JP7216420B2 - がん治療効果の検査方法及び免疫応答誘導用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、がん治療の効果の予測若しくは予後予測のための検査と免疫応答誘導ペプチドの利用に関する。
本邦での肺癌の罹患者数は１１万人であり、２０１３年の主な部位別がん死亡数で第１位を占めている。組織型は小細胞肺癌（１０％）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（９０％）に大別され、非小細胞肺癌の中では肺腺癌が７０－８０％を占める。治療法としては、外科療法、放射線療法、化学療法があり、化学療法としては、チロシンキナーゼ阻害薬やプラチナ製剤を中心とした多剤併用療法が施行される。中央生存期間（ＯＳ）は小細胞肺癌で約１２ヶ月、非小細胞肺癌では約３０ヶ月である。
近年、進行期ＮＳＣＬＣの１次、２次治療で、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法（ニボルマブ、ペムブロリズマブ）が、標準治療に対し、有意に高い奏効率又は全生存期間の延長を認め、現在、日本、米国、欧州連合で抗ＰＤ－１抗体療法が実施されている。
免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対する有用なバイオマーカーは、腫瘍及び腫瘍内の免疫担当細胞に発現するＰＤ－Ｌ１分子であるが、ＰＤ－Ｌ１高発現群であっても奏効率は３０－４０％程度であり、さらに免疫チェックポイント分子阻害薬は非常に高額であることから、新たなバイオマーカーの同定が待ち望まれている。
さらに、免疫チェックポイント阻害薬以外の、より強い抗腫瘍効果を有する新規治療法の開発が望まれている。
これまでに我々は、肺癌の中で最も多い肺腺癌に発現するＸＡＧＥ１抗原を同定した。ＸＡＧＥ１抗原は進行期肺腺癌の４０－５０％に発現し、ＸＡＧＥ１抗原が発現している約半数の患者でＸＡＧＥ１に対する抗体（ＩｇＧ）反応が観察され、ＸＡＧＥ１に対する抗体（ＩｇＧ）陽性者は予後が延長することを明らかにしてきた（非特許文献１、２）。
ＸＡＧＥ１抗原はがん精巣抗原のひとつである。がん精巣抗原（ＣＴ抗原）は、多くのがんに発現するが、正常組織では精巣のみに発現する抗原の総称であり、数多くのＣＴ抗原が知られている（非特許文献３、４）。
既治療肺扁平上皮癌を対象としてニボルマブとドセタキセルを比較した第III相臨床試験のＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験での奏効率は、ニボルマブ群で３６％、ドセタキセル群で３１％であった。主要評価項目である中央生存期間（以下、ＯＳともいう）において、ニボルマブ群で9.2ヶ月、ドセタキセル群で6.0ヶ月と有意な延長を示した。また、既治療非扁平上皮非小細胞肺癌を対象としたニボルマブとドセタキセルを比較する同様のＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験での奏効率は、ニボルマブ群で１９％、ドセタキセル群で１２％であった。主要評価項目であるＯＳにおいて、ニボルマブ群で１２．２ヶ月、ドセタキセル群で９．４ヶ月と有意な延長を示し、前治療歴を有する切除不能又は転移性の非小細胞肺癌においてニボルマブの単剤治療はドセタキセルと比較して、ニボルマブの有効性が証明された。
病勢進行率において、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験で、ニボルマブ群はドセタキセル群と比較して有意ではないもののそれぞれ、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０１７試験では、ニボルマブ群３３％、ドセタキセル群３０％、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ－０５７試験では、ニボルマブ群４４％、ドセタキセル群２９％であった。
またバイオマーカー検索として、腫瘍発現ＰＤ－Ｌ１の多寡とＯＳ関係が検討され、ＰＤ－Ｌ１低発現又は陰性腫瘍は、ＯＳの改善は乏しかった。
もう一つの抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブは、既治療の非小細胞肺癌を対象に、ＫＥＹＮＯＴＥ－００１、ＫＥＹＮＯＴＥ－０１０試験においてその有用性が検討された。ＫＥＹＮＯＴＥ－００１試験での、全体の奏効率は１８－２０%であり、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍で１９－２３%、ＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍においても９－１３％で奏功を認めた。ＫＥＹＮＯＴＥ－０１０試験では、腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が１％以上を対象としてペムブロリズマブとドセタキセルを比較する第III相臨床試験で、奏効率は、ペムブロリズマブ群で１８．０％－１８．５％であり、ドセタキセル群は９．３％であった。ＯＳは、ペムブロリズマブ群で１０．４ヵ月－１２．７ヵ月であり、ドセタキセル群は８．５ヵ月であったことから、ドセタキセル群と比較してペムブロリズマブ群が有意にＯＳの延長を認めた。無増悪生存期間（ＰＦＳ）はドセタキセル群と比較し、有意な差を認めなかった。腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が５０％以上の患者では、奏効率は、ペムブロリズマブ群で２９．１％－３０．２％、一方、ドセタキセル群は７．９％であった。ＯＳはペムブロリズマブ群で１４．９ ヵ月－１７．３ヵ月であり、腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現が５０％以上の患者集団においては、ＰＦＳもドセタキセル群と比較し有意に改善した。その為、腫瘍ＰＤ－Ｌ１高発現腫瘍においては、ペムブロリズマブの高い抗腫瘍効果と予後を延長することが明らかとなった。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブもニボルマブやペムブロリズマブと同様に既治療非小細胞肺癌を対象とし、単剤投与の効果をみたＢＩＲＣＨ試験、さらにドセタキセルと比較する第II相臨床試験のＰＯＰＬＡＲ試験において、ＯＳはアテゾリズマブ群で１２．６ヶ月、ドセタキセル群９．７ヶ月と有意な延長効果を示した。さらにがん免疫微小環境で、腫瘍若しくは腫瘍浸潤免疫細胞でＰＤ－Ｌ１が発現している場合は、ＯＳが１５．１－１５．５ヶ月と、さらに予後を延長することが示された。また、がん免疫微小環境でＰＤ－Ｌ１が高発現しているアテゾリズマブ群の奏効率は３８％であり、ＰＤ－Ｌ１発現がないがん免疫微小環境のドセタキセル群では１５％程度にとどまった。既治療非小細胞肺癌を対象としドセタキセルと比較する第III相試験のＯＡＫ試験でも、ＰＯＰＬＡＲ試験と同様の結果が観測されている。
以上のように、現時点での免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対するバイオマーカーは、腫瘍若しくは腫瘍内の免疫担当細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現が有用であると考えられている。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１高発現（１％以上若しくは５０％以上）であっても、免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功率は３０－４０％であり、またＰＤ－Ｌ１低発現又は陰性症例でも１０％前後の奏功例が認められている。
さらに、それぞれの免疫チェックポイント分子阻害薬（ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ）で、独自のコンパニオン診断法（ＰＤ－Ｌ１発現解析）が施行され、臨床現場では混乱を来している。
特許第５７０９１０８号 国際公開ＷＯ２０１６／１８１９１２
Ohue Y, et al. Clin Cancer Res. 20(19), 5052-5063 (2014) Ohue Y, et al. Cancer Immunol Res. 4(12), 1049-1060 (2016) Hofmann O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23; 105(51), 20422-7 (2008) Wang C, et al. Nat Commun. 2016 Jan 27;7:10499
本発明は、がん治療の効果を的確に予測できる、又は的確な予後予測を可能にする検査方法を提供することを課題とする。また、がん免疫応答を誘導する新規ペプチド、新規組成物及びそのペプチドのスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がんの治療効果を予測または確認できることを見いだした。好適には、がん治療前にＩｇＧタイプのＸＡＧＥ１抗体（以下、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとも記載する）及びＩｇＡタイプのＸＡＧＥ１抗体（以下、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡとも記載する）、又はＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体（以下、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧとも記載する）ががん治療の治療効果の予測及び予後予測の指標になることを見出した。また、新規がんワクチン用ペプチドおよびその組成物を見いだした。さらに、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法を見いだした。即ち、本発明は下記の態様を包含する。
１．試料中のがん精巣抗原に対する抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
２．前記がん精巣抗原が、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのがん精巣抗原である、前項１に記載の方法。
３．ＩｇＧタイプの抗体とＩｇＡタイプの抗体を検出する、前項１または２に記載の検査方法。
４．前記試料ががん治療前の被験体から採取された試料であり、該がん治療の効果を予測するための検査である、前項１～３のいずれか１に記載方法。
５．試料中の抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がん治療効果の検査方法。
６．以下の１）～４）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、がん治療の効果があると判定される、前項１～５のいずれか一に記載の方法；
１）がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である、
４）複数のがん精巣抗原に対する抗体が陽性である。
７．がん精巣抗原、がん精巣抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、及び抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キット。
８．以下のａ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチド；
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ）前記ａ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ）前記ａ）又はｂ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物。
９．前項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫応答誘導用組成物。
１０．前記がんが、ＸＡＧＥ１陽性の肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、又は、膀胱癌である前項９に記載の組成物。
１１．免疫療法前又は化学療法前に投与される、前項９または１０に記載の組成物。
１２．前項８に記載のａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有するがんに対する免疫療法若しくは化学療法の効果増強剤。
１３．試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする、がんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法。
１４．前記試料が、がんワクチン用候補ペプチドによって刺激培養されたＢ細胞含有液から採取された試料である、前項１３に記載の方法。
１５．末梢血から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ１及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ２で刺激培養する工程を含む、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法。
１６．前項８に記載のａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドによる、免疫応答を誘導する方法。
１７．免疫療法または化学療法を開始する前に、前項８に記載のａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前項８に記載のｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを投与することによる、該免疫療法または該化学療法の効果を増大する方法。
１８．請求項１に記載の検査方法により、がん治療の効果があると判定されなかった場合に、抗体価を上昇させて、免疫療法を有効症例に導く方法。
本発明の検査方法は、がん治療前にがん治療の効果および予後を的確に予測することができる。また、がん治療後にがん治療の効果を確認することができる。より具体的には、化学療法の効果（抗がん剤の効果）、免疫療法の効果、免疫チェックポイント分子阻害薬の効果を的確に予測することができる。特に、ＰＤ－Ｌ１発現によらず、免疫チェックポイント分子阻害薬が奏功する患者か否かの判別を可能にする。ＰＤ－Ｌ１発現では効果を予測できなかった患者についても効果を予測可能にしたことは画期的なことである。
