝子発現を、GAPDHの遺伝子発現を内部標準として用いて解析することにより行うことができる。
Lin28_Fw：cacggtgcgggcatctg（配列番号１）
Lin28_Rv：ccttccatgtgcagcttactc（配列番号２）
　より詳しくは、定量的ＰＣＲ法は、後述の実施例６に記載されるとおり行うことができる。後述の実施例６では、心筋細胞集団に残存するｉＰＳ細胞の割合が0.0002％以上であれば、定量的ＰＣＲ法により検出可能であることが示されている。例えば、心筋細胞集団が１×１０7個の細胞数を有する場合、心筋細胞集団に残存するｉＰＳ細胞の数が２０個以上であれば、定量的ＰＣＲ法により検出することができる。
　第１態様に係る心筋細胞集団は、例えば１×１０7個以上の細胞数を有する。より具体的には、第１態様に係る心筋細胞集団は、例えば１×１０7～１×１０10個の細胞数を有する。
　第１態様に係る心筋細胞集団は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する。
　第１態様に係る心筋細胞集団は、例えばヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む。より具体的には、第１態様に係る心筋細胞集団は、例えば２～８個の多核を有するヒト心筋細胞、好ましくは３～８個の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５～８個の多核を有するヒト心筋細胞を含む。第１態様に係る心筋細胞集団は、ヒト多核心筋細胞を任意の割合で含むことができる。例えば、「１．心筋細胞集団の製造方法」の欄で説明した方法に従って心筋細胞集団を得た場合、心筋細胞集団は、ヒト多核心筋細胞を、例えば０．０００１～１％の割合で含むことができる。
　第１態様において、ヒト多核心筋細胞は、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、例えば５０～１０００μｍ、好ましくは５０～５００μｍの平均最大長さを有する。第１態様において、ヒト多核心筋細胞は、好ましくは、発達した筋繊維を有する。
　４．移植材料
　上述の「３．心筋細胞集団」の欄で説明した心筋細胞集団は、移植材料を製造するための原料細胞として使用することができる。移植材料としては、心筋細胞シート、単一細胞注入移植法のための心筋細胞集団などが挙げられる。したがって、別の側面によれば、上述の「１．心筋細胞集団の製造方法」の欄に記載される方法により製造された心筋細胞集団を含む移植材料が提供される。
　以下、移植材料の具体的な態様について説明する。　
　第１態様に係る移植材料は、
　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、
　Lin28を発現していない
心筋細胞集団を含む。
　移植材料に含まれる心筋細胞集団については、上述の「第１態様に係る心筋細胞集団」の説明を参照することができる。すなわち、第１態様に係る移植材料において、心筋細胞集団は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する。また、第１態様に係る移植材料において、心筋細胞集団は、例えばヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む。また、第１態様に係る移植材料において、心筋細胞集団は、例えば１×１０7個以上の細胞数を有する。
　５．好ましい実施形態
　以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
　［Ａ１］　心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
　［Ａ２］　心筋細胞を含む前記細胞集団が、０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、更に好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された細胞集団である［Ａ１］に記載の方法。
　［Ａ３］　心筋細胞を含む細胞集団を播種することと、
　播種された前記細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることと
を含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
　［Ａ４］　前記播種が、０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、更に好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で行われる［Ａ３］に記載の方法。
　［Ａ５］　前記細胞集団は、前記培養の開始時に３０～９５％、好ましくは７５～９５％の心筋細胞純度を有する［Ａ１］～［Ａ４］の何れか１に記載の方法。
　［Ａ６］　前記ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である［Ａ１］～［Ａ５］の何れか１に記載の方法。
　［Ａ７］　前記ＷＮＴシグナル活性化剤が、前記培養液中に、１～５μＭ、好ましくは２～５μＭ、より好ましくは２～４μＭの濃度で含まれ、前記ＥＧＦ受容体阻害剤が、前記培養液中に、１～１０μＭ、好ましくは２～１０μＭ、より好ましくは４～８μＭの濃度で含まれる［Ａ１］～［Ａ６］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ１］　０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
　［Ｂ２］　心筋細胞を含む細胞集団を、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種することと、
