JP2016503662A - カルバペネム合成に有用な人口生体触媒 - Google Patents

カルバペネム合成に有用な人口生体触媒 Download PDF

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Abstract

本開示は、カルバペネム系抗生物質イミペネムの合成に有用な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを提供する。本開示はまた、前記人工ｐＮＢエステラーゼをコードするポリヌクレオチド、前記人工ｐＮＢエステラーゼを発現することができる宿主細胞、およびイミペネムの生産における前記人工ｐＮＢエステラーゼの使用方法を提供する。本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、野生型ｐＮＢエステラーゼと比較した１個以上の残基差異を有するように操作されている。

Description

本出願は、２０１３年１月１８日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／７５４，０９５号の優先権を主張し、当該出願はその全体がすべての目的について援用される。
１．技術分野
本開示は、ｐＮＢエステラーゼ生体触媒、およびカルバペネム系抗生物質化合物イミペネムを調製するための前記生体触媒の使用方法に関する。
２．配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の正式な写しは、ＡＳＣＩＩ形式のテキストファイル（ファイル名「ＣＸ２−１２８ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１３年１月１７日、サイズ３６９，８０１バイト）として、本明細書と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出した配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
３．背景
カルバペネムは、広範囲の抗菌活性を有するβ−ラクタム系抗生物質の一クラスである。カルバペネム系抗生物質は元々、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａの天然由来生成物であるチエナマイシンから開発された。カルバペネム系抗生物質は、ほとんどのβ−ラクタマーゼに対して耐性が強い構造を有するので、大腸菌およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａなどの細菌による高耐性感染症の最後の処置手段の抗生物質となることが多い。カルバペネム系抗生物質としては、限定されないが、イミペネム、エルタペネム、メロペネム、ドリペネム、パニペネム、ビアペネム、ラズペネムおよびタビペネムが挙げられる。
イミペネム（以下に示される化合物（１））は、グラム陽性およびグラム陰性の好気性細菌種および嫌気性細菌種に対して広範囲の抗菌活性を示すカルバペネムである。
Figure 2016503662
イミペネムの使用および製造の方法は、米国特許第４，１９４，０４７号で最初に開示された。イミペネムを調製するための様々な別の合成方法は、例えば、米国特許第４，３７４，７７２号、米国特許第４，８９４，４５０号および米国特許第７，４６２，７１２号に記載されている。イミペネムを調製するためのいくつかの合成経路は、イミペネムのｐ−ニトロベンジル−エステル（以下に示される化合物（２））の形成を含む。
Figure 2016503662
 ｐ−ニトロベンジル基を除去するためにパラジウムまたは白金水素化触媒を使用することによって、このｐＮＢ保護イミペネム化合物（２）を脱保護すると、イミペネム生成物化合物（１）が得られる（例えば、米国特許第４，２９２，４３６号および米国特許第５，２４５，０６９号および米国特許出願公開第２００２／００９５０３４号を参照のこと）。しかしながら、ｐＮＢの脱保護にこれらの触媒を使用するのは高価であり、脱保護されたイミペネムの収率は比較的低い（例えば、６０％未満）。
米国特許第５，４６８，６３２号では、セファロスポリン由来抗生物質および１−カルバ−セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌａｓｐｏｒｉｎ）抗生物質の合成において、エステラーゼ酵素を使用してｐＮＢ保護基を除去することが開示された。米国特許第５，４６８，６３２号では、このようなｐＮＢ保護基を除去するためのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の特定の野生型ｐＮＢエステラーゼが単離され、クローニングされ、配列決定された。また、抗生物質ロラカルベフのｐＮＢ保護前駆体からのｐＮＢ基の除去に関して、熱安定性および活性を増加させるために、これと同じ野生型ｐＮＢエステラーゼが操作されている（例えば、Ｍｏｏｒｅら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７（１９９６）；Ｍｏｏｒｅら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７（１９９７）；Ｇｉｖｅｒら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２８０９−１２８１３（Ｏｃｔ．１９９８）を参照のこと）。しかしながら、商業的に実現可能で工業的に有用な処理条件下におけるｐＮＢ保護カルバペネム中間体（例えば、化合物（２）のｐＮＢ保護イミペネム）の脱保護に関して、選択性および高収率を提供する人工ｐＮＢエステラーゼの必要性が依然として存在する。
米国特許第４，１９４，０４７号明細書 米国特許第４，３７４，７７２号明細書 米国特許第４，８９４，４５０号明細書 米国特許第７，４６２，７１２号明細書 米国特許第４，２９２，４３６号明細書 米国特許第５，２４５，０６９号明細書 米国特許出願公開第２００２／００９５０３４号明細書 米国特許第５，４６８，６３２号明細書 米国特許第５，４６８，６３２号明細書
Ｍｏｏｒｅら、"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，"Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７（１９９６） Ｍｏｏｒｅら、"Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７（１９９７） Ｇｉｖｅｒら、"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２８０９−１２８１３（Ｏｃｔ．１９９８）
４．概要
本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリペプチドの作製方法、およびイミペネムなどのカルバペネム生成物の合成においてｐＮＢ保護基を選択的に除去するために前記ポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、野生型ｐＮＢエステラーゼと比較した１個以上の残基差異を有するように操作されている。それらはまた、配列番号２のアミノ酸配列の予め操作された人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド（これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼと比べて増強した溶媒安定性および熱安定性を有する）と比較した１個以上の残基差異を有する。特に、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、スキーム１に示されているように、化合物（２）のイミペネム前駆体化合物からｐＮＢ保護基を効率的に除去し、それによりそれを生成化合物（１）イミペネムに変換するために操作されている。
Figure 2016503662
アミノ残基差異は、様々な酵素特性（特に、活性、安定性、生成物選択性および生成物許容性を含む）に影響を与える残基位置に位置する。これらのアミノ残基差異は、化合物（２）のイミペネム前駆体からｐＮＢ保護基を除去するために作り出されたものであるが、構造的に類似するカルバペネム前駆体化合物（限定されないが、チエナマイシンメロペネム、ドリペネム、エルタペネム、バイオペネムおよびパニペネムのｐＮＢ保護前駆体化合物を含む）のｐＮＢ保護基を除去するのに有用な活性を有する人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを作り出すのにも使用され得る。
一態様では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／ＶおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、位置Ｘ１９３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖから選択される残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｘ１９３における配列番号２と比較したアミノ酸残基差異は、Ｘ１９３Ｖである。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較したアミノ酸差異Ｘ１９３Ｖとを有するアミノ酸配列を含み、位置Ｘ２１９およびＸ２７３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ２１９Ｌ／ＶおよびＸ２７３Ａ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む。さらなる実施形態では、アミノ酸配列は、位置Ｘ１０８およびＸ３６２における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／ＹおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む。またさらなる実施形態では、人工ポリペプチドは、位置Ｘ１１５における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１１５Ｑ／Ｗから選択される残基差異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較した残基差異の組み合わせであって、（ａ）Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９ＶおよびＸ２７３Ａ；（ｂ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｄ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｓ；（ｃ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；（ｄ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｌ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；ならびに（ｅ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑから選択される残基差異の組み合わせとを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上（または本明細書の他の箇所）に開示されるｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、他の残基位置におけるさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼは、配列番号２と比較した１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２と比較した１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の残基差異をさらに有する。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較した１個以上のアミノ酸残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／ＶおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上のアミノ酸残基差異とを有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／ＬおよびＸ３２１Ａから選択される１個以上の残基差異をさらに含む。またさらなる実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ４９Ｇ、Ｘ９４Ｇ、Ｘ９６Ｓ、Ｘ２２７Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２６７Ｒ、Ｘ２７１Ｌ、Ｘ２７４Ｌ、Ｘ３１３Ｆ、Ｘ３２２Ｃ／Ｙ、Ｘ３４３Ｖ、Ｘ３５６Ｒ、Ｘ３５９Ａ、Ｘ３９８Ｌ、Ｘ４１２Ｅ、Ｘ４３７Ｔ、Ｘ４６４ＡおよびＸ４８１Ｒから選択される残基差異をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、本明細書に開示される（例えば、表２の例示的なポリペプチドに開示される）配列番号２と比較したアミノ酸差異のいずれかとを有するアミノ酸配列を含むが、前記アミノ酸配列は、位置Ｘ６０、Ｘ１４４、Ｘ３１７、Ｘ３２２、Ｘ３３４、Ｘ３５８およびＸ３７０における配列番号２と比較した残基差異を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、本明細書に開示されるアミノ酸残基差異のいずれかとを有する人工ポリペプチドは、適切な反応条件下における化合物（２）の化合物（１）への変換について、配列番号４のポリペプチドと比較して少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ以上増加した活性をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示はさらに、本明細書に開示されるｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドのいずれかであって、固体支持体上に固定化されている人工ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である。
ｐＮＢエステラーゼ活性と、本明細書に開示される残基差異（それらの様々な組み合わせを含む）が組み込まれたアミノ酸配列とを有する例示的な人工ポリペプチドであって、（例えば、適切な反応条件下で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる）改善された特性を有する例示的な人工ポリペプチドは、表２および実施例に開示されている。アミノ酸配列は配列表において提供され、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０が挙げられる。
別の態様では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および前記人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を提供する。例示的なポリヌクレオチド配列は配列表（これは、参照により本明細書に組み込まれる）において提供され、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で、前記人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含み得る方法を提供する。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを製造するための方法はまた、（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択されるアミノ酸配列を含み、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること；および（ｂ）前記ポリヌクレオチドによってコードされるｐＮＢエステラーゼポリペプチドを発現させることを含み得る。詳細な説明でさらに示されているように、ポリヌクレオチドの合成中にさらなる変化を導入して、発現されるアミノ酸配列中に対応する差異を有する人工ポリペプチドを調製し得る。
人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの構造的特徴は、化合物（２）のｐＮＢ保護基質を、それに対応する化合物（１）の非保護生成物イミペネムに変換するのを可能にする。したがって、別の態様では、本開示は、化合物（１）のカルバペネム系抗生物質イミペネムまたは化合物（１）の塩もしくは水和物
Figure 2016503662
 を調製するための方法であって、適切な反応条件下で、基質化合物（２）または化合物（２）の塩もしくは水和物
Figure 2016503662
 を本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。本明細書に示されているように、人工ｐＮＢエステラーゼを使用する方法は、特に、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷、圧力および反応時間を含む一定範囲の適切な反応条件下で行われ得る。いくつかの実施形態では、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼを使用する生体触媒プロセスに適切な反応条件は、（ａ）約２ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．１〜１０ｇ／Ｌの人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド；（ｃ）約０．０５〜０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液；（ｄ）約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ共溶媒；（ｅ）約６〜８のｐＨ；および／または（ｆ）約１０〜３５℃の温度を含み得る。さらに、人工ｐＮＢエステラーゼの選択、生体触媒の調製、ならびに前記方法を行うためのパラメータおよび反応条件に関するガイダンスは、以下の詳細な説明に記載されている。
５．詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、複数のポリペプチドを含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は互換的なものであり、限定的であることを意図するものではない。様々な実施形態の記載が用語「含む」を使用する場合、一部の場合には、用語「から本質的になる」または「からなる」を使用して実施形態を代わりに説明することができることを当業者であれば理解することが、さらに理解されるべきである。
上記一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものに過ぎず、本開示を制限するものではないことが理解されるべきである。本明細書で使用されるセクションの表題は構成目的のものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきではない。
５．１ 略語
遺伝的にコードされるアミノ酸に使用される略語は慣例的なものであり、以下の通りである：
Figure 2016503662
Figure 2016503662
三文字略語が使用される場合、「Ｌ」または「Ｄ」が明確に前に付いているか、またはその略語が使用される文脈から明らかではない限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）に関してＬ−立体配置か、またはＤ−立体配置かのいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α−炭素に関する配置を指定することなくアラニンを示すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれＤ−アラニンおよびＬ−アラニンを示す。一文字略語が使用される場合、大文字は、α−炭素に関してＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字は、α−炭素に関してＤ配置のアミノ酸を示す。例えば、「Ａ」はＬ−アラニンを示し、「ａ」はＤ−アラニンを示す。ポリペプチド配列が、一文字または三文字略語（またはこれらの混合）の文字列として示される場合、この配列は、一般的な慣例にしたがって、アミノ（Ｎ）→カルボキシ（Ｃ）方向で示される。
遺伝的コードヌクレオシドに使用される略語は慣例的なものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）。特に明記されない限り、略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個々にまたは一括にリボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであると特定され得る。核酸配列が一文字略語の文字列として示される場合、一般的な慣例にしたがって配列は５’から３’の方向に示され、リン酸は示されない。
５．２ 定義
本開示に関して、本明細書の説明で使用される技術用語および科学用語は、特に明確な定義がない限り、当業者によって一般に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものである。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書では、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２アミノ酸のポリマーを表すのに互換的に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２個以上のヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから完全に構成され得るか（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから完全に構成され得るか（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは一般に、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つ以上の非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含み得る。さらに、ポリヌクレオチドは一般に、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、１つ以上の改変核酸塩基および／または合成核酸塩基、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含み得る。好ましくは、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
