CN103760179B - 细胞显微成像方法、图像处理方法以及成像分析系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞显微成像方法、图像处理方法以及成像分析系统，所述方法利用软X射线来进行，包括以下步骤：（1）标本制作；（2）目标细胞的初步查找和选择，和（3）软X射线成像。所述图像处理方法能够降低噪声、消除伪影和提高对比度，所述成像分析系统包括：光学显微镜系统、同步辐射装置、图像处理系统和显示装置。所述方法和系统可有效探测细胞的存在及其所在的区域环境，研究细胞和亚细胞的空间尺度、结构及其功能，从而为包括病理学、医学、农林、食品在内的多个领域提供有效的中间信息。

Description

细胞显微成像方法、图像处理方法以及成像分析系统

技术领域

本发明涉及一种利用软X射线进行细胞显微成像的方法、图像处理方法以及成像分析系统。

背景技术

Roentgen在1895年发现的X射线具有强烈穿透物质的特性，适用于人体组织器官成像。其波长较短，为0.1-1.0nm。但X射线与物质作用很复杂，加之难以制造出类似可见光应用中的光学元件，所以很难实现X线显微镜。随着电子对撞同步辐射光源的诞生，发射出专用软X射线，其波长在1-10nm，通过光学衍射聚光和光学元件把软X射线会聚投射到样品上，再成像到像平面上。

软X射线显微成像术的分辨率已达10nm，其原理是：

将样品紧贴着放在软X射线灵敏的探测器(光刻胶)上，经过软X射线曝光及“显影”，显示出光刻胶辐射的图形，它与样品原物形态有着相对应的关系。然后用光学或电子显微镜观察此图形，就可读出样品的软X射线显微图像。

软X射线显微术是一种主要利用“水窗口”波段(2.3-4.4nm)的软X射线作为光源的显微成像技术。相对于光学显微镜，它具有更高的成像分辨率；相对于电子显微镜，其样品制备简单，仅需超薄切片标本，无须对样品进行冰冻、封蜡、脱水、染色等传统的病理检查工作程序。概括地说，软X射线显微成像技术可以不用传统病理方法，就可实现观察细胞组织的亚微结构形态学特征。

近几年来，软X射线显微术的应用研究取得了飞速的发展，尤其是在生命科学研究中。除有类似病理学诊断价值外，软X射线显微成像技术具有以下特点：①不用染色可清晰分辨，其分辨率 (70.0nm)比光镜高，并接近电镜；②组织标本可以在活体状态下进行病理学检查分析；③可以对自然状态下活体组织细胞亚显微结构进行鉴别诊断及应用于临床诊断。软X射线显微镜可以观察自然状态下的生物样品，目前可以观察细胞的超微结构和内部动态变化，还可以在细胞水平的样品上研究蛋白质、DNA等生物大分子的分布。

软X射线显微技术已为生物医学的研究开拓了一条新途径，受到各国科学家的关注。该技术最适合于自然状态下生物样品的高分辨率成像，在世界范围内得到迅速发展。当今，许多国家重视积极开发研制各种形式的软X射线显微镜并应用于生物医学样品的研究，取得了显著进展。

美、俄、德、日、英、法等国掌握了此项技术，并对软X射线生物医学样品进行了研究。Kirz和Rarback在Brookhaven(1981)、Göttingen (1983)召开的会议上，发表了软X射线综述的相关报道。1985年Feder等人使用软X射线显微成像方法已成功得到分辨率约10nm的活体状态下的血小板软X射线显微成像图；1990年Shinohara等拍摄了HeLa细胞核仁清晰的软X射线显微图像，并对染色质、酶原颗粒结构进行了观察分析。尽管如此，国外目前对软X射显微技术应用于医学分析还鲜见报道。

国内对软X射线显微成像技术研究虽然起步稍晚，但起点较高，对软X射线显微成像图技术的研究和应用也给予了高度重视。1991年中国科技大学(合肥)国家同步辐射实验站建成，1992年开始对国内外开放。我国科研人员和学者可以在合肥同步辐射光源上开展软X射线显微术研究，在软X射线显微术的理论和实践上做出了突出贡献，也取得很多的成果，中国科技大学谢行恕教授在软X射线显微术的理论和实践上做出了突出的贡献；也有学者将软X射线成像应用于大肠杆菌、男性精子、昆虫翅膀、植物种子、食品等方面的研究。

