WO2011105421A1

WO2011105421A1 - Ｘ線顕微鏡像観察用試料支持部材、ｘ線顕微鏡像観察用試料収容セル、およびｘ線顕微鏡

Info

Publication number: WO2011105421A1
Application number: PCT/JP2011/053973
Authority: WO
Inventors: 小椋　俊彦
Original assignee: 独立行政法人産業技術総合研究所
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2011-09-01
Also published as: JP2011174784A; JP5626757B2; EP2541558B1; EP2541558A4; US8891728B2; EP2541558A1; US20120321037A1

Abstract

　生物試料のＸ線顕微鏡観察に好適なＸ線顕微鏡像観察用試料支持部材を提供すること。試料支持部材（１０）は、窒化シリコン膜、カーボン膜、ポリイミド膜などの試料支持膜（１１）と、この試料支持膜の一方主面に設けられ荷電粒子の照射を受けて軟Ｘ線領域の特性Ｘ線を放射するＸ線放射膜（１３）と、試料支持膜（１１）の他方主面に設けられた金属膜であって吸着により観察対象試料（１）を固定する試料吸着膜（１２）とを備えている。生物試料の構成物質であるタンパク質は金属イオンに吸着し易い性質があるため、試料吸着膜（１２）を試料支持部膜（１１）の主面の一方に形成してこれに観察試料を吸着させるようにする。このような試料支持部材（１０）を用いれば、生物試料を含む溶液を試料吸着膜（１２）の上に滴下したり試料支持部材（１０）を収容したセル内に注入したりするだけで、観察試料を固定することが可能となる。

Description

Ｘ線顕微鏡像観察用試料支持部材、Ｘ線顕微鏡像観察用試料収容セル、およびＸ線顕微鏡

　本発明はＸ線顕微鏡像の観察技術に関し、特に、水溶液中の生物試料の高分解能Ｘ線顕微鏡像の観察に好適な技術に関する。

　Ｘ線顕微鏡は、光学顕微鏡に比較して、水溶液中の試料を高分解能で観察することが可能である。特に、一般に「水の窓」と呼ばれる２．３～４．４ｎｍの波長範囲（２８４～５４０ｅＶに相当）の軟Ｘ線は、生体を構成する物質の吸収係数の差が大きく、水は透過する一方、炭素や窒素に良く吸収されるためにタンパク質などは透過しにくいという特性を有する。

　このような「水の窓」領域の軟Ｘ線を用いると、水分を含んだ対象物（生体試料や溶液中の試料）をそのままの状態で観察することが可能となることに加え、波長は可視光よりも短いために、光学顕微鏡以上の高分解能観察が可能であることから、「水の窓」の波長領域にあるＸ線を利用した軟Ｘ線顕微鏡の開発が進められている（例えば、非特許文献１：真島秀明他「細胞をＸ線顕微鏡で見る」Medical　Imaging　Technology,　Vol.　17,　No.3　p.211-216　(1999)）。

　なお、「水の窓」の波長範囲の軟Ｘ線以外にも、炭層の吸収が少ない「炭素の窓」波長領域（５．０～４．５ｎｍ）の軟Ｘ線や、更に短い波長領域（０．６～２．３ｎｍ）の軟Ｘ線も、生物試料の観察には有効である。

　Ｘ線顕微鏡は、主として、ゾーンプレート等の集光系を用いてＸ線ビームを細く絞って試料に照射する方法（集光系）と、点光源からのＸ線ビームを試料に照射する方法（点光源系）に分類される。

　集光系のＸ線顕微鏡は、照射透過型のものと走査透過型のものとに分類され（非特許文献２：Chris　Jacobsen　「Soft　x-ray　microscopy」Trend　in　Cell　Biology,　Vol.　9,　p.44-47　(1999)）、この方法での分解能はゾーンプレートの加工精度に依存し、理論的な限界は１０～１５ｎｍ程度と予想されている（非特許文献３：W.　Chao　et　al.,　「Soft　X-ray　microscopy　at　a　spatial　resolution　better　than　15nm」 Nature,　Vol.　453,　p.1210-1213　(2005)）。

　一方、点光源を用いる方法は、レーザーによりＸ線を発生させる方法と、電子線でＸ線を発生させる方法とに分類されるが、例えば、電子線をターゲットに入射させて発生させたＸ線をプローブとして試料観察する方法が開発されている。

　この方法では、試料支持膜に電子線を直接入射させてＸ線を発生させ、このＸ線を電子線入射方向とは反対の支持膜表面に付着させた試料に照射するという手法が採用されている（特許文献１：特開平８－４３６００号公報、特許文献２：特願２００９－１８２９０の明細書、特許文献３：特開平２－１３８８５６号公報）。

　このような手法によれば、極めて細く絞った荷電粒子を試料支持膜に入射させて荷電粒子の拡散範囲を抑えることが可能となるため、高い分解能を達成することができる。また、試料支持膜の下側の様々な角度や位置にＸ線検出器を複数個設置することとすれば、その設置角度に依存した傾斜画像を得ることができるため、１回の荷電粒子線走査で検出器の数と同じ数だけの傾斜画像が得られ、これらの傾斜画像に基づいて観察対象試料の３次元構造を再現することも可能となる（特許文献２：特願２００９－１８２９０の明細書）。

　このような軟Ｘ線顕微鏡観察に用いられる試料支持部材（支持膜）としては、窒化シリコン膜が広く用いられてきた。窒化シリコン膜は耐圧性に優れているため、内部が大気圧にある試料収容セルの窓部に設けた場合でも、真空となる顕微鏡装置内での使用には何ら支障が生じない。例えば、特開平６－１８０４００号公報（特許文献４）に開示されている発明では、２枚の窒化シリコン膜が所定の間隔を有するようにして平行に固定しその間隔内に水溶液と一緒に観察試料を封入して密閉した試料セルを、内部が真空の軟Ｘ線顕微鏡装置へと導入している。

　ところで、水溶液中にある試料を高分解能で観察する場合には、ブラウン運動に起因する観察像のブレを抑制するために、支持部材へ試料を固定する必要があるが、このような試料固定のための支持膜は、可能な限り薄く且つ耐久性があり、しかもＸ線に対しては高い透過性を有するものであることが重要な要素となる。

