WO2010131916A2 - siRNA 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention provides a conjugate in which a polymer compound that enhances the delivery of siRNA, which can be usefully used for the treatment of cancer and other infectious genes, is conjugated to siRNA using degradable or non-degradable bonds, a method for preparing the conjugate, and siRNA delivery using the conjugate. It is about a method.
  • RNA interference is a mechanism that regulates gene expression after nucleotide sequence specificity by double-stranded RNA (dsRNA) in the expression process of genes, such as C. elegans was first discovered plants, fruit flies, mammals Common to animals (Fire et al ., Nature, 391: 806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430: 161-164, 2004).
  • RNA interference occurs when 19-25bp of dsRNA enters the cell and binds to the RNA-induced silencing complex (RISC) complex, and only the antisense (guide) strand is complementary to the mRNA and is present in the RISC complex.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the dsRNA When the dsRNA is delivered intracellularly, the dsRNA binds specifically to the target mRNA sequence and degrades the mRNA. Thus, the dsRNA is considered to be a new tool that can control the expression of genes using the same.
  • the introduction of dsRNA into cells caused antiviral interferon pathways, making it difficult to see RNA interference effects.In 2001, Elbashir and Tuschl et al.
  • siRNAs have recently been shown to have an excellent effect on inhibiting the expression of specific genes in animal cells, and have attracted much attention as gene therapy agents. Due to their high activity and precise gene selectivity, siRNA oligonucleotides have been studied for the past 20 years and are currently used as therapeutic agents. (ODN) is expected to be a therapeutic replacement (Dana J. Gary et al. Journal of Controlled Release 121: 64-73, 2007).
  • ODN is expected to be a therapeutic replacement
  • siRNA techniques have a great advantage because they can be easily designed, compared with other pharmaceutical products, and have high target selectivity and characteristics that inhibit the expression of specific genes.
  • the inhibition of gene expression by RNA interference is low toxicity because it uses a mechanism that exists naturally in vivo.
  • 'Bevasiranib' is an siRNA that inhibits the expression of VEGF by selectively acting on vascular endotherial growth factor (VEGF) that causes angiogenesis.
  • VEGF vascular endotherial growth factor
  • disease therapies including siRNAs targeting various genes are currently under development (Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery 7: 115-116, 2008).
  • siRNA delivery requires the use of enzymes in the blood, interactions with elements in the blood and nonspecific delivery to cells. There are many problems that need to be solved (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22 (3): 142-151, 2007). Attempts are being made to overcome these problems, in part by using nuclease resistant analogs or by improving delivery techniques.
  • gene delivery techniques using viruses such as adenovirus and retroviruses
  • gene delivery techniques using non-viral vectors using liposomes, cationic lipids and cationic polymer compounds have been developed.
  • viral carriers have a safety problem because the delivered genes cannot enter the host chromosome to induce abnormalities in the host genes or to activate oncogenic genes. Expression may cause autoimmunity, or a modified form of viral infection from the virus carrier may not result in efficient protective immunity.
  • Non-viral carriers are less efficient than viral carriers, but have the advantages of low side effects and low production costs, given the safety and economical efficiency in vivo (Lehrman S. Nature. 401 (6753): 517-). 518, 1999).
  • RNA molecules including siRNAs, one of which encodes shRNA (short hairpin RNA).
  • siRNAs short hairpin RNA
  • DNA expression plasmids the system through DNA has the advantage that siRNA is expressed only while the expression vector is present.
  • recent studies on chemically modifying siRNAs have suggested methods to improve instability and low cellular uptake of nucleic acids (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida.Drug Metab. Parmacokinet. 22 (3): 142-151). , 2007).
  • nucleic Acid Res. 31: 589-595, 2003 Another form of chemical modification is to link the functional groups to the 3 'end of the sense (anti-guide) strand to give enhanced pharmacokinetic characteristics compared to the control and to apply in vivo through the hydrophilic / hydrophobic balance of siRNA. It was found that high efficiency can be induced (Soutschek J. et al . Nature 432: 173-178. 2004).
  • the present inventors have found that a conjugate in which a hydrophilic or hydrophobic polymer compound is conjugated to an siRNA using degradable or non-degradable bonds improves the in vivo stability of the siRNA, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to conjugate a hydrophilic polymer or hydrophobic polymer compound, which is a biocompatible polymer compound, to a terminal of a sense strand or an antisense strand of a siRNA by using degradable or non-degradable bonds to improve the intracellular delivery efficiency of siRNA.
  • Another object of the present invention is a solid support comprising a polymer compound, in particular a polymer compound having proven stability in human application, such as polyethylene glycol (PEG), and RNA, DNA, wherein PEG is bonded to 3 'using the support. It is to provide a method for efficiently preparing oligonucleotides comprising RNA-DNA chimera and analogues.
  • a polymer compound in particular a polymer compound having proven stability in human application, such as polyethylene glycol (PEG), and RNA, DNA, wherein PEG is bonded to 3 'using the support.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the siRNA conjugate and a method for delivering siRNA using the siRNA conjugate.
  • a first aspect of the present invention for achieving the above object provides a siRNA and a polymer compound conjugate of the following structure:
  • a and B are each independently a hydrophilic polymer or a hydrophobic polymer compound, X, Y are each independently a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond, R represents siRNA.
  • a second aspect of the present invention provides a siRNA and a polymer compound conjugate having the structure:
  • A is a hydrophobic polymer compound
  • X is a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond
  • R represents siRNA.
  • the third aspect of the present invention also provides a conjugate in which the single strand of the siRNA (R) is composed of 19 to 31 nucleotides.
  • the fourth aspect of the present invention provides a conjugate, wherein the hydrophobic polymer compound (A) is a hydrophobic polymer compound having a molecular weight of 250 to 1,000.
  • the fifth aspect of the present invention provides a conjugate wherein the hydrophobic polymer compound (A) is C 16 -C 50 saturated hydrocarbon or cholesterol.
  • the sixth aspect of the present invention also provides a conjugate wherein the covalent bond (X, Y) is a non-degradable bond or a degradable bond.
  • the seventh aspect of the present invention also provides a conjugate wherein the non-degradable bond is an amide bond or a phosphate bond.
  • the eighth aspect of the present invention provides a conjugate wherein the degradable bond is selected from disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds, and enzyme degradable bonds.
  • the ninth aspect of the present invention also provides a conjugate in which the hydrophilic polymer compound (A or B) is a nonionic polymer compound having a molecular weight of 1,000 to 10,000.
  • the tenth aspect of the present invention also provides a conjugate wherein the hydrophilic polymer compound is selected from the group consisting of polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and polyoxazoline.
  • the eleventh aspect of the present invention also provides a solid support having a polyethylene glycol having the structure:
  • R is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl or heteroaryl; m is an integer from 2 to 18 and n is an integer from 5 to 120; X is hydrogen, 4-monomethoxytrityl group, 4,4'-dimethoxytrityl group or 4,4 ', 4 "-trimethoxytrityl group.
  • a twelfth aspect of the present invention provides a solid support in which polyethylene glycol is bonded, wherein the solid support is controlled pore glass (CPG).
  • CPG controlled pore glass
  • a thirteenth aspect of the present invention provides a solid support in which the CPG is bonded polyethylene glycol having a diameter of 40 to 180 ⁇ m and a pore size of 500 ⁇ to 3000 ⁇ m.
  • a fourteenth aspect of the present invention provides a solid support bonded to polyethylene glycol, which is 3'-PEG-CPG, having the structure of Formula IV:
  • R is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl or heteroaryl; n is an integer of 5 or more and 120 or less.
  • a seventeenth aspect of the present invention provides a nanoparticle composed of the first or second siRNA conjugate.
  • the nineteenth aspect of the present invention provides a method of treatment, wherein the nanoparticles are administered to the body by oral administration or intravenous injection.
  • a twentieth aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the first or second siRNA conjugate.
  • the twenty-first aspect of the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of the seventeenth nanoparticle.