　播種された前記細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることと
を含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
　［Ｂ３］　前記細胞密度が、０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2である［Ｂ１］または［Ｂ２］に記載の方法。
　［Ｂ４］　前記細胞集団は、前記培養の開始時に３０～９５％、好ましくは７５～９５％の心筋細胞純度を有する［Ｂ１］～［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ５］　前記ＷＮＴシグナル活性化剤がＣＨＩＲ９９０２１である［Ｂ１］～［Ｂ４］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ６］　前記ＷＮＴシグナル活性化剤が、前記培養液中に、１～５μＭ、好ましくは２～５μＭ、より好ましくは２～４μＭの濃度で含まれる［Ｂ１］～［Ｂ５］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ７］　前記培養液がＥＧＦ受容体阻害剤を更に含む［Ｂ１］～［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ８］　前記ＥＧＦ受容体阻害剤がＡＧ１４７８である［Ｂ１］～［Ｂ７］の何れか１に記載の方法。
　［Ｂ９］　前記ＥＧＦ受容体阻害剤が、前記培養液中に、１～１０μＭ、好ましくは２～１０μＭ、より好ましくは４～８μＭの濃度で含まれる［Ｂ１］～［Ｂ８］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ１］　心筋細胞を含む前記細胞集団が、ヒト心筋細胞を含む細胞集団である［Ａ１］～［Ａ７］および［Ｂ１］～［Ｂ９］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ２］　心筋細胞を含む前記細胞集団が、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団、好ましくはｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団である［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ３］　心筋細胞を含む前記細胞集団が、単一細胞の状態で播種される［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ２］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ４］　前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が、３～３０ｍｍ、好ましくは５～１０ｍｍである条件下で前記培養が行われる［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ３］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ５］　前記培養液が血清を含む［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ４］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ６］　前記培養が継代培養により行われる［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ５］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ７］　前記培養により得られた前記心筋細胞集団の少なくとも一部を播種し、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で継代培養することを更に含む［Ａ１］～［Ａ７］および［Ｃ１］～［Ｃ６］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ８］　前記培養により得られた前記心筋細胞集団の少なくとも一部を、０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種し、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で継代培養することを更に含む［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ６］の何れか１に記載の方法。
　［Ｃ９］　前記培養が接着培養により行われる［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ８］の何れか１に記載の方法。
　［Ｄ１］　［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ９］の何れか１に記載の方法により製造された心筋細胞集団。
