WO2013147233A1 - 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途 - Google Patents

抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2013147233A1
WO2013147233A1 PCT/JP2013/059692 JP2013059692W WO2013147233A1 WO 2013147233 A1 WO2013147233 A1 WO 2013147233A1 JP 2013059692 W JP2013059692 W JP 2013059692W WO 2013147233 A1 WO2013147233 A1 WO 2013147233A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
protein
antibody detection
reagent
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/059692
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
二見　淳一郎
和宏 垣見
隆司 前川
正人 白木
Original Assignee
国立大学法人岡山大学
株式会社メディネット
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人岡山大学, 株式会社メディネット filed Critical 国立大学法人岡山大学
Priority to US14/389,016 priority Critical patent/US10822384B2/en
Priority to JP2013531595A priority patent/JP6168497B2/ja
Priority to EP13768100.3A priority patent/EP2833143B1/en
Priority to AU2013240942A priority patent/AU2013240942B2/en
Priority to CN201380028339.6A priority patent/CN104380106B/zh
Priority to SG11201406160QA priority patent/SG11201406160QA/en
Publication of WO2013147233A1 publication Critical patent/WO2013147233A1/ja
Priority to US17/029,206 priority patent/US20210032302A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an antibody detection reagent.
  • the present invention also relates to an antibody detection reagent produced by the same method and its use.
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • Patent Document 1 or 2 describes a method for detecting an antibody contained in the blood of a cancer patient. This method detects antigen epitope peptide-specific antibodies contained in the blood of the subject by immobilizing the antigen epitope peptide (antigen peptide consisting of several amino acids) on the bead and bringing the bead into contact with the blood component of the subject. .
  • the epitope portion to which the antibody binds varies depending on the type of HLA, in order to use the method described in Patent Document 1 or 2, the subject's HLA type is examined, and the epitope peptide that matches the subject's HLA type It is necessary to clear various conditions such as being identified.
  • a detection reagent for an antibody against a specific antigen protein When preparing a detection reagent for an antibody against a specific antigen protein, to prepare a reagent that includes all epitope parts derived from one type of antigen protein on the surface of one type of bead, and detects it with high sensitivity and stability. It is preferable to obtain an antigen having a water-soluble and flexible structure. However, many denatured proteins, poorly soluble proteins such as membrane proteins, and proteins with unstable physical properties are likely to aggregate. Therefore, conventionally, partial peptides that can exhibit stable physical properties have been often used.
  • the protein When using partial peptides, it is necessary to synthesize a wide variety of overlapping peptides in order to cover all epitopes, to prepare various types of beads, and to provide seamless epitope peptides Is practically difficult. Fortunately, even when full-length Native structure antigens can be obtained, the protein generally forms a higher-order structure that embeds a hydrophobic portion inside, so that epitopes that react with antibodies are not necessarily exposed. There is a case.
  • the thiol groups contained in the protein may form disulfide bonds with time, which may affect antibody detection. is there.
  • Patent Document 3 describes a method for detecting an anti-HCV antibody contained in the serum of a subject using a long-chain polypeptide of human hepatitis C virus (HCV).
  • HCV human hepatitis C virus
  • Patent Document 3 describes that a disulfide bond generated within a protein or between proteins with the passage of time decreases the detection sensitivity of an antibody.
  • the detection sensitivity of the antibody is improved by releasing a disulfide bond within or between proteins using a reducing agent before or during detection. That is, even a solubilized protein may precipitate over time, and some means must be taken to eliminate it.
  • TAPS-Sulfonate trimethylammoniopropylmethanethiosulfonate, hereinafter referred to as TAPS
  • TAPS binds to a thiol group of a protein and can reversibly cationize the protein (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Cationized protein has improved water solubility.
  • TAPS is a reversible reaction
  • an antibody binds to a protein modified with a sugar chain, there is no report as to whether the antibody can bind to a protein bound with an artificially synthesized compound such as TAPS.
  • Patent No. 3960614 (Immunodia) JP 2005-098877 (Hitachi Software) Patent No. 3225468 (Dynabot)
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a method for efficiently producing a reagent for detecting an antibody that specifically binds to a poorly soluble antigen protein present in a liquid sample, and is produced by the production method.
  • the present invention provides an antibody detection reagent and its use.
  • the present invention aims to provide the following means.
  • a method for producing an antibody detection reagent comprising an antigen protein and a carrier comprising the steps of cationizing and solubilizing the antigen protein, and binding the cationized antigen protein to the carrier
  • a method for producing an antibody detection reagent (2) The method for producing a reagent for antibody detection according to (1), wherein the antigen protein is a full-length protein, (3) The method for producing a reagent for antibody detection according to (1) or (2), wherein the antigen protein is a membrane protein, (4) The method for producing an antibody detection reagent according to any one of (1) to (3), wherein the antigen protein is a cancer antigen protein; (5) The antibody detection reagent according to any one of (1) to (4), wherein the cationization is performed by binding a cationizing agent to a thiol group of an antigen protein. Production method.
  • the cationizing agent is selected from any one of a thiosulfonate compound, a mixed disulfide compound, a pyridyl sulfide cationizing agent, an alkyl halide cationizing agent, or a mixture thereof.
  • the thiosulfonate compound is a compound of the following formula (6)
  • a method for producing an antibody detection reagent (wherein R 1 represents a linear alkylene group having 2 to 20 carbon atoms, and R 2 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms) , N is an integer from 1 to 3), (8)
  • the compound is TAPS-Sulfonate wherein R 1 is — (CH 2 ) 3 —, R 2 is CH 3 —, and n is 1.
  • the compound is TAP3S-Sulfonate wherein R 1 is — (CH 2 ) 3 —, R 2 is CH 3 —, and n is 3.
  • a method for detecting an antigen-specific antibody contained in a sample comprising the step of contacting the sample with the antibody detection reagent according to (12), and adding a labeled secondary antibody that binds to the antibody
  • An antibody detection method comprising: a step of binding to an antibody; a step of recovering an antibody detection reagent; and a step of detecting an antibody detection reagent bound to the antibody,
  • an antibody detection reagent for detecting an antibody against an antigen protein can be produced with the above-described configuration, and completed the present invention.
  • the antigen protein can be efficiently solubilized and recovered by using a cationizing agent.
  • a reagent for antibody detection in which a large number of antigen protein molecules are bound to the carrier. Can be manufactured efficiently.
  • antibody detection reagents are more stable than reagents produced by conventional methods and can be stored for a long time.
  • a hardly soluble antigen protein can be used as an antigen for detecting an antibody. Since a protein is used, even if the epitope portion that can be recognized by HLA is different, it can be detected. Therefore, compared to the case where the epitope peptide is immobilized on the beads, it is not necessary to produce a plurality of reagents according to the type of HLA of the subject, and it can be said that the production efficiency is high.
  • the cationizing agent is bonded to the thiol group of the antigen protein, it is possible to suppress a disulfide bond within the protein or between the proteins that occurs with time. Therefore, the effect which suppresses aggregation of the reagents for antibody detection by the disulfide bond between proteins with time passage is anticipated. Therefore, even when a poorly soluble antigen protein is bound to a carrier, or after long-term storage at room temperature, 4 ° C. or ⁇ 20 ° C., the antibody detection reagent is more effective than the conventional method. Function can be maintained.
  • the artificially synthesized compound is bound to the antigen protein, thereby suppressing the binding between the antigen protein and the antibody.
  • the inventors have also found that antibodies can be detected.
  • the antibody detection reagent can be efficiently produced by using the production method of the present invention.
  • the antibody detection reagent produced by the production method of the present invention can detect an antibody against an antigenic protein present in a liquid sample, for example, it can be removed from a serum sample regardless of the HLA type of the cancer patient. It becomes possible to detect an antibody specific for an antigen protein.
  • TAPS-Sulfonate and TAP-Br have a low molecular weight, so that steric hindrance that inhibits the reaction between the protein and the antibody can be minimized while maintaining high solubilizing ability.
  • it since it has a low molecular weight, it is easy to bind a plurality of molecules to a protein, and all SH groups contained in the protein can be cationized. Therefore, aggregation of beads when stored for a long time can be suppressed. From these characteristics, the method of the present invention using TAPS-Sulfonate and TAP-Br is more effective than the conventional method.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram regarding protein cationization.
  • FIG. 2 is a diagram showing the result of analysis by SDS-PAGE after cationization of WT-1 with TAPS.
  • FIG. 3 shows the results of analysis by SDS-PAGE after cationization of MAGE-A4 with TAPS.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of purifying TAPS-modified WT-1 by HPLC.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of purification of TAPS-modified MAGE-A4 by HPLC.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analysis by SDS-PAGE after purification of TAPS-modified WT-1 and MAGE-A4 by HPLC.
  • Min represents the elution time when purification is performed by HPLC (FIGS.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of analyzing the prepared antigen protein by SDS-PAGE. Each lane was filled with 2 ⁇ g of antigen protein.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of detecting antibodies against 6 types of cancer antigen proteins contained in the serum of cancer patients using the antibody detection reagent produced by the production method of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing the results of detecting antibodies against three types of cancer antigen proteins contained in the serum of cancer patients using the antibody detection reagent produced by the production method of the present invention.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of detecting antibodies against three types of cancer antigen proteins contained in the serum of cancer patients using the antibody detection reagent produced by the production method of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography) for TAPS, TAP3S, Native, and reduced lysozyme.
  • FIG. 12 shows bead aggregates contained in a suspension in which beads immobilized with TAPS, TAP3S, Native and reduced MAGE-A4 were stored at 4 ° C. for 5 days, 37 ° C. for 10 days or 41 days. It is a figure which shows a ratio.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography) for TAPS, TAP3S, Native, and reduced lysozyme.
  • FIG. 12 shows bead aggregates contained in a suspension in which beads immobilized with TAPS, TAP3S, Native and reduced MAGE-A4 were stored at 4
  • FIG. 13 shows a stock solution in which TAPS-modified MAGE-A4 immobilized beads (lane 2), TAP3S-modified MAGE-A4 immobilized beads (lane 3), and Native MAGE-A4 immobilized beads (lane 4) were stored for 104 days. It is a figure which shows the result of having performed western blotting. In lane 1, 100 ng of MAGE-A4 protein was run as a control.
  • FIG. 14 shows an image in which proteins bound to the surface of Bio-Plex COOH beads, TAPS-modified MAGE-A4 immobilized beads, TAP3S-modified MAGE-A4 immobilized beads, or Native MAGE-A4 immobilized beads stored for 104 days are detected. It is. The left is an image taken with a confocal laser fluorescence microscope, and the right is a differential interference image (bright field) taken simultaneously.
  • the production method of the present invention is a method for producing an antibody detection reagent comprising a step of cationizing and solubilizing an antigen protein and a step of binding the cationized antigen protein to a carrier.
  • an antigen protein may be a hardly soluble protein.
  • sparingly soluble is used to explain the characteristics of a protein and does not dissolve in a liquid to form a uniform mixed solution. In particular, it cannot or cannot be dissolved in water or a physiological solvent. The characteristic that it is difficult.
  • a sparingly soluble protein of the type described herein can be obtained after centrifugation for 1 hour at 15,100 ⁇ g when the protein is in water, water and salts, water and physiological solvents that do not denature the protein, It can be defined as a poorly soluble protein when substantially the majority is recovered in the precipitated fraction.
  • protein as used herein includes peptides, polypeptides, etc., and is not limited to naturally occurring proteins existing in nature. Recombinant proteins derived from cells transformed by gene transfer or the like, cell-free proteins in vitro Proteins expressed using an expression system and synthetic proteins produced by organic synthetic chemistry are also included. Furthermore, some or all of the amino acids constituting the protein may be those to which functional groups such as acetylation, phosphorylation, and methylation have been added, or those modified with sugars, proteins, lipids, and the like.
  • the “slightly soluble protein” as used herein means that it does not dissolve or hardly dissolves at room temperature in water or a physiological solvent, for example, even if dissolved by using a denaturing agent, it is replaced with a physiological solvent. It refers to the protein that causes precipitation.
  • the natural type is originally a soluble protein, when expressed using a heterologous organism as a recombinant protein (for example, when an expression system in E. coli is constructed using a gene recombination technique), When the target protein is recovered as an inclusion body (inclusion body), the target protein is also referred to as a hardly soluble protein.
  • examples of poorly soluble proteins include, but are not limited to, full-length proteins, membrane proteins, cancer antigen proteins, and the like.
  • “solubilization” refers to dissolving a protein in a physiological solvent while maintaining the amino acid sequence.
  • the solution containing the protein dissolved by the denaturing agent is replaced with the physiological solvent and centrifuged. In this case, it means that the amount of the protein recovered in the supernatant after centrifugation is increased.
  • the full-length protein means not only a natural protein that has been confirmed to exist in the living body but also a protein having the largest open reading frame (ORF) predicted from the genomic sequence.
  • ORF open reading frame
  • the amino acid sequence of such a full-length protein is obtained from a database such as The ORFeome Collaboration (http://www.orfeomecollaboration.org/), GeneCard (registered trademark) (http://www.genecards.org/), or the like. It is possible, but not limited to this.
  • Membrane protein is a protein having a transmembrane structure and present on the surface of cell membrane, nuclear membrane and other intracellular organelles. A hydrophilic part in contact with the inside or outside of the cell and a hydrophobic part buried in the cell membrane are present in one protein molecule. Therefore, when it is obtained by expression in Escherichia coli or the like, it is a protein that is difficult to form a three-dimensional structure in an aqueous solution and easily forms inclusion bodies.
  • Cancer antigen protein refers to an antigen protein that is expressed in a tumor and induces an immune response or an antigen protein that can serve as an indicator of the presence of a tumor.
  • proteins whose expression increases when cells become cancerous proteins whose amino acids are partly mutated when cells become cancerous, and the like.
  • the production method of the present invention is characterized by cationizing a protein. More preferably, it is characterized by cationizing a hardly soluble protein.
  • Protein cationization means adding an excessive positive charge to the protein. Cationic proteins have improved water solubility due to charge repulsion. In order to cationize a protein, a cationizing agent is bound to the protein.
  • Carrier refers to a substance that binds the antigen protein to a solid surface. Specific examples include glass, nylon membrane, semiconductor wafer, and microbeads, but are not limited thereto.
  • the binding of the antigen protein to the carrier means that the “antigen protein” is directly immobilized on the surface of the carrier using a known technique, or through a bond such as biotin-avidin or via a linker molecule. It may be fixed indirectly.
  • sample refers to an antibody (including subtypes such as IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE) that is detected by the antibody detection reagent according to the present invention, and a fragment that maintains its activity (eg, Fab fragment, F ( ab ′) a sample containing 2 fragments and the like.
  • a fragment that maintains its activity eg, Fab fragment, F ( ab ′) a sample containing 2 fragments and the like.
  • Body fluid refers to a liquid sample that can be collected from a living body.
  • Peripheral blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, pleural effusion, ascites, urine, and the like fall under this, and samples obtained by treating these with a method well known to those skilled in the art (for example, plasma and serum obtained by centrifuging peripheral blood from the supernatant) This also applies to this.
  • “Secondary antibody” refers to an antibody (including subtypes such as IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) to be detected by the antibody detection reagent according to the present invention, and a fragment (for example, Fab) that maintains its activity. Fragments, F (ab ′) 2 fragments and the like, and active fragments thereof.
  • “Labeled secondary antibody” refers to a secondary antibody bound to a label such as a radioisotope, a luminescent agent, a fluorophore, or the like.
  • an enzyme such as luciferase or peroxidase, or a protein such as biotin or green fluorescent protein (GFP) can be used as such a “label”.
  • a protein such as biotin or green fluorescent protein (GFP)
  • GFP green fluorescent protein
  • the “labeled secondary antibody” can also be produced by genetic engineering as a single recombinant protein in the form of a fusion protein.
  • cationizing agent used in the production method of the present invention various compounds can be used as long as they can add a positive charge to a protein via a disulfide bond (FIG. 1).
  • disulfide bond FOG. 1
  • thiosulfonate compounds, mixed disulfide compounds, pyridyl disulfide cationizing agents, alkyl halide cationizing agents, and the like can be used.