なお、免疫チェックポイント分子阻害薬は、非常に高価であり、またその治療の終了を示す有効なバイオマーカーが現在のところ存在しない。また、免疫チェックポイント分子阻害薬はこれまでの化学療法とは異なり、一部の患者では有効であるが、全身の自己免疫疾患の発症という重篤な有害事象も懸念されている。本発明の検査方法は、治療効果が低い患者についても予測可能であり、副作用とのバランスを考えて該治療を中止することもできる。これらのことより、本発明により、免疫チェックポイント分子阻害薬が著効する症例を選択できることは、治療費及び副作用対策などに係る費用等を含めた医療経済的にも画期的である。
本発明の新規ペプチド及びその新規ペプチドを含有する免疫応答誘導用組成物は、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することにより、がんに対する免疫応答を誘導しがん治療薬（がんワクチン）となり得る。本発明の新規ペプチド及び免疫応答誘導用組成物は、ＸＡＧＥ１特異的抗体、特に、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を誘導でき、さらに、抗原特異的Ｔ細胞を誘導できる。
本発明の新規ペプチド及び本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法、免疫療法及び免疫チェックポイント分子阻害薬による治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することによって、治療奏功及び予後良好群に導く画期的治療を可能にする。さらに既存の治療法、新規治療法との併用による強力ながん免疫療法を可能にするものである。さらに本発明の免疫応答誘導用組成物は安全性にも優れている。
本発明の新規ペプチドは、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、長鎖ペプチドであることから種々のエピトープを含み、従来のエピトープワクチンより強い免疫応答を誘導できる。さらに、前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドとｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを併用することにより、さらに強い免疫応答を誘導できる。
本発明のスクリーニング方法は、がんワクチン用として好適なペプチドの選択を可能にする。
本発明の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法により得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、養子免疫（Ｔ細胞）療法など、細胞治療に用いることができる。
図１は、１５７例の早期又は局所進行期の肺腺癌（ｃＳｔａｇｅ Ｉ－ＩＩＩＡ）と１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅ ＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清について、がん関連抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する抗原特異的ＩｇＧ及び抗原特異的ＩｇＡを検出した結果を示す。 図２は、１５７例の早期又は局所進行期の肺腺癌（ｃＳｔａｇｅ Ｉ－ＩＩＩＡ）と１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清の検査結果であり、がん関連抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する特異的ＩｇＧ陽性患者の頻度と特異的ＩｇＡ陽性患者の頻度を示す。 図３Ａは、５１種類のがん抗原に対する自己抗体反応について、ＸＡＧＥ１抗原陽性の５５例の肺腺癌患者から得られた血清を検査した結果を示す。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとＸＡＧＥ１－ＩｇＡが自己腫瘍に対する免疫応答のサロゲートマーカーになることを示している。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、種々のがん抗原に対する免疫応答が観察される。一方でＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体の出現（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していることを示す。ＸＡＧＥ１免疫陰性例（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答がほとんど観察されないことを示す。図３Ｂは、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者は、複数のがん抗原に免疫反応を有しがんに対する免疫応答が潜在的に高い状態（免疫活性化状態）であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が高い状態であるが、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が抑制されている状態であることを示す。 図４は、進行期肺腺癌患者１４５例の血清中の免疫抑制サイトカインを計測した結果を示す。 図５は、早期又は局所進行の肺腺癌患者のがん局所のＢ細胞、Ｔ細胞の状態を解析した結果を示す。図５Ａ及びＢは、がん局所（ＴＩＬ）の細胞の集積状態を示す。末梢血に比べがん局所にＩｇＡ陽性Ｂ細胞が増加している。図５Ｃは、ＩｇＡ陽性Ｂ細胞浸潤が多い症例は３０％程度であることを示す。図５Ｄは、ＩｇＡ陽性Ｂ細胞浸潤が多い症例では、腫瘍局所の制御性Ｔ細胞が増加していることを示す。図５Ｅは、末梢血に比べ腫瘍浸潤リンパ球では、免疫抑制性のサイトカインであるＩＬ-１０の産生が認められ、Ｔ細胞以外にＢ細胞もＩＬ－１０を産生していることを示す。図５Ｆは、図５Ｅで示されたＩＬ－１０産生性の腫瘍浸潤Ｂ細胞がＩｇＡ陽性であることを示す。 図６は肺腺癌患者のＩｇＡ＋Ｂ細胞に発現する免疫チェックポイント分子を解析した結果を示す。免疫チェックポイント分子であるＰＤ－Ｌ１とＧａｌｅｃｔｉｎ－９を高発現したＰＤ－Ｌ１＋ＧＡＬ－９＋ＩｇＡ＋のＢ細胞が、がん局所に有意に集積していることを示す。 図７はＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性群が有意に中央生存期間を延長すること、この傾向はＥＧＦＲ遺伝子変異陰性症例に顕著であることを示す。 図８はＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群が、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群や免疫応答なし群に比べ、初回化学療法の奏功率が有意に高いことを示す。 図９は免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法の効果の指標として、ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答が有用であることを示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性群）と免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）における標的病変の最大変化率を示す。 図１０は、ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性群）と免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）における、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法後の奏効率、無増悪生存期間（Progression-Free Survival）及び全生存期間（Overall Survival）を示す。 図１１は、図３Ａに示す結果をさらにＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群で各がん抗原に対する免疫反応を解析した結果を示す。 図１２は、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例で、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＸＡＧＥ１抗体および抗ｐ５３抗体をモニターした結果を示す。 図１３Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法を実施した患者の治療前の血清を用いて、ＸＡＧＥ１およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を含むがん抗原５０種に対する免疫応答を解析した結果を示す。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性の患者は多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態であることを示す。図１３Ｂは抗ＰＤ－１抗体療法前の抗ＢＡＧＥ抗体または、抗ＢＯＲＩＳ抗体の検出により抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得ることを示す。 図１４Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率（マイナスは腫瘍縮小を意味する）とＣＴ抗原に対する抗体（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＮＹＥＳＯ－１-ＩｇＧ）の抗体価との関係を示している。図１４Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率と治療後の多抗原に対する免疫反応の増強（抗原スプレディング）数との関係を示している。 図１５Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法の前後における多抗原に対する免疫応答の差を示す。図１５Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例では、ＭＡＧＥ－Ｂ３抗原 及びＳＳＸ４抗原に対する免疫応答のスプレディングが高頻度に認められ、非奏功例には認められなかったことを示す。 図１６は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体、術前併用医師主導治験症例の完全奏功例で、実際にＳＳＸ４抗原に対する免疫反応が観察されたことを示す。 図１７は、腫瘍縮小の経過とＳＳＸ４に対する免疫反応が相関したことを示す。 図１８は、ＣＴ抗原に対する抗体（抗ＸＡＧＥ１抗体及び抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体）陽性は、既知のバイオマーカーより抗ＰＤ－１抗体療法の効果を明確に判別することができることを示す。 図１９は、ＳＬＰ２に特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ４クローンともいう）である４Ｃ３４－１とＳＬＰ１に特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（以下ＣＤ８クローンともいう）である８Ｃ３４ＴＹが認識するペプチドを示す。 図２０は、ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞、ＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞、及びこれらＴ細胞の混合物をＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により刺激した結果を示す。ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用による刺激がより強い免疫応答を誘導すること示す。 図２１は、末梢血単核球をＣＤ４クローンＴ細胞とＣＤ８クローンＴ細胞と共に、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、又は各ペプチド併用で刺激した後、Ｂ細胞表面上のＩｇＧ及びＩｇＡを検出した結果を示す。Ｂ細胞表面上のＩｇＧは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を併用することで発現の上昇が認められた。一方でＩｇＡの発現量には変化はなかった。 図２２は、Ｂ細胞を、ＣＤ４クローンＴ細胞及びＣＤ８クローンＴ細胞と共に、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独、又は各ペプチド併用で刺激した後の培養上清中のＸＡＧＥ１特異的抗体の検出結果を示す。ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用した場合に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧが産生され、ＩｇＡの産生は認められなかった。 図２３は、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含むＸＡＧＥ１ワクチンの投与により、７例中４例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認め、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは誘導されなかったことを示す。 図２４は、ＸＡＧＥ１ワクチンの投与により腫瘍マーカーの上昇抑制または低下が、７例中４例で観察されたことを示す。 図２５は、ＸＡＧＥ１ワクチン低用量投与で、免疫応答が誘導できたことを示す。患者から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞は主にＳＬＰ１に反応し、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により免疫応答が増強することを示す。 図２６は、ＸＡＧＥ１ワクチン中用量投与で、免疫応答が誘導できたことを示す。患者から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞はＳＬＰ１とＳＬＰ２に反応し、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用により免疫応答が増強することを示す。
本発明の検査方法は、試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする。又、本発明のがんワクチン用ペプチドのスクリーニング方法も、試料中のがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することを特徴とする。
