JP6652265B2 - 有機物試料の観察方法、これに用いられる観察ホルダ及び観察ステージ - Google Patents

有機物試料の観察方法、これに用いられる観察ホルダ及び観察ステージ Download PDF

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Description

本発明は、走査電子顕微鏡内で有機物試料を観察する観察方法、これに用いられる観察ホルダ及び観察ステージであって、特に、水溶液中で生物を生きたまま有機物試料として観察することを可能とする有機物試料の観察方法、これに用いられる観察ホルダ及び観察ステージに関する。
従来、走査電子顕微鏡を用いて有機物試料を観察しようとした場合、電子線による試料のダメージを抑制しコントラストの高い画像を得られるよう、試料をパラホルムアルデヒド等で固定化した上で各種処理を行っていた。例えば、試料表面に金やプラチナ、カーボン等をコーティングする方法や、重金属によって染色を施す方法などが知られている。一方、このような煩雑な処理を与えずとも高コントラストの画像を得られる観察方法も提案されている。
例えば、特許文献１では、絶縁性薄膜／導電性薄膜の積層体のうちの該導電性薄膜の上に生物試料を付着させ、絶縁性薄膜側に電子線を照射すると該絶縁性薄膜内で発生する２次電子が積層体内の大きな電位勾配によるトンネル効果で導電性薄膜側へと放出され、生物試料をも透過できることが開示されている。この透過電子（トンネル電子）の空間的分布を検知することで生物試料内部の構造観察ができるとしている。
更に、非特許文献１乃至３では、水溶液中の生物試料を走査電子顕微鏡内で観察するための方法を開示している。絶縁薄膜の上に金属薄膜を形成しこれに電子線を照射すると、局所的な電位変化が生じこれが水溶液中の生物試料を透過するときの減衰状態を画像として観察できるのである（変動電位透過観察法）。かかる方法では、水の比誘電率が約８０と高いために良好に電位変化を透過させる一方、生物試料のそれは２〜３程度と低く電位変化を透過させ難いことを利用している。
また、特許文献２では、水溶液中の生物試料を走査電子顕微鏡内で観察するための方法として、生物試料を水溶液とともに一対の対向する絶縁性薄膜及び導電性薄膜の間に介在させることを開示している。ここでは、絶縁性薄膜の上に２次電子放射防止薄膜を与えてこれに電子線を照射することで、該２次電子放射防止薄膜内部で発生した２次電子の多くは絶縁性薄膜へと流れ込み、負に帯電して対向する導電性薄膜との間に急峻な電位勾配が形成されるとしている。
更に、特許文献３では、同様に、走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物試料を観察する観察方法として、一対の対向する絶縁性薄膜の間に水溶液とともに生物試料を介在させ、一方の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜に電子線をその強度をパルス状に変化させつつ走査照射し、他方の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化を検知する観察方法を開示している。
特開２０１３−１３４９５２号公報 特開２０１４−２２３２３号公報 特開２０１４−２０３７３３号公報
上記した特許文献３に開示の観察方法によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料に電子線をそのまま照射しないからこれを生きたまま直接観察できる。また、画像の分解能は、電子線の照射径にほぼ依存するためこれを１ｎｍ程度にまで絞り込めば、同等程度の１ｎｍの分解能を得られる。つまり、バクテリア、ウイルス、タンパク質、若しくは、タンパク質複合体からなる生物試料も観察できる。
本発明は、以上のような状況に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で観察できしかもその組成分析を与えるような観察方法、これに用いられる観察ホルダ及び観察ステージを提供することにある。
本発明による走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察方法は、一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法において、異なるＯＮ／ＯＦＦ周波数の前記パルス電子線に対応した前記画像の差から前記試料の組成分析を与えることを特徴とする。
かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で観察できるとともに、異なるＯＮ／ＯＦＦ周波数による画像の差からその組成分析を明瞭に得られるのである。
