WO2015053293A1 - 細菌ｄｎａ増幅用のｐｃｒ用プライマーセット、細菌種の検出及び／または同定用キット及び細菌種の検出及び／または同定方法 - Google Patents

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仰 天野
智美 酒井
久陽 矢内
多葉田　誉
洋 南
北島　勲
英樹 仁井見
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三井化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a primer set useful for detection and / or identification of bacterial species by a test method using PCR, particularly real-time PCR, a kit containing the primer set for detection or identification of bacterial species, and bacterial species using these
  • the present invention relates to a method for detecting and / or identifying.
  • Microbiological testing is a technology required at research sites, medical sites, food manufacturing sites, and the like.
  • smearing, microscopic examination, culture, etc. have been practiced as routine inspection methods.
  • some microorganisms have antibiotic resistance genes, so drug susceptibility tests are often performed in parallel.
  • general inspection methods such as culture require considerable time (in units of days)
  • research has been actively conducted in recent years in order to increase the speed and sensitivity of the inspection.
  • the method has also been developed in various ways.
  • PCR methods DNA probe methods and gene amplification methods
  • the PCR method can amplify a very small amount of DNA present in a sample in a short time, has a higher detection sensitivity than the DNA probe method, and has a wider application range.
  • thermostable DNA polymerase preparation produced by using this eukaryote as a host for PCR, it is possible to provide an analysis method suitable for a novel examination of a very small amount of specimen bacteria. This is an epoch-making technique for analyzing bacteria.
  • a method in which a Tm value of an amplified 16S rDNA fragment and a plurality of probes is measured using a real-time PCR apparatus, and a bacterial species is identified based on the Tm value (Journal of Clinical Microbiology 2010, p.258-267). Also in this method, a sample after blood culture is used as a sample for extracting DNA, and this method takes a long time necessary for the culture.
  • the detection method using the PCR method has a rapidity with respect to the DNA probe method and is also applied to high-sensitivity detection. And it is useful as a highly sensitive detection method.
  • the detection method using the conventional PCR method cannot cope with the case where the bacterial species contained in the sample is unknown, or the growth of the bacteria in the sample to ensure the amount of nucleic acid necessary for detection. In some cases, it may not be sufficient to achieve further improvement in detection sensitivity and rapidity due to the time required.
  • Non-Patent Document 4 it can be inferred from the fact that 2-10 ng of bacterial DNA to be used for PCR is used for the analysis that a considerable amount of cells after culturing is necessary for analysis.
  • Escherichia coli the genome size of Escherichia coli MG1655 strain is 4463965 bp, from which it is calculated that the average molecular weight is 1 base pair, and that the genome is 1 copy (1 molecule) per bacterial cell.
  • the genomic DNA per cell of E. coli is about 5fg, and the amount of bacteria corresponding to the amount of DNA to be subjected to PCR is estimated to be considerable, which suggests that the detection sensitivity of this method is not sufficient Is done.
  • the selection of the primer set used in the PCR method is one of the important elements in order to increase the detection and identification sensitivity of the test. For example, depending on the choice of primer set, the amplification rate in PCR, the number of start-up cycles, the production rate of undesired amplification products, etc. differ, and each of these requirements was optimized to increase the detection and identification sensitivity of the test.
  • a primer set is required.
  • DNA derived from human cells such as leukocytes and exfoliated epithelial cells in the case of blood specimens, for example, in the case of blood specimens, such as specimens derived from blood. Sometimes it is.
  • the primer set is designed in view of the technical problem when the specimen such as blood as described above is to be examined, and is not found in the prior art.
  • a primer that can obtain an amplification product having a suitable Tm value for improving the speed of detection and detection sensitivity It is preferred to select a set.
  • thermostable DNA polymerase preparation used for amplification by the PCR method and the conditions for use thereof are also important factors for increasing the detection sensitivity of the test using the PCR method.
  • thermostable DNA polymerase preparations commonly used in PCR reactions are commercially available as high-purity purified preparations. Even in PCR reactions using these high-purity purified preparations, high-sensitivity detection is possible. When it is necessary to carry out the gene amplification reaction beyond about the usual 30 cycles in order to carry out, an amplification product of unknown cause or unknown origin was detected, and its use was limited.
  • Patent Document 4 mentions contamination of bacterial DNA derived from a host of DNA polymerase, but does not mention contamination of bacterial DNA that is a source of contamination from other reagents and instruments. However, the present inventors have found that contamination of bacteria-derived DNA, which is a source of contamination from reagents and instruments, has a very significant effect on the detection of bacterial DNA and identification of bacterial species in extremely small amounts of specimens. .
  • thermostable DNA polymerase preparation produced using a eukaryote as a host disclosed in Patent Document 2
  • the detection limit of bacterial DNA can be lowered to 10 fg / ⁇ L, and conventional PCR can be performed. Compared with the detection method used, it became possible to analyze sample-derived DNA with higher sensitivity.
  • microbial DNA of 10 fg / ⁇ L or more can be detected by performing PCR using SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52, but DNA having a concentration of less than 10 fg / ⁇ L. Cannot be detected. From this, if PCR is performed using SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52 by a method disclosed in Patent Document 2 using a certain solution as a template and amplification of the target product cannot be confirmed, bacteria mixed in the solution It can be confirmed that the concentration of the derived DNA is less than 10 fg / ⁇ L.
  • the amount of DNA per 1 ⁇ L sample to be subjected to PCR is theoretically equivalent to two E. coli cells, It becomes possible to detect Escherichia coli in a sample with high sensitivity.
  • the identification limit is 20 pg / ⁇ L, PCR is performed. It is expected that the amount of bacteria corresponding to the amount of DNA to be provided is a considerable amount.
  • the amplification rate of the amplification product in order to accurately identify bacterial species with high sensitivity by further lowering the identification limit, the amplification rate of the amplification product
  • a new finding was obtained that it was effective to use a primer set with further improved selectivity.
  • primers made from a sequence site common to all bacterial 16S rRNA genes used in Patent Document 2 and Patent Document 4 have the same sequence, and more than the primer sets disclosed in these Patent Documents. If it is possible to provide a primer set in which the amplification rate and selectivity of the amplification product are further improved, not only the detection sensitivity of the bacterial species but also the identification sensitivity of the bacterial species can be further improved.
  • an object of the present invention is to provide primer sets useful for further improving sensitivity in detection or identification of bacterial species in a specimen by PCR, a set for PCR using the same, and bacterial species in specimens. It is to provide a detection or identification method.
  • Another object of the present invention is to further improve the sensitivity in detection or identification of bacterial species in a specimen by carrying out a PCR method using the above primer set while minimizing the amount of contaminating nucleic acid derived from bacteria. Is to achieve.
  • the present inventors have used a specific primer set, and further, by minimizing the contamination of DNA derived from bacteria that are the source of contamination of reagents and instruments to be used, It was found that a bacterial species identification kit capable of detecting bacterial DNA in the sample and identifying the bacterial species with high sensitivity and high accuracy can be obtained.
  • the PCR primer set for amplifying bacterial DNA according to the present invention comprises at least one of seven primer pairs obtained by selecting one primer pair for each of the groups S1 to S7 described later. It includes one primer pair.
  • the kit for detecting a bacterial species according to the present invention includes at least one primer pair out of seven primer pairs obtained by selecting one primer pair for each group of groups K1 to K7 described later. It is characterized by including.
  • this kit may further have at least one of reagents and parts selected from PCR enzymes, pH buffer solutions, fluorescent dyes, dNTPs, MgCl 2 and measurement containers. Individually or as a whole, the amount of mixed nucleic acid derived from bacteria can be 10 fg or less.
  • a method for detecting and / or identifying a bacterial species to be detected in a specimen is as follows: A step of performing PCR using bacterial genomic DNA prepared from the specimen, a primer for obtaining an amplification product containing a target gene specific to the bacterial species to be detected, and a thermostable DNA polymerase; Detecting or identifying the target bacterial species in the sample by detecting the target gene in the amplified product in the PCR or analyzing the amplified product; Have It is a method for detecting and / or identifying a bacterial species, characterized by using the above primer set as the primer.
  • a primer set for bacterial DNA amplification PCR and a kit for detecting and / or identifying bacterial species useful for detecting and / or identifying bacterial species with high sensitivity. Furthermore, sensitivity in detection and / or identification of bacterial species can be further improved by minimizing the contamination of bacteria-derived DNA which is a source of contamination of reagents and instruments used in this kit. Therefore, according to the present invention, detection of bacteria-derived DNA and detection and / or identification of bacterial species in a very small amount of sample in the medical field, food field, etc. are performed with higher sensitivity and higher accuracy than conventional test kits. can do.
  • FIG. 6 is a diagram showing a part of the result of electrophoresis in Example 2 and Comparative Example 2.
  • FIG. It is a graph which shows a part (amplification curve) of the result of real-time PCR in Example 3 and Comparative Example 3.
  • 6 is a graph showing a part (melting curve) of the results of real-time PCR in Example 3 and Comparative Example 3. It is a figure which shows the result in Example 12. It is a figure which shows the result in Example 13. It is a figure which shows the result in Example 14.
  • Each line is the amplification result of the following primer pair.
  • the first point in the present invention resides in a specific primer set that can enjoy the effects of improved detection sensitivity and improved identification accuracy based thereon.
  • Each primer in the primer set described in Patent Document 4 has a DNA sequence that hybridizes to a conserved region common to bacteria in DNA encoding 16S rRNA of bacteria (16S rDNA) (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, sequence number 44, sequence number 51, sequence number 52, sequence number 53, sequence number 57, sequence number 62, sequence number 70, sequence number 76, sequence number 91, sequence number 104, sequence number 2).
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 16SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 28, sequence number 44, sequence number 51, sequence number 52, sequence number 53, sequence number 57, sequence number 62, sequence number 70, sequence number 76, sequence number 91, sequence number 104, sequence number 2.
  • bands other than the analyte appear in the electrophoresis analysis, the target amplification product cannot be detected, or real time is detected.
  • PCR amplifications had low amplification efficiency (see the dotted line in FIG. 1B), and peaks (or shoulders) other than the main peak appeared in the melting curve analysis in real-time PCR (see the dotted line in FIG. 1C). These may be an obstacle in the detection of a trace amount of sample-derived DNA and the further improvement of detection sensitivity in the identification of bacterial species.
  • one primer pair is selected from each of the groups S1 to S7, and at least one of the seven first to seventh selected primer pairs thus obtained, preferably Was a primer set for PCR for bacterial DNA amplification that could be used for detection and / or identification of bacterial species by at least four.
  • a primer set for identifying bacterial species can be obtained by using at least four primer pairs among the first to seventh selected primer pairs.
  • a sequence of SEQ ID NO: 56 A primer pair consisting of a combination of a forward primer consisting of: a reverse primer consisting of any one of SEQ ID NOS: 57 to 59 and 61; Group S5 5-1A: a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 62; and SEQ ID NO: 70 , A primer pair consisting of a combination of reverse primers consisting of any one of sequences 73 to 75, 5-2: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 63 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-3: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-4: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 65 and
  • one primer pair is selected from each of the groups K1 to K7, and at least one of the seven first to seventh selected primer pairs thus obtained is used.
  • at least four may constitute a kit for detection and / or identification of bacterial species.
  • a kit for identifying bacterial species can be obtained by using at least four primer pairs in the group of the first to seventh selected primer pairs.
  • a sequence of SEQ ID NO: 56 A primer pair consisting of a combination of a forward primer consisting of: a reverse primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 57 to 59 and 61; K5 group 5-1: a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 62; and SEQ ID NO: 70 , 71 and a primer pair consisting of a combination of reverse primers consisting of any one sequence of 73 to 75, 5-2: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 63 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-3: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-4: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 65
  • the primer set including a primer pair selected from the above-mentioned S1 group to S7 group preferably includes at least one primer pair among the following seven primer pairs of S-1) to S-7) .
  • S-1) As a primer set of the S1 group, a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 16, S-2)
  • S-2 group As a primer set of the S2 group, a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 43 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 50;
  • S-3) As a primer set of the S3 group, a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 51 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 52; S-4)
  • S4 group As a primer set of the S4 group, a primer pair comprising a combination of
  • the above primer set preferably contains any one of the primer pairs of S-1) to S-7) as an essential component for detecting bacterial species, and any one of the following AGs:
  • the combination is preferably included for bacterial species detection and / or identification.
  • C When the primer pair of S-3) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from S-1), S-2) and S-4) to S-7).
  • the primer set for a kit including a primer pair selected from the above-mentioned group K1 to group K7 includes at least one primer pair among the following seven primer pairs K-1) to K-7) It is preferable.
  • K-1) As a primer set of the K1 group, a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 16, K-2)
  • K-3 As a primer set of the K3 group, a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 51 and a reverse primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 52;
  • K-4 As a primer set of Group K4, a primer pair consisting of a combination of a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO:
  • the primer set for the kit preferably contains any one of the primer pairs K-1) K- to 7) as an essential component for detecting bacterial species. It is preferred for the detection and / or identification of bacterial species to include any one combination.
  • primer pair 4) When the primer pair 4) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from K-1) to K-3) and K-5) K-7).
  • E When the primer pair of 5) is necessarily included, at least three primer pairs selected from K-1) to K-4) and K-6) to K-7) are further included.
  • F When the primer pair of K-6) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from K-1) to K-5) and K-7).
  • primer pair of K-7) When the primer pair of K-7) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from K-1) to K-6).
  • Bacterial species can be identified by using four of the S-1 to S-7 primer pairs in combination in the above primer set, and the number of pairs selected from these seven primer pairs can be determined. It is preferable to increase to 5 or more, and it is more preferable to combine all of the seven S-1 to S-7 primer pairs. Thus, identification accuracy can be further improved by increasing the number of selected primer pairs.
  • bacterial species can be identified by using four of the primer pairs K-1 to K-7 in combination in the primer set for the kit described above. It is preferable to increase the number of selected groups to 5 or more, and it is more preferable to combine all of the seven K-1 to K-7 primer pairs. Thus, identification accuracy can be further improved by increasing the number of selected primer pairs.
  • any primer that can hybridize with the complementary strand of each DNA fragment of SEQ ID NO as claimed in the present application is regarded as equivalent to the primer of the present invention.
  • 1 to 2 bases are added or deleted in the base sequence.
  • a substituted base sequence is understood to be equivalent to the primer of the present invention.
  • the primer set of the present invention has been found for the first time after confirming the presence or absence of an effect based on a combination of a considerable amount, and cannot be achieved at the level of simple confirmation of the effect. It is added that it has been confirmed that it is a novel combination as a primer set for bacterial species detection and / or identification.
  • the present invention does not preclude the use of a plurality of known primers for fungi, specific microorganisms or viruses in addition to the primer set of the present invention.
  • the primer set of the present invention is for the purpose of amplifying a target DNA fragment by PCR from bacterial DNA extracted from a specimen, measuring the Tm of the amplified DNA fragment, measuring the molecular weight, or decoding the sequence.
  • a target DNA fragment by PCR from bacterial DNA extracted from a specimen
  • measuring the Tm of the amplified DNA fragment measuring the molecular weight, or decoding the sequence.
  • it is suitably used for identifying a bacterial species by the Tm value of a DNA fragment consisting of a part of the Bacteria 16S rDNA sequence amplified by the primer set of the present invention.
  • the bacterial common storage region on 16S rDNA A DNA containing a target sequence may be amplified in advance using a Forward and Reverse primer pair having a base number of 15 to 30 b containing a hybridizing DNA sequence, and the amplified sample may be further amplified by PCR using the primer set. (So-called Nested PCR method and Semi-nested PCR method).
  • the forward and reverse primers having 15 to 30 bases used for DNA amplification by the first PCR are not particularly limited as long as they contain a DNA sequence that hybridizes to a conserved bacterial common region on the 16S DNA sequence.
  • the DNA chain length of the PCR product using the primer pair is preferably 500 bp to 1500 bp.
  • the primer set used for the second amplification specifically, the primer pairs described in groups K1 to K7 hybridize to generate a DNA product from which at least four DNA fragments can be obtained. Primers are preferred.
  • the primer set used in the present invention is suitably used for detection of a trace amount of sample bacterial DNA and / or identification of bacterial species. Therefore, it is necessary to minimize the contamination of bacterial origin DNA, which is a source of contamination, in each primer pair.
  • the amount of contaminating bacterial bacterial DNA is less than 10 fg, preferably less than 5 fg, more preferably less than 1 fg with respect to the primer pair preparation.
  • Primer concentration in PCR is not particularly limited, but is generally set appropriately in the range of 0.05 ⁇ M to 1.0 ⁇ M according to the examination.
  • Reagents other than the primer set used for PCR analysis in the present invention known reagents can be used in a known combination.
  • Reagents necessary for the measurement include PCR-use enzyme, pH buffer solution, dNTP, Mg 2+ source, and sterile water purified by filtration.
  • a fluorescent dye is required in addition to the above.
  • thermostable DNA polymerase that minimizes the amount of bacterial DNA.
  • specific examples include those produced in eukaryotes, those that have been highly purified, and those that have been treated with EMA (ethidium monoazide) or PMA (propidium monoazide), which are selective membrane-permeable dyes. This is not the case.
  • the amount of DNA derived from bacteria is less than 10 fg, preferably less than 5 fg, more preferably less than 1 fg with respect to the enzyme preparation solution.
  • a thermostable DNA polymerase preparation (preparation solution) that is produced in eukaryotes using a thermostable DNA polymerase gene derived from bacteria and that is contaminated with DNA from the thermostable DNA polymerase gene derived from bacteria
  • the amount of DNA derived from bacteria other than the gene encoding the thermostable DNA polymerase is not more than the above upper limit.
  • the PCR enzyme is preferably Taq DNA Polymerase having a bacterial DNA content of less than 10 fg / ⁇ L.