在近些年，关于对组织细胞的评估和分析，在方法和技术上的进展已经使数字图像分析成为辅助病理学家更准确解释图像的最有效工具之一。尽管这样的图像分析技术有助于给病理学家、细胞学家等提供准确的、重复性和客观的细胞分析，但是细胞组织的解释仍倾向于依赖对样品的主观分析。这样的组织学解释技术还严重受制于观察者自身以及观察者之间一致性的变化，这进一步导致产生较低准确性、较低重复性和较少客观性的结果。因此如何给病理学家、细胞学家等提供更准确的、重复性更高和更客观的细胞组织中间信息一直是所追求的。

在国内，目前用软X射线显微成像技术多半应用于微生物学、植物和动物的生物样品标本，利用软X射线进行细胞显微成像研究方面尚处于兴起和起步阶段，且研究的重点主要集中在软X射线成像操作方面，过于依赖X射线成像本身，在样品处理方面以及图像处理方面研究较少，往往忽略了样品处理和图像处理对图像信息产生的影响，同时还缺少对最佳适用于软X射线成像的衍射光栅的研究。此外，在超薄切片制作过程中，由于受传统X射线成像技术（例如硬X射线成像技术）的影响，不太重视切片制作过程中可能产生的褶皱，然而这种褶皱对于利用软X射线进行细胞显微成像却能够产生很大的影响；在成像过程中，也常常沿用传统X射线成像技术，对最佳适用于软X射线的光栅和光刻胶也缺乏研究，致使衍射光栅的性能受到限制。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明人经过深入研究，提供了以下解决方案，以提供有效中间信息，例如提供给病理学家或农林专家等，由其进行细胞特征提取、分类、分析、比较和得出可靠结论。

在一方面，提供了一种利用软X射线进行细胞显微成像的方法，其特征在于该方法利用软X射线进行细胞亚微结构的成像，其包括以下步骤：（1）标本制作；（2）目标细胞的初步查找和选择；和（3）软X射线成像。

所述标本制作步骤可包括：（1）将组织细胞标本切成超薄切片标本，超薄切片标本厚度为1.5-5nm；（2）将已切好的超薄切片标本放置在38℃-40℃水槽的水面上，使标本漂浮于水面迅速均匀展开呈平面状，所述槽液中含有3ppm-10ppm重量的吐温20或吐温40，优选吐温20；和（3）使用电镜铜网捞取已在水槽漂浮展平的超薄切片标本，再将该电镜铜网放在吸水纸上控尽水分并晾干，所述电镜铜网为200-300目并且在捞取切片之前进行如下处理：将干净的铜网平铺在培养皿内滤纸上，然后缓慢倒入0.1-0.5%重量的Formvar溶液直到漫过铜网为止，再立即倒干培养皿内液体，干燥备用。

吐温20和40 属于非离子型表面活性剂，能降低槽液的表面张力和提高载网支持膜及树脂切片的亲水性。如果槽液的浓度太高，切片过程就会出现包埋块沾水或切片浸湿而不能自由漂浮；如果浓度太低，则不易垂直拖起切片。可据此原则来调整和配制出适宜浓度的吐温20或40槽液。槽液中吐温20或吐温40的浓度优选为5ppm重量。通过上述方法，可有效减轻或消除切片褶皱的形成。

所述组织细胞标本来自植物例如农业作物和林业植物、微生物、食品、动物、人体等。对于植物、人体和动物体，尤其是人体和动物，根据该中间信息尚不能直接获得诊断结果，必须将处理后的图像数据进行存储，作为中间信息提供给病理学家，方便其进一步进行细胞特征提取、分类、分析、比较，由其依赖其主观分析得出可靠诊断结论。