上記した発明において、前記パルス電子線は、第１のＯＮ／ＯＦＦ周波数のパルスの一群を第２のＯＮ／ＯＦＦ周波数で与えるよう制御することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で観察できしかもその組成分析をより簡便且つ短時間に与えるのである。
上記した発明において、前記第１の絶縁性薄膜は前記導電性薄膜との間にエレクトレット層を含むことを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能でより明瞭に観察できるのである。
上記した発明において、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上には電位変化により光学的変化を与える電位感受性物質からなる電位感受性膜を与え、これを光学的に検知することを特徴としてもよい。更に、前記電子線の走査照射と同期させて前記電位感受性膜の光学的変化を検知することを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で直接観察できるのである。
本発明による走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察ホルダは、一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法に用いられ、前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させる試料保持空間と、前記試料保持空間を与える前記第１及び第２の絶縁性薄膜と、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜と、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた電位感受性物質からなる電位感受性膜と、を少なくとも含むことを特徴とする。
かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能でより明瞭に観察できるのである。
上記した発明において、前記電位感受性物質は電位変化により光学的変化を与えることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能でより明瞭に観察できるのである。
上記した発明において、前記第１の絶縁性薄膜は前記導電性薄膜との間にエレクトレット層を含むことを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能でより明瞭に観察できるのである。
本発明による走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察ステージは、一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法に用いられ、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化を検知する検知手段を少なくとも含むことを特徴とする。
かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で観察できるのである。
上記した発明において、前記検知手段は、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化により光学的変化を与える電位感受性物質からなる電位感受性膜の変化を光学的に検知する手段であることを特徴としてもよい。かかる発明によれば、走査電子顕微鏡内において水溶液中の生物試料を生きたままより高い分解能で直接観察できるのである。
本発明による観察方法を示すブロック図である。 本発明による観察方法を与える走査電子顕微鏡内の要部の断面図である。 ファンクションジェネレータによる制御信号の例を示す図である。 電位変化に基づく画像の解析について説明する図である。 本発明による観察方法を与える走査電子顕微鏡内の要部の断面図である。 本発明による観察方法を与える走査電子顕微鏡内の要部の断面図である。 電位変化の集束について説明する図である。
以下に、本発明による走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物試料を観察する観察方法及び装置の１つの実施例について、図１及び図２を用いて説明する。
