WO2015129384A1

WO2015129384A1 - 糖鎖を含む標的物質の検出用試薬、検出方法、および糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法

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Publication number: WO2015129384A1
Application number: PCT/JP2015/052700
Authority: WO
Inventors: 親是鶴野; 永井　慎也; 美菜子寺尾; 知佳水田; 拓也京藤
Original assignee: シスメックス株式会社
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2015-09-03
Also published as: US20160363586A1; CN106030305A; CN111398602A; US11378574B2; JP2015179064A; EP3112868A4; CN111398601A; KR20160126055A; EP3112868B1; EP3112868A1; JP2019191187A; JP6947780B2; JP6545960B2; KR101939891B1; US20220299502A1

Abstract

　本発明は、特定の糖鎖を含む糖タンパク質などの検出に有用な標的物質の検出方法、標的物質の検出用試薬、担体および当該担体の製造方法に関する。

Description

糖鎖を含む標的物質の検出用試薬、検出方法、および糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体ならびにその製造方法

　本発明は、標的物質の検出用試薬に関する。より詳しくは、本発明は、特定の糖鎖を含む糖タンパク質などの検出に有用な標的物質の検出方法、標的物質の検出用試薬、担体および当該担体の製造方法に関する。

　糖鎖は、一般的に、グリコシド結合によって共有結合した複数の単糖から構成される化合物である。かかる糖鎖は、例えば、タンパク質または脂質と結合して糖タンパク質または糖脂質を形成する。

　糖鎖を含む標的物質などを分析する方法としては、例えば、糖鎖と結合するレクチンを用いて当該糖鎖または標的物質を分析する方法が提案されている（例えば、特許文献１および２を参照）。

　特許文献１に記載の方法は、糖鎖に相互作用を示すタンパク質と糖鎖または複合糖質上の糖鎖との相互作用を利用して糖鎖構造を解析する方法である。特許文献１に記載の方法では、前記糖鎖に相互作用を示すタンパク質であるレクチンが、エポキシ基を活性基として有する化合物を介して基板に固定化されたアレイが用いられている。

　また、特許文献２に記載の方法は、糖タンパク質であるＭａｃ－２結合タンパク質（Ｍａｃ－２－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、「Ｍ２ＢＰ」ともいう）の糖鎖と結合するレクチンであるウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（以下、「ＷＦＡ」ともいう）などを用いてＭ２ＢＰを測定する方法である。特許文献２に記載の方法では、前記レクチンとして、前記レクチンにビオチンが結合したビオチン化レクチンがストレプトアビジンを介して固定化された磁性粒子、前記レクチンが固定化されたアレイなどが用いられている。

　これらの特許文献１および２に記載の方法では、レクチンの活性を十分に発現させて糖鎖を検出するために、天然のレクチンのサブユニット構造を保持した状態で当該レクチンが固相に固定化されている。

米国特許出願公開第２００７／２０２５３５号明細書米国特許出願公開第２０１２／１７２２４７号明細書

　しかし、レクチンは、糖鎖との反応に際して、立体構造が維持されていることを必要とするが、溶液中で長期間にわたって立体構造を安定的に維持することが難しく、十分な反応性を確保しにくい。

　本発明は、前記従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、標的物質に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れる標的物質の検出用試薬、標的物質を検出するために用いられる担体および当該担体の製造方法ならびに高い感度および高い再現性を確保することができる標的物質の検出方法を提供することを目的とする。

　本発明の１つの側面は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出するための試薬であって、ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡが固相担体に固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体を含有していることを特徴とする標的物質の検出用試薬を含む。

　本実施形態に係る標的物質の検出用試薬は、２量体ＷＦＡ固定化担体を含有しているので、糖鎖、特に、末端にＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン〔ＩＵＰＡＣ名：２－（アセチルアミノ）－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース〕残基（以下、「ＧａｌＮＡｃ残基」ともいう）を有する糖鎖への結合能を維持しながらも、天然に存在するＷＦＡ（４量体ＷＦＡ）が固相担体に固定化された担体を含有する試薬と比べて当該糖鎖に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れている。したがって、本実施形態に係る標的物質の検出用試薬を、糖鎖を含む標的物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。

　本実施形態に係る標的物質の検出用試薬においては、２量体ＷＦＡが、ビオチンとビオチン結合タンパク質とを介して固相担体に固定化されていることが好ましい。
　また、本実施形態に係る標的物質の検出用試薬においては、２量体ＷＦＡがビオチン化２量体ＷＦＡであり、かつ固相担体にビオチン結合タンパク質が固定化されており、ビオチン化２量体ＷＦＡがビオチン結合タンパク質を介して固相担体に固定化されていることが好ましい。

　本発明の他の側面は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質の検出方法であって、（Ａ）ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡが固相担体に固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体と、標的物質を含む試料と、標的物質に特異的に結合する標識物質とを接触させることにより、固相担体上に２量体ＷＦＡと標的物質と標識物質とを含む複合体を形成させる工程、および（Ｂ）工程（Ａ）で得られた複合体中の標識物質を測定することにより、標的物質を検出する工程を含むことを特徴とする標的物質の検出方法を含む。

　本実施形態に係る標的物質の検出方法は、２量体ＷＦＡ固定化担体と、標的物質を含む試料とを接触させることにより、固相担体上に２量体ＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成させるという操作が採用されている。かかる操作が採用されているので、本実施形態に係る標的物質の検出方法によれば、高い反応性で効率よく２量体ＷＦＡと標的物質の糖鎖とを結合させることができる。したがって、本実施形態に係る標的物質の検出方法によれば、高い感度を確保することができる。また、２量体ＷＦＡ固定化担体に用いられている２量体ＷＦＡは、保存安定性に優れている。したがって、本実施形態に係る標的物質の検出方法によれば、高い再現性を確保することができる。

　本実施形態に係る標的物質の検出方法においては、標識物質が、標的物質に特異的に結合する標識抗体であることが好ましい。

　本発明のさらに他の側面は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体であって、ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡと、固相担体とを有し、２量体ＷＦＡが固相担体上に固定化されていることを特徴とする担体を含む。

　本実施形態に係る担体では、２量体ＷＦＡが固相担体上に固定化されている。そのため、本実施形態に係る担体は、天然に存在するＷＦＡ（４量体ＷＦＡ）が固相担体に固定化された担体と比べて当該糖鎖に対する高い反応性を有し、保存安定性に優れている。したがって、本実施形態に係るＷＦＡ固定化試薬を、糖鎖を含む標的物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。