本明細書で使用される場合、「ｐＮＢエステラーゼ活性」は、パラ−ニトロベンジルエステル基を加水分解してパラ−ニトロフェノールおよび前記エステルの対応する酸を形成する酵素活性を指す。
本明細書で使用される場合、「ｐＮＢエステラーゼ」は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する酵素を指し、天然に存在する（野生型）ｐＮＢエステラーゼ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｐＮＢエステラーゼ、および人為的操作によって作製された天然に存在しない人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドが挙げられ得る。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離することができ、人為的操作によって意図的に改変されていない配列である。
「組換え」または「人工」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、ある様式で改変された材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料であって、改変のない場合には天然に存在しないか、または天然に存在するものと同一であるが、合成物質からおよび／もしくは組換え技術を使用する操作によって生産もしくは生成された材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、特に、ネイティブな（非組換え）形態の細胞に見られない遺伝子を発現するか、または改変のない場合には異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセンテージ相同性」は、本明細書では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すのに互換的に使用され、比較ウインドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって、このパーセンテージを計算することができる。あるいは、両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアライメントする位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって、このパーセンテージを計算することができる。当業者であれば、２つの配列をアライメントさせるのに利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認識している。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性調査法、これらのアルゴリズムのコンピュータ制御による実行（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的な検査によって行うことができる（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）。配列同一性および配列類似性のパーセンテージを決定するのに適切なアルゴリズムの例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされる場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはこれを満たすクエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、同上）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するさらに長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、このワードヒットを各配列に沿って両方向に拡大する。ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチング残基のペアの報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか；負のスコア残基アライメントが１つ以上蓄積することにより、累積スコアが０以下になるか；またはいずれかの配列の末端に到達したら、ワードヒットの各方向への拡大を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されたデフォルトのパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される規定の配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列で非常に異なる配列をさらに含むことができるので、一般には、「比較ウインドウ」にわたる２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して局所領域の配列類似性を同定および比較することによって、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を実施する。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくものであり得、この場合、参照配列は、一次配列中に１つ以上の変化を有し得る配列である。例えば、「Ｘ１９３に対応する残基にアラニンを有する配列番号２に基づく参照配列」または「Ｘ１９３Ａ」は、Ｘ１９３における対応する残基（これは、配列番号２ではメチオニンである）がアラニンに変更された配列番号２の参照配列を指す。
「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して、参照配列と比較した場合に、２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０より長い連続した残基であり得、場合により３０、４０、５０、１００またはそれ以上の長いウインドウを含む。
「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウにわたって、多くの場合には少なくとも３０〜５０残基のウインドウにわたって参照配列と比較される場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、および８９〜９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較のウインドウにわたって、合計で参照配列の２０％以下となる欠失または付加を含む配列と比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、用語「実質的な同一性」は、２つのポリペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアライメントされる場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれ以上（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
「に対応する」、「を参照して」または「と比べて」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用される場合、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、特定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、人工ｐＮＢエステラーゼのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対してアライメントさせることができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、この配列がアライメントされている参照配列に対して行われる。
「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比べたポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の変化を指す。アミノ酸差異の位置は一般に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号２と比較したＸ１９３位の残基差異」は、配列番号２の１９３位に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の変化を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが１９３位でメチオニンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ１９３位の残基差異」は、配列番号２の１９３位に対応するポリペプチドの位置でのメチオニン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、人工ポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）の一文字識別子である）として示される。複数のアミノ酸が特定の残基位置に現れ得るいくつかの実施形態では、代替アミノ酸は、ＸｎＹ／Ｚ（ＹおよびＺは、代替アミノ酸残基を表す）の形式で記載され得る。一部の場合では（例えば、表２において）、本開示はまた、慣例的な表示法「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、人工ポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）によって表される特定のアミノ酸差異を提供する。さらに、一部の場合では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べた１個以上のアミノ酸残基差異を含み得、これは、参照配列に対して変更がなされる特定の位置のリストによって示される。
「保存的アミノ酸置換」は、ある残基を、類似側鎖を有する異なる残基で置換することを指し、したがって一般に、ポリペプチド中のアミノ酸を、同じかまたは類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを含む。一例として限定されないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンと置換することができ、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンと置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンと置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンと置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸と置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸と置換される。例示的な保存的置換を以下の表１に提供する。
Figure 2016503662
「非保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸を、側鎖特性が顕著に異なるアミノ酸に置換することを指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクに影響を与える。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸と置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸と置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸と置換された親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を除去することによる、ポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または人工ｐＮＢエステラーゼ酵素の改善された特性を保持しつつ、１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上または２０アミノ酸以上の除去であって、参照酵素を構成する全アミノ酸数の１０％までの除去、または参照酵素を構成する全アミノ酸数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とするものであり得る。様々な実施形態では、欠失は連続的なセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
「挿入」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を付加することによる、ポリペプチドの改変を指す。いくつかの実施形態では、改善された人工ｐＮＢエステラーゼ酵素は、天然に存在するｐＮＢエステラーゼポリペプチドへの１アミノ酸以上の挿入、ならびに他の改善されたｐＮＢエステラーゼポリペプチドへの１アミノ酸以上の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。当技術分野で公知であるように、本明細書で使用される挿入は、融合タンパク質を含む。参照ポリペプチドにおいて、挿入は、連続的なアミノ酸セグメントであり得るか、またはアミノ酸の１つ以上によって隔てられ得る。
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上、および全長ｐＮＢエステラーゼポリペプチド、例えば、配列番号２の参照人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％までであり得る。
「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の混入物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から回収または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたｐＮＢエステラーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態（例えば、溶解産物または単離された調製物）で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態では、改善されたｐＮＢエステラーゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量基準で、これが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、存在する高分子種の少なくとも約５０モルパーセントまたは約５０重量パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なｐＮＢエステラーゼ組成物は、この組成物中に存在するすべての高分子種の約６０モル％または重量％以上、約７０モル％または重量％以上、約８０モル％または重量％以上、約９０モル％または重量％以上、約９５モル％または重量％以上、および約９８モル％または重量％以上を構成する。いくつかの実施形態では、目的種は、本質的に均一になるまで精製され（すなわち、混入物種は、慣例的な検出方法によって組成物中に検出することができない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択性」は、１つの立体異性体の別の立体異性体に対する化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。立体選択性は、部分的（この場合、ある立体異性体の形成が他の立体異性体に対して有利である）なものであり得るか、または完全（この場合、わずか１つの立体異性体が形成される）なものであり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、両方の合計における一方のエナンチオマーの分率（一般にパーセンテージとして報告される）である、エナンチオ選択性と称される。あるいは、当技術分野では、エナンチオ選択性は、式［主要なエナンチオマー−副次的なエナンチオマー］／［主要なエナンチオマー＋副次的なエナンチオマー］によって、これから計算されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として一般的に報告される（一般にパーセンテージとして）。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、あ立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの分率（一般にパーセンテージとして報告される）であるジアステレオ選択性と称され、あるいは、一般に、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。
「改善された酵素特性」は、参照ｐＮＢエステラーゼと比較した場合に、何らかの酵素特性の改善を示すｐＮＢエステラーゼポリペプチドを指す。本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドについて、比較は一般に、配列番号４の参照人工ｐＮＢエステラーゼ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態では、参照ｐＮＢエステラーゼは、別の人工ｐＮＢエステラーゼまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼである場合がある。改善が望まれる酵素特性としては、限定されないが、酵素活性（基質の変換率の観点から表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、生成物選択性、ｐＨ活性プロファイル、阻害剤（例えば、基質または生産物阻害）に対する不応性、および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。
「増加した酵素活性」は、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照ｐＮＢエステラーゼ酵素と比較して、増加した特異的活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）、または基質の生成物への増加した変換率（例えば、出発量の基質の、特定量のｐＮＢエステラーゼを使用した、特定時間内での生成物への変換率）によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例において提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関係する任意の特性が影響され得、その変化は酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の改善は、対応する野生型ｐＮＢエステラーゼ酵素の酵素活性の約１．２倍の酵素活性から、天然に存在するｐＮＢエステラーゼ、またはそのｐＮＢエステラーゼポリペプチドがそれに由来する別の人工ｐＮＢエステラーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ以上の酵素活性までであり得る。ｐＮＢエステラーゼ活性は、反応物または生成物の分光光度的特性の変化をモニタリングすることなどによって、標準的なアッセイのいずれか１つによって測定することができる。いくつかの実施形態では、生成される生成物の量は、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、その後のｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）などを用いた誘導体化によって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書に詳細にさらに記載されるように、酵素の規定の調製、一連の条件下での規定のアッセイ、および１つ以上の規定の基質を使用して行われる。一般に、溶解産物が比較される場合、宿主細胞によって産生され、溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小限にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞が使用されると共に、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変換を指す。「変換率」は、特定条件下である時間の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換率」として表すことができる。
「熱安定」は、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって高温（例えば、４０〜８０℃）に曝露した後に、野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するｐＮＢエステラーゼポリペプチドを指す。
「溶媒安定」は、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒、（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、ブチルアセテート、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露した後に、野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するｐＮＢエステラーゼポリペプチドを指す。