図１に示すように、走査電子顕微鏡１は、所定の真空度まで排気可能な試料室２を備え、これと連通しその上にある筐体３の頂部近傍にある電子源３０から電子線３１を適宜、絞り３２を通過させながら試料室２内の観察ホルダ１０の所定位置上に導いて観察を行う装置である。
電子源３０は電界放出（フィールドエミッション）型の電子銃である。出射した電子線３１は偏光板３３によってその進行方向を変化させることが可能であり、ファンクションジェネレータ３４からの、例えば、１ｋＨｚ以上の周波数のＯＮ／ＯＦＦ信号が矩形波状の制御信号を受けて、これに対応したパルス状に出力変化する電子線を観察ホルダ１０の上に与え得るのである。
試料室２には開閉自在のシャッタ４０を挟んで試料交換室４１が設けられており、試料室２内の真空度を維持したまま試料交換棒４２を用いて試料室２内に設けられたステージ２０の上に観察ホルダ１０を脱着可能である。ステージ２０の絶縁性の筐体２１上には後述する光学測定系Ａが設けられており、光学測定系Ａからの信号を試料室２の外部に取り出し可能である。かかる信号は、光学測定系Ａに内蔵されるアンプ２３（図２参照）によって増幅されて周波数分離装置３５に導かれ、周波数分離されて組成解析装置３６に出力される。周波数分離装置３５は、ファンクションジェネレータ３４から上記した電子線の出力変化のリファレンス信号を入力される。また、光学測定系Ａには、アンプ２３等の動作のためのＤＣ電源３７が接続される。
図２に示すように、観察ホルダ１０は、上下に窓を有する外枠体１１と、かかる上下の窓を内部からそれぞれ閉塞する絶縁性薄膜１２ａ及び１２ｂを含む。上側の窓を閉塞する絶縁性薄膜１２ａは、生物試料１８を含む水溶液１８ｂを上側からその下側面で保持し、その上側面に導電性薄膜１３を積層される。また、下の窓を閉塞する絶縁性薄膜１２ｂは、生物試料１８を含む水溶液１８ｂを下側からその上側面で保持し、その下側面に電位感受性膜１５として電位感受性インクによる皮膜が積層される。
電位感受性膜１５の電位感受性物質としては、圧電素子であるチタン酸バリウムやチタン酸ジルコン酸鉛、圧電ポリマーのポリフッ化ビニリデンが好適である。かかる電位感受性物質による膜は、電位変化によって厚さを変化させ、照射された光に対する反射率や吸光度が変化し、また位相変化を生じさせる。この変化を検出することで、電位変化を高い感度で検出できるのである。
また、絶縁性薄膜１２ａ及び１２ｂは、それぞれＯリング１７や図示しないパッキン等によって観察ホルダ１０の内面に接しており、観察ホルダ１０の外部の真空に対して内部を密閉して、内部の気圧を保持可能である。ここで、絶縁性薄膜１２ａ及び１２ｂは、これらの圧力差に耐え得るだけの強度を有する。その他については、公知である故に詳述しないが、例えば、観察ホルダ１０の詳細は特許文献３に開示された「試料ホルダ」と同様である。
ステージ２０の光学測定系Ａは、アンプ２３に接続されてレーザー光を出射して上記した電位感受性膜１５上に照射可能なレーザーダイオード２２ａと、その反射光を受光するフォトダイオード２２ｂを含む。フォトダイオード２２ｂはアンプ２３に接続される。アンプ２３はフォトダイオード２２ｂの受光した反射光に基づく信号を増幅して、コネクタ２４を介して、上記したように周波数分離装置３５に出力できる。また、コネクタ２４を介して、上記したように、アンプ２３とその動作電源であるＤＣ電源３７とを接続している。
次に、走査電子顕微鏡１の使用方法について図１乃至図４を用いて説明する。
図１を参照すると、観察ホルダ１０を取り付けた走査電子顕微鏡１は、試料室２を所定の真空度まで排気した後に、電子源３０から電子線３１が出射される。電子線３１は、ファンクションジェネレータ３４からの制御信号により、その出力をパルス状に変化させる。
図３を併せて参照すると、ファンクションジェネレータ３４による偏光板３３への制御信号は、相対的に高い周波数である第１の周波数による矩形波状のＯＮ／ＯＦＦ信号の所定個数のパルスの一群を、相対的に低い周波数である第２の周波数の間隔で与えるのである。ここでは、第１の周波数を１ＭＨｚとし、第２の周波数を３０ｋＨｚとしている。ファンクションジェネレータ３４からの信号をＯＦＦとすると、偏光板３３にはプラス電位の制御信号が与えられる。これにより、電子線３１は偏光板３３によってその進行方向を変化させて絞り３２により遮られ、ＯＦＦとされる。またかかる信号をＯＮとすると、偏光板３３にはゼロ電位の制御信号が与えられる。これにより、電子線３１は偏光板３３によって進行方向を変化されることなく直進して、絞り３２を通過し、ＯＮとなる。これによって、ファンクションジェネレータ３４から生成される制御信号と同期した周波数でＯＮ／ＯＦＦパルスとなって電子線３１が観察ホルダ１０に照射される。つまり、電子線３１も第１の周波数による所定個数のパルスの一群を第２の周波数の間隔でＯＮ／ＯＦＦされるパルスとして観察ホルダ１０に向けて照射されるのである。