本発明の検査方法およびスクリーニング方法における、前記がん精巣抗原（以下、ＣＴ抗原ともいう）は、特に限定されるものではなく、がん細胞に発現し、正常組織では精巣のみに発現する抗原である。本発明はＣＴ抗原に対する抗体を検出すること特徴とし、好ましいＣＴ抗原としては、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４が挙げられる。さらに好ましいＣＴ抗原としては、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１が挙げられる。
本発明の検査方法およびスクリーニング方法は、好ましくは、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。好ましいＣＴ抗原に対する抗体として、ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体及び抗ＳＳＸ４抗体が挙げられ、これら抗体はＩｇＧタイプであることが好ましい。より好ましい抗体として、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体、ＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体が挙げられる。
さらに好ましくは、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体に加えてＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体を検出する。好適なＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体として、ＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体が挙げられる。好ましくは、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体とＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する。
本明細書において「がんワクチン」は、がんに対する免疫応答を誘導させることのできる医薬組成物を意味し、また、該免疫応答誘導には、体液性免疫誘導及び／又は細胞性免疫誘導が含まれる。
本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療前の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。また、本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療後の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する。
がん治療前の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がん治療前に該がん治療の効果及び予後を予測することができる。
がん治療後の被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出することにより、がん治療後に該がん治療の効果を確認し予後を予測することができる。さらに、その後の治療の効果及び予後を予測することができる。
本発明の検査方法は、種々のがん治療の効果の予測、確認、予後予測に適しているが、化学療法や免疫療法の効果の予測、確認、予後予測に適している。免疫療法の効果の予測により適しており、特に免疫チェックポイント分子阻害薬の治療の効果の予測に適している。
化学療法には、プラチナ製剤等の各種抗がん剤の投与による治療が含まれる。免疫療法には、免疫抑制阻害療法（免疫チェックポイント分子阻害薬による治療）、サイトカイン（ＩＬ－２等）療法、ＢＲＭ療法（免疫賦活剤等）、がんワクチン療法等が含まれる。免疫チェックポイント阻害剤による治療には、ＰＤ－１阻害剤（ニボルマブ等）の投与による治療、ＣＴＬＡ－４阻害剤（イピリムマブ等）による治療等が含まれる。
本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療前の被験体から採取された試料を検査対象とする。本明細書において「がん治療前」とは、効果を予測したいがん治療を始める前という意味である。すなわち、本発明の「がん治療前」には、がん治療を新たに始める前、がん治療用薬剤投与前、がん治療の継続中における薬剤投与前、がん治療用薬剤変更前、がん治療方針変更前、及びがん治療を中止するか否かの検討期間を含む。
本発明の検査方法の一実施形態は、がん治療後の被験体から採取された試料を検査対象とする。本明細書において「がん治療後」とは、特定のがん治療薬を選定し、がん治療を開始後、一定期間を経て、当該がん治療薬の効果を確認する段階という意味である。すなわち、本発明の「がん治療後」には、がん治療の継続中におけるさらなる薬剤投与前、がん治療用薬剤の変更前、がん治療方針の変更前、及びがん治療を中止するか否かの検討段階を含む。
本発明のスクリーニング方法における「試料」としては、がんワクチン用候補ペプチドによって刺激培養されたＢ細胞含有液から採取された試料が好ましい。例えば、ヒト血液から得られた単核球含有画分又はＢ細胞含有画分を、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と共に、がんワクチン用候補ペプチドで刺激培養した後の培養液の上清が使用できる。
本明細書において「治療効果」は、がんの病状進行抑制、がんの縮小、がんの消滅、再発抑制、転移抑制、生存期間の延長等を含む概念である。奏効率、生存率、生存期間等で表される。
本発明の検査方法における「がん治療」のがんは、特に制限はなく、いずれのがんであってもよい。好適ながんとしては、ＸＡＧＥ１陽性又はＮＹ－ＥＳＯ－１陽性のがんが挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法により得られるがんワクチン用ペプチドのがんは、特に制限はなく、いずれのがんであってもよい。好適ながんとしては、ＸＡＧＥ１陽性のがんが挙げられる。本発明の検査方法および本発明のスクリーニング方法におけるがんとして、例えば、肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、及び、膀胱癌等が挙げられる。好適には、肺癌が挙げられ、特に非小細胞肺癌が挙げられる。さらには、本発明の検査は、難治である進行期非小細胞肺癌治療や進行期の肺腺癌治療の効果の予測に適している。
ＸＡＧＥ１（Ｘ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｆａｍｉｌｙ， Ｍｅｍｂｅｒ １）は、ＸＡＧＥ１遺伝子によりコードされ、Ｃａｎｃｅｒ／Ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １２．１（ＣＴ１２．１）としても知られる公知のがん精巣抗原である。これまでにＸＡＧＥ１ａ－ｅの５種類の遺伝子が同定され、その関連タンパク質はＧＡＧＥＤ２であり、ＧＡＧＥＤ２ａとＧＡＧＥＤ２ｄの二種類のアイソフォームが存在することが知られている。また、これまでにＸＡＧＥ１ａ，ｂ，ｃ，ｄの４種類の選択的スプライスバリアントが同定されている（Sato et al., Cancer Immunity, vol. 7, page 5 (2007)）。ＸＡＧＥ１ａとＸＡＧＥ１ｂは８１アミノ酸からなるＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）タンパク質をコードし、ＸＡＧＥ１ｄは、６９アミノ酸からなるＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ｄ）タンパク質をコードしている。
種々の動物種についてＸＡＧＥ１のアミノ酸配列が公知である。例えば、ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）の配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０９１０７３．２及びＮＰ＿００１０９１０６３．２として、ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ｄ）の配列はＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿００１０９１０７４．１として提供されている。
ヒトＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）：（配列番号３）
mespkkknqq lkvgilhlgs rqkkiriqlr sqcatwkvic kscisqtpgi nldlgsgvkv kiipkeehck mpeageeqpq v
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における測定対象である抗ＸＡＧＥ１抗体は、ＸＡＧＥ１（ＧＡＧＥＤ２ａ）（以下、本明細書では単にＸＡＧＥ１と記載する）に対する抗体である。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の検出対象である抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する方法に特に制限はないが、例えば、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原としては、全長ＸＡＧＥ１であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。好ましくは、全長ＸＡＧＥ１を用いる。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一実施形態は、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体を検出する。好ましくは、ＩｇＧタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体（ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ）とＩｇＡタイプの抗ＸＡＧＥ１抗体（ＸＡＧＥ１―ＩｇＡ）を検出する。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法に特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一実施形態は、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ及び／又はＸＡＧＥ１―ＩｇＡを検出する工程を含む。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧは、自己腫瘍に対する免疫応答が増強していることを示すバイオマーカーであり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱して（抑制されて）いることを示すバイオマーカーである。このようなマーカーが、がん治療薬の治療効果の予測に適用可能であることははじめて見出いだされた。
ＮＹ－ＥＳＯ－１も公知のがん精巣抗原のひとつである。悪性黒色腫をはじめ各種腫瘍にさまざまな程度５－４０％に発現しているが、正常組織では精巣のみに発現が限られている。ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質は１８０のアミノ酸からなり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ０５９０８．１として提供されている。
ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１：(配列番号４)
mqaegrgtgg stgdadgpgg pgipdgpggn aggpgeagat ggrgprgaga arasgpggga
prgphggaas glngccrcga rgpesrllef ylampfatpm eaelarrsla qdapplpvpg
vllkeftvsg niltirltaa dhrqlqlsis sclqqlsllm witqcflpvf laqppsgqrr
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における検出対象である抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出する方法に制限はないが、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原は、全長ＮＹ－ＥＳＯ－１であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。好ましくは、全長ＮＹ－ＥＳＯ－１を用いる。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の一態様は、ＩｇＧタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出する。さらに、ＩｇＡタイプの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を検出してもよい。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法は特に限定されない。例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４も公知のがん精巣抗原である。各種腫瘍にさまざまな程度に発現しているが、正常組織では精巣のみに発現が限られている。ｐ５３は、がん抑制タンパク質として知られている。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法における検出対象である抗ＭＡＥＬ、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体及び抗ｐ５３抗体を検出する方法に制限はないが、抗原との結合を検出する方法が挙げられる。結合させる抗原は、全長であっても、その一部のアミノ酸配列からなる部分ペプチドであってもよい。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法では、ＩｇＧタイプの抗ＭＡＥＬ、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体及び抗ｐ５３抗体を検出する。さらにＩｇＡタイプの抗体を検出してもよい。ＩｇＧタイプの抗体の検出方法に特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることができる。また、ＩｇＡタイプの抗体の検出方法にも特に制限はないが、例えば、標識された抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。
各ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する方法は、抗体の量、濃度又は抗体価を測定できる方法であれば特に限定されず、当該分野において公知の手法を用いて測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、アフィニティーカラム法等によって測定することができる。
本発明の検査方法における「被験体」は、特に限定されるものではなく広く哺乳動物一般（ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）を含むが、ヒトであることが好ましい。被験体がヒトである場合、がん患者やがんを有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被験体となり得る。被験体の性別、年齢等は特に限定されない。
本発明の検査方法における「試料」としては、例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、胸・腹水、気管支肺胞洗浄液、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体等を挙げることができる。好ましい試料としては血清が挙げられる。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい実施形態では、以下の１）～４）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、がん治療の効果があると判定される。
１）がん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である、
３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である、
４）複数のがん精巣抗原に対する抗体が陽性である。
本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい実施形態では、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性である場合に、がん治療の効果があると判定される。好ましい具体例として、抗ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体、及び抗ｐ５３抗体が挙げられる。該ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体はＩｇＧタイプの抗体であることがさらに好ましい。好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが挙げられる。
また、好ましい実施形態では、ＩｇＧタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陰性である場合に、がん治療の効果があると判定される。好ましい具体例としては、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが陽性であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性である場合が挙げられ、特に好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧが陽性であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性である場合が挙げられる。
ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性であるとは、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体の量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上である場合であり、陰性であるとはＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体の量、濃度又は抗体価がカットオフ値以下である場合である。カットオフ値は、例えば、健常人の抗体価の１０～１０００倍の抗体価であってもよく、２０～５００倍の抗体価であってもよく、５０～２００倍の抗体価であってもよく、また、１００倍であってもよい。また、カットオフ値は、５０検体以上の健常成人の血清の平均＋３ＳＤのように設定してもよい。好ましくは、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上である場合に、がん治療の効果があると判定される。
本発明の検査方法の一実施形態は、試料中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む。好ましくは、該試料は、がん治療前の被検体から採取された試料である。該ＣＴ抗原に対する抗体の具体例としては、抗ＸＡＧＥ１抗体と又抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体が挙げられる。さらに好ましい具体例として、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧとＸＡＧＥ１―ＩｇＡの組み合わせ、ＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧ及びＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧとＸＡＧＥ１―ＩｇＡの組み合わせが挙げられる。
本発明の検査方法の一実施形態は、被験体から採取された試料中のＸＡＧＥ１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価を検出する工程と同一試料中のＸＡＧＥ１―ＩｇＡの量、濃度又は抗体価を検出する工程とを含む。ＸＡＧＥ１―ＩｇＡの存在は、免疫が抑制されていることを示していることより、ＸＡＧＥ１―ＩｇＧの量、濃度又は抗体価がカットオフ値以上であり、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡがカットオフ値以下である場合に、がん治療の効果があると判定することができる。
ＸＡＧＥ１－ＩｇＧは、自己腫瘍に対する免疫応答が増強していることを示すバイオマーカーである。一方、がん局所で、ＩｇＡ陽性の制御性Ｂ細胞が増加していることが判明し、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していることを示すバイオマーカーになる。なお、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧを有する患者の約半数でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応がみられる。
本発明のスクリーニング方法は、例えばヒト血液から分離したＢ細胞を、ワクチン用候補ペプチドによって刺激培養する工程及び培養上清中のＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む。
好ましくは、さらに、ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体が陽性の場合に、候補ペプチドにがん治療の効果があると判定する工程を含む。好適には、ＸＡＧＥ１―ＩｇＡが陰性でありＸＡＧＥ１―ＩｇＧ又はＮＹ－ＥＳＯ－１―ＩｇＧが陽性である場合に、候補ペプチドにがん治療の効果があると判定する工程を含む。
また、本発明の検査方法若しくはスクリーニング方法の好ましい他の実施形態では、複数のＣＴ抗原に対する抗体が陽性である場合に、がん治療の効果があると判定される。本実施形態では、被験体から採取された試料中のＣＴ抗原に対する抗体の量、濃度又は抗体価を検出する工程と、同一試料中の該ＣＴ抗原とは異なる他のＣＴ抗原に対する抗体の量、濃度又は抗体価を検出する工程とを含む。検査されるＣＴ抗原に対する抗体に特に制限はないが、好ましくは、抗ＸＡＧＥ１抗体、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＭＡＥＬ抗体、抗ＢＡＧＥ抗体、抗ＢＯＲＩＳ抗体、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体又は抗ＳＳＸ４抗体を含む。複数のＣＴ抗原に対する抗体が検出される患者は、多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態であり、免疫療法等のがん治療が奏功する。複数は２以上であればよく、好ましくは３以上である。上限に制限はないが、検査の煩雑さから具体的には、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下等が挙げられる。
抗ＣＴ抗原に対する抗体若しくは抗ｐ５３抗体を指標にすることで（ＣＴ抗原若しくはｐ５３に対する免疫応答を検出することで）、好ましくは、抗ＸＡＧＥ１抗体若しくは抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を指標にすることで（ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答を検出することで）、がん治療効果を的確に予測することができるようになった。抗ＸＡＧＥ１抗体若しくは抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体陽性は、既知のバイオマーカーより抗ＰＤ－１抗体療法の効果を明確に判別する。特に、免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例を明確に判別することができるようになった。ＰＤ－Ｌ１発現が陽性であっても、奏効率は３０％であり、陰性であっても奏功例が１０％であったため、これらバイオマーカーにより明確に奏功例を判別できることは画期的である。
本発明の検査方法により、がん治療効果がありと判定された場合には、免疫療法、又は化学療法を行い得る。本発明の検査方法によりがん治療効果があると判定されなかった場合に、抗体価を上昇させて、免疫療法、又は化学療法を有効症例に導くことができる。抗体価を上昇させる方法の一実施形態として、ワクチン投与が挙げられる。好ましいワクチンは、ＣＴ抗原を含むワクチンであり、より好ましくは、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのＣＴ抗原またはこれら抗原の一部からなるペプチドを含むワクチンである。
本願は、試薬キットに係る発明も含む。試薬キットに係る発明は、ＣＴ抗原、ＣＴ抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、及び抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キットである。
好ましい、実施形態は、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチド、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなるペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドが固相化された担体、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬、並びに抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含むがん治療効果検査用の試薬キットである。本キットは、がん治療の効果を検査するための試薬キットである。
ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドとは、配列番号３に表されるアミノ酸配列の一部からなる配列を有するペプチドである。好ましくは、１０以上のアミノ酸を含むペプチドであり、１つ以上のエピトープを含む。ＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなるペプチドとは、配列番号４に表されるアミノ酸配列の一部からなるアミノ酸配列を有するペプチドである。好ましくは、１０以上のアミノ酸を含むペプチドであり、１つ以上のエピトープを含む。
本発明の試薬キットの中に含まれるペプチドが固相化された担体には、ＣＴ抗原、ＣＴ抗原の一部からなるペプチド、ｐ５３、及びｐ５３の一部からなるペプチドからなる群から選択される少なくとも１が固相化されている。好ましくは、ＸＡＧＥ１、ＸＡＧＥ１の一部からなるペプチド、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＮＹ－ＥＳＯ－１の一部からなる群から選択される少なくとも１が固相化されている。担体は、特に限定されるのもではなく、例えばプレートやスティックが挙げられる。
本発明の試薬キットは、ペプチドが固相化された担体の他に、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬と抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含む。これら抗体は標識されていることが好ましい。また、本発明のキットには、標識と反応させるための試薬や、希釈液等、さらに試薬や検査用器具を含有してもよい。
本願のペプチドに係る発明は、以下のａ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドである。
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ）前記ａ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ）前記ａ）又はｂ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大５個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個又は２個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
本発明のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列に基づき設計され、通常の方法により合成することができる。該ペプチドのアミノ酸数は、好ましくは２０～３０の範囲である。また、本発明のペプチドは、上記がんワクチン用ペプチドのスクリーニングにより選択され得るペプチドである。
