WO2012029819A1 - 新規加水分解酵素タンパク質 - Google Patents

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WO2012029819A1
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protein
hydrolase protein
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潤 川端
良磨 三宅
久仁子 朝田
良平 加藤
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株式会社エーピーアイ コーポレーション
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    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a novel hydrolase protein that can be used for the production of (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, and the use thereof.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for hydrolyzing dimethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid with an enzyme to obtain (1S, 2S) -1-methoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the optical selectivity of the enzyme is insufficient, and the obtained (1S, 2S) -1-methoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid has an optical purity of 90% ee, which is an intermediate of a pharmaceutical product. It was unsuitable as an industrial production method.
  • Bacillus subtilis is ATCC23857
  • the amino acid sequence of paranitrobenzyl esterase derived from the Bacillus ⁇ ⁇ subtilis ATCC23857 strain (hereinafter sometimes referred to as “PNBE23857”). Is registered in GenBank Accession No. ZP_03593235.
  • the present invention is useful as an intermediate for the production of a therapeutic agent for hepatitis C by hydrolyzing a dialkyl ⁇ 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid with an enzyme.
  • paranitrobenzyl hydrolase protein derived from Bacillus subtilis has good selectivity and diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1- It was found that (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid can be efficiently obtained by hydrolyzing dicarboxylic acid.
  • a hydrolase comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 and having an activity of catalyzing the reaction shown in formula (1) with higher selectivity than the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. protein.
  • amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 amino acid numbers 70, 106, 107, 108, 219, 270, 271, 272, 273, 273, 274, 275
  • the amino acid sequence of Nos. 276 and 313 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted with amino acids having a lower side chain than the wild-type amino acid, and the reaction shown in Formula (1) is performed.
  • amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5 the amino acid numbers 188, 190, 193, 215, 216, 217, 314, 358, 362, and 363
  • One or more of the amino acids consists of an amino acid sequence substituted with an amino acid having a bulky side chain compared to the wild-type amino acid, and the reaction shown in Formula (1) is converted from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a hydrolase protein having an activity of catalyzing with higher selectivity than the protein.
  • amino acid numbers 70, 106, 107, 108, 219, 270, 271, 272, 273, 273, 274, 275 One or more of amino acids No. 276, No. 313 is substituted with an amino acid whose side chain is less bulky than wild-type amino acids, and amino acid Nos. 188, 190, 193,
  • amino acids Nos. 215, 216, 217, 314, 358, 362, and 363 are substituted with amino acids having a higher bulk side chain than wild-type amino acids.
  • a hydrolase protein comprising an amino acid sequence and having an activity of catalyzing the reaction represented by the formula (1) with higher selectivity than a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the leucine of amino acid number 270 is substituted with any amino acid of serine, glutamine, glutamic acid, or alanine, according to [5] or [6] Hydrolase protein.
  • the leucine at amino acid number 70 is aspartic acid
  • the leucine at 270 number is any one of glutamine, glutamic acid, or alanine
  • the 273th leucine is at arginine
  • a hydrolase protein comprising an amino acid sequence in which the 313th leucine is substituted with methionine, and having an activity of catalyzing the reaction represented by formula (1) with higher selectivity than the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a hydrolase protein according to any one of [1] to [12] is allowed to act on a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid to produce (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl.
  • the hydrolase protein of the present invention when hydrolyzing dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid to produce 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, (1S, 2S) 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid has high selectivity that it can be produced preferentially. That is, according to the hydrolase protein of the present invention, (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid, which is useful as an intermediate for producing a therapeutic agent for hepatitis C, is industrially put into practical use. And can be manufactured more efficiently than conventional methods.
  • the method for producing (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid using the hydrolase protein of the present invention can be used for the production of a therapeutic agent for hepatitis C and its intermediate. it can.
  • the compound produced by the production method of the present invention can be used as a raw material or an intermediate in the production of a therapeutic agent for hepatitis C.
  • hydrolase protein of the present invention comprises the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, or an amino acid sequence obtained by mutating the amino acid sequence, and a reaction represented by the formula (1) Is characterized in that it has an activity of catalyzing with higher selectivity than a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of paranitrobenzyl esterase (PNBE23857, GenBank Accession No. ZP_03593235) derived from Bacillus subtilis ATCC23857 strain.
  • Et represents an ethyl group.
  • selectivity means optical selectivity and means a property of producing an optically active compound by preferentially producing a certain isomer. Specifically, it means the property of preferentially producing (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid by hydrolyzing dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid. To do. Dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid is required for hydrolase protein to hydrolyze (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid The following points are mentioned as selectivity.
  • dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid has two types of stereoisomers, (2R) and (2S), but there are special conditions that cause steric inversion at the 2-position. Unless otherwise, only the (2S) isomer can be the starting material for the desired (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the hydrolase protein is pro-R among the two alkoxycarbonyl groups bonded to the 1-position prochiral carbon.
  • Pro-R is a notation that distinguishes two Xs on CX 2 YZ, and the outline is as follows. Priorities are determined for each substituent on C according to the CIP rule. Then, assume that one of the two Xs has a higher priority than the other. The priority relationship with Y and Z is not changed. Based on provisional priorities, the central notation chirality is determined to be R or S using RS notation.
  • the priority X at that time is designated as pro-R
  • pro-S the priority X at that time
  • This selectivity can be compared using the ratio of (1S, 2S) and (1R, 2S) isomers of 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced by hydrolysis as an index, and (1S, 2S )
  • the yield of (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid is improved as the ratio of the amount of (1R, 2S) produced is lower than the amount produced. Is advantageous.
  • the hydrolase protein is a pro-R alkoxycarbonyl group out of two alkoxycarbonyl groups bonded to the 1-position prochiral carbon of dialkyl (2R) -2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid.
  • any selectivity can be compared by the enantiomeric excess (% ee) of the (1S, 2S) form of the 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid produced by hydrolysis to the (1R, 2R) form.
  • the hydrolase protein is pro-R among the two alkoxycarbonyl groups bonded to the 1-position prochiral carbon of dialkyl (2R) -2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid.
  • Hydroxyloxycarbonyl group can be hydrolyzed to produce (1S, 2R) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid corresponding to the desired (1S, 2S) diastereomer.
  • This selectivity can be compared by the ratio of the generated amount of (1S, 2S) isomer and (1S, 2R) isomer of 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid to be generated.
  • Those having a lower production amount of (1S, 2R) body relative to the production amount of 2S) body are less likely to adversely affect the subsequent production process and the physiological activity of the manufactured pharmaceutical, and are advantageous in industrialization.
  • the selectivity in the present invention is an index of “1R2S / 1S2S ratio”, “1S2S optical purity (% ee)”, or “1S2R / 1S2S ratio” in 1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid. It is what. That is, “the activity of catalyzing the reaction shown in Formula (1) with higher selectivity than the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” of the present invention is the product 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclohexane.
  • the “1R2S / 1S2S ratio”, “1S2S optical purity (% ee)”, or “1S2R / 1S2S ratio” in propanecarboxylic acid can be determined as an index.
  • Preferred embodiments of the hydrolase protein of the present invention include the following.
  • Reaction consisting of an amino acid sequence in which one or more of the amino acids of Nos. 276 and 313 is substituted with an amino acid having a lower side chain bulk than the wild-type amino acid, and represented by the above formula (1)
  • a hydrolase protein having an activity of catalyzing with higher selectivity than a protein comprising (C) In the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, amino acid numbers 70, 106, 107, 108, 219, 270, 271, 272, 273, 274, 275 One or more of amino acids No. 276, No. 313 is substituted with an amino acid whose side chain is less bulky than wild-type amino acids, and amino acid Nos. 188, 190, 193, One or more of amino acids Nos. 215, 216, 217, 314, 358, 362, and 363 are substituted with amino acids having a higher bulk side chain than wild-type amino acids.
  • a hydrolase protein comprising an amino acid sequence and having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1) with higher selectivity than a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • D The hydrolase protein of (a) or (c) above, wherein at least one amino acid of amino acids Nos. 70, 270, 273, and 313 is substituted.
  • a hydrolase protein comprising an amino acid sequence and having an activity of catalyzing the reaction represented by the above formula (1) with higher selectivity than a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the hydrolase protein (d) is particularly preferable.
  • “Bulk” in “an amino acid having a lower side chain bulk than a wild-type amino acid” or “an amino acid having a higher side chain bulk than a wild-type amino acid” specifically refers to “J. Theoret. Biol. , 1968, 21, 170, the value shown as Bulkiness in Table 3 can be used as an index. Specifically, the Bulkiness value of each amino acid is as follows.
  • substitution with an amino acid whose side chain is lower in bulk than the wild-type amino acid means that the amino acid has been substituted with an amino acid having a smaller Bulkiness value than the wild-type amino acid.
  • substitution with an amino acid having a bulky side chain compared to the wild-type amino acid means that the amino acid has been substituted with an amino acid having a greater Bulkiness value than the wild-type amino acid.
  • the hydrolase protein of the present invention includes one or more of leucine or isoleucine having amino acid numbers 70, 270, 273, or 313 in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5. However, those substituted with an amino acid having a smaller Bulkiness value than these are preferred.
  • hydrolase proteins include the following.
  • E The hydrolase protein of (d) above, wherein in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, at least leucine of amino acid number 70 is aspartic acid, asparagine, serine, threonine, or glycine A hydrolase protein in which any amino acid is substituted.