目标细胞的初步查找和选择步骤可包括：将电镜铜网超薄切片标本置于光学显微镜下进行视觉检查，初步查找目标细胞后，选择并固定好观察视野，在光学显微镜下拍摄细胞放大至少100倍的光镜照片，其中目标细胞的初步查找和选择是基于细胞显微成像的直接目的进行的，所述直接目的包括为生物学、病理学、食品学和农林业提供可用的有效中间信息。

制备好组织切片后，在显微镜下视觉检查组织样品，如果要对切片进行详细图像分析，必须使用更大倍数的显微镜。

软X射线成像步骤可包括：将电镜铜网超薄切片标本送至同步辐射装置，应用同步辐射软X射线显微光束线扫描，显影在光刻胶上，再用显微透射进行观察并拍摄出软X射线显微成像的图像，软X射线显微光束波长范围为1.0-10.0nm，软X射线显微对生物样品曝光的水窗材料为氮化硅，最小厚度为20nm，所述氮化硅的配比为Si₃N₄，窗口尺寸为0.1-0.5mm× 0.1-0.5mm，优选0.2mm × 0.2mm。

在另一方面，提供了一种图像处理方法，该方法可用于处理前述方法获得的图像以降低噪声、消除伪影和提高对比度，处理步骤包括：在同步辐射软X射线细胞显微成像后，首先进行图像信号调理，然后进入图像信号采集进行数字采样，最终将数字信号以串口或并口的形式送入计算机系统进行处理，其中，同步辐射软X射线显微图像信号是模拟信号，在变换为数字信号之前进行调理，即放大、缓冲或定标模拟信号，以适合于后续信号采集单元输入；图像信号采集包括图像预处理、图像分割分析和重叠细胞重构。

所述图像预处理包括灰度变换、直方图调整、细胞前置处理、细胞核前置处理以及去除干扰物质；所述灰度变换为将细胞影像转为灰度格式，以便于后续的处理工作，利用彩色影像与灰度影像之间的转换公式进行转换；所述直方图调整为采用直方图拉伸或直方图均衡化方法间接增强对比度；所述细胞前置处理包括对比调整、二值化、边缘检测中的一种或其任意组合；所述去除干扰物质包括侵蚀、扩张及逻辑处理中的一种或其任意组合，目的是取得去除干扰物质后的细胞影像。

通常，定量评价数字化图像的重要步骤是图像分割，其有时包括额外的预处理中间步骤。在分割期间，使细胞相互之间分离以及从图像背景中分开。在一些情况中，算法的进步已经使得有可能向下分割细胞至亚细胞组分水平（即，核、细胞质和膜）。然而，分割在图像分析中经常是困难、复杂且易出错的步骤。对于以在数字化图像中显示良好的方式而使细胞被精细地分开和染色的切片来说，通常可以有效地完成分割。然而一旦上述条件之一未得到满足，就必须应用极复杂的和费时的分割算法，其中要应用另外的关于细胞及其相互关系或者关于标志物和复染亚细胞定位的已有知识，使整个过程变得非常复杂。例如，对于浸润肿瘤的组织切片正是如此，此时切片中大部分细胞不能清楚地被分开，而是趋向于相互接触和重叠。

在本发明中，图像分割分析可包括；将第一快速行进算法应用于经预处理的图像以获得第一快速行进图，所述第一快速行进算法起始于图像的背景，并且第一快速行进算法的速度函数是基于图像的第一边缘强度图；将第一快速行进图分割成多个同质区域；将所述同质区域中的每一个区域分别映射到所述图像的一个结点使得相邻同质区域的结点彼此相连，以及使得图像包含与位于细胞中心的同质区域相对应的根结点；基于所述图像，将每个同质区域按前景或背景进行划分；在所述按前景划分的同质区域内将第二快速行进算法应用于第二边缘强度图，使得将前景分割成单个的细胞，其中该第二快速行进算法起始于与所述图像的根结点相对应的同质区域。通过采用本发明的图像分割方法，即使对于细胞相互接触和重叠严重的情形，有效地使细胞相互之间分离并且从图形背景中分开。