　本発明の別の側面では、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体の製造方法であって、（Ｉ）ＷＦＡを２量体化して２量体ＷＦＡを得る工程、および（ＩＩ）工程（Ｉ）で得られた２量体ＷＦＡを固相担体に固定化して２量体ＷＦＡ固定化担体を得る工程を含むことを特徴とする担体の製造方法を含む。

　本実施形態に係る担体の製造方法は、ＷＦＡを２量体化し、得られた２量体ＷＦＡを固相担体に固定化するという操作が採用されている。かかる操作が採用されているので、本実施形態に係る担体の製造方法によれば、天然に存在するＷＦＡ（４量体ＷＦＡ）が固定化された担体と比べて当該糖鎖に対する高い反応性を有し、かつ保存安定性に優れたＷＦＡ固定化担体を得ることができる。

　本実施形態に係る担体の製造方法においては、工程（Ｉ）において、ビオチンを含む架橋剤を含有する溶液と、ＷＦＡとを混合して、ビオチン化２量体ＷＦＡを調製することが好ましい。
　また、本実施形態に係る担体の製造方法においては、工程（ＩＩ）において、固相担体として、ビオチン結合タンパク質が固定化された担体を用い、担体中のビオチン結合タンパク質とビオチン化２量体ＷＦＡとを結合させることによって２量体ＷＦＡを固相担体に固定化することが好ましい。

　また、本実施形態に係る担体の製造方法においては、工程（Ｉ）において、架橋剤を含有する溶液と、ＷＦＡとを、〔ＷＦＡ／架橋剤〕のモル比が１／１０以下（ただし０を含まない）となるように接触させることにより、２量体ＷＦＡを得ることが好ましい。

　さらに、本実施形態に係る担体の製造方法においては、架橋剤が、２量体ＷＦＡ中のアミノ基と架橋を形成する架橋剤であることが好ましい。かかる架橋剤は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、オキシエチレン基、炭素数１～４のクロロアルキル基、アルデヒド基およびカルボキシル基からなる群より選ばれた少なくとも１種の官能基を２量体ＷＦＡ中のアミノ基に対する反応基として有していることが好ましい。
　また、ビオチンと反応基とが、スペーサーを介して結合していることが好ましい。

　本発明によれば、標的物質に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れる標的物質の検出用試薬、標的物質を検出するために用いられる担体および当該担体の製造方法ならびに高い感度および高い再現性を確保することができる標的物質の検出方法を提供することができる。

試験例１において、ＷＦＡと架橋剤との混合比と、反応産物の予想分子量との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例２において、Ｍ２ＢＰを標的物質として用いたときのＷＦＡ感作濃度と発光強度との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例３において、Ｍ２ＢＰを標的物質として用いたときの２量体ＷＦＡ感作濃度と発光強度との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例４において、Ｍ２ＢＰを標的物質として用いたときの残存活性の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。試験例５において、Ｍｕｃ－１を標的物質として用いたときの残存活性の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。試験例６において、Ｍｕｃ－１を標的物質として用いたときの残存活性の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。試験例７において、胆管がん患者の検体１を用い、２量体ＷＦＡ感作濃度とＭｕｃ－１に対する相対反応性との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例７において、胆管がん患者の検体２を用い、２量体ＷＦＡ感作濃度とＭｕｃ－１に対する相対反応性との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例７において、胆管がん患者の検体３を用い、２量体ＷＦＡ感作濃度とＭｕｃ－１に対する相対反応性との関係を調べた結果を示すグラフである。

（標的物質の検出用試薬）
　本実施形態の標的物質の検出用試薬（以下、「本実施形態の試薬」ともいう）は、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む標的物質を検出するための試薬であって、前記ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡが固相担体に固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体を含有していることを特徴としている。

　天然に存在するウィステリア・フロリブンダのレクチンは、４つのサブユニットから構成される４量体のタンパク質である。本明細書において、特に断りのない限り、４量体のウィステリア・フロリブンダのレクチンを単に「ＷＦＡ」と表記するか、あるいは「４量体ＷＦＡ」と表記する。また、本明細書において、４量体ＷＦＡを２量体化することによって得られた産物を、「２量体ＷＦＡ」と表記する。

　ＷＦＡ（４量体ＷＦＡ）は、末端にＧａｌＮＡｃ残基を有する糖鎖と結合する〔ピラー（Ｐｉｌｌｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９１、４６１－４６６（１９９０）参照〕。また、ＷＦＡ（４量体ＷＦＡ）は、末端にガラクトース（Ｇａｌ）残基を有する糖鎖とも結合する。本実施形態においては、好ましくはＧａｌＮＡｃ残基を有する糖鎖を標的物質とする。本発明者らは、４量体ＷＦＡを２量体化して得られた２量体ＷＦＡも、上記のような糖鎖に結合する活性を有していることを見出した。また、本発明者らは、前記２量体ＷＦＡを固定化した固相担体を用いた試薬が、４量体ＷＦＡを固定化した固相担体を用いた試薬と比べて高い反応性を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、当該試薬の保存安定性が４量体ＷＦＡを用いた試薬の保存安定性と比べて顕著に高いことを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。

　このように、本実施形態の試薬は、２量体ＷＦＡが固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体を含有しているので、前記糖鎖に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れている。したがって、本実施形態の標的物質の検出用試薬を、糖鎖を含む標的物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。

　本明細書において、前記ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質は、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含む物質である。前記ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質としては、例えば、Ｍ２ＢＰ、α１酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、Ｍｕｃ－１、神経細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＫＬ－６抗原などの糖タンパク質や糖脂質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。これらの標的物質は、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含み、ＷＦＡと結合する点で共通している。
　Ｍ２ＢＰおよびＡＧＰは、肝臓の線維化や肝臓がんのマーカーとして用いられる。したがって、本実施形態の試薬によるＭ２ＢＰおよびＡＧＰの検出結果は、被験者の肝臓の線維化レベルを判定する指標となり得る。
　Ｍｕｃ－１は、胆管がんのマーカーとして用いられる。したがって、本実施形態の試薬によるＭｕｃ－１の検出結果は、被験者の胆管が胆管がんを有しているか否かの指標となり得る。
　Ｌ１ＣＡＭは、胆管がん、大腸癌、乳癌、神経系または中皮性の腫瘍などの腫瘍マーカーとして用いられる。したがって、本実施形態の試薬によるＬ１ＣＡＭの検出結果は、被検者の胆管、大腸、乳房、神経系、中皮などが腫瘍を有しているか否かの指標となり得る。
　ＫＬ－６抗原は、間質性肺炎のマーカーとして用いられる。したがって、本実施形態の試薬によるＫＬ－６抗原の検出結果は、被検者の肺臓の線維化レベルを判定する指標となり得る。