　［Ｄ２］　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する［Ｄ１］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｄ３］　前記心筋細胞集団が、多核心筋細胞（例えば、２～８個の多核を有する心筋細胞）、好ましくは３核以上の多核を有する心筋細胞（例えば、３～８個の多核を有する心筋細胞）、より好ましくは５核以上の多核を有する心筋細胞（例えば、５～８個の多核を有する心筋細胞）を含む［Ｄ１］または［Ｄ２］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｄ４］　前記多核心筋細胞が、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、５０～１０００μｍ、好ましくは５０～５００μｍの平均最大長さを有する［Ｄ３］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｄ５］　前記多核心筋細胞が、発達した筋繊維を有する［Ｄ３］または［Ｄ４］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｄ６］　前記心筋細胞集団が、Lin28を発現していない［Ｄ１］～［Ｄ５］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｄ７］　前記心筋細胞集団が、定量的ＰＣＲ法を用いてLin28の遺伝子発現を検出した場合にLin28の遺伝子発現が検出されない［Ｄ１］～［Ｄ５］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ１］　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、且つLin28を発現していない心筋細胞集団。
　［Ｅ２］　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、且つ定量的ＰＣＲ法を用いてLin28の遺伝子発現を検出した場合にLin28の遺伝子発現が検出されない心筋細胞集団。
　［Ｅ３］　Lin28の遺伝子発現の前記検出に使用される心筋細胞集団が、１×１０7個以上、好ましくは１×１０7～１×１０10個、一例を挙げると５×１０7個の細胞数を有する［Ｅ２］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ４］　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する［Ｅ１］～［Ｅ３］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ５］　前記心筋細胞集団が、ヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む［Ｅ１］～［Ｅ４］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ６］　前記心筋細胞集団が、２～８個の多核を有するヒト心筋細胞、好ましくは３～８個の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５～８個の多核を有するヒト心筋細胞を含む［Ｅ１］～［Ｅ５］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ７］　前記ヒト多核心筋細胞が、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、５０～１０００μｍ、好ましくは５０～５００μｍの平均最大長さを有する［Ｅ５］または［Ｅ６］に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ８］　前記ヒト多核心筋細胞が、発達した筋繊維を有する［Ｅ５］～［Ｅ７］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ９］　前記心筋細胞集団が、１×１０7個以上、好ましくは１×１０7～１×１０10個の細胞数を有する［Ｅ１］～［Ｅ８］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｅ１０］　前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である［Ｅ１］～［Ｅ９］の何れか１に記載の心筋細胞集団。
　［Ｆ１］　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、Lin28を発現していない心筋細胞集団を含む移植材料。
　［Ｆ２］　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、且つ定量的ＰＣＲ法を用いてLin28の遺伝子発現を検出した場合にLin28の遺伝子発現が検出されない心筋細胞集団を含む移植材料。
　［Ｆ３］　Lin28の遺伝子発現の前記検出に使用される心筋細胞集団が、１×１０7個以上、好ましくは１×１０7～１×１０10個、一例を挙げると５×１０7個の細胞数を有する［Ｆ２］に記載の移植材料。
　［Ｆ４］　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する［Ｆ１］～［Ｆ３］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｆ５］　前記心筋細胞集団が、ヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む［Ｆ１］～［Ｆ４］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｆ６］　前記心筋細胞集団が、２～８個の多核を有するヒト心筋細胞、好ましくは３～８個の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５～８個の多核を有するヒト心筋細胞を含む［Ｆ１］～［Ｆ５］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｆ７］　前記ヒト多核心筋細胞が、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、５０～１０００μｍ、好ましくは５０～５００μｍの平均最大長さを有する［Ｆ５］または［Ｆ６］に記載の移植材料。