  • F The hydrolase protein of (d) or (e) above, wherein in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, the leucine at amino acid number 270 is one of serine, glutamine, glutamic acid, or alanine A hydrolase protein that is substituted with an amino acid.
  • (G) The hydrolase protein of (d) or (e) above, wherein in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2, or 5, isoleucine of amino acid number 270 is serine, glutamine, glutamic acid, Alternatively, a hydrolase protein substituted with any amino acid of alanine.
  • (H) The hydrolase protein of any one of (d) to (g) above, wherein in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 5, leucine of amino acid number 273 is arginine or histidine A hydrolase protein substituted with any amino acid.
  • leucine at amino acid number 70 is aspartic acid
  • leucine at 270 is any amino acid of glutamine, glutamic acid, or alanine
  • leucine at 273 is arginine.
  • the hydrolase protein of the present invention further includes an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence of the hydrolase protein of the present invention described above, or the amino acid sequence of the hydrolase protein of the present invention described above. It consists of an amino acid sequence having 1 to several amino acid substitutions, deletions and / or additions, and catalyzes the reaction shown in formula (1) with higher selectivity than the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Those having the activity of
  • amino acid sequence having 90% or more homology with the above-mentioned amino acid sequence of the hydrolase protein of the present invention means the amino acid of the hydrolase protein of the present invention. It means that the homology or identity with the sequence is 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more.
  • substitution, deletion and / or addition of one to several amino acids means, for example, about 1 to 40, preferably about 1 to 20 More preferably, it means about 1 to 10, more preferably about 1 to 5.
  • the origin of the hydrolase protein of the present invention is not particularly limited, and may be a natural enzyme derived from a microorganism or a genetically modified protein.
  • the natural enzyme can be preferably obtained from Bacillus subtilis. That is, the hydrolase protein of the present invention includes, for example, Bacillus subtilis NBRC3026, Bacillus ⁇ subtilis 3 NBRC3108, Bacillus ⁇ subtilis NBRC3027, and Bacillus ⁇ subtilis 13 NBRC3027, and Bacillus ⁇ subtilis NBRC3027.
  • Specific purification methods include, for example, salting out with ammonium sulfate (ammonium sulfate) or sodium sulfate, centrifugation, dialysis, ultrafiltration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography. Processing operations such as chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, zymography, and combinations thereof.
  • ammonium sulfate ammonium sulfate
  • sodium sulfate sodium sulfate
  • centrifugation dialysis
  • ultrafiltration ultrafiltration
  • adsorption chromatography ion exchange chromatography
  • hydrophobic chromatography hydrophobic chromatography
  • reverse phase chromatography reverse phase chromatography.
  • Processing operations such as chromatography, gel filtration, gel permeation chromatography, affinity chromatography, electrophoresis, zymography, and combinations thereof.
  • the hydrolase protein of the present invention can be obtained as a recombinant protein by cloning the gene of the hydrolase protein of the present invention according to a known method, introducing the gene into a suitable host and expressing it.
  • a probe or primer specific to the gene of the hydrolase protein of the present invention is designed based on the information on the base sequence of the gene encoding the hydrolase protein of the present invention, and the probe or primer is used to DNA libraries (e.g., genomic libraries or cDNA such as Bacillus subtilis NBRC3026, Bacillus subtilis NBRC3108, Bacillus subtilis NBRC3027, and Bacillus subtilis NBRC3013)
  • the DNA encoding the hydrolase protein of the present invention is isolated or amplified from the rally, etc., put into a vector by gene recombination technology, introduced into a host cell, and expressed therein, thereby allowing the hydrolysis of the present invention. Enzyme protein can be obtained.
  • DNA of the present invention DNA encoding the hydrolase protein of the present invention described above is provided.
  • Specific examples of the DNA of the present invention include DNA comprising the following base sequences.
  • substitution of one to several bases in the base sequence described in SEQ ID NOs: 7 to 10 lack of A base sequence having a loss and / or an addition, which encodes a hydrolase protein having an activity of catalyzing the reaction shown in Formula (1) with higher selectivity than the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Base sequence:
  • DNA encoding the hydrolase protein of the present invention includes Bacillus subtilis NBRC3026, Bacillus ⁇ subtilis NBRC3108, Bacillus ⁇ subtilis NBRC3027, and Bacillus ⁇ subtilis 13 NBRC3027 and Bacillus ⁇ subtilis (Bacillus RC RC30 It is a cloned DNA or a mutation introduced into the DNA.
  • Bacillus RC RC30 It is a cloned DNA or a mutation introduced into the DNA.
  • the base sequence is determined according to the present invention, it is possible to synthesize based on this base sequence.
  • DNA hybridization of a microorganism such as Bacillus subtilis is performed by hybridization using an oligonucleotide prepared based on this base sequence as a probe, or by PCR using an oligonucleotide prepared based on the sequence as a primer. It can also be isolated from a library (eg, genomic DNA library or cDNA library).
  • the DNA of the hydrolase protein of the present invention is not limited to those isolated from natural microorganisms, but also known DNA synthesis methods such as the methods described in US Pat. No. 6,472,184 and US Pat. No. 5,750,380. It may be synthesized using.
  • DNA capable of hybridizing under stringent conditions refers to DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 7 to 10 or a complementary sequence thereof and 80% or more, preferably 90% by BLAST analysis. % Or more, more preferably 95% or more of DNA containing a base sequence having homology.
  • hybridization under stringent conditions is a reaction in a normal hybridization buffer at a temperature of 40 to 70 ° C., preferably 60 to 65 ° C., and a salt concentration of 15 mM to 300 mM, preferably The washing can be performed in a washing solution of 15 mM to 60 mM or the like.
  • “1 to several” in the “base sequence having substitution, deletion and / or addition of 1 to several bases” means, for example, about 1 to 30, preferably 1 Means about 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5.
  • substitution, deletion, and / or addition of amino acids that do not substantially harm the enzyme activity can be easily selected by those skilled in the art.
  • DNA encoding the hydrolase protein of the present invention having amino acid substitutions, deletions, and / or additions that do not substantially affect enzyme activity should be obtained from, for example, natural mutants or variants. Can do.
  • DNA having a base sequence having 1 to several base substitutions, deletions and / or additions can be prepared by using a mutagen or site-specific mutation. It can be obtained by a usual mutation operation such as a method. These can be easily performed with a commercially available kit such as PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio) or Quick Change Site Directed Muta Genesis Kit (Stratagene).
  • the present invention further provides a recombinant vector having the DNA of the present invention.
  • the DNA of the present invention is usually added to the vector together with a promoter suitable for the host microorganism so that the 5 ′ end of the coding region of the DNA of the present invention is linked downstream of this promoter. insert.
  • the DNA of the present invention may be inserted into an expression vector containing a promoter.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can replicate and proliferate in the host microorganism, and examples thereof include plasmid vectors, shuttle vectors, and phage vectors.
  • Specific plasmid vectors include pBR322, pUC18, pHSG298, pUC118, pSTV28, pTWV228, pHY300PLK (the above plasmid vectors can be purchased from, for example, Takara Bio Inc.), pET expression vector series (manufactured by Novagen), and the like. Can do. Examples of E.
  • coli-coryneform bacterium shuttle vectors include plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmids pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE and pCRY3KX described in JP-A-2-276575; Plasmids pCRY2 and pCRY3 described in Kaihei 1-191686; pAM330 described in JP-A-58-67679; pHM1519 described in JP-A-58-77895; described in JP-A-58-192900 PAJ655, pAJ611 and pAJ1844; pCG1 described in JP-A-57-134500; pCG2 described in JP-A-58-35197; pCG4 and pCG1 described in JP-A-57-183799 Etc., or it may be derivatives thereof.
  • the phage vector include ( ⁇ FixI
  • a promoter for expressing the DNA encoding the hydrolase protein of the present invention a promoter possessed by the host microorganism can be generally used, but is not limited thereto, and the promoter of the hydrolase protein DNA of the present invention is not limited thereto. Any promoter may be used as long as it is a prokaryotic base sequence for initiating transcription. Specifically, a lactose operon promoter, a tryptophan operon promoter, a lambda phage-derived PL promoter, a tryptophan lactose hybrid (tac) promoter [H. A. Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
  • inducible promoters can be used for the purpose of improving the expression efficiency.
  • gene expression can be induced by adding lactose or isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG).
  • a transformant obtained by introducing the DNA or recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • the host into which the DNA or recombinant vector of the present invention is introduced is not particularly limited, but dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid is converted to (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2- Those having activity of hydrolyzing other than vinylcyclopropanecarboxylic acid are not suitably used. Further, those having an activity of changing the produced (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid into another compound are also not preferable.
  • the host that can be used in the present invention is brought into contact with a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid or the desired product (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid. As a result, it can be selected by analyzing the resulting compound.
  • Specific examples of host microorganisms that can be used in the present invention include Escherichia bacteria (for example, Escherichia coli), Actinomycetes bacteria, Bacillus bacteria, Serratia.
  • (Serratia) bacteria Pseudomonas bacteria, Corynebacterium bacteria, Brevibacterium bacteria, Rhodococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Streptomyces ( Streptomyces bacteria, Thermus bacteria, Streptococcus bacteria and the like can also be used as hosts for introducing the DNA or recombinant vector of the present invention.