　本実施形態の試薬に用いられる固相担体は、粒子、基板、メンブレンなどであってよい。粒子としては、例えば、磁性粒子、ポリスチレン粒子、ラテックス粒子などが用いられる。基板としては、例えば、ガラス基板、シリコン基板、ポリスチレン製のプレートなどが用いられる。メンブレンとしては、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ポリフッ化ビニリデンメンブレンなどが用いられる。固相担体として粒子を用いる場合は、当該粒子は溶媒中に分散されていることが好ましい。溶媒としては、例えば、精製水、緩衝液などが例示される。上記の固相担体のうち、固相担体と反応液との分離および溶媒の置換が容易であることから、磁性粒子を用いることが好ましい。

　固相担体として前記磁性粒子を用いる場合、当該磁性粒子の平均粒子径は、本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体の用途などによって異なることから、２量体ＷＦＡ固定化担体の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。前記磁性粒子の平均粒子径は、通常、１～３μｍ、好ましくは１．５～２．５μｍ、より好ましくは１．８～２．２μｍである。なお、前記平均粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＳＡＬＤシリーズ〕を用いて光散乱法によって測定することによって求められた値である。

　前記２量体ＷＦＡは、ビオチンとビオチン結合タンパク質とを介して前記固相担体に固定化されていることが好ましい。ビオチン結合タンパク質は、ビオチンへの結合性を有するものであれば特に限定されないが、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン（登録商標）などが例示される。
　ビオチンとビオチン結合タンパク質とを用いる場合、前記２量体ＷＦＡがビオチン化２量体ＷＦＡであり、かつ前記固相担体にビオチン結合タンパク質が固定化されており、前記ビオチン化２量体ＷＦＡが前記ビオチン結合タンパク質を介して前記固相担体に固定化されているものであることが好ましい。この場合、固相担体に固定化するビオチン結合タンパク質の量は、２量体ＷＦＡ固定化担体の用途などによって異なることから、２量体ＷＦＡ固定化担体の用途などに応じて適宜決定することができる。

　本実施形態の試薬における２量体ＷＦＡ固定化担体の含有量は、本実施形態の試薬の用途などによって異なることから、本実施形態の試薬の用途に応じて適宜決定することが望ましい。本実施形態の試薬における２量体ＷＦＡ固定化担体の含有量は、結合可能量の観点から、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．４８質量％以上であり、自動分析機における攪拌効率の観点から、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。

　本実施形態の試薬は、標識物質を含んでいてもよい。標識物質は、シグナル発生物質と、標的物質結合部とを含む。シグナル発生物質は、標的物質結合部を介して標的物質に結合している。

　シグナル発生物質は、シグナルを生じる物質であってもよいし、シグナルを生じさせる物質を有していてもよい。シグナルを生じる物質としては、具体的には、蛍光色素、放射性同位体などが挙げられる。シグナルを生じさせる物質は、化学反応を触媒することによって反応液に発光、蛍光、発色などのシグナルを生じさせる物質であればよい。シグナルを生じさせる物質としては、具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素が例示される。当該酵素を用いる場合は、酵素に基質を反応させ、反応産物から生じる発光、蛍光または発色が検出される。

　標的物質結合部は、標的物質に特異的に結合するものであれ、特に限定されない。標的物質結合部としては、好適には標的物質に特異的に結合する抗体が用いられる。標的物質結合部は、標的物質に特異的に結合する一次物質（例えば、抗体など）と、一次物質に結合し、かつシグナル発生物質を含む物質（例えば、標識抗体など）とから構成されていてもよい。この場合、シグナル発生物質は、２種類の抗体を介して標的物質に結合することとなる。なお、３種類以上の抗体を介して標的物質に結合させることも可能であるが、反応工程が多くなり、検出感度の低下などを招く可能性を考慮に入れる必要がある。標的物質結合部として用いられる抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法〔ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ　Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｅｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、１９９２年発行〕などに記載の慣用の方法により、糖鎖を含む標的物質の全部または一部、当該標的物質とＷＦＡとの結合部位を用いて動物を免疫することによって容易に作製することができる。標識物質による前記抗体の標識は、標識物質の種類に応じた手法に容易に行なうことができる。なお、本実施形態においては、前記抗体の代わりに、当該抗体を精製後、ペプチダーゼなどにより処理することによって得られた抗体断片を用いてもよい。

　前記標識物質は、好ましくは前記標的物質に特異的に結合する標識抗体である。

　また、本実施形態の試薬は、安定化剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、非特異反応抑制剤、防腐剤などを適宜含有していてもよい。

　２量体ＷＦＡ固定化担体および標識物質は、それぞれ別容器に収容された試薬キットとしても提供され得る。本明細書において、「試薬」は、試薬キットをも含む。また、試薬キットは別容器に収容された洗浄液を含んでいてもよい。標識物質が酵素を有する場合は、当該酵素に対する基質をさらに含んでいてもよい。

　以上説明したように、本実施形態の試薬は、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れていることから、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含む物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。したがって、本実施形態の試薬は、糖鎖を含む標的物質、特に、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含む標的物質の検出（定性的検出または定量的検出）に有用である。

（２量体ＷＦＡ固定化担体およびその製造方法）
　本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体であって、２量体ＷＦＡと、固相担体とを有し、前記２量体ＷＦＡが前記固相担体上に固定化されていることを特徴としている。

　このように、本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体は、前記２量体ＷＦＡが前記固相担体上に固定化されているので、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖に対して高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れている。本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化試薬を、当該糖鎖を含む標的物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。

　本実施形態の２量体ＷＦＡ固相担体は、上述した本実施形態の試薬に含まれる２量体ＷＦＡ固定化担体と同様である。

　つぎに、本実施形態の担体（量体ＷＦＡ固相担体）の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」ともいう）を説明する。本実施形態の製造方法は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる２量体ＷＦＡ固定化担体の製造方法であって、
（Ｉ）　前記ＷＦＡを２量体化して２量体ＷＦＡを得る工程、および
（ＩＩ）　前記工程（Ｉ）で得られた２量体ＷＦＡを固相担体に固定化して２量体ＷＦＡ固定化担体を得る工程、
を含むことを特徴としている。

