JP2008002961A - 生体物質検出・回収方法およびその装置、認識素子及び生体物質解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料溶液中の標的物質の検出を、固相表面に極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化して前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、前記極性脂質のリポソーム構造を認識素子として用い前記標的物質が検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程及び前記標的物質を捕捉した前記認識素子を回収する工程を有することを特徴とする。
【選択図】 図1
Description
一方で、近年のゲノム研究をはじめとするオーミクス研究では、生体の構成要因は遺伝子だけでも数万に及び、それ以外に、ゲノム情報によらずに関係し合う化学物質や物質間の相互作用は膨大な数にのぼることが明らかになりつつある。このため、生命現象は物質の複雑な相互作用の結果であるという古典的な解釈が再浮上している。
前者の方法では、物質間が相互作用した際に生じる熱量を測定する等温滴定カロリメトリー法、核磁気共鳴法(NMR)によって分子の構造変化をモニターする方法、蛍光共鳴エネルギー転移法が挙げられる。
後者の方法では、表面プラズモン共鳴法や水晶振動子を利用した方法が挙げられる。表面プラズモン共鳴センサーは、金属薄膜に全反射する光を入射した際に生じる微弱なエネルギー波(エバネッセント波)が誘電体と接触している金属表面における粗密波(表面プラズモン)と共鳴する事で全反射光が減衰する現象(SPR現象)を応用する。生体物質間の相互作用によって生じた金属薄膜表面の誘電率変化をSPR現象の減衰ピークの生じる角度変化によって検出する水晶振動子は、水晶板の圧電効果を利用し、水晶板に一定の電圧を印加することで一定の周波数で発振する素子を用いる。水晶板表面に負荷される質量や粘性および弾性の変化によって周波数が変化し、生体物質が相互作用した際に生じる質量負荷の変化を周波数として検出することができる。この他に、表面の屈折率を計測するエリプソメーター、二面編波式干渉法、表面弾性波を利用した方法がある。
その一例として、表面プラズモン共鳴センサーを用いて、認識物質に対し相互作用した物質の活性を測定した後、センサー上で捕捉した物質を回収して質量分析法にて同定する報告がされている(非特許文献1)。
しかし、固相表面と液相間との反応はLangmuirの法則に従う平衡反応であると同時に、ごく限られた領域の検出部で物質を捕捉、回収することになるので、元の試料溶液中の被検出対象物質濃度がとても濃くなければ、後の分析に耐えうるサンプル量を得る事は困難であった。また、抗原抗体反応、DNAの相補鎖同士のハイブリダイゼーションおよび認識物質が一般的にアプタマーと呼ばれているある特定物質に対し特異的に結合するポリヌクレオチドであれば結合定数も強く、非常に安定した結合体を形成するが、結合能が低い物質間相互作用においてはほとんどが試料溶液中に未反応で残ってしまい、回収が困難であった。
また、DDS技術や医療用デバイス、人工臓器といった技術の発展によって、細胞膜を構成するphosphatidylcholineの極性基と同一の構造をもつ2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体(以下「MPCポリマ」とする。)のような様々なポリマーやリポソーム試薬が開発されており、その生体物質の非特異的吸着や適合性を評価する方法が求められている。
また、請求項2に記載の本発明は、請求項1に記載の生体物質検出・回収方法において、前記生体物質間の相互作用を水晶振動子の周波数変化によって検出することを特徴とする。
また、請求項3に記載の本発明は、請求項1に記載の生体物質検出・回収方法において、前記生体物質間相互作用を表面プラズモン共鳴法センサ表面の誘電率変化により検出することを特徴とする。
また、請求項4に記載の本発明は、請求項1に記載の生体物質検出・回収方法において、前記標的物質がペプチド分子であることを特徴とする。
また、本発明の生体物質解析方法は、請求項5に記載の通り、請求項1に記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記標的物質が捕捉された前記認識素子を分光学的手法によって構造解析を行う工程を有することを特徴とする。
また、本発明の生体物質解析方法は、請求項6に記載の通り、請求項1に記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記標的物質が捕捉された前記認識素子を固体核磁気共鳴法によって構造解析を行うことを特徴とする。