  • the thiosulfonate compound used in the production method of the present invention is a compound represented by the following formula [Chemical Formula 2].
  • X is a group having a cation. One or a plurality of groups having a cation of X may be linked.
  • R 2 represents a lower alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. That is, the thiosulfonate compound used in the production method of the present invention is a thiosulfonate compound having one or more cations derived from X in one molecule.
  • Examples of X include a quaternary ammonium group.
  • the thiosulfonate compound used in the production method of the present invention is a thiosulfonate compound represented by the following formula [Chemical Formula 3] having one or more cations derived from a quaternary ammonium group in one molecule.
  • R 1 is a direct number of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14 , 15, 16, 17, 18, 19 or 20 carbon atoms.
  • R 2 represents a lower alkyl group having 1, 2 or 3 carbon atoms
  • n represents any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 Or more preferably an integer of 1, 2, or 3
  • the dissociation group R 2 formed after the cationization reaction of the protein is an inactive dissociation group.
  • TAPS trimethylammoniopropylmethanethiosulfonate
  • TAP3S-Sulfonate TAP3S-Sulfonate
  • TAPS is a compound represented by the following formula [Formula 4].
  • TAPS has a quaternary amine with a strong positive charge in the molecule, and cationizes the protein by binding to the protein via a cysteine residue. The cationized protein has improved solubility and the SH group is stably protected.
  • TAPS is synthesized with reference to, for example, Biotechnol. Appl. Biochem. (1998) 28, 207-213, or purchased as a reagent in the form of a Br salt (formula [Formula 5] below) (molecular weight 292.26). It is possible (Wako Pure Chemicals, Katayama Chemical Industries, etc.).
  • TAP3S is a molecular weight compound represented by the following formula [Chem. 6]. TAP3S has three quaternary amines with a strong positive charge in the molecule and can cationize more strongly than TAPS. TAP3S can be synthesized with reference to, for example, International Publication No. 2011/118731.
  • Examples of the mixed disulfide compound used in the production method of the present invention include cystamine as shown in the following formula [Chemical Formula 7].
  • cystamine As shown in the following formula [Chemical Formula 7].
  • NH 3 + is a group having a cation.
  • Examples of the pyridyl sulfide-based cationizing agent used in the production method of the present invention include compounds represented by the following formula [Chemical Formula 8].
  • X is a group having a cation. One or more groups having a cation of X may be connected.
  • a halogenated alkyl cationizing agent capable of adding a positive charge to a protein by S-alkylation
  • a halogenated alkyl cationizing agent capable of adding a positive charge to a protein by S-alkylation
  • TAP-Br 3-bromopropyl trimethylammonium
  • TAP-Br binds irreversibly to the SH group of the protein and improves the protein solubilizing ability.
  • TAP-Br (molecular weight 261.00) can be purchased as a reagent, for example, in the form of a Br salt ([Chemical Formula 9]) (for example, SIGMA-ALDRICH).
  • TAPS-Sulfonate and TAP-Br have a low molecular weight, so the reaction between the protein and the antibody while maintaining high solubilization ability. The steric hindrance which inhibits can be minimized.
  • it since it has a low molecular weight, it is easy to bind a plurality of molecules to a protein, and all SH groups contained in the protein can be cationized. Therefore, aggregation of beads when stored for a long time can be suppressed.
  • the gene of the antigen protein is introduced into E. coli and cultured.
  • the cultured E. coli is disrupted and the antigenic protein is recovered.
  • the antigen protein may form an inclusion body.
  • Solubilize the collected inclusion bodies with a denaturant examples include, but are not limited to, urea, guanidine hydrochloride, and a surfactant.
  • the antigen protein After denaturing the antigen protein, it is treated with a reducing agent to cleave the SS bond.
  • a reducing agent examples include, but are not limited to, dithiothreitol (DTT) and 2-mercaptoethanol (2ME).
  • TAPS to the solution containing the denatured antigen protein and let stand at room temperature for 30 minutes.
  • the amount of TAPS added is preferably such that TAPS has a molar concentration of 1 to 10 times the molar concentration of the antigen protein and the thiol group contained in the solution. More preferably, it is 1.1 to 1.2 times.
  • TAPS antigen protein contained in the supernatant is purified.
  • a method such as dialysis or column chromatography can be used. For example, transfer to a dialysis tube and dialyze against pure water to 0.5% acetic acid at 4 ° C to remove the denaturant. Centrifuge the dialyzed liquid at 12,000 rpm, 4 ° C. to room temperature for 15 minutes and collect the supernatant.
  • the cationized antigen protein exhibits high water solubility, is easy to prepare, and exhibits extremely high stability under weakly acidic conditions (preferably pH 6 or less, more preferably pH 2 to 5). Therefore, water solubility can be maintained in a state where the epitope of the full-length protein is exposed seamlessly. For this reason, all the epitopes contained in one antigen protein can be immobilized on one kind of bead in a state in which it easily reacts with an antibody.
  • the TAPS protein is bound to the carrier.
  • magnetic beads non-magnetic beads, microplates, and the like can be used as the carrier.
  • beads are used as a carrier will be described.
  • the bead Suspend the beads in the binding solution. If the bead has already been modified to assist in binding to the protein, the bead is directly bound to the TAPS protein. In the case where the modification that assists the binding between the bead and the protein is not made, the bead is modified using a substance that does not inhibit the reaction between the TAPS protein and the antibody when detecting the antibody, such as skim milk.
  • the time for mixing with beads activated to react with amino groups is preferably 2 to 16 hours.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Collect the beads, suspend in the washing solution, centrifuge and wash.
  • the washing solution include a phosphate buffer.
  • the storage buffer include a storage buffer manufactured by Bio-Rad. If the storage buffer is weakly acidic (preferably pH 6 or lower, more preferably pH 2 to 5), the solubility of the TAPS protein is more stably maintained.
  • an antibody detection reagent can be produced.
  • the antibody detection method as one aspect using the antibody detection reagent (hereinafter referred to as the reagent of the present invention) produced by the production method of the present invention will be described in detail.
  • the reagent of the present invention may be an antibody detection reagent comprising a cationized hardly soluble antigen protein and beads.
  • a body fluid can be used as the sample.
  • peripheral blood As the body fluid, peripheral blood, bone marrow fluid, umbilical cord blood, pleural effusion, ascites, urine and the like can be used.
  • Peripheral blood is preferably used in consideration of ease of collection and less burden on the subject. It is preferable to collect an amount that does not burden the subject.
  • whole blood collection using a vacuum blood collection tube, a blood collection bag or the like can be used. In collecting blood, heparin or the like may be added to prevent coagulation of blood.
  • plasma from the collected blood by centrifugation.
  • plasma can be obtained when partial blood collection is performed using a component blood collection device.
  • peripheral blood remove blood cell components and blood coagulation components, obtain serum, and use it as a sample.
  • ⁇ ⁇ Mix the reagent of the present invention and plasma.
  • the mixing time for example, when the reaction is performed at room temperature, it is preferable to leave for about 2 hours, and when the reaction is performed at 4 ° C., it is preferably about overnight.
  • the reagent of the present invention is recovered by a centrifugal method or a magnetic device and washed.
  • Bind secondary antibody to detect antibody when the subject is a human, the antibody bound to the reagent of the present invention is a human antibody. Therefore, labeling is performed using a labeled anti-human antibody as the secondary antibody.
  • a labeled anti-human antibody for example, biotinylated anti-human IgG mouse monoclonal antibody and the like can be mentioned.
  • antibodies can be detected from other liquid samples using the reagent of the present invention.
  • the following situation is assumed by analyzing the antibody contained in the blood of the subject.
  • the subject's allergic reactivity is determined by analyzing the subject's in vivo antibodies.
  • the treatment policy is determined and the prognosis is predicted and judged using the found antibody as an index.
  • the therapeutic effect is improved by using an antigen in which an antigen-specific antibody is detected in the serum of a patient.
  • Predicting the therapeutic effect that is related to immune function such as Abscopal effect by analyzing antibody before and after radiotherapy.
  • the above-described effects can be obtained with an antibody detection reagent using an epitope peptide, but the reagent of the present invention is excellent in that a protein can be used. This is because by using the protein, the antibody can be detected without being limited to the HLA type of the subject. Therefore, even an HLA type that is generally regarded as a minor and for which analysis of epitope peptides has not progressed can be analyzed.
  • His-tag fusion MAGE-A4 (SEQ ID NOs: 16, 17, antigen protein sequences are SEQ ID NOs: 3, 4) and His-tag fusion WT-1 (SEQ ID NOs: 14, 15, antigen protein sequences) cloned in the pET28b vector E. coli T7express was transformed with two types of plasmid DNAs of SEQ ID NOs: 1, 2), several colonies formed on the plate were added to 10 mL of LB / Kan25 medium, and cultured with shaking for 2 hours.
  • the cells were dispersed in a 40 mL lysis buffer (20 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM MgSO 4 , 0.2% Tween20) using an ultrasonic crusher, and further crushed for 1 minute ⁇ 3 sets. .
  • HC Benzonase
  • the precipitate (inclusion body) was collected by centrifugation (8 krpm, 10-15 min, room temperature), and the supernatant was removed. 50-100 mL of RO water was added to the recovered precipitate, the precipitate was suspended again using a sonicator, and the precipitate was recovered by centrifugation (8 krpm, 10-15 min, room temperature).
  • MAGE-A4 recovered the supernatant by centrifugation (8 krpm, 10-15 min, room temperature).
  • the precipitate was dissolved with 5-10 mL of 6 M guanidine 0.1 M Tris-HCl pH 8 + 1 mM EDTA. After deaeration and nitrogen substitution, 30 mM DTT (solid) was added, and the mixture was treated at 37 ° C. for about 1 hour.
  • the above affinity purified MAGE-A4 was added to an eggplant-shaped flask, and the water was removed with a freeze dryer, and then dissolved in 3 mL of 6M guanidine, 0.1M Tris-HCl pH 8. After deaeration and nitrogen substitution, 30 mM DTT (solid) was added, and the mixture was treated at 37 ° C. for about 1 hour. 70 mM TAPS-Sulfonate was added to the solution containing MAGE-A4 and treated at 37 ° C. for about 30 minutes.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-PAGE analysis for TAPS-modified MAGE-A4 and WT-1 after HPLC. From the results of the analysis, it was confirmed that the TAPS protein can be prepared as a highly pure antigen protein by purifying by reverse phase HPLC. MAGE-A4 collects fractions with an elution time of 50 to 51 minutes (lane 50 min in Fig. 6), and WT-1 collects fractions with an elution time of 52 to 53 minutes (lane 52 min in Fig. 6). used.
  • FIG. 7 shows the result of SDS-PAGE analysis of the prepared protein.
  • Immobilization was performed using 6 types of Bio-Plex COOH beads (1/10 volume (1.25 ⁇ 10 6 beads)) and Bio-Plex amine coupling kit (manufactured by Bio-Rad).
  • the antigens used were 11 ⁇ g each, and they were all denatured antigens solubilized by TAPS.
  • the solubilized protein was dissolved in a buffer and allowed to stand on ice.
  • the container of COOH beads was shaken with a vortex mixer for 30 seconds, and the ultrasonic wave was suspended for 30 seconds.
  • the COOH bead suspension was centrifuged at 14,000 ⁇ g for 4 minutes, and the supernatant was removed.
  • 80 ⁇ L of bead activation buffer was added to the collected precipitate, and the mixture was well shaken with a vortex mixer for 30 seconds, and ultrasonic waves were suspended for 30 seconds.
  • the COOH bead suspension and the TAPS protein suspension were mixed, and PBS was added so that the total amount became 500 ⁇ L.
  • the beads were shielded from light so that they were not exposed to light and permeated using a rotary incubator at room temperature for 2 hours.
  • the suspension of COOH beads and TAPS protein was centrifuged at 14,000 ⁇ g for 4 minutes, and the supernatant was removed.
  • the COOH beads were shielded from light with aluminum foil so that they were not exposed to light, and shaken using a rotary incubator at room temperature for 30 minutes.
  • the COOH bead suspension was centrifuged at 14,000 ⁇ g for 4 minutes, and the supernatant was removed.
  • the beads immobilized with the TAPS protein thus obtained were suspended in a storage buffer of 150 ⁇ L and stored.
  • Table 1 shows the concentration of each bead.
  • Donor2 confirmed the reaction to XAGE1b.
  • Serum was obtained from 8 patients with renal cell carcinoma (Donor 2 to Donor 9) before and after EP-DC treatment.
  • EP-DC treatment a tumor tissue removed from a cancer patient by surgery is prepared as a lysate by freeze-thawing, etc., taken into dendritic cells by electroporation, and a dendritic cell vaccine prepared It is a treatment method administered to a patient.
  • the beads were washed with a wash station (Bio-Rad), PE-labeled streptavidin (Vector (Laboratories) was added, light-shielded with aluminum foil, and shaken at room temperature for 10 minutes to react.
  • the beads were washed with a wash station (Bio-Rad) and analyzed using a BioPlex (Bio-Rad) measuring device.
  • the patient serum used was diluted 400 times, 1600 times, or 6400 times.
  • the Donor3 serum had a higher response to WT-1 after the DC vaccine treatment, compared with before and after the DC vaccine treatment.
  • the presence of an antibody that recognizes WT-1 in the blood of Donor3 suggests that the tumor tissue of Donor3 may express WT-1. In that case, it is presumed that it is appropriate to perform peptide vaccine or DC vaccine treatment using WT-1.
  • lysozyme 15 mg was weighed into a 100 mL pear-shaped flask and dissolved in 2 mL of 6 M guanidine hydrochloride, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5, 2 mM EDTA. The resulting solution was degassed and purged with nitrogen, dithiothreitol (DTT) was added to a final concentration of 30 mM, and the mixture was reacted in a 37 ° C. constant temperature bath for 2 hours.
  • DTT dithiothreitol
  • each cationization reagent (TAPS-sulfonate (manufactured by Katayama Chemical Co., Ltd.) or TAP3S-sulfonate) having a final concentration of 70 mM was added and further reacted at room temperature for 2 hours. 1/10 amount of acetic acid was added to the resulting solution to stop the reaction, and then dialyzed against Milli-Q water at 4 ° C. for 1 day to obtain TAPS lysozyme and TAP3S lysozyme.
  • the TAP3S-sulfonate used was synthesized by the method described in Japanese Patent Application No. 2010-070804.
  • Reverse phase HPLC high performance liquid chromatography
  • Native lysozyme has a certain degree of hydrophilicity because there are four SS bonds in one molecule and the hydrophobic group is not exposed.
  • Reduced lysozyme is a denatured protein in which SS bonds are reduced and has the highest hydrophobicity (low solubility in water).
  • the column used was COSMOSIL-Protein-R (manufactured by Nacalai Techs), the solvent used was acetonitrile diluted with 0.1% hydrochloric acid, and the acetonitrile concentration was set from 1% to 50%.
  • FIG. 11 shows the result of summarizing the reverse phase HPLC chart.
  • the straight line indicates the concentration of acetonitrile.
  • TAP3S lysozyme is more hydrophilic than native and reduced lysozyme and is eluted with a low concentration of acetonitrile solvent.
  • TAPS-modified lysozyme had all eight SH groups protected and cationized and was highly uniform.
  • the difference in the protective ability of SH groups between TAPS and TAP3S depends on the size of the molecule.
  • TAP3S which has a large molecule, is It is presumed that the steric hindrance above occurs and a small amount of SH groups that cannot bind to TAP3S remain, so that the SH / SS exchange reaction proceeds slowly thereafter.
  • TAPS, TAP3S, and Native MAGE-A4 were prepared, and beads with respective proteins immobilized thereon were prepared.
  • the prepared beads were suspended in a storage buffer and stored at 4 ° C. or 37 ° C. After a certain period of time, the degree of aggregated beads among the beads in the suspension was measured with a hemocytometer. The ratio of bead aggregates shown in the results was calculated by the number of aggregates formed of three or more beads / total number of beads ⁇ 100.
  • FIG. 12 shows the ratio of bead aggregates contained in the suspension stored at 4 ° C. for 5 days, 37 ° C. for 10 days or 41 days.
  • the beads aggregates of TAGS-modified MAGE-A4 were preserved compared to the beads immobilized with Native MAGE-A4. The rate is falling.
  • ⁇ His-tag is added to the N-terminal side of MAGE-A4 immobilized on beads. Therefore, free MAGE-A4 protein contained in the stock solution of beads immobilized with MAGE-A4 was detected by Western blotting using an anti-His-tag antibody (OGHis, manufactured by MBL).
  • binding proteins were detected for Bio-Plex® COOH beads, TAPS-modified MAGE-A4 immobilized beads, TAP3S-modified MAGE-A4 immobilized beads, or Native® MAGE-A4 immobilized beads stored for 104 days.
  • beads prepared by the method for producing an antibody detection reagent disclosed in the present invention have an effect of suppressing the formation of aggregates compared to the preparation of beads using a native protein. Became clear. It was also confirmed that the suppression of aggregate formation was not due to the release of the antigen protein on the bead surface. Furthermore, it was known that TAP3S was superior to TAPS in terms of protein solubilization ability, but TAPS was superior to the solubilization ability of the prepared beads, unlike the solubilization ability. Became clear.
  • an antibody detection reagent using an antigen protein can be efficiently produced by using the production method of the present invention. It has also been confirmed that the antibody detection reagent produced by the production method of the present invention has high stability and can efficiently detect antibodies in a liquid sample.
  • the reagent of the present invention it is possible to provide an antibody analysis test that is not restricted by the HLA type of the subject. By performing this test, it is considered that, for example, it is possible to determine a treatment policy for a disease involving immunity and to predict / determine a therapeutic effect.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、液体サンプル中に存在する難溶性抗原タンパク質に特異的に結合する抗体を検出するための試薬を効率よく製造する方法、前記製造方法によって製造された抗体検出用試薬とその用途を提供するものである。 抗原タンパク質の可溶化工程において、カチオン化剤を使用することで効率よく抗原タンパク質を可溶化、回収することができるため、従来方法に比べ、担体に多数の抗原タンパク質分子が結合した抗体検出用試薬を効率よく製造することができる。