　本実施形態の製造方法では、まず、ＷＦＡを２量体化して２量体ＷＦＡを得る〔工程（Ｉ）〕。前記工程（Ｉ）は、４量体ＷＦＡを２量体化させる方法によって行なわれる。一般的に、タンパク質のサブユニットの解離は、タンパク質中のスルフヒドリル基と反応するスルフヒドリル試薬（ＳＨ試薬）によって行なわれることが多い。しかし、本実施形態においては、ビオチンを含む架橋剤と、４量体ＷＦＡとを接触させることによって、効率よく４量体ＷＦＡを２量体化させることができる。

　前記工程（Ｉ）において、ビオチンを含む架橋剤を用いる場合、前記架橋剤は、前記４量体ＷＦＡ中のアミノ基と架橋を形成する架橋剤であることが好ましい。前記架橋剤としては、具体的には、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、オキシエチレン基、炭素数１～４のクロロアルキル基、アルデヒド基およびカルボキシル基からなる群より選ばれた少なくとも１種の官能基を前記４量体ＷＦＡ中のアミノ基に対する反応基として有している架橋剤が例示される。前記架橋剤を用いると、効率よく４量体ＷＦＡを２量体化させることが可能である。

　前記ビオチンを含む架橋剤は、ＷＦＡとの反応性、製造時における取り扱い性および標的物質の検出時における反応性を向上させる観点から、ビオチンと前記反応基とがスペーサーを介して結合しているものが好ましい。かかるスペーサーとしては、例えば、アミノヘキサノイル基（すなわち、アミノカプロイル基）などが挙げられるが、特に限定されない。

　また、前記工程（Ｉ）において、前記架橋剤を用いる場合、架橋剤を含有する溶液と、前記ＷＦＡとを接触させることにより、２量体ＷＦＡを得ることができる。具体的には、前記工程（Ｉ）において、前記ビオチンを含む架橋剤を用いる場合、当該ビオチンを含む架橋剤を含有する溶液と、ＷＦＡとを混合して、ビオチンを含む２量体ＷＦＡ（例えば、ビオチン化２量体ＷＦＡなど）を調製することができる。〔ＷＦＡ／架橋剤〕のモル比は、好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下である。一方、前記〔ＷＦＡ／架橋剤〕のモル比の下限値は、ＷＦＡ固定化担体の用途などに応じて２量体ＷＦＡが得られる範囲で適宜決定することできる。前記〔ＷＦＡ／架橋剤〕のモル比は、架橋剤の使用量と生成する２量体ＷＦＡの収率とのバランスを考慮すると、１／１００以上とすることができる。

　つぎに、前記工程（Ｉ）で得られた２量体ＷＦＡを固相担体に固定化して２量体ＷＦＡ固定化担体を得る〔工程（ＩＩ）〕。固相担体への２量体ＷＦＡの固定化は、特に限定されるものではなく、例えば、ビオチンとビオチン結合タンパク質との特異的結合、静電相互作用、疎水的な相互作用、水素結合、共有結合、変性作用による物理的吸着などを利用することができる。

　工程（Ｉ）において、ビオチンを含む架橋剤を含有する溶液と、ＷＦＡとを混合して、ビオチンを含む２量体ＷＦＡを調製した場合には、工程（ＩＩ）において、前記固相担体として、ビオチン結合タンパク質が固定化された担体を用い、当該担体中のビオチン結合タンパク質と前記ビオチン化２量体ＷＦＡとを結合させることによって前記２量体ＷＦＡを前記固相担体に固定化することが好ましい。

　以上説明したように、本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体は、天然に存在するＷＦＡが固定化された担体と比べ、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖に対する高い反応性を有し、しかも保存安定性に優れている。よって、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含む物質の検出に用いることにより、高い感度および高い再現性を得ることができる。したがって、本実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体は、糖鎖を含む標的物質、特に、末端にＧａｌＮＡｃ残基またはＧａｌ残基を有する糖鎖を含む標的物質の検出（定性的検出または定量的検出）に有用である。

（標的物質の検出方法）
　本実施形態の検出方法は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質を検出する方法（以下、「本実施形態の検出方法」ともいう）である。

　本実施形態の検出方法では、まず、２量体ＷＦＡ固定化担体と、前記標的物質を含む試料と、標識物質とを接触させることにより、前記固相担体上に前記２量体ＷＦＡと前記標的物質と標識物質とを含む複合体を形成させる〔工程（Ａ）〕。

　工程（Ａ）では、２量体ＷＦＡ固定化担体として、前述した実施形態の２量体ＷＦＡ固定化担体を用いることができる。

　工程（Ａ）では、標識物質として、前述した本実施形態の試薬に含まれる標識物質を用いることができる。

　工程（Ａ）では、２量体ＷＦＡ固定化担体と、標的物質を含む試料と、標識物質との接触順序は特に限定されない。即ち、前記接触順序は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれであってもよい：
　（ａ）まず、２量体ＷＦＡ固定化担体と試料とを接触させた後、得られた混合物に標識物質を接触させること、
　（ｂ）まず、２量体ＷＦＡ固定化担体と標識物質とを接触させた後、得られた混合物に試料を接触させること、
　（ｃ）まず、試料と標識物質とを接触させた後、得られた混合物に２量体ＷＦＡ固定化担体を接触させること。

　前記工程（Ａ）において、前記試料と接触させる前記２量体ＷＦＡ固定化担体の量は、当該試料の種類、前記２量体ＷＦＡ固定化担体中の２量体ＷＦＡの量、２量体ＷＦＡ固定化担体の保存状態（液体保存または凍結乾燥保存）などによって異なることから、当該試料の種類、前記２量体ＷＦＡ固定化担体中の２量体ＷＦＡの量、２量体ＷＦＡ固定化担体の保存状態（液体保存または凍結乾燥保存）などに応じて適宜決定することが望ましい。

　前記試料と前記２量体ＷＦＡ固定化担体との接触時における温度は、２量体ＷＦＡの立体構造が維持され、かつ２量体ＷＦＡと糖鎖との結合反応を行なうのに適した温度であればよい。前記温度は、通常、４～５０℃、好ましくは１５～４２℃である。

　前記試料と前記２量体ＷＦＡ固定化担体との接触後、得られた産物を洗浄して、複合体を形成していない遊離の標的物質および遊離の２量体ＷＦＡ固定化担体を除去することが好ましい。前記産物の洗浄に用いられる洗浄剤としては、例えば、緩衝剤、界面活性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを含む洗浄剤；精製水などが挙げられるが、特に限定されない。