「熱および溶媒安定」は、熱安定および溶媒安定の両方であるｐＮＢエステラーゼポリペプチドを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、本明細書では、核酸ハイブリッドが安定である条件を指すのに使用される。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映されている。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６８：７６１−７７７；Ｂｏｌｔｏｎら、１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８８９３−８８９７；Ｆｒｅｉｅｒら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｋｉｅｒｚｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７８４０−７８４６；Ｒｙｃｈｌｉｋら、１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：６４０９−６４１２（ｅｒｒａｔｕｍ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｓｕｐｒａ）；Ｓｕｇｇｓら、１９８１，Ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら、ｅｄｓ．），ｐｐ．６８３−６９３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：２２７−２５９を参照のこと。すべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、規定条件、例えば、中ストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件などの下で、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼ酵素をコードする配列の相補体にハイブリダイズする。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける、洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低ストリンジェンシーの条件下で実施され、その後に、様々なストリンジェンシーではあるが、より高ストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「中ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドと約９０％超の同一性を伴って、標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合するのを可能にする条件を指す。例示的な中ストリンジェントな条件は、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中のハイブリダイゼーションと等価な条件であって、その後４２℃で、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中の洗浄が続く。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、規定のポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で求めた場合に、熱融解温度Ｔｍから約１０℃以下である条件を一般に指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で、０．０１８ＭのＮａＣｌ中で安定ではない場合、これは、本明細書で意図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳに等価な条件でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃で、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中の洗浄によってもたらすことができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃で、０．１％（ｗ：ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中のハイブリダイジング、および６５℃で、０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中の洗浄と等価な条件でのハイブリダイジングである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中ストリンジェントな条件は、上記に引用された参考文献に記載されている。
「異種」ポリヌクレオチドは、実験室技術によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作にかけられ、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、特定の生物内で優先的に使用されるものへと変化することを指す。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義語」コドンまたは「同義」コドンと称されるいくつかのコドンによって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高くなり得る。いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現させるのに選択された宿主生物体からの最適な産生のために最適化されたコドンであり得る。
「好ましい、最適な、高コドン使用頻度バイアスのコドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、１個の遺伝子、共通の機能または起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、またはこれらの組み合わせに関して決定することができる。遺伝子発現のレベルと共にその頻度が増加するコドンは一般に、発現にとっての最適コドンである。例えば、クラスター分析または対応分析を使用する多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）、およびコドン選択を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子中で使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（ＧＣＧ ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｊ．Ｏ，１９９８，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：３７２−７３；Ｓｔｅｎｉｃｏら、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２２４３７−４６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．，１９９０，Ｇｅｎｅ ８７：２３−２９を参照のこと）。拡大している生物リストについて、コドン使用頻度表が利用可能である（例えば、Ｗａｄａら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８；Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２；Ｄｕｒｅｔら、ｓｕｐｒａ；Ｈｅｎａｕｔ ａｎｄ Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”１９９６，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｅｄｓ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠することができる。これらのデータセットは、発現タンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，Ｄ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２５９−２８１；Ｔｉｗａｒｉら、１９９７，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：２６３−２７０を参照のこと）。
「制御配列」は、本明細書では、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に固有でも、異種でもあり得る。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との制御配列のライゲーションを促進する特定の制限部位を導入するために、リンカーを用いて提供され得る。
「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドと相対的なある位置で制御配列が適切に配置され（すなわち、機能的な関係で）、その結果、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節する配置として定義される。
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、転写制御配列を含有し、これは、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する。変異プロモーター、短縮プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含むプロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と同種または異種の細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
「適切な反応条件」は、本開示のｐＮＢエステラーゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（２）の化合物（１）への変換）下での生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は詳細な説明において提供されており、実施例によって例示されている。
「化合物負荷」または「酵素負荷」または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
生体触媒媒介プロセスとの関連における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示される方法における人工ｐＮＢエステラーゼ生体触媒の例示的な基質は、化合物（２）である。
生体触媒媒介プロセスとの関連における「生成物」は、生体触媒が作用した結果生じる化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示される方法における人工ｐＮＢエステラーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物（１）である。
「保護基」は、分子中の反応性官能基に付加すると、官能基の反応性を遮蔽、減少または抑制する原子団を指す。一般には、保護基を所望により合成過程中に選択的に除去し得る。保護基の例は、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”４ｔｈＥｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）およびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−８，１９７１−１９９６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに見られ得る。保護基を有し得る官能基としては、限定されないが、ヒドロキシ基、アミノ基およびカルボキシ基が挙げられる。
５．３ 人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド
本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリペプチドの使用方法を提供する。上記説明がポリペプチドに関するものである場合、それは、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明していると理解すべきである。
本開示は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８１９１５．１、ＧＩ：４６８０４６のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼポリペプチドから作られた人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドに関する。本開示の人工ｐＮＢエステラーゼは、化合物（２）のｐＮＢ保護基質を、対応する化合物（１）の脱保護生成物イミペネムに変換するのを可能にするアミノ酸残基置換によって操作されている。重要なことに、本開示は、ｐＮＢ保護カルバペネム基質の脱保護に関して、酵素活性、生成物選択性および安定性を増加させ得る人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのアミノ酸残基位置および対応するアミノ酸残基置換を同定する。
構造に基づく合理的な配列ライブラリー設計を使用して定向進化法によって操作し、化合物（２）のｐＮＢ保護イミペネム前駆体の、それに対応する化合物（１）の非保護生成物イミペネムへの変換に基づく活性アッセイを使用して、改善された機能特性についてスクリーニングすることによる、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの特定の残基位置および置換の同定。具体的には、スキーム１（上記）に示されているような、基質化合物（２）の生成物化合物（１）への変換。適切な反応条件下で、化合物（２）のｐＮＢ保護イミペネム基質を生成物化合物（１）に効率的に変換するために、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを作り出した。
本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの特定の構造的特徴および構造−機能相関情報はまた、他のｐＮＢ保護カルバペネム化合物（化合物（２）以外）を対応するカルバペネム生成物化合物（化合物（１）以外）に選択的に脱保護し得る人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの合理的設計および定向進化を可能にする。いくつかの実施形態では、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、ｐＮＢ保護カルバペネム化合物（これは、化合物（２）の構造類似体である）を、それに対応する脱保護カルバペネム生成物化合物（これは、化合物（１）の構造類似体である）に変換することができる。
化合物（２）の化合物（１）への効率的な変換に適切な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、配列番号２の参照人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのアミノ酸配列と比較した１個以上の残基差異を有する。残基差異は、酵素活性、酵素安定性、および化合物（３）のβ−ラクタム開環二酸などの望ましくない副生成物の形成に対する抵抗性を含む酵素特性の増強に関連する。
Figure 2016503662
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、同量の酵素を用いた規定時間内におけるｐＮＢ保護基質化合物（２）の脱保護生成物化合物（１）への変換について、配列番号４の参照人工ｐＮＢエステラーゼと比較して増加した活性を示す。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、適切な反応条件下で、配列番号４によって表される参照人工ポリペプチドと比較して少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍またはそれ以上の活性を有する。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、適切な反応条件下で、基質の存在について配列番号４の参照ポリペプチドと比べて増加した許容性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。したがって、いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、適切な反応条件下で、少なくとも約１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１２５ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌまたは約２００ｇ／Ｌまたはそれ以上の基質負荷濃度下で、少なくとも約少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の変換率で、約７２時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下または約２４時間以下の反応時間で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、２５ｇ／Ｌの基質負荷および１５℃の温度で、２時間で、基質化合物（２）の少なくとも７０％を生成物化合物（１）に変換することができる。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１またはそれ以上の生成化合物（１）：副生成物化合物（３）選択比で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。
人工ポリペプチドの上記改善された特性が変換を行う適切な反応条件は、以下および実施例でさらに記載されているように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、緩衝液、共溶媒、ｐＨおよび／または条件（温度および反応時間を含む）に関して決定され得る。
本開示は、化合物（２）の基質（イミペネムのｐＮＢ保護前駆体）を対応する化合物（１）の生成物イミペネムに変換することができる構造的特徴を有する５９個の例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを提供する。本開示は、本開示に添付の電子的な配列表ファイル（これは、参照により本明細書に組み込まれる）において、５９個の例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの配列構造を配列番号３〜１２０として提供する。奇数番号の配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数番号の配列番号によって提供されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。本開示はまた、表２において、特定のアミノ酸配列の特徴を人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの機能活性と相関させる配列構造情報を提供する。この構造−機能相関情報は、配列番号２の参照人工ポリペプチドと比べた特定のアミノ酸残基差異、および関連する配列番号３〜１２０の５９個の例示的な人工ｐＮＢエステラーゼの実験的に決定された活性データの形式で示されている。アミノ酸残基差異は、配列番号２の参照配列（これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の野生型ｐＮＢエステラーゼの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＡ８１９１５．１、ＧＩ：４６８０４６）と比べて以下の７個のアミノ酸残基差異：Ｉ６０Ｖ、Ｌ１４４Ｍ、Ｐ３１７Ｓ、Ｈ３２２Ｒ、Ｌ３３４Ｓ、Ｍ３５８ＶおよびＹ３７０Ｆを有する）との比較に基づくものである。表２に記されているように、配列番号２の人工ポリペプチドは、化合物（２）の化合物（１）への変換について、検出可能な活性を有しない。配列番号４の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド（これは、配列番号２と比較して１個のアミノ酸差異Ｍ１９３Ａを有する）は、化合物（２）の化合物（１）への変換について、検出可能な活性を有することが見出された。相対活性測定の参照としてこれを使用した。ハイスループット（ＨＴＰ）アッセイにおいて、設定時間および温度にわたって、化合物（１）のイミペネム生成物への基質化合物（２）の変換について、各例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの相対ｐＮＢエステラーゼ活性を、配列番号４の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのｐＮＢエステラーゼ活性と比較して決定した。表および実施例に記されているアッセイ反応条件にしたがって、約２５０μＬ容量／ウェルの９６ウェルプレートフォーマットで大腸菌明細胞溶解物のアッセイを使用して、表２の活性改善値を決定した。
Figure 2016503662
Figure 2016503662
アミノ酸配列の調査および表２の５９個の例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの結果によれば、改善された特性（増加した活性、選択性および／または安定性）は、以下の残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した１個以上の残基差異に関連する。これらの各位置における配列番号２と比較した特定のアミノ酸差異であって、改善された特性に関連するアミノ酸差異としては、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２によって表される人工ｐＮＢエステラーゼと比較した残基差異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した特定のアミノ酸残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。
当業者であれば認識するように、表２に開示されている残基差異は、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド（これらはすべて、化合物（２）を化合物（１）に変換するためのｐＮＢエステラーゼ活性を維持する）のｐＮＢエステラーゼ活性および／または生成物選択性に対して顕著な悪影響を及ぼさない。したがって、当業者であれば、本明細書に開示される残基位置における残基差異を個別にまたは様々な組み合わせで使用して、ｐＮＢ保護カルバペネム化合物（例えば、化合物（２））およびその構造類似体の、その対応する脱保護カルバペネム化合物（例えば、化合物（１）イミペネム）への変換に関する所望の機能特性（特に、ｐＮＢエステラーゼ活性、選択性および安定性を含む）を有する人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを生産し得ると理解するであろう。