Description

抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途
　本発明は、抗体検出用試薬の製造方法に係る。また、同方法によって製造された抗体検出用試薬とその用途に係る。
　液体サンプル中に含まれる抗体の検出する方法は、例えば、ラジオイムノアッセイやELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay；酵素免疫測定法）等多数存在する。ELISAは、マイクロプレート上に特定の抗原を固定化し、抗体を含むサンプルを系列希釈した後に、マイクロプレート上で抗原・抗体の反応を行い、結合した抗体を酵素標識二次抗体により検出する方法である。この方法では、個々の抗原に対する抗体検査を、個別のアッセイプレートを用いて評価する必要があった。
　上記の問題を解決する手法として、固定化する担体にレポーター蛍光を保持したマイクロビーズを用いることにより、多種多様な抗原に対する抗体を同時に解析できるマルチプレックス技術が注目を集めている。
　いずれの技術を活用する場合においても、多様な抗原を水溶性として調製することが必須である。従来は、水溶性として調製できるNative構造のタンパク質や化学合成されたポリペプチド断片を用いる例がほとんどである。
　例えば、がん患者の血液中に含まれる抗体を検出する方法が特許文献１又は２に記載されている。抗原エピトープペプチド（数個のアミノ酸からなる抗原ペプチド）をビーズに固定化し、ビーズと被験者の血液成分を接触させて、被験者の血液中に含まれる抗原エピトープペプチド特異的な抗体を検出する方法である。しかし、抗体が結合するエピトープ部分はHLAのタイプによって異なるため、特許文献１又は２に記載された方法を使用するためには、被験者のHLAのタイプを調べること、被験者のHLAタイプに合うエピトープペプチドが同定されていること等様々な条件をクリアする必要がある。
　特定の抗原タンパク質に対する抗体の検出試薬を調製する際に、１種類のビーズ表面に１種類の抗原タンパク質に由来するすべてのエピトープ部分を含み、高感度かつ安定的に検出する試薬を調製するためには、水溶性でフレキシブルな構造を持った抗原の取得が好ましい。しかし、多くの変性タンパク質、膜タンパク質等の難溶性のタンパク質や不安定な物性のタンパク質は凝集しやすい。そのため、従来は、安定な物性を示しうる部分ペプチドを使用することが多かった。
　部分ペプチドを使用する場合には、すべてのエピトープを網羅するために多種多様なオーバーラップペプチドを合成する必要があり、多種類のビーズを準備する必要があるほか、シームレスなエピトープペプチドを提供することは現実的には困難である。また、運よく全長のNative構造の抗原が取得できる場合も、一般にタンパク質は疎水的な部分を内部に埋め込むような高次構造を形成しているため、必ずしも抗体と反応するエピトープが露出していない場合がある。
　さらに、可溶化したタンパク質を用いて抗体検出用の試薬を作製しても、時間経過とともに、タンパク質に含まれるチオール基同士がジスルフィド結合を形成してしまい、抗体の検出に影響を与える可能性がある。
　例えば、特許文献３には、ヒトC型肝炎ウイルス（HCV）の長鎖ポリペプチドを使用して、被験者の血清中に含まれる抗HCV抗体を検出する方法が記載されている。特許文献３には、時間経過とともに発生するタンパク質内又はタンパク質間のジスルフィド結合が、抗体の検出感度を低下させることが記載されている。その解決方法として、検出前や検出中に還元剤を用いてタンパク質内又はタンパク質間のジスルフィド結合を開放することで、抗体の検出感度が向上することも記載されている。つまり、可溶化したタンパク質であっても、時間の経過とともに沈澱してくる可能性があり、解消するためには何らかの手段を講じる必要がある。
　タンパク質を可溶化する化合物として、TAPS-Sulfonate（トリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホナート、以下、TAPSと記す）が知られている。TAPSは、タンパク質のチオール基に結合し、タンパク質を可逆的にカチオン化することができる（例えば、非特許文献１、２参照）。
　カチオン化されたタンパク質は水に対する溶解性が改善される。また、タンパク質とTAPSの結合は可逆的な反応であるため、細胞内に取り込まれた際には、TAPSがタンパク質からはずれることで、リフォールディングが起こり、タンパク質本来の機能を発揮できることが知られている。しかし、抗体検出用試薬を作製する工程において、TAPSを用いた可溶化を利用するという試みはこれまでなされていない。また、糖鎖で修飾されたタンパク質に抗体が結合することは公知であるが、TAPSのような人工的に合成された化合物を結合させたタンパク質に抗体が結合できるかどうかについての報告はない。
特許第3960614号（イムノディア） 特開2005-098877号（日立ソフトウェア） 特許第3225468号（ダイナボット）
M. Seno et al., Growth Factors, 15, 215-229 (1998) M. Inoue et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 28, 207-213 (1998)
　本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、液体サンプル中に存在する難溶性抗原タンパク質に特異的に結合する抗体を検出するための試薬を効率よく製造する方法、前記製造方法によって製造された抗体検出用試薬とその用途を提供するものである。
　すなわち、本発明は以下の手段を提供することを目的とする。
（１）抗原タンパク質と担体とで構成される抗体検出用試薬の製造方法であって、抗原タンパク質をカチオン化して可溶化する工程と、カチオン化した抗原タンパク質を担体に結合させる工程と、を含む抗体検出用試薬の製造方法、
（２）前記抗原タンパク質が、全長タンパク質であることを特徴とする、（１）に記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（３）前記抗原タンパク質が、膜タンパク質であることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（４）前記抗原タンパク質が、がん抗原タンパク質であることを特徴とする、（１）～（３）のいずれか一つに記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（５）前記カチオン化が、抗原タンパク質のチオール基にカチオン化剤を結合させることによって行われることを特徴とする、（１）～（４）のいずれか一つに記載の抗体検出用試薬の製造方法。
（６）前記カチオン化剤が、チオスルホナート化合物、混合ジスルフィド化合物、ピリジルスルフィド系のカチオン化剤、ハロゲン化アルキル系カチオン化剤のいずれか１つ、又はその混合物から選択されることを特徴とする、（５）に記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（７）前記チオスルホナート化合物が、以下の式の化合物である
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（６）に記載の抗体検出用試薬の製造方法（式中、Ｒ１は、炭素原子数２～２０の直鎖アルキレン基を表し、Ｒ２は、炭素原子数１～３のアルキル基を表し、ｎは１～３のいずれかの整数である）、
（８）前記化合物が、Ｒ１が－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２がＣＨ３－であり、ｎが１で表されるTAPS-Sulfonateであることを特徴とする、（７）に記載の製造方法、
（９）前記化合物が、Ｒ１が－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２がＣＨ３－であり、ｎが３で表されるTAP3S-Sulfonateであることを特徴とする、（７）に記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（１０）前記ハロゲン化アルキル系カチオン化剤が、TAP－Brであることを特徴とする、（６）に記載の抗体検出用試薬の製造方法、
（１１）前記担体が、磁気ビーズであることを特徴とする、（１）～（１０）のいずれか一つに記載の抗体検出用試薬の製造方法。
（１２）（１）～（１１）の製造方法によって製造された抗体検出用試薬。
（１３）サンプル中に含まれる抗原特異的な抗体の検出方法であって、（１２）に記載の抗体検出用試薬とサンプルとを接触させる工程と、抗体に結合する標識した二次抗体を添加し、抗体と結合させる工程と、抗体検出用試薬を回収する工程と、抗体が結合した抗体検出用試薬を検出する工程とを含む、抗体検出方法、
（１４）前記サンプルが、単離された体液であることを特徴とする、（１３）に記載の抗体検出方法。
　本発明者らは、以上のような構成により、抗原タンパク質に対する抗体を検出するための抗体検出用試薬を製造できることを見いだし、本発明を完成させた。
　抗原タンパク質の可溶化工程において、カチオン化剤を使用することで効率よく抗原タンパク質を可溶化、回収することができるため、従来方法に比べ、担体に多数の抗原タンパク質分子が結合した抗体検出用試薬を効率よく製造することができる。
　更に、かかる抗体検出用試薬は従来方法で製造された試薬に比べ安定性にすぐれ、長期の保存が可能である。
　さらに本願発明の一態様として、抗体を検出するための抗原として、難溶性抗原タンパク質を使用することができる。タンパク質を利用するため、HLAにより認識できるエピトープ部分が異なっていても検出することができる。そのため、エピトープペプチドをビーズに固定化する場合と比較して、被験者のHLAのタイプに合わせて複数の試薬を製造しておく必要がなく、製造効率がよい方法であるといえる。
　さらに、カチオン化剤が抗原タンパク質のチオール基に結合していることで、時間経過とともに発生するタンパク質内又はタンパク質間のジスルフィド結合を抑制することができる。そのため、時間経過によるタンパク質間のジスルフィド結合による抗体検出用試薬同士の凝集を抑制する効果が期待される。したがって、難溶性抗原タンパク質を担体に結合させた場合にあっても、あるいは、室温もしくは４度あるいは－２０度において長期の保存をした後であっても、従来法に比べ抗体検出用試薬はその機能を維持しうる。
　一方で、人工的に合成された化合物が抗原タンパク質に結合していることで、抗原タンパク質と抗体の結合を抑制してしまう可能性が考えられるが、カチオン化剤が結合した抗原タンパク質であっても、抗体が検出可能であることが発明者らにより明らかとなった。
　以上のような特徴により、本発明の製造方法を用いることで、抗体検出用試薬を効率よく製造することができる。また、本発明の製造方法で製造した抗体検出用試薬は液体サンプル中に存在する抗原タンパク質に対する抗体を検出することができるため、例えば、がん患者のHLAタイプに関係なく、血清サンプル中からがん抗原タンパク質に特異的な抗体を検出することが可能となる。
　特に、TAPS-Sulfonate、TAP-Brは低分子量であるため、高い可溶化能を維持しつつ、タンパク質と抗体の反応を阻害するような立体障害を最小限に抑えることができる。また、低分子量であることからタンパク質に複数分子を結合させ易く、タンパク質に含まれるSH基すべてをカチオン化することができるため、長期保存した場合のビーズの凝集を抑制することができる。これらの特徴から、TAPS-Sulfonate、TAP-Brを用いた本発明の方法は従来法に比較してより有効である。
図１は、タンパク質のカチオン化に関する説明図である。 図２は、WT-1をTAPSによりカチオン化した後、SDS-PAGEで解析を行った結果を示す図である。 図３は、MAGE-A4をTAPSによりカチオン化した後、SDS-PAGEで解析を行った結果を示す図である。 図４は、TAPS化したWT-1を、HPLCにより精製を行った結果を示す図である。 図５は、TAPS化したMAGE-A4を、HPLCにより精製を行った結果を示す図である。 図６は、TAPS化したWT-1およびMAGE-A4を、HPLCにより精製した後、SDS-PAGEで解析を行った結果を示す図である。MinはHPLCにより精製を行った際（図４、図５）の溶出時間を表している。例えば、49minは、溶出時間49分から1分間分を収集したフラクションを泳動したレーンである。 図７は、作製した抗原タンパク質をSDS-PAGEで解析した結果を示す図である。各レーンには2μgの抗原タンパク質を充填した。 図８は、本発明の製造方法により製造した抗体検出用試薬を用いて、がん患者の血清中に含まれる6種のがん抗原タンパク質に対する抗体を検出した結果を示す図である。 図９は、本発明の製造方法により製造した抗体検出用試薬を用いて、がん患者の血清中に含まれる3種のがん抗原タンパク質に対する抗体を検出した結果を示す図である。 図１０は、本発明の製造方法により製造した抗体検出用試薬を用いて、がん患者の血清中に含まれる3種のがん抗原タンパク質に対する抗体を検出した結果を示す図である。 図１１は、TAPS化、TAP3S化、Native及び還元したリゾチームについて、逆相HPLC（高速液体クロマトグラフィー）を実施した結果を示す図である。 図１２は、TAPS化、TAP3S化、Native及び還元したMAGE-A4を固定化したビーズを４℃で５日間、３７℃で１０日間又は４１日間保存した懸濁液中に含まれるビーズ凝集体の割合を示す図である。 図１３は、TAPS化MAGE-A4固定化ビーズ（レーン2）、TAP3S化MAGE-A4固定化ビーズ（レーン3）、Native MAGE-A4固定化ビーズ（レーン4）を104日間保存した保存液について、ウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。レーン1は、コントロールとして、100ngのMAGE-A4タンパク質を泳動した。 図１４は、Bio-Plex COOHビーズ、104日間保存したTAPS化MAGE-A4固定化ビーズ、TAP3S化MAGE-A4固定化ビーズ又はNative MAGE-A4固定化ビーズ表面に結合しているタンパク質を検出した画像である。左が共焦点レーザー蛍光顕微鏡による撮影画像、右は同時に撮影した微分干渉画像（明視野）である。