　従来、生物試料の固定剤として、コンカナバリンＡやポリイミジン等の有機物が用いられてきた。しかしこれらの有機物は、炭素や窒素を多量に含むため、上述した水の窓領域の軟Ｘ線が吸収され易く、得られる観察画像のコントラストを大幅に低下させてしまう。また、分子サイズが数十ｎｍと大きいために、高分解能観察時にこれらの試料固定剤の構造自体が観察されてしまうという問題もある。さらに、熱や紫外線あるいは湿度等の外的環境にも弱く耐久性に乏しいという欠点もある。

特開平８－４３６００号公報特願２００９－１８２９０明細書特開平２－１３８８５６号公報特開平６－１８０４００号公報

真島秀明他「細胞をＸ線顕微鏡で見る」Medical Imaging Technology, Vol. 17, No.3 p.211-216 (1999) Chris Jacobsen「Soft x-ray microscopy」 Trend in Cell Biology, Vol. 9, p.44-47(1999) W. Chao etal., 「Soft X-ray microscopyat a spatial resolution better than 15 nm」 Nature, Vol. 453, p.1210-1213 (2005)

　本発明はこのような問題点に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、「水の窓」領域の軟Ｘ線の透過性と耐久性に優れ、しかも、荷電粒子の照射による観察試料へのダメージを軽減させ得る、生物試料のＸ線顕微鏡観察に好適なＸ線顕微鏡像観察用試料支持部材を提供することにある。

　また、本発明の目的は、上記試料支持部材を用いたＸ線顕微鏡像観察用試料収容セルおよびＸ線顕微鏡の提供にも及ぶ。

　上記課題を解決するために、本発明では、Ｘ線顕微鏡像観察用試料支持部材の試料吸着膜として、生物試料の構成物質であるタンパク質を吸着し易い金属膜を用いることとした。

　つまり、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材は、試料支持膜と、該試料支持膜の一方主面に設けられ荷電粒子の照射を受けて軟Ｘ線領域の特性Ｘ線を放射するＸ線放射膜と、前記試料支持膜の他方主面に設けられた金属膜であって吸着により観察対象試料を固定する試料吸着膜とを備えている。

　前記試料吸着膜は、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、クロム、金、プラチナの何れかの元素を主成分として含む金属膜とすることができる。

　前記試料吸着膜の厚みは、例えば、３００ｎｍ以下である。

　前記Ｘ線放射膜は、カーボン、アルミニウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、ニッケル、シリコン、ゲルマニウム、及びこれらの酸化物若しくは窒化物を主成分とする膜とすることができる。

　前記Ｘ線放射膜は、組成の異なる複数の膜が積層されている態様としてもよい。

　好ましくは、前記組成の異なる複数の膜の厚みは何れも１００ｎｍ以下である。

　また、好ましくは、前記組成の異なる複数の膜は、荷電粒子照射側から、主成分元素の原子番号が小さい膜から大きい膜となる順番で積層されている。なお、前記組成の異なる複数の膜は、荷電粒子照射側から、膜の組成質量の軽い材質から重い材質となる順番で積層されている態様としてもよい。

　本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材は、前記試料支持膜と前記Ｘ線放射膜との間又は前記試料支持膜と前記試料吸着膜との間に荷電粒子遮蔽膜を備えている態様としてもよい。

　前記荷電粒子遮蔽膜は、金、プラチナ、パラジウム、オスミウム、タングステン、スズ、コバルト、ニッケルの何れかの金属元素を主成分とする膜とすることができる。

　前記試料支持膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、又はポリイミド膜とすることができる。

　前記試料支持膜の厚みは、例えば、２００ｎｍ以下である。

　本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、上述のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材が設けられたセル上部と、該セル上部の前記試料吸着膜側の面に対向する観察窓を有するセル下部とを有し、前記セル上部と前記セル下部がスペース部材を介して所定の間隔の隙間を有するように配置されている。

　本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、前記セル上部と前記セル下部との間に形成される隙間内に観察試料を導入する注入孔と空気孔が設けられている態様としてもよい。

　また、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、前記注入孔を複数有し、該複数の注入孔のそれぞれに対応付けられた複数の流路を備えている態様としてもよい。

　さらに、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、前記注入孔の近傍に設けられた導電膜と、該導電膜と前記試料吸着膜との間に電位差を生じさせて電気泳動により前記注入孔から前記試料吸着膜側へと観察試料を導く電圧印加部とを有している態様とすることもできる。

　また、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、前記注入孔の近傍に、該注入孔から前記試料吸着膜側へと観察試料を押し出す圧力印加部を備えている態様とすることもできる。

　好ましくは、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セルは、前記試料収容セルの構成部材に関連する情報を記録するセル情報記録部を備えている。

　前記セル情報記録部は、例えば、外部からの読取が可能な位置に印刷乃至刻印されている。

　また、前記セル情報記録部は、例えば、外部から読取及び書込が可能な記録媒体である。

　本発明のＸ線顕微鏡は、上述した試料支持部材又は試料収容セルを保持するホルダと、前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、該荷電粒子線の走査機構部と、前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている。

　また、本発明のＸ線顕微鏡は、上述した試料支持部材又は試料収容セルを保持するホルダと、前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、該荷電粒子線の走査機構部と、前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を電子に光電変換する光電変換部と、前記光電変換された電子線を検知する電子線検出器と、該電子線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、を備えている。

　本発明のＸ線顕微鏡は、前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている態様としてもよい。

　この場合、前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて、３次元のＸ線画像を形成する画像処理部を備えている態様としてもよい。

　本発明では、Ｘ線顕微鏡像観察用試料支持部材の観察試料吸着膜として、生物試料の構成物質であるタンパク質を吸着し易い金属膜を用いることとしたので、観察試料側へと透過する荷電粒子を遮蔽して試料へのダメージを低減する一方、Ｘ線観察像の画質は低下させ難く、しかも、温度変化や湿度変化あるいは紫外線照射等による劣化も少なく耐久性にも優れている、生物試料のＸ線顕微鏡観察に好適なＸ線顕微鏡像観察用試料支持部材を提供することが可能となる。

　また、本発明では、予め、試料支持部材そのものに、或いは、試料支持部材を収容する試料収容セルに、構成部材に関連する情報を記録するセル情報記録部を設けておき、これに観察条件や放射される特性Ｘ線の情報を印刷等しておくこととしたので、Ｘ線高分解能観察を簡便に行うことが可能となる。