本明細書で提供されるガイダンスを考慮して、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０の例示的な人工ポリペプチドはいずれも、例えば表２における他のポリペプチドとの様々なアミノ酸差異と本明細書に記載される他の残基位置との新たな組み合わせを追加することによる次の進化ラウンドによって、他の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列として使用され得ることをさらに意図する。先の進化ラウンドを通じて変化せずに維持された残基位置におけるアミノ酸差異を含めることによって、さらなる改善がもたらされ得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性と、場合により、ｐＮＢ保護基質化合物（２）の脱保護生成物化合物（１）への変換について、配列番号４の参照ポリペプチドと比較して改善された特性とを有する人工ポリペプチドであって、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性と、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した特定のアミノ酸残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性と、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１９３、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６およびＸ３６２における配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／ＬおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／ＶおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の同一性と、位置Ｘ１９３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖから選択される残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｘ１９３における配列番号２と比較したアミノ酸残基差異は、Ｘ１９３Ｖである。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較したアミノ酸差異Ｘ１９３Ｖとを有するアミノ酸配列を含み、位置Ｘ２１９およびＸ２７３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ２１９Ｌ／ＶおよびＸ２７３Ａ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、位置Ｘ１０８およびＸ３６２における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／ＹおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む。またさらなる実施形態では、人工ポリペプチドは、位置Ｘ１１５における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１１５Ｑ／Ｗから選択される残基差異をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性と、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した特定の残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４、１２、２０、３６、３８、５４、７６、８０、８８、１１２および１１６から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号５４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号７６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８０である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１６である。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性と、配列番号２と比較した残基差異の組み合わせであって、（ａ）Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９ＶおよびＸ２７３Ａ；（ｂ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｄ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｓ；（ｃ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；（ｄ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｌ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；ならびに（ｅ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑから選択される残基差異の組み合わせとを有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上（または本明細書の他の箇所）に開示されるｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、他の残基位置におけるさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼは、配列番号２と比較した１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のさらなる残基差異を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２と比較した１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の残基差異をさらに有する。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％の同一性と、配列番号２と比較した１個以上のアミノ酸残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／ＶおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上のアミノ酸残基差異とを有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／ＬおよびＸ３２１Ａから選択される１個以上の残基差異をさらに含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ４９Ｇ、Ｘ９４Ｇ、Ｘ９６Ｓ、Ｘ２２７Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２６７Ｒ、Ｘ２７１Ｌ、Ｘ２７４Ｌ、Ｘ３１３Ｆ、Ｘ３２２Ｃ／Ｙ、Ｘ３４３Ｖ、Ｘ３５６Ｒ、Ｘ３５９Ａ、Ｘ３９８Ｌ、Ｘ４１２Ｅ、Ｘ４３７Ｔ、Ｘ４６４ＡおよびＸ４８１Ｒから選択される残基差異をさらに含み得る。
配列番号２の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＡ８１９１５．１、ＧＩ：４６８０４６）と比較して以下の７個のアミノ酸差異：Ｉ６０Ｖ、Ｌ１４４Ｍ、Ｐ３１７Ｓ、Ｈ３２２Ｒ、Ｌ３３４Ｓ、Ｍ３５８ＶおよびＹ３７０Ｆを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、本明細書に開示される（すなわち、表２の配列番号４〜１２０の例示的なポリペプチドに開示される）配列番号２と比較したアミノ酸差異のいずれかとを有するアミノ酸配列を含むが、前記人口ポリペプチド中のアミノ酸配列が、Ｘ６０、Ｘ１４４、Ｘ３１７、Ｘ３２２、Ｘ３３４、Ｘ３５８およびＸ３７０から選択される位置における配列番号２と比較した残基差異を含まない人工ポリペプチドを提供する。
当業者であれば認識するように、いくつかの実施形態では、選択される１個の上記残基差異または上記残基差異の組み合わせを、人工ｐＮＢエステラーゼ中でコア配列（または特徴）として保存することができ、他の残基位置におけるさらなる残基差異をコア配列に組み込んで、改善された特性を有するさらなる人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを作製することができる。したがって、１個の上記残基差異または上記残基差異のサブセットを含有する任意の人工ｐＮＢエステラーゼについて、本開示は、１個の残基差異または残基差異のサブセットと、さらに、本明細書に開示される他の残基位置における１個以上の残基差異とを含む他の人工ｐＮＢエステラーゼを意図すると理解すべきである。一例として限定されないが、残基位置Ｘ１９３における残基差異を含む人工ｐＮＢエステラーゼは、他の残基位置、例えばＸ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における１個以上の残基差異をさらに取り込み得る。別の例は、残基位置Ｘ２７３における残基差異を含む人工ｐＮＢエステラーゼであって、他の残基位置、例えばＸ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における１個以上の残基差異をさらに含み得る人工ｐＮＢエステラーゼである。上記各実施形態について、人工ｐＮＢエステラーゼは、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択されるさらなる残基差異をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比べて少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の活性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる。いくつかの実施形態では、配列番号４の参照ポリペプチドの活性と比べて少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の活性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される位置における配列番号４と比較した１個以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含み、前記特定の残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、表２に開示されている反応条件Ａである。いくつかの実施形態では、配列番号４と比べて少なくとも１．２倍の活性で、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができる人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７８、８２、８４、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６および１２０から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ｐＮＢエステラーゼは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０の１つとの少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性と、表２において提供される配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のいずれか１つに存在する配列番号２と比較したアミノ酸残基差異とを有するアミノ酸配列を含む。
上記で特定された残基位置に加えて、本明細書に開示される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドはいずれも、他の残基位置、すなわちＸ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２以外の残基位置における配列番号２と比べた他の残基差異をさらに含み得る。これらの他の残基位置における残基差異は、ポリペプチドがｐＮＢエステラーゼ反応（例えば、化合物（２）の化合物（１）への変換）を行う能力に悪影響を及ぼさずに、アミノ酸配列のさらなるバリエーションを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのいずれか１つのアミノ酸残基差異に加えて、配列は、他のアミノ酸残基位置における配列番号２と比較した１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１１個、１〜１２個、１〜１４個、１〜１５個、１〜１６個、１〜１８個、１〜２０個、１〜２２個、１〜２４個、１〜２６個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個の残基差異をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、参照配列と比較したアミノ酸残基差異の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個の残基位置であり得る。これらの他の位置における残基差異は、保存的変化または非保存的変化を含み得る。いくつかの実施形態では、残基差異は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼポリペプチドまたは配列番号２の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと比較して、保存的置換および非保存的置換を含み得る。
米国特許第５，９０６，９３０号および米国特許第５，９４５，３２５号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）ならびに以下の刊行物（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）では、他の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドについて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼまたは配列番号２の人工ポリペプチドと比べた他の位置におけるアミノ酸残基差異、および酵素機能に対するこれらの差異の効果が記載されている：Ｍｏｏｒｅら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７（１９９６）；Ｍｏｏｒｅら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７（１９９７）；Ｇｉｖｅｒら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２８０９−１２８１３（Ｏｃｔ．１９９８）。
したがって、いくつかの実施形態では、配列番号２の配列と比較したアミノ酸差異の１個以上はまた、Ｘ４９、Ｘ９４、Ｘ９６、Ｘ２２７、Ｘ２５１、Ｘ２６７、Ｘ２７１、Ｘ２７４、Ｘ３１３、Ｘ３２２、Ｘ３４３、Ｘ３５６、Ｘ３５９、Ｘ３９８、Ｘ４１２、Ｘ４３７、Ｘ４６４およびＸ４８１から選択される残基位置において、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドに導入され得る。特に、上記位置におけるアミノ酸残基は、以下から選択され得る：Ｘ４９Ｇ、Ｘ９４Ｇ、Ｘ９６Ｓ、Ｘ２２７Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２６７Ｒ、Ｘ２７１Ｌ、Ｘ２７４Ｌ、Ｘ３１３Ｆ、Ｘ３２２Ｃ／Ｙ、Ｘ３４３Ｖ、Ｘ３５６Ｒ、Ｘ３５９Ａ、Ｘ３９８Ｌ、Ｘ４１２Ｅ、Ｘ４３７Ｔ、Ｘ４６４ＡおよびＸ４８１Ｒ。これらの残基位置におけるアミノ酸残基の選択、および望ましい酵素特性に対するそれらの効果に関するガイダンスは、引用されている参考文献に見られ得る。
いくつかの実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載される人工ポリペプチドのいずれかの断片であって、その人工ｐＮＢエステラーゼの機能活性および／または改善された特性を保持する断片を含む人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、適切な反応条件下における化合物（２）の化合物（１）への変換について、ｐＮＢエステラーゼ活性を有するポリペプチド断片であって、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド、例えば配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含むポリペプチド断片を提供する。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド、例えば配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０の例示的な人工ポリペプチドのいずれか１つの欠失を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびすべての実施形態について、アミノ酸配列は、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、３アミノ酸以上、４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、８アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上または２０アミノ酸以上の欠失であって、全アミノ酸数の１０％まで、全アミノ酸数の１０％まで、全アミノ酸数の２０％までまたは全アミノ酸数の３０％までの欠失を含み得、この場合、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼの、関連する機能活性および／または改善された特性は維持されている。いくつかの実施形態では、欠失は、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、欠失の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、欠失は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド、例えば配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０の例示的な人工ポリペプチドのいずれか１つと比較して挿入を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示のｐＮＢエステラーゼポリペプチドのそれぞれのおよびすべての実施形態について、挿入は、１アミノ酸以上、２アミノ酸以上、３アミノ酸以上、４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、８アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、４０アミノ酸以上または５０アミノ酸以上を含み得、この場合、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼの関連する機能活性および／または改善された特性は維持されている。挿入は、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端または内部部分に対するものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される配列と、場合により、１個または数個（例えば、３個、４個、５個まで、または１０個まで）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換とを含むアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、前記アミノ酸配列が、以下の刊行物に開示されている例示的な人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドアミノ酸配列のいずれかと同一ではない（すなわち、それらを除く）人工ポリペプチドを提供する：米国特許第５，９０６，９３０号；米国特許第５，９４５，３２５号；Ｍｏｏｒｅら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７（１９９６）；Ｍｏｏｒｅら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７（１９９７）；およびＧｉｖｅｒら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２８０９−１２８１３（Ｏｃｔ．１９９８）。
上記実施形態では、人工ポリペプチドの適切な反応条件は、表２、実施例および本明細書の他の箇所に記載されているものであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の人工ポリペプチドは、人工ポリペプチドが他のポリペプチド、例えば一例として限定されないが、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例えば、金属に結合するためのＨｉｓタグ）および細胞局在化シグナル（例えば、分泌シグナル）に融合された融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、本明細書に記載される人工ポリペプチドは、他のポリペプチドに融合させて、または他のポリペプチドに融合させずに使用され得る。