　つぎに、前記工程（Ａ）で得られた複合体中の標的物質を検出する〔工程（Ｂ）〕。

　前記工程（Ｂ）において、複合体中の標識物質から生じるシグナルを測定することによって複合体中の標的物質を検出することができる。標識物質が蛍光色素や放射性同位体を含む場合は、蛍光や放射能などのシグナルを測定することができる。また、標識物質が酵素である場合は、複合体に酵素の基質を反応させ、酵素反応の産物から生じる発光、蛍光、発色などのシグナルを測定することができる。測定結果は標的物質の量と相関するため、標的物質を定性的または定量的に検出することができる。

　以下、実施例などにより、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において、平均粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＳＡＬＤシリーズ〕を用いて光散乱法によって測定することによって求められた値である。

（実験例１）
　ＷＦＡ〔ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）社製、商品名：Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ〕を当該ＷＦＡの濃度が２．５ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、ＷＦＡ含有溶液を得た。

　得られたＷＦＡ含有溶液に、ビオチンを含む架橋剤である５－（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルＤ－ビオチンアミド〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ－ＡＣ５－Ｏｓｕ〕をＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１００となるように添加した。得られた溶液を２５℃で９０分間インキュベーションすることにより、前記ＷＦＡと前記ビオチンを含む架橋剤とを反応させ、反応産物を得た。

（実験例２～５）
　実験例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を５／１００（実験例２）、１０／１００（実験例３）、２５／１００（実験例４）または５０／１００（実験例５）としたことを除き、実験例１と同様の操作を行ない、反応産物を得た。

（試験例１）
　実験例１～５で得られた反応産物を、高速液体クロマトグラフィーにより、以下の条件で分析し、反応産物の予想分子量を求めた。
・溶出溶媒：リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
・分離カラム：ゲル濾過カラム
　　　　〔東ソー（株）製、商品名：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷＸＬ〕
・分子量マーカー：サイログロブリン（分子量６６９０００）
　　　　　　　　　γ－グロブリン（分子量１５８０００）
　　　　　　　　　オバルブミン（分子量４４０００）
　　　　　　　　　ミオグロビン（分子量１７０００）
　　　　　　　　　ビタミン１２（分子量１３０００）

　試験例１において、ＷＦＡと架橋剤との混合比と、反応産物の予想分子量との関係を調べた結果を図１に示す。なお、ビオチン化された４量体のＷＦＡ（以下、「ビオチン化４量体ＷＦＡ」ともいう）の分子量の理論値は、１１６０００である。また、ビオチン化された２量体のＷＦＡ（以下、「ビオチン化２量体ＷＦＡ」ともいう）の分子量の理論値は、５８０００である。ビオチン化された単量体のＷＦＡ（以下、「ビオチン化単量体ＷＦＡ」ともいう）の分子量の理論値は、２９０００である。

　図１に示されるように、ＷＦＡと架橋剤との混合比（体積比）が２５／１００以上である場合（実験例４および５）、反応産物の予想分子量が１２２０００であることから、実験例４および５で得られた反応産物は、ビオチン化４量体ＷＦＡであることが示唆される。

　一方、ＷＦＡと架橋剤との混合比が２５／１００未満である場合（実験例１～３）、当該混合比が減少するほど、反応産物の予想分子量が減少する傾向にあることがわかる。ＷＦＡと架橋剤との混合比が１／１００である場合（実験例１）の反応産物の予想分子量が５６０００であることから、実験例１で得られた反応産物は、ビオチン化２量体ＷＦＡであることが示唆される。また、前記混合比が５／１００である場合（実験例２）の反応産物の予想分子量が６４０００であることから、実験例２で得られた反応産物は、ほとんどが２量体化ＷＦＡであることが示唆される。さらに、前記混合比が１０／１００である場合（実験例３）の反応産物の予想分子量が９６０００であることから、実験例３で得られた反応産物は、ビオチン化２量体ＷＦＡとビオチン化４量体ＷＦＡとの混合物であることが示唆される。

　したがって、これらの結果から、ＷＦＡと架橋剤との混合比（体積比）が１０／１００以下である場合、ビオチン化２量体ＷＦＡが得られることが示唆される。

（実施例１）
（１）ＷＦＡ含有溶液の調製
　ＷＦＡ〔ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）社製、商品名：Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ〕を２．５ｍｇ／ｍＬとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、ＷＦＡ含有溶液を得た。

（２）ＷＦＡと架橋剤との反応
　実施例１（１）で得られたＷＦＡ含有溶液に、ビオチンを含む架橋剤としてビオチンと反応基とがスペーサーを介して結合している架橋剤である５－（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルＤ－ビオチンアミド〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ－ＡＣ５－Ｏｓｕ〕をＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１００となるように添加した。得られた溶液を２５℃で９０分間インキュベーションすることにより、前記ＷＦＡと前記架橋剤とを反応させ、反応産物を得た。

（３）ビオチン化２量体ＷＦＡの精製
　実施例１（２）で得られた反応産物を、高速液体クロマトグラフィーにより、以下の条件で精製し、ビオチン化２量体ＷＦＡを得た。
・溶出溶媒：リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
・分離カラム：ゲル濾過カラム
　　　　〔東ソー（株）製、商品名：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷＸＬ〕

（４）ＳＴＡ結合粒子含有液の調製
　ストレプトアビジンが磁性粒子（平均粒子径２μｍ）の表面に固定化された複合体（磁性粒子１ｇあたりのストレプトアビジンの量：２．９～３．５ｍｇ；以下、「ＳＴＡ結合磁性粒子」ともいう）を０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で３回洗浄した。洗浄後のＳＴＡ結合磁性粒子をＳＴＡ濃度が１８～２２μｇ／ｍＬ（ＳＴＡ結合磁性粒子の濃度が０．４８～０．５２ｍｇ／ｍＬ）となるように０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、ＳＴＡ結合粒子含有液を得た。