　このように、本発明によれば、誰もが簡便に溶液中の生物試料の高分解能なＸ線画像を取得することが可能となる。

本発明に係る試料支持部材を用いてＸ線顕微鏡観察を行う際のＸ線顕微鏡の構成例の概要を説明するためのブロック図である。Ｘ線検出器を複数備えＸ線顕微鏡像を３次元で再構成することを可能とするＸ線顕微鏡の構成例を説明するための図である。観察対象試料を透過したＸ線を光電変換させて２次電子検出器によりＸ線画像を観察する構成例を示した図である。図３に示した態様のＸ線顕微鏡において、更に、光電変換面へのＸ線透過経路中に電子線遮蔽用のフィルタを設けることとした態様を示した図である。図２に示した態様のＸ線顕微鏡において、Ｘ線放射膜を組成の異なる複数の膜を積層させた多層構造のものとした構成例を示した図である。本発明の試料収容セルの構成例を説明するための斜視図である。本発明の試料収容セルの構成例を説明するための上面図である。本発明の試料収容セルの構成例を説明するための断面図である。本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための斜視図である。本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための上面図である。本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための断面図である。溶液の送り込みを電気泳動的に行うこととした本発明の試料収容セルの構成例を説明するための上面図である。溶液の送り込みを電気泳動的に行うこととした本発明の試料収容セルの構成例を説明するための断面図である。溶液の送り込みを電気泳動的に行うこととした本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための上面図である。溶液の送り込みを電気泳動的に行うこととした本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための断面図である。図６Ａに示した試料収容セルのセル上部にセル情報記録部としてのバーコードが印刷されている態様を図示したものである。図６Ｂに示した試料収容セルのセル上部にセル情報記録部としてのバーコードが印刷されている態様を図示したものである。図６Ａに示した試料収容セルのセル上部にセル情報記録部としての半導体チップが設けられている態様を図示したものである。図６Ｂに示した試料収容セルのセル上部にセル情報記録部としての半導体チップが設けられている態様を図示したものである。図１１Ａ及びＢに示した態様の試料収容セルを用いて観察を行う際のＸ線顕微鏡の構成例を説明するための図である。５０ｎｍ厚の窒化シリコン膜の試料支持膜に試料吸着膜として１２０ｎｍ厚のニッケルを蒸着し、この試料吸着膜で酵母を固定して観察したＸ線画像である。上記試料支持部材に電子線を照射した場合のシミュレーション結果を示した図である。図１３Ｂに示した電子線照射時に窒化シリコンの試料支持膜から放出される窒素の特性Ｘ線の放射量のシミュレーション結果を示した図である。厚みが１２０ｎｍのニッケルの膜につきＸ線の透過率をシミュレーションした結果を示した図である。４０ｎｍ厚のカーボン膜の試料支持膜に試料吸着膜として６０ｎｍ厚のニッケルを蒸着し、このニッケル膜に観察試料としてのバクテリアを吸着させて２，０００倍の倍率で観察した画像である。上記バクテリアの観察倍率を１５，０００倍に上げたときの画像である。上記試料支持部材に電子線を照射した場合のシミュレーション結果を示した図である。カーボン膜で発生した特性Ｘ線の放射範囲（特性Ｘ線強度の広がりの程度）を示す図である。電子線入射側から、カーボン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、チタン（２０ｎｍ）の順に積層されたＸ線放射膜の電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションで求めた図である。カーボン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、チタン（２０ｎｍ）の各膜からの特性Ｘ線の放射範囲（特性Ｘ線強度の広がりの程度）を示す図である。上記特性Ｘ線の放射範囲を正規化して示した図である。電子線入射側から、チタン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、カーボン（２０ｎｍ）の順に積層されたＸ線放射膜の電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションで求めた図である。チタン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、カーボン（２０ｎｍ）の各膜からの特性Ｘ線の放射範囲（特性Ｘ線強度の広がりの程度）を示す図である。上記特性Ｘ線の放射範囲を正規化して示した図である。

　以下に、図面を参照して、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材および試料収容セルならびにＸ線顕微鏡について説明する。なお、以下では、荷電粒子線が電子線である場合について説明するが、荷電粒子線は電子線に限らず、後述するＸ線放射膜への入射により特性Ｘ線を発生させるものであればよく、イオンビームであってもよい。

　図１は本発明に係る試料支持部材を用いてＸ線顕微鏡観察を行う際のＸ線顕微鏡の構成例の概要を説明するためのブロック図で、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）内にＸ線検出器を設けた構成例を図示している。したがって、この走査型Ｘ線顕微鏡は、ＳＥＭ機能も併せもつことが可能である。

　図１に示した構成例の走査型Ｘ線顕微鏡は、観察対象となる試料（１）を支持する試料支持部材（１０）を保持するホルダ（２０）と、試料支持部材（１０）に荷電粒子である電子線を収束させて入射する電子銃（３０）と、電子銃（３０）から出射する電子線を走査させる信号（走査信号）を生成する回路部を有するコントロールＰＣ（４０）と、コントロールＰＣ（４０）からの走査信号に基づいて電子線を走査させるための偏向コイル（５０）と、入射電子線の照射を受けて試料支持部材（１０）内で発生するＸ線を検知するＸ線検出器（６０）と、このＸ線検出器（６０）により検知された信号を増幅する増幅器（７０）と、Ｘ線検出信号に基づいてＸ線画像を形成するＸ線画像処理ＰＣ（８０）を備えている。

　上記のＸ線検出器（６０）には、例えば、シリコンドリフト検出器やＰＩＮフォトダイオード型検出器といった、エネルギー分光可能なＸ線検出器を用いるようにしてもよい。また、通常のＳＥＭに標準的に装備されているように、上述のホルダ（２０）の平面内及び高さ方向の位置調整等を可能とする走査機構部（不図示）を設けるようにしてもよい。

　図１に示したとおり、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材（１０）は、例えば、窒化シリコン膜、カーボン膜、ポリイミド膜などで厚みが２００ｎｍ以下の試料支持膜（１１）と、この試料支持膜の一方主面に設けられ荷電粒子の照射を受けて軟Ｘ線領域の特性Ｘ線を放射するＸ線放射膜（１３）と、試料支持膜（１１）の他方主面に設けられた金属膜であって吸着により観察対象試料（１）を固定する試料吸着膜（１２）とを備えている。