　［Ｆ８］　前記ヒト多核心筋細胞が、発達した筋繊維を有する［Ｆ５］～［Ｆ７］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｆ９］　前記心筋細胞集団が、１×１０7個以上、好ましくは１×１０7～１×１０10個の細胞数を有する［Ｆ１］～［Ｆ８］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｆ１０］　前記多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である［Ｆ１］～［Ｆ９］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｇ１］　［Ａ１］～［Ａ７］、［Ｂ１］～［Ｂ９］および［Ｃ１］～［Ｃ９］の何れか１に記載の方法により製造された心筋細胞集団を含む移植材料。
　［Ｇ２］　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する［Ｇ１］に記載の移植材料。
　［Ｇ３］　前記心筋細胞集団が、多核心筋細胞（例えば、２～８個の多核を有する心筋細胞）、好ましくは３核以上の多核を有する心筋細胞（例えば、３～８個の多核を有する心筋細胞）、より好ましくは５核以上の多核を有する心筋細胞（例えば、５～８個の多核を有する心筋細胞）を含む［Ｇ１］または［Ｇ２］に記載の移植材料。
　［Ｇ４］　前記多核心筋細胞が、培養容器底面に接着している状態で測定された場合、５０～１０００μｍ、好ましくは５０～５００μｍの平均最大長さを有する［Ｇ３］に記載の移植材料。
　［Ｇ５］　前記多核心筋細胞が、発達した筋繊維を有する［Ｇ３］または［Ｇ４］に記載の移植材料。
　［Ｇ６］　前記心筋細胞集団が、Lin28を発現していない［Ｇ１］～［Ｇ５］の何れか１に記載の移植材料。
　［Ｇ７］　前記心筋細胞集団が、定量的ＰＣＲ法を用いてLin28の遺伝子発現を検出した場合にLin28の遺伝子発現が検出されない［Ｇ１］～［Ｇ５］の何れか１に記載の移植材料。
　［実施例１］
　［１－１］方法
　プロテインフリー心筋分化誘導法を用いてヒトiPS細胞（253G1株、理研バイオリソースセンター）の分化誘導を行い、分化誘導を開始してから37日目の心筋細胞（cTnT陽性率70～90%）を以下のとおり準備した。
心筋細胞ロットNo.72：cTnT陽性率７５．８％
心筋細胞ロットNo.73：cTnT陽性率８８．２％
心筋細胞ロットNo.80：cTnT陽性率７１％
心筋細胞ロットNo.81：cTnT陽性率８７．３％
心筋細胞ロットNo.86：cTnT陽性率８４．７％
　心筋細胞をトリプシン（Life Technology)で分散処理したのち、20%FBS心筋分化培地（心筋細胞ロットNo.72、73、80、81については、3μM　Y-27632、3μM　CHIR99021および6μM　AG1478を含む。心筋細胞ロットNo.86については、3μM　Y-27632および3μM　CHIR99021を含むがAG1478を含まない。）中に、単一心筋細胞の状態で懸濁した。懸濁された心筋細胞を、iMatrix laminin511（株式会社ニッピ）でコーティングしたT25フラスコ（イワキ）に播種した。心筋細胞は、細胞密度が5.0×106細胞/T25フラスコ（すなわち、2.0×105細胞/cm2）となるように播種した。
　細胞含有培養液は、培養液の液面から培養容器底面までの距離が７ｍｍになるように、培養容器に入れた。
　播種の翌日（day1）に、2%FBS心筋分化培地（心筋細胞ロットNo.72、73、80、81については、3μM　CHIR99021および6μM　AG1478を含む。心筋細胞ロットNo.86については、3μM　CHIR99021を含むがAG1478を含まない。）で培地交換を行い、それ以降3～4日ごとに培地交換を行って、2週間培養を行った（第１継代培養）。
　心筋細胞ロットNo.73については、第４継代培養まで培養を行った。具体的には、前回の培養で得られた細胞を、トリプシンEDTAを用いて分散処理し、得られた単一心筋細胞を、前回の培養と同じ細胞密度でフラスコに播種して、上記と同じ条件で継代培養を行った。
　［１－２］分析
　培養後に得られた細胞を、トリプシンEDTAを用いて分散処理し、細胞数をカウントし、心筋トロポニンT（cTnT）抗体で処理した後、フローサイトメトリーで心筋細胞の割合（cTnT陽性率）を調べた。心筋細胞の割合（cTnT陽性率）は、「心筋細胞純度」を表す。また、培養後の心筋細胞数を培養前の心筋細胞数で割ることにより「心筋細胞増殖率」を求めた。
　「多核心筋細胞の割合」は、心筋細胞１００００個に占める多核心筋細胞の割合から求めた。「多核心筋細胞の平均最大長さ」は、５個の多核心筋細胞の最大長さを顕微鏡の二次元画像から測定し、測定された値の平均を算出することにより求めた。
　［１－３］結果
　（ａ）心筋細胞増殖率および心筋細胞純度の結果
　第１継代培養後に、心筋細胞は以下の増殖率で増殖した。　
心筋細胞ロットNo.72：心筋細胞増殖率２．５倍
心筋細胞ロットNo.73：心筋細胞増殖率２．１倍
心筋細胞ロットNo.80：心筋細胞増殖率３．２倍
心筋細胞ロットNo.81：心筋細胞増殖率２．９倍
心筋細胞ロットNo.86：心筋細胞増殖率３．０倍
　心筋細胞純度の結果を図１に示す。　
　培養前の心筋細胞純度は70～90%であったが、第１継代培養後に、心筋細胞ロットNo.72、73、80、81の心筋細胞純度（cTnT陽性率）を95%以上まで増大させることができた（図１を参照）。一方、第１継代培養後に、心筋細胞ロットNo.86の心筋細胞純度（cTnT陽性率）は、９０%であった。また、心筋細胞ロットNo.73では、第３～第４継代培養後に、最大で98.5%の心筋細胞純度を有する心筋細胞集団を得ることができた（図１を参照）。
　以上の結果から、心筋細胞を含む細胞集団を、適切な細胞密度で播種し、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養すると、心筋細胞純度を顕著に増大させることができることが分かる。また、心筋細胞を含む細胞集団を、適切な細胞密度で播種し、ＷＮＴシグナル活性化剤を含むがＥＧＦ受容体阻害剤を含まない培養液中で培養しても、心筋細胞純度を顕著に増大させることができることが分かる。また、継代培養の継代回数を重ねると、心筋細胞純度を100％に近づけることができることが分かる。