  • a competent cell method [Journalourof Molecular Biology, logyVol.53, p.159 (1970)], pulse wave energization method [J. Indust.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)], etc., transduction methods using phages [E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p.189 (1970)], conjugation transfer method [J. G. C. Ottow , Ann. Rev. Microbiol., Vol. 29, p. 80 (1975)], cell fusion method [MH Gabor, J. Bacteriol., Vol. 137, p. 1346 (1979)] and the like can be used. From these methods, a method suitable for the host microorganism may be appropriately selected.
  • homologous recombination technology or transposon or insertion sequence for directly introducing the DNA encoding the hydrolase protein of the present invention linked to a promoter into the chromosome of the host microorganism It can also be expressed by a technique introduced using the above. Therefore, the transformant of the present invention is not limited as long as the enzyme of the present invention is expressed, and the method of gene introduction is not limited.
  • the transformant obtained as described above is cultured, and the hydrolase protein of the present invention is obtained from the culture. Can be collected.
  • the transformant can be cultured in a normal nutrient medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salt, various vitamins, etc.
  • a carbon source include sugars such as glucose, sucrose, fructose and maltose, ethanol Alcohols such as methanol, citric acid, malic acid, succinic acid, maleic acid, organic acids such as fumaric acid, molasses, etc. are used.
  • the nitrogen source for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea or the like is used alone or in combination.
  • inorganic salts that can be used include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate.
  • nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, and biotin can be added to the medium.
  • Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as aeration stirring and shaking.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the host microorganism can grow, and the pH during the culture is not particularly limited as long as the host microorganism can grow.
  • the pH adjustment during the culture can be performed by adding an acid or an alkali.
  • the enzyme can be collected from the culture by a known collection method using the enzyme activity as an index.
  • the enzyme does not necessarily need to be purified to homogeneity, and may be purified to a degree of purification according to the application.
  • the crudely purified fraction or purified enzyme used in the present invention not only the cells isolated from the culture solution in which the transformant was cultured, but also the culture solution and the cells are crushed by means of ultrasonic waves, crushing or the like.
  • the resulting crushed product, the extract containing the hydrolase protein of the present invention obtained by extracting the crushed product with water, and the like, and further subjected to treatment such as ammonium sulfate salting out and column chromatography.
  • the obtained crude enzyme preparation or purified enzyme preparation of the hydrolase protein of the present invention may be used.
  • carrier can also be used.
  • Immobilization of these cells, disrupted cells, extract or purified enzyme is carried out by immobilizing the cells on an appropriate carrier such as acrylamide monomer, alginic acid, or carrageenan in accordance with a known and commonly used method. It can be performed by the method of making it. For example, when the cells are immobilized on a carrier, they are recovered from the culture or washed with an appropriate buffer, for example, a phosphate buffer (pH 6 to 10) of about 0.02 M to 0.2 M. Can be used.
  • an appropriate buffer for example, a phosphate buffer (pH 6 to 10) of about 0.02 M to 0.2 M.
  • Examples of the optionally substituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms represented by R include a substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and more preferable. Includes a substituted or unsubstituted linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a normal hexyl group, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group and the like are preferable, and an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms is particularly preferable.
  • the optionally substituted aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms represented by R is preferably a substituted or unsubstituted aralkyl group having 7 to 12 carbon atoms.
  • benzyl group 4-methylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 2-phenylethyl group, 1-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group, etc.
  • benzyl group 4-methylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 2-phenylethyl group, 1-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group, etc.
  • benzyl group 4-methylbenzyl group, 4-methoxybenzyl group, 4-chlorobenzyl group, 4-bromobenzyl group, 2-phenylethyl group, 1-phenylethyl group, 3-phenyl
  • R examples of the optionally substituted aryl group having 6 to 12 carbon atoms represented by R include a phenyl group, 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, o-methylphenyl group, m-methylphenyl group, p -Methylphenyl group, o-methoxyphenyl group, m-methoxyphenyl group, p-methoxyphenyl group, 2,3-dimethylphenyl group, 2,4-dimethylphenyl group, 2,5-dimethylphenyl group, 2,6 -Dimethylphenyl group, 3,4-dimethylphenyl group, 3,5-dimethylphenyl group, 2,3,5-trimethylphenyl group, 2,3,6-trimethylphenyl group, 2,4,6-trimethylphenyl group And o-nitrophenyl group, m-nitrophenyl group, p-nitrophenyl group and the like are preferable.
  • R is preferably
  • the hydrolase protein of the present invention When the hydrolase protein of the present invention is allowed to act on dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid, the hydrolase protein of the present invention, which has been purified or roughly purified, is produced.
  • (1S) by allowing a microorganism (eg, a transformant having a DNA encoding the hydrolase protein of the present invention) or a treated product thereof to act on a dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid.
  • 2S -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid.
  • the reaction method is not particularly limited, and a dialkyl ⁇ 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid serving as a substrate is added to a liquid containing the hydrolase protein of the present invention, and an appropriate temperature (for example, 10 ° C. to 40 ° C.). Or about pressure (eg about atmospheric pressure). Thereby, (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid can be produced.
  • the method for fractionating the desired (1S, 2S) -1-alkoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid from the reaction mixture is not particularly limited, and any method for separation or purification known to those skilled in the art may be used. it can. For example, it can be carried out by solvent extraction, crystallization, resin adsorption, column chromatography, etc., but is not limited thereto.
  • the hydrolase protein of the present invention is a method for producing (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid by hydrolyzing diethyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid In particular, it can be suitably used.
  • the dialkyl 2-vinylcyclopropane-1,1-dicarboxylic acid of the present invention can be produced by the reaction of the following formula (3). That is, it can be produced by reacting the raw material compound of the formula (3) with malonic acid esters in the presence of an alkali metal alkoxide or an alkali metal hydride.
  • R 3 represents an optionally substituted arylsulfonyl group having 6 to 12 carbon atoms, an alkylsulfonyl group having 1 to 10 carbon atoms, and an aralkylsulfonyl group having 7 to 20 carbon atoms.
  • Examples include benzenesulfonyl group, p-toluenesulfonyl group, 1-naphthalenesulfonyl group, 2-naphthalenesulfonyl group, methanesulfonyl group, ethanesulfonyl group, propanesulfonyl group, trifluoromethanesulfonyl group, and benzylsulfonyl group.
  • R 3 is preferably a methanesulfonyl group, a benzenesulfonyl group or a p-toluenesulfonyl group, particularly preferably a p-toluenesulfonyl group.
  • R is the same as defined above.
  • the starting compound of the formula (3) can be produced according to a known method, for example, a method described in Frederic Dolle et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1115-1125 and the like. Moreover, it can manufacture by reaction of the following formula
  • 1,4-butenediol is reacted with a compound represented by R 3 X and then crystallized, or a commercially available raw material compound is hydrolyzed with an acid or a base to produce 1,4-butenediol. It can be produced by obtaining butenediol and further reacting with a compound represented by R 3 X, followed by crystallization.
  • X 1 represents a hydrogen atom or R 1
  • X 2 represents a hydrogen atom or R 2
  • R 1 and R 2 each independently have 2 to 11 carbon atoms that may be substituted
  • X 1 is R 1 and X 2 is R 2 , more preferably R 1 and R 2 are an acetyl group, an ethylcarbonyl group, a tert-butylcarbonyl group, and a benzoyl group, and more preferably an acetyl group It is.
  • (1S, 2S) -1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid obtained in the present invention is useful for the production of various HCV NS3 protease inhibitors and the like that are under development as therapeutic agents for hepatitis C.
  • An intermediate (1R, 2S) / (1S, 2R) -1-amino-1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropane and a salt thereof can be produced.
  • Example 1 Cloning of paranitrobenzyl esterase gene (pnbA; SEQ ID NOs: 6 to 10) (1) Cloning of gene Bacillus subtilis ATCC23857, Bacillus subtilis NBRC3026, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) ) DNeasy Blood & Tissue Kit from cells obtained by culturing NBRC3108, Bacillus subtilis NBRC3027, and Bacillus subtilis NBRC3013 overnight in a liquid medium designated by each strain preservation institution. Chromosomal DNA was prepared using (Qiagen).
  • pnbA23857 SEQ ID NO: 6
  • PNBE23857 GenBank Accession No. ZP_03593235, SEQ ID NO: 1
  • Primers pnbA F and pnbA R for amplifying the full length of the esterase gene were designed and synthesized.
  • the respective base sequences are shown in SEQ ID NOs: 11 (pnbAF) and 12 (pnbA R) in the sequence listing.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR was performed using KOD-plus-Ver.2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the conditions of the attached instruction manual. Regarding the temperature condition, after holding at 94 ° C. for 2 minutes, (94 ° C., 15 seconds; 58 ° C., 30 seconds; 68 ° C., 4 minutes) was repeated 30 cycles, and the temperature was held at 68 ° C. for 5 minutes to finish.
  • pnbA3026 For the plasmids ppnbA3026, ppnbA3108, ppnbA3027, and ppnbA3013, the inserted DNA sequence was analyzed, and it was confirmed that each gene contained a 1467 bp ORF. These genes were named pnbA3026, pnbA3108, pnbA3027, and pnbA3013, respectively. Each sequence was as shown by SEQ ID NO: 7 (pnbA3026), 8 (pnbA3108), 9 (pnbA3027) and 10 (pnbA3013). The amino acid sequences encoded by the respective DNA sequences were named PNBE3026, PNBE3108, PNBE3027, and PNBE3013.