再び、図２を参照すると、観察ホルダ１０に向けて照射された電子線３１は観察ホルダ１０の窓から導電性薄膜１３に入射して吸収され、入射した部位をマイナスに帯電させる。これにより生物試料１８及び水溶液１８ｂの誘電率に従って、対向する絶縁性薄膜１２ｂに電荷を生じさせる。ここで、水溶液１８ｂの水分子は分極するため高い誘電率を有するが、タンパク質などからなる生物試料１８では相対的に低い誘電率となる。つまり、電子線３１の走査された位置に対応する生物試料１８及び水溶液１８ｂの誘電率によって、絶縁性薄膜１２ｂに生じる電荷に時間的な変動が与えられる。また、絶縁性薄膜１２ｂに積層された皮膜である電位感受性膜１５は、電位の変化に基づいてその色を変化させる性質を有し、これを光学系Ａで測定し、その信号を周波数分離装置３５に出力する。この光学系Ａでは、例えば、電位感受性膜１５からの反射光により、反射率、吸光度、位相変化を測定できる。なお、光学系Ａのレーザーダイオード２２ａによってレーザー光を走査して電位感受性膜１５上の測定位置を電子線３１の走査された位置に対応させてもよい。
図１を再び参照すると、周波数分離装置３５は、ファンクションジェネレータ３４から受けたリファレンス信号に基づき、ファンクションジェネレータ３４の生成した制御信号の第１及び第２の周波数、すなわち観察ホルダ１０に照射された電子線３１のＯＮ／ＯＦＦパルスによる２つの周波数の周波数成分のみをそれぞれ抽出して分離できる。かかる分離にはフーリエ変換解析法などの公知の手法を用い得る。このように抽出された電位感受性膜１５の色の変化に基づく信号によって、組成解析装置３６は生物試料１８の誘電率に応じてこれを透過した電位の絶縁性薄膜１２ｂの主面に沿った方向の分布に基づく画像、つまり生物試料１８を透過した電位分布の二次元画像を生成する。
図４を参照すると、組成解析装置３６は、第１及び第２の周波数毎に得られた電位分布の画像５１及び５２を解析部３６ａで所定の解析アルゴリズムに従い解析する。ここで、物質の誘電率は、変調する周波数成分により変化し、その変化の状態は物質毎に異なることが知られている。従って、２つの周波数成分による電位分布の画像の違いに基づく誘電率の変化の状態から生物試料１８の物質の組成を解析して確定することが可能である。かかる組成に基づいた画像５３を生成することもできる。
本実施例では、２つの周波数成分を合成した電子線３１を用い、検出信号で複数の周波数信号成分を分離し画像化している。これにより、一回の測定で２つの周波数成分の電位分布の画像５１及び５２を得ることが可能となる。また、比較する画像同士の時間のズレも無い。なお、３つ以上の周波数を混合させて、同様に電位分布の画像を得てこれを解析してもよい。
また、光学系Ａにおけるレーザーダイオード２２ａによるレーザー光は、数μｍのスポットまで絞ることが出来るため、電位分布の画像５１及び５２も数μｍの高い分解能で得ることができる。
かかるレーザーダイオード２２ａを用いた検出系では、応答性を高めることが出来るとともに、数ＭＨｚ以上の電位変化を回路の容量成分に起因する時定数の遅れなしに検出可能であり、高周波信号の検出に好適である。さらに、レーザー光の検出方法としては、光強度、偏向、位相等の多くの情報を得られ、感度を大幅に向上させることが出来る。
なお、図５に示すように、観察ホルダ１０ａにおいて、絶縁性薄膜１２ｂの下側面に電極パターン１９を取り付けてこれに沿って電位変化を計測しても良い。つまり、電極パターン１９は、絶縁性薄膜１２ｂの主面に沿って配置された複数の金属片によるパターンの形成された電極であり、金属片のそれぞれが電極としてアンプ２３に接続されて絶縁性薄膜１２ｂの電位を金属片の配置された位置毎に測定できるのである。
更に、図６に示すように、観察ホルダ１０ｂにおいて、絶縁性薄膜１２ａと導電性薄膜１３との間に、エレクトレットによるエレクトレット層１３ｂを設けてもよい。これによれば、絶縁性薄膜１２ａ上の電荷を主面内において均一にし得て、絶縁性薄膜１２ａ及び１２ｂ間の電位を安定させることができる。
また、電極パターン１９のそれぞれの金属片を電圧制御アンプ２５にも接続して、それぞれの金属片の電位を操作することで、絶縁性薄膜１２ｂに印加される電場を制御してもよい。これにより、生物試料１８及び水溶液１８ｂに印加される電場を制御して電子線３１に起因する電位の変化をより集束させて高分解能化を可能とする。