本发明的上述图像分割方法还具有诸多显著优点：图像中存在的生物细胞 可通过第一快速行进算法得到放大以获得第一快速行进图，与不应用第一快速行进算法的图像相比，这使得能够更容易地将第一快速行进图分割成多个同质区域；此外，通过将通知区域映射到图的结点，可以形成简单明了的判定标准；该判定标准可以按简单方式应用于同质区域按前景或背景划分的步骤中；另外，将同质区域按前景或背景划分使得第二快速行进算法仅仅只需应用于作为前景划分的同质区域内，从而使第二快速行进算法的运算时间和成本得到很大减少。

所述重叠细胞重构可以包括：基于所述经图像分割后的映射数据来执行三维反映射处理，该三维反映射处理包括将所述映射数据用滤波器沿行方向进行卷积，该滤波器的滤波器系数在多行X射线检测器的一条通道和另一条通道彼此之间不同；以及对由所述三维反映射处理获得的数据进行重构函数卷积，从而有效消除由于细胞间的相互连接、相邻边界紧密重叠而使分割造成的伪边界和伪轮廓，避免细胞发生信息提取产生误差，通过该重叠细胞重构使得将这些因素消除。

在又一方面，提供了一种细胞显微成像分析系统，其包括：光学显微镜系统、同步辐射装置、图像处理系统和显示装置，其中：所述同步辐射装置包含单色器，该单色器包括在入口狭缝和出口狭缝之间的两个镜和一个衍射光栅，所述两个镜为柱面镜而且设置成使得它们的弧矢面与所述光栅的切面或色散面重合，并且所述入口狭缝和出口狭缝相对于光栅的中心对称分布；所述同步辐射装置还包含光传感器、评估单元和控制单元，其中所述光传感器部件用于实时接收来自X射线源的软X射线所发出的光，所述评估单元用于评估软X光的量，所述控制单元用于基于该评估结果来控制X光源；所述图像处理系统能够实施上文所述的图像处理方法；以及所述显示装置能够将经处理的数字信号转换为可视图像。上述单色器器件的设置能够更有效地使狭缝开口与距离相匹配，极大地提高接受强度和分辨率，减少环境本底的干扰。由于成像机时有限，必须要快速、灵活地进行能量切换和光束调节，达到光源的最佳化，以节省用户有限的机时，上述通过软X光的量的动态控制，可获得最佳的成像效果，克服了现有技术中存在的软X光的量固定所带来的适应性差的问题，并且大大节省了用户的机时。经处理的数字信号转换的可视图像能够恰当、准确地表现出原始光学图像的重要信息。

利用软X射线显微方法对生物样品曝光所采用的含氮化硅薄膜的衍射光栅可以通过如下方法制得：在洁净的石英玻璃衬底上，用电子束蒸发方法制得Cr/Au层，从而形成基片，其中Cr层的厚度为2-10nm，Au层的厚度为5-20nm，在该基片上旋涂厚度为100-800nm的电子束光刻胶，并在烘箱中干燥，然后利用电子束在涂有电子束光刻胶的基片上轰击出所需的波带片图形；对形成的波带片图形进行曝光，然后使用显影液进行显影，在基片上形成衍射光栅的光刻胶图形，然后采用等离子体气相沉积技术，在形成衍射光栅的光刻胶图形的基片上沉积一层氮化硅层，该氮化硅层的厚度是波长的奇数倍，所述氮化硅层的沉积在100-150℃的温度下进行；用去胶液去除光刻胶，然后采用ICP刻蚀基片底层的铬层和金层，从而形成含氮化硅薄膜的衍射光栅。

光刻剂优选是由下面通式I表示的单元构成：

（式I）

其中R¹、R²和R³各自独立地是氢原子、氟原子、直链烷基、支链烷基或环状烷基、或氟代烷基，所述这些烷基的碳原子数优选为3-20；R是直链烷基、支链烷基或环状烷基、或氟代烷基，所述这些烷基的碳原子数优选为3-20；m≥0，n≥0，s＞0，并且1≤k≤3。