　試料吸着膜（１２）として用いられる金属膜としては、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、クロム、金、プラチナの何れかの元素を主成分として含む金属膜が好適である。

　一般に、生物試料の構成物質であるタンパク質は、ニッケルイオンやコバルトイオンなどの金属イオンに吸着し易い性質がある。本発明では、この性質を利用して上述の試料吸着膜（１２）を試料支持部膜（１１）の主面の一方に形成してこれに観察試料を吸着させるようにする。このような試料支持部材（１０）を用いれば、生物試料を含む溶液を試料吸着膜（１２）の上に滴下したり試料支持部材（１０）を収容したセル内に注入したりするだけで、観察試料を固定することが可能となる。

　また、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、クロム、金、プラチナ等の金属は荷電粒子の吸収効率が高い一方、「水の窓」領域の軟Ｘ線の透過能が高い。このため、これらの金属からなる試料吸着膜（１２）は、観察試料側へと透過する荷電粒子を遮蔽して試料へのダメージを低減する一方、Ｘ線観察像の画質は低下させ難いという利点がある。

　さらに、上記の金属膜は、温度変化や湿度変化あるいは紫外線照射等による劣化も少なく耐久性にも優れている。

　なお、試料吸着膜（１２）の厚みに特に制限はないが、あまり厚いと「水の窓」領域の軟Ｘ線の吸収を無視できなくなるため、３００ｎｍ以下とすることが好ましい。

　Ｘ線放射膜（１３）は、荷電粒子の照射を受けて波長が０．６～６ｎｍの特性Ｘ線を放射する。このような膜としては、カーボン、アルミニウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、ニッケル、シリコン、ゲルマニウム、及びこれらの酸化物若しくは窒化物を主成分とする膜が好適である。特に、酸化物や窒化物は酸素や窒素の原子を多量に含むため、「水の窓」領域の軟Ｘ線の放射源として好適である。

　なお、図１に示した例では、Ｘ線放射膜（１３）は単層の膜としたが、組成の異なる複数の膜を積層させた多層構造とし、様々な特性Ｘ線を発生させることとしてもよい。この場合、全ての膜からの特性Ｘ線が顕著に減衰することなく観察試料へと照射されることが必要であることから、各膜の厚みを１００ｎｍ以下とし、さらに、荷電粒子照射側から主成分元素の原子番号が小さい膜から大きい膜となる順番で積層させることが好ましい。あるいは、Ｘ線放射膜（１３）が金属やカーボンの酸化物や窒化物、もしくは合金の場合は、荷電粒子照射側から組成材料の質量の軽いものから重いもの順に積層させることとしてもよい。

　また、図１に示したように試料支持膜（１１）とＸ線放射膜（１３）との間に、あるいは試料支持膜（１１）と試料吸着膜（１２）との間に、観察試料（１）に対する荷電粒子によるダメージの更なる軽減を目的として、厚みが５～１００ｎｍ程度の金属元素を主成分とする荷電粒子遮蔽膜（１４）を設けるようにしてもよい。このような荷電粒子遮蔽膜（１４）としては、金、プラチナ、パラジウム、オスミウム、タングステン、スズ、コバルト、ニッケルの何れかの金属元素を主成分とする膜が好ましい。

　試料支持部材（１０）のＸ線放射膜（１３）の上面（表面）から電子線が照射され、入射電子は試料支持膜（１１）の内部で拡散しながら広がり、試料支持膜（１１）の下面付近に到達する。Ｘ線観察像を撮影する際の電子線加速電圧は、試料支持膜（１１）に入射した電子が該試料支持膜（１１）をほとんど透過せず、且つ、試料支持膜（１１）の下面に到達する程度の電圧に調整され、観察試料（１）には電子線が照射されない条件とされる。

　このような加速電圧とした場合には、試料支持膜（１１）の下面からは、試料支持膜（１１）内で発生したＸ線のみが放出され、入射電子線（１次電子）の試料支持膜（１１）外への放出はほとんどなくなる。このため、試料支持膜（１１）の下面に付着している観察試料（１）に対して１次電子がダメージを与えることを回避することができる。

　試料支持膜（１１）の下面から放出されたＸ線は、観察試料（１）が付着している部位では少なくともその一部が吸収される一方、その他の部位ではそのまま透過することとなる。

　図１中に示したように、試料支持膜（１１）の下方に配置されているＸ線検出器（６０）により検知されたＸ線の検出信号は、増幅器（７０）で増幅され、走査回路部（４５）から走査信号を受信するデータレコーダ（８５）に送られて記録され、この検知信号（および走査信号）に基づいてＸ線画像処理ＰＣ（８０）によりＸ線画像が形成される。つまり、電子線の走査信号を基に、各電子線照射位置に対応付けられたＸ線信号強度を計測することで、観察試料（１）のＸ線画像を得ることが可能となる。そして、電子銃（３０）から出射する電子線は、偏向コイル（５０）により試料支持膜（１１）上の所望の範囲を走査可能であるから、Ｘ線検出器（６０）で検知されるＸ線の強度は、観察試料（１）の付着領域では相対的に弱く、その他の領域では相対的に強くなり、Ｘ線画像処理ＰＣ（８０）により形成されるＸ線画像には、観察試料（１）の形状や構造等の情報が含まれることとなる。

　図１に示した構成例では、Ｘ線検出器は１つだけ設けられているが、Ｘ線検出器を複数備えることとし、これら複数のＸ線検出器を、試料支持膜（１１）に支持された観察試料（１）を異なる方向から望む位置に配置するようにしてもよい。

　図２は、Ｘ線検出器を複数備えたＸ線顕微鏡の構成例を説明するための図で、この図に示した例では、Ｘ線検出器は３つ設けられている（６０ａ～ｃ）。これに対応して、増幅器も３つ設けられ（７０ａ～ｃ）、これらの増幅器からの検知信号をＡ／Ｄ変換器（７５）およびデータレコーダ（８５）を介して、Ｘ線画像処理ＰＣ（８０：ここでは３次元画像処理用ＰＣ）に送る構成となっている。これ以外の基本的構成は、図１に示したものと同じである。