例えば、図７に示すように、電極パターン１９の金属片のうち、中央の金属片１９ａのみを入力電極とし、他の金属片１９ｂにプラスの電位を加える。すると、電子線３１による電位の変化を中央の金属片１９ａに集束させることができる。このような電位の変化を集束させる金属片を電子線３１の走査された位置に応じて変更させることもできる。
以上のように、本実施例によれば、水溶液１８ｂ中の生物試料に染色処理や固定化処理を施すことなく簡便に観察することが可能になる。特に、生物試料１８には電子線３１を透過させず、水溶液１８ｂ中に配置させたまま圧力変化も与えない。電位の変化を与えるだけなので生物試料１８を生きたまま観察に供することができるのである。さらに上記した実施例の選択や組み合わせにより分解能を向上させ得る。これにより、上記したように生物試料１８の組成を分析でき、また三次元構造解析も可能とする。
以上、本発明による実施例及びこれに基づく変形例を説明したが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の主旨又は添付した特許請求の範囲を逸脱することなく、様々な代替実施例及び改変例を見出すことができるであろう。
１ 走査電子顕微鏡
１０ 観察ホルダ
１２ａ 絶縁性薄膜
１２ｂ 絶縁性薄膜
１３ 導電性薄膜
１５ 電位感受性膜
１８ 生物試料
１８ｂ 水溶液
３１ 電子線

Claims (9)

  1. 走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察方法であって、一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法において、異なるＯＮ／ＯＦＦ周波数の前記パルス電子線に対応した前記画像の差から前記有機物試料の組成分析を与えることを特徴とする有機物試料の観察方法。
  2. 前記パルス電子線は、第１のＯＮ／ＯＦＦ周波数のパルスの一群を第２のＯＮ／ＯＦＦ周波数で与えるよう制御することを特徴とする請求項１記載の有機物試料の観察方法。
  3. 前記第１の絶縁性薄膜は前記導電性薄膜との間にエレクトレット層を含むことを特徴とする請求項２記載の有機物試料の観察方法。
  4. 前記第２の絶縁性薄膜の外向面上には電位変化により光学的変化を与える電位感受性物質からなる電位感受性膜を与え、これを光学的に検知することを特徴とする請求項２記載の有機物試料の観察方法。
  5. 前記電子線の走査照射と同期させて前記電位感受性膜の光学的変化を検知することを特徴とする請求項３記載の有機物試料の観察方法。
  6. 走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察ホルダであって、
    一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法に用いられ、
    前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させる試料保持空間と、
    前記試料保持空間を与える前記第１及び第２の絶縁性薄膜と、
    前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜と、
    前記第２の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた電位感受性物質からなる電位感受性膜と、を少なくとも含むことを特徴とする観察ホルダ。
  7. 前記電位感受性物質は電位変化により光学的変化を与えることを特徴とする請求項６記載の観察ホルダ。
  8. 前記第１の絶縁性薄膜は前記導電性薄膜との間にエレクトレット層を含むことを特徴とする請求項７記載の観察ホルダ。
  9. 走査電子顕微鏡内で水溶液中の生物の如き有機物試料を観察する観察ステージであって、
    一対の対向する第１及び第２の絶縁性薄膜の対向面の間に前記水溶液とともに前記有機物試料を介在させ、前記第１の絶縁性薄膜の外向面上に与えられた導電性薄膜にその強度をパルス状に変化させたパルス電子線を走査照射し、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化に応じた画像を得る方法に用いられ、
    前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化を検知する検知手段を少なくとも含み、
    前記検知手段は、前記第２の絶縁性薄膜の外向面上の電位変化により光学的変化を与える電位感受性物質からなる電位感受性膜の変化を光学的に検知する手段であることを特徴とする観察ステージ。
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