前記保存的置換では、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、１個のアミノ酸が類似構造又は特性を持つアミノ酸に置換される。更に、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズおよび化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸に交換される。自然発生的な相同タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換は他のアミノ酸置換より認容性が高いことが多く、これらは元のアミノ酸とその置換物との間で、大きさ、電荷、極性、疎水性が類似の相関関係を示すことが多く、これが、「保存的置換」の定義の基礎である。保存的置換は、本明細書では次の５グループの１つに交換されることと定義されてもよい：グループ１－分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ala, Ser,Thr, Pro, Gly）；グループ２－極性、負電荷残基及びそれらのアミド類（Asp, Asn, Glu, Gln）；グループ３－極性、正電荷残基（His, Arg, Lys）；グループ４－分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Met, Leu, Ile, Val, Cys）；そしてグループ５－分子量が大きい、芳香残基（Phe、Tyr、Trp）。
本発明のペプチドのＣ末端は、アミド又はエステルであってもよい。また、Ｎ末端のアミノ基や分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えば、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１－６アシル基など）で保護されていてもよい。また、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなども含まれる。また、アミノ酸の一部がＤアミノ酸であってもよい。
本発明のペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩等が挙げられる。本発明のペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。プロドラッグ化されていてもよい。プロドラッグは、生体内における生理条件下で本発明のペプチドに変換するように設計され得る。
本発明のペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチド若しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、必要であれば保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
前記ａ）で特定されるペプチドにおいて、伸長及び／又は欠失するアミノ酸の数は、最大５個であり、好ましくは４個であり、より好ましくは３個であり、より好ましくは２個であり、さらに好ましくは１個である。最も好ましくは０個である。
前記ｂ）で特定されるペプチドにおいて、保存的置換されるアミノ酸の数は、２個又は１個である。より好ましくは１個である。
前記ｄ）で特定されるペプチドにおいて、伸長及び／又は欠失するアミノ酸の数は、最大５個であり、好ましくは４個であり、より好ましくは３個であり、より好ましくは２個であり、さらに好ましくは１個である。最も好ましくは０個である。
前記ｅ）で特定されるペプチドにおいて、保存的置換されるアミノ酸の数は、２個又は１個である。より好ましくは１個である。
本発明の好ましいペプチドとして、以下のａ１）～ｆ１）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドが挙げられる。
ａ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大３個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｂ１）前記ａ１）のペプチドのアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｃ１）前記ａ１）又はｂ１）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
ｄ１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＸＡＧＥ１の一部からなるペプチドであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末側及び／又はＣ末側に最大３個のアミノ酸の伸長及び／又は欠失を許容するアミノ酸配列を有するペプチド
ｅ１）前記ｄ）のペプチドのアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が保存的置換されたアミノ酸配列を有するペプチド
ｆ１）前記ｄ）又はｅ）のペプチドの薬学的に認容可能な塩若しくは溶媒和物
本発明の最も好ましいペプチドとしてＳＬＰ１とＳＬＰ２が挙げられる。ＳＬＰ１及びＳＬＰ２は、２５個のアミノ酸残基を有する長鎖ペプチドである。ＳＬＰ１は配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＳＬＰ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
ＳＬＰ１：（配列番号１）NQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQ
ＳＬＰ２：（配列番号２）ISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEH
ＳＬＰ１はＸＡＧＥ１（配列番号３）の８番目から３２番目のアミノ酸配列を有し、ＳＬＰ２は、ＸＡＧＥ１の４４番目から６８番目のアミノ酸配列を有する。
本願のがんに対する免疫応答誘導用組成物に係る発明は、前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。より好ましくは、前記ａ１）～ｃ１）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ１）～ｆ１）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。さらに好ましくは、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含有する。これらペプチドの併用により、単独では達し得なかった効果を達成した。
本願のがんに対する免疫療法若しくは化学療法の効果増強剤に係る発明は、前記ａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。より好ましくは、前記ａ１）～ｃ１）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ１）～ｆ１）から選択される少なくとも１つのペプチドを含有する。さらに好ましくは、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含有する。これらペプチドの併用により、単独では達し得なかった効果を達成した。
本発明の免疫応答誘導用組成物及び本発明の効果増強剤は、がんワクチンということもできる。
本発明の免疫応答誘導用組成物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の免疫応答を誘導するために用いられる。
本発明の免疫応答誘導用組成物は、体液性免疫、細胞性免疫を活性化し、がんに対する免疫応答を増強させ、がんの治療に用いることができる。また、化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害剤によるがん治療の効果を増大させることができる。さらに、本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法及び免疫療法、免疫チェックポイント分子阻害薬による治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導することによって、治療奏功及び予後良好群に導くことができる。また、本発明の免疫応答組成物は安全性にも優れている。
本発明の組成物は、ＸＡＧＥ１を発現しているがんに対する免疫応答を誘導することができ、そのがんの治療に用いることができ、また、そのがんの治療効果を増強することができる。また、そのがんの治療の無効例、又は予後不良群に対し、ＸＡＧＥ１免疫を能動的に誘導し、治療奏功及び予後良好群に導くことができる。治療対象がんとして、例えば、肺癌、肝癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、乳癌、食道癌、腎癌、又は、膀胱癌を挙げることができる。特に、適しているがんとしては、肺癌が挙げられ、肺癌の中でも、非小細胞肺癌、肺腺癌、特に進行期の非小細胞肺癌、肺腺癌の免疫応答誘導に適している。
本発明の免疫応答誘導用組成物は、抗ＸＡＧＥ１抗体の産生を誘導することができる。特に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの産生を誘導することができる。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性の患者や治療対象は、予後良好、治療奏効であることより、本発明の免疫応答誘導用組成物は、化学療法、免疫療法及び免疫チェックポイント阻害剤による治療によっても予後不良、治療無効と予想される患者等を予後良好、治療奏効に導くことができる。
本発明者等は、ＸＡＧＥ１の一部の１６～１７アミノ酸を含むエピトープワクチンを以前作成したが、本発明のペプチドは、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、長鎖ペプチドであることから種々のエピトープを含み、さらに、前記ａ）～ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを併用することで従来のエピトープワクチンより強い免疫応答が誘導できる。
本発明の免疫応答誘導用組成物は免疫応答を高めるためにアジュバントを含んでいてもよい。その他に薬理学的に許容される担体、安定剤を含んでいてもよい。本発明の免疫応答誘導用組成物は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って製造され、例えば注射剤として、非経口的（静脈内注射、筋肉内注射等）に安全に投与することができる。
本発明の免疫応答誘導用組成物の製造に用いられてもよい薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
調製された注射剤は、液剤であっても、用事溶解する固形製剤であってもよい。投与にあたっては、前記の固形製剤の場合は、慣用の水性希釈剤中で溶解し、液剤として用いることができる。水性希釈剤としてはぶどう糖水溶液、生理食塩水、リンゲル液、栄養補給剤液などが含まれる。
本発明の免疫応答誘導用組成物において、本発明のペプチドの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１～１００重量％、好ましくは約１０～９９．９重量％、さらに好ましくは約２０～９０重量％程度である。前記ａ）～ｃ）から選択される少なくとも１つのペプチドと前記ｄ）～ｆ）から選択される少なくとも１つのペプチドの含有量の比は適宜調整される。例えば、１：９～９：１、３：７～７：３、５：５等が挙げられる。本発明の免疫応答誘導用組成物の投与量は、投与ルート、症状、患者の年令などによっても異なるが、例えば、静脈内投与など非経口的に投与する場合、１日当たり体重１ｋｇあたりペプチドとして約０．００５～５０ｍｇ，好ましくは約０．０５～１０ｍｇを投与できる。
本発明一態様である免疫応答誘導用組成物は、他の化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント分子阻害薬投与の前に投与することができる。これらの前に本発明の免疫応答誘導用組成物を投与することにより、該化学療法、該免疫療法、該免疫チェックポイント分子阻害薬の効果を増強することができる。例えば、これらの薬剤の投与の１日～半年前、好ましくは、１週間～３ヶ月前、さらに好ましくは２週間～２ヶ月前に投与することができる。好ましい一実施形態として、免疫チェックポイント分子阻害薬投与の２８日～３ヶ月前に投与することができる。
本発明は、また、患者の末梢血から得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ１及び配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＳＬＰ２で刺激培養する工程を含む、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞又は活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製方法である。
より詳細には、末梢血単核球細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞又はＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離し、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２存在下で３日～２１日間、好ましくは７日～１８日間刺激培養する。その後、抗原提示細胞と共にＳＬＰ１及び／又はＳＬＰ２で３～２４時間、好ましくは６～１８時間再刺激することにより得ることができる。刺激培養時のＳＬＰ１及びＳＬＰ２の濃度はそれぞれ、０．１～１０μＭ、好ましくは、０．１～１μＭの濃度が好ましい。
得られた活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞は細胞療法に用いることができる。例えば、末梢血を提供した患者本人に投与し、養子免疫療法に利用することができる。
以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
実施例で用いられている血液は、がん治療を行う前の患者からインフォームドコンセントのもとに提供を受けた。
［実施例１］
＜ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡの検出＞
ＸＡＧＥ１タンパク質（８１個のアミノ酸、配列番号３）は、ＧＬバイオケム社（上海、中国）で合成されたものを使用した。合成したＸＡＧＥ１タンパク質は、ＨＰＬＣカラムで精製を行い、純度が９０％以上であることを確認している。