　試料支持膜（１１）内からのＸ線は様々な方向に放出されるが、Ｘ線検出器を複数設け、これらを試料支持膜（１１）に支持された観察試料（１０）を異なる方向から望む位置に配置することとすれば、試料を望む角度に依存した複数のＸ線画像（傾斜画像）を得ることができる。つまり、１回の電子線走査で検出器数と同数の傾斜画像が得られることとなり、これらの傾斜画像から、観察対象である試料の３次元構造を求めることが可能となり、しかも、上述したとおり、試料に対するダメージも極めて軽微なものである。

　なお、図２では、Ｘ線検出器数が３の例を示したが、当然のことながら、例えば数十個あるいはそれ以上のＸ線検出器を配置するようにして多数の傾斜画像を取得し、高精度の３次元構造を求めるようにすることも可能である。

　図３は、２次電子を検出してＸ線画像を形成する態様のＸ線顕微鏡の構成の一部を示した図で、この態様では、試料支持部（１０）を載置するホルダ支持部（２１）の下方に光電変換機構部（２２）を設け、この光電変換機構部（２２）には観察試料（１）を透過したＸ線を電子に光電変換させる光電変換面（２３）が設けられている。光電変換面（２３）で発生する電子は、２次電子検出器（６５）により検出され、図１に示したのと同様に、走査回路部から走査信号を受信するデータレコーダに送られて記録され、この電子線検知信号（および走査信号）に基づいてＸ線画像処理ＰＣによりＸ線画像が形成される。なお、図３に示したホルダ支持部（２１）の下部は、いわゆる「絞り」として機能している。

　この態様のＸ線顕微鏡は、通常のＳＥＭに特段の改良を加える必要がないという利点がある。すなわち、図１や図２に示したＸ線顕微鏡では、ＳＥＭ内部にＸ線検出器と増幅器を新たに設置する等の必要が生じるが、図３の態様とすればこのような手間は不要となる。また、光電変換面（２３）には金薄膜が利用可能であり、簡便で小型の構造のものとすることができるため、光電変換機構部（２２）を通常のＳＥＭで用いられる試料ステージの上にそのまま載せてＸ線顕微鏡観察することも可能である。

　図４は、図３に示した態様のＸ線顕微鏡において、更に、光電変換面（２３）へのＸ線透過経路中に、電子線遮蔽用のフィルタ（２４）を設けることとした態様を示している。このフィルタ（２４）は、電子線を遮蔽する一方、Ｘ線は透過させる。フィルタ（２４）により、透過電子が２次電子検出器（６５）により検出されてノイズとなったりＸ線顕微鏡像のコントラスを低下させることを、完全に抑制することが可能となる。

　また、このフィルタ（２４）として、窒化シリコン膜等の耐圧性の膜を用いることとすれば、ホルダ支持部（２１）は試料収容セルとして機能することとなり、このセル内部を大気圧に保つこともでき、更に、溶液試料の観察も可能となる。

　なお、図４に示した態様のＸ線放射膜（１３）は、組成の異なる複数の膜（１３ａ～ｃ）を積層させた多層構造のものであり、荷電粒子である電子線の照射側から、カーボン膜（１３ａ）、アルミニウム膜（１３ｂ）、チタン膜（１３ｃ）の順番で、すなわち、主成分元素の原子番号が小さい膜から大きい膜となる順番で積層されており、それぞれの特性Ｘ線のエネルギーは、２８３ｅＶ、４５３ｅＶ、１５５０ｅＶである。なお、これらの膜は何れも厚みが１００ｎｍ以下であるが、このような積層構造とすることにより、複数の特性Ｘ線を発生させるとともに、全ての膜からの特性Ｘ線が顕著に減衰することなく観察試料（１）へと照射される。

　図５は、図２に示した態様のＸ線顕微鏡において、Ｘ線放射膜（１３）を組成の異なる複数の膜（１３ａ～ｃ）を積層させた多層構造のものとし、更に、Ｘ線検出器（６０ａ～ｃ）としてＸ線エネルギーの計測が可能なシリコンドリフトＸ線検出器を用い、元素組成を３次元的に解析することを可能とした構成例を示した図である。なお、この構成では、データレコーダ（８５）にはエネルギー計測器が、また、画像処理用ＰＣ（８０）にはエネルギー分光画像処理用ＰＣが用いられる。また、シリコンドリフト検出器に代えてＰＩＮフォトダイオード型検出器などを用いることとしてもよい。

　この構成のＸ線放射膜（１３）も、図４に示したものと同様に、荷電粒子である電子線の照射側から、カーボン膜（１３ａ）、アルミニウム膜（１３ｂ）、チタン膜（１３ｃ）の順番であり、それぞれの特性Ｘ線のエネルギーは、２８３ｅＶ、４５３ｅＶ、１５５０ｅＶである。

　これらの特性Ｘ線のエネルギーに応じて、シリコンドリフトＸ線検出器（６０ａ～ｃ）の出力は変化する。具体的には、エネルギーの高いアルミニウムの特性Ｘ線では出力ピーク値は高く、エネルギーの低いカーボンの特性Ｘ線では出力ピーク値は低くなる。これらの出力をＡ／Ｄ変換した後、エネルギー計測器（８５）により、検出位置における特性Ｘ線種とそのＸ線強度を求める。この処理により、荷電粒子の走査領域におけるＸ線吸収分
光画像が求められるから、この画像を基に観察試料の元素分析（組成解析）が可能となる。

　また、上述したとおり、それぞれのＸ線検出器（６０ａ～ｃ）は観察試料（１０）を異なる方向から望む位置に配置されているから、試料を望む角度に依存した複数のＸ線吸収分光画像が得られることとなり、これらのＸ線吸収分光傾斜画像から、観察試料の３次元的な吸収分光情報や元素組成情報を求めることも可能である。

　観察対象が生物試料である場合には、試料が溶液中に存在する場合がある。また、種々の薬品等が当該生物試料の形状等に及ぼす影響などについて調べる必要も生じ得る。そこで本発明では、かかる要求に応えるべく、上述した試料支持部材（１０）を備えた試料収容セル、すなわち、観察対象となる試料を含む溶液をセル内に流入させて上述の試料吸着膜に吸着させる構造の試料収容セル、ならびに、セル内への溶液の流入を制御する機構を備えた構造の試料収容セルについても検討を行った。