　（ｂ）心筋細胞集団の結果
　多核心筋細胞の割合を図２に示し、多核心筋細胞の平均最大長さを図３に示す。
　心筋細胞ロットNo.７３の場合、第１継代培養後に得られた心筋細胞集団は、３核または４核の多核を有する多核心筋細胞を０．２１％の割合で含み、５核以上の多核を有する多核心筋細胞を０．０３％の割合で含んでいた（図２参照）。すなわち、得られた心筋細胞集団は、３核以上の多核を有する多核心筋細胞を０．２４％の割合で含んでいた。この場合、第１継代培養後に、多核心筋細胞（すなわち、２核以上の多核を有する心筋細胞）は、５７μｍの平均最大長さを有していた（図３参照）。また、第１継代培養後に、多核心筋細胞内に縞模様状のサルコメア構造を観察することができた。
　心筋細胞ロットNo.７３の場合、第３継代培養後に得られた心筋細胞集団は、３核または４核の多核を有する多核心筋細胞を０．３１％の割合で含み、５核以上の多核を有する多核心筋細胞を０．０８％の割合で含んでいた（図２参照）。すなわち、得られた心筋細胞集団は、３核以上の多核を有する多核心筋細胞を０．３９％の割合で含んでいた。この場合、第３継代培養後に、多核心筋細胞（すなわち、２核以上の多核を有する心筋細胞）は、１２０μｍの平均最大長さを有していた（図３参照）。また、第３継代培養後の多核心筋細胞は、第１継代培養後に得られた多核心筋細胞と比べて、より明瞭な縞模様状のサルコメア構造を観察することができた。
　これらの結果から、継代培養の継代回数を重ねると、多核心筋細胞の割合や多核心筋細胞の核の数が増加するとともに、多核心筋細胞のサイズが増大することが分かる。また、継代培養の継代回数を重ねると、心筋細胞の成熟度が高まることが分かる。
　［実施例２］
　実施例２では、第１実施形態に係る方法において播種密度が心筋細胞純度に及ぼす効果を調べた。
　［２－１］方法
　実施例１と同様の手順に従って、心筋細胞（cTnT陽性率：約87～約90%）を準備した。心筋細胞を、20%FBS心筋分化培地（3μM　Y-27632、3μM　CHIR99021および6μM　AG1478を含む）中に、単一心筋細胞の状態で懸濁した。懸濁された心筋細胞を、iMatrix laminin511（株式会社ニッピ）でコーティングしたT25フラスコ（イワキ）に播種した。心筋細胞は、細胞密度が0.05×105細胞/cm2、2.0×105細胞/cm2、または6.0×105細胞/cm2となるように播種した。培養は、実施例１と同様の手順に従って行った。
　［２－２］分析
　第１継代培養後に得られた細胞および第２継代培養後に得られた細胞について、実施例１と同様の手順に従って「心筋細胞純度」を求めた。
　［２－３］結果
　心筋細胞純度の結果を図４に示す。図４の結果から、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養すると、播種密度に関わらず、心筋細胞純度を向上させることができることが分かる。
　［実施例３］
　実施例３では、第２実施形態に係る方法において播種密度が心筋細胞純度に及ぼす効果を調べた。
　［３－１］方法
　実施例１と同様の手順に従って、心筋細胞（cTnT陽性率：約90～約92%）を準備した。心筋細胞を、20%FBS心筋分化培地（3μM　Y-27632および3μM　CHIR99021を含むがAG1478を含まない）中に、単一心筋細胞の状態で懸濁した。懸濁された心筋細胞を、iMatrix laminin511（株式会社ニッピ）でコーティングしたT25フラスコ（イワキ）に播種した。心筋細胞は、細胞密度が1.0×105細胞/cm2、2.0×105細胞/cm2、または3.2×105細胞/cm2となるように播種した。培養は、実施例１と同様の手順に従って行った。
　［３－２］分析
　第１継代培養後に得られた細胞および第２継代培養後に得られた細胞について、実施例１と同様の手順に従って「心筋細胞純度」を求めた。
　［３－３］結果
　心筋細胞純度の結果を図５に示す。図５の結果から、心筋細胞を含む細胞集団を、適切な細胞密度で播種し、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養すると、心筋細胞純度を向上させることができることが分かる。
　［実施例４］
　得られた心筋細胞集団の薬剤応答性を確認した。薬剤としてテルフェナジンを使用した。テルフェナジンは、抗エネルギー薬で、ＱＴ延長を引き起こすことが知られている。
　［４－１］方法
　実施例１と同様の方法に従って、心筋細胞を、第３継代培養まで培養して心筋細胞集団を製造した。心筋細胞集団の心筋細胞数は、第１継代培養の開始時から約１５倍に増加した。心筋細胞集団は、９８．５％の心筋細胞純度を有していた。
　得られた心筋細胞集団の薬剤応答性を試験した。薬剤応答性試験は、蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージングによって行った。具体的には、薬剤応答性試験は、蛍光顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ８３で、心筋細胞の拍動カルシウム蛍光動画を取得することにより行った。
　薬剤応答性試験では、以下の組成を有する培養液をｐＨ７．４に調整して、心筋細胞の培養液として使用した：
０．１８２ｇ／ＬのＣａＣｌ2、
０．０９７６７ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、
０．４ｇ／ＬのＫＣｌ、
３．３６２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、
５．４５２５ｇ／ＬのＮａＣｌ、