１μｇ／ｍｌの濃度のＸＡＧＥ１（炭酸バッファー、ｐＨ９．６）を４℃オーバーナイトで９６穴プレート（ヌンク社製）に固相化した後に、洗浄液（ＰＢＳ／０．１％ＴＷＥＥＮ）で９６穴プレートを洗浄し、５％ＦＣＳ／ＰＢＳを加えて、３７℃で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、１００倍、４００倍、１６００倍、６４００倍に希釈した血清を加えて、３７℃で２時間反応させた。次いで、洗浄液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）（ジャクソン社製）若しくはペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（８０００倍希釈）（ジャクソン社製）を加えて、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で洗浄し、過酸化水素を加えた基質溶液（オルトフェニレンジアミンを０．０５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解した溶液）を加えて発色させた。発色後、６Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用いて吸光度（波長４９０ｎｍ）を測定した。これら吸光度をもとに、一般的な抗体価の求め方で抗体価を算出した（Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｓａｃｈａ Ｇｎｊａｔｉｃ，Ｌｌｏｙｄ Ｊ． Ｏｌｄ，Ｙａｏ－Ｔｓｅｎｇ Ｃｈｅｎ）。ＩｇＧ、ＩｇＡともに健常人コントロール血清の抗体価の１００倍以上をもって陽性とし、１００倍未満を陰性とした。
＜ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧの検出＞
ＮＹ－ＥＳＯ－１（１８０個のアミノ酸、配列番号４）は、通常の方法により大腸菌を用いて作成した。ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは上記ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの検出方法と同様の方法で検出した。
＜ＣＴ抗原若しくはｐ５３に対する抗体の検出＞
各ＣＴ抗原若しくはｐ５３は、ビーズに固定化された状態で岡山大学より入手した（Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2076-2084）。各ＣＴ抗原若しくはｐ５３は、上記ＸＡＧＥ１抗体の検出方法と同様の方法で検出した。
［試験例１］
＜ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及び ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応＞
１４５例の進行期（ｃＳｔａｇｅＩＩＩＢ－ＩＶ）の肺腺癌患者から採取した血清について、がん抗原、ＸＡＧＥ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＴＰ５３に対する特異的ＩｇＧ及びＩｇＡを検査した。
ＭＡＧＥ－Ａ３は、ＡＴｇｅｎ社（韓国）より入手し、ＳＳＸ－２は、ＡＴｇｅｎ社（韓国）より入手し、ＴＰ５３は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（アメリカ）より入手した。ＮＹ－ＥＳＯ－１（１８０個のアミノ酸、配列番号４）は、通常の方法により大腸菌を用いて作成した。それぞれの抗原に対する特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの検出は、上記ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡの検出方法と同様の方法で検出した。
ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性者は３３例（２２．７％）であり、その約半数の１５例（１０．３％）でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ免疫応答を確認した（図１）。これは、肺癌で、高免疫原性を有すると言われるＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＰ５３抗原に対する免疫応答よりもはるかに高頻度であった（各抗原に対するＩｇＧ反応：４．１％、１．４％、６．２％、８．３％、ＩｇＡ反応：０．７％、０．７％、０．７％、４．１％）（図２）。なお、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性患者はすべてＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性であった。
［試験例２］
＜サロゲートマーカーとしてのＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ反応＞
ＸＡＧＥ１抗原が陽性の５５例の肺腺癌患者から得られた血清について５１種類のがん抗原への自己抗体反応を検査した結果（図３Ａ）、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群には、種々のがん抗原に対する免疫応答が観察され、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ１－ＩｇＡが自己腫瘍に対する免疫応答のサロゲートマーカーになっていることが明らかになった。一方でＸＡＧＥ１－ＩｇＡ免疫応答の出現は、自己腫瘍に対する免疫応答が減弱していた（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群）。さらに、ＸＡＧＥ１免疫陰性例（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、自己腫瘍に対する免疫応答はほとんど観察されなかった。
図３Ｂで示すように、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者に比べ、複数のがん抗原に免疫反応を有し、がんに対する免疫応答が潜在的に高い状態（免疫活性化状態）である。一方、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が高い状態であるが、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者より免疫活性が抑制されている状態である。
免疫活性化状態と免疫抑制状態をもたらす原因として、腫瘍自体の性質がまず考えられる。肺腺癌患者１４５例の血清中の免疫抑制サイトカインを計測した結果を図４に示す。免疫抑制性のサイトカインであるＴＧＦ－βの値は、ＸＡＧＥ１免疫を有さない患者に比べ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者では有意に低値であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者では同等であった。さらに予後不良因子であり、免疫疲弊の時に上昇するサイトカインであるＩＬ－６の値は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に比べＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者で有意に高く、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に比べＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性者は免疫疲弊状態であると考えられる。
さらに、がん局所の解析（図５）において、ＩｇＡ＋Ｂ細胞が局所に高集積している患者では、がん局所において免疫を抑制する細胞である制御性Ｔ細胞の頻度が有意に高く（図５Ｄ）、そのような局所に集積するＩｇＡ＋Ｂ細胞自体が、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ－１０を産生している（図５Ｆ）ことが示された。よって、ＩｇＡ＋Ｂ細胞は、局所の免疫抑制および制御性Ｔ細胞の集積（局所のＩＬ－１０が集積に関与）に関与していると考えられる。また、 ＩｇＡ＋Ｂ細胞に発現する免疫チェックポイント分子（Ｔ細胞機能を抑制する分子）を解析した結果、免疫チェックポイント分子であるＰＤ－Ｌ１とＧａｌｅｃｔｉｎ－９を高発現したＰＤ－Ｌ１＋ＧＡＬ－９＋ＩｇＡ＋Ｂ細胞が、がん局所に有意に集積していることが認められた（図６）。
以上の結果より、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ＋ＩｇＡ＋患者では、腫瘍の遺伝子異常等により、免疫抑制性のサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－１０など）が産生され、がん局所に免疫を抑制するようなＩｇＡ＋Ｂ細胞（制御性Ｂ細胞）が集積してくると考えられる。 ＩｇＡ＋Ｂ細胞は、自身の産生するＩＬ－１０や、免疫チェックポイント分子による直接的なT細胞の機能抑制の他に、制御性T細胞を局所に集積させることによって間接的にも免疫を抑制していると考えられる。
［試験例３］
＜ＸＡＧＥ１免疫による化学療法の奏効率及び予後予測＞
進行期肺腺癌１４５例の検討で、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ、免疫応答なし、ＸＡＧＥ１発現なしを指標として生存曲線を解析した結果、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、中央生存期間３３．８ヶ月、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群は、中央生存期間１９．７ヶ月、免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、中央生存期間１１．９ヶ月、ＸＡＧＥ１発現無し群は、中央生存期間１３．６ヶ月であり、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性群が有意に中央生存期間を延長することが明らかになった。特に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は中央生存期間の延長が顕著であった（図７）。
これらの傾向はＥＧＦＲ遺伝子変異陰性症例に顕著であり、ＥＧＦＲ遺伝子変異陰性の進行期肺腺癌１０１例の検討で、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、中央生存期間３２．０ヶ月、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群は、中央生存期間１６．０ヶ月、免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群）は、中央生存期間１５．４ヶ月、ＸＡＧＥ１発現無し群は、中央生存期間１１．７ヶ月であった（図７）。
さらに、ＥＧＦＲ遺伝子変異陰性であり、ＸＡＧＥ１抗原が発現している病変の測定が可能な３６例の進行期肺腺癌患者では、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群や免疫応答なし群に比べ、初回化学療法の奏功率が有意に高いことが明らかとなった（図８）。
以上のことより、ＸＡＧＥ１に対する免疫応答（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ、免疫応答なし）を指標とすることで、化学療法の奏効率及び予後を明確に予測できることが明らかになった。
［試験例４］
＜免疫チェックポイント分子阻害薬の奏功例に対するバイオマーカーとしてのＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１免疫＞
高免疫原性のＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答（ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり、免疫応答なし）を指標として、免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法の効果について、５３例の進行期非小細胞肺癌患者で検討した。患者の血清は抗ＰＤ－１抗体療法を始める概ね２８日前に採血した。
ＸＡＧＥ１に対する免疫応答あり（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性）又はＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり（ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性）群：１６例
免疫応答なし群（ＸＡＧＥ１及びＮＹ－ＥＳＯ－１に対する抗体なし群）：３７例
図９に標的病変の最大変化率を示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群で、ほとんどの症例で著明な標的病変の腫瘍縮小効果を認めたが、免疫応答なし群では、著明な腫瘍縮小効果は認められなかった。奏効率を図１０に示す。ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群では、ＣＲ（完全奏功）：５例、ＰＲ（部分奏功）：６例、ＳＤ（安定）：３例、ＰＤ（病態進行）：２例であった。免疫応答なし群では、ＰＲ：２例、ＳＤ：９例、ＰＤ：２６例であった。また、ＸＡＧＥ１若しくはＮＹ－ＥＳＯ－１に対する免疫応答あり群と免疫応答なし群における無増悪生存期間（Progression-Free Survival）と全生存期間（Overall Survival）を図１０に示す。無増悪生存期間と全生存期間は、免疫応答あり群と免疫応答なし群で顕著な差があることが明らかになった。
［試験例５］
現在の指針では、免疫チェックポイント阻害薬は、ＥＧＦＲ遺伝子変異、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常といったドライバー遺伝子変異を有する肺癌では、免疫療法の効果が少ないということで免疫療法は慎重に適応を決めるよう（控えるよう）に通達が来ている。しかしながら、ＥＧＦＲ遺伝子変異1名、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常1名のＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性の患者２名に免疫療法（免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法）を施行した結果、ＥＧＦＲ遺伝子変異1名はＳＤ、ＥＭＬ－４／ＡＬＫ融合遺伝子異常1名は著効にて９０％以上腫瘍が縮小した。現在の指針では見逃してしまう免疫療法（免疫チェックポイント分子阻害薬である抗ＰＤ－１抗体療法）著効症例を、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧとＸＡＧＥ１－ＩｇＡを指標とすることで、見逃すことなく治療することができる。