  • the present invention provides siRNA and polymer compound conjugates of the following structure:
  • a and B are each independently a hydrophilic polymer or a hydrophobic polymer compound
  • X, Y are each independently a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond
  • R represents siRNA.
  • the present invention also provides a siRNA and a polymer compound conjugate having the structure:
  • A is a hydrophobic polymer compound
  • X is a simple covalent bond or a linker mediated covalent bond
  • R represents siRNA
  • the oligo strand of the siRNA preferably comprises 19 to 31 nucleotides.
  • the siRNA usable in the present invention may employ siRNAs derived from any gene that is or may be used for gene therapy or research.
  • the hydrophobic polymer compound is preferably a hydrophobic polymer compound having a molecular weight of 250 to 1,000.
  • Examples of the hydrophobic polymer compound include saturated hydrocarbons, preferably C 16 to C 50 saturated hydrocarbons and cholesterol. At this time, the hydrophobic polymer compound is not limited to the saturated hydrocarbon and cholesterol.
  • the hydrophobic polymer compound plays a role of causing a hydrophobic interaction to form a micelle composed of siRNA and a hydrophobic polymer compound conjugate.
  • saturated hydrocarbons have the advantage of being easily conjugated in the preparation of siRNA, which is very suitable for the preparation of the conjugate of the present invention.
  • the covalent bond (ie, X, Y) may be either a non-degradable bond or a degradable bond.
  • the non-degradable bonds include amide bonds or phosphate bonds
  • the degradable bonds include disulfide bonds, acid-decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds, or enzyme-degradable bonds, but are not limited thereto. no.
  • the linker that mediates the linkage covalently binds the end groups of the hydrophilic polymer (or hydrophobic polymer) and the residue derived from siRNA, and is not particularly limited as long as it provides a bond that can be degraded in a predetermined environment as necessary.
  • the linker may include any compound that binds to activate siRNA and / or hydrophilic polymer (or hydrophobic polymer) during the preparation of the conjugate.
  • the hydrophilic polymer compound is preferably a nonionic polymer compound having a molecular weight of 1,000 to 10,000.
  • nonionic hydrophilic high molecular compounds such as polyethyleneglycol, polyvinylpyrrolidone, and polyoxazoline, as a hydrophilic high molecular compound, it is not necessarily limited to this.
  • the functional group of the said hydrophilic high molecular compound may be substituted by another functional group as needed.
  • PEG has a terminal capable of introducing various molecular weights and functional groups, and has good affinity in vivo, does not induce an immune response, and increases solubility in water to improve gene transfer efficiency in vivo. As it increases, it is very suitable for the preparation of the conjugates of the present invention.
  • the present invention provides a solid support bonded to the polyethylene glycol of the following structure.
  • solid supports include, but are not limited to, for example, CPG, polystyrene, silica gel, cellulose paper, and the like; R is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl or heteroaryl; m is an integer from 2 to 18, n is an integer from 5 to 120 (Molar mass 282 to 5300); X corresponds to 4-monomethoxytrityl group, 4,4'-dimethoxytrityl group or 4,4 ', 4 "-trimethoxytrityl group and is removed after treatment with acid to form hydrogen.
  • Solid support is CPG
  • the diameter is preferably 40 to 180 mu m, and preferably has a pore size of 500 mu to 3000 mu m.
  • the present invention also provides a solid support bonded to polyethylene glycol, which is 3'-PEG-CPG, having the structure of Formula IV:
  • the present invention also provides a process for preparing 3'-PEG-CPG of formula IV comprising the following steps:
  • R is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl or heteroaryl; n is an integer of 5 or more and 120 or less.
  • the present invention provides a method for preparing a conjugate between siRNA and PEG using the solid support to which the polyethylene glycol is bound. Specifically,
  • siRNA conjugate comprising covalently connecting the end group of the siRNA and polyethylene glycol. This allows for the efficient preparation of oligonucleotides including RNA, DNA, RNA-DNA chimeras and analogs.
  • the siRNA can be prepared using a method of linking phosphodiester bonds forming an RNA backbone structure using ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite ( ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite) (Shina et al. Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984).
  • ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite
  • a reactant may be obtained, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a nanoparticle consisting of the siRNA conjugate.
  • the siRNA and the polymer compound conjugate of the present invention can form a nanoparticle structure by interaction, and the nanoparticles composed of the siRNA and the polymer compound conjugate and the siRNA polymer compound conjugate thus formed improve the intracellular delivery of the siRNA, which is a disease It is possible to apply the model for therapeutic purposes.
  • the production of more specific conjugates and the characteristics, cell delivery efficiency and effects of the nanoparticles composed of the conjugates will be described in more detail in the following examples.
  • the present invention also provides a gene therapy method using the nanoparticles.
  • a gene therapy method comprising the step of preparing a nanoparticle consisting of the siRNA polymer compound conjugate and the step of injecting the nanoparticles into the body of the animal.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically effective amount of nanoparticles composed of the siRNA conjugates.
  • composition of the present invention may be prepared by containing one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers should be compatible with the active ingredients of the present invention and may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. If necessary, antioxidants, ona sap solution, bacteriostatic agents, and the like can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's pharmaceutical Science (Mack Publishing company, Easton PA).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be determined by one of ordinary skill in the art based on the symptoms and severity of the disease of a typical patient. It may also be formulated in various forms, such as powders, tablets, capsules, solutions, injections, ointments, syrups, etc., and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal Sublingual, or topical administration is possible.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques.
  • the dosage of the composition of the present invention varies in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, excretion rate and severity of the disease, etc. of the patient, and easily available to those skilled in the art. You can decide.
  • the nanoparticles composed of the siRNA polymer compound conjugates of the present invention can efficiently deliver therapeutic siRNA into cells by improving the in vivo stability of siRNA, and the activity of siRNA at relatively low concentrations without transfection material As well as a tool for siRNA treatment for cancer and other infectious diseases, the new type of siRNA delivery system can be very useful in basic research and medical industry for biotechnology.
  • 1 is a structural formula of the prepared 3'-PEG-CPG.
  • FIG. 3 is 1 H NMR data of [Compound A], which is a 3′-PEG reagent for binding to LCAA-CPG in Example 1.
  • FIG. 3 is 1 H NMR data of [Compound A], which is a 3′-PEG reagent for binding to LCAA-CPG in Example 1.
  • FIG. 5 is 1 H NMR data of [Compound C], which is a 3′-PEG reagent for binding with LCAA-CPG in Example 1.
  • FIG. 5 is 1 H NMR data of [Compound C], which is a 3′-PEG reagent for binding with LCAA-CPG in Example 1.
  • Example 6 is Maldi-Tof molecular weight data after 3′-PEG-CPG and oligonucleotide (siRNA) preparation in Example 1-3.
  • siRNA means naked siRNA, each conjugate representing an siRNA polymer compound conjugate shown in Table 1.
  • 19, 23, 27, 31mer refers to siRNA consisting of 19, 23, 27, 31 nucleotides, respectively, all prepared siRNA polymer compound conjugate in the structure of siRNA conjugate 4.
  • Figure 9 shows the degradation of siRNA with time in the presence of serum proteins for the evaluation of the stability in the blood of the siRNA polymer conjugate conjugated form of the siRNA and hydrophilic polymer compound conjugated without the polymer compound Electrophoresis picture showing.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of nanoparticles formed by a siRNA polymer compound complex.
  • Figure 11 shows the size of the nanoparticles measured by zeta potential meter of naked siRNA nanoparticles to which the polymer compound is not conjugated.
  • Figure 12 shows the size of the nanoparticles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 9.
  • Figure 13 shows the size of the nanoparticles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 10.
  • Figure 14 shows the size of the nanoparticles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 11.
  • Figure 15 shows the size of the nanoparticles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 12.
  • Figure 16 shows the size of the nanoparticles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 13.
  • Figure 17 shows the mRNA of the survivin gene after transfection with a transfection material in order to analyze the RNAi effect of the siRNA polymer conjugate conjugated form of the siRNA and PEG hydrophilic polymer compound of the original form It is a graph comparing the degree of expression.