また、本発明の認識素子は、請求項7に記載の通り、緩衝液を含む試料溶液中の標的物質の検出を、固相表面に極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化して前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、前記極性脂質のリポソーム構造を認識素子として用い前記標的物質が検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程及び前記標的物質を捕捉した前記認識素子を回収する工程を含む生体物質検出・回収方法において使用される認識素子であって、前記緩衝液の比重よりも、前記リポソームに含まれる溶液の比重を重くしたことを特徴とする。
また、請求項8に記載の本発明は、請求項7に記載の認識素子において、前記リポソームに含まれる溶液を、糖類を主成分とした溶液としたことを特徴とする。
また、本発明の生体物質検出・回収装置は、請求項9に記載の通り、試料溶液中の標的物質と相互作用する極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化するための固相表面に備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が検出された前記試料溶液と前記認識物質のリポソーム構造である認識素子とを混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質が捕捉された認識素子を回収するための遠心分離手段を備えたことを特徴とする。
また、請求項10に記載の本発明は、請求項9に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段は、水晶振動子のセンサーであることを特徴とする。
また、請求項11に記載の本発明は、請求項9に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段は、表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする。
また、請求項12に記載の本発明は、請求項8又は9に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段の前記検出部と前記混合手段とは、前記試料溶液を搬送するための流路により接続されていることを特徴とする。
また、請求項13に記載の本発明は、請求項8又は9に記載の生体物質検出・回収装置において、前記検出手段の前記検出部と前記混合手段との間に、前記試料溶液を排出するための他の流路を備えたことを特徴とする。
また、極性脂質により構成されたリポソームを認識素子を使用することにより、固相表面と液相の平衡状態において捕捉できる標的物質を使用する場合に比べ、結合積が増えより効率的に試料溶液中の標的物質を回収することができる。この結果、相互作用の測定と標的物質の回収を効率的に行うことができ、回収された標的試料は他の分析手段に使用することができる。また、極性脂質を基本構成とする認識物質により特定の機能を有する生体物質を解析する場合に、相互作用解析、具体的には結合の有無やその親和性を解析し、それと同時に構造解析などの機能解析を行うことができる。
また、本発明の認識素子によれば、緩衝液の比重よりも重い糖類を主成分とした溶液等を含むために、沈殿しやすく遠心分離により容易に回収することができる。
認識物質と相互作用する標的物質を検出し効率的に標的物質を回収できるので、認識物質と相互作用する標的物質を検出し、効率的に標的物質を回収することが可能となるため、標的物質を他の手法、例えば固体核磁気共鳴法などによる解析が可能となる(非特許文献1:Biophys. J 78, 2405-2417(2000))。
固相表面での生体物質間相互作用は、水晶振動子センサーや表面プラズモンセンサーを利用できるため、容易にシステムを構築することが可能となる。
本明細書において、生体物質というのは生命現象に関わる物質一般を指し、本明細書における認識物質は極性脂質膜および極性脂質と複合体を形成しているものとする。そして、この認識物質と相互作用し得る物質を標的物質とする。
(標的物質を含む試料溶液の検出工程)
本発明における検出手段は、固相表面を反応検出場とし、標的物質と認識物質との生体物質間の相互作用により生じる固相表面の物理的特性を測定することができるセンサーであればよく、水晶振動子、表面プラズモン、エリプソメトリー、二面編波式干渉法および表面弾性波を利用したセンサーを使用することができる。
検出手段として水晶振動子を使用する場合には、水晶板の両面に設けられた電極のうちの一方の電極に、認識物質を固定化し、認識物質が固定化されている水晶板の片側を試料溶液に浸し、前記両電極に電圧を所定周波数で印加するようにし、その際に、電極上の認識物質と標的物質との相互作用による水晶板の周波数変動を両電極を介して測定すればよい。