  • Each sequence was as shown in SEQ ID NO: 2 (PNBE3026), 3 (PNBE3108), 4 (PNBE3027) and 5 (PNBE3013).
  • Each amino acid sequence showed a sequence identity of 97%, 91%, 90%, and 98% with respect to the known amino acid sequence of PNBE23857 (SEQ ID NO: 1), respectively.
  • Example 2 Comparison of Selectivity of Novel Paranitrobenzyl Esterase Using the five plasmids obtained in Example 1, Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed according to a conventional method. Each of the obtained recombinant Escherichia coli was cultured by shaking at 30 ° C. in a liquid LB medium containing 20 mg / l kanamycin and 0.2 mM IPTG, and collected at 20 hours of culture.
  • VCPDE 100 mM phosphoric acid containing 5 g / l racemic 1,1-diethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropane
  • VCPDE 5 g / l racemic 1,1-diethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropane
  • VCPME 1-ethoxycarbonyl-2-vinylcyclopropanecarboxylic acid
  • the three enzymes PNBE3026, PNBE3108, and PNBE3027 showed higher values in the “1S2S optical purity” than the enzyme PNBE23857 with a known sequence.
  • PNBE3013 showed a lower value in the “1S2R / 1S2S ratio” than the enzyme PNBE23857 with a known sequence.
  • Synthesis Example VCPDE used in Example 1 was synthesized as follows. A 2 L 4-neck flask was charged with 93.4 g (583 mmol) of malonic acid diethyl ester and 1000 mL of toluene, and 223 mL (569 mmol) of a 20% sodium ethoxide ethanol solution was added as a base. After stirring at room temperature for 1.5 hours, 59.4 g of trans-1,4-dibromo-2-butene (278 mmol, Aldrich reagent) was added. After stirring at room temperature for 2 hours, 109 mL (278 mmol) of a 20% sodium ethoxide ethanol solution was further added.
  • Example 3 Three-dimensional structure modeling of the hydrolase protein of the present invention (SEQ ID NO: 4)
  • the amino acid sequence of PNBE3027 was subjected to a BLAST search against Protein Data Bank (PDB), and the following three types of crystal structures were referenced. Selected as.
  • the notation A56V indicates that the 56th amino acid residue alanine (A) is substituted with valine (V).
  • the S-form and R-form of the substrate VCPDE are generated in the direction of (1S, 2S) -VCPME and the direction of (1R, 2R) -VCPME. It was created by coordinating to the initial structure and minimizing energy. When performing energy minimization, the following distance constraint conditions were set in consideration of the hydrolysis reaction mechanism of esterase.
  • Example 4 Estimation of amino acid residues involved in substrate recognition in paranitrobenzyl esterase First, in each of the “1S2S model” and “1R2R model” obtained in Example 3, the carbon at the 2-position of the vinyl group of VCPDE All amino acid residues that were partially or wholly within 8 cm from the atom were extracted. Use Discovery Studio Visualizer v2.5.5.9350 to calculate the distance. Among the extracted amino acid residues, other than the hydrogen atom closest to the carbon atom at the 2-position of the vinyl group of VCPDE of each model The distance from each atom was defined as the distance from each amino acid residue.
  • Example 5 Modification of paranitrobenzyl esterase gene by mutagenesis Using the plasmid ppnbA3027 obtained in Example 1 as a template, a primer (L70FW) shown in SEQ ID NO: 13 and a primer (L70RV) shown in SEQ ID NO: 14 were used. Then, a random mutation was introduced into the base encoding leucine with amino acid number 70 by QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). About 200 colonies obtained were each cultured with shaking at 30 ° C. in a liquid LB medium containing 20 mg / l kanamycin and 0.2 mM IPTG, and collected at 20 hours of culture.
  • reaction was performed in 100 mM potassium phosphate buffer containing 5 g / l or 30 g / l racemic VCPDE and 5% dimethyl sulfoxide at 30 ° C and pH 7 for 21 hours. I let you. Further, in the same manner as described above, a primer (L313FW) shown in SEQ ID NO: 15 and a primer (L313RV) shown in SEQ ID NO: 16 are used to randomly generate a base encoding the leucine residue of amino acid number 313. About 200 colonies were reacted in the same manner as described above.
  • SEQ ID Nos: 1 to 20 in the present specification are as follows.
  • SEQ ID No. 1 Amino acid sequence of Bacillus subtilis ATCC23857-derived paranitrobenzyl esterase (PNBE23857, GenBank Accession No.
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence PNBE3026 of a hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3026
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence PNBE3108 of the hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3108
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence PNBE3027 of the hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3027
  • SEQ ID NO: 5 Amino acid sequence PNBE3013 of the hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3013
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 7: Base sequence of a DNA encoding a hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3026 pnbA3026 SEQ ID NO: 8: Base sequence of DNA encoding a hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3108 pnbA3108 SEQ ID NO: 9: Base sequence of DNA pnbA3027 encoding a hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3027 SEQ ID NO: 10: Base sequence of DNA encoding the hydrolase protein derived from Bacillus subtilis NBRC3013 pnbA3013 SEQ ID NO: 11: Primer pnbA F for amplifying the full length of the paranitrobenzyl esterase gene SEQ ID NO: 12: Primer pnbA R for amplifying the full length of paranitrobenzyl esterase gene Sequence number 13: Primer (L70FW) Sequence number 14: Primer (L)

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Abstract

　本発明の課題は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を酵素により加水分解し、Ｃ型肝炎治療薬の合成中間体として有用である(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を効率的に得るための新規加水分解酵素を提供することである。本発明によれば、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなり、ジエチル2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸から(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸への反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質が提供される。

Description

新規加水分解酵素タンパク質
　本発明は、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造に利用可能な新規な加水分解酵素タンパク質、及びその利用に関するものである。
　(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸は、Ｃ型肝炎治療薬として開発中の各種HCV NS3プロテアーゼ阻害剤等の製造に有用な中間体である。非特許文献１にはジメチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を酵素により加水分解し、(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を得る方法が記載されているが、酵素の光学的選択性は不十分であり、得られた(1S,2S)-1-メトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の光学純度は９０％e.e.で、医薬品の中間体の工業的な製造法としては不向きであった。
　また、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857のゲノム配列は公知であり、当該バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857株由来のパラニトロベンジルエステラーゼ（以下、「PNBE23857」と称する場合がある。）のアミノ酸配列は、GenBank Accession No. ZP_03593235に登録されている。
C. Fliche他 Synth. Commun. 24(20), 2873-2876 (1994)
　本発明は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を酵素により加水分解し、Ｃ型肝炎治療薬の製造用中間体として有用である(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を効率的に得るための新規な加水分解酵素タンパク質を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)由来のパラニトロベンジル加水分解酵素タンパク質が良好な選択性でジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解し、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を効率的に得ることが可能であることを見出した。また、既知のバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)由来パラニトロベンジル加水分解酵素タンパク質のDNA配列情報を元に、近縁のバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)が有するパラニトロベンジル加水分解酵素遺伝子をクローニングし、当該遺伝子がコードするパラニトロベンジル加水分解酵素タンパク質の活性を確認したところ、既知のパラニトロベンジル加水分解酵素タンパク質に比べて高い選択性で上記加水分解反応を触媒する新規ホモログを得ることに成功した。さらに、パラニトロベンジル加水分解酵素タンパク質の既知の立体構造情報を元に、上記新規ホモログのホモロジーモデリングを行い、基質結合部位近辺のアミノ酸残基に対する変異導入試験を行ったところ、上記加水分解反応をさらに高い選択性で触媒する加水分解酵素タンパク質を作製することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［２］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［３］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［４］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されていて、かつアミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［５］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくとも、アミノ酸番号７０番、２７０番、２７３番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸が置換されている、［２］又は［４］に記載の加水分解酵素タンパク質。