  • Figure 18 is transfected with a transfection material to analyze the RNAi effect of the siRNA of the long sequence modified with the siRNA and siRNA polymer compound conjugate 4 structure of the original form, and compare the mRNA expression level of survivin gene One graph.
  • Figure 19 shows the survivin gene after transfection under conditions without transfection material to analyze the RNAi effect of the siRNA polymer compound conjugates modified with siRNA and siRNA polymer compound conjugates 1 to 5 and 9 to 14 of the original form It is a graph comparing the degree of inhibition of mRNA expression.
  • Example 1-1-2 500 mg (0.206 mmol) of Compound A obtained in Example 1-1-2 was dissolved in 10 ml of methylene chloride, and 83.14 ⁇ l (1.03 mmol) of pyridine was added thereto. To this, 165 mg (0.781 mmol) of N-succinimidyl trifluoro acetic acid (Sigma Aldrich, USA) was added thereto, and the reaction was terminated after stirring at room temperature for 7 hours.
  • N-succinimidyl trifluoro acetic acid Sigma Aldrich, USA
  • Example 1-2-2 Preparation of 3'-PEG-CPG (2000 ') using 2-succinic acid 2- [bis- (4-dimethoxytrityl) -poly (ethylene glycol)] [Compound A]
  • Compound B was used to prepare 3'-PEG-CPG (2000 Hz).
  • Example 1-2-1 Specifically LCAA-CPG (2000 Hz) obtained in Example 1-2-1 1 g was sufficiently wetted with 8 ml of pyridine.
  • compound B A solution of 205 mg (2eq) and 55 ⁇ l of triethylamine in 2 ml of pyridine was evenly mixed with the LCAA-CPG solution. After the reaction was carried out at 50 to 60 ° C. for 8 hours, the reaction mixture was filtered and the filtered coupling-CPG was washed sequentially with methanol, water and methylene chloride, followed by vacuum drying. 10 ml of pyridine was added to 1 g of the dried coupling-CPG, and then wetted.
  • Example 6 is a result of confirming the Maldi-Tof molecular weight after preparing the siRNA as shown in Example 2, using 3'-PEG-CPG as a starting material.
  • LCAA-CPG (2000 Hz) obtained in Example 1-2-1 1 g was sufficiently wetted with 8 ml of pyridine.
  • compound C A solution of 200 mg and 55 ⁇ l of triethylamine in 2 ml of pyridine was mixed with the LCAA-CPG solution. After reacting at 50 to 60 ° C. for 8 hours, the reaction mixture was filtered and the filtered coupling-CPG was washed with methanol, water and methylene chloride in that order and dried in vacuo. 10 ml of pyridine was added to 1 g of dried coupling-CPG, and then wetted.
  • Example 7 shows the results of preparing siRNAs as shown in Example 2 below using 3′-PEG-CPG as a starting material.
  • survivin siRNA was used to inhibit survivin.
  • Survivin is a protein commonly expressed in most neoplastic tumors or transformed cell lines that have been tested so far, and is expected to be an important target for anticancer therapy (Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3 ( 8): 917-921, 1997).
  • the survivin siRNA sequence of the present invention when composed of 19 nucleotides, is composed of a sense strand described in SEQ ID NO: 1 and an antisense strand that is complementary thereto.
  • the nucleotide sequence is set forth as SEQ ID NO: 2, 3, and 4.
  • the siRNA was prepared using a method of linking phosphodiester bonds forming an RNA backbone structure using ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite. Specifically, using a RNA synthesizer (384 Synthesizer, BIONEER, Korea), a series of processes including deblocking, binding, oxidation, and capping on a solid support to which nucleotides are attached is repeated to produce a reaction containing RNA of a desired length. Obtained.
  • siRNA polymer conjugates were prepared by hexadecane (C16) or octadecane (C18) saturated hydrocarbons using PEG or a dodecane linker, a hydrophobic polymer compound, at the 5 'end.
  • the reaction was performed using the 3'PEG-CPG prepared in Example 1 as a support, to prepare a siRNA polymer compound conjugate to which PEG is attached to the 3 'terminal.
  • the reactants were separated by RNA using HPLC (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japan), and measured using a MALDI-TOF mass absorbance analyzer (MALDI TOF-MS, SHIMADZU, Japan) to measure molecular weight. It was confirmed that it matches the base sequence. Thereafter, the same amount of sense and antisense RNA strands were mixed and placed in 1X annealing buffer (30mM HEPES, 100mM Potassium acetate, 2mM Magnesium acetate, pH 7.0-7.5), reacted for 3 minutes in a 90 ° C constant temperature water bath, and then again at 37 ° C. To prepare the desired double-stranded siRNA polymer compound conjugates, respectively. The prepared siRNA polymer compound conjugate has the structure shown in Table 1. The prepared siRNA polymer compound conjugate was confirmed annealing through the electrophoresis picture (Fig. 8).
  • siRNA polymer compound conjugates Conjugate name Conjugate structure name Terminal modification siRNA naked siRNA Sense: none Antisense: none siRNA polymer compound conjugate 1 5'PEG-sense siRNA Sense: 5'PEG Antisense: none siRNA polymer compound conjugate 2 5'PEG-antisense siRNA Sense: none Antisense: 5'PEG siRNA polymer compound conjugate 3 5'ssPEG-antisense siRNA Sense: none Antisense: 5'ssPEG siRNA polymer compound conjugate 4 5'PEG + PEG siRNA Sense: 5'PEG Antisense: 5'PEG siRNA polymer compound conjugate 5 5'PEG + ssPEG siRNA Sense: 5'PEG Antisense: 5'ssPEG siRNA polymer compound conjugate 6 3'PEG-sense siRNA Sense: 3'PEG Antisense: none siRNA polymer compound conjugate 7 3'PEG-antisense siRNA Sense
  • siRNA polymer compound conjugate prepared and separated in Example 2 has improved stability compared to the original siRNA to which the polymer compound is not bound.
  • the original unmodified siRNA and the siRNA polymer compound conjugates 1 to 5 prepared in Example 2 were added in a medium to which 10% FBS (fetal bovine serum) was added, which simulated in vivo conditions. After incubation for 6, 9, 12, 24, 36 or 48 hours, the degree of degradation of siRNA was examined by electrophoresis.
  • FBS fetal bovine serum
  • siRNA showed stability even up to 48 hours in the siRNA polymer compound conjugate in which PEG was introduced (FIG. 9).
  • the siRNA showed stability up to 12 to 24 hours even at 10% serum conditions.
  • siRNA polymer compound conjugates 9 to 14 hydrophobic interactions between hydrophobic polymer compounds imparted to the ends of siRNA form nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugates, that is, micelles (FIG. 10). The size of the nanoparticles was measured by zeta-potential measurement.
  • the nanoparticle sizes of the siRNA polymer compound conjugates 9 to 13 and siRNA prepared in Example 2 were measured.
  • the size of the nanoparticles was homogenized (200 W, 40 kHz, 5 sec) using an ultrasonic disperser (Wiseclean, DAIHAN, Korea). Homogenized nanoparticles were sized with a Zeta Potentiometer (Nano-ZS, MALVERN, UK). The refractive index of the material was 1.454, the absorption index was 0.001, and the temperature of the solvent, water, was 25 ° C. And the resulting viscosity and refractive index were measured. One measurement consisted of a size measurement consisting of 20 repetitions, which were repeated three times.
  • FIG. 11 is a result showing the size of the particle measured by the zeta potential meter of naked siRNA nanoparticles.
  • FIG. 13 shows the size of particles measured through a zeta potential detector of nanoparticles composed of siRNA polymer compound conjugate 10.
  • the nanoparticles composed of siRNA polymer compound conjugate 10 58.9% of the particles having a size of 5.61-10.1 nm (maximum of 8.72 nm) were obtained.
  • Figure 14 is a result showing the size of the particles measured by the zeta potential meter of the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 11.
  • the nanoparticles composed of siRNA polymer compound conjugate 11 it can be seen that the one having a size of 5.61-10.1 nm (maximum of 8.72 nm) occupies 45.6%.