また、検出手段として、表面プラズモンセンサーを使用する場合には、プリズム底面に金属層を設け、認識物質を積層し、プリズム底面を試料溶液を浸漬させ誘電率の変化を測定する。具体的には、表面プラズモン共鳴現象の減衰ピークの生じる角度変化を測定すればよい。
認識物質と相互作用が確認して標的物質を含むことが確認できた試料溶液は、そのまま次の工程に送られる。尚、標的物質を含むか否かの判断については、ゼロかそうでないか以外にも、所定の濃度をボーダーとしてその判断を行うようにしてもよい。また、標的物質を含まない試料溶液についてはドレイン等を介して排出する工程を設けることが好ましい。複数の試料溶液を連続して検出する場合に、標的物質を含まない溶液を排出すれば作業効率が高めることができるからである。
標的物質を回収するために前記極性脂質をリポソーム構造とした認識素子を前記試料溶液中に添加することにより、標的物質を捕捉する。認識素子は微粒子としてみなすことができ、標的物質との衝突確率が高く、試料中の標的物質のほとんどが認識素子により捕捉することができる。
また、上記試料溶液中の標的物質の検出時においては、標的物質とセンサー上の認識素子との反応は平衡であるために、標的物質のほとんどが未反応で試料溶液中に存在している。認識素子は、この未反応の標的物質を捕捉することもできる。
標的物質を捕捉した認識素子は、遠心分離や電気泳動法等の公知の分離方法により容易に回収することができる。
尚、緩衝液とはpHを保つための溶液で、中性付近で用いられる緩衝液としてはリン酸、Tris、HEPES等が挙げられる。生体内での反応を再現するためにはこれにNaCl等の塩やタンパク質の変性防止目的としてグリセロール等の糖が加えられ用いる。尚、本明細書においては、これら生理緩衝液一般を指す。
また、SUVの調整やサイズをコントロールする方法として市販されているフィルターを用いることができる。この他の脂質組成においても上記論文記載の方法で十分対応ができるが、Dimyristoyl phosphatidylglycerol(以下「DMPG」とする。)のような極性の偏った極性脂質においてはクロロホルムだけでは溶解できないのでエタノールなどの極性溶媒を用いればよい。また、膜タンパク質を有する認識素子を作成する場合は、上記方法で得られるリポソームに膜タンパク質を再構成する方法で可能となるし、膜表在性ペプチドなどは上記リポソームと混合することで修飾することができる。
本発明は、試料溶液中の標的物質と相互作用する極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化するための固相表面に備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が検出された前記試料溶液と前記極性脂質のリポソーム構造を認識素子と混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質が捕捉された認識素子を回収するための遠心分離手段を備えたものである。
前記検出手段は、生体物質検出・回収方法のところで説明した検出手段と同じである。前記混合手段は、認識素子を試料溶液に加え混合できるものであればよく、また、遠心分離手段についても、遠心分離により認識素子を回収できるものであればよく、いずれも市販されている。
上記検出手段の検出部から混合手段への試料溶液の移動は、手作業によっても行うことができるが、好ましくは検出手段を容器内に設け、この容器と混合手段とを流路により接続してポンプ等を利用して移動できるように構成することが好ましい。検出を行った試料溶液をそのまま混合手段に移動することができ、作業効率がよいからである。また、前記容器又は前記流路をドレインに接続するようにしてもよい。検出により、不要と判断した試料溶液を排出し、更に回収することができるからである。更に、電磁弁等により、前記ドレインへの切換ができるようにすれば、操作がより簡便となるため好ましい。また、試料溶液の量については特に制限はないが、通常10μL〜5 mL程度である。
抗菌性ペプチドであるMagainin2(以下「MG2」とする。)を標的物質のモデルとし、Dimyristoyl phosphatidylcholine(以下「DMPC」とする。)膜とDMPG膜を認識物質として採用し、試料溶液中の標的物質と認識物質との相互作用を検出する手段として表面プラズモン共鳴(以下「SPR」とする。)センサーを使用して行う。その後、標的物質を含む試料溶液中の標的物質を各極性脂質膜から構成されるリポソーム(認識素子)により回収するとともに遠心分離器により、リポソームを分離するとともにこれに対して円偏光二色性法および固体高分解能核磁気共鳴法(以下「NMR」とする。)によってMG2および各脂質膜の構造解析を行う例を示す。
図1の最上段部に符号101で示す容器には、試料溶液と測定緩衝液である1%BSA, 10 mM Tris(pH 7.4), 150 mM NaCl溶液と試料が導入される。この容器(101)内には、検出手段としてSPRセンサー(127)が設けられており、SPRセンサー(127)表面上に固定化されている認識物質(125)と標的物質(124)の相互作用を検出できるように構成される。