  • the gene encoding the enzyme for PCR used in the present invention may be any gene such as cDNA, genomic DNA, synthetic DNA encoding thermostable DNA polymerase, and has a single strand or its complementary strand. It may be double stranded and may contain natural or artificial nucleotide derivatives. Further, when the thermostable DNA polymerase is derived from an organism, the origin of the thermostable DNA polymerase is not particularly limited.
  • the heat-resistant DNA polymerase may be a heat-resistant DNA polymerase artificially synthesized by genetic engineering.
  • the PCR enzyme used in the present invention is preferably a thermostable DNA polymerase derived from a thermostable organism, more preferably a methane bacterium, a thermophilic bacterium, a thermophilic bacterium, a hyperthermophilic bacterium or the like. It is derived from prokaryotes.
  • the enzyme for PCR used in the present invention is preferably an enzyme produced using a eukaryote as a host.
  • eukaryotic cells examples include fungi, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • Host cells are not particularly limited as long as they are cells derived from eukaryotes.
  • yeast or filamentous fungi are preferable, and specific examples include Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium (Rhodosporidi), Aspergillus, Fusarium, Trichoderma and the like.
  • animal cells include human-derived cultured cells and mouse-derived cultured cells, and specific examples include CHO cells and Hela cells.
  • the plant cell may be a cell derived from a plant, and preferably a cultured cell, such as a Nicotiana cell, an Arabidopsis cell, an Ipomoea cell, or a carrot (Daucus).
  • Genus cells such as a Nicotiana cell, an Arabidopsis cell, an Ipomoea cell, or a carrot (Daucus).
  • Genus cells such as a Nicotiana cell, an Arabidopsis cell, an Ipomoea cell, or a carrot (Daucus).
  • Genus cells such as a Nicotiana cell, an Arabidopsis cell, an Ipomoea cell, or a carrot (Daucus).
  • Genus cells such as a Nicotiana cell, an Arabidopsis cell, an Ipomoea cell, or a carrot (Daucus).
  • the insect cell may be a cell derived from an insect, and is preferably a cultured cell, such as a cultured cell sf9 strain, sf21 strain, or silkworm (Bombix mori) cultured cell derived from Spodoptera frugiperda. Examples include Bm-N strains.
  • the host cell is preferably a microorganism or eukaryote that grows quickly such as yeast, such as yeasts including the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, and cultured cells of the genus tobacco (Nicotiana) such as Nicotiana tabacum. And filamentous fungi including Aspergillus genus such as Aspergillus oryzae.
  • the manufacturing method is not particularly limited, for example, it can be appropriately manufactured according to the method described in Patent Document 4.
  • the enzyme for PCR is inactivated by the selective membrane-permeable dyes EMA (ethidium monoazide) and PMA (propidium monoazide) and irradiated with light to inactivate the bacterial source DNA, especially the dead bacterial DNA. can do. Since inactivated DNA does not undergo amplification by PCR, it is possible to detect only the DNA derived from the bacteria to be detected present in the specimen and to identify the bacterial species.
  • the processing conditions are the same as those recommended by the manufacturer and manufacturer of the reagent and the reagent processing agent.
  • the pH buffer is used to adjust the pH to 7.0 to 10.0 (more preferably pH 8.0 to 9.0) as a sample to be subjected to PCR analysis.
  • Specific examples include Tris hydrochloric acid buffer.
  • Tris hydrochloric acid buffer it is used at 5 mM to 100 mM.
  • dNTP is a nucleoside source for DNA amplification by PCR, and four types of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP are required. Further, dNTP may be chemically modified for use in the hot start method, for example, CleanAmp TM dNTP manufactured by TriLink BioTechnologies, Inc. The amount used is dATP, dGTP, dCTP, and dTTP at a concentration of about 0.2 mM each.
  • Mg 2+ is required for DNA amplification by PCR.
  • Mg 2+ source examples include MgCl 2 and MgSO 4 .
  • MgCl 2 is preferred, and the amount used is suitably in the range of 0.5 mM to 5.0 mM depending on the study.
  • Fluorescent dyes are used for the purpose of detecting DNA amplification products by real-time PCR, and for measuring Tm of amplified DNA fragments, and various known ones can be used. Examples thereof include a method using an intercalator having a labeling function and a method using a probe in which a fluorescent substance is bound to a nucleotide that specifically hybridizes to the DNA sequence to be amplified. Examples of intercalators include unsaturated fluorescent dyes such as ethidium bromide, Cyber Green I (SYBR Green I), saturated fluorescent dyes Resolight (Roche), and EvaGreen (Biotim). .
  • Preferred intercalators are Cyber Green I which is an unsaturated fluorescent dye, EvaGreen and Resolight which are saturated fluorescent dyes, and more preferably EvaGreen and Resolight which are saturated fluorescent dyes. The amount used follows the recommendation of the manufacturer and seller of the fluorescent dye used.
  • kits may contain bacterial genomic DNA used as a positive control for PCR and sterile water used as a negative control.
  • a container for PCR analysis measurement for example, a tube for analysis measurement
  • one having a shape or a structure corresponding to a measuring instrument can be selected and used. If what was recommended by the acquisition place of a measuring instrument is used, it can use for a measurement without a problem in particular.
  • instruments necessary for carrying out the present invention include instruments widely used in molecular biology experiments such as pipettes, pipette tips, and 1.5 ml microtubes.
  • apparatuses include PCR, clean bench, Devices widely used in molecular biology experiments such as tube centrifuges can be mentioned.
  • the second point in the present invention is to detect the contamination level of bacterial-derived DNA, which is a source of contamination as a whole sample solution prepared for PCR measurement, including primers used for detection and / or identification, and to detect trace amounts of sample bacteria and bacteria. It is to reduce to a level that does not interfere with species identification.
  • Patent Document 4 describes that the amount of bacteria-derived DNA in the thermostable polymerase preparation solution is preferably 10 fg or less.
  • bacterial contamination in reagents and instruments is also an extremely important factor in the detection of trace amounts of specimen bacteria and identification of bacterial species.
  • PCR amplification was observed (Comparative Example 11).
  • the present invention it is necessary to suppress contamination of bacteria-derived DNA, which is a contamination source, not only for each reagent used, but also for instruments used for preparing a measurement preparation solution and filtered water.
  • bacteria-derived DNA which is a contamination source
  • the instruments for example, in a work space such as a clean room where DNA contamination from the environment is blocked, the instruments are washed with washing water that dissolves DNA without DNA contamination, and the washed water after washing is used for PCR analysis. By applying it, DNA contamination can be inspected. If necessary, this method may be used to check for DNA contamination.
  • the contamination amount of bacteria-derived DNA as a contamination source is 10 fg or less, preferably 5 fg or less, more preferably 1 fg or less, relative to the entire identification kit.
  • the contamination amount of bacteria-derived DNA as a contamination source is 10 fg or less, preferably 5 fg or less, more preferably 1 fg or less, relative to the entire identification kit.
  • it is less than 10 fg, preferably less than 5 fg, more preferably less than 1 fg with respect to individual preparation solutions.
  • By limiting the amount of contaminating bacterial DNA to this level unnecessary peaks can be obtained even if more than 30 cycles of amplification are performed in the PCR analysis required for detection of trace amounts of specimen bacteria and identification of bacterial species.
  • Bacterial species can be detected and identified with high sensitivity and high accuracy without the appearance of Tm and the deviation of Tm value.
  • ⁇ Contamination removal method> examples of the method for suppressing contamination of bacteria-derived DNA, which is a source of contamination, for reagents and instruments used in the present invention include UV irradiation treatment, gamma ray sterilization treatment, ultrafiltration treatment, and EMA treatment. If it is clear from the acceptance test that the amount of contaminating bacterial DNA is 10 fg or less, the following treatment is not necessarily required.
  • bacterial-derived DNA as a contamination source can be destroyed by direct irradiation with gamma rays.
  • the gamma ray irradiation conditions vary depending on the type of irradiated object. In general, processing of 5 kGy to 30 kGy, preferably 10 kGy to 25 kGy is applied.
  • gamma-ray sterilization treatment cannot be applied to instruments made of specific materials such as Resolight, EvaGreen, Cyber Green I, etc. due to gamma-ray irradiation due to degradation of gamma-ray irradiation.
  • Example 15 which will be described later shows the effect of the gamma sterilization treatment.
  • the reagent used in the present invention can be subjected to ultrafiltration treatment to separate and remove bacteria-derived DNA as a contamination source.
  • the bacterial source DNA that is the source of contamination is bacteria or genomic DNA
  • the molecular weight is large, so the reagents used pass through the ultrafiltration membrane, and the genomic DNA Ultrafiltration may be performed after selecting a membrane so that it does not pass through the ultrafiltration membrane.
  • the ultrafiltration membrane it is preferable to use a membrane having a molecular weight cut-off of 1 kDa to 1000 kDa, preferably 10 kDa to 100 kDa, more preferably 30 kDa to 50 kDa.
  • a membrane having an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa to 1000 kDa, preferably 30 kDa to 100 kDa, more preferably 30 kDa to 50 kDa is used.
  • the material for the ultrafiltration membrane is not particularly limited, and examples thereof include regenerated cellulose, cellulose acetate, and polyethersulfone.
  • a pressure source for ultrafiltration any method such as gas pressurization and centrifugation may be used, but a preferred method is selected according to the amount of treatment.
  • centrifugal membrane filtration When the amount of treatment is small, centrifugal membrane filtration is preferred.
  • the amount of the treatment liquid and the centrifugal force (G) at the time of centrifugation are in accordance with the recommendations of the manufacturer and seller of the filtration device to be used.
  • Example 13 Example 14, Comparative Example 10, and Comparative Example 11, which will be described later, show the effects of centrifugal membrane filtration treatment.
  • EMA ethidium monoazide
  • PMA propidium monoazide
  • the processing conditions are the same as those recommended by the manufacturer and manufacturer of the reagent and the reagent processing agent.
  • the “Viable Bacteria Selection Kit for PCR” manufactured by Takara Bio Inc.
  • Example 16 to be described later shows the effect of the EMA process.
  • the bacterial species identification kit of the present invention is a kit for identifying a bacterial species by analyzing a DNA fragment consisting of a part of the bacterial 16S rDNA sequence amplified by the primer set of the present invention. Analysis of DNA fragments includes molecular weight analysis of DNA fragments and measurement of Tm value. The Tm value is preferably measured, and real-time PCR is preferably used for that purpose. The molecular weight can be analyzed by electrophoresis, a mass spectrometer, or the like.
  • primer pairs classified into the following groups K1 to K7 are suitable as primer pairs constituting the bacterial species detection kit. Therefore, by selecting one primer pair from each of the groups K1 to K7 and detecting at least one of the seven primer pairs thus obtained, preferably using at least four, It was set as the kit for.
  • a sequence of SEQ ID NO: 56 A primer pair consisting of a combination of a forward primer consisting of: a reverse primer consisting of any one of SEQ ID NOs: 57 to 59 and 61; K5 group 5-1: a forward primer consisting of the sequence of SEQ ID NO: 62; and SEQ ID NO: 70 , 71 and a primer pair consisting of a combination of reverse primers consisting of any one sequence of 73 to 75, 5-2: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 63 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-3: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 64 and a reverse primer comprising any one of the sequences of SEQ ID NOs: 70 to 75, 5-4: a primer pair comprising a combination of a forward primer comprising the sequence of SEQ ID NO: 65
  • the primer set and kit preferably include at least one primer pair among the following seven primer pairs 1) to 7).
  • the above kit preferably contains any one of the primer pairs 1) to 7) as an essential component, and contains any one of the following combinations A to G for bacterial species identification: preferable.
  • A In the case where the primer set of 1) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from 2) to 7).
  • B In the case where the primer set of 2) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from 1) and 3) to 7).
  • C When the primer pair of 3) is necessarily included, at least three primer pairs selected from 1), 2) and 4) to 7) are further included.
  • D When the primer pair of 4) is necessarily included, at least three primer pairs selected from 1) to 3) and 5) to 7) are further included.
  • primer pair of 5 When the primer pair of 5) is necessarily included, at least three primer pairs selected from 1) to 4) and 6) to 7) are further included.
  • primer pair of 6) When the primer pair of 6) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from 1) to 5) and 7).
  • primer pair of 7) When the primer pair of 7) is necessarily included, it further includes at least three primer pairs selected from 1) to 6).
  • the bacterial species detection and / or identification kit comprises one or more of the primer pairs described above.
  • reagents such as PCR enzyme, pH buffer, MgCl 2 , dNTP (or CleanAmp-dNTP) and sterilized water, PCR analysis measurement container (for example, analysis measurement tube) Or at least one reagent and / or part selected from parts such as other necessary instruments.
  • a fluorescent dye can be added as a component in the analysis by real-time PCR.
  • components necessary for the PCR method used in addition to these components may be added to the kit.
  • Each of these reagents or parts may be packaged in any form, such as individually, partly or entirely.
  • the following aspects are provided. 1) Separate for each reagent used. 2) In the analysis by pH buffer, MgCl 2 , dNTP (or CleanAmp-dNTP), and real-time PCR, it is subdivided into three: a premixed fluorescent dye, a primer pair, and an enzyme. 3) In the analysis by pH buffer, MgCl 2 , dNTP (or CleanAmp-dNTP), real-time PCR, the fluorescent dye, the primer pair previously mixed, and the enzyme are subdivided into two. 4) In the analysis by pH buffer, MgCl 2 , dNTP (or CleanAmp-dNTP), and real-time PCR, fluorescent dye, primer and enzyme are all mixed in advance.
  • the amount of DNA derived from bacteria as a contamination source as a whole is 10 fg or less, and the enzyme used was subjected to selective membrane-permeable dye treatment such as eukaryotic production, highly purified treatment or EMA.
  • Reagents and instruments used are individually or as a whole treated with gamma sterilization, centrifugal membrane filtration or selective membrane-permeable dye treatment as needed. It is a thing.
  • various treatments are performed so that the amount of bacteria-derived DNA mixed in the package after sealing the package is 10 fg or less.
  • the bacterial species detection and / or identification kit of the present invention can be used for bacterial detection and bacterial species identification in various fields such as medical field, food field, and environmental analysis. Particularly in the medical field, it is useful because it can detect infectious bacteria in infectious diseases and / or identify bacterial species.
  • Specimens used for bacterial testing are not particularly limited and can be applied to a wide range of specimens.
  • blood, cerebrospinal fluid, tears, amniotic fluid, other body fluids, and medical device deposits such as catheters are included.
  • Blood, amniotic fluid, and cerebrospinal fluid are particularly useful in detecting causative bacteria of serious infections.
  • food itself, a liquid in the middle of production, or a solid sample, equipment deposits in the manufacturing process, and the like can be mentioned.
  • ⁇ DNA extraction process> When detection of bacteria in a specimen and / or identification of bacterial species is carried out using the identification kit of the present invention, it is necessary to previously extract DNA from bacteria that will be present in the specimen.
  • alkaline dissolution methods, boiling methods, phenol extraction methods, and the like are known as DNA extraction methods, and dedicated DNA extraction kits are also sold by manufacturers.
  • the DNA extraction method in the present invention is not particularly limited, but the optimum method differs depending on the sample, and therefore it is desirable to select a method corresponding to the target sample.
  • the QIAamp® DNA® Mini Kit manufactured by Qiagen and the High® pure® PCR® template® preparation kit used by Roche are examples of DNA extraction methods that can be suitably used.
  • the elution amount can be changed from 50 ml to 200 ml as required.
  • the primer set or kit of the present invention is used in a PCR method.
  • PCR method various PCR methods can be used as long as the PCR method is used for amplification of a target gene for detecting a specimen bacterium.
  • a preferred analysis method is real-time PCR, more preferably a combination of real-time PCR and solution curve analysis for Tm measurement.
  • the spec of the real-time PCR instrument to be used preferably has a temperature control ability of ⁇ 0.1 ° C. Specific examples of PCR and real-time PCR and Tm measurement using the PCR and real-time PCR are listed below.
  • PCR and real-time PCR known devices such as equipment and methods may be used.
  • the temperature cycle conditions in PCR are not particularly limited, and can be set appropriately according to the nature of the primers, enzymes, templates, etc. and the sensitivity of the DNA detection method after PCR. Good. Many documents are already known about the setting of such conditions.
  • a heat denaturation step of template double-stranded DNA, a primer annealing step, and an enzymatic DNA extension step are generally repeated.
  • the heat denaturation step may be a temperature and a time at which the template double-stranded DNA is dissociated into single strands.
  • the temperature is set at 90 ° C. to 98 ° C. for several seconds to several minutes.
  • a heat denaturation process of several to 10 minutes is often added only to the first cycle.
  • the primer annealing step is set according to the base sequence of the primer and the number of bases, but is often set to several seconds to several tens of seconds at 40 ° C to 72 ° C.
  • the temperature is generally from 58 ° C to 76 ° C, depending on the properties such as the optimum temperature of the enzyme.
  • the length of the DNA to be amplified and the DNA of the enzyme Estimate the required time from the synthesis speed and set it.
  • the target DNA is amplified by repeating the steps of heat denaturation, annealing, and extension.The number of repetitions can be changed as appropriate depending on the amount of template DNA, the amount of enzyme, and the sensitivity of the DNA detection method after PCR. However, a typical example is 10 to 50 times. Further, when the annealing temperature and the DNA extension temperature are approximately the same, both steps can be performed simultaneously.
  • the conditions for heat denaturation, annealing, and DNA elongation necessary for DNA amplification, and the number of repetitions of these steps are the same as described for PCR above.
  • the amount of amplified DNA can be quantified or estimated by measuring fluorescence intensity derived from an intercalator or probe before and after the DNA extension step. The temperature at which the fluorescence intensity is measured can be changed as appropriate according to the type of probe used.
  • the temperature at which the fluorescence intensity is measured for example, in the case of using an intercalator, the temperature at the time of DNA elongation may be the same, and the length of the target DNA to be amplified is relatively long, and its Tm value is relatively If it is high, nonspecifically amplified non-specifically amplified DNA (also referred to as nonspecifically amplified DNA), such as a primer dimer, which has a relatively short chain length, makes use of the relatively low Tm value of the target DNA. It may be set to a temperature between the Tm value and the Tm value of nonspecifically amplified DNA.
  • the Tm of the amplified DNA can be measured by melting curve analysis after completion of the DNA amplification step.
  • the temperature and detection conditions are not particularly limited.
  • denaturation 90 ° C to 98 ° C
  • duplex formation (Annealing) (40 ° C to 80 ° C)
  • melting gradually from the temperature of duplex formation to around 98 ° C
  • a method for detecting or identifying a bacterial species in a specimen a method having the following steps can be used. (1) A step of performing PCR using a bacterial genomic DNA prepared from the specimen, a primer for obtaining an amplification product containing a target gene specific to the bacterial species to be detected, and a heat-resistant DNA polymerase. (2) A step of detecting or identifying a target bacterial species in the specimen by detecting the target gene in the amplification product in the PCR or analyzing the amplification product.
  • the primer set according to the present invention as a primer, highly sensitive bacterial species can be identified. Furthermore, by using the reagent and instrument which controlled the contamination level mentioned above, further high sensitivity and speed can be achieved.
  • the amplification step is preferably performed under the suppression of amplification of a gene other than the target gene (non-target gene).
  • Hot start PCR can be used to suppress the amplification of non-target genes.