　図６Ａ乃至Ｃは、本発明の試料収容セルの構成例を説明するための図で、図６Ａは斜視図、図６Ｂは上面図、図６Ｃは断面図、である。

　この試料収容セル（１００）は、本発明のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材（１０）が設けられ中央部に上部観察窓（１０３）を有するセル上部（１０１）と、セル上部（１０１）の試料吸着膜（１２）側の面に、上部観察窓（１０３）に対向する下部観察窓（１０４）を有するセル下部（１０２）とを有しており、これらセル上部（１０１）とセル下部（１０２）はシール部材を兼ねるスペース部材（１０５）を介して所定の間隔の隙間を有するように配置されている。

　また、セル上部（１０１）には、セル上部（１０１）とセル下部（１０２）との間に形成される隙間内に観察試料を含む溶液を導入するための注入孔（１０６）と空気孔（１０７）が設けられている。

　注入孔（１０６）から滴下された溶液は、空気孔（１０７）が反対側に設けられているために、表面張力の作用により、溶液流路（１０８）に沿って容易に観測窓（１０３、１０４）にまで導入され、溶液中に含まれている観察試料は、観察窓下の試料吸着膜（１２）に吸着し固定される。なお、溶液導入後は、注入孔（１０６）および空気孔（１０７）を密封部材や気密テープ等で塞ぎ、Ｘ線顕微鏡内にセットされる。

　図７Ａ乃至Ｃは、本発明の試料収容セルの他の構成例を説明するための図で、図７Ａは斜視図、図７Ｂは上面図、図７Ｃは断面図、である。この試料収容セルは、注入孔（１０６ａ～ｃ）を複数有し、これら複数の注入孔のそれぞれに対応付けられた複数の溶液流路（１０８ａ～ｃ）を備えており、これらの溶液流路に導入された溶液は、表面張力の作用により、観測窓（１０３、１０４）にまで導入される。

　また、この試料収容セル（１００）のそれぞれの注入孔近傍の側部には、注入孔から試料吸着膜側へと溶液を押し出すための圧力印加部としてのダンパー（１０９ａ～ｃ）が設けられており、これらのダンパーの先端には圧力印加弁が設けられている。

　このような複数の溶液流路（１０８ａ～ｃ）を設けることとすると、予め観察試料を収容したセル内に、新たに試薬等を送り込み、これによる反応を観察するといった実験等も容易となる。なお、図中に符号１２０ａおよび１２０ｂで示したものは、注入孔および空気孔を塞ぐ密封部材である。このような溶液の送り込みは、圧力印加部によらず、電気泳動的に行うこととしてもよい。

　図８Ａ及びＢは、溶液の送り込みを電気泳動的に行うこととした、本発明の試料収容セルの構成例を説明するための図で、図８Ａは上面図、図８Ｂは断面図、である。注入孔は３つ（１０６ａ～ｃ）設けられており、それぞれの注入孔に対応付けられて導電膜の電極（１１０ａ～ｃ）が設けられている。また、これらの電極と並んで、試料吸着膜（１２）に電圧を加えるための導電膜の電極（１１０ｄ）も設けられ、電源（１１１）により、注入孔の近傍に設けられた導電膜の電極（１１０ａ～ｃ）と試料吸着膜（１２）との間に電位差を生じさせ、電気泳動により試料吸着膜側へと観察試料を導く。

　なお、試料吸着膜（１２）の導電性が高い場合には、その試料吸着膜（１２）と電極（１１０ｄ）を直接接続させることができるが、試料吸着膜（１２）の導電性が不十分である場合には、図９Ａの上面図及び図９Ｂの断面図に図示したように、観察窓（１０３）と空気孔（１０７）との間に別途電極（１１０ｅ）を設けることとして溶液の電気泳動を促すこととしてもよい。

　上述した試料収容セルを用いて、観察対象となる試料の鮮明な画像を得るためには、適正な条件下で観察を行うことが必要である。特に、Ｘ線顕微鏡の観察条件である荷電粒子線の加速電圧と電流は、極めて重要である。例えば、ＳＥＭを使用してＸ線顕微鏡観察を行う場合の電子線加速電圧は、電子線がＸ線放射膜を透過する一方、観察試料には到達しない値に設定することが必要である。このような適正条件は、試料支持部材を構成している各膜の材質や厚み等の因子により定まる。

　こうした条件は、試料収容セルの外観を見ただけでは知ることはできないため、簡便な観察を行う観点からは、予め、試料支持部材そのものに、或いは、試料支持部材を収容する試料収容セルに、構成部材に関連する情報を記録するセル情報記録部を設けておき、これに観察条件や放射される特性Ｘ線の情報を印刷等しておくことが望ましい。このようなセル情報記録部は、例えば、外部からの読取が可能な位置に、記号や数字などの文字、バーコード、ＱＲコードなどを、印刷乃至刻印してもよい。また、例えば、半導体チップなどの、外部から読取及び書込が可能な記録媒体をセル情報記録部として用いてもよい。

　図１０Ａ及び図１０Ｂは、図６Ａ及び図６Ｂに示した試料収容セルのセル上部（１０１）に、セル情報記録部としてのバーコード（１１２）が印刷されている態様を図示したものである。

　また、図１１Ａ及び図１１Ｂは、上記バーコードの代わりに、セル情報記録部としての半導体チップ（１１３）を設けることとした態様を図示したもので、セル上部（１０１）の端部には、当該半導体チップ（１１３）への読取及び書込を可能とするための端子部（１１４ａ～ｄ）が設けられている。当然のことながら、非接触での情報の読取／書込み可能な素子をセル情報記録部として用いることも可能である。

　図１２は、図１１Ａ及びＢに示した態様の試料収容セルを用いて観察を行う際の、Ｘ線顕微鏡の構成例を説明するための図である。基本的な装置構成は図１に示したものと同様であるが、試料収容セル（１００）のセル上部（１０１）端部に設けられた半導体チップ（１１３）から、コネクタ（１１５）を介して構成部材に関連する情報である荷電粒子の加速電圧や電流量の適正値等がデータ入出力装置（９０）によって読み出される。データ入出力装置（９０）は、これらの情報に基づいて荷電粒子の加速電圧及び電流量を設定し、コントロールＰＣ（４０）により、電子銃の電圧制御部（９５）に印加すべき電圧と電流量が制御される。