０．１０９ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4
５．９５８ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、および
１０質量％のＦＢＳ（Fetal bovine serum, Invitrogen）。
　顕微鏡上で細胞培養液にテルフェナジンを添加し、１０分後に、カルシウムセンサータンパク質ＧＣａＭＰまたはカルシウム指示薬Ｃａｌ－５２０を用いてカルシウムシグナルを測定した。データ解析にはＩｍａｇｅＪベースの画像解析ソフトウェアを使用した。
　［４－２］結果
　測定結果を図６Ａ～６Ｅに示す。図６Ａは、テルフェナジンを添加しなかった場合の波形図、図６Ｂは、100 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図、図６Ｃは、300 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図、図６Ｄは、500 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図、図６Ｅは、900 nMの最終濃度でテルフェナジンを添加した場合の波形図を示す。
　テルフェナジン（培養液中の濃度：100 nM）の添加によりＱＴ延長応答が検出された（図６Ｂ参照）。また、テルフェナジンの濃度を300～900 nMに高めると、早期後脱分極（ＥＡＤ）応答が検出された（図６Ｃ～６Ｅを参照）。したがって、得られた心筋細胞集団は、心筋細胞としての機能を維持していることが確認された。
　［実施例５］
　得られた心筋細胞集団の生着性を確認した。
　［５－１］方法
　実施例１と同様の方法に従って、心筋細胞を、第２継代培養まで培養して心筋細胞集団を製造した。心筋細胞集団の心筋細胞数は、第１継代培養の開始時から約４倍に増加した。心筋細胞集団は、９５％の心筋細胞純度を有していた。得られた心筋細胞集団を心筋梗塞ラットに移植した。
　［５－２］結果
　移植後の心筋梗塞ラットの心臓を図７Ａおよび７Ｂに示す。移植された心筋細胞集団は、予めＧＦＰ遺伝子が導入されている。図７Ａは、ＧＦＰ抗体を用いた染色結果を示す。図７Ｂの上段は、心筋マーカーを用いた心筋細胞の染色結果を示し、下段は、ＧＦＰ抗体を用いた染色結果を示す。
　図７Ａおよび７Ｂに示されるとおり、得られた心筋細胞集団を心筋梗塞ラットに移植したところ、多量の心筋細胞が生着し、心筋細胞以外の細胞の生着は見られなかった。したがって、得られた心筋細胞集団は、移植用途において、高い安全性と治療効果を期待することができる。
　［実施例６］
　本発明の方法に従って心筋細胞集団を製造し、心筋細胞マーカー遺伝子（cTnT）および未分化ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（Lin28）の発現量を調べた。未分化ｉＰＳ細胞マーカー遺伝子（Lin28）の発現は、心筋細胞集団にｉＰＳ細胞が残存していることを表す。また、心筋細胞集団をマウスの皮下に移植し、造腫瘍性を評価した。
　［６－１］方法
　（心筋細胞集団の作製）
　プロテインフリー心筋分化誘導法を用いてヒトiPS細胞（NH50191株、米国NIH）の分化誘導を行い、分化誘導を開始してから14日目の心筋細胞（cTnT陽性細胞率75.4%）を準備した。
　心筋細胞をトリプシン（Life Technology)で分散処理したのち、20%FBS心筋分化培地（3μM　Y-27632、2μM　CHIR99021、および4μM　AG1478を含む）中に、単一心筋細胞の状態で懸濁した。「心筋分化培地」の組成は、実施例１の記載を参照することができる。懸濁された心筋細胞を、iMatrix laminin511（株式会社ニッピ）でコーティングしたT25フラスコ（イワキ）に播種した。心筋細胞は、5.0×106細胞/T25フラスコ（すなわち、2.0×105細胞/cm2）の細胞密度となるように播種した。
　播種の翌日（day1）に、2%FBS心筋分化培地（2μM　CHIR99021および4μM　AG1478を含む）で培地交換を行い、それ以降3～4日ごとに培地交換を行って、2週間培養を行った。以下、この培養を「拡大培養」と呼ぶ。拡大培養後、トリプシンEDTAを用いて細胞を分散処理して、単一細胞の状態の心筋細胞を得た。
　（ＦＡＣＳ解析）
　得られた心筋細胞について、細胞数をカウントし、cTnTのFACS解析を行った。細胞数は、T25フラスコ当たり18.5×106個であった。また、cTnT陽性細胞率は92.6%であった。
　（マーカー遺伝子の発現解析）
　さらに、得られた心筋細胞（5×107細胞）からRNA回収キット（miRNeasy Mini Kit、キアゲン）を用いてmRNAを回収した。比較対照１として、未分化のiPS細胞（1×107細胞）からRNA回収キット（miRNeasy Mini Kit、キアゲン）を用いてmRNAを回収した。比較対照２として、上記の分化誘導を開始してから21日目の心筋細胞（拡大培養無し）（5×107細胞）からRNA回収キット（miRNeasy Mini Kit、キアゲン）を用いてmRNAを回収した。比較対照３として、上記の分化誘導を開始してから28日目の心筋細胞（拡大培養無し）（5×107細胞）からRNA回収キット（miRNeasy Mini Kit、キアゲン）を用いてmRNAを回収した。
　各mRNAから、SuperScriptTM III逆転写酵素でcDNAを合成した。PowerUp SYBR Green Master Mix（サーモフィッシャー）とQuantStudio 6 Flex Real-time PCR system（サーモフィッシャー）を用いた定量的PCR法を用いて、心筋細胞マーカー遺伝子であるcTnTと、未分化iPS細胞マーカーであるLin28の遺伝子発現を解析した。この解析では、GAPDHの遺伝子発現を内部標準として用いた。すべてのPCR反応は４５サイクルで実施した。上記の拡大培養は独立して３回行った。３回の拡大培養を、それぞれ「拡大CM１」、「拡大CM2」、「拡大CM3」と呼ぶ。