　以下、本発明の実施の形態を説明する。
　まず、本発明の抗体検出用試薬の製造方法（以下、本発明の製造方法とも記す）について説明する。
　本発明の製造方法は、抗原タンパク質をカチオン化して可溶化する工程と、カチオン化した抗原タンパク質を担体に結合させる工程と、を含む抗体検出用試薬の製造方法である。かかる抗原タンパク質は難溶性タンパク質であってもかまわない。
　本明細書において「難溶性」とは、タンパク質の特性を説明するためのものであり、液体に溶解して均一な混合液を形成せず、特に水または生理的溶媒に溶解できない、もしくは溶解しにくいという特性を指す。本明細書に説明する種類の難溶性のタンパク質は、そのタンパク質が水、水および塩、水およびそのタンパク質を変性しない生理的溶媒中にある際、１５，１００×ｇで一時間遠心した後に、実質的に大部分が沈殿画分に回収される場合に、難溶性のタンパク質と定義されうる。
　ここでいう「タンパク質」とは、ペプチド、ポリペプチド等を含み、自然界に存在する天然由来のタンパク質に限定されず、遺伝子導入等により形質転換した細胞由来の組換えタンパク質、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで無細胞蛋白質発現系を用いて発現させたタンパク質、また、有機合成化学的に作製する合成タンパク質も含まれる。さらに、タンパク質を構成するアミノ酸の一部又は全部がアセチル化、リン酸化、メチル化等の官能基が付加されたもの、糖類、蛋白質、脂質等で修飾されたものであっても構わない。
　ここでいう「難溶性タンパク質」とは、室温において、水や生理的溶媒中に攪拌しても溶解せずもしくは溶解しにくく、例えば変性剤を用いることで溶解しても、生理的溶媒に置換すると沈殿を生ずるタンパク質を指す。また、元来天然型が可溶性のタンパク質であっても、組換えタンパク質として異種生物を用いて発現させた場合（例えば、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌での発現系を構築した場合等）、目的タンパク質はインクルージョンボディ（封入体）として回収される場合、その目的タンパク質も難溶性タンパク質と言う。難溶性タンパク質としては、全長タンパク質、膜タンパク質、がん抗原タンパク質などが挙げられるがこれに限定されない。
　本明細書において「可溶化」とは、タンパク質を、アミノ酸配列を維持したまま生理的溶媒中に溶解させることをいい、変性剤によって溶解したタンパク質を含む溶液を生理的溶媒に置換し、遠心した際に、該タンパク質が遠心後に上清に回収される量を増加させることをいう。
　全長タンパク質とは、生体内に存在することが確認されている天然のタンパク質だけでなく、ゲノム配列上から予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一番大きなタンパク質をも意味する。このような全長タンパク質のアミノ酸配列は例えば、The ORFeome Collaboration (http://www.orfeomecollaboration.org/)、ＧｅｎｅＣａｒｄ（登録商標）（http://www.genecards.org/）などのデータベースより取得することが可能であるが、これに限定されない。
　膜タンパク質とは、膜貫通構造を有するタンパク質で、細胞膜、核膜およびその他の細胞内オルガネラ表面に存在しているタンパク質である。細胞内又は細胞外に接している親水性の部分と、細胞膜内に埋もれている疎水性の部分とが、一つのタンパク質分子中に存在する。そのため、大腸菌等に発現させて取得する場合に、水溶液中で立体構造を形成しづらく、封入体を形成しやすいタンパク質である。
　がん抗原タンパク質とは、腫瘍に発現し、免疫応答を誘導する抗原タンパク質あるいは、腫瘍の存在の指標となりうる抗原タンパク質のことをいう。細胞ががん化することによって発現が増加するタンパク質、細胞ががん化することによってアミノ酸の一部が突然変異したタンパク質等がある。
　本発明の製造方法は、タンパク質をカチオン化することを特徴とする。より好ましくは難溶性タンパク質をカチオン化することを特徴とする。
　タンパク質のカチオン化とは、タンパク質に過剰な正電荷を付加することである。カチオン化されたタンパク質は電荷の反発により、水への可溶性が改善される。タンパク質をカチオン化するためには、カチオン化剤をタンパク質に結合させることが挙げられる。
　「担体」とは上記抗原タンパク質を固相面に結合させるものをいう。具体的にはガラス、ナイロンメンブレン、半導体ウェハー、マイクロビーズなどが挙げられるがこれに限定されない。
　抗原タンパク質を担体に結合させるとは、公知の技術を用いて、直接「抗原タンパク質」を担体の表面に固定させることを意味し、あるいはビオチン－アビジンなどの結合を介して、あるいはリンカー分子を介して間接的に固定させることであってもよい。
　「サンプル」とは本願発明に係る抗体検出用試薬が検出する抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどのサブタイプを含む）、およびその活性を維持した断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片などを含む）を含む試料をいう。
　「体液」とは、生体から採取できる液体状の試料を指す。末梢血、骨髄液、臍帯血、胸水、腹水、尿等がこれに該当するが、これらを当業者が周知の方法で処理した試料（例えば、末梢血を遠心して上清から得られる血漿、血清など）もこれに該当する。
　「二次抗体」とは本願発明に係る抗体検出用試薬が検出しようとする抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどのサブタイプを含む）、およびその活性を維持した断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片などを含む）を認識する抗体及びその活性断片を指す。「標識した二次抗体」とはラジオアイソトープ（radio isotope）、発光剤(luminescent agent)、蛍光剤（fluorophore）等の標識と結合した二次抗体を指す。あるいは、かかる「標識」としてルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンや緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein, ＧＦＰ）などのタンパク質も用いることが出来る。かかるタンパク質由来の「標識」の場合、「標識した二次抗体」は、融合タンパク質の形で１つの組み換えタンパク質として遺伝子工学的に作製することも可能である。
　本発明の製造方法で使用するカチオン化剤としては、ジスルフィド結合を介して、タンパク質に正電荷を付加できる化合物であれば、様々な化合物を使用することができる（図１）。例えば、チオスルホナート化合物、混合ジスルフィド化合物、ピリジルジスルフィド系のカチオン化剤、ハロゲン化アルキル系カチオン化剤等を使用することができる。
　本発明の製造方法で使用するチオスルホナート化合物は、以下の式［化２］によって表わされる化合物である。式中、Xはカチオンを有する基である。Xのカチオンを有する基は１つ又は複数連結していても構わない。式中、Ｒ２は、炭素原子数１～３の低級アルキル基を表す。すなわち、本発明の製造方法で使用するチオスルホナート化合物は、１分子内にXに由来するカチオンを1つ以上有するチオルホナート化合物である。Xとしては、例えば、第4級アンモニウム基等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明の製造方法で使用するチオスルホナート化合物は、１分子内に第４級アンモニウム基に由来するカチオンを１つ以上有する以下の式［化３］で表されるチオスルホナート化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ１は、炭素原子数２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ｒ２は、炭素原子数１、２又は３の低級アルキル基を表し、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０のいずれか、より好ましくは１、２、３のいずれかの整数である）
　チオスルホナート化合物の特徴として、図１に示す説明図において、タンパク質のカチオン化反応後にできる解離基Ｒ２が不活性な解離基であることが挙げられる。
　１分子内に第４級アンモニウム基に由来するカチオンを１つ含んでいる化合物としてはトリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホナート（TAPS- Sulfonate：以下、TAPSと記す）が挙げられる。また、１分子内に第４級アンモニウム基に由来するカチオンを３つ含んでいる化合物としてはTAP3S-Sulfonate（以下、TAP3Sと記す）が挙げられる。
　TAPSとは、以下の式［化４］によって表わされる化合物である。TAPSは、分子内に強い正電荷を帯びた4級アミンを有しており、システイン残基を介してタンパク質に結合することで、タンパク質をカチオン化する。カチオン化されたタンパク質は、可溶性が改善され、SH基が安定に保護される。TAPSは、例えば、Biotechnol. Appl. Biochem. (1998) 28, 207-213を参照して合成すること、またはBr塩の形（以下の式［化５］）（分子量292.26）の試薬として購入することが可能である（和光純薬、片山化学工業など）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　TAP3Sとは、以下の式［化６］によって表わされる、分子量の化合物である。TAP3Sは、分子内に強い正電荷を帯びた４級アミンを３つ有しており、TAPSより強くカチオン化することができる。TAP3Sは、例えば、国際公開第2011/118731号を参照して合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本発明の製造方法で使用する混合ジスルフィド化合物としては、以下の式［化７］に示すようなシスタミンが挙げられる。シスタミンの場合、NH３ ＋がカチオンを有する基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明の製造方法で使用するピリジルスルフィド系のカチオン化剤としては、以下の式［化８］に示すような化合物が挙げられる。Xはカチオンを有する基である。Xのカチオンを有する基は１個又は複数個つながっていても構わない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本発明の製造方法で使用するカチオン化剤としては、S-アルキル化により、タンパク質に正電荷を付加できるハロゲン化アルキル系カチオン化剤も使用することができる。例えば、（3-ブロモプロピル）トリメチルアンモニウム（TAP-Br）を使用することができる。TAP-Brは、タンパク質のSH基に不可逆的に結合し、タンパク質の可溶化能を向上させる。TAP-Br（分子量261.00）は、例えば、Br塩の形（［化９］）で試薬として購入することが可能である（例えば、SIGMA-ALDRICH社）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明の製造方法で使用するカチオン化剤として、様々なものが使用できるが、特にTAPS-SulfonateやTAP-Brは低分子量であるため、高い可溶化能を維持しつつ、タンパク質と抗体の反応を阻害するような立体障害を最小限に抑えることができる。また、低分子量であることからタンパク質に複数分子を結合させ易く、タンパク質に含まれるSH基すべてをカチオン化することができるため、長期保存した場合のビーズの凝集を抑制することができる。
　以下にカチオン化抗原タンパク質の取得の一例として、抗原タンパク質を作製し、TAPSを用いてTAPS化抗原タンパク質を作製する工程を説明する。
　抗原タンパク質の遺伝子を大腸菌に導入し、大腸菌の培養を行う。培養した大腸菌を破砕し、抗原タンパク質を回収する。回収時に、抗原タンパク質は封入体を形成していてもよい。
　回収した封入体を変性剤で可溶化する。使用する変性剤としては、尿素や塩酸グアニジン、界面活性剤等が挙げられるがこれに限定されない。
　抗原タンパク質を変性させた後、還元剤で処理し、SS結合を切断する。還元剤としては、ジチオスレイトール（DTT）、２－メルカプトエタノール（2ME）等が挙げられるがこれに限定されない。
　変性させた抗原タンパク質を含む溶液に、TAPSを添加し、室温で30分静置する。TAPSを添加する量としては、抗原タンパク質と溶液中に含まれるチオール基のモル濃度に対して、TAPSが１～１０倍のモル濃度となるように添加することが好ましい。より好ましくは、１．１～１．２倍である。