  • An example is a hot start method using an anti-DNA polymerase antibody. In that case, it is preferable to use an excessive amount of anti-DNA polymerase antibody with respect to 1 U of heat-resistant DNA polymerase.
  • a hot start method by applying reversible chemical modification to DNA polymerase can also be suitably used.
  • a hot start method using a chemically modified dNTP or a chemically modified primer as in US Patent Application No. 20070281308 can also be suitably used.
  • hot start by physically isolating DNA polymerase and components essential for DNA amplification by DNA polymerase (for example, primers, dNTPs, and Mg 2+ salts) using wax that melts when heated The method can also be suitably used.
  • the detection and / or identification step of the amplification product can be performed by measuring Tm by real-time PCR using an intercalator or probe having a fluorescent label for detection.
  • Real-time PCR using an intercalator is preferred, and preferred intercalators are Cyber Green I which is an unsaturated fluorescent dye, EvaGreen and Resolight which are saturated fluorescent dyes, and more preferably EvaGreen and Resolight which are saturated fluorescent dyes It is.
  • the amplification product of the target gene can be detected, and other amplification products of the non-target gene can be detected as non-detection.
  • the primer is designed so that the melting temperature (Tm A ) of the target gene amplification product is higher than the melting temperature (Tm B ) of the amplification product of the non-target gene, (2) A method in which amplification product detection is set at a temperature between Tm A and Tm B, and only the amplification product of the target gene is detected is preferred.
  • the amplification step and the detection and / or identification step can be performed by real-time PCR using a display device that displays the amount of the amplification product, and a method in which the amplification product of the non-target gene is hidden on the display device can be used. .
  • the detection and / or identification step can also be performed by analyzing the amplification product that is developed and visualized by electrophoresis on a gel or the like.
  • the detection and / or identification step can also be performed by analyzing the amplification product by decoding the base sequence of the amplification product. Furthermore, this step can also be performed by a method in which the molecular weight of the amplification product is measured and analyzed with a mass spectrometer.
  • the Tm value of a DNA fragment obtained from the detection bacterium can be used using the primer set according to the present invention.
  • an algorithm for identification not only the above-described combination of Tm values themselves, but also identification using the combination of differences between each Tm value, for example, the influence of measurement errors such as measurement errors for each trial of the device Can be added.
  • the average value of combinations of Tm values and the combination of relative values of Tm values from the average values can be used.
  • this is a method for identifying the arrangement of combinations of Tm values as “shape”.
  • the “shape” that shows the arrangement of the combination of Tm values in two dimensions is not affected by the measurement error.
  • a combination of Tm values specific to the detection bacteria n (n is an integer of 4 or more and 7 or less)
  • T1db to Tndb db is database
  • the relative values from the average values are d1db to dndb, respectively.
  • Tm values (n (n is an integer not less than 4 and not more than 7)
  • Tnref Tnref (ref is a reference)
  • Dist. ⁇ [(D1 db -D1 ref) 2 + (D2 db -D2 ref) 2 + .... (Dn db -Dn ref) 2] If it is the calculation method by Formula 1, the D value obtained by this calculation formula is identified as the detection bacterial species to be obtained that is closest to 0. However, the allowable range of the D value is 0 to 0.37, preferably 0 to 0.30, depending on the temperature control specifications of the device and the number of primers due to the measurement error of the PCR device used.
  • the above algorithm can be used as database identification software on a computer.
  • the identifiable microorganisms are classified as bacteria, they can be detected by mechanism and identified as bacterial species.
  • Specific bacterial species Achromobacter denitrificans, Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Actinomyces israelii, Aerococcus christensenii, Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Alcaligenes faecalis, Alistipes onderdonkii, Anaerococcus vaginalis, Anaeroglobus geminatus, Arcanobacterium haemolyticum, Arcanobacterium pyogenes, Arthrobacter cumminsii, Atopobium vaginae, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacill
  • e-DNAP was prepared by the following method and used in the following examples.
  • aquaticus-derived heat-resistant DNA polymerase expression vector A synthesized gene encoding T. aquaticus-derived heat-resistant DNA polymerase was inserted into plasmid pYES2 (Invitrogen) to construct vector pYES-TA01.
  • the gene encoding the thermostable DNA polymerase is digested with pUC-TA01 with restriction enzymes HindIII and EcoRI (TaKaRa Bio), electrophoresed with 1% agarose gel (Wako), and with QIAquick gel extraction kit (Qiagen) The gene encoding the thermostable DNA polymerase was recovered.
  • the plasmid pYES2 was digested with EcoRI and NotI (TaKaRa Bio), and the gene encoding the thermostable DNA polymerase and pYES2 were ligated with DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (TaKaRa Bio).
  • Transformation of S. cerevisiae PCR was performed using the genome of Saccharomyces cerevisiae X2180 as a template and SEQ ID NO: 134 as a forward primer and SEQ ID NO: 135 as a reverse primer to obtain a fragment A of about 550 bp.
  • PCR was performed using the genome of Saccharomyces cerevisiae X2180 as a template and SEQ ID NO: 136 as a forward primer and SEQ ID NO: 137 as a reverse primer to obtain a fragment B of about 550 bp.
  • PCR was performed using fragment A and fragment B as templates and SEQ ID NO: 134 as a forward primer and SEQ ID NO: 137 as a reverse primer to obtain fragment AB.
  • competent cells were prepared after culturing Saccharomyces cerevisiae X2180, and fragment AB was transformed using FastTrackTM-Yeast Transformation Kit (Geno Technology).
  • the transformant was applied to a minimum agar medium containing 5-FOA to a final concentration of 1 mg / ml. After culturing this agar medium at 28 ° C. for 3 days, a strain capable of growing on a minimum agar medium containing 5-FOA was obtained and designated as Saccharomyces cerevisiae X2180-S.
  • Saccharomyces cerevisiae X2180 strain is available from the American Type Culture Collection, a cell / microorganism / gene bank.
  • the obtained vector pYES-TA01 was introduced into yeast (Saccharomyces cerevisiae X2180-S strain). If the host is a uracil-requiring strain, other yeasts can be used. For transformation, FastTrackTM-Yeast Transformation Kit (Geno Technology) was used. (4) Production of heat-resistant DNA polymerase derived from T. aquaticus by S. cerevisiae In the following experiments, ultrapure water and equipment were used with DNA-free materials. The obtained transformant was cultured with shaking at 28 ° C. for 72 hours in 100 ml of SD medium (0.67% Bacto yeast nitrogen base, 2% Galactose).
  • a disruption buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM KCl
  • the cells were disrupted using 0.5 mm glass beads, and then 12000 rpm, 30 minutes. Centrifugation was performed to obtain a yeast lysate supernatant and a precipitate to obtain a cell extract.
  • the cell extract was heat-treated at 70 ° C. for 60 minutes, and after the heat treatment, centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant.
  • Polyethyleneimine (Sigma Aldrich) was added to the supernatant to a final concentration of 0.1%, stirred vigorously for 1 minute, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation at 8000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was passed through a 0.45 mm filter.
  • thermostable DNA polymerase derived from T. aquaticus Purification of thermostable DNA polymerase derived from T. aquaticus
  • ultrapure water and equipment were used in a low-temperature cabinet using DNA-free water.
  • the recovered crude extract is subjected to HiTrap Q FF (GE) equilibrated with buffer A (50 mM Tris-HCl pH 7.5), and then 5% buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 M NaCl). Was allowed to flow through the column to elute impurities.
  • 15% buffer B was passed through the column to elute the thermostable DNA polymerase.
  • the eluted enzyme solution was subjected to HiTrap Heparin equilibrated with 15% buffer B, and buffer B was gradually increased to 50%, and the fraction from which the enzyme was eluted was collected.
  • the buffer solution of this enzyme fraction was replaced with a storage buffer solution (40 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M NaCl, 2 mM DTT, 0.2 mM EDTA), and a storage solution (98% glycerol, 1% Tween 20, 1 % NP-40) was added in an equal amount, and after stirring, the enzyme solution was stored at ⁇ 20 ° C.
  • a storage buffer solution 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M NaCl, 2 mM DTT, 0.2 mM EDTA
  • a storage solution 98% glycerol, 1% Tween 20, 1 % NP-40
  • thermostable DNA polymerase was defined based on the number of Thunder Taq (Nippon Gene) units.
  • Example 1 Bacterial identification by nested-PCR
  • Escherichia coli DNA was extracted from a culture solution of Escherichia coli MG1655 using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN).
  • QIAamp DNA purification kit QIAGEN
  • EC1 and EC3 shown in Table 3 were used as reaction templates.
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM QIAGEN
  • Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • the Escherichia coli MG1655 strain is available from the American Type Culture Collection, a cell / microorganism / gene bank.
  • the composition shown in Table 4 was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 40 times.
  • forward primer sequence number 1 and reverse primer sequence number 2 were used for the primer.
  • the reaction solution was collected and diluted 500 times with DNA-free ultrapure water. Using this diluted solution as a template, the reaction was carried out with the composition shown in Table 5.
  • Primers are (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 combinations, (4) forward primer sequence number 53 and reverse primer sequence number 57 combination, (5) forward primer sequence number 62 and reverse primer sequence number 70 combination, (6) forward primer sequence number 76 and reverse primer sequence No. 91 combination, (7) 7 sets of forward primer SEQ ID No.
  • DNA dissociation curves are prepared after DNA amplification. Values were measured.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. In addition, the temperature was kept for 2 seconds at each stage to acquire data.
  • the obtained Tm value was compared with the previously obtained Tm value of Escherichia coli as described in Patent Document 4 to obtain a D value. When the D value was 0.3 or less, it was determined to be the same type. The results are shown in Table 6 together with the results of Comparative Example 1.
  • Example 1 Comparison of Example 1 (nested-PCR) (direct PCR)
  • the following comparative example is a follow-up experiment of Patent Document 4.
  • E. coli DNA was extracted from the culture solution of E. coli MG1655 using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN). After extraction, the amount of DNA was measured with an absorptiometer and diluted with DNA-free ultrapure water. As shown, EC1 and EC3 were used as reaction templates. The reaction was carried out with the composition shown in Table 5. Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • the PCR method after heating at 95 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C.
  • Primers are (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 combinations, (4) forward primer sequence number 53 and reverse primer sequence number 57 combination, (5) forward primer sequence number 62 and reverse primer sequence number 70 combination, (6) forward primer sequence number 76 and reverse primer sequence No. 91 combination, (7) 7 sets of forward primer SEQ ID NO: 104 and reverse primer SEQ ID NO: 2 are set, and DNA dissociation curves are prepared after DNA amplification. Values were measured.
  • Example 7 of patent document 4 it compared with Tm value of colon_bacillus
  • the results are shown in Table 6 together with the results of Example 1.
  • the D value was 0.3 or less, it was determined to be the same type.
  • Example 2 Primer verification (electrophoresis with purified coli genome)
  • EC3 shown in Table 3 was used as a reaction template. Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • a forward primer consisting of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 2-5 and (2) a forward primer consisting of SEQ ID NOS: 1 and 6-15 and SEQ ID NO: 16- (3) a combination of a forward primer consisting of SEQ ID NO: 28-43 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 44-50, and (4) a forward primer consisting of SEQ ID NO: 53-56,
  • (1) was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times.
  • (2) to (7) were heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • the solution after the reaction was electrophoresed on 2% agarose gel, and after staining with ethidium bromide, the amplification amount of the target product and the amplification of the non-specific product were verified.
  • (1) was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times.
  • (2) to (7) were heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • the solution after the reaction was electrophoresed on 2% agarose gel, and after staining with ethidium bromide, the amplification amount of the target product and the amplification of the non-specific product were verified. The results are shown in Tables 7-1 to 7-7 together with the results of Example 2.
  • Example 3 Primer verification (PCR / Melting with purified coli genome)
  • EC3 in Table 3 was used as a template. Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • Each combination (3) each combination of a forward primer consisting of SEQ ID NO: 28-43 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 44-50, (4) from a forward primer consisting of SEQ ID NO: 53-56 and SEQ ID NO: 57-61 (5) a combination of a forward primer consisting of SEQ ID NO: 62-69 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 70-75, (6) a forward primer consisting of SEQ ID NO: 76-90 and SEQ ID NO: 91
  • Each combination of reverse primer consist consist
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR device.
  • the program (1) is heated at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 ° C. Repeat 30 seconds for 35 times, and for (2) to (7), heat at 95 ° C. for 5 minutes, then repeat 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds for 35 times, then dissociate the amplified product DNA A curve was created.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C.
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR device.
  • the program (1) is heated at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 ° C. Repeat 30 seconds for 35 times, and for (2) to (7), heat at 95 ° C. for 5 minutes, then repeat 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds for 35 times, then dissociate the amplified product DNA A curve was created.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. In addition, the temperature was kept for 2 seconds at each stage to acquire data. The number of rising cycles of the amplification curve and the dissociation curve were verified. The results are shown in Tables 8-1 to 8-7 together with the results of Example 3.
  • Example 4 Primer verification (electrophoresis with pseudo DNA sample)
  • a solution obtained by adding E. coli genomic DNA to 100 mg / ml human genomic DNA (clonetech) to a final concentration of 10 pg / ml, HE was used as a template.
  • Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • a forward primer consisting of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 2-5 and (2) a forward primer consisting of SEQ ID NOS: 1 and 6-15 and SEQ ID NO: 16-
  • a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 31 a forward primer consisting of SEQ ID NO: 47, a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 47, a forward primer consisting of SEQ ID NO: 32, and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 48
  • (1) was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times.
  • (2) to (7) were heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • the solution after the reaction was electrophoresed on 2% agarose gel, and after staining with ethidium bromide, the amplification amount of the target product and the amplification of the non-specific product were verified.
  • (1) was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 35 times.
  • (2) to (7) were heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • the solution after the reaction was electrophoresed on 2% agarose gel, and after staining with ethidium bromide, the amplification amount of the target product and the amplification of the non-specific product were verified.
  • the results are shown in Tables 9-1 to 9-7 together with the results of Example 4.
  • Example 5 Primer verification (PCR / Melting with pseudo-DNA samples)
  • a solution obtained by adding E. coli genomic DNA to 100 mg / ml human genomic DNA (clonetech) to a final concentration of 10 pg / ml, HE was used as a template.
  • Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • a combination of primers (1) a combination of a forward primer consisting of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of SEQ ID NO: 2-5, and (2) a forward primer consisting of SEQ ID NOS: 1 and 6-15 and SEQ ID NO: 16- Each combination of reverse primer consisting of 27, (3) Each combination of forward primer consisting of SEQ ID NO: 28 and reverse primer consisting of SEQ ID NO: 44, 45 and 47, Forward primer consisting of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 48 Combination of reverse primer, forward primer consisting of SEQ ID NO: 31 and reverse primer consisting of SEQ ID NO: 47, forward primer consisting of SEQ ID NO: 32 and reverse primer consisting of SEQ ID NO: 48 Combinations, combinations of forward primers consisting of SEQ ID NOs: 33-43 and reverse primers consisting of SEQ ID NOs: 44-50, (4) combinations of forward primers consisting of SEQ ID NO: 53 and reverse primers consisting of SEQ ID NOs: 57 and 61 A combination of a
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR device.
  • (1) is heated at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 Repeated 30 seconds at 35 ° C for 35 times, and for (2) to (7), heated at 95 ° C for 5 minutes, then repeated at 94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 10 seconds 35 times, and then amplified product DNA A dissociation curve was created.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C.
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR device.
  • (1) is heated at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 Repeated 30 seconds at 35 ° C for 35 times, and for (2) to (7), heated at 95 ° C for 5 minutes, then repeated at 94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 10 seconds 35 times, and then amplified product DNA
  • a dissociation curve was created.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. In addition, the temperature was kept for 2 seconds at each stage to acquire data. The number of rising cycles of the amplification curve and the dissociation curve were verified. The results are shown in Tables 10-1 to 10-7 together with the results of Example 5.
  • E. coli DNA was extracted from a culture solution of E. coli MG1655 using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN), and after extraction, the amount of DNA was measured with an absorptiometer.
  • QIAamp DNA purification kit QIAGEN
  • the EC1 and EC2 solutions shown in Table 3 diluted with ultrapure water were used as reaction templates. Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • the reaction was carried out with the composition shown in Table 5.
  • Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR apparatus. The program is heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C.
  • a DNA dissociation curve was prepared.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. At each stage, the temperature was kept for 2 seconds to acquire data, and the Tm value of the amplified product was measured.
  • primers (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) forward primer SEQ ID NO: 81 and reverse.
  • primers (1) Combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) Combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, and (3) Forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) a forward primer SEQ ID NO: 76 and reverse.
  • PCR was performed using all 7 sets of the combination of primer SEQ ID NO: 91 and (7) the combination of forward primer SEQ ID NO: 104 and reverse primer SEQ ID NO: 2.
  • m value in the Patent Document 4 to obtain a D value is compared with Tm values of E. coli that had been previously obtained. The results are shown in Table 11 together with the results of Example 6. When the D value was 0.3 or less, it was determined to be the same type.
  • Example 7 Comparison of detection sensitivity with pseudo-specimens and nested PCR with primers in Patent Document 4
  • E. coli suspension was added to 2 ml of whole blood of a healthy person as shown in Table 12 I prepared what I did. All experiments were conducted in the laboratory of the attached hospital inspection department of Toyama University (2630 Sugitani, Toyama City, Toyama Prefecture 930-0194).
  • the solution obtained by adding the E. coli suspension to whole blood was centrifuged at 100 g for 5 minutes to recover the plasma fraction, and then the supernatant was further centrifuged at 13000 g for 5 minutes to recover the precipitate.
  • PCR was performed using DNA precipitates B1 and B2 extracted from this precipitate using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN) as a template. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) was used as the real-time PCR apparatus.
  • the PCR program was first heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 40 times. .
  • Primer is (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) forward primer SEQ ID NO: 81 and sequence.
  • the combination of No. 103 and (7) all seven sets of combinations of forward primer SEQ ID NO: 115 and reverse primer SEQ ID NO: 5 were used.
  • the obtained Tm value was verified by comparison with the previously obtained Tm value of E.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. At each stage, the temperature was kept for 2 seconds to acquire data, and the Tm value of the amplified product was measured. The results are shown in Table 13 together with the results of Comparative Example 7. When the D value was 0.3 or less, it was determined to be the same type.