  • FIG. 15 shows the size of particles measured through a zeta potential detector of nanoparticles composed of siRNA polymer compound conjugate 12.
  • 23.6% had a size of 4.85-5.61nm
  • 23.5% had a size of 21.0-32.7nm
  • 23.1% had a size of 68.1-78.8nm. Can be.
  • FIG. 16 shows the results of nanoparticle sizes measured through a zeta potential meter of a nanoparticle composed of siRNA polymer compound conjugate 13.
  • the nanoparticles consisting of siRNA polymer compound conjugate 13 it can be seen that the one having a size of 4.85-8.72 nm (5.61 nm peak) occupies 84.6%.
  • the size of the nanoparticles composed of siRNA polymer compound conjugates 9 to 13 had sizes of 4-8 nm except siRNA conjugate 12.
  • the size of the nanoparticles was measured variously, which is thought to be due to the aggregation of the nanoparticles over time even when homogenized through an ultrasonic disperser during the measurement.
  • the size of the nanoparticles composed of the measured siRNA conjugate shows a size of 100 nm or less, which is sufficient to be taken into the cell through pinocytosis (Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4: 84-85, 2009).
  • Each siRNA polymer compound conjugate 1 to 8 prepared in Example 2 was used to transfect human cervical cancer cell lines, which are tumor cell lines, and the expression patterns of survivin genes were analyzed in the transfected tumor cell lines.
  • Hela Human cervical cancer cells obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were 10% (v / v) fetal calf serum, penicillin 100 units / ml, streptococci in RPMI 1640 culture medium (GIBCO, Invitorgen, USA). 100 ⁇ g / ml of mycin was added and incubated under conditions of 37 ° C., 5% (v / v) CO 2 .
  • the siRNA polymer compound conjugates 1 to 8 of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 2 were transfected with a human uterine cancer cell line (HeLa), a tumor cell line, and expression patterns of survivin in the transfected tumor cell line. was analyzed.
  • Tumor cell line 1.3 ⁇ 10 5 cultured in Example 5-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 6-well plate at 37 ° C. and 5% (v / v) CO 2 , and then the medium was removed. 800 ⁇ l Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed per well.
  • cDNA was prepared by extracting total RNA from the cell line transfected in Example 5-2-1, mRNA amount of survivin gene was quantified by real-time PCR.
  • Example 5-2-2-1 RNA Isolation and cDNA Preparation from Transfected Cells
  • RNA extraction kit (AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea) the total RNA is extracted from the cell line transfected in Example 5-2-1, the extracted RNA is RNA reverse transcriptase (AccuPower Using CycleScript RT Premix / dT 20, Bioneer, Korea), cDNA was prepared by the following method.
  • Example 5-2-2-1 Using the cDNA prepared in Example 5-2-2-1 as a template, the relative amount of survivin mRNA was quantified by real-time PCR in the following manner.
  • HK gene a housekeeping gene
  • HMBS Hydroxymethyl-bilane synthase
  • HPRT1 Hydroxanthine phosphoribosyl-transferase1
  • UBC Ubiquitin C
  • YWHAZ Tyrosine 3-monooxygenase
  • zeta polypeptide tryptophan 5-monooxygenase activtion protein
  • the obtained Ct (threshold cycle) value of the survivin is calculated by calculating the normalized factor (NF) through the HK gene to obtain the corrected Ct value of the survivin. Differences in ⁇ Ct values were obtained using the experimental group treated only with the specification material as a control. MRNA expression rate of survivin was compared using the ⁇ Ct value and Formula 2 ( ⁇ Ct) ⁇ 100 (FIG. 17). mock means a control treated with only the transfection material.
  • RNA- It is expected to reduce steric hindrance in complex formation with induced silencing complex (RISC).
  • siRNA-PEG conjugates showed higher inhibition of target gene mRNA expression at low concentrations (20 nM) compared to high concentrations (100 nM), suggesting that PEG inhibits binding of siRNA to RISC at higher concentrations. do.
  • Example 5-3 Inhibition of expression of target gene using long sequence siRNA polymer compound conjugate
  • siRNA hydrophilic polymer compound conjugate together with the transfection material by using siRNA which induces terminal modification of the siRNA polymer compound conjugate 4 structure in the nucleotide sequence of siRNA SEQ ID NOs: 1-4 Expression inhibition was analyzed.
  • Example 5-3-1 Transfection of Tumor Cell Lines Using siRNA Polymer Compound Conjugates
  • Tumor cell line 1.3 ⁇ 10 5 cultured in Example 5-1 was incubated in RPMI 1640 for 24 hours in a condition 6-well plate at 37 ° C., 5% (v / v) CO 2 , and then the medium was removed. 800 ⁇ l Opti-MEM medium was dispensed per well.
  • cDNA was prepared by extracting total RNA from the cell line transfected in Example 5-3-1, the mRNA amount of survivin gene was quantified by real-time PCR.
  • RNA extraction kit (AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea) the total RNA is extracted from the cell line transfected in Example 5-3-1, the extracted RNA is RNA reverse transcriptase (AccuPower Using CycleScript RT Premix / dT 20, Bioneer, Korea), cDNA was prepared by the following method.
  • Example 5-3-2-1 Using the cDNA prepared in Example 5-3-2-1 as a template, the relative amount of survivin mRNA was quantified by real-time PCR in the following manner.
  • the obtained Ct (threshold cycle) value of the survivin was calculated by calculating the normalized factor (NF) through the HK gene to obtain the corrected Ct value of the survivin. Differences in ⁇ Ct values were obtained using the experimental group treated only with the specification material as a control. MRNA expression rate of survivin was compared using the ⁇ Ct value and the formula 2 ( ⁇ Ct) ⁇ 100 (FIG. 18).
  • 5'P + P represents the structure of the siRNA polymer compound conjugate 4, and treated under the conditions of 20nM, 100nM and compared the degree of inhibition of expression of the target gene.
  • the long-chain naked siRNA when the long-chain naked siRNA was transformed into the siRNA polymer compound conjugate 4, the long-chain naked siRNA did not show a difference in expression inhibition effect of the target gene mRNA compared to the original naked siRNA.
  • the siRNA was modified, it was found that the steric hindrance caused by PEG was reduced compared to the short chain. That is, in the case of long-chain siRNA, siRNA is cleaved into 19 + 2 structure by dicer in the mechanism of action of RNAi, and the cleaved siRNA binds to the RISC complex, resulting in RNAi mechanism of action.
  • siRNA without PEG is present compared to SEQ ID NO: 1, and thus has relatively high interaction with RISC complex, from which RNAi induction effect is maintained. Seems to be.
  • Each siRNA polymer compound conjugates 1 to 14 prepared in Example 2 were transfected with a human uterine cancer cell line (HeLa), which is a tumor cell line, and analyzed for expression of survivin in the transfected tumor cell line. It was.
  • HeLa human uterine cancer cell line
  • Hela Human cervical cancer cells obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were 10% (v / v) fetal calf serum, penicillin 100 units / ml, streptococci in RPMI 1640 culture medium (GIBCO / Invitorgen, USA). 100 ⁇ g / ml of mycin was added and incubated under conditions of 37 ° C., 5% (v / v) CO 2 .
  • Tumor cell line 1.3 ⁇ 10 5 cultured in Example 6-1 was incubated in RPMI 1640 for 24 hours in a 6-well plate at 37 ° C. and 5% (v / v) CO 2 . 900 ⁇ l Opti-MEM medium was dispensed per well.
  • Opti-MEM medium 100 ⁇ l of Opti-MEM medium and 5 or 10 ⁇ l of each of the siRNA polymer compound conjugates 9 to 14 (1 nmole / ⁇ l) prepared in Example 2 were added (final 500 nM, 1 ⁇ M treatment), followed by decomposition by high frequency sound.
  • a solution was prepared by equalizing micelles composed of siRNA hydrophobic polymer compound conjugates through sonication.
  • transfection solution 100 ⁇ l was dispensed into each well of Opti-MEM-dispersed tumor cell lines, followed by incubation for 24 hours, and then 1 ml of RPMI 1640 containing 20% FBS was added. It was further incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% (v / v) CO 2 , followed by incubation for a total of 48 hours after siRNA polymer compound complex treatment.