　30分後、TAPS化抗原タンパク質を含む溶液に平均分子量600のポリエチレンイミンを終濃度0.2％となるように添加した後、10％酢酸を溶液の4倍量添加する。TAPS化抗原タンパク質を含む溶液を遠心分離にかけ、上清を回収する。
　次いで、上清に含まれるTAPS化抗原タンパク質の精製を行う。精製には、透析やカラムクロマトグラフィー等の方法を利用することができる。たとえば、透析チューブに移し、4℃にて純水～0.5％酢酸に対して透析し、変性剤を除去する。透析した液体を12,000rpm、4℃～室温、15分間遠心分離にかけ、上清を回収する。
　以上の工程により、カチオン化抗原タンパク質を取得する。
　カチオン化した抗原タンパク質は、高い水溶性を示し、調製も容易で、弱酸性条件下（好ましくはpH6以下、さらに好ましくはpH2～5）で極めて高い安定性を示す。そのため、シームレスに全長タンパク質のエピトープを露出させた状態で水溶性を維持することができる。このため、１つの抗原タンパク質に含まれるすべてのエピトープを、抗体と反応しやすい状態で１種類のビーズ上に固定化することができる。
　次に、TAPS化タンパク質を担体に結合させる。
　一態様として、担体としては、磁気性ビーズ、非磁気性ビーズ、マイクロプレート等を使用することができるが、解析の操作の簡便性から磁気性ビーズを使用することが好ましい。以下、担体としてビーズを使用する例を記載する。
　ビーズを結合用の溶液に懸濁する。ビーズにすでにタンパク質との結合を補助するような修飾が施されている場合には、そのままビーズとTAPS化タンパク質との結合を行う。ビーズとタンパク質との結合を補助するような修飾がなされていない場合には、スキムミルク等、抗体検出時に、TAPS化タンパク質と抗体の反応を阻害しないような物質を用いて、ビーズの修飾を行う。
　TAPS化タンパク質の溶液とビーズの懸濁液を混合する。例えば、アミノ基と反応できる状態に活性化されたビーズと混合する場合の時間は2～16時間が好ましい。
　ビーズを回収し、洗浄用溶液に懸濁して、遠心分離を行い、洗浄する。洗浄用溶液としてはリン酸緩衝液等があげられる。洗浄後にビーズを保存する場合には、保存用のバッファーに懸濁して、保存する。保存用のバッファーとしてはBio-Rad社の保存バッファー等が挙げられる。保存用のバッファーが弱酸性（好ましくはpH6以下、さらに好ましくはpH2～5）であれば、TAPS化タンパク質の可溶性がより安定的に保たれる。
　以上の工程により、抗体検出用試薬を製造することができる。
　次に、本発明の製造方法によって製造された抗体検出用試薬（以下、本発明の試薬と記す）を用いた、一態様としての、抗体検出方法について詳説する。
　本発明の試薬は、カチオン化した難溶性抗原タンパク質とビーズによって構成される抗体検出用試薬であってもよい。
　被験者から抗体が含まれると予想される試料を入手する。試料としては体液を用いることができる。体液としては、末梢血、骨髄液、臍帯血、胸水、腹水、尿等を利用することができる。採取の容易さ、被験者への負担の少なさを考慮すると末梢血を利用することが好ましい。採取量は被験者の負担とならない程度の量を採取することが好ましい。末梢血を採取する場合の方法としては、真空採血管、採血バッグ等による全血採取を利用することができる。採血の際、血液の凝固を防止するためにヘパリン等を添加しても構わない。
　採取した血液から、遠心分離によって血漿を採取する。また、成分採血装置を使用して血液の部分採取を行う際に、血漿を取得することも可能である。
　また、末梢血を採取し、血球成分と血液凝固成分を除去し、血清を取得し、試料として使用することもできる。
　抗体の検出にあたり、血漿又は血清を必要に応じて希釈する。
　本発明の試薬と血漿とを混合する。混合する時間として、例えば、室温で反応させる場合は2時間程度、4℃で反応させる場合は一晩程おくことが好ましい。本発明の試薬を、遠心分離法や磁気装置により回収し、洗浄する。
　カチオン化が抗原抗体反応に影響していることが懸念される場合には、ジチオスレイトール等の還元剤で処理することで容易にカチオン化を解除することができるため、その影響を容易に検証することができる。
　抗体を検出するため二次抗体を結合させる。例えば、被験者がヒトである場合には、本発明の試薬に結合している抗体はヒト抗体である。そのため、二次抗体としては標識化した抗ヒト抗体を用いて標識を行う。例えば、ビオチン化抗ヒトIgGマウスモノクローナル抗体や等が挙げられる。
　フローサイトメーターを用いて二次抗体が結合したビーズを検出する。検出を行う際、ビーズそのものにも染色が行われているBio-Plex（Bio-Rad社）を使用していれば、複数種のビーズを同時に装置にかけることが可能となり、一度の操作で複数種の抗体を解析することができる。そのため、解析時間の短縮が図れる。
　前段落の説明の血漿を、血清等の液体サンプルに読み変えることで、本発明の試薬により、他の液体サンプルから抗体を検出することができる。
　以上のような実施形態で、被験者の血液中に含まれる抗体の解析を行うことにより以下のような状況が想定される。
・被験者の生体内抗体の解析により、被験者のアレルギー反応性を判定する。
・治療の前後において抗体の解析を行い、治療の効果や治療後の経過と相関関係を有する抗体を見出す。見出した抗体を指標として治療方針の決定、予後の予測・判定を行う。
・免疫細胞療法において、患者血清中に抗原特異的抗体が検出された抗原を治療に用いることにより、治療効果の向上を図る。
・放射線療法の前後に、抗体の解析を行うことで、アブスコパル効果等の免疫機能が関与するとされている治療効果の予測を行う。
　前述の効果を得ることは、エピトープペプチドを用いた抗体検出用試薬でも可能ではあるが、本発明の試薬ではタンパク質を使用することができる点において優れている。タンパク質を利用することで、被験者のHLAタイプに制限されることなく抗体を検出することができるためである。そのため、一般にマイナーとされ、エピトープペプチドの解析が進んでいないようなHLAタイプであっても、解析を行うことが出来る。
　以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
＜MAGE-A4とWT-1の大量培養と調製方法の検討＞
　まず、抗体検出に使用する抗原タンパク質の調製を行った。
　pET28bベクターにクローニングされたHis-tag融合MAGE-A4（配列番号１６、１７、抗原タンパク質の配列は配列番号３、４）とHis-tag融合WT-1（配列番号１４、１５、抗原タンパク質の配列は配列番号１、２）の二種類のプラスミドDNAで大腸菌T7expressを形質転換し、プレート上に形成されたコロニー数個とり10mLのLB/Kan25培地に添加し、２時間振盪培養した。
　次に400mLのTB培地に少量培養したしたものを添加し、さらに37℃で培養を続けた。菌体の濃度がOD600で0.7～0.8となったとき、IPTGを終濃度0.5mMになるように添加し、さらに37℃で3時間培養した。
　菌体を40mLの溶菌buffer（20mM Tris HCl pH8.0、50mM NaCl、5mM MgSO4、0.2％ Tween20）中で超音波破砕機を使用して分散し、さらに1分×3セットの破砕をおこなった。
　菌体破砕物が含まれる溶液に強力な核酸分解酵素であるBenzonase(HC)を1μL加えて、室温で15分程度静置した。
　WT-1は、遠心分離（8krpm,　10-15min,　室温）により沈殿（inclusion body）を回収し、上清を除去した。回収された沈殿に50-100mLのRO水を加え、再度ソニケーターを用いて沈殿を懸濁し、遠心分離（8krpm,　10-15min,　室温）により沈殿を回収した。
　MAGE-A4は、遠心分離（8krpm,　10-15min,　室温）により上清を回収した。
＜WT-1の沈殿画分の可逆的変性カチオン化法による可溶化＞
　沈澱を5-10mLの6Mグアニジン0.1M Tris-HCl pH8 ＋ 1mM EDTAで溶解した。脱気・窒素置換後に30mMのDTT(固体)を加え、37℃で１時間ほど処理した。
　WT-1を含む溶液に70mM TAPS-Sulfonateを添加し、37℃で30分ほど処理した。
　WT-1、TAPS-Sulfonateを含む溶液に1/10量の酢酸と0.1％PEI600を添加した後、4℃でmilliQ水に対してよく透析した。透析後、SDS-PAGEを行った結果を図２に示した。Supは透析後の溶液を泳動したレーンを、pptは透析後に不溶性画分として得られたサンプルを泳動したレーンを示している。「還元」は、サンプルに還元剤を添加して、TAPSを分離したタンパク質を泳動したレーンを、「非還元」は、サンプルに還元剤を添加せず、TAPS化したタンパク質を泳動したレーンを示す。図２に示したSDS-PAGEの解析結果により、WT-1をTAPS化および可溶化できていることが確認できた。
＜MAGE-A4のCo2+カラムによるHis-tag精製＞
　Co2+カラムをA液(20mM Tris HCl pH8.0、50mM NaCl、0.2％ Tween20)で平衡化後、MAGE-A4の上清を樹脂に吸着させた。その後、A液で十分洗浄した。次にA液＋5mMイミダゾールを30mL流した。カラムにA液＋200mMイミダゾールを4mL加えて5min静置後タンパクを溶出させた。この動作を５回繰り返し、精製MAGE-A4を回収した。
＜MAGE-A4のTAPS化＞
　ナス型フラスコに上記アフィニティー精製後のMAGE-A4を加え、水分を凍結乾燥機で除去したものを3mLの6M グアニジン、0.1M Tris-HCl pH8で溶解した。脱気・窒素置換後に30mMのDTT(固体)を加え、37℃で１時間ほど処理した。MAGE-A4の含まれる溶液に70mM TAPS-Sulfonateを添加し、37℃で30分ほど処理した。
　MAGE-A4、TAPS-Sulfonateを含む溶液に1/10量の酢酸と0.1％PEI600を添加した後、4℃でMilli-Q水に対してよく透析した。透析後、SDS-PAGEを行った結果を図3に示した。
＜HPLCによる精製＞
　TAPS化したMAGE-A4、WT-1に対し逆相HPLCを用いて精製を行った。精製図を図４、５に示す。
　HPLC後のTAPS化MAGE-A4、WT-1に対しSDS-PAGE解析を行った結果を図６に示す。解析の結果から、TAPS化タンパク質を逆相HPLCにより精製することで、高純度な抗原タンパク質として調製可能であることが確認された。MAGE-A4は溶出時間50分から51分（図６のレーン50min）のフラクションを、WT-1は溶出時間52分から53分（図６のレーン52min）のフラクションをそれぞれ回収して、以降の工程に使用した。
　His-tagが融合したNY-ESO-1（配列番号１８、１９、抗原タンパク質の配列は配列番号５、６）、XAGE1b（配列番号２０、２１、抗原タンパク質の配列は配列番号７、８）、gp100（配列番号２２、２３、抗原タンパク質の配列は配列番号９、１０）、Survivin-2B（配列番号２４、２５、抗原タンパク質の配列は配列番号１１、１２）はWT-1と同様の方法で調製した。作製したタンパク質に対しSDS-PAGE解析を行った結果を図７に示す。
＜Bio-Plex COOHビーズ（Bio-Rad社製）への結合＞
　6種類のBio-Plex COOHビーズ（1/10量(1.25×106beads)）と、Bio-Plexアミンカップリングキット（Bio-Rad社製）を用いて、固定化を行った。使用した抗原は各１１μgで、すべてTAPS化により可溶化した変性状態の抗原である。
　可溶化したタンパク質はバッファーに溶解させ、氷上に静置した。
　COOHビーズの容器をボルテックスミキサーで30秒間振盪し、超音波を30秒かけて、懸濁した。
　COOHビーズ懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。
　回収した沈澱にビーズ洗浄バッファーを100μL加え、ボルテックスミキサーで10秒間振盪し、超音波を10秒間かけて懸濁した。COOHビーズ懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。
　回収した沈澱にビーズ活性化バッファーを80μL加え、ボルテックスミキサーで30秒間よく振盪し、超音波を30秒間かけて懸濁した。
　COOHビーズ懸濁液に50mg/mL EDACを10％加えた後、50mg/mL S-NHS（N-hydroxysulfosuccinimide）を10μL加えた。COOHビーズ懸濁液をボルテックスミキサーで30秒間振盪した。
　ビーズに光が当たらないよう遮光し、COOHビーズ懸濁液を回転培養器で20分間振盪した。
　COOHビーズ懸濁液にPBSを150μL加え、ボルテックスミキサーで10秒間振盪した。COOHビーズ懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。この作業は再度繰り返した。
　回収した沈澱にPBSを100μL加え、ボルテックスミキサーで30秒間振盪し、超音波を15秒間かけて懸濁した。
　COOHビーズ懸濁液と、TAPS化タンパク質懸濁液とを混合し、全量が500μＬとなるようにＰＢＳを加えた。
　ビーズに光が当たらないよう遮光し、室温で２時間回転培養器を用いて浸透した。
　COOHビーズ、TAPS化タンパク質の懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。
　沈澱として回収したCOOHビーズ（TAPS化タンパク質が固定化されている）にＰＢＳを500μＬ加え、洗浄した。COOHビーズの懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。
　沈澱として回収したCOOHビーズにBlocking Bufferを250μＬ加え、再び懸濁した。COOHビーズ懸濁液をボルテックスミキサーで15秒間振盪した。