［６］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくともアミノ酸番号７０番のロイシンが、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸に置換されている、［５］に記載の加水分解酵素タンパク質。
［７］　配列番号３又は４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、［５］又は［６］に記載の加水分解酵素タンパク質。
［８］　配列番号１、２又は５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のイソロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、［５］又は［６］に記載の加水分解酵素タンパク質。
［９］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７３番のロイシンが、アルギニン、又はヒスチジンのいずれかのアミノ酸に置換されている、［５］から［８］のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質。
［１０］　配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３１３番のロイシンが、メチオニン、アラニン、又はプロリンのいずれかのアミノ酸に置換されている、［５］から［９］のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質。
［１１］　配列番号４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番のロイシンがアスパラギン酸に、２７０番のロイシンがグルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に、２７３番目のロイシンがアルギニンに、かつ３１３番目のロイシンがメチオニンに置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［１２］　［１］から［１１］の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は［１］から［１１］の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列に対して１から数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［１３］　［１］から［１２］の何れかに記載の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡ。
［１４］　以下の塩基配列からなる、［１３］に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号７から１０に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号７から１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件化でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：又は
（ｃ）配列番号７から１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列であって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［１５］　［１］から［１２］のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質をジアルキル　２－ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させて（１Ｓ，２Ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、（１Ｓ，２Ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
　本発明の加水分解酵素タンパク質は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して 1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造する際に、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成できるという高い選択性を有している。即ち、本発明の加水分解酵素タンパク質によれば、Ｃ型肝炎治療薬の製造用中間体として有用である(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を工業的に実用化可能な方法で、従来の方法に比べて効率的に製造することができる。本発明の加水分解酵素タンパク質を用いた(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法は、Ｃ型肝炎の治療薬及びその中間体の製造に利用することができる。本発明の製造方法により製造される化合物はＣ型肝炎の治療薬の製造における原料又は中間体として利用することができる。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の加水分解酵素タンパク質
　本発明の加水分解酵素タンパク質は、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列、又はそれに変異を施したアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有することを特徴とする。ここで、配列番号１は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857株由来のパラニトロベンジルエステラーゼ（PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235）のアミノ酸配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　尚、式（１）中のＥｔはエチル基を示す。
　本発明において、選択性とは光学的選択性のことであり、ある異性体を優先的に生成させることにより光学活性な化合物を生成する性質を意味する。具体的には、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する性質を意味する。
　ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を効率的に得るための加水分解酵素タンパク質に求められる選択性としては以下の点が挙げられる。
＜1R2S/1S2S比＞
　まず、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸には、(2R)体及び(2S)体の2種類の立体異性体が存在するが、2位での立体反転が起こる特殊な条件で無い限り、基本的には(2S)体のみが目的とする(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の原料となり得る。
　ジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解する際、加水分解酵素タンパク質は、1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する選択性を有する必要がある。なお、pro-Rとは、CX2YZ 上にある 2個の X について、それらを区別する表記法であり、概要は以下の通りである。Ｃ上の各置換基についてCIP則により優先順位を決める。そのとき、2個の X のうち一方の優先順位を他方よりも高いものと仮定する。Y、Z との優先順位の関係は変えない。仮の優先順位に基づき、RS表記法により中心炭素のキラリティが R か S かを決める。R体の場合は、そのときに優先させた X を pro-R とし、S体の場合はpro-S とする。
　本選択性は、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体と(1R,2S)体の比率を指標として比較可能であり、(1S,2S)体の生成量に比して(1R,2S)体の生成量の比率が低いものほど(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の収率が向上し、工業化において有利である。
＜1S2S体光学純度(％ e.e.)＞
　次に、ラセミ体のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を基質とする際に、(2R)体を加水分解酵素タンパク質により加水分解して、(1S,2R)体及び(1R,2R)体を生成し得るが、目的とする(1S,2S)体のエナンチオマーにあたる(1R,2R)体はその生成量を極力低く抑えることが好ましい。即ち、加水分解酵素タンパク質は、ジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基のみを優先的に加水分解し、(1S,2R)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を優先的に生成する選択性、及び／又はジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に比してジアルキル (2S)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を優先的に加水分解する選択性を有する必要がある。いずれの選択性も、加水分解により生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体の(1R,2R)体に対するエナンチオマー過剰率(％ e.e.)により比較可能であり、(1S,2S)体のエナンチオマー過剰率が高いものほど後の製造工程や製造された医薬品の生理活性に悪影響が生じる可能性が低く、工業化において有利である。
＜1S2R/1S2S比＞
　また、上記したように、加水分解酵素タンパク質はジアルキル (2R)-2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸の1位のプロキラルな炭素に結合した二つのアルコキシカルボニル基のうち、pro-Rなアルコキシカルボニル基を加水分解し、目的とする(1S,2S)体のジアステレオマーにあたる(1S,2R)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を生成し得るが、後段の製造工程への影響を軽減するため、この(1S,2R)体の混入も極力低減させることが好ましい。
　本選択性は、生成する1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の(1S,2S)体の生成量と(1S,2R)体の生成量の比率により比較可能であり、(1S,2S)体の生成量に対する(1S,2R)体の生成量が低いものの方が後の製造工程や製造された医薬品の生理活性に悪影響が生じる可能性が低く、工業化において有利である。
　したがって、本発明における選択性は、1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸における、「1R2S/1S2S比」、「1S2S体光学純度(％ e.e.)」、あるいは「1S2R/1S2S比」を指標とするものである。
　即ち、本発明の「式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性」とは、生成物である1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸における、「1R2S/1S2S比」、「1S2S体光学純度(％ e.e.)」、あるいは「1S2R/1S2S比」を指標として決定することができる。
　本発明の加水分解酵素タンパク質の好ましい態様としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
（ｂ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
（ｃ）配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されていて、かつアミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、上記式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
（ｄ）上記（ａ）又は（ｃ）の加水分解酵素タンパク質であって、少なくとも、アミノ酸番号７０番、２７０番、２７３番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなり、上記式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
　本発明においては、特に（ｄ）の加水分解酵素タンパク質が好ましい。
　「野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸」又は「野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸」における「嵩高さ」とは、具体的には、Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．，１９６８，２１，１７０のTable 3にＢｕｌｋｉｎｅｓｓとして示される値を指標とすることができる。各アミノ酸のＢｕｌｋｉｎｅｓｓの値は、具体的には以下の通りである。
Ａｌａ（アラニン）：１１．５０
Ａｒｇ（アルギニン）：１４．２８
Ａｓｐ（アスパラギン酸）：１１．６８
Ａｓｎ（アスパラギン）：１２．８２
Ｃｙｓ（システイン）：１３．４６
Ｇｌｕ（グルタミン酸）：１３．５７
Ｇｌｎ（グルタミン）：１４．４５
Ｇｌｙ（グリシン）：　３．４０
Ｈｉｓ（ヒスチジン）：１３．６９
Ｌｅｕ（ロイシン）：２１．４０
Ｉｌｅ（イソロイシン）：２１．４０
Ｌｙｓ（リシン）：１５．７１
Ｍｅｔ（メチオニン）：１６．２５
Ｐｈｅ（フェニルアラニン）：１９．８０
Ｐｒｏ（プロリン）：１７．４３
Ｓｅｒ（セリン）：　９．４７
Ｔｈｒ（スレオニン）：１５．７７
Ｔｒｐ（トリプトファン）：２１．６７
Ｔｙｒ（チロシン）：１８．０３
Ｖａｌ（バリン）：２１．５７
　即ち、「野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されている」とは、野生型のアミノ酸に比べて上記Ｂｕｌｋｉｎｅｓｓの値が小さいアミノ酸に置換されているということであり、「野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されている」とは、野生型のアミノ酸に比べて上記Ｂｕｌｋｉｎｅｓｓの値が大きいアミノ酸に置換されているということである。
　特に、本発明の加水分解酵素タンパク質としては、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、２７０番、２７３番、又は３１３番のロイシン又はイソロイシンのうちの１つ以上が、これらよりも上記Ｂｕｌｋｉｎｅｓｓの値が小さいアミノ酸に置換されているものが好ましい。
　このような加水分解酵素タンパク質としては、以下のものが挙げられる。
（ｅ）上記（ｄ）の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくともアミノ酸番号７０番のロイシンが、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
（ｆ）上記（ｄ）又は（ｅ）の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号３又は４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
（ｇ）上記（ｄ）又は（ｅ）の加水分解酵素タンパク質であって、配列番号１、２又は５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のイソロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
（ｈ）上記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの加水分解酵素タンパク質であって、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７３番のロイシンが、アルギニン、又はヒスチジンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