  • mRNA amount of survivin gene was relatively quantified by real-time PCR.
  • Example 6-3-1 RNA Isolation and cDNA Preparation from Transfected Cells
  • RNA extraction kit (AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea) the total RNA is extracted from the cell line transfected in Example 6-2, the extracted RNA is RNA reverse transcriptase (AccuPower Using CycleScript RT Premix / dT 20, Bioneer, Korea), cDNA was prepared by the following method.
  • Example 6-3-1 Using the cDNA prepared in Example 6-3-1 as a template, the relative amount of survivin mRNA was quantified by real-time PCR in the following manner.
  • HK gene a housekeeping gene (HK gene), HMBS (Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC (Ubiquitin C), and YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase) / tryptophan 5-monooxygenase activtion protein (zeta polypeptide) as a standard gene, diluting the cDNA prepared in Example 6-3-1 by 1/5 and diluting cDNA 2 in each well of a 96-well plate and 2 10 ⁇ l of GreenStar TM PCR master mix (BIONEER, Korea), 6 ⁇ l of distilled water, and 1 ⁇ l of each HK gene qPCR primer (10 pmole / ⁇ l, respectively, BIONEER, Korea) were prepared for HK gene real-time PCR mixture.
  • the 96-well plate containing the mixed solution was subjecte
  • siRNA polymer compound conjugates 1 to 5 showed a high RNAi effect compared to high concentrations at low concentrations (500 nM).
  • siRNA hydrophobic polymer compound conjugates of the conjugates 9 to 14 generally showed a low inhibition of survivin mRNA expression when treated at the same concentration (500 nM) as compared to the siRNA hydrophilic polymer compound conjugates 2 to 5.
  • siRNA polymer compound conjugate 14 when treated in a high concentration (1 ⁇ M) conditions, especially in the siRNA polymer compound conjugate 14 showed a high survivin mRNA expression inhibitory effect.

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Abstract

본 발명은 siRNA와 고분자 화합물의 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 siRNA의 생체내 안정성 향상을 위해 siRNA와 고분자 화합물을 공유결합으로 연결시킨 하이브리드 접합체 및 상기 하이브리드 접합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있으며, 또한 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 siRNA의 활성을 나타낼 수 있어, 암 및 다른 감염성 질환을 위한 siRNA 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 23.07.2010]　siRNA 접합체 및 그 제조방법
본 발명은 암 및 다른 감염성 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 siRNA의 전달을 향상시키는 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 siRNA에 접합시킨 접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 접합체를 이용한 siRNA 전달방법에 관한 것이다.
RNA 간섭현상은 유전자의 발현과정에서 이중가닥의 RNA(dsRNA)에 의하여 염기서열 특이적으로 전사 후 유전자 발현을 조절하는 기작으로, 이와 같은 기작은 처음 발견된 C. elegans를 비롯하여 식물, 초파리, 포유동물에도 공통적으로 존재한다(Fire et al., Nature, 391:806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). RNA 간섭현상이 일어나는 과정은 19-25bp의 dsRNA가 세포내로 들어오면 RISC(RNA-induced silencing complex) 복합체와 결합하고 안티센스(가이드) 가닥만이 mRNA와 염기서열 상보적으로 결합하여 RISC 복합체에 존재하는 엔도뉴클라제 도메인에 의하여 표적 mRNA를 분해하는 것으로 알려져 있다(Rana, T.M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8: 23-36, 2007; Tomari, Y. and Zamore, P.D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005).
dsRNA가 세포내에 전달되면 상기 dsRNA가 표적 mRNA 서열에 특이적으로 결합하여 그 mRNA를 분해하기 때문에, 이를 이용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있는 새로운 도구로 여겨지고 있다. 그런데 인간의 경우 dsRNA를 세포에 도입할 때 항바이러스성 인터페론 기작(antiviral interferon pathway)이 유발되어 RNA 간섭효과를 보기가 힘들었는데, 2001년 Elbashir와 Tuschl 등에 의해 21 nt(nucleotide)의 작은 dsRNA를 인간 세포에 도입하는 경우에는 인터페론 경로가 유발되지 않고 표적 mRNA를 특이적으로 분해시킨다는 것이 밝혀졌다(Elbashir,S.M., Harborth,J., Lendeckel,W., Yalcin,A., Weber, K., Tuschl,T., Nature, 411, 494-498, 2001; Elbashir,S.M., Lendeckel,W., Tuschl,T., Genes ＆ Dev., 15, 188-200, 2001; Elbashir,S.M., Martinez,J., Patkaniowska,A., Lendeckel,W., Tuschl,T., EMBO J., 20, 6877-6888, 2001). 이후 21 nt의 dsRNA는 siRNA(small interfering RNA)라는 이름으로 새로운 기능유전체학(functional genomics)의 도구로서 각광을 받기 시작하였다.
siRNA는 최근 동물세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 유전자 치료제로 각광을 받고 있고, 이들의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다(Dana J. Gary et al. Journal of Controlled Release 121:64-73, 2007). 특히 치료를 목적으로 siRNA 기법은 다른 의약품에 비하여 쉽게 디자인이 가능하고, 높은 목표 선택성과 특정 유전자의 발현을 저해하는 특징을 갖기 때문에 큰 장점을 갖는다. 또한 RNA 간섭에 의한 유전자 발현 억제는 생체내에서 자연적으로 존재하는 기작을 이용하는 것이므로 독성이 낮다. 최근 OPKO사에서 개발된 황반변성(wet Age-Related Macular disease)의 치료제로 개발된 'Bevasiranib'은 신생혈관 발생을 유발하는 VEGF(vascular endotherial growth factor)에 선택적으로 작용하여 VEGF의 발현을 저해하는 siRNA로서 임상 3상의 과정을 거치고 있다(Dejneka NS et al., Mol Vis., 28(14):997-1005, 2008). 그 외에도 다양한 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 포함하는 질병 치료제는 현재 개발 중에 있다(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery 7: 115 - 116, 2008).
RNA 간섭을 통해 in vivo 상에서 특이적인 발현 저해를 유발한 여러가지 결과가 있음에도 불구하고, in vivo siRNA 전달을 위해서는 혈액 내의 효소에 의한 분해, 혈액 내 요소들과 상호작용 및 비특이적으로 세포에 전달되는 것과 같이 해결되어야 하는 많은 문제점을 갖는다(Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007). 이러한 문제점들은 부분적으로 핵산 분해효소 저항성 유사체를 이용하거나 전달 기술을 개선하는 것으로 극복하려는 시도가 진행 중이다.
개선된 전달 기술의 예로서, 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과 리포좀과 양이온성 지질 그리고 양이온성 고분자 화합물을 이용한 비바이러스성 벡터(non-viral vector)에 의한 유전자 전달 기술들이 개발되어왔다. 그러나 바이러스성 전달체는 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입되어 숙주 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시킬 가능성도 배제할 수 없기 때문에 안전성에 문제점이 있으며, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현이 되어 자가 면역증을 유발하거나, 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발되는 경우 효율적인 방어 면역을 일으키지 못할 수 있다. 한편, 비바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성이 떨어지지만, 생체내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴하다는 장점은 있다(Lehrman S. Nature. 401(6753): 517-518, 1999). 또한, 비바이러스성 전달방법에서는 siRNA를 포함한 RNA 분자의 전달을 이루기 위해 효소 또는 비효소적인 분해에 대해 효과적으로 방어할 수 있는 방법이 요구되는데, 이 중 한 방법이 shRNA(short hairpin RNA)를 암호화한 DNA 발현 플라스미드를 활용하는 것으로, DNA를 통한 시스템은 발현벡터가 존재하는 동안에만 siRNA가 발현되는 장점을 갖는다. 더욱이 최근 siRNA를 화학적으로 변형시키는 연구를 통해 핵산 분해효소에 대한 불안정성 및 세포내 낮은 흡수율을 개선하는 방법이 제안되고 있다(Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
siRNA의 화학적인 변형 방법 중, 핵산 분해효소에 의해 분해되는 부분인 인산디에스테르 결합(phosphorodiester bond)을 인산황화결합(phosphorothioate linkage)로 변형하거나, 5탄당의 2' 부분을 2'-O-meRNA, 2'-디옥시-2'-플루오로유리딘(2'-디옥시-2'-fluouridine) 또는 2'와 4'을 연결하여 LNA(locked nucleic acid)의 형태로 변경하여 혈청내 안정성을 증진시킨 결과를 얻었다(Braasch D. A. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. and Rana T. M., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al. Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003). 다른 형태의 화학적인 변형방법으로 센스(안티-가이드) 가닥의 3' 말단 부위에 작용기를 연결하여 대조군에 비하여 증진된 약동학적 특징을 갖게 하고, siRNA의 친수성/소수성의 균형을 통해 in vivo에 적용시 높은 효율을 유도할 수 있다는 것을 파악할 수 있었다(Soutschek J. et al. Nature 432:173-178. 2004).