金表面であるSPRセンサー(127)をオゾンプラズマで10秒間処理し、さらにピランハ溶液(30%過酸化水素水と濃硫酸の混合溶液)で10分間金表面を洗浄する。続いて、トルエンに溶解した5 mM n-Octadecanethiol溶液をセンサー表面に置き、1時間、室温で放置することで、n-Octadecanethiolの自己組織化膜が形成される。n-Octadecanethiolの自己組織化膜ではメチル基が表面にくるため、SPRセンサー(127)表面が疎水性に改質される。次に上記している方法にて50 nmのサイズに調整された、DMPCまたはDMPGのSUVを0.5 mMの濃度で疎水性センサー表面に反応させることで、認識物質(125)である各極性脂質を単相膜としてセンサー(127)表面に固定化することができる。
DMPGを認識物質とした場合においても、DMPCの時と同様に試料溶液B(123)でのみシグナルが変化し標的物質(124)が検出されることが確認される。
その際、上述したSPRセンサー(127)における標的物質(124)と固定化された認識物質(125)との相互作用は、Langmuirの固相表面−液相間の法則に従うため、図1の中段右側に示すように試料溶液B(123')中の標的物質(124)のほとんどが未反応な状態で残る。このため、粒子状の認識素子(128)は試料溶液B(123’)中の標的物質MG2(124)のほとんどと結合し複合体(129)の状態で捕捉される。
十分な時間、試料溶液B(123’)と認識素子(128)を混合した後、この混合液を遠心分離手段である遠心分離槽(104)に流路(113)を介して移動し、130,000gで5分間遠心することで沈殿物として複合体(129)を回収する。
遠心後の上清は流路(114)、ポンプ(105)及び流路(115)を介してドレインへと排出する。
上記の方法により、複合体(129)は測定緩衝液に再懸濁された状態で回収することができる。
また、本実施例では相互作用解析は単純化するために検出のみとしたが、様々な濃度の試料をセンサー上にアプライすることによって結合(解離)定数を求めるアフィニティー解析やその結合および解離速度から速度論解析を行う事もできる。
次に薬物送達系(Drug Delivery System,DDS)として応用するためのリポソームの評価として、脂質とDNAの複合体の評価を行った例を示す。固相表面で生体物質間相互作用を検出手段として27 MHzを基本周波数とする水晶振動子センサーを採用し、中性脂質である1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphatidylcholine(以下「DOPC」とする。)とDOPCとカチオン脂質である1,2-dioleoyl-3-3trimethyl-ammoniumpropane(以下「DOTAP」とする。)の混合膜を認識物質として採用する。DOPCとDOTAPの混合比は5:1のものを調整する。各脂質はクロロホルムとメタノールの混合溶媒に溶解し、フィルムを作成後、0.2 wt %のAnthraceneを含む10 mM PBS(pH 7.5), 150 mM NaClの緩衝液で懸濁し、0.2 μmのフィルターを通したMLVを調整し、遠心、回収することで認識素子とする。ここで調整されたリポソームのアルキル鎖疎水部にはAnthraceneが修飾され、蛍光寿命測定法による解析が可能となる。認識物質であるDNAはClontech社から購入したPlasmid DNA pCMVSport-β-Gal DNA(以下「DNA β-Gal」とする。)を使用する。
検出手段(301)においては、水晶振動子センサーが設けられている。水晶振動子センサーの電極上には認識物質であるDOPCもしくはDOPC/DOTAP混合膜が二重膜で固定化されている。DOPCもしくはDOPC/DOTAP混合膜の固定化方法は、水晶振動子表面にSiO2膜を0.1 μmの膜厚で蒸着し、オゾンプラズマアッシングを10秒間行った表面に、SUVのDOPCもしくはDOPC/DOTAPを結合させることにより行う。
水晶振動子センサー表面に3μM, 6μM, 9μM, 12μMのDNA β-Galを導入しその周波数の経時変化の模式図が図4(a)である。
導入するDNA β-Galの濃度が高くなるにつれ、水晶振動子センサーの周波数減少の減衰時定数が短く、DOPCとDNA β-Galとの相互作用が平衡に達するまでの時間が早いことが分かる。
動力学解析方法は1対1の結合モデルで行う。水晶振動子センサー上に固定化されている認識物質(A)とそれと相互作用する標的物質(B)は結合し複合体(C)を形成する過程はA+B⇔Cに従う平衡であり、その親和性は下記数1で定義される結合(解離)定数Ka(Kd)で定量化することができる(ここで、[A]、[B]、[C]はそれぞれのモル濃度を示す)。