　COOHビーズに光が当たらないようアルミホイルで遮光し、室温で30分間、回転培養器を用いて振盪した。
　COOHビーズ懸濁液を14,000×gで4分間遠心し、上清を除去した。
　沈澱として回収したCOOHビーズに保存用バッファーを500μＬ加え、再懸濁した。COOHビーズ懸濁液を16,000×gで6分間遠心し、上清を除去した。
　このようにして取得したTAPS化タンパク質を固定化したビーズは、保存バッファー150μLに懸濁して、保存した。表１にそれぞれのビーズの濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
＜がん患者の血清中に含まれる抗体の解析１＞
　2名のがん患者（Donor1及びDonor2）から血液を採取し、血清を取得した。
　抗原たんぱく質（NY-ESO-1、WT-1、MAGE-A4、XAGE1b、gp100、Survivin-2B）をそれぞれ固定化した磁気ビーズ6種を同じ濃度になるように混合し、96wellプレート（Bio-Rad、#171-025001）に分注した。各ウェルに患者の血清を加えて、アルミホイルで遮光し、室温で1時間振盪し、反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、抗体を検出するため二次抗体として、ビオチン化anti-human IgG (H+L)（Vector Laboratories社製、BA-3000）を添加し、アルミホイルで遮光し、室温で30分間振盪し、反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、（Ｒ－）フィコエリスリン（Phycoerythrin（ＰＥ））標識ストレプトアビジン（Vector Laboratories）を添加して、アルミホイルで遮光し、室温で10分間振盪して反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、Bio-Plex（Bio-Rad）を用いて解析した。患者血清は400倍、1600倍、6400倍に希釈したものを使用した。
　図８に示す通り、Donor1ではNY-ESO-1に対する反応が確認された。
　この結果から、Donor1の血液中にNY-ESO-1を認識する抗体が存在すること、Donor1のがんがNY-ESO-1を発現していること、NY-ESO-1を使用したペプチドワクチンやDCワクチン治療が有効である可能性が示唆された。
　この結果、Donor2ではXAGE1bに対する反応が確認された。
　この結果から、Donor2の血液中にXAGE1bを認識する抗体が存在すること、Donor2のがんがXAGE1bを発現していること、XAGE1bを使用したペプチドワクチンやDCワクチン治療が有効である可能性が示唆された。
＜がん患者の血清中に含まれる抗体の解析２＞
　腎細胞がん患者8名（Donor２～Donor９）から、EP-DC治療の前後で、血清を取得した。
　EP-DC治療は、がん患者から手術によって除去した腫瘍組織を凍結融解法などによりライセートとして調製し、エレクトロポレーション法により樹状細胞に取り込ませ、樹状細胞ワクチンを調製したものを、当該患者へ投与する治療方法である。
　抗原たんぱく質を固定化した磁気ビーズ６種を同じ濃度になるように混合し、96wellプレート（Bio-Rad、#171-025001）に分注した。各ウェルに患者の血清を加えて、アルミホイルで遮光し、室温で1時間振盪し、反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、抗体を検出するため二次抗体として、ビオチン化anti-human IgG (H+L)（Vector Laboratories、BA-3000）を添加し、アルミホイルで遮光し、室温で30分間振盪し、反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、PE標識ストレプトアビジン（Vector Laboratories）を添加して、アルミホイルで遮光し、室温で10分間振盪して反応させた。ビーズをウォッシュステーション（Bio-Rad）により洗浄し、BioPlex（Bio-Rad）の測定装置を用いて解析した。患者血清は400倍、1600倍、6400倍に希釈したものを使用した。
　図９に示す通り、Donor６とDonor８の血清で、MAGE-A4に対する反応が認められた。Donor６とDonor８の血液中にMAGE-A4を認識する抗体が存在していることから、Donor６とDonor８の患者体内の腫瘍組織がMAGE-A4を発現している可能性が示唆される。その場合には、MAGE-A4を使用したペプチドワクチンやDCワクチン治療を行うことが適切であると推察される。
　また、図１０に示す通り、Donor３の血清では、DCワクチン治療前と治療後とを比較して、DCワクチン治療後に、WT-1に対する反応が高くなっていることが確認された。Donor３の血液中にWT-1を認識する抗体が存在していることから、Donor３の腫瘍組織がWT-1を発現している可能性が示唆される。その場合には、WT-1を使用したペプチドワクチンやDCワクチン治療を行うことが適切であると推察される。
＜カチオン化試薬のSH基保護能の評価＞
　ニワトリ卵白リゾチーム（配列番号１３、以下、単にリゾチームとも記す、キューピー社製）をサンプルとして、カチオン化試薬のSH基保護能の評価を行った。
　100ｍLナシ型フラスコにリゾチームを15mg量り取り、２ｍＬの６Ｍ塩酸グアニジン、0.1M Tris-HCl、pH8.5, 2mM EDTAに溶解した。得られた溶液を脱気及び窒素置換後、ジチオスレイトール（DTT）を終濃度30mMとなるように加え、37℃の恒温槽で2時間反応させた。得られた還元リゾチームに、終濃度70mMの各カチオン化試薬（TAPS-sulfonate（片山化学工業社製）、またはTAP3S-sulfonate）を添加し、さらに室温で2時間反応させた。得られた溶液に1/10量の酢酸を加えて反応を停止させた後、Milli-Q水に対して4℃で1日間透析をし、TAPS化リゾチーム、TAP3S化リゾチームを取得した。なお、TAP3S-sulfonateは特願2010-070804に記載の手法で合成したものを使用した。
　TAPS化、TAP3S化、Native及び還元したリゾチームについて、逆相HPLC（高速液体クロマトグラフィー）を実施した。Nativeのリゾチームには、1分子内に４つのSS結合が存在し、疎水基が露出していないため、ある程度の親水性を有する。還元リゾチームはSS結合を還元した変性タンパク質であり疎水性が最も高い（水への溶解度が低い）ものである。カラムはCOSMOSIL Protein-R（ナカライテクス社製）を使用し、溶媒は０．１％塩酸で希釈したアセトニトリルを使用し、アセトニトリル濃度は１％から５０％までに設定した。
　逆相HPLCのチャートをまとめた結果を図１１に示す。直線はアセトニトリルの濃度を示しており、ピークが左にあるほど、サンプルの疎水性度が低い（水への溶解度が高い）ことを示している。TAP3S化したリゾチームはNative及び還元したリゾチームより親水性が高く、低濃度のアセトニトリル溶媒で溶出している。しかし、TAP3Sではリゾチームの８つすべてのSH基を保護・カチオン化するのは困難であり、一部のSH基が保護されていない不完全体が混入してしまうため、ピークが分散している。一方、TAPS化したリゾチームは８つのSH基がすべて保護・カチオン化されており、均一性が高いことが確認された。TAPSとTAP3SによるSH基の保護能の差は、分子の大きさによるものであり、タンパク質分子上である程度密集したSH基を保護する場合には分子の大きいTAP3Sは、カチオン化の際にタンパク質分子上で立体障害を起こし、TAP3Sと結合できない微量のSH基が残ってしまうため、その後ゆっくりとSH/SS交換反応が進行するためと推察される。
＜ビーズの保存安定性の評価＞
　タンパク質のSH基がすべて保護されていない状態で抗体検出用試薬を調製・保存した場合には、保護されずに残ったSH基がSS結合を形成し、タンパク質の凝集や抗体検出用試薬の凝集が起こることが想定される。そこで、抗体検出用試薬の保存安定性を、以下の手順により確認した。
　実施例１に記載した手順により、TAPS化、TAP3S化、NativeのMAGE-A4をそれぞれ作製し、それぞれのタンパク質を固定化したビーズを調製した。
　調製したビーズを保存用バッファーに懸濁し、４℃又は３７℃の条件下で保存した。一定期間経過した後、懸濁液中のビーズのうち、凝集しているビーズがどの程度存在するかを血球計数盤により測定した。結果に示すビーズ凝集体の割合は、３つ以上のビーズで形成された凝集体の数÷ビーズの総数×１００により算出した。
　図１２に、４℃で５日間、３７℃で１０日間又は４１日間保存した懸濁液中に含まれるビーズ凝集体の割合を示す。４℃で保存した場合、NativeのMAGE-A4を固定化したビーズを保存した場合と比較して、TAPS化又はTAP3S化したMAGE-A4を固定化したビーズを保存した場合において、ビーズの凝集体の割合が低下している。また、３７℃で保存した場合、NativeのMAGE-A4を固定化したビーズを保存した場合と比較して、TAPS化したMAGE-A4を固定化したビーズを保存した場合において、ビーズの凝集体の割合が低下している。
　次に、ビーズの凝集体の割合の減少が、固定化した抗原タンパク質のビーズから遊離によるものでないかを確認するため、ビーズ保存液のSDS-PAGEを行った。
　ビーズに固定化したMAGE-A4はN末端側にHis-tagが付加されている。そこで、抗His-tag抗体（OGHis、MBL社製）を用いたウェスタンブロッティング法により、MAGE-A4を固定化したビーズの保存液中に含まれる遊離したMAGE-A4タンパク質を検出した。
　結果を図１３に示す。レーン2-4に泳動したサンプルは、それぞれTAPS化MAGE-A4固定化ビーズ、TAP3S化MAGE-A4固定化ビーズ、Native MAGE-A4固定化ビーズを104日間保存したものの保存液を使用した。いずれのサンプルからも同程度の遊離タンパク質が検出され、カチオン化したことで抗原タンパク質がビーズから遊離しやすくなっているという現象は確認されなかった。
　さらに、Bio-Plex COOHビーズ、104日間保存したTAPS化MAGE-A4固定化ビーズ、TAP3S化MAGE-A4固定化ビーズ又はNative MAGE-A4固定化ビーズについて、結合しているタンパク質の検出を行った。
　PBS中で200ng/mLに希釈した抗His-tag抗体(OGHis、MBL社製)と、各ビーズを室温で30分間混合した後、PBSを用いて各ビーズを2回洗浄した。次に、PBS中で200ng/mLに希釈した抗マウスIgG-Alexa488（2次抗体：Invitrogen)と、各ビーズを室温で30分間混合した後、PBSを用いて2回洗浄した。これらのビーズを共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察（励起光488nm, 蛍光フィルターLP505）し、ビーズ表面にHis-tag付加MAGE-A4タンパク質が存在することを可視化した。撮影画像を図１４に示す。なお、いずれの画像も全て同じ検出感度で撮影している。図１４に示したように、いずれのビーズの表面にもMAGE-A4タンパク質が結合していることが確認できた。
　実施例５の結果から、本発明に開示された抗体検出用試薬の製造方法により調製されたビーズは、Nativeのタンパク質を用いてビーズを調製するよりも凝集体の形成を抑制する効果を有することが明らかとなった。この凝集体の形成抑制は、ビーズ表面の抗原タンパク質が遊離することによるものではないことも確認した。さらに、タンパク質の可溶化能については、TAPSよりもTAP3Sが優れていることは公知であったが、調製されたビーズの凝集抑制効果については、可溶化能と異なり、TAPSのほうが優れていることが明らかとなった。
＜TAP-Brによるタンパク質のカチオン化＞
　ナス型フラスコに上記アフィニティー精製後のXAGE1b又はNY-ESO-1を加え、水分を凍結乾燥機で除去したものを3mLの6M グアニジン，0.1M Tris-HCl pH8で溶解した。脱気・窒素置換後に30mMのDTT(固体)を加え、37℃で１時間ほど処理した。XAGE1b又はNY-ESO-1の含まれる溶液に70mM TAP-Brを添加し、37℃で60分ほど処理した。
　XAGE1b又はNY-ESO-1とTAP-Brを含む溶液に1/10量の酢酸を添加した後、4℃でMilli-Q水に対してよく透析した。TAP化したXAGE1b、NY-ESO-1を逆相HPLCにより精製した。
　実施例１に記載した方法により、TAP化XAGE1b、TAPS化XAGE1b、TAP化NY-ESO-1、TAPS化NY-ESO-1をそれぞれ固定化したビーズを調製した。TAP化した抗原タンパク質もTAPS化した抗原タンパク質と同様にビーズに固定化できることを確認した。
　なお、本明細書中で引用したすべての刊行物、特許をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
　以上、説明したように、本発明の製造方法を用いることにより、抗原タンパク質を用いた抗体検出用試薬を効率よく製造することができる。本発明の製造方法によって製造された抗体検出用試薬は、安定性が高く、また液体サンプル中の抗体を効率よく検出できることも確認された。本発明の試薬を用いることで、被験者のHLAタイプに拘束されない抗体解析検査を提供することが可能である。この検査を実施することで、例えば、免疫が関与する疾患の治療方針の決定や治療効果の予測・判定等が行えると考えられる。