本明細書に記載される人工ポリペプチドは、遺伝的にコードされたアミノ酸に限定されないことを理解すべきである。遺伝的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されるポリペプチドは、全体的または部分的に、天然に存在する非コードアミノ酸および／または非コード合成アミノ酸から構成され得る。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得る一般的に見られる特定の非コードアミノ酸としては、限定されないが、遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アントリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられる。本明細書に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなる非コードアミノ酸は、当業者には明らかであろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ａｔ ｐｐ．３−７０およびそこで引用されている参考文献（これらはすべて、参照により組み込まれる）に示されている様々なアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ−立体配置またはＤ−立体配置のいずれかであり得る。
当業者であれば、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基も、本明細書に記載される人工ポリペプチドを含み得ることを認識するであろう。この場合に芳香族のカテゴリーに属するこのような保護アミノ酸の非限定的な例としては、限定されないが、Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）が挙げられる（保護基は括弧内に記載されている）。
立体配座的に制限された非コードアミノ酸であって、本明細書に記載される人工ポリペプチドを構成し得る非コードアミノ酸としては、限定されないが、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられる。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、固体支持体、例えば膜、樹脂、固体担体または他の固相材料上に提供され得る。固体支持体は、有機ポリマー、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、スフィア、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的な平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部または他の入れ物、容器、特徴または位置の形態で形成され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドは、配列番号４の参照ポリペプチドと比べて改善された活性および／または他の改善された特性を保持するように、固体支持体上に固定化され得る。このような実施形態では、固定化された人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、ｐＮＢ保護基質化合物（２）または他の構造的に類似するｐＮＢ保護基質化合物を、脱保護生成物化合物（１）イミペネムまたは対応する構造類似体生成物カルバペネムに生体触媒により変換するのを促進することができ、反応完了後に（例えば、ポリペプチドが固定化されたビーズを保持することによって）容易に保持され、次いで、次の反応において再生またはリサイクルされる。このような固定化酵素プロセスは、さらなる効率化およびコスト削減を可能にする。したがって、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを使用する方法はいずれも、固体支持体上に結合または固定化された同じ人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを使用して行われ得ることをさらに意図する。
酵素の固定化方法は、当技術分野で周知である。人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、非共有結合または共有結合され得る。酵素を固体支持体（例えば、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲートおよび固定化するための様々な一般的方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｙｉら、“Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｅａｄｓ，”Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（５）：８９５−８９８（Ｍａｙ ２００７）；Ｍａｒｔｉｎら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ（Ｓ）−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（４）：８４３−８５１（Ｓｅｐｔ．２００７）；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌ−ｇｅｌ／ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４（Ａｐｒ．２０１０）；Ｔｒｕｐｐｏら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣＡＬ−Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ Ｏｄａｎａｃａｔｉｂ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏら、“Ｅｐｏｘｙ ｓｅｐａｂｅａｄｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｏｘｙ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｖｅｒｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １８（３）：６２９−３４（２００２）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（これらの開示はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本開示の人工ｐＮＢエステラーゼを固定化するのに有用な固体支持体としては、限定されないが、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂が挙げられる。本開示の人工ｐＮＢエステラーゼを固定化するのに有用な例示的な固体支持体としては、限定されないが、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃおよび以下の様々な種類のＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含むＳＥＰＡＢＥＡＤｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、人工ポリペプチドは、例えば、単離された調製物、実質的に精製された酵素、前記酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、ならびに／またはこのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物などの様々な形態であり得る。以下でさらに議論されるように、酵素は、凍結乾燥、噴霧乾燥、沈殿され得るか、または粗製ペーストの形態であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される人工ポリペプチドは、キットの形態で提供され得る。キット中の酵素は個別に存在し得るか、または複数の酵素として存在し得る。キットは、酵素反応を行うための試薬、酵素活性を評価するための基質、および生成物を検出するための試薬をさらに含み得る。キットはまた、試薬ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含み得る。
いくつかの実施形態では、人工ポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に別個の場所に配置されたアレイの形態で固体支持体上に提供され得る。アレイは、ポリペプチドによる変換について、様々な基質化合物を試験するのに使用され得る。試薬のロボット送達が処理可能な様々な場所において、または検出方法および／もしくは機器によって処理可能な様々な場所において、複数の支持体がアレイ上に配置され得る。基板、例えば膜、ビーズ、ガラスなどへの様々なコンジュゲーション方法は、特に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；（２００８），ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のキットは、異なる処理可能な位置において、複数の様々な本明細書に開示される人工ポリペプチドを含むアレイを含み、前記様々なポリペプチドは、参照配列の様々な変異体であって、それぞれが少なくとも１つの異なる改善された酵素特性を有する様々な変異体である。複数の人工ポリペプチドを含むこのようなアレイおよびそれらの使用方法は、例えば、国際公開第２００９００８９０８号に記載されている。
５．４ 人工ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、前記ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製し得る。人工ｐＮＢエステラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するｐＮＢエステラーゼポリペプチドを発現させ得る。
当業者には明らかであるように、タンパク質配列、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知見の利用可能性により、対象ポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明が提供される。同一のアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、改善されたｐＮＢエステラーゼ酵素をすべてがコードする極端に多数の核酸が作られることを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列の知見を有すれば、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で、１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の様々な核酸を作ることができるであろう。この点において、本開示は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって、本明細書に記載されるポリペプチドをコードして作製することができる、ポリヌクレオチドのそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを特に意図し、すべてのこのようなバリエーションは、表２に示されているアミノ酸配列を含めて、本明細書に記載される任意のポリペプチドについて具体的に開示されており、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０として配列表（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されていると見なされるべきである。
様々な実施形態では、コドンは、タンパク質が産生されている宿主細胞に合うように選択されることが好ましい。例えば、細菌中で使用される適切なコドンは、細菌内での発現に使用され；酵母中で使用される適切なコドンは、酵母内での発現に使用され；哺乳動物で使用される適切なコドンは、哺乳動物細胞での発現に使用される。いくつかの実施形態では、天然の配列は適切なコドンを含むため、および適切なコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要とされない場合があるため、ｐＮＢエステラーゼのコドン使用頻度を最適化するのに、すべてのコドンが置換される必要はない。したがって、ｐＮＢエステラーゼ酵素をコードする、コドンが最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超のコドン位置で適切なコドンを含有し得る。
上記のように、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性（例えば、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する能力）と共にｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性と、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２の参照ポリペプチドと比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した特定の残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４、１２、２０、３６、３８、５４、７６、８０、８８、１１２および１１６から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号５４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号７６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８０である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１６である。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性と共にｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性と、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１９３、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６およびＸ３６２における配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／ＬおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２の参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性と、少なくとも、配列番号２と比較した残基差異の組み合わせであって、（ａ）Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９ＶおよびＸ２７３Ａ；（ｂ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｄ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｓ；（ｃ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；（ｄ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｌ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；ならびに（ｅ）Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑから選択される残基差異の組み合わせとを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のいずれか１つから選択される参照ポリペプチドとの少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、前記アミノ酸配列が、表２に列挙されている配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０のポリペプチド配列のいずれか１つに含まれる配列番号２と比較した残基差異セットのいずれか１つを含む人工ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることができ、本明細書に記載される改善された特性の１つ以上と共にｐＮＢエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異を有するアミノ酸配列を含むｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードし、場合により、配列番号２と比較した特定の残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするが、人工ｐＮＢエステラーゼをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９から選択される。
本明細書における人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現が得られるように様々な方法で操作され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために１つ以上の制御配列が存在する発現ベクターとして提供することができる。発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが望ましいかまたは必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。ガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”３ｒｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，ａｎｄ ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ２００６に提供されている。
いくつかの実施形態では、制御配列としては、特に、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。適切なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を指令するのに適切なプロモーターとしては、大腸菌ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られたプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン−様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）の遺伝子から得られたプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異プロモーター、短縮プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列）であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のターミネーターを本発明で使用し得る。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ α−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２（上記）に記載されている。
制御配列はまた、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能的な任意のリーダー配列を使用し得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するシグナルとして転写時に宿主細胞によって認識される配列）であり得る。選択される宿主細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列を本発明で使用し得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ α−グルコシダーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １５：５９８３−５９９０に記載されている。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域であって、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるシグナルペプチドコード領域であり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳読み枠内で天然で連結されているシグナルペプチドコード領域を本来的に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、このコード配列と起源が異なるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。選択される宿主細胞の分泌経路に発現したポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード領域を、人工ポリペプチドの発現に使用し得る。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７ マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５７：１０９−１３７に記載されている。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であり得る。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来し得る。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合では、チモーゲン）と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得られ得る（国際公開第９５／３３８３６号）。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置される。
宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めた化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーターシステムが挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１システムが挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡ α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
別の態様では、本開示はまた、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターおよびターミネーターなどの１つ以上の発現調節領域と、複製起点などとを、これらが導入される宿主の種類に応じて含む組換え発現ベクターを対象とする。上記様々な核酸および制御配列を一緒に結合させて、１つ以上の便利な制限部位（これは、このような部位において、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする）を含み得る組換え発現ベクターを生産し得る。あるいは、本開示の核酸配列は、該核酸配列、またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現させ得る。発現ベクターの作製では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、ベクター中に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、そして、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に一般に依存するであろう。ベクターは、直鎖プラスミドまたは閉環状プラスミドであり得る。
発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター（例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体または人工染色体）であり得る。ベクターは、自己複製を保証するための何らかの手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されるとゲノムに組み込まれて、これが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中、またはトランスポゾン中に導入される全ＤＮＡを一緒に含有する１つのベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用し得る。
発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを与える遺伝子である。細菌性選択可能マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）、もしくはテトラサイクリン耐性などを付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞内で使用するための選択可能マーカーとしては、限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞で使用するための実施形態としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。
別の態様では、本開示は、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記ポリヌクレオチドが、前記宿主細胞においてｐＮＢエステラーゼ酵素を発現させるための１つ以上の制御配列に作動可能に連結されている宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現させるのに使用するための宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されないが、細菌性細胞、例えば、大腸菌細胞、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞など；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））など；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞など；ならびに植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１である。
したがって、別の態様では、本開示は、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドの発現に適切な条件下で、前記人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含み得る方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載されるように、発現したｐＮＢエステラーゼポリペプチドを単離または精製することをさらに含み得る。
上記宿主細胞に適切な培地および成長条件は、当技術分野で周知である。ｐＮＢエステラーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術としては、特に、電気穿孔、微粒子銃粒子ボンバードメント、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書の実施形態について、人工ポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドは、当業者によって使用される方法を使用して得られ得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｚｏｃｋら、“Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｎｂＡ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｇｅｎｅ １５１：３７−４３（１９９４）および米国特許第５，４６８，６３２号に開示されており、改善された安定性を有する人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを作製する方法は、米国特許第５，９０６，９３０号および米国特許第５，９４５，３２５号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）ならびに以下の刊行物（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている：Ｍｏｏｒｅら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｑｕｅｏｕｓ−ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８−４６７（１９９６）；Ｍｏｏｒｅら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒａｎｄｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７（１９９７）；Ｇｉｖｅｒら、“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒａｓｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１２８０９−１２８１３（Ｏｃｔ．１９９８）。
本明細書に開示される特性を有する人工ｐＮＢエステラーゼは、天然に存在するｐＮＢエステラーゼまたは人工ｐＮＢエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載される突然変異生成法および／または定向進化法に供することによって得られ得る。例示的な定向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されている突然変異生成法および／またはＤＮＡシャッフリングである。使用し得る他の定向進化法として、特に、ジグザグ伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ再結合（Ｚｈａｏら、１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）、突然変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）、およびカセット突然変異生成法（Ｂｌａｃｋら、１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９）が挙げられる。本明細書の目的に有用な突然変異生成法および定向進化技術は、以下の参考文献にも記載されている：Ｌｉｎｇ，ら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，”Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３１５−３１９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号。すべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
突然変異生成処理に従って得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する人工ｐＮＢエステラーゼについてスクリーニングし得る。例えば、所望の改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を規定温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後に、酵素活性を測定し得る。次いで、ｐＮＢエステラーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化を同定し（存在する場合）、これを使用して酵素を宿主細胞で発現させる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術を使用して実施され得る。
人工ポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法にしたがって、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、約１００塩基までの断片を、個々に合成し、次いで結合（例えば、酵素的連結（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法もしくは化学的連結法、またはポリメラーゼ媒介法によって）することによって、任意の所望の連続的な配列を形成し得る。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９−６９に記載されている古典的なホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５に記載されている方法を使用した化学合成によって、例えば、これが自動化された合成法で一般に実行されるように、調製され得る。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。
したがって、いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異を有するポリペプチドであって、場合により、配列番号２と比較した特定の残基差異が、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから場合により選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること；および（ｂ）前記ポリヌクレオチドによってコードされるｐＮＢエステラーゼポリペプチドを発現させることを含み得る。
前記方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、場合により、１個または数個（例えば、３個、４個、５個まで、または１０個まで）のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、１〜７個、１〜８個、１〜９個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２１個、１〜２２個、１〜２３個、１〜２４個、１〜２５個、１〜３０個、１〜３５個、１〜４０個、１〜４５個または１〜５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、場合により、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を有する。いくつかの実施形態では、置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
発現された人工ｐＮＢエステラーゼは、本明細書に記載されるアッセイ条件のいずれかによって、化合物（２）の化合物（１）への変換における、所望の改善された特性、例えば、活性、選択性、安定性および／または生成物許容性について測定され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞内で発現される人工ｐＮＢエステラーゼ酵素はいずれも、特に、リゾチーム処理、超音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む周知のタンパク質精製技術のいずれか１つ以上を使用して、細胞および／または培地から回収され得る。大腸菌などの細菌からタンパク質を溶解し、高い効率で抽出するのに適切な溶液は表２および実施例に示されており、例えばＳｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｂ（商標）で市販されている。
ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、特に、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態では、親和性技術を使用して、改善されたｐＮＢエステラーゼ酵素を単離し得る。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用し得る。抗体の産生のために、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドまたはその断片による注射によって、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を免疫し得る。側鎖官能基によって、または側鎖官能基に結合したリンカーによって、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドまたは断片をＢＳＡなどの適切な担体に結合させ得る。
５．７ 人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの使用方法
上記のように、適切な反応条件下で、ｐＮＢ保護基質化合物（２）を対応する生成物化合物（１）イミペネムに効率的に変換するために、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを作り出した。人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの構造的特徴は、ｐＮＢ保護基質化合物（２）をその対応する脱保護生成物化合物（１）イミペネムに変換するのを可能にする。したがって、別の態様では、本開示は、化合物（１）のカルバペネム系抗生物質イミペネムまたは化合物（１）の塩もしくは水和物
Figure 2016503662
 を調製するための方法であって、適切な反応条件下で、基質化合物（２）または化合物（２）の塩もしくは水和物
Figure 2016503662
 を本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。
人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの構造的特徴はまた、化合物（２）の構造類似体である他のｐＮＢ保護カルバペネム基質を変換することができる人工ｐＮＢエステラーゼを提供し得る。したがって、別の態様では、本開示は、ｐＮＢ保護カルバペネム化合物からｐＮＢ基が除去される脱保護反応を行うために、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを使用する方法を提供する。一般に、生体触媒ｐＮＢ脱保護反応を実施するための方法は、カルバペネム前駆体を脱保護して所望のカルバペネム化合物を得るのに適切な反応条件下で、本開示の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをｐＮＢ保護化合物と接触させるか、またはｐＮＢ保護化合物と共にインキュベートすることを含む。
上記方法について、本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドはいずれも使用され得る。一例として限定されないが、いくつかの実施形態では、前記方法は、本開示のｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される参照配列との少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性と、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む人工ポリペプチドを使用し得る。いくつかの実施形態では、残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した特定の残基差異は、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４、１２、２０、３６、３８、５４、７６、８０、８８、１１２および１１６から選択される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号５４である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号７６である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８０である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号８８である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１２である。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号１１６である。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法を行うことができる例示的なｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの選択および使用に関するガイダンスは、本明細書の記載、例えば表２および実施例において提供されている。
本明細書の実施形態および実施例に例示される実施形態では、限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、圧力、および反応時間の範囲を含む適切な反応条件の様々な範囲を使用し得る。本明細書に記載される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを使用して基質化合物を生成物化合物に生体触媒変換するための方法を実施するためのさらに適切な反応条件は、限定されないが、濃度、ｐＨ、温度、溶媒の条件の実験的反応条件下で人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと基質化合物とを接触させる工程と、生成物化合物を検出する工程とを含む日常の実験によって、本明細書に提供されるガイダンスを考慮して、容易に最適化され得る。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の効果、反応条件下での酵素の安定性、および基質の生成物への変換率を考慮して変更され得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌ、約２０〜約１００ｇ／Ｌまたは約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌまたは少なくとも約２００ｇ／Ｌまたはさらにそれ以上の基質化合物負荷を含む。本明細書に提示される基質負荷の値は、化合物（２）の分子量に基づくが、等モル量の化合物（２）の様々な水和物および塩もこの方法で使用できることも企図される。さらに、化合物（２）の基質の構造的類似体も、化合物（２）の基質に使用される量を考慮して、適切な量で使用され得る。
本明細書に記載される反応を行う際に、精製酵素、前記酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、ならびに／またはこのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物の形態で、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを反応混合物に追加し得る。人工ｐＮＢエステラーゼ酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体もしくはその細胞抽出物、溶解物、および単離酵素は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）または半固体（例えば、粗製ペースト）を含む様々な異なる形態で用いられ得る。沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）とそれに続いて脱塩手順を行ってから凍結乾燥（例えば、限外ろ過、透析など）をすることによって、細胞抽出物または細胞溶解物を部分的に精製し得る。細胞調製物はいずれも、公知の架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを使用して架橋することによって、または固相（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなど）に固定化することによって、安定化され得る。