  • Rotor Gene Q 5-plex (QIAGEN) was used as the real-time PCR apparatus, and the PCR program was first heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then was repeated 40 times at 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds.
  • the primer was used for the combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 2 and reacted with the composition shown in Table 1.
  • this reaction product was diluted 500-fold with DNA-free ultrapure water, heated at 95 ° C. for 5 minutes with the composition shown in Table 2 as a template, then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 After repeating 10 seconds at 30 ° C.
  • a DNA dissociation curve of the amplification product was prepared, and the Tm value of each amplification product was measured.
  • primers (1) Combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) Combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, and (3) Forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) a forward primer SEQ ID NO: 76 and reverse.
  • the experiment was performed using a combination of primer SEQ ID NO: 91 and (7) all seven sets of combinations of forward primer SEQ ID NO: 104 and reverse primer SEQ ID NO: 2.
  • the obtained Tm value was verified by comparison with the previously obtained Tm value of E. coli, as described in Patent Document 4.
  • the results are shown in Table 13 together with the results of Example 7. When the D value was 0.3 or less, it was determined to be the same type.
  • Example 8 Verification of primers in multiple bacterial species.
  • Bacteroides Flagilis were conserved in Toyama (Hospital examination unit laboratory) in the present embodiment, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringes, Acinetobacter calcoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium xerosis, Enterobacter What extracted the genome from the cultured microbial cell body of cloacae using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN) was used for the reaction template.
  • QIAamp DNA purification kit QIAamp DNA purification kit
  • the reaction was carried out with the composition shown in Table 5. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. After the PCR program was heated at 95 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • Primer is (1) a combination of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 17, (2) a combination of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 50, (3) a combination of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 50; (4) a combination of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 61, (5) a combination of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 58, (6) a combination of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 61, (7) a combination of SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 72; (8) a combination of SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 103, (9) a combination of SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 103, (10) a combination of SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 125, (11) SEQ ID NO: 115 and SEQ ID NO: 5 PCR was performed on the combinations of the above, and it was verified whether amplification of the target fragment was observed. The results are
  • Target product quantity ⁇ : Amplification is particularly good ⁇ : Amplification is good ⁇ : Amplification is bad ⁇ : Amplification is particularly bad non-specific product amplification ⁇ : Non-specific product is present ⁇ : Non-specific product is present ⁇ : Number of rising cycles with many non-specific products: A: The number of rising cycles is fast (decrease by 2 cycles or more) ⁇ : The number of rising cycles is slightly faster.
  • Bacteroides Flagilis were conserved in Toyama (Hospital examination unit laboratory) in the present comparative example, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringes, Acinetobacter calcoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium xerosis, Enterobacter What extracted the genome from the cultured microbial cell body of cloacae using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN) was used for the reaction template. The reaction was carried out with the composition shown in Table 5. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. After the PCR program was heated at 95 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds were repeated 35 times.
  • Toyama Hospital examination unit laboratory
  • Primer is (1) a combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 16, (2) a combination of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 44, (3) a combination of SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52, (4) a combination of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 57, (5) a combination of SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 70, (6 Combination of SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 91, (7) PCR was performed on the combination of SEQ ID NO: 104 and SEQ ID NO: 2 to verify whether the target fragment was amplified. The results are shown in Table 14 together with Example 8.
  • Example 9 Verification of primers in multiple bacterial species.
  • Bacteroides Flagilis were conserved in Toyama (Hospital examination unit laboratory) in the present embodiment, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringes, Acinetobacter calcoaceticus, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium xerosis, Enterobacter What extracted the genome from the cultured microbial cell body of cloacae using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN) was used for the reaction template.
  • QIAamp DNA purification kit QIAamp DNA purification kit
  • the reaction was carried out with the composition shown in Table 5. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) is used as the real-time PCR apparatus. The program is heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds are repeated 35 times. A DNA dissociation curve was prepared. The DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C.
  • Primer is (1) a combination of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 17, (2) a combination of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 50, (3) a combination of SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 50; (4) a combination of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 61, (5) a combination of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 58, (6) a combination of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 61, (7) a combination of SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 72; (8) a combination of SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 103, (9) a combination of SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 103, (10) a combination of SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 125, (11) PCR was performed on the combination of SEQ ID NO: 115 and SEQ ID NO: 5, and then a DNA dissociation curve of the amplified product was prepared.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. At each stage, the temperature was kept for 2 seconds to obtain data, and the Tm value of the amplified product was measured. Based on this result, the number of rising cycles of the amplification curve and the dissociation curve were verified. The results are shown in Table 14 together with Comparative Example 5.
  • the reaction was carried out with the composition shown in Table 5. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) was used as the real-time PCR apparatus. The program was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 94 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds 35 times.
  • Primers are the combination of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 16, the combination of SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 44, the combination of SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52, the combination of SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 57, the SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 70.
  • PCR was performed on the combination of SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 91, and the combination of SEQ ID NO: 104 and SEQ ID NO: 2, and then the DNA dissociation curve of the amplified product was prepared.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and increasing the temperature by 0.5 ° C.
  • Example 10 Verification with a simulated blood sample of bacterial species other than E. coli
  • a body added to 2 ml of whole blood of a healthy person so as to have a concentration shown in Table 15 was prepared in cooperation with Toyama University. All experiments were conducted in the laboratory of Toyama University Hospital.
  • the solution obtained by adding the bacterial suspension to whole blood was centrifuged at 100 g for 5 minutes to recover the plasma fraction, and then the supernatant was further centrifuged at 13000 g for 5 minutes to recover the precipitate.
  • PCR was carried out in the laboratory of Toyama University Hospital using the DNA solution extracted from this precipitate using QIAamp DNA purification kit (QIAGEN) as a template. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN) was used as the real-time PCR apparatus. The PCR program was first heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 40 times. . Primers were used for the combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 5. The reaction was carried out with the composition shown in Table 4.
  • This reaction product was diluted 500-fold with DNA-free ultrapure water, and this was used as a template and heated at 95 ° C. for 5 minutes at the composition shown in Table 5, followed by 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 After repeating 10 seconds at 30 ° C. 30 times, a DNA dissociation curve of the amplification product was prepared.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. At each stage, the temperature was kept for 2 seconds to acquire data, and the Tm value of the amplified product was measured.
  • Primer is Combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, combination of forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52, and forward primer SEQ ID NO: 53 And reverse primer SEQ ID NO: 57, forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, forward primer SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 103, and forward primer SEQ ID NO: 115 and reverse primer SEQ ID NO: 5. Seven sets of combinations were used. About the obtained Tm value, as it exists in patent document 4, it compared with Tm value of each microbial species acquired previously, and verified. The results are shown in Table 15.
  • Example 11 Verification with clinical specimen of Toyama University Hospital
  • a DNA solution extracted from a blood sample of a patient suspected of sepsis in Toyama University Hospital was used as a template. Performed in the laboratory. Ultrapure water and equipment used were DNA-free. Rotorgene Q MDx 5plex HRM was used as the real-time PCR apparatus. First, the PCR program was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 40 times. Primers were used for the combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 5. The reaction was carried out with the composition shown in Table 4.
  • This reaction product was diluted 500-fold with DNA-free ultrapure water, and this was used as a template and heated at 95 ° C. for 5 minutes at the composition shown in Table 5, followed by 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 After repeating 10 seconds at 30 ° C. 30 times, a DNA dissociation curve of the amplification product was prepared.
  • the DNA dissociation curve was prepared by heating at 95 ° C. for 10 seconds, then maintaining at 72 ° C. for 90 seconds, and raising the temperature by 0.5 ° C. to 95 ° C. At each stage, the temperature was kept for 2 seconds to acquire data, and the Tm value of the amplified product was measured.
  • Primer is Combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, combination of forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52, and forward primer SEQ ID NO: 53 And reverse primer SEQ ID NO: 57, forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, forward primer SEQ ID NO: 81 and SEQ ID NO: 103, and forward primer SEQ ID NO: 115 and reverse primer SEQ ID NO: 5. Seven sets of combinations were used. As described in Patent Document 4, the obtained Tm value was verified by comparing the Tm value obtained in advance with the data in the input database. The results are shown in Table 16.
  • Example 12 Hot start PCR
  • DNA solution (HE) was used as a template, and amplification reaction was performed using CleanAmp dNTPs (Sigma-Aldrich), which is a hot start dNTP, and dNTPs that are usually used. The results were compared. The composition was reacted at the compositions shown in Table 4 and Table 17.
  • Ultra pure water / equipment was DNA free. EC3 shown in Table 3 was used as a template.
  • the primer is a combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 2.
  • the PCR program was first heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then repeated at 35 ° C. for 10 seconds, 94 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 30 seconds, 35 times. .
  • the solution after the reaction was electrophoresed on 2% agarose gel, and after staining with ethidium bromide, the amplification amount of the target product and the amplification of the non-specific product were verified.
  • Example 13 DNA removal treatment (ultrafiltration, E. coli genome addition experiment) Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • Amicon UFC50508 (Millipore) was supplied with 500 mL of sterilized water and centrifuged at 5000 g for 5 minutes to remove the filtrate and the solution remaining in the filter. Next, 500 ml of 1N hydrochloric acid was used, and centrifugation was performed at 5000 g for 5 minutes to remove the filtrate and the solution remaining in the filter. Finally, 500 mL of sterilized water was supplied, centrifugation was performed at 5000 g for 5 minutes, and the operation of removing the filtrate and the solution remaining in the filter was performed twice.
  • Primers were used in combination of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the product of this reaction solution was diluted 500 times, and PCR was performed with the composition shown in Table 5 using this as a template. After heating at 95 ° C for 5 minutes, repeating 94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 10 seconds 30 times, create a DNA dissociation curve for the amplification products and measure the Tm value of each amplification product. It was.
  • primers Combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, and combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, combination of forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52, and forward primer SEQ ID NO: 53 And reverse primer SEQ ID NO: 57, forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, forward primer SEQ ID NO: 76 and reverse primer SEQ ID NO: 91, forward primer SEQ ID NO: 104 and reverse primer SEQ ID NO: PCR was carried out with 7 sets of 2 combinations, and it was verified whether amplification of each DNA fragment was observed. The result is shown in FIG. 3 together with the result of Comparative Example 10.
  • the product of this reaction solution was diluted 500 times, and PCR was performed with the composition shown in Table 5 using this as a template. After heating at 95 ° C for 5 minutes, repeating 94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 10 seconds 30 times, create a DNA dissociation curve for the amplification products and measure the Tm value of each amplification product. It was.
  • primers Combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, and combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, combination of forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52, and forward primer SEQ ID NO: 53 And reverse primer SEQ ID NO: 57, forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, forward primer SEQ ID NO: 76 and reverse primer SEQ ID NO: 91, forward primer SEQ ID NO: 104 and reverse primer SEQ ID NO: PCR was carried out with 7 sets of 2 combinations, and it was verified whether amplification of each DNA fragment was observed. The results are shown in FIG. 3 together with the results of Example 13.
  • Example 14 DNA removal treatment (purification of contamination reagent, direct-PCR) Ultrapure water and equipment used were DNA-free.
  • Amicon UFC50508 (Millipore) was supplied with 500 mL of sterilized water and centrifuged at 5000 g for 5 minutes to remove the filtrate and the solution remaining in the filter. Next, 500 ml of 1N hydrochloric acid was used, and centrifugation was performed at 5000 g for 5 minutes to remove the filtrate and the solution remaining in the filter. Finally, 500 mL of sterilized water was supplied, centrifugation was performed at 5000 g for 5 minutes, and the operation of removing the filtrate and the solution remaining in the filter was performed twice.
  • PCR was performed by adding EvaGreen and sterilized water to the filtrate.
  • Rotor Gene Q MDx 5plex HRM QIAGEN
  • the PCR program was heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 94 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds were repeated 35 times.
  • Primers were used in combination of SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the product of this reaction solution was diluted 500 times, and PCR was performed with the composition shown in Table 5 using this as a template.
  • the PCR apparatus was Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN), heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then repeated 26 times at 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds, and then the DNA dissociation curve of the amplified product The Tm value of each amplification product was measured.
  • primers (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) forward primer SEQ ID NO: 81 and reverse.
  • PCR was performed on 7 sets of the combination of primer SEQ ID NO: 103 and (7) the combination of forward primer SEQ ID NO: 115 and reverse primer SEQ ID NO: 5, and the amplification of the target fragment was observed. It was carried out to verify whether or not be. The result is shown in FIG. 4 together with the result of Comparative Example 11.
  • the PCR apparatus was Rotorgene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN), heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then repeated 26 times at 94 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 10 seconds, 72 ° C. for 10 seconds, and then the DNA dissociation curve of the amplified product The Tm value of each amplification product was measured.
  • primers (1) a combination of forward primer SEQ ID NO: 15 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) a combination of forward primer SEQ ID NO: 43 and reverse primer SEQ ID NO: 50, and (3) forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) forward primer SEQ ID NO: 81 and reverse.
  • PCR was performed on 7 sets of the combination of primer SEQ ID NO: 103 and (7) the combination of forward primer SEQ ID NO: 115 and reverse primer SEQ ID NO: 5, and the amplification of the target fragment was observed. It was carried out to verify whether or not be. The results are shown in FIG. 4 together with the results of Example 14.
  • Example 15 DNA removal treatment (gamma ray sterilization E. coli DNA gamma ray treatment) Ultrapure water and equipment used were DNA-free. A solution prepared by adding 500 fg of Escherichia coli DNA to 100 mL of sterilized water was prepared and irradiated with 10 kGy and 25 kGy of gamma rays. Using this solution as a template, PCR was performed under the following conditions. The reaction was carried out with the composition shown in Table 1. The PCR machine uses Rotor Gene Q MDx 5plex HRM (QIAGEN).
  • the PCR program was first heated at 95 ° C for 5 minutes, and then repeated 40 times at 94 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 30 seconds.
  • a DNA dissociation curve was prepared.
  • Primers were used in combination of SEQ ID NOs: 1 and 2. After diluting the product of this reaction solution 500 times, using this as a template and heating at 95 ° C for 5 minutes, repeating 94 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 10 seconds, 72 ° C for 10 seconds 30 times, A DNA dissociation curve was prepared.
  • primers (1) Combination of forward primer SEQ ID NO: 1 and reverse primer SEQ ID NO: 16, (2) Combination of forward primer SEQ ID NO: 28 and reverse primer SEQ ID NO: 44, and (3) Forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 And (4) a combination of forward primer SEQ ID NO: 53 and reverse primer SEQ ID NO: 57, and (5) a combination of forward primer SEQ ID NO: 62 and reverse primer SEQ ID NO: 70, and (6) a forward primer SEQ ID NO: 76 and reverse.
  • PCR is performed with the combination of primer sequence number 91 and (7) the combination of forward primer sequence number 104 and reverse primer sequence number 2, and amplification of each DNA fragment is observed was carried out verification of whether or not. The results are shown in Table 18.
  • Example 16 DNA removal treatment
  • EMA DNA removal treatment
  • the ultrapure water and equipment were DNA-free, and the work was performed in a clean bench.
  • a solution in which the template, primer, and evagreen were removed from the reaction solution composition shown in Table 5 was prepared, and 25 ng of E. coli genomic DNA was added thereto.
  • the above solution to which Ethidium Monoazide Bromid (Molecular Probe) was added to a final concentration of 20 ⁇ M and the above solution to which EMA was not added were prepared as a negative control.
  • These solutions were placed under a 570 lumen LED bulb and irradiated with light for 15 minutes.
  • After adding primer and EvaGreen and heating at 95 ° C. for 10 minutes repeating 95 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. 60 times, creating a DNA dissociation curve of the amplification product, Existence was verified.
  • primers forward primer SEQ ID NO: 51 and reverse primer SEQ ID NO: 52 were used. The result is
  • Example 17 Identification of bacterial species at four Tm values A culture solution of four bacterial species of Escherichia coli, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae was omitted and a blind test was performed. Escherichia coli was designated as Bacteria 1, Clostridium difficile was designated as Bacteria 2, Klebsiella pneumoniae was designated as Bacteria 3, and Enterobacter cloacae was designated as Bacteria 4, and identification was performed by DNA extraction. The PCR reaction was performed in the same manner as in Example 11. Identification was performed only with a combination of four Tm values. In consideration of the measurement error of RotorGene Q, those having Dist ⁇ 0.2 or less were regarded as the same bacterial species.