　定量的PCRに使用したプライマーの配列は以下のとおりである：
Lin28_Fw：cacggtgcgggcatctg（配列番号１）
Lin28_Rv：ccttccatgtgcagcttactc（配列番号２）
cTnT_Fw：gaaggacctgaatgagttgcag（配列番号３）
cTnT_Rv：acgtsctctcgatcctgtctttg（配列番号４）
　配列番号４において、sはgまたはcを表す。
　（造腫瘍性の評価）
　２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞、上記のiPS細胞（比較対照１）、ならびに分化誘導を開始してから28日目の心筋細胞（比較対照３）について、造腫瘍性の評価を行った。具体的には、NOGマウスの背部皮下に1×107個の細胞を注入し、２ヶ月後に腫瘍の有無を確認した。
　［６－２］結果
　（ＦＡＣＳ解析）
　２週間の拡大培養によって、T25フラスコ当たり18.5×106個の心筋細胞が回収できた。細胞数は、播種時の5×106個から3.7倍に増加した。また、２週間の拡大培養後、cTnT陽性細胞率は92.6%であった。cTnT陽性細胞率は、播種時の75.4%から17.2%増加した。
　（マーカー遺伝子の発現解析）
　cTnTの遺伝子発現の解析結果を図１７の上のグラフに示す。Lin28の遺伝子発現の解析結果を図１７の下のグラフに示す。図１７の各グラフは、左から順に以下の試料の結果を表す。
ｉＰＳ：ｉＰＳ細胞（比較対照１）
ｄ２１ＣＭ：分化誘導を開始してから21日目の心筋細胞（比較対照２）
拡大ＣＭ１：２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞
拡大ＣＭ２：２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞
ｄ２８ＣＭ：分化誘導を開始してから28日目の心筋細胞（比較対照３）
　上のグラフは、ｄ２１ＣＭ（比較対照３）におけるcTnT発現量を１とした場合の相対的なcTnT発現量を示す。下のグラフは、ｉＰＳ（比較対照１）におけるLin28発現量を１とした場合の相対的なLin28発現量を示す。なお、下のグラフは、対数表示グラフである。
　遺伝子発現解析の結果、iPS細胞にはcTnTの発現が見られず、心筋細胞は、拡大培養を行った場合も行わなかった場合も、同程度のcTnT発現量を示した（図１７の上のグラフ）。一方、Lin28は、iPS細胞で発現が検出された。拡大培養を行っていない21日目の心筋細胞（d21CM）および拡大培養を行っていない28日目の心筋細胞（d28CM）では、それぞれ、iPS細胞の0.1%から0.01%程度のLin28発現量が示された。拡大培養を行って得られた心筋細胞（拡大CM1および拡大CM2）では、Lin28の発現は全く検出されなかった（図７の下のグラフ）。
　さらに、心筋細胞集団に残存するiPS細胞の検出限界を求めるために以下の実験を行った。未分化のiPS細胞からのRNAサンプルを、一定の細胞数（すなわち、1×102、1×103、1×104、1×107）に対応するように希釈し、定量的PCRでLin28の発現量解析を行った。この解析は、拡大培養を行って得られた心筋細胞（5×107の細胞数）からのRNAサンプルと同時比較しながら行った。
　Lin28の遺伝子発現の解析結果を図１８に示す。図１８のグラフは、左から順に以下の試料の結果を表す。
コントロール：PCRバッファーのみのサンプル（細胞を含まない）
拡大ＣＭ３：２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞からのRNAサンプル
ｉＰＳ（1×10e2）：iPS細胞からのRNAサンプルを、1×102のiPS細胞数に対応するように希釈したサンプル
ｉＰＳ（1×10e3）：iPS細胞からのRNAサンプルを、1×103のiPS細胞数に対応するように希釈したサンプル
ｉＰＳ（1×10e4）：iPS細胞からのRNAサンプルを、1×104のiPS細胞数に対応するように希釈したサンプル
ｉＰＳ（1×10e7）：iPS細胞（比較対照１）からのRNAサンプル
　図１８のグラフは、iPS細胞（比較対照１）におけるLin28発現量を１とした場合の相対的なLin28発現量を示す。なお、このグラフは、対数表示グラフである。
　iPS細胞からのRNAサンプルを、1×102のiPS細胞数に対応するように希釈した場合でも、Lin28を検出することができた。一方、コントロールと拡大培養後の心筋細胞の場合、Lin28は検出されなかった（図１８）。これらの結果から、２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞において、iPS細胞の残存数は1×102未満であることが分かる。この残存数を、心筋細胞数（すなわち5×107の細胞数）に対する割合に換算すると、0.0002％未満である。
　以上より、心筋細胞集団に残存するiPS細胞の割合は、0.0002％以上であれば、定量的ＰＣＲ法により検出可能であることが分かる。
　（造腫瘍性の評価）
　造腫瘍性の評価結果について以下に述べる。NOGマウスの皮下にiPS細胞（比較対照１）を移植した場合、２か月後に、マウス６匹中４匹に大きな腫瘍（2～5mm)が発生した。NOGマウスの皮下に、分化誘導を開始してから28日目の心筋細胞（比較対照３）を移植した場合、２か月後に、マウス６匹中２匹に比較的小さい腫瘍（1～2mm）が発生した。NOGマウスの皮下に、２週間の拡大培養を行って得られた心筋細胞を移植した場合、２か月後に、マウス６匹全てにおいて腫瘍は見られなかった。
　これらの結果は、本発明の方法により作製された心筋細胞集団が、腫瘍化しにくいことを示す。
　［６－３］考察