Claims (14)

  1. 　抗原タンパク質と担体とで構成される抗体検出用試薬の製造方法であって、抗原タンパク質をカチオン化して可溶化する工程と、カチオン化した抗原タンパク質を担体に結合させる工程と、を含む抗体検出用試薬の製造方法。
  2. 　前記抗原タンパク質が、全長タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  3. 　前記抗原タンパク質が、膜タンパク質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  4. 　前記抗原タンパク質が、がん抗原タンパク質であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  5. 　前記カチオン化が、抗原タンパク質のチオール基にカチオン化剤を結合させることによって行われることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  6. 　前記カチオン化剤が、チオスルホナート化合物、混合ジスルフィド化合物、ピリジルスルフィド系のカチオン化剤、ハロゲン化アルキル系カチオン化剤のいずれか１つ、又はその混合物から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  7. 　前記チオスルホナート化合物が、以下の式の化合物である
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    請求項６に記載の抗体検出用試薬の製造方法（式中、Ｒ１は、炭素原子数２～２０の直鎖アルキレン基を表し、Ｒ２は、炭素原子数１～３のアルキル基を表し、ｎは１～３のいずれかの整数である）。
  8. 　前記化合物が、Ｒ１が－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２がＣＨ３－であり、ｎが１で表されるTAPS-Sulfonateであることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
  9. 　前記化合物が、Ｒ１が－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２がＣＨ３－であり、ｎが３で表されるTAP3S-Sulfonateであることを特徴とする、請求項７に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  10. 　前記ハロゲン化アルキル系カチオン化剤が、TAP－Brであることを特徴とする、請求項６に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  11. 　前記担体が、磁気ビーズであることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の抗体検出用試薬の製造方法。
  12. 　請求項１乃至１１の製造方法によって製造された抗体検出用試薬。
  13. 　サンプル中に含まれる抗原特異的な抗体の検出方法であって、請求項１２に記載の抗体検出用試薬とサンプルとを接触させる工程と、抗体に結合する標識した二次抗体を添加し、抗体と結合させる工程と、抗体検出用試薬を回収する工程と、抗体が結合した抗体検出用試薬を検出する工程とを含む、抗体検出方法。
  14. 　前記サンプルが、単離された体液であることを特徴とする、請求項１３に記載の抗体検出方法。
PCT/JP2013/059692 2012-03-30 2013-03-29 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途 WO2013147233A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/389,016 US10822384B2 (en) 2012-03-30 2013-03-29 Method for producing reagent for antibody detection and use thereof
JP2013531595A JP6168497B2 (ja) 2012-03-30 2013-03-29 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途
EP13768100.3A EP2833143B1 (en) 2012-03-30 2013-03-29 Method for producing reagent for antibody detection and use thereof
AU2013240942A AU2013240942B2 (en) 2012-03-30 2013-03-29 Method for producing reagent for antibody detection and use thereof
CN201380028339.6A CN104380106B (zh) 2012-03-30 2013-03-29 用于生产抗体检测试剂的方法及其用途
SG11201406160QA SG11201406160QA (en) 2012-03-30 2013-03-29 Method for producing reagent for antibody detection and use thereof
US17/029,206 US20210032302A1 (en) 2012-03-30 2020-09-23 Method for detecting an antigen-specific antibody and reagent for use therein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012082735 2012-03-30
JP2012-082735 2012-03-30