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Abstract

　本発明の目的は、PCR法による検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上のために有用なプライマーセット、これを用いたPCR用のセット及び検体中の細菌種の検出または同定方法を提供すること、並びに、細菌由来の核酸の混入量を最小限として、上記のプライマーセットを用いたPCR法を行うことによって、検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上を達成することにある。これらの目的を達成するめために、本発明にかかる細菌DNA増幅用のPCR用のプライマーセットは、特定のプライマーペアからなる第Ｓ１群～第Ｓ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含む。更に、本発明にかかる細菌種検出用のキットは、特定のプライマーペアからなる第Ｋ１群～第Ｋ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含む。

Description

細菌ＤＮＡ増幅用のＰＣＲ用プライマーセット、細菌種の検出及び／または同定用キット及び細菌種の検出及び／または同定方法
　本発明は、PCR、特にリアルタイムPCRを用いた検査法による細菌種の検出及び／または同定に有用なプライマーセット、細菌種の検出または同定用の該プライマーセットを含むキット、ならびにこれらを用いる細菌種の検出及び／または同定方法に関する。
　微生物検査は、研究現場、医療現場、食品製造現場等で必要とされている技術である。医療現場、食品製造現場においては、従来、塗抹・鏡検・培養等がルーチンの検査法として実施されている。また、医療現場では、微生物の中には抗生剤耐性遺伝子を有する場合もあるため、併行して薬剤感受性試験が行われることも多い。しかしながら、培養等上記の一般的検査法は相当な時間（日単位）を要するため、近年、検査の迅速化・高感度化が求められ盛んに研究が行われている。特に、遺伝子解析に基づく公開データベースの蓄積により、病原遺伝子の解析、毒素遺伝子の解析、抗生物質耐性遺伝子の解析、系統発生学的視点によるrRNAをコードするDNA配列（rDNA）の解析などにより、検査手法も多様な発達を遂げている。
　現在、遺伝子検査法としては、DNAプローブ法と遺伝子増幅法（PCR法）に大別されている。とりわけ、PCR法は、試料中に存在する微量のDNAを短時間で増幅することができ、かつ、DNAプローブ法に比して検出感度が高く、その分適用範囲が広い。
　このような背景からPCRを用いた未同定の菌の検出について検討がなされており、敗血症起因微生物DNAの痕跡をPCRにより増幅し、増幅された起因微生物DNAを、経験的に想定した微生物に標的を定めた菌種固有のヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、起因微生物を検出及び細菌種の同定する試みがなされている（特開平6-90799号公報）。
　さらに、検出及び細菌種の同定の迅速性を求めて、ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムPCRを基本原理とした敗血症検査技術開発が検討されている（生物試料分析，Vol.28,No5.(2005),400-40）。また、微生物DNAを鋳型として特定のプライマーセットを複数用いてPCRでの遺伝子増幅を行い、次いで得られる複数のDNA断片に応じた融解温度（Tm値）の組合せ、あるいは各Tm値間の差を解析することによる起因菌の迅速な検出及び細菌種の同定方法が検討されている（国際公開2007/097323号）。
　しかしながら、短時間で得られる結果においても精度が担保されていなければならないため、PCRにおいては感度と特異度の高さを両立させることが重要と言える。これら先行技術はPCRによる遺伝子増幅技術を応用してはいるものの想定した標的微生物に限定された方法である。
　一方、PCRに用いるDNAポリメラーゼを提供するために、遺伝子組み換え技術によるDNAポリメラーゼ調製物の製造方法が検討されている（特開2006-180886号公報）。真核生物を宿主として製造された耐熱性ＤＮＡ調製物を用いてPCR法により極微量の検体細菌DNAの増幅を行う際における非特異核酸増幅を抑制する方法が提案されている（国際公開第2010/082640号）。この真核生物を宿主として生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物をＰＣＲに用いることによって、極微量の検体細菌の新規検査に好適な分析方法を提供することができ、当該技術は、極微量の検体細菌の分析方法としては、極めて画期的な技術である。
　また、最新のリアルタイムPCR装置を用い、細菌から増幅された3種のDNA断片に対して、高解像度融解曲線分析（High Resolution Melting：HRM）により曲線を得、その形の組み合わせにより細菌種を判定する手法が提案されている（Journal of Clinical Microbiology 2009, p.2252-2255：Journal of Clinical Microbiology 2010, p.3410-3413）。しかしながら、これらの文献には波形の一致、不一致を判定する明確な基準は開示されていない。また、上記の文献では60種の細菌の判定を実施しているが、DNA断片３種からのHRMによる曲線3種では100種を超えるような広範囲の菌種を同定することは困難であると推測される。同時に本手法ではDNAを抽出するためのサンプルとしては血液培養後の検体を使用しており、培養のために必要となるだけの時間がかかる手法となっている。
　さらに同様にリアルタイムPCR装置を用い、増幅された16S rDNA断片と複数のプローブとのTm値を測定し、そのTm値をもとに細菌種を特定する方法が開示されている（Journal of Clinical Microbiology 2010, p.258-267）。本手法においても、DNAを抽出するためのサンプルとしては血液培養後の検体を使用しており、培養のために必要となるだけの時間がかかる手法となっている。
特開平６－９０７９９号公報 国際公開２００７／０９７３２３号 特開２００６－１８０８８６号公報 国際公開第２０１０／０８２６４０号
生物試料分析，Vol.28,No5.(2005),400-40 Journal of Clinical Microbiology 2009, p.2252-2255 Journal of Clinical Microbiology 2010, p.3410-3413 Journal of Clinical Microbiology 2010, p.258-267
　特許文献４に開示される技術に基づけば、簡便に極微量の検体細菌からのDNAを増幅し、短時間の内に分析、特に定量または同定分析することができれば、これまで解析不可能であった極微量レベルでの遺伝子についてまで解析可能になるばかりでなく、医療分野や獣医分野、生活用水や食品などの各種検体の分析分野においては迅速且つ正確な判断に繋がるものと考えられる。しかしながら、臨床現場、食品製造現場等からはより一層の検出感度向上や迅速性が求められている。
　先に述べたとおり、PCR法を用いた検出方法は、DNAプローブ法に対して迅速性を有し、また、高感度検出にも適用しており、臨床現場、食品製造現場等においける迅速かつ高感度検出方法として有用である。しかしながら、従来のPCR法を用いた検出方法では、検体中に含まれる菌種が不明である場合に対応できない場合や、検出に必要な量の核酸を確保するための検体中の菌の増殖に時間を要するなど、より一層の検出感度の向上及び迅速性を達成するには十分に対応できない場合があった。
　例えば、非特許文献４においては、培養などを経たのちの相当量の菌体量が分析に必要であることは、PCRに供する細菌DNAを2-10 ng用いていることからも伺われる。細菌として大腸菌を例とすると、大腸菌MG1655株のゲノムサイズは4639675 bpであり、そこから1塩基対の平均分子量、さらに1細菌細胞あたりゲノムは1コピー（1分子）であることを考慮、計算すると、大腸菌1細胞あたりのゲノムDNAは約5fgであり、PCRに供するDNA量に相当する細菌量が相当な量であることが伺われ、このことから、本手法の検出感度が十分でないことが想定される。
　PCR法を用いて菌の検出や同定を行う場合において、検査の検出・同定感度を上げるためには、PCR法において用いるプライマーセットの選択が重要な要素の一つとなる。例えば、プライマーセットの選択によっては、PCRにおける増幅率、立ち上がりサイクル数、目的としない増幅産物の生産率等において異なり、検査の検出・同定感度を上げるためには、これらの各要件を最適化したプライマーセットが必要となる。検体の種類によっては、血液等由来の検体のように、検査対象となる細菌由来のDNA以外に、例えば血液検体の場合は白血球や剥離した上皮細胞などのヒト細胞に由来するDNAが大量に存在している場合もある。本発明者の検討によれば、このような検体において検査対象となる細菌のDNAの含有量が少ない場合に、PCR用のプライマーセットの検査対象となる細菌DNAに対する選択性、あるいはその増幅産物の生産率が低いと、検査対象の菌種の同定に必要な量の増幅産物の取得ができない場合や、目的としないDNAの増幅産物の量が多くなり同定のバックグランドの上昇を招く場合がある。特許文献４においては、PCR法を用いた検査対象となる細菌の同定に、真核生物を宿主として用いて生産された細菌由来のDNAの量を抑えた耐熱DNAポリメラーゼ調製物を用いることによって、特許文献４が対象としている従来技術による同定方法に対しては、同定感度の格段の向上を達成しているが、上記のように検査対象となる細菌のDNAの量が、大量に存在する検査対象となる細菌以外のDNAに対してさらに少ない検体においても、更なる高感度での同定を可能とする必要がある。このような観点からも、PCR法に用いるプライマーセットについて、目的としない増幅産物がない、選択性のより高いプライマーの設計が重要である。しかしながら、上述したような血液等の検体を検査対象とする際の技術課題に着目して設計されてプライマーセットは従来技術においては見当たらないのが現状である。
　更に、増幅産物のTm値を用いて検出対象菌の分析や未同定菌の同定を行う場合には、検査の迅速性や検出感度を上げる上で好適なTm値を有する増幅産物が得られるプライマーセットを選択することが好ましい。
　一方、PCR法での増幅に用いる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の特性やその使用条件も、PCR法を用いた検査の検出感度を上げる上で重要な要素のひとつとなる。
　PCR反応において一般的に使用される市販の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の中には高純度精製調製物も市販されているが、これら高純度精製調製物を用いたPCR反応でも、高感度検出を行うために遺伝子増幅反応を通常の30サイクル程度を超えて行う必要がある場合などにおいては、原因不明、由来不明の増幅産物が検出されてしまい、その使用には限界があった。
　特許文献４では、DNAポリメラーゼの宿主由来の細菌DNAの混入については触れられているが、その他試薬、器具からの汚染源である細菌由来DNAの混入については言及していない。ところが、試薬、器具からの汚染源である細菌由来DNAの混入は、極微量の検体中の細菌DNAの検出及び細菌種の同定において極めて重大な影響を及ぼすことが本発明者らの検討により判明した。
　極微量の検体中の細菌由来DNAを増幅する場合のPCR分析において、感度と特異度を共により一層高く制御するための手段は、未だ提供されておらず、検体中の細菌由来のDNAを対象とした場合における細菌種の高感度な同定についても十分に達成できているとはいえない。
　特許文献２に開示の真核生物を宿主として生産された耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いる検出方法によれば、細菌由来のDNAの検出限界を10fg/μLまで下げることができ、従来のPCRをもちいた検出方法と比較して、より高感度での検体由来DNAの分析が可能となった。
　特許文献２で開示されている方法によると、配列番号５１と配列番号５２を用いてPCR法をおこなうと10fg/μL以上の微生物DNAを検出することはできるが、10fg/μL未満の濃度のDNAについては検出することができない。このことから、ある溶液を鋳型として特許文献２で開示されている方法で配列番号５１と配列番号５２を用いてPCRをおこない目的産物の増幅が確認できなければ、その溶液に混入している細菌由来DNAの濃度が10fg/μL未満であることが確認できる。
　検体中の細菌種の検出のみならず、検体中の細菌種の同定を高感度で高精度に行うには、細菌由来のDNA量の検出限界を下げることに加えて、細菌種同定に十分な量の検体由来のDNA増幅産物が得られることが必要となる。例えば、検体由来のDNAの増幅産物のTm値を測定することよって検体中の細菌種の同定を行う場合には、信頼性の高いTm値の測定結果を得るには、そのために十分な量の増幅産物がPCRによって得られることが重要となる。言い換えれば、十分なDNAの増幅が行われていない際には正確なTm値の測定を行うことができず、高精度な同定が難しくなる。
　例えば、大腸菌1細胞あたりのゲノムDNAは約5fgであり、検出限界が10fg/μLである検出方法の場合は、理論上、PCRに供する試料１μL当たりのDNA量は大腸菌細胞２個相当分となり、検体中における大腸菌の高感度での検出を行うことが可能となる。これに対して、DNA増幅産物の信頼性のあるTm値を測定する上で最低限必要とされる検体中の大腸菌由来のDNA量、すなわち同定限界が20pg/μLであると仮定すると、PCRに供するDNA量に相当する細菌量が相当な量となることが伺われる。
　本発明者における検討によれば、高感度での細菌種の検出が可能な測定系において、同定限界を更に下げて高感度での細菌種の同定を精度良く行うには、増幅産物の増幅率や選択性が更に向上したプライマーセットを用いることが有効であるとの新たな知見を得た。例えば、特許文献２及び特許文献４で用いられている全ての細菌の16SrRNA遺伝子に共通な配列部位からつくられたプライマーは同じ配列を有しており、これらの特許文献に開示のプライマーセットよりも増幅産物の増幅率や選択性が更に向上したプライマーセットを提供することができれば、細菌種の検出感度のみならず、細菌種の同定感度を更に向上させることが可能となる。
　従って、本発明の目的は、PCR法による検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上のために有用なプライマーセット、これを用いたPCR用のセット及び検体中の細菌種の検出または同定方法を提供することにある。
　本発明の他の目的は、細菌由来の核酸の混入量を最小限として、上記のプライマーセットを用いたPCR法を行うことによって、検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上を達成することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定のプライマーセットを用いること、さらには、使用する試薬及び器具の汚染源である細菌由来DNAの混入を最小限とすることにより、極微量の検体中の細菌DNAの検出及び該細菌種の同定を高感度、高精度に実施することができる細菌種同定キットが得られることを見出した。
　本発明にかかる細菌DNA増幅用のPCR用のプライマーセットは、後述する第Ｓ１群～第Ｓ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする。
　本発明にかかる細菌種検出用のキットは、後述する第Ｋ１群～第Ｋ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする。
　このキットは、プライマーセットの他に、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、蛍光色素、dNTP、MgCl2及び測定用容器等から選択される試薬及び部品の少なくとも１つを更に有することができ、これらの個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下とすることができる。
　本発明にかかる、検体中の検出対象細菌種の検出及び／または同定方法は、
　前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程と、
　前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程と、
を有し、
　前記プライマーとして上記のプライマーセットを用いる
ことを特徴とする細菌種の検出及び／または同定方法である。
　本発明によれば、高感度での細菌種の検出及び／または同定に有用な細菌ＤＮＡ増幅ＰＣＲ用プライマーセット及び細菌種検出及び／または同定用のキットを提供することができる。更に、このキットに使用する試薬及び器具の汚染源である細菌由来DNAの混入を最小限とすることにより、細菌種の検出及び／または同定における感度を更に向上させることができる。従って、本発明によれば、医療分野、食品分野等における極微量の検体中の細菌由来DNAの検出及び細菌種の検出及び／または同定を、従来の検査キットよりも高感度、高精度に実施することができる。
実施例２と比較例２での電気泳動の結果の一部を示す図である。 実施例３と比較例３でのリアルタイムPCRの結果の一部（増幅曲線）を示すグラフである。 実施例３と比較例３でのリアルタイムPCRでの結果の一部（融解曲線）を示すグラフである。 実施例１２における結果を示す図である。 実施例１３における結果を示す図である。 実施例１４における結果を示す図である。各線は以下のプライマーペアの増幅結果である。（１）配列番号１５と１６の組み合わせ（２）配列番号４３と５０の組み合わせ（３）配列番号５１と５２の組み合わせ（４）配列番号５３と５７の組み合わせ（５）配列番号６２と７０の組み合わせ（６）配列番号８１と１０３の組み合わせ（７）配列番号１１５と５の組み合わせ 実施例１６における結果を示す図である。
　＜Primer＞
　本発明における第一のポイントは、検出感度向上及びそれに基づく同定精度向上という効果が享受できる特定のプライマーセットにある。
　特許文献４に記載のプライマーセットにおける各プライマーは、細菌の16S rRNAをコードするDNA（16S　rDNA）における細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を有する（配列番号１，配列番号１６，配列番号２８，配列番号４４，配列番号５１，配列番号５２，配列番号５３，配列番号５７，配列番号６２，配列番号７０，配列番号７６，配列番号９１，配列番号１０４，配列番号２）。しかしながら、図１Ａのレーン２に示される通り、特許文献４に記載のプライマーセットでは、電気泳動分析において分析対象物以外のバンドが出現したりまた目的の増幅産物が検出できなかったり、また、リアルタイムPCRにおいて増幅効率が低いものが散見されたり（図１Ｂの点線参照）、リアルタイムPCRでの融解曲線分析においてメインのピーク以外のピーク（又は肩）が出現した（図１Ｃの点線参照）。これらは、極微量の検体由来DNAの検出及び細菌種の同定における更なる検出感度の向上において障害となる場合がある。
　16S rDNA上の細菌共通の保存領域は複数存在するが、特許文献２に記載のプライマーセットが認識する７領域内について検討を行った。具体的には、特許文献２に記載のプライマーセットを基準に、共通保存領域の3’末端側及び5’末端側に数塩基～数十塩基分ずれた範囲であり、かつ十～数十塩基分のプライマーをForward, Reverseそれぞれにつき各種設計した。設計した７つの保存領域に相当する複数のプライマーペアについて、効果を確認したところ、以下の第Ｓ１群～第Ｓ７群に分類されるプライマーペア並びに第Ｋ１群～第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。
　そこで、第Ｓ１群～第Ｓ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つの第１～第７の選択されたプライマーペアの群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも４つによって細菌種の検出及び／または同定に利用し得る細菌ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ用のプライマーセットとした。なお、第１～第７の選択されたプライマーペアの内の少なくとも４つのプライマーペアを用いることによって細菌種同定用のプライマーセットとすることができる。
（プライマーセット用プライマーペア）
　第Ｓ１群：
１－１Ａ：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－２Ａ：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－３Ａ：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－８Ａ：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１９～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－９Ａ：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１－１０Ａ：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｓ２群：
２－１Ａ：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－６Ａ：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－７Ａ：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５、４７及び４８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－８Ａ：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－９Ａ：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１０Ａ：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１２Ａ：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４８及び５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１４Ａ：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１５Ａ：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２－１６Ａ：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４６～４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｓ３群：
　配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｓ４群：
４－１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４－４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｓ５群
５－１Ａ：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－５Ａ：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７２、７３及び７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－６Ａ：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５－８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｓ６群
６－１Ａ：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９３、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－４Ａ：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１１Ａ：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６－１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｓ７群
７－１Ａ：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８～１２５、１２７、１２８、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－２Ａ：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８～１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－３Ａ：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６及び１１８～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－４Ａ：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－５Ａ：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－６Ａ：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、１１８～１２２、１２４及び１２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－７Ａ：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１８、１２０、１２１、１２４及び１２６～１３０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－８Ａ：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１８～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－９Ａ：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６、及び１１８～１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１０Ａ：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１８～１２６、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１１Ａ：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７－１２Ａ：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２及び５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　更に、細菌種検出用キットを構成するプライマーペアとしては、以下の第Ｋ１群～第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。
　そこで、第Ｋ１群～第Ｋ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つの第１～第７の選択されたプライマーペアの群のうちの少なくとも１つ用いて、好ましくは少なくとも４つによって細菌種の検出及び／または同定用のキットを構成することができる。なお、第１～第７の選択されたプライマーペアの群の内の少なくとも４つのプライマーペアを用いることによって細菌種同定用のキットとすることができる。
　（キット用プライマーペア）
第Ｋ１群：
１－１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１と２３～２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１－１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｋ２群：
２－１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４６及び４８～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２－１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｋ３群：
　配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ４群：
４－１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４－４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ５群
５－１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５－８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ６群
６－１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６－１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ７群
７－１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７－１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５～１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
　上記の第Ｓ１群～第Ｓ７群から選択されるプライマーペアを含むプライマーセットは、以下のＳ－１）～Ｓ－７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
Ｓ－１）第Ｓ１群のプライマーセットとして、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ－２）第Ｓ２群のプライマーセットとして、配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ－３）第Ｓ３群のプライマーセットとして、配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ－４）第Ｓ４群のプライマーセットとして、配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ－５）第Ｓ５群のプライマーセットとして、配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ－８）第Ｓ６群のプライマーセットとして、配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
Ｓ－７）第Ｓ７群のプライマーセットとして、配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
　更に、上記のプライマーセットは、前記Ｓ－１）～Ｓ－７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが細菌種検出用として好ましく、以下のＡ～Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種検出及び／または同定用として好ましい。
（Ａ）前記Ｓ－１）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｓ－２）～Ｓ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記Ｓ－２）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｓ－１）及びＳ－３）～Ｓ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記Ｓ－３）のプライマーペアを必ず含む場合に、Ｓ－１）、Ｓ－２）及びＳ－４）～Ｓ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記Ｓ－４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ－１）～Ｓ－３）及びＳ－５）～Ｓ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記Ｓ－５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ－１）～Ｓ－４）及びＳ－６）～Ｓ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記Ｓ－６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ－１）～Ｓ－５）及びＳ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記Ｓ－７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ－１）～Ｓ－６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
　上記の第Ｋ１群～第Ｋ７群から選択されるプライマーペアを含むキット用のプライマーセットは、以下のＫ－１）～Ｋ－７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
Ｋ－１）第Ｋ１群のプライマーセットとして、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ－２）第Ｋ２群のプライマーセットとして、配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ－３）第Ｋ３群のプライマーセットとして、配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ－４）第Ｋ４群のプライマーセットとして、配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ－５）第Ｋ５群のプライマーセットとして、配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ－６）第Ｋ６群のプライマーセットとして、配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
Ｋ－７）第Ｋ７群のプライマーセットとして、配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
　更に、上記のキット用のプライマーセットは、前記Ｋ－１）Ｋ－～７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが細菌種検出用として好ましく、以下のＡ～Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種検出及び／または同定用として好ましい。
（Ａ）前記Ｋ－１）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｋ－２）～Ｋ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記Ｋ－２）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｋ－１）及びＫ－３）～Ｋ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記Ｋ－３）のプライマーペアを必ず含む場合に、Ｋ－１）、Ｋ－２）及びＫ－４）Ｋ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ－１）～Ｋ－３）及びＫ－５）Ｋ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ－１）～Ｋ－４）及びＫ－６）～Ｋ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記Ｋ－６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ－１）～Ｋ－５）及びＫ－７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記Ｋ－７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ－１）～Ｋ－６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
　上記のプライマーセットにおいてＳ－１～Ｓ－７のプライマーペアの内の４つを組み合わせて用いることによって、細菌種の同定を行うことができ、これらの７つのプライマーペアから選択される組数を５以上に増やすことが好ましく、７つＳ－１～Ｓ－７のプライマーペアの全てを組み合わせることがより好ましい。このように、選択されるプライマーの組数を増やすことで同定精度を更に向上させることができる。