（ｉ）上記（ｄ）から（ｈ）のいずれかの加水分解酵素タンパク質であって、配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３１３番のロイシンが、メチオニン、アラニン、又はプロリンのいずれかのアミノ酸に置換されている加水分解酵素タンパク質。
　本発明においては、配列番号４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番のロイシンがアスパラギン酸に、２７０番のロイシンがグルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に、２７３番目のロイシンがアルギニンに、かつ３１３番目のロイシンがメチオニンに置換されているアミノ酸配列からなり、上記式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質が特に好ましい。
　本発明の加水分解酵素タンパク質としては、さらに、上記した本発明の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は上記した本発明の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列に対して１から数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有するものも含まれる。
　本発明において、「上記した本発明の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上の相同性」とは、本発明の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列との相同性又は同一性が９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
　本発明において、「１から数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加」における「１もしくは数個」とは、例えば、１から４０個程度を意味し、好ましくは１から２０個程度を意味し、より好ましくは１から１０個程度を意味し、さらに好ましくは１から５個程度を意味する。
　本発明の加水分解酵素タンパク質の由来は、特に限定されるものではなく、微生物などに由来する天然の酵素でもよいし、遺伝子組み換えタンパク質でもよい。
　天然の酵素としては、好ましくは、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis)から取得することができる。即ち、本発明の加水分解酵素タンパク質は、例えば、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027、及びバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013などの菌株から、通常の酵素の抽出、精製方法によって得ることができる。抽出方法として具体的には、例えば細片化、ホモジナイズ、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。また、精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、ザイモグラフィー等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
　また、本発明の加水分解酵素タンパク質の遺伝子を公知の方法に従ってクローニングし、適当な宿主に導入して、発現させることにより、本発明の加水分解酵素タンパク質を遺伝子組み換えタンパク質として得ることができる。例えば、本発明の加水分解酵素タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて本発明の加水分解酵素タンパク質の遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーを設計し、当該プローブ又はプライマーを用いて、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027、及びバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013などのＤＮＡライブラリー（例えば、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーなど）から本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡを単離又は増幅し、これを遺伝子組換え技術によりベクターに入れ、宿主細胞に導入し、そこで発現させることにより、本発明の加水分解酵素タンパク質を得ることができる。
（２）本発明のＤＮＡ
　本発明によれば、上記した本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡが提供される。
　本発明のＤＮＡの具体例としては、以下の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号７から１０に記載の塩基配列；
（ｂ）配列番号７から１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件化でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：又は
（ｃ）配列番号７から１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列であって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡは、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027、及びバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013からクローニングされたＤＮＡ、又は当該ＤＮＡに変異を導入したものである。また、本発明によりその塩基配列が決定されたので、この塩基配列に基づいて合成することも可能である。さらに、この塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、又は前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによって、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis)などの微生物のＤＮＡライブラリー（例えば、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーなど）から単離することもできる。また、本発明の加水分解酵素タンパク質のＤＮＡは、天然の微生物から分離されたもののみならず、既知のＤＮＡ合成方法、例えば、米国特許第6,472,184号公報や米国特許第5,750,380号公報に記載の方法を用いて合成されたものであってもよい。
　本発明において、「ストリンジェントな条件化でハイブリダイズすることができるＤＮＡ」とは、配列番号７から１０に記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡとＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０～７０℃、好ましくは６０～６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ～３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ～６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
　本発明において、「１から数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」とは、例えば、１から３０個程度を意味し、好ましくは１から２０個程度を意味し、さらに好ましくは１から１０個程度を意味し、さらに好ましくは１から５個程度を意味する。
　酵素活性を実質的に害さないアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加は、当業者であれば容易に選択することができる。また、酵素活性に実質的に影響を与えないアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を有する本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、自然突然変異株又は変種から取得することができる。
　配列番号７から１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列を有するＤＮＡの作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等の通常の変異操作によって得ることができる。これらは、例えばPrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit（タカラバイオ社）やクイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
（３）組み換えベクター及び形質転換体
　本発明によればさらに、本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。組み換えベクターを調製する際には、通常、本発明のＤＮＡを宿主微生物に適したプロモーターとともに、このプロモーターの下流に本発明のＤＮＡのコード領域の５'末端側が連結されるようにして、ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現ベクターを用い、これに本発明のＤＮＡを挿入してもよい。
　発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プラスミドベクター、シャトルベクター及びファージベクターが挙げられる。具体的なプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えばタカラバイオ社から購入できる）、ｐＥＴ発現ベクターシリーズ（Novagen社製）等を挙げることができる。大腸菌－コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、特開平３－２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２－２７６５７５号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１－１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３；特開昭５８－６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８－７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８－１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７－１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８－３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７－１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４及びｐＣＧ１１等、あるいはこれらの誘導体等を挙げることができる。また、ファージベクターとしては、（λＦｉｘIIベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入できる）等を挙げることができる。
　本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターは、宿主微生物が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、それに限られるものではなく、本発明の加水分解酵素タンパク質のＤＮＡの転写を開始させるための原核生物由来の塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。具体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（ｔａｃ）プロモーター［H. A. Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げられる。これらのプロモーターのうち、発現効率を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンのプロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより遺伝子発現を誘導することができる。
　本発明によれば、さらに本発明のＤＮＡ又は組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体が提供される。本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを導入する宿主としては、特に限定されるものではないが、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸以外に加水分解する活性を有するものは好適には用いられない。また、生成された(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸をさらに別の化合物に変化させる活性を有するものも好ましくない。
　本発明で用いることができる宿主は、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸、あるいは目的物である(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸と接触させ、その結果、得られる化合物を分析することにより選択することができる。
　本発明で用いることができる宿主微生物としては、具体的には、エシェリヒア（Escherichia）属細菌（例えば、大腸菌）が挙げられ、また、放線菌（Actinomycetes）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌等も、上記性質を有するものは、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを導入する宿主として用いることができる。
　具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等であって、上記性質を有するものを用いることができる。
　また、上記微生物において、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸以外に加水分解する活性や生成された(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸をさらに別の化合物に変化させる活性を有するものは、該活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子を既存の方法により破壊することにより、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを導入する宿主として用いることができる。
　上記宿主微生物への遺伝子の導入法としては、コンピテントセル法［Journal of Molecular Biology, Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法［J. Indust.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)］等を用いることができる。これらの方法から、宿主微生物に適した方法を適宜選択すればよい。
　上記のような発現ベクターを用いた発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡを、宿主微生物の染色体中に直接導入する相同組換え技術あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術によっても発現させることができる。従って、本発明の形質転換体は、本発明の酵素が発現していればよく、遺伝子の導入の方法は限定されない。
（４）形質転換体を用いた本発明の加水分解酵素タンパク質の製造
　本発明によれば、上記のようにして得られる形質転換体を培養し、その培養物から本発明の加水分解酵素タンパク質を採取することができる。
　形質転換体の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
　培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加して行うことができる。
　培養物からの酵素の採取は、酵素の活性を指標として公知の採取方法により行うことができる。酵素は必ずしも均一にまで精製される必要はなく、用途に応じた精製度まで精製すればよい。