当光刻剂是通过将具有缩醛基团取代基的乙烯基磺酰胺共聚获得的具有上述式I的聚合物时，所得光刻图案具有良好的形状，没有发生表面粗糙和图案粗糙，并且在暴露于光的整个过程中没有发生表面粗糙化情形。

附图说明

图1为疑似食管鳞癌细胞软X射线显微成像的原始数据。

图2为疑似食管鳞癌细胞软X射线显微成像的灰度直方图。

图3为疑似食管鳞癌细胞软X射线显微成像的原图像灰度图。

图4为图3的对应直方图。

图5为图3的灰度变换图。

图6为图4的直方图调整图。

图7为进行阈值的分割的图像处理。

图8为细胞形态学的图像处理。

图9-1为采用Laplacian算子进行边缘检测图。

图9-2为采用Roberts算子进行边缘检测图。

图9-3为采用Sobel算子进行边缘检测图。

图9-4为采用Prewit算子进行边缘检测图。

具体实施方式

实施例1：利用软X射线显微成像进行疑似食管鳞癌细胞的软X射线成像及处理的方法

选6例住院的疑似患者(其中男4例，女2例)，年龄在51-64岁(平均57.3岁)。

切取标本送病理科做常规组织学、细胞学检查，发现疑似食管鳞癌细胞时，在光学显微镜下拍摄疑似食管鳞癌细胞放大100倍的光镜照片。同时又送疑似食管鳞癌细胞标本至同步辐射实验室应用软X线显微光束线扫描衍射，显影在光刻胶上，并拍摄出软X线显微成像照片。

本实施例使用的仪器设备为：

利用中国科技大学国家同步辐射实验室软X线显微成像光束线站；选用软X射线显微光束波长范围为1.0-10.0nm；主要利用“水窗口”波段(2.3-4.4nm)的软X射线作为光源的显微成像技术。

还包括有真空干燥箱，CJ-3A甩胶机(北京半导体设备厂生产)； Olympus微分干涉差显微镜(日本)及扫描电镜KYKY-1000B型(中国科学院科学仪器厂制造)；151II型超薄切片机(西德SEIXY厂制造)。

标本制作步骤为：

第一步：将疑似食管鳞癌细胞组织标本放置在德国生产的病理超薄切片机上，切成超薄切片病理组织细胞标本，超薄切片厚度为2-3nm。

第二步：把已切好的超薄切片病理组织细胞标本放置在38℃至40℃水槽的水面上，让标本漂浮在水面迅速均匀展开呈平面。

第三步：用上海产的电镜带把柄铜网捞取已在水槽漂浮展平的超薄切片病理组织细胞标本，然后，再将电镜铜网放在吸水纸上控尽水分并晾干。

分析识别步骤为：同步辐射软X射线疑似癌细胞显微成像后，首先进行图像信号调理，然后进入图像信号采集进行数字采样，最终将数字信号以串口或并口的形式送入计算机系统进行处理和智能识别。

同步辐射软X射线显微图像信号是模拟信号；在变换为数字信号之前必须进行调理，即放大、缓冲或定标模拟信号，使其适合于后续信号采集单元输入。

图像信号采集包括图像预处理、图像分割分析、和重叠细胞重构。

图像预处理模块为灰度变换；图像分割按上文所述方法进行。将处理后的图像数据进行存储，作为中间信息提供给病理学家，由其依赖其主观分析进行细胞特征提取、分类、分析、比较并得出可靠诊断结论。

在本发明中，软X射线显微术分辨率取决于所使用软X线的波长以及所用的光刻胶材料，同时也受后继观察显微镜的影响。由于软X射线透过较厚的生物物质，改变波长即可增强图像衬度。本发明取波长范围在2.3-4.4nm(称为“水窗口”)的软X射线，它对水具有“透明”效应。因此，可以在这个波长范围内观察较厚的含水且无染色的生物样品，如活体状态下的完整细胞及细胞内亚显微结构，而光镜或电镜则没有该功能。

实施例2：利用软X射线显微成像进行疑似肺癌细胞的软X射线成像及处理方法

选择疑似肺癌患者，男女不限。

仪器设备等实验手段：

软X射线显微成像光束线站(中国科技大学国家同步辐射实验 室)；

真空干燥箱，CJ-3A甩胶机(北京半导体设备厂生产)；

Olympus微分干涉差显微镜(日本)