　同様に、上記のキット用のプライマーセットにおいてＫ－１～Ｋ－７のプライマーペアの内の４つを組み合わせて用いることによって、細菌種の同定を行うことができ、これらの７つのプライマーペアから選択される組数を５以上に増やすことが好ましく、７つＫ－１～Ｋ－７のプライマーペアの全てを組み合わせることがより好ましい。このように、選択されるプライマーの組数を増やすことで同定精度を更に向上させることができる。
　また、本発明の効果を享受できる範囲内であれば、配列中の一部の塩基を変換したものも適用できる。原則、本願の請求項記載の配列番号の各DNA断片の相補鎖とハイブリダイズ可能なものであれば本発明のプライマー同等とみなされるが、塩基配列において１～２個の塩基が付加、欠失又は置換した塩基配列であれば本発明のプライマーと同等であると解される。
　本発明のプライマーセットは、相当量の組合せに基づき効果の有無を確認のうえ初めて見出したものであり、単なる効果の追認のレベルでは到底なしえないものであること、また、配列検索の結果、細菌種検出及び／または同定用プライマーセットとして新規な組合せであることを確認していること、を付記する。
　本発明は、本発明のプライマーセット以外に、真菌、特定微生物又はウイルスについての公知のプライマーを複数併用することを妨げるものではない。
　本発明のプライマーセットは、検体から抽出された細菌DNAからPCRにより目的とするDNA断片を増幅し、増幅されたDNA断片のTmを測定したり、分子量を測定したり、配列を解読する目的で好適に用いられる。具体的には、本発明のプライマーセットによって増幅されるBacteriaの16S rDNA配列の一部からなるDNA断片のTm値によって細菌種を同定するために好適に用いられる。
　PCRでのDNA増幅、Tm測定において、プライマーセット用またはキット用の前記第１～第７のプライマーペアのうち１つ以上のプライマーペアを使用する前に、16S rDNA上の細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を含む、塩基数が15～30bのForward及び Reverseプライマーペアによりあらかじめ目的とする配列を含むDNAを増幅し、該増幅された試料について前記プライマーセットによりさらにPCR増幅してもよい（いわゆる、Nested PCR法およびSemi-nested PCR法）。
　１回目のPCRによるDNA増幅に用いる、塩基数が15～30bのForward及び Reverseプライマーは、16S rDNA配列上の細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を含むものであれば特に限定されないが、そのプライマーペアを用いてのPCR産物のDNA鎖長が500bp～1500bpであることが好ましい。特に、２回目の増幅に用いられるプライマーセット、具体的には第K1群からK7群に記載のプライマーペアがハイブリダイズし、そこから少なくとも4つ以上のDNA断片が得られるようなDNA産物を生じるプライマーが好ましい。
　本発明に使用されるプライマーセットは、極微量の検体細菌DNAの検出及び／または細菌種の同定に好適に使用される。そのため、各プライマーペア中に汚染源である細菌由来DNAの混入が最小限に抑えられている必要がある。汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、プライマーペア調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。
　PCRにおけるPrimer濃度は特に限定されないが、一般的には0.05μM～1.0μMの範囲で、検討に応じて適宜設定する。
　＜試薬＞
　本発明でPCR分析のために使用されるプライマーセット以外の試薬は、公知のものを公知の組合せにより使用することができる。測定に必要な試薬は、PCR用の酵素、pH緩衝液、dNTP、Mg2+源、ろ過処理などにより精製された滅菌水が挙げられる。また、リアルタイムPCR分析においては蛍光色素が上記に加えて必要となる。
　＜PCR用の酵素＞
　本発明において使用されるPCR用の酵素としては、細菌由来のDNA混入量を最小限にとどめた耐熱性DNAポリメラーゼを用いることが好ましい。具体的には、真核生物で生産されたもの、高度精製処理されたもの、又は選択的膜透過性色素であるＥＭＡ（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）により処理されたものが挙げられるが、この限りではない。
　本発明における、宿主又は汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、酵素調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。なお、細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を利用して真核生物で生産され、細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子からのDNAが混入している状態の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（調製液）を用いる場合には、耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外の細菌由来のDNAの混入量を上記の上限以下とする。ＰＣＲ用酵素は、細菌由来のDNA含有量１０fg/μL未満のTaq DNA Polymeraseであることが好ましい。
　本発明において使用されるPCR用の酵素をコードする遺伝子は、耐熱性DNAポリメラーゼをコードするcDNA、ゲノムDNA、合成DNAなどいかなる遺伝子であってもよく、また１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよく、天然、あるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。更に耐熱性DNAポリメラーゼが生物由来である場合には、該耐熱性DNAポリメラーゼの由来についても特に限定されない。
　本発明で用いられる耐熱性DNAポリメラーゼの具体例としては、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、サーモコッカス・コダカラエンシスKOD１（Thermococcus kodakaraensis KOD１）、パイロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）パイロコッカス・フリオシス（Pyrococcus furiosus）、エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アクイフェックス・アエオリカス（Aquifex aeolicus）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）、パイロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）、またはメタノパイラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来の耐熱性DNAポリメラーゼを挙げることができる。
　また、耐熱性DNAポリメラーゼは遺伝子工学的に人工的に合成された耐熱性DNAポリメラーゼであってもよい。
　本発明で使用されるPCR用の酵素は、好ましくは耐熱性を有する生物由来の耐熱性DNAポリメラーゼであり、より好ましくはメタン菌、好熱好酸菌、好熱菌、超好熱菌などの原核生物由来のものである。
　（真核生物生産）
　本発明に使用されるPCR用酵素としては、真核生物を宿主として生産された酵素であることが好ましい。
　真核細胞としては菌類、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、宿主細胞としては真核生物由来の細胞であれば良く、特に限定はされない。
　菌類としては酵母やカビなどの子嚢菌、糸状菌、担子菌、接合菌などが挙げられ、中でも酵母または糸状菌が好ましく、具体例として、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クライベロマイセス属（Kluyveromyces）、チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、トリコスポロン属（Trichosporon）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidi）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Trichoderma）などが挙げられる。
　具体的には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、ヤロウイア・リポリティカ (Yarrowia lipolytica )、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）などを挙げることができる。
　動物細胞としてはヒト由来培養細胞、マウス由来培養細胞などが挙げられ、具体例としてはCHO細胞、Hela細胞などが挙げられる。植物細胞としては、植物より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、タバコ(Nicotiana)属細胞、シロイヌナズナ(Arabidopsis)属細胞、サツマイモ(Ipomoea)属細胞、ニンジン(Daucus)属細胞、イネ(Oryza)属細胞などが挙げられ、具体的にはNicotiana tabacum BY-2培養細胞、Arabidopsis thaliana培養細胞、Ipomoea batatas培養細胞、Daucus carota培養細胞、Oryza sativa培養細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、昆虫より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、ハスモンヨトウ近似種Spodoptera frugiperdaの 卵巣細胞由来培養細胞sf９株、sf21株、カイコ(Bombix mori)培養細胞Bm-N株などが挙げられる。宿主細胞として好ましくは、酵母などの増殖が早い微生物あるいは真核生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母、Nicotiana tabacumなどのタバコ(Nicotiana)属植物の培養細胞をはじめとする植物細胞、アスペルギルス・オリザなどのアスペルギルス（Aspergillus）属を始めとする糸状菌が挙げられる。
　製造方法は特に限定されないが、例えば、特許文献４に記載の方法に準じて適宜製造することができる。
　（高度精製処理）
　また、大腸菌等の細菌を宿主として生産された一般の酵素であっても、DNA分解酵素やイオン交換樹脂などを用いて宿主細菌由来のDNAを物理的に除去する高度に精製処理を施したものであって、汚染源である細菌由来DNAの混入量を酵素調製液に対して10fg未満としたものであれば、本発明に用いることができる。
　（選択性膜透過性色素による処理）
　PCR用の酵素について、選択性膜透過性色素であるEMA（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）と混合し光照射することにより、汚染源である細菌由来DNA、特に死菌細菌由来DNAを不活化することができる。不活化したDNAは、PCRによる増幅が起こらないため、検体に存在する検出の対象となる細菌由来のDNAのみ検出及び細菌種の同定することが可能となる。処理条件は、当該試薬及び当該試薬処理剤の製造販売メーカーの推奨条件に従う。
　＜その他試薬、器具等＞
　pH緩衝液は、PCR分析に供する試料として、pH=7.0～10.0（より好ましくは、pH8.0～9.0）に調整するために用いられる。具体的には、Tris塩酸緩衝液などが挙げられる。例えば、Tris塩酸緩衝液の場合、5mM～100mMで使用する。
　dNTPは、PCRによるDNA増幅のためのヌクレオシド源であり、dATP, dGTP, dCTP, dTTPの４種類が必要である。また、dNTPは、ホットスタート法に用いるために化学修飾されたもの、例えばTriLink BioTechnologies, Inc.製、CleanAmpTM dNTPを用いても良い。使用量は、dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々0.2mM前後の濃度で使用する。
　PCRによるDNA増幅においては、Mg2+が必要である。Mg2+源としては、MgCl2、MgSO4などが挙げられる。好ましいのはMgCl2であり、その使用量は、0.5mMから5.0mMの範囲で検討に応じて適宜使用する。
　蛍光色素は、リアルタイムPCRによるDNA増幅産物の検出、さらには、増幅されたDNA断片のＴｍ測定の目的で用いられ、種々の公知のものが利用できる。例えば、標識機能を有するインターカレーターを用いる方法や、増幅するDNA配列に対し特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに蛍光物質を結合したプローブを用いる方法などが挙げられる。インターカレーターとしては、不飽和型蛍光色素であるエジチジウムブロマイド、サイバー・グリーンＩ（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ）や飽和型蛍光色素であるResolight　(Roche社製)、EvaGreen（Biotim社製）などが挙げられる。好ましいインターカレーターは、不飽和型蛍光色素であるサイバー・グリーンＩ、飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolight、より好ましくは飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolightである。使用量は、使用する蛍光色素の製造販売メーカーの推奨に従う。
　その他キットには、PCRの陽性対照として使用する細菌のゲノムDNAや、陰性対照として使用する滅菌水が含まれていてもよい、
　本発明において用いられるPCR分析測定用容器（例えば分析測定用チューブ）としては、測定機器に応じた形状や構造を有するものを選択して用いることができる。測定機器の入手先によって推奨されたものを用いれば、特に問題なく測定に用いることができる。
　本発明を実施するに際してその他に必要な器具としては、ピペット、ピペット用チップ、1.5mlマイクロチューブなど広く分子生物学の実験に使用される器具類が挙げられ、装置類としてはPCR、クリーンベンチ、チューブ用遠心機など広く分子生物学の実験に使用される機器が挙げられる。
　＜コンタミレベル＞
　本発明における第二のポイントは、検出及び/または同定に使用するプライマーを含めPCR測定用に調製した試料液全体としての汚染源である細菌由来DNAの混入レベルを極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定を妨げないレベルまで下げることにある。
　特許文献４には、耐熱性ポリメラーゼ調製液中の細菌由来DNAの混入量として、10fg以下が好ましい旨記載されている。しかしながら、本発明者らが検討した結果、試薬・器具中の細菌汚染についても、極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定においては極めて重要なファクターであることを見出した。市販の試薬・器具をそのまま用いて分析に供した場合、ときによって、PCRでの増幅が見られるケースが散見された（比較例11）。
　本発明においては、使用される各試薬はもちろんのこと、測定用調製液作製のために使用される器具、ろ過水についても、汚染源である細菌由来DNAの混入を抑えることが必要である。器具については、環境からのDNAの混入を遮断した、例えばクリーンルーム等の作業空間中で、DNA混入の無いDNAを溶解する洗浄水で器具を洗浄し、洗浄後の洗浄水をPCR法による分析にかけることで、DNAの混入を検査することができる。必要に応じて、この方法を用いてＤＮＡの混入の有無を検査してもかまわない。
　本発明における、汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、同定キット全体に対して10fg以下、好ましくは5fg以下、さらに好ましくは1fg以下である。それぞれの試薬・器具に対しては、後述のキットの態様にもよるが、個別の調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。汚染源である細菌由来DNAの混入量をこのレベルに抑えることにより、極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定に必要なPCR分析にける30サイクル以上の増幅を実行しても、不要なピークの出現やTm値のずれなど無く、高感度、高精度に細菌種の検出及び細菌種の同定ができる。
　＜コンタミ除去方法＞
　本発明で使用する試薬・器具について、汚染源である細菌由来DNAの混入を抑える方法としては、ＵＶ照射処理、ガンマ線滅菌処理、限外ろ過処理、ＥＭＡ処理等が挙げられる。受入検査等により汚染源である細菌由来DNAの混入量が10fg以下であることが明確な場合には、必ずしも以下の処理を行う必要はない。
　（ガンマ線滅菌処理）
　　本発明で使用する試薬・器具について、ガンマ線を直接照射することにより、汚染源である細菌由来DNAを破壊することができる。ガンマ線照射条件については、被照射物の種類により異なる。一般的には、5kGy～30kGy、好ましくは10kGy～25kGyの処理が適用される。
　ただし、Resolight、EvaGreen、サイバーグリーンＩなど特定の蛍光色素、プライマー、ポリプロピレンなど特定の材質の器具に対しては、ガンマ線照射により劣化が生じるため、条件によってはガンマ線滅菌処理を適用できない。後述する実施例１５は、ガンマ線滅菌処理の効果について示したものである。
　（限外ろ過処理）
　　本発明で使用する試薬について、限外ろ過処理をすることにより、汚染源である細菌由来DNAを分離除去することができる。具体的には、汚染源である細菌由来DNAが細菌そのものであったり、ゲノムDNAである場合、その分子量は大きなものであることから、使用する試薬などは限外ろ過膜を通過し、ゲノムDNAは限外ろ過膜を通過しないよう、膜を選定の上、限外ろ過を実施すればよい。限外ろ過膜としては、分画分子量が1kDa～1000kDa、好ましくは、10kDa～100kDa、より好ましくは30kDa～50kDaである膜を用いることが好ましい。ただし、プライマーを限外ろ過処理する場合には、限外ろ過膜の分画分子量は10kDa～1000kDa、好ましくは30kDa～100kDa、より好ましくは、30kDa～50kDaである膜を用いる。限外ろ過膜の材質としては、特に限定されないが、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリエーテルスルホンなどが挙げられる。限外ろ過のための圧力源としては、気体加圧、遠心等いずれの方法を用いても良いが、処理量に応じて好ましい方法が選択される。
　処理量が少ない場合には、遠心膜ろ過処理が好ましい。遠心膜ろ過処理の場合の、処理液量や遠心操作時の遠心力（Ｇ）は、使用するろ過装置の製造販売メーカーの推奨に従う。
　後述する実施例１３、実施例１４及び比較例１０、比較例１１は、遠心式膜ろ過処理の効果について示したものである。
　（選択性膜透過性色素処理）
　試薬・器具について、選択性膜透過性色素であるEMA（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）で処理し光照射することにより、汚染源である細菌由来DNA、特に死菌細菌由来DNAを不活化することができる。不活化したDNAは、PCRによる増幅が起こらないため、検体に存在する検出対象となる細菌由来のDNAのみ検出及び細菌種の同定することが可能となる。
　処理条件は、当該試薬及び当該試薬処理剤の製造販売メーカーの推奨条件に従う。例えば、タカラバイオ社の”Viable Bacteria Selection Kit for PCR”では、処理対象とする溶液40μlに対して、添付のSolution A-gn液 10 μl 、Solution B-gn液 5 μl を添加し、５～１５分間遮光下で静置・反応させた後、約５分間光照射することが開示されている。後述する実施例１６は、ＥＭＡ処理の効果について示したものである。
＜キットの態様＞
　本発明の細菌種同定キットは、本発明のプライマーセットによって増幅される細菌の16S rDNA配列の一部からなるＤＮＡ断片を解析することで細菌種を同定するためのキットである。DNA断片の解析はDNA断片の分子量解析や、Ｔｍ値測定などが上げられる。好ましくはＴｍ値測定であり、その目的においてはリアルタイムPCRが好適に使用される。分子量の解析は、電気泳動や質量分析計などにより解析可能である。
　細菌種検出用キットを構成するプライマーペアとしては、以下の第Ｋ１群～第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。そこで、第Ｋ１群～第Ｋ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つのプライマーペアの少なくとも１つを、好ましくは少なくとも４つを用いて、細菌種の検出用のキットとした。
　（キット用プライマーペア）
　第Ｋ１群：
１－１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１と２３～２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１－１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１－１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｋ２群：
２－１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４６及び４８～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２－１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２－１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
　第Ｋ３群：
　配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ４群：
４－１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４－３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４－４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ５群
５－１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５－７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５－８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ６群
６－１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６－１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６－１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
　第Ｋ７群
７－１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７－１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７－１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５～１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
　上記のプライマーセット及びキットは、以下の１）～７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
１）配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
３）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
７）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
　更に、上記のキットは、前記１）～７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが好ましく、以下のＡ～Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種同定用として好ましい。
（Ａ）前記１）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記２）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記２）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記１）及び３）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記３）のプライマーペアを必ず含む場合に、１）、２）及び４）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）～３）及び５）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）～４）及び６）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）～５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）～６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
　本発明にかかる細菌種の検出及び／または同定キットは、上述したプライマーペアの１つ以上を含んで構成される。このプライマーの他に、必要に応じて、PCR用の酵素、pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)及び滅菌水から等の試薬、PCR分析測定用容器（例えば分析測定用チューブ）やその他に必要な器具などの部品から選択される少なくとも１種の試薬及び／または部品を含むことができる。更に、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を成分として加えることができる。また、PCR法の各種態様によっては、これらの成分の他に用いるPCR法に必要な成分をキットに加えてもよい。これらの各試薬または各部品は、個別に、またはその一部毎に、あるいは全部が一体など、いかなる形態で包装されていても良い。具体的には、例えば以下のような態様である。
１）用いる試薬毎に個分けする。
２）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を予め混合したもの、プライマー対及び酵素の３つに小分けする。
３）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、プライマー対を予め混合したもの、及び酵素の２つに小分けする。
４）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、プライマーと酵素、全てを予め混合する。
　上記キットは、全体として汚染源である細菌由来のDNAの混入量が10fg以下であり、使用される酵素は、真核生物生産、高度精製処理又はＥＭＡなど選択性膜透過性色素処理を施されたものであり、使用される試薬・器具（PCR分析用チューブを含む）は、必要に応じて、個別又は全体として、ガンマ線滅菌処理、遠心式膜ろ過処理又は選択性膜透過性色素処理を施されたものである。各試薬及び部品の包装に当たっては、包装密封後の包装内における細菌由来のDNAの混入量が10fg以下となるように各種処理を行う。
　＜用途分野・検体＞
　本発明の細菌種検出及び／または同定キットは、医療分野、食品分野、環境分析等、様々な分野における細菌の検出及び細菌種の同定に使用することができる。特に、医療分野においては、感染症における感染菌を検出及び／または細菌種の同定することができるため有用である。
　細菌検査に供される検体としては、特に限定されず広範囲な検体に適用可能である。具体的には、医療分野においては、血液、髄液、涙液、羊水、その他体液、カテーテル等医療器具付着物などが挙げられる。血液、羊水、髄液については、重篤な感染症の原因菌検出において特に有用である。食品分野においては、食品自体、生産途中の液体、又は固体試料、製造工程内の機器付着物などが挙げられる。
　＜DNA抽出処理＞
　本発明の同定キットを用いて検体中の細菌の検出及び／または細菌種の同定を実施する場合、検体中に存在するであろう細菌からあらかじめDNAを抽出しておく必要がある。DNA抽出方法としては、現在、アルカリ溶解法、ボイリング法、フェノール抽出法などが知られており、また、メーカー各社から専用のDNA抽出キットも販売されている。
　本発明におけるDNAの抽出方法は特に限定されないが、検体により最適な方法は異なるため、対象検体に相応した方法を選択することが望ましい。なお、本願実施例において使用しているキアゲン社製QIAamp DNA Mini Kitやロシュ社製High pure PCR template preparation kitは好適に使用可能なDNA抽出方法の一例である。また、キアゲン社製QIAamp DNA Mini Kitのマニュアルにあるように、溶出量は必要に応じて５０mｌから２００mlの中で変えることができる。
　＜PCR分析＞
　本発明のプライマーセット又はキットは、PCR法において使用される。PCR法としては、検体細菌を検出するための目的遺伝子の増幅のためのPCR法であれば種々のPCR法を利用できる。好ましい分析法としては、リアルタイムPCRであり、より好ましくはリアルタイムPCRとTm測定のための解曲線分析の組み合わせである。この場合、使用するリアルタイムPCR機器のスペックとしては、温度制御能が±0.1℃であることが好ましい。以下、PCRおよびリアルタイムPCRとそれを用いたTm測定の具体例を列記する。
　PCRおよびリアルタイムPCRにおいては、装置、手法など通常知られたものを使用すればよい。
　PCRにおける温度サイクルの条件（温度、時間、昇降温速度、サイクル数）は特に限定されず、使用するプライマーや酵素、鋳型などの性質やPCR後のDNA検出方法の感度に応じて適宜設定すればよい。こうした条件の設定については多くの文献が既に知られている。
　PCRにおいて、一般的には、鋳型二本鎖DNAの熱変性ステップ、プライマーのアニーリングステップ、酵素によるDNA伸長ステップを繰り返す。熱変性のステップは鋳型二本鎖DNAが一本鎖に解離する温度と時間であればよく、例えば90℃～98℃で数秒～数分を設定する。またPCR開始時にはその1回目のサイクルにのみ、数分～10分の熱変性の過程を追加することも多い。プライマーのアニーリングステップはプライマーの塩基配列、塩基数に応じ設定するが、40℃～72℃で数秒～数十秒を設定することが多い。DNA伸長ステップにおいては、温度については酵素の最適温度などの性質に応じ、例えば、58℃～76℃が一般的であり、DNA伸長ステップの時間については増幅させたいDNAの鎖長と酵素のDNA合成速度から必要時間を概算し設定する。熱変性、アニーリング、伸長のステップを繰り返すことで目的のDNAを増幅させるが、この繰り返し回数は、鋳型DNAの量や、酵素の量、PCR後のDNA検出方法の感度に応じて、適宜変更すればよいが、一般的な例として10～50回が例示される。また、アニーリングの温度とDNA伸長の温度が同程度である場合、両ステップを同時に行うことも可能である。
　リアルタイムPCRにおいても、DNA増幅に必要な熱変性、アニーリング、DNA伸長についての条件設定、さらにはそれらのステップの繰り返し回数は、上記のPCRについての記載と同様である。リアルタイムPCRにおいては、DNA伸長のステップの前後などに、インターカレーターやプローブに由来する蛍光強度を測定することで増幅されたDNA量を定量ないしは見積もることが可能である。蛍光強度を測定する温度は使用するプローブの種類などに応じて適宜変更可能である。蛍光強度を測定する温度は、例えばインターカレーターを用いての実施の場合は、DNA伸長時の温度そのままでも良く、また、増幅される目的DNAの鎖長が比較的長く、そのTm値が比較的高い場合には、プライマーダイマーなどの比較的鎖長が短い非特異的に増幅された目的外DNA（非特異的増幅DNAともいう）はそのTm値が比較的低いことを利用して、目的DNAのTm値と非特異的増幅DNAのTm値の中間値はじめとする、間の温度に設定しても良い。こうすることで、特にインターカレーターを用いての実施ではプライマーダイマーなどの非特異的増幅DNAのみが二本鎖から一本鎖に解離し、蛍光強度から定量ないしは見積もられるDNA量は目的DNAについてのものとすることが可能である。
　さらに、リアルタイムPCRにおいてはDNA増幅工程の終了後、融解曲線解析により、増幅されたDNAのTmを測定できる。融解曲線分析では、温度変化に応じたDNAの二本鎖から一本鎖への解離を観察するが、その温度および検出条件は特に限定はない。一般的に、熱変性（Denaturation）（90℃から98℃）、二本鎖形成（Annealing）（40℃から80℃）、融解（Melting）（二本鎖形成の温度から98℃前後まで徐々に昇温）の段階をへて、融解のステップでの蛍光強度の変化をモニターすることで、融解曲線を得て、そこからTm値を得ることができる。こうした測定はリアルタイムPCR装置の多くの機種で可能であり、機器の使用方法に準じて実施可能である。
　＜検出及び／または同定方法＞
　本発明にかかる検体中の細菌種の検出または同定方法としては、以下の工程を有する方法を用いることができる。
（１）前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程。
（２）前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程。
　プライマーとして本発明にかかるプライマーセットを用いることによって、高感度の細菌種の同定を行うことができる。更に、先に述べたコンタミレベルをコントロールした試薬や器具を用いることにより、更なる高感度化及び迅速化を達成することができる。
　この検出及び／または同定方法では、増幅工程を、目的遺伝子以外の遺伝子（目的外遺伝子）の増幅抑制下で行うことが好ましい。この目的外遺伝子の増幅抑制には、ホットスタート法PCRが利用できる。一例として、抗DNAポリメラーゼ抗体を用いるホットスタート法が挙げられる。その際、耐熱性DNAポリメラーゼ１Ｕに対して、過剰量の抗DNAポリメラーゼ抗体を用いることが好ましい。また、特開2000-4847や特開平10-276776に開示されているようにDNAポリメラーゼに対して、可逆的な化学修飾を施すことによるホットスタート法も好適に利用できる。さらには、化学修飾されたdNTPを用いたり、米国特許出願第２００７０２８１３０８号のように化学修飾されたプライマーを用いたホットスタート法も好適に利用できる。また、加熱により溶融するワックスなどを用いて、DNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅に必要不可欠な構成成分（例えば、プライマーやdNTPやMg2+塩）とを物理的に隔離することによるホットスタート法も好適に利用できる。
　増幅産物の検出及び／または同定工程は、検出用の蛍光標識を有するインターカレーターやプローブを用いたリアルタイムPCRによりTmを測定することで実施可能である。好ましくはインターカレーターを用いたリアルタイムPCRであり、好ましいインターカレーターは不飽和型蛍光色素であるサイバー・グリーンＩ、飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolight、より好ましくは飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolight である。
　リアルタイムPCRを用いたTm測定による検出及び／または同定工程では、前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行うことができる。そのための方法としては、目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
（１）目的遺伝子増幅産物の融解温度（TmＡ）が、目的外遺伝子の増幅産物の融解温度（TmＢ）よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
（２）増幅産物の検出を、TmＡとTmＢとの間の温度で行う
ことにより設定し、目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法が好ましい。
　更に、増幅工程と検出及び／または同定工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムPCRにより行い、目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる方法を用いることができる。
　検出及び／または同定工程は、増幅産物をゲル上などでの電気泳動により展開、可視化する増幅産物の解析により行うこともできる。また、検出及び／または同定工程は、増幅産物の塩基配列を解読することによる増幅産物の解析により行うことも可能である。さらに、この工程は増幅産物の分子量を質量分析計で測定して解析する方法によって行うことにもできる。
　＜同定方法＞