　再生医療において、移植される細胞の造腫瘍性は重要な課題である。未分化な状態のiPS細胞を動物に移植すると腫瘍化することが知られており、移植する分化細胞には可能な限り未分化な状態のiPS細胞が含まれていないことが望ましい。しかしながら、現状では、多くの場合、iPS細胞から分化誘導した様々な分化細胞（例えば、iPS細胞から分化誘導した心筋細胞）に、ある程度の量の未分化細胞が残存しており、このことが再生医療の課題となっている。
　分化細胞に残存する未分化iPS細胞を評価する手法として、未分化iPS細胞マーカーであるLin28の遺伝子発現量を指標とする方法が知られている。上記実験データにおいて、拡大培養を行っていない心筋細胞については、従来言われているように、一定量のLin28の発現が検出された。しかし、本発明の方法に従って拡大培養を行って得られた心筋細胞については、Lin28の発現は全く検出されなかった。また、本発明の方法に従って拡大培養を行って得られた心筋細胞については、NOGマウスにおける細胞移植後にも、腫瘍化が見られなかった。
　以上の結果から、本発明の方法により作製された心筋細胞集団は、未分化のiPS細胞がほとんど含まれず、腫瘍化しにくい細胞であると考えられる。

Claims (24)

  1. 　心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
  2. 　０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、向上した心筋細胞純度を有する心筋細胞集団の製造方法。
  3. 　心筋細胞を含む前記細胞集団が、０．０５×１０5～６．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2、より好ましくは０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、更に好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された細胞集団である請求項１に記載の方法。
  4. 　前記細胞密度が、０．３×１０5～４．０×１０5細胞／ｃｍ2、好ましくは１．０×１０5～３．２×１０5細胞／ｃｍ2である請求項２に記載の方法。
  5. 　前記培養液がＥＧＦ受容体阻害剤を更に含む請求項２または４に記載の方法。
  6. 　前記細胞集団は、前記培養の開始時に３０～９５％の心筋細胞純度を有する請求項１または３に記載の方法。
  7. 　前記細胞集団は、前記培養の開始時に３０～９５％の心筋細胞純度を有する請求項２、４または５に記載の方法。
  8. 　前記培養液の液面から前記心筋細胞が接している培養容器底面までの距離が３～３０ｍｍである条件下で前記培養が行われる請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
  9. 　前記培養液が血清を含む請求項１～８の何れか１項に記載の方法。
  10. 　前記培養が継代培養により行われる請求項１～９の何れか１項に記載の方法。
  11. 　心筋細胞を含む前記細胞集団が、ヒト心筋細胞を含む細胞集団である請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
  12. 　心筋細胞を含む前記細胞集団が、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導することにより得られた細胞集団である請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 　心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤およびＥＧＦ受容体阻害剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法。
  14. 　０．１×１０5～５．０×１０5細胞／ｃｍ2の細胞密度で播種された、心筋細胞を含む細胞集団を、ＷＮＴシグナル活性化剤を含む培養液中で培養して、前記細胞集団における前記心筋細胞の純度を向上させることを含む、心筋細胞の純化方法。
  15. 　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、且つLin28を発現していない心筋細胞集団。
  16. 　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する請求項１５に記載の心筋細胞集団。
  17. 　前記心筋細胞集団が、ヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む請求項１５または１６に記載の心筋細胞集団。
  18. 　前記心筋細胞集団が、１×１０7個以上の細胞数を有する請求項１５～１７の何れか１項に記載の心筋細胞集団。
  19. 　多能性幹細胞由来であるヒト心筋細胞を含み、Lin28を発現していない心筋細胞集団を含む移植材料。
  20. 　前記心筋細胞集団が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の心筋細胞純度を有する請求項１９に記載の移植材料。
  21. 　前記心筋細胞集団が、ヒト多核心筋細胞、好ましくは３核以上の多核を有するヒト心筋細胞、より好ましくは５核以上の多核を有するヒト心筋細胞を含む請求項１９または２０に記載の移植材料。
  22. 　前記心筋細胞集団が、１×１０7個以上の細胞数を有する請求項１９～２１の何れか１項に記載の移植材料。
  23. 　請求項１～１２の何れか１項に記載の方法により製造された心筋細胞集団。
  24. 　請求項１～１２の何れか１項に記載の方法により製造された心筋細胞集団を含む移植材料。
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