（５）２量体ＷＦＡ固定化担体の調製
　実施例１（３）で得られたビオチン化２量体ＷＦＡを当該ビオチン化２量体ＷＦＡの濃度（２量体ＷＦＡ感作濃度）が５μｇ／ｍＬ（実験番号１－１）、１０μｇ／ｍＬ（実験番号１－２）、２０μｇ／ｍＬ（実験番号１－３）または３０μｇ／ｍＬ（実験番号１－４）となるように実施例１（４）で得られたＳＴＡ結合粒子含有液に添加し、ＳＴＡ結合磁性粒子のストレプトアビジンとビオチン化２量体ＷＦＡのビオチンとを結合させた。得られた産物を０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で３回洗浄し、２量体ＷＦＡ固定化担体を得た。得られた２量体ＷＦＡ固定化担体をＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などのグッドバッファー；リン酸緩衝液などに懸濁し、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（比較例１）
（１）ＷＦＡの還元およびビオチン化
　還元剤〔３５０ｍＭ　２－メルカプトエチルアミン、ナカライテスク（株）製、商品名：２‐メルカプトエチルアミン塩酸塩〕８８μＬとＷＦＡ〔ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）社製、商品名：Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ〕２０００μｇとを混合し、２５℃で９０分間インキュベーションすることにより、ＷＦＡを還元した。つぎに、得られた還元ＷＦＡをＮ－ビオチニル-Ｎ’－［２－（Ｎ－マレイミド）エチル］ピペラジン塩酸塩〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥ－ｍａｌｅｉｍｉｄｅ〕によってビオチン化し、反応産物を得た。

（２）予測分子量の算出
　試験例１において、実験例１～５で得られた反応産物を用いる代わりに、比較例１（１）で得られた反応産物を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、反応産物の予想分子量を求めた。その結果、比較例１（１）で得られた反応産物の予想分子量が２９０００であったことから、比較例１（１）で得られた反応産物は、ビオチン化単量体ＷＦＡであることが示唆される。

（３）ビオチン化単量体ＷＦＡの精製
　実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた反応産物を用いる代わりに、比較例１（１）で得られた反応産物を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、ビオチン化単量体ＷＦＡを得た。

（４）単量体ＷＦＡ固定化担体の調製
　比較例１（３）で得られたビオチン化単量体ＷＦＡを当該ビオチン化単量体ＷＦＡの濃度（単量体ＷＦＡ感作濃度）が５μｇ／ｍＬ（実験番号２－１）、１０μｇ／ｍＬ（実験番号２－２）、２０μｇ／ｍＬ（実験番号２－３）または３０μｇ／ｍＬ（実験番号２－４）となるように実施例１（４）で得られたＳＴＡ結合粒子含有液に添加し、ＳＴＡ結合磁性粒子のストレプトアビジンとビオチン化単量体ＷＦＡのビオチンとを結合させた。得られた産物を０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で３回洗浄し、単量体ＷＦＡ固定化担体を得た。この単量体ＷＦＡ固定化担体を０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）などに懸濁し、単量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（比較例２）
　ＷＦＡ〔ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベクター・ラボラトリーズ）社製、商品名：Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ　Ｌｅｃｔｉｎ〕を５μｇ／ｍＬ（実験番号３－１）、１０μｇ／ｍＬ（実験番号３－２）、２０μｇ／ｍＬ（実験番号３－３）または３０μｇ／ｍＬ（実験番号３－４）となるように実施例１（４）で得られたＳＴＡ結合粒子含有液に添加し、ＳＴＡ結合磁性粒子のストレプトアビジンとビオチン化４量体ＷＦＡのビオチンとを結合させた。得られた産物を０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で３回洗浄し、４量体ＷＦＡ固定化担体を得た。この４量体ＷＦＡ固定化担体を０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）などに懸濁し、４量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（試験例２）
　０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬと被検試料〔０．１～１００μｇ／ｍＬ糖タンパク質Ｍ２ＢＰ含有水溶液〕１０μＬとを混合し、４２℃で２分間インキュベーションした。

　得られた混合物に、実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１－１～１－４）、比較例１で得られた単量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号２－１～２－４）または比較例２で得られた４量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号３－１～３－４）３０μＬを添加した。これを４２℃で１分間インキュベーションして被検試料中のＭ２ＢＰと２量体ＷＦＡ固定化担体、単量体ＷＦＡ固定化担体または４量体ＷＦＡ固定化担体とを反応させた。

　得られた反応産物を洗浄液〔２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）と０．１質量％　Ｔｗｅｅｎ２０と０．１質量％アジ化ナトリウムと０．８質量％塩化ナトリウムとを含む水溶液〕１００～７００μＬで４回洗浄した。

　洗浄後、０．１Ｕ／ｍＬアルカリホスファターゼ標識抗Ｍ２ＢＰ抗体溶液（抗体濃度０．０１～１００μｇ／ｍL）１００μＬを添加した。得られた混合物を４２℃で２．５分間インキュベーションした。その後、前記洗浄液１００～７００μＬで４回洗浄した。

　洗浄後、反応溶液〔０．１Ｍ　２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール（ｐＨ９．６）と１ｍＭ塩化マグネシウムと０．１質量％アジ化ナトリウムとを含む水溶液〕５０μＬおよび基質含有溶液〔アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ＣＤＰ－Ｓｔａｒ　ｗｉｔｈ　Ｓａｐｐｈｉｒｉｎｅ－ＩＩ〕１００μＬを添加した。これを４２℃で５分間インキュベーションしアルカリホスファターゼ反応を行なった。

　その後、全自動免疫測定装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ－２０００ｉ〕を用い、波長３００～６５０ｎｍにおける発光強度を測定した。

　試験例２において、Ｍ２ＢＰを標的物質として用いたときのＷＦＡ感作濃度と発光強度との関係を調べた結果を図２に示す。図中、白三角は実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１－１～１－４）を用いたときの発光強度、白四角は比較例１で得られた単量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号２－１～２－４）を用いたときの発光強度、白丸は比較例２で得られた４量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号３－１～３－４）を用いたときの発光強度を示す。

　図２に示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体を用いた場合（白三角）、感作濃度１０μｇ／ｍＬ以上であれば、感作濃度にかかわらず高い発光強度が得られることがわかる。これに対し、単量体ＷＦＡ固定化担体または４量体ＷＦＡ固定化担体を用いた場合は、感作濃度１０μｇ／ｍＬ以上では高い発光強度を示すが、感作濃度２０μｇ／ｍＬ以上では発光強度が大きく低下することがわかる。

　前記発光強度の低下は、高い感作濃度によってＭ２ＢＰとレクチンとの結合に何らかの立体構造上の障害が生じたことが原因と予想される。すなわち、感度を向上させるために多量の単量体ＷＦＡまたは４量体ＷＦＡを使用しても、逆に感度が低下することとなる。一方、２量体ＷＦＡは、高い感作濃度であってもＭ２ＢＰとの結合を阻害するような障害は生じていないと考えられ、高感度化のために多量のレクチンを固相担体上に感作することができることがわかる。