　検出細菌を同定するために、本発明にかかるプライマーセットを用いて検出細菌から得られるDNA断片のTm値を利用することができる。同定するためのアルゴリズムとしては、上述したTm値そのものの組合せだけでなく、各Tm値間の差の組合せを利用して同定することで、例えば機器の試行回毎の測定誤差といった測定誤差の影響を最小限とする工程を付加することができる。
　上記の、機器の試行回毎の測定誤差を補正する方法として、“Tm値の組合せの平均値を算出し、その平均値からの各Tm値の相対値の組合せ”を利用することが出来る。つまり、Tm値の組合せの配置を“形”として同定する方法である。Tm値の組合せの配置を２次元で示した“形”は測定誤差に影響されない。例えば、検出細菌に特異的なTm値の組合せ（ｎ個（ｎは4以上、7以下の整数））をＴ１db～Ｔｎdbとし（dbはdatabase）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１db～ｄｎdbとする。同様に検体から得られた未知の検出対象生物のTm値の組合せ（ｎ個（ｎは4以上、7以下の整数））をＴ１ref～Ｔｎrefとし（refはreference）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１ref～ｄｎrefとする。そうしてdatabaseと比較し、「相対値の組合せが近似したもの＝Tm値の組合せの配置の“形”が近いもの」、を同定アルゴリズムとして利用する。
　具体的な計算方法としては、例えば、ユークリッド空間上の２点間距離を算出する方法（式１）が挙げられるが、この限りではない。
 [式1] 
Dist.=√[(D1db－D1ref)2+(D2db－D2ref)2+….(Dndb－Dnref)2]
　式１による計算方法であれば、この計算式によって得られるＤ値が０に最も近いものが求める検出細菌種として同定される。ただし、使用するPCR機器の測定誤差の関係上、機器の温度制御スペックやプライマーの数にもよるが、Ｄ値の許容範囲としては、0～0.37、好ましくは0～0.30である。
　以上のアルゴリズムは、コンピュータ上でデータベース型同定ソフトウェアとして利用できる。
　＜同定可能な細菌種＞
　同定可能な微生物は、分類上細菌に該当するものであれば、機構上検出及び細菌種の同定が可能である。具体的な細菌種としては、Achromobacter denitrificans、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Actinomyces israelii、Aerococcus christensenii、Aeromonas hydrophila、Aeromonas sobria、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Alcaligenes faecalis、Alistipes onderdonkii、Anaerococcus vaginalis、Anaeroglobus geminatus、Arcanobacterium haemolyticum、Arcanobacterium pyogenes、Arthrobacter cumminsii、Atopobium vaginae、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus sphaericus、Bacillus subtilis、Bacteroides dorei、Bacteroides finegoldii、Bacteroides fragilis、Bacteroides nordii、Bacteroides salyersiae、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides vulgatus、Bartonella henselae、Bartonella quintana、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bilophila wadsworthia、Bordetella pertussis、Borrelia burgdorferi、Borrelia recurrentis、Brevibacillus laterosporus、Brucella abortus、Brucella melitensis、Brucella suis、Burkholderia cepacia、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Campylobacter coli、Campylobacter curvus、Campylobacter jejuni、Campylobacter rectus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga granulosa、Capnocytophaga haemolytica、Capnocytophaga sputigena、Cardiobacterium hominis、Chryseobacterium meningosepticum、Citrobacter amalonaticus、Citrobacter freundii、Citrobacter koseri、Clostridium butyricum、Clostridium difficile、Clostridium histolyticum、Clostridium hylemonae、Clostridium paraputrificum、Clostridium perfringens、Clostridium septicum、Clostridium sporogenes、Clostridium subterminale、Clostridium tertium、Clostridium tetani、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium confusum、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium glucuronolyticum、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium kroppenstedtii、Corynebacterium macginleyi、Corynebacterium minutissimum、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium riegelii、Corynebacterium tuberculostearicum、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium xerosis、Edwardsiella tarda、Eggerthella lenta、Eikenella corrodens、Elizabethkingia meningoseptica、Empedobacter brevis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter sakazakii、Enterococcus avium、Enterococcus bovis、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus cecorum、Enterococcus dispar、Enterococcus durans、Enterococcus faecium、Enterococcus flavescens、Enterococcus gallinarum、Enterococcus gilvus、Enterococcus hirae、Enterococcus italicus、Enterococcus malodoratus、Enterococcus mundtii、Enterococcus pallens、Enterococcus pseudoavium、Enterococcus raffinosus、Enterococcus sanguinicola、Erysipelothrix rhusiopathiae、Escherichia albertii、Escherichia coli、Eubacterium lentum、Eubacterium limosum、Finegoldia magna、Francisella tularensis、Fusobacterium necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium varium、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、Geobacillus stearothermophilus、Granulicatella adiacens、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Hafnia alvei、Halomonas venusta、Helicobacter cinaedi、Helicobacter pylori、Kingella kingae、Klebsiella granulomatis、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus jensenii、Lactococcus garvieae、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Micrococcus luteus、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nocardia cyriacigeorgica、Odoribacter splanchnicus、Pantoea agglomerans、Parabacteroides distasonis、Parvimonas micra、Pasteurella multocida、Pediococcus damnosus、Peptoniphilus asaccharolyticus、Peptoniphilus gorbachii、Peptostreptococcus anaerobius、Plesiomonas shigelloides、Porphyromonas asaccharolytica、Porphyromonas gingivalis、Prevotella bivia、Prevotella bivia、Prevotella corporis、Prevotella intermedia、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella timonensis、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes、Propionibacterium avidum、Propionibacterium granulosum、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia rettgeri、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Serratia plymuthica、Shigella boydii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Spirillum minus、Staphylococcus aureus、Staphylococcus auricularis、Staphylococcus capitis、Staphylococcus caprae、Staphylococcus carnosus、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus pasteuri、Staphylococcus pettenkoferi、Staphylococcus pulvereri、Staphylococcus saccharolyticus、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus schleiferi、Staphylococcus simulans、Staphylococcus warneri、Staphylococcus xylosus、Stenotrophomonas maltophilia、Streptobacillus moniliformis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus canis、Streptococcus constellatus、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equi、Streptococcus gallolyticus、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantarius、Streptococcus iniae、Streptococcus intermedius、Streptococcus lutetiensis、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus pasteurianus、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus porcinus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus suis、Streptococcus vestibularis、Sutterella wadsworthensis、Treponema pallidum、Ureaplasma parvum、Vagococcus fluvialis、Veillonella atypica、Veillonella parvula、Vibrio alginolyticus、Vibrio cholerae、Vibrio fluvialis、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosisなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　以下、本発明を実施例及び試験例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（製造例１）ＤＮＡＰ調製方法
　特許文献４の段落０１９５から０２０１に準じて以下の方法でｅ－ＤＮＡＰを調製し、以下の実施例で使用した。
（１）ＤＮＡの合成
　T.aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはGenScript社にて全ＤＮＡ配列を合成した。この際、コドン配列を酵母宿主、S.cerevisiaeに最適化した。合成したＤＮＡは、プラスミドpUC５７に組み込まれGenScript社より提供され、ベクターpUC-TA０１を得た。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、５’末端配列にHindIII、３’末端配列にEcoRI制限酵素サイトが入るように設計した。
（２）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
　合成したT. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES２（invitrogen社）に挿入し、ベクターpYES-TA０１を構築した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、pUC-TA０１を制限酵素HindIII、EcoRI（TaKaRa Bio）にて消化し、１％アガロースゲル（Wako）にて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を回収した。プラスミドpYES２はEcoRI、NotI（TaKaRa Bio）にて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１（TaKaRa Bio）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子とpYES２を連結した。
（３）S.cerevisiaeの形質転換
　Saccharomyces cerevisiae X２１８０のゲノムを鋳型に配列番号１３４をフォワードプライマーとして配列番号１３５をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない約５５０ｂｐの断片Ａを得た。同様にSaccharomyces cerevisiae X２１８０のゲノムを鋳型に配列番号１３６をフォワードプライマーとして配列番号１３７をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない約５５０ｂｐの断片Ｂを得た。次に断片Ａと断片Ｂを鋳型に配列番号１３４をフォワードプライマーとして配列番号１３７をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない断片ＡＢを得た。次にSaccharomyces cerevisiae X２１８０を培養後にコンピテントセルを作成し、断片ＡＢをFastTrackTM-Yeast Transformation Kit（Geno Technology社）を用いて形質転換した。５－ＦＯＡが終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるよう含まれた最小寒天培地に形質転換体を塗布した。この寒天培地を２８℃にて３日間培養後に５－ＦＯＡを含む最小寒天培地にて生育可能な株を取得し、Saccharomyces cerevisiae X２１８０－Ｓ株とした。なお、酵母　Saccharomyces cerevisiae X２１８０株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手可能である。
　この得られたベクターpYES-TA０１を酵母（Saccharomyces cerevisiae X２１８０－Ｓ株）へ導入した。宿主はウラシル要求株であれば他の酵母を用いることも可能である。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kit（Geno Technology社）を用いた。
（４）S.cerevisiaeによるT. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
　以下の実験では、超純水・器具はDNAフリーなものを用いておこなった。得られた形質転換体は、SD培地（０.６７% Bacto yeast nitrogen base、２% Galactose、）１００mlにて、２８℃、７２時間振とう培養を行った。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後１２０００rpm、３０分間遠心分離を行い、酵母破砕液上清および沈殿物を得て細胞抽出物とした。次に、上記細胞抽出物を７０℃にて６０分間熱処理をおこない、熱処理後に５０００rpm、３０分間４℃遠心分離し上清を回収した。この上清に終濃度０．１％になるようにポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ）を添加し、１分間激しく攪拌した後に５分間室温で放置した。その後、８０００rpm、３０分間４℃遠心分離し上清を回収し、この上清を０．４５mｍのフィルターに通した。
　（５）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
　以下の実験では、超純水・器具はDNAフリーなものを用い、低温キャビネット内にておこなった。回収した粗抽出液を緩衝液Ａ（５０mM Tris-HCl pH７.５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ（ＧＥ）に供し、その後５％の緩衝液Ｂ（５０mM Tris-HCl pH７.５、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに流し夾雑物を溶出した。次に１５％の緩衝液Ｂをカラムに流し耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶出した。溶出した酵素溶液を１５％の緩衝液Ｂで平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎに供し、緩衝液Ｂを５０％まで段階的に高めていき、酵素が溶出された画分を回収した。この酵素画分の緩衝液を保存用緩衝液（４０mM Tris-HCl pH８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）に置換し、さらに保存用溶液（９８％ グリセロール、１％ Ｔｗｅｅｎ２０、１％ ＮＰ－４０）を等量添加し攪拌後に酵素溶液として－２０℃で保存した。
（６）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性測定
　まず、表１に示した溶液を調製し、７０℃で５分間保温した。この溶液を用いて表２に示したように反応用液を調製し７４℃で５分間反応をおこない、反応停止のために１０ｍＭ　ＥＤＴＡを５０mＬ添加した。反応停止後にＳＹＢＥＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ １０mＬと滅菌水１５mＬを添加し室温で５分間放置後に蛍光の測定（Ｅｍ：４９７ｎｍ, Ｅｘ：５２８ｎｍ）をおこなった。Ｔｈｕｎｄｅｒ　Ｔａｑ（日本ジーン）のユニット数を基準とすることで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　（実施例１）ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲによる細菌同定
　本実施例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した溶液のうち表３に示すＥＣ１とＥＣ３を反応の鋳型に用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。なお、大腸菌エシェリヒア・コリMG1655株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲを行うにあたり、表４に示した組成で、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　プライマーについてはフォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２を用いた。ＰＣＲ終了後に反応液を回収し、ＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈した。この希釈した溶液を鋳型として、表５に示した組成で反応をおこなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　ＰＣＲの方法については、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。プライマーは、（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせの７セットでおこない、ＤＮＡ増幅後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこないＴｍ値を測定した。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。この結果を比較例１の結果とあわせて表６に示す。
　（比較例１）　実施例１（nested-PCR）の比較（ｄｉｒｅｃｔＰＣＲ）
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定しＤＮＡフリーな超純水にて希釈した溶液のうち、表３にあるようにＥＣ１とＥＣ３を反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成でおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲの方法については、９５℃５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　２０秒を３５回繰り返した。プライマーは、（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせの７セットでおこない、ＤＮＡ増幅後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこないＴｍ値を測定した。得られたＴｍ値については特許文献４の実施例７に準じて、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。この結果を実施例１の結果とあわせて表６に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　（実施例２）　プライマー検証（精製coliゲノムでの電気泳動）
　本実施例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。プライマーの組み合わせについては、（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２－５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（２）配列番号１及び６－１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６－２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（３）配列番号２８－４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４－５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（４）配列番号５３－５６からなるフォワードプライマーと配列番号５７－６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（５）配列番号６２－６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（６）配列番号７６－９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１－１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（７）配列番号１０４－１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６－１３１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例２の結果と合わせて表７－１～表７－７に示す。
　なお、表７における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異増幅産物
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
　（比較例２）　実施例２の比較例
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。その結果を実施例２の結果と合わせて表７－１～表７－７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　（実施例３）　プライマー検証（精製coliゲノムでのPCR・Melting）
　本実施例では、表３のＥＣ３を鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２－５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（２）配列番号１及び６－１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６－２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（３）配列番号２８－４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４－５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（４）配列番号５３－５６からなるフォワードプライマーと配列番号５７－６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（５）配列番号６２－６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（６）配列番号７６－９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１－１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（７）配列番号１０４－１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６－１３１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例３の結果と合わせて表８－１～表８－７に示す。
　なお、表８における評価は以下の基準に従って行った。
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
-：ピーク無し
　（比較例３）　実施例３の比較例
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例３の結果と合わせて表８－１～表８－７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
　（実施例４）　プライマー検証（摸擬ＤＮＡ検体での電気泳動）
　本実施例では、１００mｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。プライマーの組み合わせについては、（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２－５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（２）配列番号１及び６－１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６－２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４及び４５及び４７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号３０からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３１からなるフォワードプライマーと配列番号４７からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３２からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３３－４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４－５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５４からなるフォワードプライマーと配列番号５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５５からなるフォワードプライマーと配列番号５７－５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５６からなるフォワードプライマーと配列番号６１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０および７１および７３－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号６３－６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（６）配列番号７６－９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１－１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（７）配列番号１０４－１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６－１３１からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例４の結果と合わせて表９－１～表９－７で示す。
　なお、表９における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異産物増幅
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
　（比較例４）　実施例４の比較例
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本実施例では、１００mｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。その結果を実施例４の結果と合わせて表９－１～表９－７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
　（実施例５）　プライマー検証（摸擬DNA検体でのPCR・Melting）
　本実施例では、１００mｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。プライマーの組み合わせについては、（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２－５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（２）配列番号１および６－１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６－２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４及び４５及び４７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号３０からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３１からなるフォワードプライマーと配列番号４７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３２からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３３－４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４－５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５４からなるフォワードプライマーと配列番号５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５５からなるフォワードプライマーと配列番号５７－５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５６からなるフォワードプライマーと配列番号６１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０および７１および７３－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号６３－６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０－７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（６）配列番号７６－９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１－１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、（７）配列番号１０４－１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６－１３１からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号５からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例５の結果と合わせて表１０－１～表１０－７で示す。
　なお、表１０における評価は以下の基準に従って行った。
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis：
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
-：ピーク無し
　（比較例５）　実施例５の比較例
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本実施例では、１００mｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせになるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
　リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例５の結果と合わせて表１０－１～表１０－７で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
  