그러나 상기 방법들은 siRNA를 분해효소로부터 보호하고, 효율적인 세포막 투과를 위해서는 여전히 미흡한 점이 많았다.
이에 본 발명자들은 siRNA에 친수성 또는 소수성 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 접합시킨 접합체가 siRNA의 생체내 안정성을 향상시키는 것을 발견하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 siRNA의 세포내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에 생체 적합성 고분자 화합물인 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 접합시킨 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고분자 화합물, 특히 인체 적용시 그 안정성이 입증된 고분자 화합물, 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함하고 있는 고형 지지체 및 상기 지지체를 이용하여 3'에 PEG가 결합된 RNA, DNA, RNA-DNA 키메라(chimera) 및 유사체(analog)를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 siRNA 접합체의 제조방법 및 상기 siRNA 접합체를 이용한 siRNA의 전달방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 제1은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R-Y-B
(상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물, X, Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제2는 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R
(상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제3은 상기 siRNA(R)의 단일가닥이 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제4는 상기 소수성 고분자 화합물(A)이 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제5는 상기 소수성 고분자 화합물(A)이 C16-C50의 포화탄화수소 또는 콜레스테롤인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제6은 상기 공유결합(X,Y)이 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제7은 상기 비분해성 결합이 아미드 결합 또는 포스페이트 결합인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제8은 상기 분해성 결합이 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제9는 상기 친수성 고분자 화합물(A 또는 B)이 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제10은 상기 친수성 고분자 화합물이 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린으로 구성된 군으로부터 선택되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제11은 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
Figure PCTKR2010003039-appb-I000001
[상기에서 R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5∼120까지의 정수이고; X는 수소, 4-모노메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 4,4',4"-트리메톡시트리틸기이다.]
또한, 본 발명의 제12는 상기 고형 지지체가 CPG(controlled pore glass)인인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제13은 상기 CPG는 직경이 40∼180 ㎛이고 공극 크기 500Å∼3000Å를 갖는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제14는 하기 구조식 Ⅳ의 구조를 갖는 3'-PEG-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
[구조식 Ⅳ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000002
또한, 본 발명의 제15는
1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG(Long Chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass)를 형성하는 단계;
2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)]을 형성하는 단계;
3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 상기 제15의 3'-PEG-CPG의 제조방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000003
[구조식 Ⅰ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000004
[구조식 Ⅱ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000005
[구조식 Ⅲ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000006
[구조식 Ⅳ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000007
[상기에서, R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
또한, 본 발명의 제16은
1) 상기 제11의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 상기 siRNA 접합체의 제조방법.
또한, 본 발명의 제17은 상기 제1 또는 제2의 siRNA 접합체로 구성된 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명의 제18은
1) 상기 제17의 나노입자를 준비하는 단계; 및
2) 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제19는 상기 나노입자가 경구투여 또는 정맥주사의 방법으로 체내에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제20은 상기 제1 또는 제2의 siRNA 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 제21은 상기 제17의 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R-Y-B
상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물이고, X,Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.
또한, 본 발명은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R
상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.
본 발명의 접합체에 있어서, 상기 siRNA의 올리고 가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용가능한 siRNA는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자 유래의 siRNA도 채택될 수 있다.
상기 소수성 고분자 화합물은 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것이 바람직하다. 상기 소수성 고분자 화합물의 예로는 포화탄화수소, 바람직하게는 C16 내지 C50의 포화탄화수소, 콜레스테롤을 들 수 있다. 이때 소수성 고분자 화합물은 상기 포화탄화수소 및 콜레스테롤에만 한정되는 것은 아니다.
상기 소수성 고분자 화합물은 소수성 상호작용을 일으켜 siRNA와 소수성 고분자 화합물 접합체로 구성된 미셀을 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 고분자 화합물 중에서도 특히 포화탄화수소의 경우, siRNA의 제조 단계에서 용이하게 접합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 접합체 제조에 매우 적합하다.
또한, 상기 공유결합(즉, X,Y)은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 포스페이트 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 결합을 매개하는 링커는 친수성 고분자(또는 소수성 고분자)와 siRNA로부터 유래된 잔기의 말단기를 공유적으로 결합시키며, 필요에 따라 소정의 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 접합체의 제조과정 중 siRNA 및/또는 친수성 고분자(또는 소수성 고분자)를 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 포함할 수 있다.
또한, 상기 친수성 고분자 화합물은 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 것이 바람직하다. 예를 들어, 친수성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 친수성 고분자 화합물의 기능기는 필요에 따라 다른 기능기로 치환되어도 무방하다. 상기 친수성 고분자 화합물 중에서도 특히 PEG는 다양한 분자량과 작용기를 도입할 수 있는 말단을 갖고 있으며, 생체내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않으며, 물에 대한 용해도를 증가시켜 생체내에서의 유전자 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 접합체의 제조에 매우 적합하다.
또한, 본 발명은 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
Figure PCTKR2010003039-appb-I000008
상기에서, 고형 지지체(solid support)는 예컨대 CPG, 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등을 포함하되 이에 제한되지 않으며; R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5∼120(Molar mass 282∼5300)까지의 정수이고; X는 4-모노메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 4,4',4"-트리메톡시트리틸기가 해당되며 산으로 처리 후 제거되어 수소가 된다. 고형 지지체가 CPG인 경우 직경은 40∼180 ㎛인 것이 바람직하며, 500Å∼3000Å의 공극 크기를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기 구조식 Ⅳ의 구조를 갖는 3'-PEG-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
[구조식 Ⅳ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000009
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 구조식 Ⅳ의 3'-PEG-CPG의 제조방법을 제공한다:
1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG를 형성하는 단계;
2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)]을 형성하는 단계;
3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 Ⅳ의 3'-PEG-CPG의 제조방법:
[화학식 1]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000010
[구조식 Ⅰ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000011
[구조식 Ⅱ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000012
[구조식 Ⅲ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000013
[구조식 Ⅳ]
Figure PCTKR2010003039-appb-I000014
[상기에서, R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
또한, 본 발명은 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 siRNA와 PEG간의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 상기 siRNA 접합체의 제조방법을 제공한다. 이를 통해 RNA, DNA, RNA-DNA 키메라 및 유사체를 포함한 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조할 수 있다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 예컨대, RNA 합성기를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 접합체로 구성된 나노입자를 제공한다.
본 발명의 siRNA와 고분자 화합물 접합체는 상호작용에 의하여 나노입자 구조를 형성할 수 있으며, 이렇게 형성된 siRNA와 고분자 화합물 접합체와 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자는 siRNA의 세포내 전달을 향상시키며, 이를 질병 모델의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 접합체의 제조와 접합체로 구성된 나노입자의 특징, 세포 전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 이용한 유전자 치료방법을 제공한다.
구체적으로 상기 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 접합체로 구성된 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 오나충액, 정균제 등 다근 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's pharmaceutical Science(Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술 분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자는 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있으며, 트랜스펙션(transfection) 물질 없이도 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 활성을 나타낼 수 있으므로, 암 및 다른 감염성 질환을 위한 siRNA 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구 및 의학 산업상 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 제조된 3'-PEG-CPG의 구조식이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 3은 실시예 1에서 LCAA-CPG와의 결합을 위한 3'-PEG 시약인 [화합물 A]의 1H NMR 데이터이다.