　観察により得られたＸ線画像は、Ｘ線画像処理ＰＣ（８０）によって形成されてコント
ロールＰＣ（４０）へと送られ、このＸ線画像に試料収容セルの構成部材等の情報が書き加えられて保存される。なお、観察試料を何時どのような条件で観察したのかを明らかにして、試料の保存や分類の際に役立てること等を目的として、Ｘ線画像を取得した日時や観察条件等の情報をコントロールＰＣ（４０）からコネクタ（１１５）を介してセル情報記録部である半導体チップ（１１３）に保存させる構成としてもよい。

　以下に、実施例により、本発明をより具体的に説明する。

　［実施例１］
　図１３Ａは、５０ｎｍ厚の窒化シリコン膜の試料支持膜に試料吸着膜として１２０ｎｍ厚のニッケルを蒸着し、この試料吸着膜で酵母を固定して観察したＸ線画像である。また、図１３Ｂ～Ｄはそれぞれ、上記試料支持部材に電子線を照射した場合のシミュレーション結果を示した図、図１３Ｂに示した電子線照射時に窒化シリコンの試料支持膜から放出される窒素の特性Ｘ線の放射量のシミュレーション結果を示した図、厚みが１２０ｎｍのニッケルの膜につきＸ線の透過率をシミュレーションした結果を示した図である。

　図１３Ｂに示したシミュレーションは試料支持膜及び試料吸着膜中での電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションにより求めたものであり、そのときの電子線の加速電圧は７ｋＶである。この程度の電子線加速条件では、殆んどの入射電子がニッケル膜で散乱・吸収されるため、電子線による観察試料へのダメージは殆ど無視できる。

　電子線照射により、窒化シリコン膜から窒素の特性Ｘ線（４５３ｅＶ）が放出されるが（図１３Ｃ）、この窒素の特性Ｘ線は、１２０ｎｍ厚のニッケル膜を約４０％透過する（図１３Ｄ）。従って、試料吸着膜であるニッケルが、電子線を遮蔽しＸ線を透過するフィルタの役割も合わせもつこととなる。

　［実施例２］
　図１４Ａは、４０ｎｍ厚のカーボン膜の試料支持膜に試料吸着膜として６０ｎｍ厚のニッケルを蒸着し、このニッケル膜に観察試料としてのバクテリアを吸着させて２，０００倍の倍率で観察した画像であり、バクテリアが極めて均一に程よく吸着されていることが確認できる。

　図１４Ｂは、上記バクテリアの観察倍率を１５，０００倍に上げたときの画像であり、この倍率ではバクテリアの内部構造も詳細に観察される。

　図１４Ｃは、上記試料支持部材に電子線を照射した場合のシミュレーション結果を示した図で、このシミュレーションは試料支持膜及び試料吸着膜中での電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションにより求めたものであり、そのときの電子線の加速電圧は４ｋＶである。照射電子はカーボン層をそのまま透過し、ニッケル膜で散乱・吸収される。

　図１４Ｄは、カーボン膜で発生した特性Ｘ線の放射範囲（特性Ｘ線強度の広がりの程度）を示す図で、カーボン膜からは極めて強い特性Ｘ線が放射されるが、カーボン膜内での電子線の散乱が少ないため、放射範囲は５ｎｍ以下と極めて小さく、これにより高分解能でのX線観察が可能となる。

［実施例３］
　図１５Ａは、複数の種類のＸ線放射膜を積層したときの電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションで求めた図で、ここでは、電子線入射側から、カーボン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、チタン（２０ｎｍ）の順に積層されており、電子線の加速電圧は５ｋＶである。複数の金属から構成される薄膜を積層することで、複数の特性Ｘ線を放射させることができ、これらの吸収比率等から試料内の元素組成を計測することが可能となる。また、電子線入射側から軽い元素順に薄膜層を形成することで、電子線の散乱範囲を抑えることができる。

　図１５Ｂは、カーボン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、チタン（２０ｎｍ）の各膜からの特性Ｘ線の放射範囲（特性Ｘ線強度の広がりの程度）を示す図で、各膜から特性Ｘ線が満遍なく放射されていることが確認できる。

　図１５Ｃは、上記特性Ｘ線の放射範囲を正規化して示した図で、この図から、何れの特性Ｘ線も半値幅は５ｎｍ以下であり、高い分解能を達成できる。

　これに対して、電子線入射側から、チタン（２０ｎｍ）、アルミニウム（２０ｎｍ）、カーボン（２０ｎｍ）の順に積層されたＸ線放射膜の電子線散乱状態をモンテカルロ・シミュレーションで求めると、電子線散乱範囲が大きく広がることが確認できる（図１６Ａ）。これは、電子線が初めに入射するチタン膜によって、大きく散乱されることに起因する。

　また、その特性Ｘ線強度もチタンが極めて強く、カーボンやアルミの放射量が低下する（図１６Ｂ）。さらに、図１６Ｂの結果を正規化して得られるX線放射範囲から、アルミニウム膜やカーボン膜のＸ線放射範囲が大きく広がっていることが確認できる。

　このような結果から、薄膜を積層したＸ線放射膜において特性Ｘ線の放射範囲を小さく抑えて高分解能観察を達成するためには、荷電粒子照射側から、主成分元素の原子番号が小さい膜から大きい膜となる順番で積層することが必要である。

　本発明は、観察試料側へと透過する荷電粒子を遮蔽して試料へのダメージを低減する一方、Ｘ線観察像の画質は低下させ難く、しかも、温度変化や湿度変化あるいは紫外線照射等による劣化も少なく耐久性にも優れている、生物試料のＸ線顕微鏡観察に好適なＸ線顕微鏡像観察用試料支持部材を提供する。