以上のとおり、ＸＡＧＥ－ＩｇＧ及びＸＡＧＥ－ＩｇＡが存在するかどうかが、化学療法、免疫療法の予後に関与することが明らかであり、ＩｇＧとＩｇＡセットで検査することが好適である。
図１１は、図３Ａに示す結果をさらにＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陽性群、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陰性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性群で各がん抗原に対する免疫反応を解析した結果を示す。図１１が示すように、ＭＡＥＬ抗原およびｐ５３抗原に対する免疫反応は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性者に特異的に認められる。その為、抗ＭＡＥＬ抗体陽性者および抗ｐ５３抗体陽性者は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性であり、免疫活性化状態である。
また、抗ｐ５３抗体に対する免疫応答は、化学療法の効果及び免疫療法の効果を予測する。図１２は、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例で、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１抗体、抗ＸＡＧＥ１抗体および抗ｐ５３抗体をモニターした。その結果、奏功例でｐ５３抗原に対する免疫応答の増強が認められ、抗ｐ５３抗体の変動は、抗ＰＤ－１抗体療法の治療効果判定に有用である。
＜抗ＮＹ-ＥＳＯ－１抗体、抗ＢＡＧＥ抗体および抗ＢＯＲＩＳ抗体＞
抗ＰＤ－１抗体療法を実施した患者の治療前の血清を用いて、ＸＡＧＥ１およびＮＹ－ＥＳＯ－１抗体を含むがん抗原５０種に対する免疫応答を解析した。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧ陽性者は図１３Ａで示すように多抗原に対する免疫応答を有し免疫活性化状態である。また、図１３Ｂで示すように、抗ＰＤ－１抗体に奏功した８例中３例で、ＢＡＧＥ抗原または、ＢＯＲＩＳ抗原に対する免疫反応が有意に陽性であり（非奏功例１２例中０例）、抗ＢＡＧＥ抗体または、抗ＢＯＲＩＳ抗体の検出により抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得る。
＜抗原スプレディング＞
図１４Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率（マイナスは腫瘍縮小を意味する）とＣＴ抗原に対する抗体（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ及びＮＹ－ＥＳＯ－１-ＩｇＧ）の抗体価との関係を示している。図１４Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法による標的病変の変化率と治療後の多抗原に対する免疫反応の増強（抗原スプレディング）数との関係を示している。ＣＴ抗原に対する抗体価が高いほど抗ＰＤ－１療法の腫瘍の縮小率が高く、また様々なＣＴ抗原に対する免疫反応の数が多い（抗原スプレディングが多い）ほど、抗ＰＤ－１療法の腫瘍の縮小率が高いことが明かになった。よって、複数のＣＴ抗原に対する抗体を検出することにより、抗ＰＤ－１療法の効果を予測し得る。
＜抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、抗ＳＳＸ４抗体＞
図１５Ａは、抗ＰＤ－１抗体療法の前後における多抗原に対する免疫応答の差を示す。図１５Ｂは、抗ＰＤ－１抗体療法の奏功例では、ＭＡＧＥ－Ｂ３抗原 及びＳＳＸ４抗原に対する免疫応答のスプレディングが高頻度に認められ、非奏功例には認められなかったことを示す。よって、抗ＭＡＧＥ－Ｂ３抗体、実際に抗ＳＳＸ４抗体は、抗ＰＤ－１抗体療法の効果に重大な影響を及ぼす因子であり、治療効果予測に有用である。
図１６及び図１７は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体、術前併用医師主導治験症例の完全奏功例であり、同一患者の画像と免疫反応を示す。図１６は、ＳＳＸ４抗原に対する免疫反応が観察されたことを示す。図１７の画像は胸部ＣＴ画像であり、ベースラインの画像は、抗ＣＣＲ４抗体＋抗ＰＤ－１抗体投与前、３週および７週は、治験薬投与後かつ術前までのＣＴ画像である。抗ＣＣＲ４抗体は術前に４回、抗ＰＤ－１抗体は術前に３回投与し、手術は８週に行った。ＣＴ画像は、免疫療法により腫瘍が縮小していることを示す。本患者は、抗ＳＳＸ４抗体陽性であり、免疫療法が著効した例である。このように免疫療法の効果を予測する方法として抗ＳＳＸ４抗体の測定が有用である。
［実施例２］
＜ＸＡＧＥ１長鎖ペプチドの合成及び免疫応答誘導用組成物（ワクチン）の作製＞
ＸＡＧＥ１の部分ペプチドである２５アミノ酸残基を有する長鎖ペプチドＳＬＰ１及びＳＬＰ２を通常の方法でＧＭＰグレードで株式会社ペプチド研究所にて合成した。ＳＬＰ１は、ＸＡＧＥ１（８１アミノ酸からなるタンパク質）の８位－３２位からなるペプチドであり、ＳＬＰ２は、４４位－６８位からなるペプチドである。ＳＬＰ１及びＳＬＰ２の各々の純度は９９％以上であることを確認している。
ＳＬＰ１アミノ酸配列（配列番号１）：NQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQ
ＳＬＰ２アミノ酸配列（配列番号２）：ISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEH
上記で得られたＳＬＰ１及びＳＬＰ２を混合し、免疫応答誘導用組成物（ワクチン）を得た。
＜ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による細胞刺激＞
ａ．細胞の分離
ＸＡＧＥ１抗体陽性患者（ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性かつＸＡＧＥ１－ＩｇＡ陰性患者）の末梢血から比重遠心法によって単核球を得た。次いで、抗ＣＤ４抗体結合ビーズ及び抗ＣＤ８抗体結合ビーズ（ミリテニーバイオテク社製）を用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、ミリテニーバイオテク社製）によって、順次ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、及びＣＤ４陰性ＣＤ８陰性細胞を分離した。
ｂ．ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローンの樹立
ｂ１．ＣＤ４陽性Ｔ細胞１x１０６と４０Ｇｙの放射線照射済みのＣＤ４陰性ＣＤ８陰性細胞１ｘ１０６を、９６穴Ｕボトムカルチャープレートで、２％血清入りＡＩＭ培養メディウム２００μｌ（ＩＬ－２、ＩＬ－７を含む）で、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２各々１μＭ存在下で１４日間刺激培養した。
以下の実験における培養においても、特に記載の無い限り、２％血清入りＡＩＭ培養メディウム２００μｌ（ＩＬ－２、ＩＬ－７を含む）を用いた。
ｂ２．抗原提示細胞として利用するために、aで入手した患者ＣＤ４陽性Ｔ細胞の一部をＰＨＡで刺激しＴ－ＡＰＣ細胞を調製した。
ｂ３．上記ｂ１で１４日間刺激培養した後の９６穴プレートより、新たな９６穴プレートに３０μｌずつＳＬＰ１及びＳＬＰ２再刺激用と未刺激用に採取し、抗原提示細胞として調整したＴ－ＡＰＣ １ｘ１０４（３０μｌ）を各ｗｅｌｌに添加した。さらに、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２再刺激用ｗｅｌｌにＳＬＰ１及びＳＬＰ２が各１μＭになるように添加し１２時間再刺激した。
ｂ４．１２時間後９６ｗｅｌｌの培養上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した。
ｂ５．ＳＬＰ１及びＳＬＰ２で刺激した培養上清と未刺激の培養上清のＩＦＮγ活性を比較し、活性が強いｗｅｌｌの中に、抗原特異的なＴ細胞が存在するので、そのｗｅｌｌを限界希釈法にてクローニングした。
ｂ６．クローニングした細胞を再度、ｂ３～ｂ５の方法にてスクリーニングし、ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ４クローンともいう）を選別して、複数のＴ細胞クローンを得た。
ｂ７．得られたクローンＴ細胞は、ＰＨＡ刺激にて細胞を増殖させ、凍結保存した。得られたＣＤ４クローンの１つが４Ｃ３４－１である。
ｃ．ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンの樹立方法
ＳＬＰ１若しくはＳＬＰ２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（以下、ＣＤ８クローンともいう）を上記ｂと同様に調製した。得られたＣＤ８クローンの１つが８Ｃ３４ＴＹである。
ｄ．得られたクローンＴ細胞のＳＬＰ１及びＳＬＰ２への反応及びエピトープ解析
上記ｂで得られたＣＤ４クローン４Ｃ３４－１、及び上記ｃで得れたＣＤ８クローン８Ｃ３４ＴＹについて解析した。
ＸＡＧＥ１のアミノ酸配列の一部からなる２０のペプチドを合成した。各々のアミノ酸配列は配列番号５～２４に示す。また、各ペプチドのＸＡＧＥ１のアミノ酸配列上の位置については、配列表と図１９に示すとおりである。ペプチド合成は通常の合成法によりＰＨジャパン（日本）において合成した。純度は各々９５％以上である。
ＣＤ４クローン若しくはＣＤ８クローンのＴ細胞２ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、各々のペプチドが１μＭになるように１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した。
結果を図１９に示す。ＣＤ４クローンである４Ｃ３４－１はＳＬＰ２（４４－６８）の中でも、５２－６８位のアミノ酸を認識していた。また、ＣＤ８クローンである８Ｃ３４ＴＹはＳＬＰ１（８－３２）と１９－３３位のアミノ酸を認識し、この中にエピトープが存在すると考えられる。
ＳＬＰ１及びＳＬＰ２で、抗ＸＡＧＥ１抗体陽性患者の末梢血単核球を刺激培養することで、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を認識する複数のＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の検出に成功した。このことは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２ワクチンが、Ｔ細胞が認識するエピトープワクチンと違い、種々のエピトープを含む多抗原性のがんワクチンであることを示す。
＜ＳＬＰ１及びＳＬＰ２の併用療法の有用性＞
ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞１ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した（図２０）。ＣＤ４クローンのＴ細胞はＳＬＰ２を認識した。
同様にＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞１ｘ１０４を、同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出した（図２０）。ＣＤ８クローンのＴ細胞はＳＬＰ１を認識していた。
そこで、ＣＤ４クローン（４Ｃ３４－１）Ｔ細胞１ｘ１０４とＣＤ８クローン（８Ｃ３４ＴＹ）Ｔ細胞１ｘ１０４を同数のＴ－ＡＰＣと共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各のペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養し、上清のＩＦＮγをＥＬＩＳＡ法にて検出したところ、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用することで、反応が上昇した。
ヒトの末梢血には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のみ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のみ存在するということはないので、ＳＬＰ１単独、ＳＬＰ２単独ではなく、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用がより強い免疫応答を誘導することが可能である。
＜ＩｇＧ免疫の誘導能＞
上記ａで得られた末梢血単核球１ｘ１０５を、ＣＤ４クローン４Ｃ３４－１Ｔ細胞２ｘ１０４、ＣＤ８クローンＣ３４ＴＹＴ細胞２ｘ１０４及びProtein Transport Inhibitor Cocktail（eBioscienc社、アメリカ）存在下（５００倍希釈）で、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各ペプチド併用（各１μＭ）で１２時間刺激培養した。
フローサイトメトリー法にてＢ細胞にゲートし、それぞれのペプチド刺激下でのＢ細胞表面上のＩｇＧ若しくはＩｇＡを検出した（図２１）。Ｂ細胞表面上のＩｇＧは、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を併用することで発現の上昇を認めた。一方でＩｇＡの発現量には変化はなかった。
次に、上記ａと同一の患者血清から分離したＢ細胞１ｘ１０５を、ＣＤ４クローン４Ｃ３４－１Ｔ細胞２ｘ１０４とＣＤ８クローン８Ｃ３４ＴＹＴ細胞２ｘ１０４と共に、ＳＬＰ１単独（１μＭ）、ＳＬＰ２単独（１μＭ）、又は各ペプチド併用（各１μＭ）で７２時間刺激培養した。
その培養上清中に存在するＸＡＧＥ１特異的抗体を検出したところ、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用した場合に、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの検出を認め、ＩｇＡは認められなかった(図２２)。
以上のとおり、抗ＸＡＧＥ１抗体陽性患者の末梢血単核球を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＳＬＰ１とＳＬＰ２を併用して刺激することで、Ｂ細胞より抗原特異的なＩｇＧを検出した。よって、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を含有する組成物は、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの産生を誘導でき、がんに対する免疫応答を誘導できるがんワクチンである。ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ陽性は、治療奏功群かつ予後良好群である為、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２を含有する組成物は、患者を治療奏功かつ予後良好に導くことができる。