도 4는 실시예 1에서 LCAA-CPG와 결합을 위한 3'-PEG시약인 [화합물 B]의 1H NMR 데이터이다.
도 5는 실시예 1에서 LCAA-CPG와 결합을 위한 3'-PEG시약인 [화합물 C]의 1H NMR 데이터이다.
도 6은 실시예 1-3에서 3'-PEG-CPG와 올리고뉴클레오티드(siRNA) 제조 후의 Maldi-Tof 분자량 데이터이다.
도 7은 실시예 1-4에서 3'-PEG-CPG와 올리고뉴클레오티드(siRNA) 제조 후의 Maldi-Tof 분자량 데이터이다.
도 8은 고분자 화합물이 접합되지 않은 원래 형태의 siRNA와 친수성 또는 소수성 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 전기영동 사진이다. siRNA는 원래 형태의(naked) siRNA를 의미하고, 각 접합체는 표 1에 표시된 siRNA 고분자 화합물 접합체를 나타낸다. 또한 19, 23, 27, 31mer는 각기 19, 23, 27, 31개의 뉴클레오티드로 구성된 siRNA를 의미하고, 모두 siRNA 접합체 4의 구조로 siRNA 고분자 화합물 접합체를 제조하였다.
도 9는 고분자 화합물이 접합되지 않은 원래 형태의 siRNA와 친수성 고분자 화합물인 PEG가 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 혈액 내 안정성 평가를 위해, 혈청 단백질이 존재하는 환경 하에서 시간에 따른 siRNA의 분해정도를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 siRNA 고분자 화합물 복합체가 형성하는 나노입자의 모식도이다.
도 11은 고분자 화합물이 접합되지 않은 naked siRNA 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 12는 siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 13은 siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 14는 siRNA 고분자 화합물 접합체 11로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 15는 siRNA 고분자 화합물 접합체 12로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 16은 siRNA 고분자 화합물 접합체 13으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 17은 원래 형태의 siRNA와 친수성 고분자 화합물인 PEG가 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질과 함께 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈(survivin) 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교한 그래프이다.
도 18은 원래 형태의 siRNA와 siRNA 고분자 화합물 접합체 4 구조로 변형된 긴 서열의 siRNA의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질과 함께 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교한 그래프이다.
도 19는 원래 형태의 siRNA와 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5와 9 내지 14로 변형된 siRNA 고분자 화합물 접합체의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질 없는 조건에서 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 저해 정도를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.
실시예 1. 3'-PEG 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 고형 지지체의 제조
실시예 1-1. LCAA-CPG와의 결합을 위한 3'-PEG 시약(화합물 A, B, C)의 제조
이후의 실시예에서, 하기 반응식에 나타난 바와 같이 3'-PEG-CPG를 제조하였다.
Figure PCTKR2010003039-appb-I000015
실시예 1-1-1. 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)]의 제조
출발물질 폴리에틸렌글리콜 2000(Alfa Aesar GmbH & Co. KG, 독일) 30g(15mmol)을 피리딘(pyridine, Sigma Aldrich, 미국) 270㎖에 녹이고, 여기에 트리에틸아민(Sigma Aldrich, 미국) 3.55㎖(25.5mmol)과 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(GL biochem, 중국) 7.12g(21mmol)을 넣어 상온에서 20시간 반응시켰다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 농축하고 에틸아세테이트 450㎖와 물 450㎖로 추출하고, 감압 농축 후 진공 건조하여 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)] 23g(66%)을 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 2에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 1.93(br,1,OH), 3.20-3.80(m,186,PEG,DMT-OCH3), 6.80-6.83(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-1-2. 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)][화합물 A]의 제조
상기 실시예 1-1-1에서 얻어진 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)] 3.9g(1.672mmol)을 피리딘 20㎖에 녹인 후 0℃로 냉각하였다. 상기 반응물에 숙신산 무수물(succinic anhydride, Acros Organics, 미국) 351mg(3.512mmol)과 DMAP(4-dimethylaminopyridine, Sigma Aldrich, 미국) 42.5mg(0.334mmol)을 첨가한 후 50℃에서 3일간 교반한 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 감압 농축하여 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)][화합물 A] 3.65g(90%, 흰색고체)를 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 3에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 2.65(m,2,CH2CO), 3.20-3.88(m,186,PEG,DMT-OCH3), 4.25(m,2,CH2CO), 6.80-6.82(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT).
실시예 1-1-3. 파라-니트로페닐숙신산 2-비스-(디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)[화합물 B]의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 화합물 A 1g(0.411mmol)을 메틸렌클로라이드(methylene chloride, 대연화학, 한국) 20㎖에 녹이고 0℃로 냉각하였다. 상기 반응물에 트리에틸아민 143㎕(1.03mmol)를 넣고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(4-nitro phenyl chloroformate) 149mg(0.740mmol)를 첨가하여, 30분 동안 상온으로 온도를 올린 후 4시간 교반 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 수성의 포화된 NaHCO3 20㎖와 0℃∼4℃로 냉각된 1M 시트르산(Sigma Aldrich, 미국) 5㎖로 1회 세정한 후, Na2SO4(Samchum Chemical Co., 한국)로 건조하였다. 이를 필터링 플라스크(filtering flask), 흡인 여과기(buchner funnel), 진공장치(aspirator)를 이용하여 여과 후 감압 농축하여 파라-니트로페닐숙신산 2-비스-(디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)(p-Nitrophenylsuccinic acid 2-[bis-(4-dimethoxytrityl)-poly(ethylene glycol)[화합물 B] 1.0g(94%, 미색 고체)을 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 4에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 2.80-2.90(m,2,CH2CO), 3.20-3.87(m,186,PEG,DMT-OCH3),4.25(m,2,CH2CO), 6.80-6.82(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-1-4. 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일에스테르 숙신산 2-비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)[화합물 C]의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 화합물 A 500mg(0.206mmol)을 메틸렌클로라이드 10㎖에 녹인 후 피리딘 83.14㎕(1.03mmol)를 넣었다. 여기에, N-숙신이미딜트리플루오로아세트산(N-succinimidyl trifluoro acetic acid, Sigma Aldrich, 미국) 165mg(0.781mmol)를 첨가하여 상온에서 7시간 교반 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 감압 농축하여 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일에스테르 숙신산 2-비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)(2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ester succinic acid 2-[bis-(4-dimethoxytrityl)-poly(ethyleneglycol)[화합물 C] 490mg(94%, 흰색 고체)를 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 5에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3);δ 2.72-2.97(m,6,CH2CO,CH2CH2), 3.20-3.87(m,186,PEG,DMT-OCH3), 4.27-4.28(m,2,CH2CO), 6.80-6.83(m,4,DMT), 7.20-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-2. LCAA-CPG와 3'-PEG 시약(화합물 A)의 결합
이후의 실시예에서, 하기 반응식에 나타난 바와 같이 CPG와 3'-PEG 시약을 결합시켰다.
Figure PCTKR2010003039-appb-I000016
실시예 1-2-1. LCAA-CPG(2000Å) 제조
직경 40∼75 ㎛, 세공 2000Å의 CPG(Silicycle Inc., 캐나다) 10g을 톨루엔 100㎖에 골고루 섞어 적셔준 후, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane, TCI Org. Chem, 일본) 2㎖를 넣어 섞고 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드의 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 LCAA-CPG(2000Å)를 10g을 얻었다.
실시예 1-2-2. 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)][화합물 A]을 사용한 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조
상기 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 2g을 메틸렌클로라이드 20㎖에 적셔 놓았다. 또한, 화합물 A 80mg과 TEA(Triethylamine, Sigma Aldrich, 미국) 14㎕, BOP(Benzortiazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, TCI Org. Chem, 일본) 15mg, HOBT(1-Hydroxybenzotriazole anhydrous, TCI Org. Chem, 일본) 5mg를 메틸렌클로라이드 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG(2000Å) 용액과 골고루 섞었다. 이를 8시간 동안 환류반응시킨 후 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켰다.