１　観察対象試料
１０　試料支持部材
１１　試料支持膜
１２　試料吸着膜
１３　Ｘ線放射膜
１４　荷電粒子遮蔽膜
２０　ホルダ
２１　ホルダ支持部
２２　光電変換機構部
２３　光電変換面
２４　電子線遮蔽用のフィルタ
３０　電子銃
４０　コントロールＰＣ
４５　走査回路部
５０　偏向コイル
６０　Ｘ線検出器
６５　２次電子検出器
７０　増幅器
７５　Ａ／Ｄ変換器
８０　Ｘ線画像処理ＰＣ
８５　データレコーダ
９０　データ入出力装置
９５　電圧制御部
１００　試料収容セル
１０１　セル上部
１０２　セル下部
１０３　上部観察窓
１０４　下部観察窓
１０５　スペース部材
１０６　注入孔
１０７　空気孔
１０８　溶液流路
１０９ａ～ｃダンパー
１１０ａ～ｅ　電極
１１１　電源
１１２　バーコード
１１３　半導体チップ
１１４ａ～ｄ　端子部
１１５　コネクタ
１２０ａ、１２０ｂ　密封部材

Claims

　試料支持膜と、該試料支持膜の一方主面に設けられ荷電粒子の照射を受けて軟Ｘ線領域の特性Ｘ線を放射するＸ線放射膜と、前記試料支持膜の他方主面に設けられた金属膜であって吸着により観察対象試料を固定する試料吸着膜とを備えているＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記試料吸着膜は、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、クロム、金、プラチナの何れかの元素を主成分として含む金属膜である請求項１に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記試料吸着膜の厚みは３００ｎｍ以下である請求項１又は２に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記Ｘ線放射膜は、カーボン、アルミニウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、ニッケル、シリコン、ゲルマニウム、及びこれらの酸化物若しくは窒化物を主成分とする膜である請求項１乃至３の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記Ｘ線放射膜は、組成の異なる複数の膜が積層されている請求項４に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記組成の異なる複数の膜の厚みは何れも１００ｎｍ以下である請求項５に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記組成の異なる複数の膜は、荷電粒子照射側から、主成分元素の原子番号が小さい膜から大きい膜となる順番で積層されている請求項５又は６に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記組成の異なる複数の膜は、荷電粒子照射側から、膜の組成質量の軽い材質から重い材質となる順番で積層されている請求項５又は６に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記試料支持膜と前記Ｘ線放射膜との間又は前記試料支持膜と前記試料吸着膜との間に荷電粒子遮蔽膜を備えている請求項１乃至８の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記荷電粒子遮蔽膜は、金、プラチナ、パラジウム、オスミウム、タングステン、スズ、コバルト、ニッケルの何れかの金属元素を主成分とする膜である請求項９に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記試料支持膜は、窒化シリコン膜、カーボン膜、又はポリイミド膜である請求項１乃至１０の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　前記試料支持膜の厚みは、２００ｎｍ以下である請求項１乃至１１の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材。
　請求項１乃至１２の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料支持部材が設けられたセル上部と、該セル上部の前記試料吸着膜側の面に対向する観察窓を有するセル下部とを有し、前記セル上部と前記セル下部がスペース部材を介して所定の間隔の隙間を有する
ように配置されているＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記セル上部と前記セル下部との間に形成される隙間内に観察試料を導入する注入孔と空気孔が設けられている請求項１３に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記注入孔を複数有し、該複数の注入孔のそれぞれに対応付けられた複数の流路を備えている請求項１４に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記注入孔の近傍に設けられた導電膜と、該導電膜と前記試料吸着膜との間に電位差を生じさせて電気泳動により前記注入孔から前記試料吸着膜側へと観察試料を導く電圧印加部とを有している請求項１４又は１５に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記注入孔の近傍に、該注入孔から前記試料吸着膜側へと観察試料を押し出す圧力印加部を備えている請求項１４又は１５に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記試料収容セルの構成部材に関連する情報を記録するセル情報記録部を備えている請求項１３乃至１７の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記セル情報記録部は、外部からの読取が可能な位置に印刷乃至刻印されている請求項１８に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　前記セル情報記録部は、外部から読取及び書込が可能な記録媒体である請求項１８に記載のＸ線顕微鏡像観察用の試料収容セル。
　請求項１乃至１２に記載の試料支持部材又は請求項１３乃至１７に記載の試料収容セルを保持するホルダと、
　前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、
　該荷電粒子線の走査機構部と、
　前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、
　該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、
を備えているＸ線顕微鏡。
　請求項１乃至１２に記載の試料支持部材又は請求項１３乃至１７に記載の試料収容セルを保持するホルダと、
　前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、
　該荷電粒子線の走査機構部と、
　前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を電子に光電変換する光電変換部と、
　前記光電変換された電子線を検知する電子線検出器と、
　該電子線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、
を備えているＸ線顕微鏡。
　請求項１８に記載の試料収容セルを保持するホルダと、
　前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、
　該荷電粒子線の走査機構部と、
　前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を検知するＸ線検出器と、
　該Ｘ線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、
　前記セル情報記録部に記録された情報の読取部と、
　該セル情報記録部に記録された情報に基づいて前記荷電粒子銃から射出される荷電粒子の加速電圧及び電流量を設定する制御部と、
を備えているＸ線顕微鏡。
　請求項１８に記載の試料収容セルを保持するホルダと、
　前記Ｘ線放射膜に荷電粒子線を収束させて入射する荷電粒子銃と、
　該荷電粒子線の走査機構部と、
　前記荷電粒子線入射に伴い前記試料支持部材から発生するＸ線を電子に光電変換する光電変換部と、
　前記光電変換された電子線を検知する電子線検出器と、
　該電子線の検出信号に基づいてＸ線画像を形成する信号処理部と、
　前記セル情報記録部に記録された情報の読取部と、
　該セル情報記録部に記録された情報に基づいて前記荷電粒子銃から射出される荷電粒子の加速電圧及び電流量を設定する制御部と、
を備えているＸ線顕微鏡。
　前記Ｘ線検出器を複数備え、該複数のＸ線検出器は、前記試料支持部材に支持される観察試料を異なる方向から望む位置に配置されている請求項２１又は２３に記載のＸ線顕微鏡。
　前記信号処理部は、前記複数のＸ線検出器からのＸ線検出信号に基づいて３次元のＸ線画像を形成する画像処理部を備えている請求項２５に記載のＸ線顕微鏡。
　前記Ｘ線検出器はエネルギー分光可能なＸ線検出器である請求項２１、２３、又は２５の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡。
　前記Ｘ線検出器は、シリコンドリフト検出器又はＰＩＮフォトダイオード型検出器である請求項２７に記載のＸ線顕微鏡。
　更に、前記ホルダの走査機構部を備えている請求項２１乃至２８の何れか１項に記載のＸ線顕微鏡。