扫描电镜KYKY-1000B型(中国科学院科学仪器厂制造)；

151II型超薄切片机(西德SEIXY厂制造)。

软X射线疑似肺癌显微图标本制作：

第一步：将疑似肺癌组织细胞标本放置在德国生产的病理超薄切片机上，将该组织标本切成超薄切片病理组织细胞标本，超薄切片厚度为2-3nm。

第二步：把已切好的超薄切片肺癌组织细胞标本放置在38℃至40℃水槽的水面上，让标本漂浮在水面迅速均匀展开呈平面。

第三步：用上海产的电镜带把柄铜网捞取已在水槽漂浮展平的疑似肺癌组织细胞超薄切片标本，然后，再将该电镜铜网放在吸水纸上控尽水分并晾干。

第四步：将此电镜超薄切片标本送病理检验部门，置于光学显微镜下进行病理学检查，发现疑似肺癌细胞后，选择并固定好肺癌细胞观察视野，在光学显微镜下拍摄疑似肺癌细胞放大100倍的光镜照片。同时又送疑似肺癌细胞标本至同步辐射实验站，应用同步辐射软X射线。显微光束线扫描，显影在光刻胶上，再用显微透射进行观察并拍摄出软X射线显微成像的照片。

在进行软X射线影像学检查前，要求未接受任何治疗，如抗结核或抗感染或抗肿瘤治疗。所有入选受试者均需要病理的组织学、细胞学检查，以病理诊断结果为金标准。

同步辐射软X射线疑似肺癌显微成像后，图像模拟信号经过调理单元经过前置放大、降噪和定标等处理，进入图像采集通道进行数字采样，最终将数字信号以串口或并口的形式送入计算机系统进行处理和智能识别。

本实施例采用了合肥国家同步辐射实验室光源(储存环能量 800Mev)激发的光束线U12B，专门用于软X射线显微成像研究。

同步辐射软X射线肺癌显微图像信号是模拟信号。然而，由于该信号是一定量级的电压、电流或电阻变化。因此，在变换为数字信号之前必须进行调理，即放大、缓冲或定标模拟信号等，使其适合于后续信号采集单元输入。简单地说，图像信号调理单元就是将软X射线肺癌显微图像的模拟信号通过放大、滤波等操作转换成采集设备能够识别的标准信号。

同步辐射软X射线疑似肺癌显微成像的图像采集单元将图像模拟信号变换为用于数据采集、控制过程、执行计算显示读出或其他目的的数字信号，相当于一个模拟/数字转换器(ADC)。而且，图像要满足一定速率的抽样率和控制条件，方可送入计算机进行数字化处理。

将同步辐射软X射线肺癌显微图像按上文所述方法进行图像预处理、图像分割分析和重叠细胞重构。将处理后的信息进行存储。可将所述信息提供给病理学家，由病理学家进一步进行细胞特征提取和分类，依赖病理学家的主观分析做出疑似肺癌的具体判断。

在本文中，对采集到的原始疑似肺癌彩色图像，应用投影算法将其从三维的RGB色彩空间投影到一维线性的256级灰度空间；再利用双阈值快速分割方法对灰度图像作阈值分割，进而得到效果较好的二值图像，即对数字化的软X射线疑似肺癌显微图像进行预处理。

在该实施例中，在图像预处理基础上，对二值化图像进行形态学滤波，改善切片图像内细胞区域的几何形状。由于形态滤波可以在一定程度上消除图像采集及转换过程中可能产生的毛刺及小孔状噪音。因此，分割细胞区域的准确性得到了保证。

细胞间的相互连接，相邻边界紧密重叠，分割易造成伪边界和伪轮廓，致使细胞发生信息提取产生误差，必须要将这些因素消除。本文的图像预处理、图像分割和重构有效地克服了上述缺陷。