＜安全性＞
ＳＬＰ１およびＳＬＰ２の混合物をアジュバントとともにSprague-Dawley系ラット（Crl:CD(SD)、投与開始時６週齢、１群雌雄各１０匹）の背部皮下に１０週間反復投与（１４日おきに５回間歇投与）し、毒性試験を行った。
被験物質の投与量は、０．２ｍｇ／ｋｇ（ＳＬＰ１：０．２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＬＰ２：０．２ｍｇ／ｋｇ）及び２ｍｇ／ｋｇ（ＳＬＰ１：２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＬＰ２：２ｍｇ／ｋｇ）の２用量とした。注射用水及びピシバニールに溶解させたＳＬＰ１及びＳＬＰ２を等量のオイルアジュバントMONTANIDE ISA 51 VG（ISA51）と混和し、エマルジョンとし、１ｍＬ／ｋｇの投与容量で背部皮下に投与した。更に、注射用水及びピシバニールとISA51のエマルジョンを投与する媒体対照群と生理食塩液を投与する生理食塩液対照群を設けた。
投与期間中、一般状態観察、体重測定及び摂餌量測定を行い、投与１０週に尿検査及び眼科学検査を行った。投与期間終了時には、血液学検査、血液化学検査、剖検、器官重量測定及び病理組織学検査を行った。
被験物質投与に起因する死亡はみられず、いずれの検査においても被験物質投与による変化はみられなかった。
なお、投与部位（背部皮下）において、媒体対照群及び被験物質投与群の雌雄ほぼ全例に投与物質の残留によると考えられる白色巣が剖検でみられ、病理組織学的には投与物質の貯留とともに、リンパ球/プラズマ細胞及び組織球の浸潤並びに線維化がみられた。また、媒体対照群の雌少数例では好中球浸潤もみられた。しかし、被験物質投与群における変化はいずれも媒体投与群と同程度であり、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による変化の増強は認められなかった。
アジュバントに起因する投与部位皮下の炎症反応がみられたが、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２による増強は認められず、被験物質投与に起因する毒性学的意義のある変化はみられなかった。したがって、本試験におけるＳＬＰ１及びＳＬＰ２の無毒性量は雌雄ともに２ｍｇ／ｋｇを上回ると考えられた。
＜ヒト用ワクチンの作製＞
ＳＬＰ１およびＳＬＰ２をアジュバントＯＫ４３２ピシバニールと共にモンタナイド（ＩＳＡ５１、ＳＥＰＰＩＣ製）でエマルジョン化して、免疫応答誘導用組成物を得た（以下、ＸＡＧＥ１ワクチンともいう）。より具体的には、ＧＭＰグレードで作成した二種の長鎖ペプチドからなる混合ペプチドを３段階の用量で用意した。
低用量：５００μg（ＳＬＰ１：２５０μｇ＋ＳＬＰ２：２５０μｇ）
中用量：１ｍｇ（ＳＬＰ１：５００μｇ＋ＳＬＰ２：５００μｇ）
高用量：２ｍｇ（ＳＬＰ１：１ｍｇ＋ＳＬＰ２：１ｍｇ）
これら混合ペプチドをＯＫ４３２（中外製薬）０．２ＫＥと共に１．２５ｍｌの生食に混和し、モンタナイド１．２５ｍｌによりエマルジョン化した。
＜安全性（第一相臨床試験）＞
上記ＸＡＧＥ１ワクチンを進行期肺腺がん患者に対して投与した。本試験は、主目的として安全性を確認し、副次目的として試験薬の投与に伴うＸＡＧＥ１抗体価の変動を検討する第I相臨床試験である。本臨床試験は、「ヘルシンキ宣言」、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」およびＸＡＧＥ１ワクチン臨床試験実施計画書に則り実施したが、ICH E6(R1)-GCP（Guideline for Good Clinical Practice）に可能な限り準拠した。
試験は、進行期または術後再発の肺腺がんを対象に、上記３段階の用量のＸＡＧＥ１ワクチン用いて行った。ＸＡＧＥ１ワクチンは、毎回、四肢の異なる部位２ヵ所に投与した。投与は、２週間隔で計４回行った。各用量は３例ずつ投与を行った。
安全性に関しては、有害事象の種類・頻度・程度を観察した。有害事象のgradingは、Common Terminology Criteria for Adverse Events（CTCAE） v4.0日本語訳JCOG版を用いる。有害事象はCTCAE v4.0に従い、判定を行った。尚有害事象の観察期間は、試験薬初回投与日から最終投与6週後（個々の試験の終了）までとした。
低用量群の３例、中用量群の３例および高用量群の１例の計７例で安全性に関する評価が終了した。表１で示すように、ＸＡＧＥ１ワクチンによる有害事象は、すべて軽微であり重篤な有害事象は観察されなかった。
Figure 0007216420000001
＜ＸＡＧＥ１ワクチンの有効性について＞
１．ＸＡＧＥ１－ＩｇＧの誘導
ＸＡＧＥ１ワクチンの投与により、７例中４例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認め、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡおよびＮＹ－ＥＳＯ－１－ＩｇＧは誘導されなかった（図２３）。
ａ．ＸＡＧＥ１ワクチン低用量群３例中２例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認めた。
ｂ．ＸＡＧＥ１ワクチン中用量群３例中２例でＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇を認めた。
ｃ．ＸＡＧＥ１－ＩｇＡは治療前より７例中１例で陽性（ＫＭＸ－０１）であったが、その他は陰性であった。ＸＡＧＥ１ワクチンによって、ＸＡＧＥ１－ＩｇＡ抗体価の上昇は認められなかった。
以上より、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２によるＸＡＧＥ１－ＩｇＧ免疫の特異的な誘導が、ｉｎ ｖｉｖｏでも観察された。
２．腫瘍マーカー
図２４で示すように、腫瘍マーカーの上昇抑制または低下が、７例中４例で観察された。
ａ．ＸＡＧＥ１ワクチン低用量群３例中２例で腫瘍マーカーの上昇抑制を認めた。
ｂ．ＸＡＧＥ１ワクチン中用量群３例中２例で腫瘍マーカーの低下を認めた。
ｃ．ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価が上昇した４例中３例で、腫瘍マーカーの上昇抑制もしくは低下が認められた。一方、ＸＡＧＥ１－ＩｇＧ抗体価の上昇が認められなかった３例中２例で腫瘍マーカーの上昇が観察された。
以上より、ＸＡＧＥ1ワクチンによって腫瘍マーカーの上昇抑制もしくは低下が観察された。
２．抗原特異的Ｔ細胞の誘導
低用量投与の患者及び中用量投与の患者の末梢血よりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離し、ＸＡＧＥ１ワクチン投与による抗原特異的Ｔ細胞の誘導について調べた。低用量投与の患者及び中用量投与の患者とも、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用刺激により、ＩＦＮ－γが産生され、ＳＬＰ１抗原及びＳＬＰ２抗原に反応性のＴ細胞が誘導されていることが証明された（図２５、図２６）。
中用量投与の患者においては、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２の単独刺激によりＩＦＮγの産生が認められた。これらはＳＬＰ１およびＳＬＰ２が、複数のエピトープを含んでいることの証明であり、ＸＡＧＥ１ワクチンがＳＬＰ１単独ワクチン及びＳＬＰ２単独ワクチンより有用であることを示す。また、ＳＬＰ１とＳＬＰ２の併用刺激より、より強いＩＦＮγの産生が確認できた（図２６）。
以上より、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を含むＸＡＧＥ１ワクチンは、がん患者において、抗原特異的なＴ細胞を誘導できるワクチンであり、かつ、 複数のエピトープを含む多抗原性ワクチンでもあり、ＳＬＰ１およびＳＬＰ２を混合することにより、より強い免疫応答を誘導できるワクチンであることがｉｎ ｖｉｖｏで証明された。
実験プロトコールは以下のとおりである。
ａ）ワクチン投与開始後１２週目の末梢血から比重遠心法によって単核球分画を得た。次いで、抗ＣＤ４抗体結合ビーズ、抗ＣＤ８抗体結合ビーズおよび抗ＣＤ１９抗体結合ビーズ（ミリテニーバイオテク社製）を用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、ミリテニーバイオテク社製）によって、順次ＣＤ８陽性分画、ＣＤ４陽性分画、ＣＤ１９陽性分画およびＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ１９－分画を分離した.
ｂ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞１ｘ１０６個と、抗原提示細胞として、同数のＸ線照射（６０Ｇｙ）ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞とを、ＳＬＰ１及びＳＬＰ２ 各々１μＭ存在下で、９６ウェルプレートを用いてＣＯ２インキュベーター内で１２日間共培養した。Ｔ細胞を培養するための培地としては、特に記載がない場合は、５％プール血清／ＡＩＭ－Ｖ（ＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍｌ、ＩＬ－７ １０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。
ｃ）ＩＦＮ－γ産生細胞の検出
刺激培養で増殖した抗原特異的なＴ細胞が含まれる細胞集団に、以下のように二次刺激を行い、抗原特異的なサイトカインの産生を検出した。
刺激培養した後の細胞に、これと同数の自己のＥＢＶ－Ｂ細胞（エプスタイン・バール・ウイルス感染Ｂ細胞：抗原提示細胞として利用）及び、ペプチド（ＳＬＰ１、ＳＬＰ２若しくはＳＬＰ１＋ＳＬＰ２）を加え、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で二次刺激を行った。コントロールは、ペプチドを加えずに、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で二次刺激を行った。
その後、ヒトＩＦＮ－γキャッチ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌを用いて培養細胞を標識するために、培養細胞を１０ｍｌのＡＩＭ－Ｖ培地に懸濁し、ローテーター（マックスミックス、ミリテニーバイオテク社製）を用いて懸濁しながら３７℃で４５分間、ＣＯ２インキュベーター内で反応させた。細胞を洗浄した後に、ＰＥ標識ヒトＩＦＮ－γ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌ、７ＡＡＤ（ＢＤ社製）２μｌ、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体またはＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体（ミリテニーバイオテク社製）１μｌを加えて染色した。
染色後、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＣＳ／ＰＢＳ，０．０２％アジ化ナトリウム）を加えて細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製）を用いてフローサイトメトリーを行い、ＩＦＮ－γ産生細胞を検出した。ＩＦＮ－γ産生細胞の頻度は、データ解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ，Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社製）を用いて解析した。結果を図２５及び図２６に示す。
本発明の検出方法は、がん治療の効果を予測することができ、がん治療の可能性を広げるものである。また、医療経済にも貢献する。また、本発明の免疫応答誘導用組成物は、直接にがんの治療に用いることができるほか、化学療法、免疫療法、免疫チェックポイント阻害薬による治療の効果を増強させ、治療無効を治療有効に導くことができる。

Claims (7)

  1. 試料中のがん精巣抗原に対する抗体を検出することを特徴とする、ＰＤ－１阻害剤の治療効果及び／又は治療予後の予測のための検査方法であり、
    前記がん精巣抗原が、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つである、
    方法。
  2. ＩｇＧタイプの抗体を検出する、又はＩｇＧタイプの抗体とＩｇＡタイプの抗体を検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料がＰＤ－１阻害剤の治療前の被験体から採取された試料である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 以下の１）～３）からなる群から選択される少なくとも１の場合に、ＰＤ－１阻害剤の治療の効果があると判定される、請求項１～３のいずれか１に記載の方法；
    １）がん精巣抗原に対する抗体が陽性である、
    ２）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体が陽性である、
    ３）ＩｇＧタイプのがん精巣抗原に対する抗体が陽性であり、ＩｇＡタイプのがん精巣抗原に対する抗体が陰性である。
  5. 前記治療効果及び／又は治療予後の予測が全生存期間（OS）に対する治療効果及び／又は治療予後の予測である、請求項１～４のいずれか１に記載の方法。
  6. 少なくともがん精巣抗原及び／又はがん精巣抗原の一部からなるペプチドが固相化された担体と、抗ヒトＩｇＧ抗体を含有する試薬を含み、前記がん精巣抗原が、ＸＡＧＥ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＥＬ、ＢＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＭＡＧＥ－Ｂ３及びＳＳＸ４からなる群から選択される少なくとも１つのがん精巣抗原である、ＰＤ－１阻害剤の治療効果の予測及び／又は予後予測検査用の試薬キット。
  7. さらに抗ヒトＩｇＡ抗体を含有する試薬を含む、請求項６に記載の試薬キット。
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