（実施例２）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１０〔実験番号４－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号４－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号４－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号４－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例３）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／２０〔実験番号５－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号５－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号５－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号５－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例４）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／４０〔実験番号６－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号６－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号６－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号６－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例５）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／６０〔実験番号７－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号７－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号７－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号７－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例６）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／８０〔実験番号８－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号８－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号８－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号８－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例７）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１２０〔実験番号９－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号９－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号９－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号９－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例８）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１６０〔実験番号１０－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号１０－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号１０－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号１０－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（実施例９）
　実施例１において、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／１００とする代わりに、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）を１／２００〔実験番号１１－１（ＷＦＡ感作濃度５μｇ／ｍＬ）、実験番号１１－２（ＷＦＡ感作濃度１０μｇ／ｍＬ）、実験番号１１－３（２０μｇ／ｍＬ）もしくは実験番号１１－４（３０μｇ／ｍＬ）〕としたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を得た。

（試験例３）
　試験例２において、実施例１～９で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用いたことを除き、試験例２と同様の操作を行ない、発光強度を測定した。

　試験例３において、Ｍ２ＢＰを標的物質として用いたときのＷＦＡ感作濃度と発光強度との関係を調べた結果を図３に示す。図中、白ひし形はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号４－１～４－４）を用いたときの発光強度、白四角はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／２０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号５－１～５－４）を用いたときの発光強度、白三角はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／４０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号６－１～６－４）を用いたときの発光強度、クロスはＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／６０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号７－１～７－４）を用いたときの発光強度、白丸はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／８０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号８－１～８－４）を用いたときの発光強度、黒ひし形はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１００である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１－１～１－４）を用いたときの発光強度、黒四角はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１２０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号９－１～９－４）を用いたときの発光強度、黒三角はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／１６０である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１０－１～１０－４）を用いたときの発光強度、および黒丸はＷＦＡ／架橋剤（モル比）が１／２００である２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１１－１～１１－４）を用いたときの発光強度を示す。

　図３に示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用いたときの発光強度は、ＷＦＡ／架橋剤（モル比）による変動が比較的小さいことがわかる。

（試験例４）
　実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液〔ＷＦＡ感作濃度：２０μｇ／ｍＬ（実験番号１－３）〕を３７℃で１４日間インキュベーションし、継時的に採取した。採取された２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用い、試験例２と同様の操作を行ない、発光強度を測定した。

　つぎに、インキュベーション前の２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用いたときの発光強度（対照の発光強度）に対する所定時間経過後の２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用いたときの発光強度の相対値（２量体ＷＦＡ固定化担体の残存活性）を求め、残存活性の経時的変化を調べることにより、２量体ＷＦＡ固定化担体の保存安定性を評価した。

　また、前記において、実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を用いる代わりに、比較例２で得られた４量体ＷＦＡ固定化担体含有液〔ＷＦＡ感作濃度：１０μｇ／ｍＬ（実験番号１－２）〕を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、４量体ＷＦＡ固定化担体の保存安定性を評価した。

　経過時間０日時点でのＭ２ＢＰとの結合活性を１００としたときの残存活性を図４に示す。図中、黒四角は２量体ＷＦＡ固定化担体含有液の残存活性、黒ひし形は４量体ＷＦＡ固定化担体含有液の残存活性を示す。

　また、図４に示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体は、Ｍ２ＢＰとの結合活性について、インキュベーション開始から１４日間経過後において、高い残存活性を有していることがわかる。図４に示された結果から、２量体ＷＦＡ固定化担体の残存活性は、４量体ＷＦＡ固定化担体の結合活性に関する残存活性と比べて高いことがわかる。したがって、２量体ＷＦＡ固定化担体は、４量体ＷＦＡ固定化担体と比べて保存安定性に優れていることがわかる。

（試験例５）
（１）２量体ＷＦＡ固定化担体の保管
　実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を２～８℃に保たれた冷蔵庫内で保管した。保管開始から０か月経過時、１か月経過時、３か月経過時、６か月経過時および７か月経過時に２量体ＷＦＡ固定化担体含有液の一部を採取した。

（２）Ｍｕｃ－１との反応性に基づく２量体ＷＦＡ固定化担体の保存安定性の評価
　０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬと被検試料として胆管がん患者血清検体〔プロムデックス（ＰＲＯＭＭＤＤＸ）社製、商品名：Ｂｉｌｅｄｕｃｔ　ｃａｎｃｅｒ〕１０μＬとを混合した。この混合物を４２℃で２分間インキュベーションした。

　その後、試験例５（１）で採取された２量体ＷＦＡ固定化担体含有液３０μＬを添加した。これを４２℃で１分間インキュベーションすることにより、被検試料中のＭｕｃ－１と２量体ＷＦＡ固定化担体とを反応させた。

　この反応産物を洗浄液〔２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）と０．１質量％　Ｔｗｅｅｎ２０と０．１質量％アジ化ナトリウムと０．８質量％塩化ナトリウムとを含む水溶液〕１００～７００μＬで４回洗浄した。

　洗浄後、０．１Ｕ／ｍＬアルカリホスファターゼ標識抗Ｍｕｃ－１抗体溶液１００μＬを添加した。これを４２℃で２．５分間インキュベーションした。その後、前記洗浄液１００～７００μＬで４回洗浄した。

　洗浄後の反応産物に、反応溶液〔０．１Ｍ　２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール（ｐＨ９．６）と１ｍＭ塩化マグネシウムと０．１質量％アジ化ナトリウムとを含む水溶液〕５０μＬおよび基質含有溶液〔アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ＣＤＰ－Ｓｔａｒ　ｗｉｔｈ　Ｓａｐｐｈｉｒｉｎｅ－ＩＩ〕１００μＬを添加した。これを４２℃で５分間インキュベーションしアルカリホスファターゼ反応を行なった。

　その後、得られた反応産物について、全自動免疫測定装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ－２０００ｉ〕を用い、波長３００～６５０ｎｍにおける発光強度を測定した。

　経過時間０か月時点のＭｕｃ－１との結合活性を１００としたときの残存活性を図５に示す。

　図５に示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体は、保管開始から７か月経過後において、高い残存活性を有していた。したがって、２量体ＷＦＡ固定化担体は、保存安定性に優れていることがわかる。

（試験例６）
　実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液を２～８℃に保たれた冷蔵庫内で保管する代わりに３７℃でインキュベーションすること、保管開始から０か月経過時、１か月経過時、３か月経過時、６か月経過時および７か月経過時に２量体ＷＦＡ固定化担体含有液の一部を採取する代わりにインキュベーション開始から０日経過後、１日経過時、３日経過時、７日経過時および１４日経過時に２量体ＷＦＡ固定化担体含有液の一部を採取することを除き、試験例５と同様の操作を行ない、２量体ＷＦＡ固定化担体の保存安定性を評価した。