实施例3：软X射线显微成像在植物叶片检查中的应用

取小麦种子，将种子在25℃培养箱中萌发，待第7-9天剪取叶片，切成2mm²的小片，切片厚度为10-20nm， 将该标本放置在40℃水槽的水面上，使标本漂浮于水面迅速均匀展开呈平面状，所述槽液中含有3ppm重量的吐温20，使用电镜铜网捞取已在水槽漂浮展平的超薄切片标本，再将该电镜铜网放在吸水纸上控尽水分并晾干，所述电镜铜网为300目并且在捞取切片之前进行如下处理：将干净的铜网平铺在培养皿内滤纸上，然后缓慢倒入0.3%重量的Formvar溶液直到漫过铜网为止，再立即倒干培养皿内液体，干燥备用。将切片在显微镜下观察，然后用软X射线对切片的特定视野进行成像。将图像按上文所述进行图像预处理、图像分割和重叠细胞重构后，将信息提供给农林学家，在进行数模转换显示出图像后，来判断小麦幼苗叶片细胞超微结构，例如膜与壁结合紧密程度，胞质浓厚程度，细胞核形态是否正常、结构是否完整，类囊体片层排列是否整齐，线粒体发育是否良好等等。

实施例4：本发明光刻剂在软X射线显微成像中的应用

重复实施例1，不同之处在于将实施例1中光栅制作过程使用的常规光刻剂聚甲基丙烯酸甲酯替换为由下面通式II表示的光刻剂：

式I

其中R¹、R²和R³各自独立地均为乙基；R是正丙基；m=5，n=3，s=2，并且k=2。

结果发现，当使用常规光刻剂聚甲基丙烯酸甲酯时，蚀刻获得的图案形状在曝露于软X光时发生劣化，并且发生表面变粗，而使用本实施例的光刻剂时在暴露于光的过程中没有发生图案形状发生劣化，并且也未发生表面变粗现象。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (1)

1.一种细胞显微成像分析系统的细胞显微成像方法，其特征在于：所述系统包括，光学显微镜系统、同步辐射装置、图像处理系统和显示装置，其中所述同步辐射装置包含单色器，该单色器包括在入口狭缝和出口狭缝之间的两个镜和一个衍射光栅，所述两个镜为柱面镜而且设置成使得它们的弧矢面与衍射光栅的切面或色散面重合，并且所述入口狭缝和出口狭缝相对于衍射光栅的中心对称分布； 所述同步辐射装置还包含光传感器、评估单元和控制单元，其中所述光传感器部件用于实时接收来自X射线源的软X射线所发出的光，所述评估单元用于评估软X射线的量，所述控制单元用于基于该评估结果来控制X光源；所述显示装置能够将经处理的数字信号转换为可视图像；利用软X射线显微方法对生物样品曝光所采用的衍射光栅通过如下方法制得，在洁净的石英玻璃衬底上，用电子束蒸发方法制得Cr/Au层，从而形成基片，其中Cr层的厚度为2-10nm，Au层的厚度为5-20nm，在该基片上旋涂厚度为100-800nm的电子束光刻胶，并在烘箱中干燥，然后利用电子束在涂有电子束光刻胶的基片上轰击出所需的波带片图形；对形成的波带片图形进行曝光，然后使用显影液进行显影，在基片上形成衍射光栅的光刻胶图形，然后采用等离子体气相沉积技术，在形成衍射光栅的光刻胶图形的基片上沉积一层氮化硅层，该氮化硅层的厚度是波长的奇数倍，所述氮化硅层的沉积在100-150°C的温度下进行；用去胶液去除光刻胶，然后采用ICP刻蚀基片底层的铬层和金层，从而形成含氮化硅薄膜的衍射光栅；