　本発明で用いられる粗精製画分又は精製酵素としては、形質転換体を培養した培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体を超音波、圧擦等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる、本発明の加水分解酵素タンパク質を含有する抽出物、該抽出物に更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる本発明の加水分解酵素タンパク質の粗酵素標品又は精製した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記菌体、破砕物、抽出物、粗精製画分又は精製酵素を担体に固定化したものも使用することができる。
　これら菌体、菌体破砕物、抽出物又は精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、又はカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。例えば、菌体を担体に固定化する場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２Ｍ～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６～１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。
（５）本発明の加水分解酵素タンパク質を用いた(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造
　本発明によれば、式（２）で表される製造、即ち、本発明の加水分解酵素タンパク質をジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させて(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　式（２）中、Ｒは置換されていてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数７～２０のアラルキル基、又は炭素数６～１２のアリール基を示す。
　Ｒで表される置換されていてもよい炭素数１～１０のアルキル基としては、炭素数１～１０の置換又は無置換の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数１～６の置換又は無置換の直鎖状若しくは分岐状若しくは環状のアルキル基が挙げられる。これらのうち、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ノルマルプロピル基、ノルマルブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ノルマルペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ネオペンチル基、ノルマルヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好適に挙げられ、特に炭素数１～４のアルキル基が好ましい。
　Ｒで表される置換されていてもよい炭素数７～２０のアラルキル基としては、好ましくは炭素数７～１２の置換又は無置換のアラルキル基である。これらのうち、ベンジル基、４－メチルベンジル基、４－メトキシベンジル基、４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基、２－フェニルエチル基、１－フェニルエチル基、３－フェニルプロピル基等が好適に挙げられる。
　Ｒで表される置換されていてもよい炭素数６～１２のアリール基としては、例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、ｏ－メチルフェニル基、ｍ－メチルフェニル基、ｐ－メチルフェニル基、ｏ－メトキシフェニル基、ｍ－メトキシフェニル基、ｐ－メトキシフェニル基、２，３－ジメチルフェニル基、２，４－ジメチルフェニル基、２，５－ジメチルフェニル基、２，６－ジメチルフェニル基、３，４－ジメチルフェニル基、３，５－ジメチルフェニル基、２，３，５－トリメチルフェニル基、２，３，６－トリメチルフェニル基、２，４，６－トリメチルフェニル基、ｏ－ニトロフェニル基、ｍ－ニトロフェニル基、ｐ－ニトロフェニル基等が好適に挙げられる。
　Ｒとしては、好ましくはメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、及びベンジル基であり、さらに好ましくはエチル基である。
　本発明の加水分解酵素タンパク質をジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させる際には、精製又は粗精製した本発明の加水分解酵素タンパク質、本発明の加水分解酵素タンパク質を産生する微生物（例えば、本発明の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡを有する形質転換体など）又はその処理物を、ジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させることによって、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することができる。
　反応の方法は特に限定されず、本発明の加水分解酵素タンパク質を含む液体に、基質となるジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加え、適当な温度（例えば、１０℃から４０℃程度）や圧力（例えば大気圧程度）で反応させることができる。これにより、(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することができる。
　反応混合物から目的の(1S,2S)-1-アルコキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を分画する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離又は精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の加水分解酵素タンパク質は、ジエチル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸を加水分解して、(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造する方法に、特に好適に用いることができる。
　また、本発明のジアルキル 2-ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸は、以下の式（３）の反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　即ち、式（３）の原料化合物を、アルカリ金属アルコキシド又はアルカリ金属水素化物の存在下でマロン酸エステル類と反応させることにより製造することができる。
　式（３）中、Ｒ3は、表される置換されていてもよい炭素数６～１２のアリールスルホニル基、炭素数１～１０のアルキルスルホニル基、及び炭素数７～２０のアラルキルスルホニル基としては、例えば、ベンゼンスルホニル基、ｐ－トルエンスルホニル基、１－ナフタレンスルホニル基、２－ナフタレンスルホニル基、メタンスルホニル基、エタンスルホニル基、プロパンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、及びベンジルスルホニル基等が挙げられる。Ｒ3は、好ましくはメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、及びｐ－トルエンスルホニル基であり、特に好ましくはｐ－トルエンスルホニル基である。また、Ｒは前記定義と同じである。
　ここで、式（３）の原料化合物は、公知の方法、例えばFrederic Dolle他、Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1115-1125 等に記載された方法に準じて製造することができる。また、以下の式（４）の反応により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　即ち、1,4-ブテンジオールをＲ3Ｘで表される化合物と反応させた後、晶析することにより、あるいは、市販されている原料化合物を酸又は塩基で加水分解して1,4-ブテンジオールを得、さらにＲ3Ｘで表される化合物と反応させた後、晶析することにより製造することができる。
　式（４）中、Ｘ1は水素原子又はＲ1を示し、Ｘ2は水素原子又はＲ2を示し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して置換されていてもよい炭素数２～１１のアルキルカルボニル基、炭素数８～２１のアラルキルカルボニル基、又は炭素数７～１３のアリールカルボニル基を示す。但し、Ｘ1及びＸ2が同時に水素原子となる場合を除く。好ましくは、Ｘ1がＲ1で且つＸ2がＲ2であり、より好ましくはＲ1及びＲ2がアセチル基、エチルカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル基、ベンゾイル基であり、さらに好ましくはアセチル基である。
　本発明で得られた(1S,2S)-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパンカルボン酸を用いることにより、Ｃ型肝炎治療薬として開発中の各種HCV NS3プロテアーゼ阻害剤等の製造に有用な中間体である(1R,2S)/(1S,2R)-1-アミノ-1-エトキシカルボニル-2-ビニルシクロプロパン及びその塩を製造することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１：パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子（pnbA；配列番号６から１０）のクローニング
（１）遺伝子のクローニング
　バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027、及びバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013を各菌株保存機関が指定する液体培地でそれぞれ一晩培養して得られた菌体より、DNeasy Blood & Tissue Kit (キアゲン社製)を用いて、染色体DNAをそれぞれ調製した。
　ゲノム配列公知株バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ（PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235、配列番号１）をコードする遺伝子配列（以下pnbA23857、配列番号６）を元に、パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーpnbA F及びpnbA Rを設計、合成した。それぞれの塩基配列を、配列表の配列番号１１（pnbA F）及び１２（pnbA R）に示す。
　調製した各菌株由来の染色体DNAを鋳型とし、pnbA F、pnbA Rをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、それぞれ約1.5kbpのDNA断片を増幅した。
　このときのPCRは、Easy-AハイフィデリティPCRクローニング酵素（アジレント・テクノロジー社製）を使用し、添付の取り扱い説明書の条件に従って反応を実施した。温度条件については、94℃で2分間保持の後、（94℃、30秒；50℃、30秒；72℃、90秒）を35サイクル繰り返し、72℃で5分間保持して終了した。
（２）発現ベクターの調製
　特開2005-34025号公報記載の方法に準じて調製したプラスミドpKV32をテンプレートとし、配列番号１９に示すプライマー（pKVXmaIFW）と配列番号２０に示すプライマー（pKVXmaIRV）を用いて、PCRにより約4kbpの断片を増幅した。増幅された断片を制限酵素XmaIにより消化した後、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)により自己閉環させてプラスミドを得た。得られたプラスミドをpKW32と命名した。
　このときのPCRは、KOD -plus- Ver.2（東洋紡社製）を使用し、添付の取り扱い説明書の条件に従って反応を実施した。温度条件については、94℃で2分間保持の後、（94℃、15秒；58℃、30秒；68℃、4分）を30サイクル繰り返し、68℃で5分間保持して終了した。
（３）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたDNA断片はそれぞれ、Ligation-Convenience Kit(ニッポンジーン社製)を用いて、（２）で調製したクローニングベクターpKW32に導入した。以下、得られた各プラスミドをそれぞれppnbA23857、ppnbA3026、ppnbA3108、ppnbA3027、及びppnbA3013とする。
　プラスミドppnbA3026、ppnbA3108、ppnbA3027、及びppnbA3013については、挿入されたDNA配列の解析を行い、それぞれ1467bpのORFからなる遺伝子を含むことを確認した。これらの遺伝子をそれぞれpnbA3026、pnbA3108、pnbA3027、及びpnbA3013と命名した。各配列は配列番号７（pnbA3026）、８（pnbA3108）、９（pnbA3027）及び１０（pnbA3013）で示される通りであった。それぞれのDNA配列がコードするアミノ酸配列をPNBE3026、PNBE3108、PNBE3027、PNBE3013と命名した。各配列は配列番号２（PNBE3026）、３（PNBE3108）、４（PNBE3027）及び５（PNBE3013）で示される通りであった。各アミノ酸配列は既知のPNBE23857のアミノ酸配列（配列番号１）に対してそれぞれ97%、91%、90%、及び98%の配列一致度を示した。
実施例２：新規パラニトロベンジルエステラーゼの選択性比較
　実施例１で得られた５種のプラスミドを用い、大腸菌(Escherichia coli) JM109（タカラバイオ株式会社製） を常法に従い形質転換した。得られた組換え大腸菌それぞれをカナマイシン 20 mg/l、IPTG 0.2mMを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。
　得られた菌体を用いて、5 g/lのラセミ体１，１－ジエトキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパン（以下、「VCPDE」と称する。）及び5%のジメチルスルホキシドを含む100mM リン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。
　反応後の反応液を下記条件の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析した。
カラム： CHIRALPAK AD-3（4.6 x 250 mm、ダイセル化学社製）
溶離液： ヘキサン : エタノール : トリフルオロ酢酸 = 95 : 5 : 0.1
流速： 0.8 ml/min
温度： 30℃
検出： UV 210 nm
　分析の結果、１－エトキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸（以下、「VCPME」と称する。）の生成が確認された。得られた結果から、選択性の指標である、生成したVCPMEの(1S,2S)体と(1R,2S)体の比率を表す「1R2S/1S2S比」、(1S,2S)体の(1R,2R)体に対するエナンチオマー過剰率を表す「1S2S体光学純度」、及び(1S,2S)体と(1S,2R)体の比率を表す「1S2R/1S2S比」について求め、その結果を表１にまとめた。また、プラスミドpKW32のみで形質転換した菌体では当該基質の加水分解活性は見られなかった。いずれの酵素も「1R2S/1S2S比」については十分低い値を示した。
　PNBE3026、PNBE3108及びPNBE3027の3種の酵素は「1S2S体光学純度」において、配列既知の酵素PNBE23857に比べて高い値を示した。
　また、PNBE3013は「1S2R/1S2S比」において、配列既知の酵素PNBE23857に比べて低い値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
合成例
　実施例１で使用したVCPDEは以下のようにして合成した。
　２Ｌ４口フラスコに、マロン酸ジエチルエステル９３．４ｇ（５８３ｍｍｏｌ）、トルエン１０００ｍＬを仕込み、塩基として２０％ナトリウムエトキシドエタノール溶液２２３ｍＬ（５６９ｍｍｏｌ）を加えた。室温下、１．５時間撹拌後、ｔｒａｎｓ－１，４－ジブロモ－２―ブテン５９．４ｇ（２７８ｍｍｏｌ、アルドリッチ社製試薬）を加えた。室温下、２時間撹拌後、さらに２０％ナトリウムエトキシドエタノール溶液１０９ｍＬ（２７８ｍｍｏｌ）を加えた。室温下、１時間撹拌後、ｔｒａｎｓ－１，４－ジブロモ－２―ブテン２９．１ｇ（１３６ｍｍｏｌ、アルドリッチ社製試薬）を加えた。室温下、４時間撹拌後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３４７ｍＬを添加して１４時間撹拌後、有機層を分離した。次いで有機層を水１３２ｍＬで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後に濾過し、得られた濾液を４０℃にて減圧濃縮し、淡黄色油状物の粗生成物として１，１－ジ－エトキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパン９９．３ｇを得た。この粗生成物の中に１，１－ジ－エトキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンは８３．２ｇ（収率９４．９％）含まれていた。また、マロン酸ジエチルエステルは含まれていなかった。