人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞に別個に形質転換することもできるし、または同じ宿主細胞に一緒に形質転換することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子によりある宿主細胞セットを形質転換することができ、別の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子により別のセットを形質転換することができる。細胞全体の形態で、またはそれに由来する溶解物もしくは抽出物の形態で、両方の形質転換細胞セットを反応混合物中で一緒に用いることができる。他の実施形態では、複数の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子で宿主細胞を形質転換することができる。いくつかの実施形態では、分泌ポリペプチドの形態で人工ポリペプチドを発現させることができ、前記分泌ポリペプチドを含有する培養培地をｐＮＢエステラーゼ反応に使用することができる。
本明細書に開示される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの活性および／または生成物選択性の増強は、より低濃度の人工ポリペプチドを用いてより高い変換率を達成し得る方法を提供する。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約０．０１〜約５０ｇ／Ｌ、約０．０５〜約５０ｇ／Ｌ、約０．１〜約４０ｇ／Ｌ、約１〜約４０ｇ／Ｌ、約２〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌ、約０．１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５〜約１０ｇ／Ｌ、約１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１〜約５ｇ／Ｌ、約０．５〜約５ｇ／Ｌまたは約０．１〜約２ｇ／Ｌの人工ポリペプチド濃度を含む。いくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０ｇ／Ｌの濃度である。
ｐＮＢエステラーゼ反応過程の間に、反応混合物のｐＨは変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲内に維持され得る。これは、反応過程の前および／または間に酸または塩基を追加することによって行うことができる。あるいは、ｐＨは、緩衝剤を使用することによって制御され得る。したがって、いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のｐＨ範囲を維持するための適切な緩衝剤は当技術分野で公知であり、一例として限定されないが、ホスフェート、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ボレート、カルボネート、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ボレートである。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、ＭＥＳ緩衝剤を含み、前記ＭＥＳ濃度は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍまたは約０．１〜約０．２Ｍである。いくつかの実施形態では、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３または０．４ＭのＭＥＳ濃度を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、緩衝剤が存在しない適切な溶媒として水を含む。
前記方法の実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含み得る。所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝剤、または緩衝および酸もしくは塩基の組み合わせの追加を使用することによって維持され得る。反応混合物のｐＨは、反応過程の前および／または間に制御され得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５〜約１２のｐＨ、約６〜約９のｐＨ、約６〜約８のｐＨ、約６．５〜約７．５のｐＨまたは約７〜約８のｐＨの溶液を含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５または１２の溶液ｐＨを含む。
本明細書の方法の実施形態では、例えば、より高温における反応速度の増加、および反応時間の間の酵素活性を考慮して、適切な温度を反応条件に使用し得る。例えば、本開示の人工ポリペプチドは、天然に存在するｐＮＢエステラーゼポリペプチド、例えば、配列番号２の野生型ポリペプチドと比べて増加した安定性を有し、それにより、変換率を増加させ、基質溶解度特性を改善するために、人工ポリペプチドをより高温で使用することが可能になる。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５℃〜約６５℃、約１０℃〜約６０℃、約１５℃〜約５５℃、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約３５℃、約２０℃〜約５５℃または約３０℃〜約６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃または約７０℃の温度を含む。
いくつかの実施形態では、より高い温度（例えば、２５℃超）は、望ましくない副生成物、例えば化合物（３）のβ−ラクタム開環二酸イミペネム副生成物の増加をもたらし得る。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５℃〜約３０℃、約１０℃〜約２５℃、約１０℃〜約２０℃または約１５℃〜約２０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃または約３０℃の温度を含む。
いくつかの実施形態では、酵素反応の間の温度は、反応過程全体にわたってある温度で維持することもできるし、または反応過程の間の温度プロファイルにわたって調整することもできる。
本明細書における方法は一般に、溶媒中で行われる。適切な溶媒としては、水、緩衝水溶液、有機溶媒、高分子溶媒、ならびに／または一般に水性溶媒、有機溶媒、および／もしくは高分子溶媒を含む共溶媒系が挙げられる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）はｐＨ緩衝されていてもよいし、または緩衝されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、前記方法は一般に、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性または極性溶媒（例えば、１エチル４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１ブチル３メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、グリセロール、ポリエチレングリコールなど）を含む水性共溶媒系中で行われる。一般に、水性共溶媒系の共溶媒成分は、反応条件下でｐＮＢエステラーゼ酵素を不利に不活性化しないように選択される。本明細書に記載されるものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において、対象の所定の基質を使用して特定の人工ｐＮＢエステラーゼ酵素の酵素活性を測定することによって、適切な共溶媒系を容易に同定し得る。水性共溶媒系の非水性共溶媒成分は、水性成分と混和性であり単一の液相を提供し得るか、または水性成分と部分的に混和性または不混和性であり、２つの液相を提供し得る。例示的な水性共溶媒系は、水と、有機溶媒、極性溶媒およびポリオール溶媒から選択される１つ以上の共溶媒とを含み得る。いくつかの実施形態では、共溶媒は、極性溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯまたは低級アルコールであり得る。
前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、水性共溶媒を含み、前記共溶媒は、約１％〜約８０％（ｖ／ｖ）、約１〜約７０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＦを含む。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％（ｖ／ｖ）のＤＭＦを含む水性共溶媒を含む。前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約５％（ｖ／ｖ）〜約４５％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）のＤＭＦ、いくつかの実施形態では濃度約１５％（ｖ／ｖ）のＤＭＦを含む水性共溶媒を含む。
ｐＮＢエステラーゼ反応で使用される反応物の量は一般に、所望の生成物の量、およびそれに付随して、使用されるｐＮＢエステラーゼ基質の量に応じて変動するであろう。当業者であれば、所望の生産性レベルおよび生産スケールにこれらの量を合わせるためには、反応物の量をどのように変更するかを容易に理解するであろう。
いくつかの実施形態では、反応物を追加する順序は、重要ではない。反応物を溶媒（例えば、単相溶媒、二相性水性共溶媒系など）に同時に一緒に追加し得るか、またはあるいは、反応物の一部を別個に追加し得、一部を異なる時点で一緒に追加し得る。例えば、補因子、ｐＮＢエステラーゼおよびｐＮＢエステラーゼ基質を溶媒に最初に追加し得る。
固体反応物（例えば、酵素、塩、基質化合物など）は、粉末（例えば、凍結乾燥した、噴霧乾燥したなど）、溶液、エマルジョン、懸濁液などを含む様々な異なる形態で反応に供給され得る。反応物は、当業者に公知の方法および装置を使用して容易に凍結乾燥または噴霧乾燥され得る。例えば、タンパク質溶液を小アリコートで−８０℃で凍結し、次いで予冷却した凍結乾燥チャンバーに追加し、続いて真空を適用し得る。
水性共溶媒系を使用する場合の混合効率を改善するために、最初に、ｐＮＢエステラーゼおよび補因子を水相に追加および混合し得る。次いで、有機相を追加および混合し、続いてｐＮＢエステラーゼ基質を追加し得る。あるいは、ｐＮＢエステラーゼ基質を有機相中で予混合してから、水相に追加し得る。
一般に、ｐＮＢ保護基質の生成物へのさらなる変換が反応時間と共顕著に変化しなくなる（例えば、基質の１０％未満が変換されている、または基質の５％未満が変換されている）まで、ｐＮＢエステラーゼ反応を進行させる。いくつかの実施形態では、ｐＮＢ保護基質が脱保護生成物化合物に完全に変換されるか、またはほぼ完全に変換されるまで、反応を進行させる。基質の生成物への転換は、公知の方法を使用して基質および／または生成物を検出することによってモニタリングされ得る。適切な方法としては、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどが挙げられる。反応混合物中の生成される脱保護生成物化合物の変換収率は、一般に、約５０％超であり、約６０％超であり得、約７０％超であり得、約８０％超であり得、９０％超であり得、約９７％超であり得る。いくつかの実施形態では、適切な反応条件下で、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを使用して脱保護イミペネム化合物（１）を調製するための方法は、約４８時間以内、約３６時間以内、約２４時間以内またはさらにより短い時間内に、化合物（２）のｐＮＢ保護基質の少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を化合物（１）の脱保護イミペネム生成物に変換する。
前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれ以上の基質負荷を含み、前記方法は、約４８時間以内、約３６時間以内または約２４時間以内に、基質化合物の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を生成物化合物に変換する。
前記方法のさらなる実施形態では、適切な反応条件は、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと接触させる反応溶液への初期基質負荷を含み得る。次いで、少なくとも約１ｇ／Ｌ／時、少なくとも約２ｇ／Ｌ／時、少なくとも約４ｇ／Ｌ／時、少なくとも約６ｇ／Ｌ／時またはそれ以上の速度の経時的な連続追加として、さらなる基質化合物を反応溶液にさらに補充する。したがって、これらの適切な反応条件によれば、少なくとも約５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液にポリペプチドを追加する。次いで、ポリペプチドの追加後、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌまたはそれ以上のかなり高い最終基質負荷に達するまで、約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時または６ｇ／Ｌ／時の速度で、さらなる基質を溶液に連続追加する。したがって、前記方法のいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌまたは４０ｇ／Ｌの初期基質負荷を有する溶液にポリペプチドを追加し、続いて、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌまたはそれ以上の最終基質負荷に達するまで、約２ｇ／Ｌ／時、４ｇ／Ｌ／時または６ｇ／Ｌ／時の速度で、さらなる基質を溶液に追加することを含む。この基質補充反応条件により、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のｐＮＢ保護基質の脱保護生成物への高い変換率を維持しつつ、より高い基質負荷を達成することが可能になる。
前記方法のいくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ反応は、以下の適切な反応条件：（ａ）約２ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．１〜１０ｇ／Ｌの人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド；（ｃ）約０．０５〜０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液；（ｄ）約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ共溶媒；（ｅ）約６〜８のｐＨ；および（ｆ）約１０〜３５℃の温度を含み得る。
前記方法のいくつかの実施形態では、ｐＮＢエステラーゼ反応は、以下の適切な反応条件：（ａ）約５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約２〜５ｇ／Ｌの人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド；（ｃ）約０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液；（ｄ）約１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ共溶媒；（ｅ）約７のｐＨ；および（ｆ）約１５℃の温度を含み得る。
いくつかの実施形態では、さらなる反応成分またはさらなる技術が反応条件を補足するために行われる。これらは、ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを安定化し、もしくはその不活化を防止し、生成物化合物阻害を軽減し、望ましくない副生成物の生成を減少させ、および／または反応平衡状態を生成物化合物形成にシフトさせるための対策を講ずることを含み得る。
さらなる実施形態では、基質化合物を生成物化合物に変換するための上記方法はいずれも、生成物化合物の抽出、単離、精製および結晶化から選択される１つ以上の工程をさらに含み得る。上に開示される方法によって生成される生体触媒反応混合物から生成物化合物を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技術、およびプロトコールは当業者に公知であり、および／または日常の実験によって利用される。さらに、以下の実施例において、例示的な方法を示す。
以下の代表的な実施例において、本開示の様々な特徴および実施形態を例証するが、これらは例示的なものであり、限定的なものではない。
６．実施例
実施例１：人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの合成、最適化およびスクリーニング
遺伝子の合成および最適化：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の４８９アミノ酸の野生型ｐＮＢエステラーゼポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８１９１５．１、ＧＩ：４６８０４６）をコードするポリヌクレオチド配列を、以下の７個のアミノ酸置換：Ｉ６０Ｖ、Ｌ１４４Ｍ、Ｐ３１７Ｓ、Ｈ３２２Ｒ、Ｌ３３４Ｓ、Ｍ３５８ＶおよびＹ３７０Ｆをコードするヌクレオチド変化と共に、大腸菌における発現のためにコドン最適化した。配列番号１として本明細書に開示されるこのコドン最適化遺伝子を合成し、ｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、米国特許出願公開第２００６０１９５９４７号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）にクローニングし、続いて大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおいて発現させた。大腸菌Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下で細胞内タンパク質としてｐＮＢエステラーゼポリペプチドを発現する。ｐＮＢ保護イミペネム基質化合物（２）の化合物（１）イミペネムへの変換について、配列番号２の元の人工ポリペプチドは、検出可能な活性を有していなかった。野生型ｐＮＢエステラーゼの活性部位による化合物（２）の構造モデリングに基づいて、配列番号２の人工ポリペプチドをアミノ酸置換Ｍ１９３Ａによってさらに改変して得られた配列番号４の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドは、化合物（２）を化合物（１）に変換する活性を有することが見出された。次いで、配列番号３のポリヌクレオチド（これは、配列番号４の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする）をさらなる最適化（これは、遺伝子合成による反復変異体ライブラリーの作製を介した標準的な定向進化法を使用する）のための開始骨格として使用し、続いて、目的物（ｈｉｔｓ）をスクリーニングおよび配列決定して、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる人工ｐＮＢエステラーゼであって、配列番号４の人工ポリペプチドと比べて増強した酵素特性を有する人工ｐＮＢエステラーゼをコードする遺伝子を作製した。得られた人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの配列および特定の変異および相対活性は、表２および配列表に記載されている。
実施例２：人工ｐＮＢエステラーゼの生産
宿主大腸菌Ｗ３１１０において、ｌａｃプロモーターの制御下で発現される細胞内タンパク質として、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドを生産した。ポリペプチドは、主に可溶性細胞質ゾル活性酵素として蓄積する。振盪フラスコ法を使用して、本明細書に開示される活性アッセイまたは生体触媒プロセスで使用され得る人工ポリペプチドの粉末を作製する。
ハイスループット成長および発現。細胞を採取し、３０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％の培養条件下で、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ培地中で一晩成長させる。一晩成長させたアリコート２０μＬを、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭ、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する３８０μＬの２ｘＹＴ成長培地を含有するディープウェルプレートに移し、３０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％で約１８時間インキュベートする。継代培養ＴＢ培地は、ＴＢ培地（３８０μＬ／ウェル）、３０μｇ／ｍＬ ＣＡＭおよび１ｍＭ ＩＰＴＧから構成される。細胞培養物を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、培地上清を廃棄する。細胞ペレットを２００μＬの溶解緩衝液（０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢＳおよび１．０ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））に再懸濁し、溶解物を下記のようにＨＴＰアッセイで使用する。
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の生産。本明細書に開示される二次スクリーニングアッセイにおいて、または大規模な生体触媒プロセスで使用される人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド粉末を、振盪フラスコ法を使用して作製した。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）は約３０％の総タンパク質を含むので、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較してより精製された人工酵素調製物が得られる。目的の人工ｐＮＢエステラーゼをコードするプラスミドを含有する大腸菌の単一コロニーを、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有する５０ｍＬのルリアベルターニブロスに接種する。２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃のインキュベーター内で、細胞を一晩（少なくとも１６時間）成長させる。１リットルフラスコ中で、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２５０ｍＬテリフィックブロス（１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＭｇＳＯ４）に培養物を希釈して０．２の６００ｎｍ光学密度（ＯＤ６００）とし、３０℃で成長させる。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を最終濃度１ｍＭまで追加することによって、ｐＮＢエステラーゼ遺伝子の発現を誘導する。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続する。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分間、５℃）によって細胞を回収し、上清を廃棄する。２５ｍＬ体積の冷（５℃）１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて細胞ペレットを再懸濁し、上記のように遠心分離によって回収する。洗浄した細胞を１２ｍＬの冷リン酸緩衝液に再懸濁し、４０ｋｐｓｉおよび５℃でｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．）に通す。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４５分間、５℃）によって、細胞残屑を除去する。溶解物の上澄みを回収し、−２０℃で保存する。凍結した溶解物の上澄みを凍結乾燥することにより、粗製ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの乾燥振盪フラスコ粉末が得られる。あるいは、細胞ペレット（洗浄前または洗浄後）を４℃または−８０℃で保存し得る。