図4で示した方法と同様、DOPC/DOTAPとDNA β-Galの相互作用における結合速度定数k+、解離速度定数k-を求めた結果、DNA β-Galの親和性はカチオン脂質が含まれるDOPC/DOTAPの方が中性脂質であるDOPCに比べ高いことがわかる。
上記した実施例1および実施例2では、水晶振動子の計測では共振点周波数のみを計測例を示しているが、特願2005-192612に示されるような水晶振動子の基本波の共振点付近のコンダクタンスの最大値の1/2になる周波数(F1、F2)およびこのオーバートーンのF1、F2を用いる方法や、Q-sence AB社が提案しているQCM-Dと呼ばれる測定方法により、質量付加の正確な測定、固定化されたフィルム膜の粘弾性変化および溶液の粘性変化を測定することにより、より正確な相互作用解析が行えることは言うまでもない。また、その他の手法、例えばエリプソメーターや二面編波式干渉法といった方法でも計測は可能である。
102 ポンプ
103 混合槽
121 試料溶液A
123 試料溶液B
124 MG2
124 標的物質
125 DMPC
125 認識物質
127 SPRセンサー
129 複合体
111,112,113,114,115 流路
301 検出手段
303 混合手段
304 分離手段
305,306,307,308,309 流路
Claims (13)
- 試料溶液中の標的物質の検出を、固相表面に極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化して前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、前記極性脂質のリポソーム構造を認識素子として用い前記標的物質が検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程及び前記標的物質を捕捉した前記認識素子を回収する工程を有することを特徴とする生体物質検出・回収方法。
- 前記生体物質間の相互作用を水晶振動子の周波数変化によって検出することを特徴とする請求項1に記載の生体物質検出・回収方法。
- 前記生体物質間相互作用を表面プラズモン共鳴法センサ表面の誘電率変化により検出することを特徴とする請求項1に記載の生体物質検出・回収方法。
- 前記標的物質がペプチド分子であることを特徴とする請求項1に記載の生体物質検出・回収方法。
- 請求項1に記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記標的物質が捕捉された前記認識素子を分光学的手法によって構造解析を行う工程を有することを特徴とする生体物質解析方法。
- 請求項1に記載の生体物質検出・回収方法により回収された前記標的物質が捕捉された前記認識素子を固体核磁気共鳴法によって構造解析を行うことを特徴とする生体物質解析方法。
- 緩衝液を含む試料溶液中の標的物質の検出を、固相表面に極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化して前記標的物質との生体物質間の相互作用により生じる前記固相表面の物理的特性の変化に基づいて行う工程、前記極性脂質のリポソーム構造を認識素子として用い前記標的物質が検出された前記試料溶液中の前記標的物質を捕捉する工程及び前記標的物質を捕捉した前記認識素子を回収する工程を含む生体物質検出・回収方法において使用される認識素子であって、前記緩衝液の比重よりも、前記リポソームに含まれる溶液の比重を重くしたことを特徴とする認識素子。
- 前記リポソームに含まれる溶液を、糖類を主成分とした溶液としたことを特徴とする請求項7に記載の認識素子。
- 試料溶液中の標的物質と相互作用する極性脂質を基本成分とする認識物質を固定化するための固相表面に備え、前記固相表面の物理的特性の変化に基づき前記標的物質を検出するための検出手段、前記標的物質が検出された前記試料溶液と前記認識物質のリポソーム構造である認識素子とを混合するための混合手段及び前記試料溶液から前記標的物質が捕捉された認識素子を回収するための遠心分離手段を備えたことを特徴とする生体物質検出・回収装置。
- 前記検出手段は、水晶振動子のセンサーであることを特徴とする請求項9に記載の生体物質検出・回収装置。
- 前記検出手段は、表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項9に記載の生体物質検出・回収装置。
- 前記検出手段の前記検出部と前記混合手段とは、前記試料溶液を搬送するための流路により接続されていることを特徴とする請求項8又は9に記載の生体物質検出・回収装置。
- 前記検出手段の前記検出部と前記混合手段との間に、前記試料溶液を排出するための他の流路を備えたことを特徴とする請求項8又は9に記載の生体物質検出・回収装置。
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