実施例３：本発明の加水分解酵素タンパク質（配列番号４）の立体構造モデリング
　PNBE3027のアミノ酸配列について、Protein Data Bank (PDB)に対してBLAST検索を行い、以下の3種の結晶構造を参照構造として選択した。なお、以下においてA56Vという表記は、５６番目のアミノ酸残基アラニン（A）がバリン(V)に置換していることを示す。
・para-nitrobenzyl esterase Mutation: A56V, I60V, T73K, L144M, L313F, H322Y, A343V, M358V, Y370F, A400T, G412E, I437T, T459S(PDB id: 1C7J) 配列一致度89％
・para-nitrobenzyl esterase Mutation: I60V, L144M, P317S, H322R, L334S, M358V, Y370F (PDB id: 1C7I) 配列一致度90％
・para-nitrobenzyl esterase 　(PDB id: 1QE3) 配列一致度91％
  ホモロジーモデルの作成は、Discovery Studio Modeling（以下DS Modeling）Ver. 2.5を用い、得られた初期モデリング構造について、CHARMM (Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics)力場を各原子に割り当て、分子力学計算による構造最適化を行った。構造の最適化は、まず、Steepest Decent法（最急降下法）で1000ステップ、次に、Adapted Basis Newton-Raphson法で5000ステップ、それぞれ計算を行うことにより行った。
　基質複合体モデルは、得られたホモロジーモデルに対し、基質であるVCPDEのS体及びR体それぞれを、(1S,2S)-VCPMEが生成する方向及び(1R,2R)-VCPMEが生成する方向に配位させて初期構造とした後、エネルギー最小化を行って作成した。エネルギー最小化を行う際には、エステラーゼの加水分解反応機構を考慮し、以下の距離拘束条件を設定した。
・オキシアニオンホールを形成する、アミド3個（Gly106, Ala107, Ala190）の窒素原子と加水分解されるエステル結合のカルボニル酸素との距離を2.0Å以上3.0Å以内とする。
・活性部位Ser189のアルコール酸素原子と加水分解されるエステル結合のカルボニル炭素の距離を2.0Å以上3.0Å以内とする。
  以上の処理により得られた構造を「1S2Sモデル」及び「1R2Rモデル」とした。
実施例４：パラニトロベンジルエステラーゼ中の基質認識に関与するアミノ酸残基の推定
　まず、実施例３で得られた「1S2Sモデル」及び「1R2Rモデル」それぞれにおいて、VCPDEのビニル基の2位の炭素原子から8Å以内に一部もしくは全部が存在するアミノ酸残基を全て抽出した。距離の計算にはDiscovery Studio Visualizer v2.5.5.9350を使用し、抽出された各アミノ酸残基の中でそれぞれのモデルのVCPDEのビニル基の2位の炭素原子からの距離が最も近い水素原子以外の原子との距離を各アミノ酸残基との距離と規定した。抽出された各アミノ酸残基について、規定した距離を「1S2Sモデル」における距離と「1R2Rモデル」における距離とで比較した結果、「1R2Rモデル」に比べて「1S2Sモデル」における距離が近いアミノ酸残基を表２に、「1S2Sモデル」に比べて「1R2Rモデル」における距離が近いアミノ酸残基を表３に示した。
　以上の結果より、表２のアミノ酸残基については、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に変換された方が、また、表３のアミノ酸残基については、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に変換された方が(1S,2S)体のVCPMEの生成に有利な選択性を発揮できると推定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表２及び表３中、対象原子（アミノ酸残基中の原子）の略称は、蛋白質構造データバンク（PDB）に規定された方法に従ったものである。以下にその例を示す。
CA = Carbon, Alpha
CB = Carbon, Beta 
CG = Oxygen, Gamma
CD = Carbon, Delta
CE = Carbon, Epsilon
CZ = Carbon, Zeta 
OE = Oxygen, Epsilon
実施例５：変異導入によるパラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の改変
　実施例１で得たプラスミドppnbA3027を鋳型として、配列表の配列番号１３に示すプライマー（L70FW）と配列番号１４に示すプライマー（L70RV）を用いて、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit （ストラタジーン社製）によりアミノ酸番号70番のロイシンをコードする塩基にランダムな変異を導入した。得られた約200個のコロニーをそれぞれカナマイシン 20 mg/l、IPTG 0.2mMを含む液体LB培地を用いて30℃で振盪培養し、培養20時間目に集菌した。
　得られた菌体を用いて、5 g/lもしくは30 g/lのラセミ体VCPDE、5%のジメチルスルホキシドを含む100mM リン酸カリウム緩衝液中で、30℃、pH 7の条件で21時間反応させた。
　また、上記と同様にして、配列表の配列番号１５に示すプライマー（L313FW）と配列番号１６に示すプライマー（L313RV）を用いて、アミノ酸番号313番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、約200個のコロニーを上記と同様の方法で反応させた。
　さらに、上記と同様にして、配列表の配列番号１７に示すプライマー（L270L273FW）と配列番号１８に示すプライマー（L270L273RV）を用いて、アミノ酸番号270と273番のロイシン残基をコードする塩基に対してランダムな変異を導入し、約400個のコロニーを上記と同様の方法で反応させた。
　反応後の反応液を、実施例２と同様の方法及び条件でHPLCによる分析を行った。基質であるVCPDEの濃度5 g/l時の各変異株の反応結果については表４に、30 g/l時の結果については表５に示した。また、得られたクローンについては、各クローンが有するプラスミドDNAを常法に従い抽出し、DNA配列を解析した。その結果得られた各変異導入部位の変異後のアミノ酸残基について表４及び５に併記した。
　表４のNo.1と、No.3～6及び11との比較により、アミノ酸番号70番のロイシンがアスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、グリシンのいずれかのアミノ酸に変換されている場合、生成するVCPMEの(1S,2S)体の光学純度が向上していた。また、野生体No.1とNo.2、7及び13との比較により、アミノ酸番号313番のロイシンがメチオニン、アラニン、プロリンのいずれかのアミノ酸に変換されている場合にも、生成するVCPMEの(1S,2S)体の光学純度が向上していた。また、No.8、10及び15は特にアミノ酸番号70番及び313番のロイシンが同時に変換されることにより、生成するVCPMEの1R2S/1S2S比が野生体に比べて向上していた。
　次に、表４のNo.1と表５のNo.16の比較により、基質であるVCPDE濃度が5 g/lから30 g/lに上昇することで、1S2S体光学純度が低下することが確認された。よって、導入した変異の効果は同一の基質濃度で行う必要があることが判明した。また、表５のNo.19及び21～25と野生体No.16との比較によりアミノ酸番号270番のロイシン及び273番のロイシンを変換することにより、1R2S/1S2S比、1S2S体光学純度、及び1S2R/1S2S比全てにおいて向上が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　ここで、表４及び表５における各記号は、以下のものを示す。
P：プロリン
G：グリシン
T：スレオニン
S：セリン
N：アスパラギン
A：アラニン
M：メチオニン
D：アスパラギン酸
F：フェニルアラニン
H：ヒスチジン
R：アルギニン
E：グルタミン酸
Q：グルタミン
　また、本明細書における配列番号１～２０は以下の通りである。
配列番号１：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ（PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235）のアミノ酸配列
配列番号２：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3026
配列番号３：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3108
配列番号４：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3027
配列番号５：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013由来加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列PNBE3013
配列番号６：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) ATCC23857由来パラニトロベンジルエステラーゼ（PNBE23857、GenBank Accession No. ZP_03593235、配列番号１）をコードする遺伝子配列（pnbA23857）
配列番号７：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3026由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3026
配列番号８：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3108由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3108
配列番号９：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3027由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3027
配列番号１０：バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) NBRC3013由来加水分解酵素タンパク質をコードするDNAの塩基配列pnbA3013
配列番号１１：パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーpnbA F
配列番号１２：パラニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーpnbA R
配列番号１３：プライマー（L70FW）
配列番号１４：プライマー（L70RV）
配列番号１５：プライマー（L313FW）
配列番号１６：プライマー（L313RV）
配列番号１７：プライマー（L270L273FW）
配列番号１８：プライマー（L270L273RV）
配列番号１９：プライマー（pKVXmaIFW）
配列番号２０：プライマー（pKVXmaIRV）

Claims (15)

  1. 配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  4. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番、１０６番、１０７番、１０８番、２１９番、２７０番、２７１番、２７２番、２７３番、２７４番、２７５番、２７６番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが低いアミノ酸に置換されていて、かつアミノ酸番号１８８番、１９０番、１９３番、２１５番、２１６番、２１７番、３１４番、３５８番、３６２番、及び３６３番のアミノ酸のうち１つ以上が、野生型のアミノ酸に比べて側鎖の嵩高さが高いアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  5. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくとも、アミノ酸番号７０番、２７０番、２７３番、及び３１３番のアミノ酸のうち１つ以上のアミノ酸が置換されている、請求項２又は４に記載の加水分解酵素タンパク質。
  6. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、少なくともアミノ酸番号７０番のロイシンが、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、スレオニン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項５に記載の加水分解酵素タンパク質。
  7. 配列番号３又は４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項５又は６に記載の加水分解酵素タンパク質。
  8. 配列番号１、２又は５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７０番のイソロイシンが、セリン、グルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項５又は６に記載の加水分解酵素タンパク質。
  9. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号２７３番のロイシンが、アルギニン、又はヒスチジンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項５から８のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質。
  10. 配列番号１～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３１３番のロイシンが、メチオニン、アラニン、又はプロリンのいずれかのアミノ酸に置換されている、請求項５から９のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質。
  11. 配列番号４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号７０番のロイシンがアスパラギン酸に、２７０番のロイシンがグルタミン、グルタミン酸、又はアラニンのいずれかのアミノ酸に、２７３番目のロイシンがアルギニンに、かつ３１３番目のロイシンがメチオニンに置換されているアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  12. 請求項１から１１の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、又は請求項１から１１の加水分解酵素タンパク質のアミノ酸配列に対して１から数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  13. 請求項１から１２の何れかに記載の加水分解酵素タンパク質をコードするＤＮＡ。
  14. 以下の塩基配列からなる、請求項１３に記載のＤＮＡ。
    （ａ）配列番号７から１０に記載の塩基配列；
    （ｂ）配列番号７から１０に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件化でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：又は
    （ｃ）配列番号７から１０に記載の塩基配列において、１から数個の塩基の置換、欠失、及び／又は付加を有する塩基配列であって、式（１）に示す反応を、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質より高い選択性で触媒する活性を有する加水分解酵素タンパク質をコードする塩基配列：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  15. 請求項１から１２のいずれか１項に記載の加水分解酵素タンパク質をジアルキル　２－ビニルシクロプロパン-1,1-ジカルボン酸に作用させて（１Ｓ，２Ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸を製造することを含む、（１Ｓ，２Ｓ）－１－アルコキシカルボニル－２－ビニルシクロプロパンカルボン酸の製造方法。
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