　（実施例６）　ｄｉｒｅｃｔＰＣＲにおける特許文献４との比較
　本実施例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した表３で示すＥＣ１とＥＣ２溶液を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットの全てを用いてＰＣＲをおこない、得られた各断片のＴｍ値について特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。この結果を比較例６の結果とあわせて表１１に示す。
　（比較例６）　実施例６の特許文献４におけるプライマー部分
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した表３で示すＥＣ１とＥＣ２溶液を反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットの全てを用いてＰＣＲをおこない、得られた各断片のＴｍ値について特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。この結果を実施例６の結果とあわせて表１１に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
  
　（実施例７）　摸擬検体での検出感度および特許文献４におけるプライマーとのｎｅｓｔｅｄＰＣＲの比較
　本実施例では、健常人の全血２ｍｌに表１２で示したようになるよう大腸菌懸濁液を添加したものを用意した。実験は全て富山大学（〒930-0194　富山県富山市杉谷2630）の付属病院検査部検査室内にて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
  
　全血に大腸菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液、Ｂ１とＢ２を鋳型としてＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５の組み合わせについておこない表４に示した組成で反応をおこなった。次にこの反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。プライマーは、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットの全てを用いて用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較し検証を行った。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。その結果を比較例７の結果とあわせて表１３に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
　（比較例７）　実施例７の特許文献４におけるプライマー部分
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では、健常人の全血２ｍｌに表１２で示したようになるよう大腸菌懸濁液を添加したものを用意した。実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。全血に大腸菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液を鋳型としてＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｑ　５－ｐｌｅｘ （ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムはまず、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２の組み合わせについておこない、表１に示した組成で反応をおこなった。次にこの反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、これを鋳型として表２に示した組成で９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせの
７セットの全てを用いておこなった。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較し検証を行った。その結果を実施例７の結果とあわせて表１３に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
  
　（実施例８）　多菌種でのプライマーの検証。（電気泳動）
　本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ, Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲプログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。プライマーは、
（１）配列番号１３と配列番号１７の組み合わせ、
（２）配列番号３４と配列番号５０の組み合わせ、
（３）配列番号４３と配列番号５０の組み合わせ、
（４）配列番号５４と配列番号６１の組み合わせ、
（５）配列番号５５と配列番号５８の組み合わせ、
（６）配列番号５５と配列番号６１の組み合わせ、
（７）配列番号６８と配列番号７２の組み合わせ、
（８）配列番号７７と配列番号１０３の組み合わせ、
（９）配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、
（１０）配列番号１１４と配列番号１２５の組み合わせ、
（１１）配列番号１１５と配列番号５
の組み合わせについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例８とあわせて表１４－１～１４－５に示す。
　なお、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ, Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの菌株については、理化学研究所バイオソースセンター、ジャパンカルチャーコレクションオブマイクロオーガニズムズにて入手可能である。
　なお、表１４における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異産物増幅
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis：
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
-：ピーク無し
　（比較例８）　多菌種でのプライマーの検証。（電気泳動）
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ, Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲプログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。
　プライマーは、
（１）配列番号１と配列番号１６の組み合わせ、
（２）配列番号２８と配列番号４４の組み合わせ、
（３）配列番号５１と配列番号５２の組み合わせ、
（４）配列番号５３と配列番号５７の組み合わせ、
（５）配列番号６２と配列番号７０の組み合わせ、
（６配列番号７６と配列番号９１の組み合わせ、
（７）配列番号１０４と配列番号２の組み合わせ
についてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を実施例８とあわせて表１４に示す。
　（実施例９）　多菌種でのプライマーの検証。（PCR）
　本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ, Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。プライマーは、
（１）配列番号１３と配列番号１７の組み合わせ、
（２）配列番号３４と配列番号５０の組み合わせ、
（３）配列番号４３と配列番号５０の組み合わせ、
（４）配列番号５４と配列番号６１の組み合わせ、
（５）配列番号５５と配列番号５８の組み合わせ、
（６）配列番号５５と配列番号６１の組み合わせ、
（７）配列番号６８と配列番号７２の組み合わせ、
（８）配列番号７７と配列番号１０３の組み合わせ、
（９）配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、
（１０）配列番号１１４と配列番号１２５の組み合わせ、
（１１）配列番号１１５と配列番号５の組み合わせ
についてＰＣＲをおこない、その後増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値を測定した。この結果を元に増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を比較例５とあわせて表１４に示す。
　（比較例９）　多菌種でのプライマーの検証。（PCR）
　以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ, Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｒｏｓｉｓ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３５回繰り返した。
　プライマーは、配列番号１と配列番号１６の組み合わせ、配列番号２８と配列番号４４の組み合わせ、配列番号５１と配列番号５２の組み合わせ、配列番号５３と配列番号５７の組み合わせ、配列番号６２と配列番号７０の組み合わせ、配列番号７６と配列番号９１の組み合わせ、配列番号１０４と配列番号２の組み合わせについてＰＣＲをおこない、その後増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値を測定した。この結果を元に増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例９と合わせて表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
  
　（実施例１０）　大腸菌以外の菌種の模擬血液検体での検証
　本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ, Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌｃｔｉａｅの培養菌体を表１５に示した濃度になるように健常人の全血２ｍｌに添加したものを富山大学の協力の下に用意した。実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。全血に菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液を鋳型として、富山大学付属病院検査部検査室内でＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５の組み合わせについておこなった。反応は表４に示した組成で反応をおこなった。この反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーは、
フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットを用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた各菌種のＴｍ値と比較し検証を行った。
その結果を表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
  
　（実施例１１）　富山大学付属病院臨床検体での検証
　本実施例では富山大学付属病院において敗血症が疑われる患者の血液検体から抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として用い、実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭを用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５の組み合わせについておこなった。反応は表４に示した組成で反応をおこなった。この反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃　９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーは、
フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットを用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた各菌のTm値を入力したデータベース内のデータと比較し検証を行った。
その結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
  
（実施例１２）　ホットスタートＰＣＲについて
　本実施例ではＤＮＡ溶液（ＨＥ）を鋳型として使用し、ホットスタート用ｄＮＴＰであるＣｌｅａｎＡｍｐ　ｄＮＴＰｓ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と通常用いられるｄＮＴＰを用いて増幅反応をおこない、その結果を比較した。組成は、表４及び表１７に示した組成で反応をおこなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
  
　超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。鋳型は表３で示したEC3を用いた。プライマーはフォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２の組み合わせでおこない、ＰＣＲプログラムは、まず９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。
　その結果を図２に示す。
　（実施例１３）　除ＤＮＡ処理（限外ろ過，大腸菌ゲノム添加実験）
　超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００mＬ作成し、さらに４ｐｇの大腸菌ＤＮＡを添加した。この溶液を上記操作を終えたアミコンＵＦＣ５０５０８に供し、５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液を回収した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例１０の結果と合わせ図３に示す。
　（比較例１０）　除ＤＮＡ処理（限外ろ過，大腸菌ゲノム添加実験のネガコン）　
　アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００mＬ作成し、この溶液を上記操作を終えたアミコンＵＦＣ５０５０８に供し、５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液を回収した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を実施例１３の結果とあわせ図３に示す。
　（実施例１４）　除DNA処理（コンタミ試薬の精製，direct-PCR）
　超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００mＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００mＬ作成した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を２６回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例１１の結果と合わせ図４に示す。
　（比較例１１）　除DNA処理（コンタミ試薬の精製，direct-PCR）
　超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。表４に示す反応組成の溶液を作成し、PCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を２６回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を実施例１４の結果とあわせ図４に示す。
　（実施例１５）　除ＤＮＡ処理（ガンマ線滅菌　大腸菌DNAをガンマ線処理）
　超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。滅菌水１００mＬに５００ｆｇの大腸菌ＤＮＡを添加した溶液を用意し、これに１０ｋＧｙ及び２５ｋＧｙのガンマ線を照射した。この溶液を鋳型として以下の条件でＰＣＲをおこなった。反応は表１に示した組成で反応をおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ　ＭＤｘ　５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについてはまず、は９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃　１０秒、７２℃　３０秒を４０回繰り返した後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃　１０秒、７２℃　１０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
  
　（実施例１６）　除ＤＮＡ処理（ＥＭＡ）
　超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。表５に示す反応液組成から鋳型、プライマー、ｅｖａｇｒｅｅｎを除いた溶液を調製し、これに２５ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した。次に終濃度２０μＭになるようＥｔｈｉｄｉｕｍ　Ｍｏｎｏａｚｉｄｅ Ｂｒｏｍｉｄ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を添加した上記溶液と、ネガティブコントロールとしてＥＭＡを添加していない上記溶液を用意した。これらの溶液を５７０ルーメンのＬＥＤ電球の下に設置し１５分間、光を照射した。その後、プライマー、ＥｖａＧｒｅｅｎを加え、９５℃ １０分間加熱した後に、９５℃ １０秒、６０℃　３０秒、７２℃を６０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない目的産物の増幅の有無を検証した。プライマーはフォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２を用いた。その結果を図５に示す。
　（実施例１７）　４つのＴｍ値での菌種の同定
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅの４菌種の培養液を無記名にして、ブラインドテストをおこなった。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉを細菌1，　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを細菌２，　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを細菌３、　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅを細菌４とし、ＤＮＡ抽出をおこない同定を試みた。ＰＣＲ反応は実施例１１の方法と同様におこなった。同定はその内４つのＴｍ値の組み合わせでのみでおこなった。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ　Ｑの測定誤差を加味し、Ｄｉｓｔ＜０．２以下のものを同一菌種であるとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
  

Claims (28)

  1. 　下記第Ｓ１群～第Ｓ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする細菌DNA増幅ＰＣＲ用のプライマーセット。
    　第Ｓ１群：
    １－１Ａ：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－２Ａ：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－３Ａ：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－８Ａ：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１９～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－９Ａ：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    １－１０Ａ：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    　第Ｓ２群：
    ２－１Ａ：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－６Ａ：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－７Ａ：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５、４７及び４８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－８Ａ：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－９Ａ：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１０Ａ：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１２Ａ：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４８及び５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１４Ａ：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１５Ａ：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ２－１６Ａ：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４６～４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    　第Ｓ３群：
    　配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｓ４群：
    ４－１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４－２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４－３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ４－４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｓ５群
    ５－１Ａ：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－５Ａ：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７２、７３及び７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－６Ａ：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ５－８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｓ６群
    ６－１Ａ：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９３、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－４Ａ：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１１Ａ：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ６－１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｓ７群
    ７－１Ａ：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８～１２５、１２７、１２８、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－２Ａ：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８～１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－３Ａ：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６及び１１８～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－４Ａ：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－５Ａ：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－６Ａ：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、１１８～１２２、１２４及び１２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－７Ａ：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１８、１２０、１２１、１２４及び１２６～１３０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－８Ａ：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１８～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－９Ａ：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６、及び１１８～１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－１０Ａ：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１８～１２６、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－１１Ａ：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ７－１２Ａ：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２及び５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
  2. 　以下の１）～７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含む請求項１に記載のプライマーセット。
    １）配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ３）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
    ７）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
  3. 　前記１）～７）のプライマーペアのいずれか１つを含む請求項２に記載のプライマーセット。
  4. 　以下のＡ～Ｇのいずれか１つの組み合わせを含む請求項３に記載のプライマーセット。
    （Ａ）前記１）のプライマーセットを含む場合において、前記２）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｂ）前記２）のプライマーセットを含む場合において、前記１）及び３）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｃ）前記３）のプライマーペアを含む場合に、１）、２）及び４）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｄ）前記４）ののプライマーペアを含む場合に、前記１）～３）及び５）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｅ）前記５）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～４）及び６）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｆ）前記６）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｇ）前記７）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
  5. 　細菌種検出用である請求項１～４のいずれかに記載のプライマーセット。
  6. 　細菌種検出及び／または同定用である請求項４に記載のプライマーセット。
  7. 　前記７つのプライマーペアのうちの、少なくとも４つのプライマーペアを含む請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌種同定用のプライマーセット。
  8. 　下記第Ｋ１群～第Ｋ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする細菌種検出用キット。
    　第Ｋ１群：
    １－１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２１と２３～２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    １－１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６～２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    １－１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    　第Ｋ２群：
    ２－１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７～４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４６及び４８～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２－１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ２－１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４～４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    　第Ｋ３群：
    　配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｋ４群：
    ４－１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４－２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４－３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ４－４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７～５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｋ５群
    ５－１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５－７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ５－８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０～７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｋ６群
    ６－１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６－１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ６－１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１～１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
    　第Ｋ７群
    ７－１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６～１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ７－１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
    ７－１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５～１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
  9. 　以下の１）～７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含む請求項８に記載のキット。
    １）配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ３）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ４）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ５）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
    ６）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
    ７）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
  10. 　前記１）～７）のプライマーペアのいずれか１つを含む請求項９に記載のキット。
  11. 　以下のＡ～Ｇのいずれか１つの組み合わせを含む請求項１０に記載のキット。
    （Ａ）前記１）のプライマーセットを含む場合において、前記２）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｂ）前記２）のプライマーセットを含む場合において、前記１）及び３）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｃ）前記３）のプライマーペアを含む場合に、１）、２）及び４）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｄ）前記４）ののプライマーペアを含む場合に、前記１）～３）及び５）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｅ）前記５）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～４）及び６）～７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｆ）前記６）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
    （Ｇ）前記７）のプライマーペアを含む場合に、前記１）～６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
  12. 　細菌種検出及び／または同定用である請求項１１に記載のキット。
  13. 　前記７つのプライマーペアのうちの、少なくとも４つのプライマーペアを含む請求項８～１１のいずれか１項に記載の細菌種同定用のキット。
  14. 　配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２～５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーから選択された少なくとも１種との追加のプライマーペアを更に含む請求項８～１３のいずれか１項に記載のキット。
  15. 　前記追加のプライマーペアが配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーのプライマーペアである請求項１４記載のキット。
  16. 　ＰＣＲ用酵素を更に含む請求項８～１５のいずれか１項に記載のキット。
  17. 　プライマー及びＰＣＲ酵素は個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項１６に記載のキット。
  18. 　pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器の少なくとも１つを更に含む請求項１６に記載のキット。
  19. 　プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器の個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下であることを特徴とする、請求項１８記載のキット。
  20. 　プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器は個別に包装されており、各包装内における細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項１９に記載のキット。
  21. 　蛍光色素を更に含む請求項１６または１７に記載のキット。
  22. 　プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、蛍光色素、MgCl2及び測定用容器の個々又は全体として、細菌由来の細菌混入量が１０fg以下であることを特徴とする、請求項２１記載の細菌種同定キット。
  23. 　プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、蛍光色素、MgCl2及び測定用容器は個別に包装されており、各包装内における細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項２２に記載のキット。
  24. 　ガンマ線処理、限外ろ過処理及びＥＭＡ処理のいずれかの処理が施されていることにより細菌由来の核酸混入量が１０fg以下となっている請求項１９、２０、２２または２３に記載のキット。
  25. 　dNTPがホットスタートPCR用に化学修飾されたdNTPである、請求項１８～２０及び２２～２３のいずれか１項に記載のキット。
  26. 　ＰＣＲ用酵素が、細菌由来のDNA含有量１０fg/μL未満のTaq DNA Polymeraseである、請求項１６～２５のいずれか１項に記載のキット。
  27. 　検体中の検出対象細菌種の検出及び／または同定方法において、
    　前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程と、
    　前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程と、
    を有し、
    　前記プライマーとして請求項１～１９のいずれかに記載のプライマーセットを用いる
    ことを特徴とする細菌種の同定方法。
  28. 　請求項８～２６のいずれか１項に記載されるキットを用いる請求項２７に記載の細菌種の同定方法。
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