　経過時間０日時点でのＭｕｃ－１との結合活性を１００としたときの残存活性を図６に示す。

　図６に示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体は、インキュベーション開始から１４日間経過しても高い残存活性を維持していることがわかった。したがって、２量体ＷＦＡ固定化担体は、保存安定性に優れていることがわかる。

（試験例７）
　０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬと被検試料１０μＬとを混合し、得られた混合物を４２℃で２分間インキュベーションした。被検試料として、胆管がん患者検体１～３〔プロムデックス（ＰＲＯＭＭＤＤＸ）供給、商品名：Ｂｉｌｅｄｕｃｔ　ｃａｎｃｅｒ〕を用いた。

　その後、実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１－１～１－４）、比較例１で得られた単量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号２－１～２－４）または比較例２で得られた４量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号３－１～３－４）３０μＬを添加した。これらを４２℃で１分間インキュベーションして被検試料中のＭｕｃ－１と２量体ＷＦＡ固定化担体とを反応させた。

　その後、全自動免疫測定装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ－２０００ｉ〕を用い、波長３００～６５０ｎｍにおける発光強度を測定した。つぎに、ＷＦＡ感作濃度が５μｇ／ｍＬである２量体ＷＦＡ固定化担体含有液実験番号１－１）を用いたときの発光強度を１００としたときの相対反応性を求めた。

　試験例７において、Ｍｕｃ－１を標的物質として用いたときのＷＦＡ感作濃度と発光強度との関係を調べた結果を図７Ａ～Ｃに示す。図中、白丸は実施例１で得られた２量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号１－１～１－４）を用いたときの発光強度、白四角は比較例１で得られた単量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号２－１～２－４）を用いたときの発光強度、白三角は比較例２で得られた４量体ＷＦＡ固定化担体含有液（実験番号３－１～３－４）を用いたときの発光強度を示す。また、図７Ａは胆管がん患者の検体１を用いたときの２量体ＷＦＡ感作濃度と相対反応性との関係、図７Ｂは胆管がん患者の検体２を用いたときの２量体ＷＦＡ感作濃度と相対反応性との関係、図７Ｃは胆管がん患者の検体３を用いたときの２量体ＷＦＡ感作濃度と相対反応性との関係を示す。

　図７Ａ～Ｃに示されるように、２量体ＷＦＡ固定化担体を用いたときの相対反応性（白丸）は、検体１～３のいずれの検体を用いた場合であっても、ＷＦＡ感作濃度にかかわらず、単量体ＷＦＡ固定化担体（白四角）または４量体ＷＦＡ固定化担体（白三角）を用いたときの相対反応性と比べ、高かった。したがって、２量体ＷＦＡ固定化担体によれば、ＷＦＡ感作濃度にかかわらず、検体中に含まれるＭｕｃ－１などのように、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質に対し、高い反応性を示すことがわかる。

　以上の結果から、２量体ＷＦＡ固定化担体は、４量体ＷＦＡ固定化担体および単量体ＷＦＡ固定化担体と比べて当該糖鎖に対する高い反応性を有していることがわかる。しかも、２量体ＷＦＡ固定化担体は、保存安定性に優れていることがわかる。

　本出願は、２０１４年２月２７日および２０１５年１月９日にそれぞれ出願された日本国特許出願特願２０１４－０３６７７７号および特願２０１５－００２８６５号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。

Claims

　ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む標的物質を検出するための試薬であって、
　前記ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡが固相担体に固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体を含有している、標的物質の検出用試薬。
　前記２量体ＷＦＡが、ビオチンとビオチン結合タンパク質とを介して前記固相担体に固定化されている、請求項１に記載の試薬。
　前記２量体ＷＦＡがビオチン化２量体ＷＦＡであり、かつ前記固相担体にビオチン結合タンパク質が固定化されており、
　前記ビオチン化２量体ＷＦＡが前記ビオチン結合タンパク質を介して前記固相担体に固定化されている、請求項２に記載の試薬。
　ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む標的物質の検出方法であって、
（Ａ）　前記ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡが固相担体に固定化された２量体ＷＦＡ固定化担体と、前記標的物質を含む試料と、前記標的物質に特異的に結合する標識物質とを接触させることにより、前記固相担体上に前記２量体ＷＦＡと前記標的物質と前記標識物質とを含む複合体を形成させる工程、および
（Ｂ）　前記工程（Ａ）で得られた複合体中の標識物質を測定することにより、前記標的物質を検出する工程
を含む、標的物質の検出方法。
　前記標識物質が、前記標的物質に特異的に結合する標識抗体である、請求項４に記載の方法。
　ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体であって、
　前記ＷＦＡが２量体化された２量体ＷＦＡと、固相担体とを有し、
　前記２量体ＷＦＡが前記固相担体上に固定化されている、担体。
　ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む標的物質を検出するために用いられる担体の製造方法であって、
（Ｉ）　前記ＷＦＡを２量体化して２量体ＷＦＡを得る工程、および
（ＩＩ）　前記工程（Ｉ）で得られた２量体ＷＦＡを固相担体に固定化して２量体ＷＦＡ固定化担体を得る工程、
を含む方法。
　前記工程（Ｉ）において、ビオチンを含む架橋剤を含有する溶液と、ＷＦＡとを混合して、ビオチン化２量体ＷＦＡを調製する、請求項７に記載の方法。
　前記工程（ＩＩ）において、前記固相担体として、ビオチン結合タンパク質が固定化された担体を用い、前記担体中のビオチン結合タンパク質と前記ビオチン化２量体ＷＦＡとを結合させることによって前記２量体ＷＦＡを前記固相担体に固定化する、請求項８に記載の方法。
　前記工程（Ｉ）において、前記架橋剤を含有する溶液と、前記ＷＦＡとを、〔ＷＦＡ／架橋剤〕のモル比が１／１０以下（ただし０を含まない）となるように接触させることにより、前記２量体ＷＦＡを得る、請求項８に記載の方法。
　前記架橋剤が、前記２量体ＷＦＡ中のアミノ基と架橋を形成する架橋剤である、請求項８に記載の方法。
　前記架橋剤が、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、オキシエチレン基、炭素数１～４のクロロアルキル基、アルデヒド基およびカルボキシル基からなる群より選ばれた少なくとも１種の官能基を前記２量体ＷＦＡ中のアミノ基に対する反応基として有している、請求項８に記載の方法。
　前記ビオチンと前記反応基とが、スペーサーを介して結合している、請求項１２に記載の方法。