下流処理（ＤＳＰ）粉末の生産：ＤＳＰ粉末は、約８０％の総タンパク質を含有するので、ハイスループットアッセイで使用される細胞溶解物と比較してより精製された人工ｐＮＢエステラーゼ酵素調製物が得られる。ＤＳＰ粉末を生産するための人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの大規模（約１００〜１２０ｇ）発酵は、標準的なバイオプロセス法にしたがって、短バッチプロセスとそれに続くフェドバッチプロセスとして行われ得る。簡潔に言えば、ｐＮＢエステラーゼの発現は、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで追加することによって誘導される。発酵後、細胞を回収し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再懸濁し、次いで、ホモジナイゼーションによって機械的に破壊する。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて細胞残屑および核酸を凝集させ、遠心分離によって懸濁液を澄明化する。タンジェンシャルクロスフロー限外ろ過膜を使用して、得られた上澄みを濃縮して塩および水を除去する。次いで、凍結乾燥機において、濃縮および部分的に精製された酵素濃縮物を乾燥し、（例えば、ポリエチレン容器に）パッケージングし得る。
実施例３：ｐＮＢ保護基質化合物（２）の化合物（１）イミペネムへの変換に関するｐＮＢエステラーゼのハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニング
細胞溶解物のＨＴＰスクリーニングを使用して、基質化合物（２）のイミペネム生成物化合物（１）への改善された変換特性を有する人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドの一次選択をガイドした。
溶解物を調製するために、実施例２に記載されているように細胞を９６ウェルプレート中で成長させ、２００μＬの溶解緩衝液（０．５ｍｇ／ｍＬ ＰＭＢＳおよび１．０ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を各ウェルに分注することによって、溶解物を調製した。プレートを密封し、２時間振盪し、次いで４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。
ＨＴＰアッセイのｐＮＢエステラーゼポリペプチド活性：０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のアリコート４５μＬおよび１２５μＬの細胞溶解物を９６ウェルプレートの各ウェルに追加した。ストック基質溶液（ＤＭＦに溶解した１３．５ｇ／Ｌの化合物（２））のアリコート３０μＬを各ウェルに追加することによって、反応を開始させた。プレートを密封し、遠心分離機で短時間スピンし（１分間未満）、２００ｒｐｍ、１５℃の振盪機に２４時間置いた。８００μＬのアセトニトリルを用いて反応をクエンチし、実施例４に記載されているようにＨＰＬＣによってサンプルを調査した。
実施例４：分析手順
ＨＴＰ反応物の活性のＨＰＬＣ分析：（実施例３のように）８００μＬのアセトニトリルを各ウェルに分注し、プレートを熱密封し、高速で１分間振盪して混合し、次いで、遠心分離機においてプレートを４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間スピンダウンすることによって、反応をクエンチした。クエンチしたＨＴＰ反応物のアリコート２００μＬを、ＨＰＬＣ分析のために９６ウェル丸底プレートに分注した。２００μＬのサンプルを以下の条件下でＨＰＬＣ分析に供した。
Figure 2016503662
得られたクロマトグラムから、化合物（２）の化合物（１）への変換を以下のように決定した：
変換（％）＝生成物面積／（生成物面積＋基質面積）×１００％
実施例５：１ｍＬスケールにおける化合物（２）の化合物（１）への変換プロセス
ｐＮＢ保護イミペネム基質化合物（２）の生成物イミペネム化合物（１）への１ｍＬスケールの変換反応では、人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドのＳＦＰ調製物を使用した。イミペネムなどのカルバペネム化合物の調製にこれらの生体触媒をどのように使用し得るかをこれらの反応により実証する。１ｍＬスケールの反応を以下のように行った。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．３５ｍＬ、ｐＮＢエステラーゼポリペプチド（配列番号７６）の２ｇ／Ｌ ＳＦＰ調製物０．５０ｍＬおよび化合物（２）の３３．３ｍｇ／ｍＬ ＤＭＦ溶液０．１５ｍＬを２ｍＬガラスバイアルに追加した。混合物を２００ｒｐｍ、１５℃でキューナーシェーカーに２時間置いた。成分の最終濃度は、５ｇ／Ｌ化合物（２）；１５％ｖ／ｖ ＤＭＦ；５ｇ／Ｌ ｐＮＢエステラーゼポリペプチドＳＦＰ調製物；および１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ７．０）であった。
異なる時点で２０μＬのサンプルを採取し、４０μＬのアセトニトリルで希釈し、十分に振盪した。サンプルを３４０μＬの１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液と混合し、十分に混合し、１０分間遠心分離した。実施例４に記載されている機器およびパラメータを使用して、ＨＰＬＣによって上清を分析した。
１ｍＬ反応で試験した様々なｐＮＢ−エステラーゼの経時的なＨＰＬＣプロファイルの結果を以下の表３に示す。
Figure 2016503662
配列番号１１６の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドによるｐＮＢ保護化合物（２）のイミペネム生成物化合物（１）への変換率は、１時間の時点で７５％に達し、わずか２時間後には８０％に達した。これらの同じ条件下で、配列番号７６および８０のポリペプチドによる化合物（２）の化合物（１）への変換率はわずかに低かった。
本出願で引用されているすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の各刊行物、特許、特許出願または他の文献が、すべての目的ために参照により組み込まれると個々に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
様々な特定の実施形態を例証および説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができると認識されよう。

Claims (39)

  1. ｐＮＢエステラーゼ活性を有する人工ポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも８０％の同一性と、Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２から選択される残基位置における配列番号２と比較した１個以上の残基差異とを有するアミノ酸配列を含む、人工ポリペプチド。
  2. 残基位置Ｘ１０８、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１３０、Ｘ１９３、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２７３、Ｘ２７６、Ｘ３２１およびＸ３６２における配列番号２と比較した前記残基差異が、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１１５Ｑ／Ｗ、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／Ｖ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／Ｌ、Ｘ３２１ＡおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される、請求項１に記載の人工ポリペプチド。
  3. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／Ｙ、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖ、Ｘ２１９Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｖ、Ｘ２７３Ａ／Ｅ／Ｔ／ＶおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される１個以上の残基差異を含む、請求項１または２に記載の人工ポリペプチド。
  4. 前記アミノ酸配列が、位置Ｘ１９３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１９３Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｖから選択される残基差異を含む、請求項１または２に記載の人工ポリペプチド。
  5. 位置Ｘ１９３における配列番号２と比較した前記アミノ酸残基差異がＸ１９３Ｖである、請求項４に記載の人工ポリペプチド。
  6. 前記アミノ酸配列が、位置Ｘ２１９およびＸ２７３における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ２１９Ｌ／ＶおよびＸ２７３Ａ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む、請求項５に記載の人工ポリペプチド。
  7. 前記アミノ酸配列が、位置Ｘ１０８およびＸ３６２における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１０８Ｌ／ＹおよびＸ３６２Ａ／Ｄ／Ｑ／Ｓ／Ｖから選択される残基差異をさらに含む、請求項６に記載の人工ポリペプチド。
  8. 前記アミノ酸配列が、位置Ｘ１１５における配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ１１５Ｑ／Ｗから選択される残基差異をさらに含む、請求項７に記載の人工ポリペプチド。
  9. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比較した残基差異の組み合わせであって、
    Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９ＶおよびＸ２７３Ａ；
    Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｄ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｓ；
    Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；
    Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｌ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ；ならびに
    Ｘ１０８Ｙ、Ｘ１１５Ｑ、Ｘ１９３Ｖ、Ｘ２１９Ｖ、Ｘ２７３ＡおよびＸ３６２Ｑ
    から選択される残基差異の組み合わせを含む、請求項２に記載の人工ポリペプチド。
  10. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比較した１個以上の残基差異であって、Ｘ１１６Ｓ、Ｘ１３０Ｔ、Ｘ１６４Ｔ、Ｘ２１４Ｇ、Ｘ２７６Ａ／Ｔ／ＬおよびＸ３２１Ａから選択される１個以上の残基差異をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工ポリペプチド。
  11. 前記アミノ酸配列が、配列番号２と比較した残基差異であって、Ｘ４９Ｇ、Ｘ９４Ｇ、Ｘ９６Ｓ、Ｘ２２７Ｔ、Ｘ２５１Ｖ、Ｘ２６７Ｒ、Ｘ２７１Ｌ、Ｘ２７４Ｌ、Ｘ３１３Ｆ、Ｘ３２２Ｃ／Ｙ、Ｘ３４３Ｖ、Ｘ３５６Ｒ、Ｘ３５９Ａ、Ｘ３９８Ｌ、Ｘ４１２Ｅ、Ｘ４３７Ｔ、Ｘ４６４ＡおよびＸ４８１Ｒから選択される残基差異をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の人工ポリペプチド。
  12. 前記アミノ酸配列が、位置Ｘ６０、Ｘ１４４、Ｘ３１７、Ｘ３２２、Ｘ３３４、Ｘ３５８およびＸ３７０における配列番号２と比較した残基差異を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の人工ポリペプチド。
  13. 前記ｐＮＢエステラーゼが、適切な反応条件下における化合物（２）の化合物（１）への変換について、配列番号４のポリペプチドと比較して少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれ以上増加した活性を有する、請求項２に記載の人工ポリペプチド。
  14. 前記アミノ酸配列が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８および１２０から選択される配列を含む、請求項１に記載の人工ポリペプチド。
  15. 前記ポリペプチドが固体支持体上に固定化されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工ポリペプチド。
  16. 前記固体支持体が、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である、請求項１５に記載の人工ポリペプチド。
  17. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  18. 請求項１に記載の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７および１１９から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
  19. 請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  20. 制御配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
  21. 請求項１７もしくは１８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１９もしくは２０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  22. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の人工ポリペプチドを調製するための方法であって、該ポリペプチドの発現に適切な条件下で、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  23. 前記人工ポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 化合物（１）または化合物（１）の塩もしくは水和物
    Figure 2016503662
     を調製するための方法であって、適切な反応条件下で、基質化合物（２）または化合物（２）の塩もしくは水和物
    Figure 2016503662
     を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチドと接触させることを含む、方法。
  25. 化合物（２）の前記基質が、約１〜約２００ｇ／Ｌ、約２〜約１００ｇ／Ｌまたは約５〜約５０ｇ／Ｌの負荷である、請求項２４に記載の方法。
  26. 化合物（２）の前記基質が、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌまたは２００ｇ／Ｌの負荷である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記適切な反応条件が、ボレート、ホスフェート、カルボネート、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、トリスおよび２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）から選択される緩衝剤を含む、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記緩衝剤がＭＥＳを含み、該ＭＥＳ濃度が約０．０１〜約０．４Ｍ、約０．０５〜約０．４Ｍ、約０．１〜約０．３Ｍまたは約０．１〜約０．２Ｍである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＭＥＳ濃度が、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０７Ｍ、０．１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１４Ｍ、０．１６Ｍ、０．１８Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍまたは０．４Ｍである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記適切な反応条件が、約５〜約１０のｐＨ、約６〜約９のｐＨまたは約７〜約８のｐＨを含む、請求項２４に記載の方法。
  31. 前記適切な反応条件が、約６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０のｐＨを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記適切な反応条件が、約５℃〜約６５℃、約１０℃〜約６０℃、約１５℃〜約５５℃、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約３５℃、約２０℃〜約５５℃または約３０℃〜約６０℃の温度を含む、請求項２４に記載の方法。
  33. 前記適切な反応条件が、約５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記適切な反応条件が、約２％〜約３０％ｖ／ｖ；または約５％〜約２０％ｖ／ｖの濃度で存在する共溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、請求項２４に記載の方法。
  35. 前記ＤＭＦが、約２％ｖ／ｖ、５％ｖ／ｖ、１０％ｖ／ｖ、１５％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ、２５％ｖ／ｖまたは３０％ｖ／ｖの濃度で存在する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ｐＮＢエステラーゼポリペプチドが、約０．０１〜約５０ｇ／Ｌ、約０．０５〜約５０ｇ／Ｌ、約０．１〜約４０ｇ／Ｌ、約１〜約４０ｇ／Ｌ、約２〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約４０ｇ／Ｌ、約５〜約３０ｇ／Ｌ、約０．１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５〜約１０ｇ／Ｌ、約１〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１〜約５ｇ／Ｌ、約０．５〜約５ｇ／Ｌまたは約０．１〜約２ｇ／Ｌの濃度である、請求項２４に記載の方法。
  37. 前記ｐＮＢエステラーゼポリペプチドが、約０．０１ｇ／Ｌ、０．０５ｇ／Ｌ、０．１ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌまたは５０ｇ／Ｌの濃度である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記適切な反応条件が、
    （ａ）約２ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；
    （ｂ）約０．１〜１０ｇ／Ｌの人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド；
    （ｃ）約０．０５〜０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液；
    （ｄ）約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ共溶媒；
    （ｅ）約６〜８のｐＨ；および
    （ｆ）約１０〜３５℃の温度
    を含む、請求項２４に記載の方法。
  39. 前記適切な反応条件が、
    （ａ）約５ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌの基質負荷；
    （ｂ）約２〜５ｇ／Ｌの人工ｐＮＢエステラーゼポリペプチド；
    （ｃ）約０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液；
    （ｄ）約１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ共溶媒；
    （ｅ）約７のｐＨ；および
    （ｆ）約１５℃の温度
    を含む、請求項２４に記載の方法。
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