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/389,016 A-371-Of-International US10822384B2 (en) 2012-03-30 2013-03-29 Method for producing reagent for antibody detection and use thereof
US17/029,206 Continuation US20210032302A1 (en) 2012-03-30 2020-09-23 Method for detecting an antigen-specific antibody and reagent for use therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013147233A1 true WO2013147233A1 (ja) 2013-10-03

Family

ID=49260472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/059692 WO2013147233A1 (ja) 2012-03-30 2013-03-29 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10822384B2 (ja)
EP (1) EP2833143B1 (ja)
JP (1) JP6168497B2 (ja)
CN (1) CN104380106B (ja)
AU (1) AU2013240942B2 (ja)
SG (1) SG11201406160QA (ja)
TW (1) TWI582424B (ja)
WO (1) WO2013147233A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018207866A1 (ja) * 2017-05-11 2018-11-15 学校法人 川崎学園 がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物
JP2021517242A (ja) * 2018-03-08 2021-07-15 イムノコア リミテッド Ｍａｇｅａ４を検出する方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013147233A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 国立大学法人岡山大学 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
PT3388075T (pt) 2015-03-27 2023-08-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Novos péptidos e combinações de péptidos para uso em imunoterapia contra vários tumores
CN111647066B (zh) * 2020-07-01 2020-12-18 维肽瀛(上海)生物技术有限公司 Wt1多肽肿瘤抑制剂

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3225468B2 (ja) 1992-08-28 2001-11-05 ダイナボット株式会社 抗体測定用試薬
JP2005098877A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Hitachi Software Eng Co Ltd 抗体検出体、その製造方法、及び抗体検出方法
JP3960614B2 (ja) 2003-08-31 2007-08-15 株式会社イムノディア 抗ペプチド抗体測定法とペプチドワクチンのワクチン候補選択方法
JP2008002961A (ja) * 2006-06-22 2008-01-10 Ulvac Japan Ltd 生体物質検出・回収方法およびその装置、認識素子及び生体物質解析方法
JP2010509602A (ja) * 2006-11-13 2010-03-25 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィーク（セーエヌエールエス） 両親媒性物質による担体上への膜タンパク質の固定
JP2010070804A (ja) 2008-09-18 2010-04-02 Daido Steel Co Ltd バッチ式熱処理炉
WO2011118731A1 (ja) 2010-03-25 2011-09-29 国立大学法人 岡山大学 チオスルホナート化合物、タンパク質及び／又はペプチドの可逆的カチオン化剤並びに可溶化方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6589736B1 (en) * 1994-11-22 2003-07-08 The Trustees Of Boston University Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules
CN1215332C (zh) * 2000-07-27 2005-08-17 协和梅迪克斯株式会社 采用不溶性载体粒子的免疫测定方法、免疫测定试剂及其稳定化方法
JP4833831B2 (ja) * 2003-03-31 2011-12-07 ウイミンズ、アンド、チルドランズ、ホスピトル リソソーム蓄積症（ｌｄｓ）の多重スクリーニング
WO2005088312A1 (en) 2004-03-08 2005-09-22 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Autoantibody detection for cancer diagnostics
EP1650297B1 (en) * 2004-10-19 2011-04-13 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and apparatus for the rapid disruption of cells or viruses using micro magnetic beads and laser
CN100406889C (zh) * 2005-07-15 2008-07-30 北京倍爱康生物技术股份有限公司 一种人甲状腺球蛋白抗体磁分离酶促化学发光免疫检测方法
JP2008233007A (ja) * 2007-03-23 2008-10-02 Osaka Industrial Promotion Organization 悪性リンパ腫の診断用キット及び判定方法
CN101452001B (zh) * 2007-12-06 2013-07-24 王颖 化学发光磁酶免疫法定量检测rbp4试剂盒
CN101403747B (zh) * 2008-11-07 2012-08-29 浙江伊利康生物技术有限公司 补体3检测试剂
CN101551394A (zh) 2009-05-13 2009-10-07 郑州安图绿科生物工程有限公司 以磁性微粒为载体检测丙型肝炎病毒抗体的方法
WO2013147233A1 (ja) * 2012-03-30 2013-10-03 国立大学法人岡山大学 抗体検出用試薬の製造方法、及びその用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3225468B2 (ja) 1992-08-28 2001-11-05 ダイナボット株式会社 抗体測定用試薬
JP3960614B2 (ja) 2003-08-31 2007-08-15 株式会社イムノディア 抗ペプチド抗体測定法とペプチドワクチンのワクチン候補選択方法
JP2005098877A (ja) 2003-09-25 2005-04-14 Hitachi Software Eng Co Ltd 抗体検出体、その製造方法、及び抗体検出方法
JP2008002961A (ja) * 2006-06-22 2008-01-10 Ulvac Japan Ltd 生体物質検出・回収方法およびその装置、認識素子及び生体物質解析方法
JP2010509602A (ja) * 2006-11-13 2010-03-25 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィーク（セーエヌエールエス） 両親媒性物質による担体上への膜タンパク質の固定
JP2010070804A (ja) 2008-09-18 2010-04-02 Daido Steel Co Ltd バッチ式熱処理炉
WO2011118731A1 (ja) 2010-03-25 2011-09-29 国立大学法人 岡山大学 チオスルホナート化合物、タンパク質及び／又はペプチドの可逆的カチオン化剤並びに可溶化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., vol. 28, 1998, pages 207 - 213
M. INOUE ET AL., BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., vol. 28, 1998, pages 207 - 213
M. SENO ET AL., GROWTH FACTORS, vol. 15, 1998, pages 215 - 229
See also references of EP2833143A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018207866A1 (ja) * 2017-05-11 2018-11-15 学校法人 川崎学園 がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物
CN110582701A (zh) * 2017-05-11 2019-12-17 学校法人川崎学园 检查癌症治疗效果的方法和用于诱导免疫应答的组合物
JPWO2018207866A1 (ja) * 2017-05-11 2020-05-28 学校法人 川崎学園 がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物
JP7216420B2 (ja) 2017-05-11 2023-02-01 学校法人 川崎学園 がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物
US11709165B2 (en) 2017-05-11 2023-07-25 Kawasaki Gakuen Educational Foundation Examination method for prediction of effect of treatment of cancer based on detection of cancer/testis antibodies
JP2021517242A (ja) * 2018-03-08 2021-07-15 イムノコア リミテッド Ｍａｇｅａ４を検出する方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104380106B (zh) 2017-02-22
EP2833143A4 (en) 2015-11-11
AU2013240942B2 (en) 2018-07-05
TWI582424B (zh) 2017-05-11
US20150064801A1 (en) 2015-03-05
SG11201406160QA (en) 2014-11-27
TW201400814A (zh) 2014-01-01
EP2833143B1 (en) 2019-04-24
US10822384B2 (en) 2020-11-03
JPWO2013147233A1 (ja) 2015-12-14
CN104380106A (zh) 2015-02-25
AU2013240942A1 (en) 2014-11-13
EP2833143A1 (en) 2015-02-04
US20210032302A1 (en) 2021-02-04
JP6168497B2 (ja) 2017-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210032302A1 (en) Method for detecting an antigen-specific antibody and reagent for use therein
EP3228709B1 (en) Tim protein-bound carrier, methods for obtaining, removing and detecting extracellular membrane vesicles and viruses using said carrier, and kit including said carrier
JP6327662B2 (ja) 細胞表面タンパクを抗原とする抗体を測定する方法
WO2005040815A1 (ja) Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法
CA2977759A1 (en) Immunological measurement method for l-fabp and measurement reagent used in said method
JP6016789B2 (ja) Ｐｉｖｋａ−ｉｉ測定試薬における非特異反応の抑制方法
JP4866977B2 (ja) 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬
JPWO2013018836A1 (ja) 生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法、当該方法に使用するための剤
JP7389740B2 (ja) Ｈｃｖ抗原のマルチエピトープ融合タンパク質およびその使用
JP2009525725A (ja) 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用
KR101864375B1 (ko) 바이오 실리카를 이용한 물질의 검출, 분리 또는 정제
JP2021098746A (ja) 遺伝子組み換えトリパノソーマ・クルージｊｌ７抗原変異型およびシャーガス病を検出するためのその使用
JP2019525889A (ja) 抗体結合性ナノフィブリル
US20240102998A1 (en) Methods and materials for improved immunoassays using synthetic antigens
CN114588881A (zh) 免疫吸附剂及其制备方法
WO2019041013A1 (pt) Trim21-sonda e sua utilização como detecção e purificação de anticorpos do tipo igg
JPWO2020027097A1 (ja) 固相担体およびキット
JP2017223636A (ja) 神経自己免疫疾患の診断

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013531595

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13768100

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14389016

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013768100

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013768100

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013240942

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20130329

Kind code of ref document: A