所述细胞显微成像方法利用软X射线进行细胞亚微结构的成像，其包括以下步骤：步骤一、标本制作；步骤二、目标细胞的初步查找和选择；步骤三、软X射线成像；所述步骤一标本制作包括：(1)将组织细胞标本切成超薄切片标本，超薄切片标本厚度为1.5-5nm ；(2)将已切好的超薄切片标本放置在38°C -40°C水槽的水面上，使标本漂浮于水面迅速均匀展开呈平面状，槽液中含有3ppm-10ppm重量的吐温20；(3)使用电镜铜网捞取已在水槽漂浮展平的超薄切片标本，再将该电镜铜网放在吸水纸上控尽水分并晾干，所述电镜铜网为200-300目并且在捞取切片之前进行如下处理:将干净的铜网平铺在培养皿内滤纸上，然后缓慢倒入0.1-0.5%重量的Formvar溶液直到漫过铜网为止,再立即倒干培养皿内液体，干燥备用；所述步骤二、目标细胞的初步查找和选择步骤包括:将电镜铜网超薄切片标本置于光学显微镜下进行视觉检查，初步查找目标细胞后，选择并固定好观察视野，在光学显微镜下拍摄细胞放大至少100倍的光镜照片，其中目标细胞的初步查找和选择是基于细胞显微成像的直接目的进行的，所述直接目的包括为生物学、病理学、医学、食品和农林业提供有效中间信息；所述步骤三、软X射线成像步骤包括，将电镜铜网超薄切片标本送至同步辐射装置，应用同步辐射软X射线显微光束线扫描，显影在光刻胶上，再用显微透射进行观察并拍摄出软X射线显微成像的图像，软X射线显微光束波长范围为1.0-10.0nm,软X射线显微对生物样品曝光的水窗材料为氮化硅，最小厚度为20nm，所述氮化硅的配比为Si₃N₄，窗口尺寸为0.1-0.5mm × 0.1-0.5mm：所述细胞显微成像方法还包括对获得的图像以降低噪声、消除伪影和提高对比度处理，处理步骤包括:在同步辐射软X射线细胞显微成像后，首先进行图像信号调理，然后进入图像信号采集进行数字采样，最终将数字信号以串口或并口的形式送入计算机系统进行处理，其中，同步辐射软X射线显微图像信号是模拟信号，在变换为数字信号之前进行调理，即放大、缓冲或定标模拟信号，以适合于后续信号采集单元输入；图像信号采集包括图像预处理、图像分割分析和重叠细胞重构；其中所述图像预处理包括灰度变换、直方图调整、细胞前置处理、细胞核前置处理以及去除干扰物质；所述灰度变换为将细胞影像转为灰度格式，以便于后续的处理工作，利用彩色影像与灰度影像之间的转换公式进行转换；所述直方图调整为采用直方图拉伸或直方图均衡化方法间接增强对比度；所述细胞前置处理包括对比调整、二值化、边缘检测中的一种或其任意组合；所述去除干扰物质包括侵蚀、扩张及逻辑处理中的一种或其任意组合，目的是取得去除干扰物质后的细胞影像；其中所述图像分割包括；将第一快速行进算法应用于经预处理的图像以获得第一快速行进图，所述第一快速行进算法起始于图像的背景，并且第一快速行进算法的速度函数是基于图像的第一边缘强度图；将第一快速行进图分割成多个同质区域；将所述同质区域中的每一个区域分别映射到所述图像的一个结点使得相邻同质区域的结点彼此相连，以及使得图像包含与位于细胞中心的同质区域相对应的根结点；基于所述图像，将每个同质区域按前景或背景进行划分；在所述按前景划分的同质区域内将第二快速行进算法应用于第二边缘强度图，使得将前景分割成单个的细胞，其中该第二快速行进算法起始于与所述图像的根结点相对应的同质区域，所述第一边缘强度图与第二边缘强度图不同，所述第一快速行进算法和第二快速行进算法相同或不同；其中所述重叠细胞重构包括:基于所述经图像分割后的映射数据来执行三维反映射处理，该三维反映射处理包括将所述映射数据用滤波器沿行方向进行卷积，该滤波器的滤波器系数在多行X射线检测器的一条通道和另一条通道彼此之间不同；以及对由所述三维反映射处理获得的数据进行重构函数卷积，从而有效消除由于细胞间的相互连接、相邻边界紧密重叠而使分割造成的伪边界和伪轮廓，避免细胞发生信息提取产生误差，通过该重叠细胞重构使得将这些因素消除。