이 중 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸이미다졸(Sigma Aldrich, 미국) 1㎖와 아세트산 무수물(Sigma Aldrich, 미국) 1.6㎖를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료되어 얻어진 캡핑(Capping) 완료된 CPG를 메탄올, 물, 메탄올, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
실시예 1-3. LCAA-CPG(2000Å)와 3'-PEG 시약(화합물 B)의 결합
Figure PCTKR2010003039-appb-I000017
화합물 B를 사용하여 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조를 수행하였다.
구체적으로 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 1g을 피리딘 8㎖에 충분히 적셔 놓았다. 또한, 화합물 B 205mg(2eq)과 트리에틸아민 55㎕를 피리딘 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG 용액과 골고루 섞었다. 이를 50∼60℃에서 8시간 반응시킨 후, 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 여과된 커플링-CPG 를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켰다. 건조 완료된 커플링-CPG 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸 이미다졸 500㎕ 아세트산 무수물 800㎕를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 커플링-CPG를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
도 6은 3'-PEG-CPG를 출발물질로 이용하여 후술하는 실시예 2에 나타낸 바와 같이 siRNA를 제조 후 Maldi-Tof 분자량 확인 결과이다.
3'-PEG-CPG 제조 서열;
sense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6664.96Da + 2000Da)(서열번호 1)
antisense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-PEG(6592.84Da + 2000Da)(서열번호 5)
PEG의 분자량(2000Da) 만큼 Maldi-Tof 분자량이 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 1-4. LCAA-CPG(2000Å)와 3'-PEG 시약(화합물 C)의 결합
Figure PCTKR2010003039-appb-I000018
화합물 C를 사용하여 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조를 수행하였다.
구체적으로 상기 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 1g을 피리딘 8㎖에 충분히 적셔 놓았다. 또한, 화합물 C 200mg과 트리에틸아민 55㎕를 피리딘 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG 용액과 골고루 섞었다. 50∼60℃에서 8시간 반응시킨 후, 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 여과된 커플링-CPG 를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켰다. 건조 완료된 커플링-CPG 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸이미다졸 500㎕와 아세트산 무수물 800㎕를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료되어 얻어진 캡핑완료된 CPG를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
도 7은 3'-PEG-CPG를 출발물질로 이용하여 후술하는 실시예 2에 나타낸 바와 같이 siRNA를 제조한 결과이다.
3'-PEG-CPG 제조 서열;
sense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6664.96Da + 2000Da)(서열번호 1)
antisense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-PEG(6592.84Da + 2000Da)(서열번호 5)
PEG의 분자량(2000Da) 만큼 Maldi-Tof 분자량이 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 2. siRNA 고분자 화합물 접합체의 제조
이하 실시예에서는 서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈 siRNA를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8): 917-921, 1997). 본 발명의 서바이빈 siRNA의 서열은 19개 뉴클레오티드로 구성된 경우, 서열번호 1번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 그 밖에 23개, 27개, 31개의 뉴클레오티드로 구성된 경우, 서열번호 2, 3, 4로 기재되는 염기서열을 갖는다.
(서열번호 1) 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(서열번호 2) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(서열번호 3) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUU-3'
(서열번호 4) 5'-AAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUUAGAUGUU-3'
상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조하였다. 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거, 결합, 산화 및 캐핑으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다.
추가적으로 5'말단 부위에 PEG 또는 소수성 고분자 화합물인 도데칸(dodecane) 링커를 이용하여 헥사데칸(hexadecane, C16)이나 옥타데칸(octadecane, C18) 포화탄화수소를 이어 siRNA 고분자 화합물 접합체를 만들었다. 또한, 상기 실시예 1에서 제조된 3'PEG-CPG를 지지체로 상기 반응을 수행하여, 3' 말단 부위에 PEG가 부여된 siRNA 고분자 화합물 접합체를 제조하였다.
상기 반응물들을 HPLC(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 이용하여 RNA를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)를 이용하여 분자량을 측정하여, 제조하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그 후, 센스와 안티센스 RNA 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30mM HEPES, 100mM Potassium acetate, 2mM Magnesium acetate, pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37℃에서 반응시켜, 목적하는 이중가닥 siRNA 고분자 화합물 접합체를 각각 제조하였다. 제조된 siRNA 고분자 화합물 접합체는 표 1에 표시된 구조를 갖는다. 제조된 siRNA 고분자 화합물 접합체는 전기영동 사진을 통하여 어닐링을 확인하였다(도 8).
표 1 siRNA 고분자 화합물 접합체의 구조 및 말단 변형 형태
접합체명 접합체 구조명 말단 변형 형태
siRNA naked siRNA Sense: none
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 1 5'PEG-sense siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 2 5'PEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 3 5'ssPEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'ssPEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 4 5'PEG+PEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 5 5'PEG+ssPEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'ssPEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 6 3'PEG-sense siRNA Sense: 3'PEG
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 7 3'PEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 3'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 8 3'PEG+PEG siRNA Sense: 3'PEG
Antisense: 3'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 5'C18-sense siRNA Sense: 5'C18-C6-ss-C6
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 10 5'C18+PEG siRNA Sense: 5'C18-C6-ss-C6
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 11 5'C16+PEG siRNA Sense: 5'C16-C6-ss-C6
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 12 5'C18-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'C18-C6-ss-C6
siRNA 고분자 화합물 접합체 13 5'PEG+C18 siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'C18-C6-ss-C6
siRNA 고분자 화합물 접합체 14 5'PEG+C16 siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'C16-C6-ss-C6
* 상기 접합체 구조 중 "ss"는 이황화 결합을 의미하고, "C16" 또는 "C18"은 각각 탄소수가 16 또는 18개인 탄화수소를 나타내며, 이에 따라 "C18-C6-ss-C6" 및 "C16-C6-ss-C6"는 소수성 고분자 화합물을 의미함.
실시예 3. siRNA 고분자 화합물 접합체의 생체내 조건에서의 안정성 평가
상기 실시예 2에서 제조, 분리한 siRNA 고분자 화합물 접합체가 고분자 화합물이 결합되지 않은 원래의 siRNA에 비하여 안정성이 향상되었는지를 확인하였다. 변형되지 않은 원래의 siRNA와 상기 실시예 2에서 제조한 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5를 생체내 조건을 모방한 형태인 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 배지에서 각각 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36 또는 48시간 동안 배양한 후 siRNA의 분해된 정도를 전기영동으로 검토하였다.
그 결과, PEG가 도입된 siRNA 고분자 화합물 접합체의 경우 48시간까지도 siRNA가 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 10% 혈청 조건에서도 12시간 내지 24시간까지 siRNA가 안정성을 나타내었다.
실시예 4. siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체의 나노입자 크기 측정
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 14의 경우 siRNA의 말단에 부여된 소수성 고분자 화합물간의 소수성 상호작용에 의하여 siRNA 고분자 화합물 접합체로 이루어진 나노입자, 즉 미셀(micelle)를 형성하게 된다(도 10). 제타 전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 13과 siRNA의 나노입자 크기를 측정하였다.
구체적으로, 상기 siRNA 및 siRNA 고분자 화합물 접합체 2nmole을 1㎖의 증류수에 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(200W, 40 kHz, 5sec)하였다. 균질화된 나노입자는 제타 전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절율(Refractive index)은 1.454 , 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 물의 온도 25℃ 및 그에 따른 점도 및 굴절율을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3회 반복하였다.
도 11은 naked siRNA 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA로 구성된 나노입자의 경우 142-295nm(최고점 164nm)의 크기를 가진 것이 73.5%를 차지함을 알 수 있다.
도 12는 siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 경우 4.19-7.53nm(최고점 6.50nm)의 크기를 가진 것이 59.1%를 차지함을 알 수 있다.
도 13은 siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 경우 5.61-10.1nm(최고점 8.72nm)의 크기를 가진 것이 58.9%를 차지함을 알 수 있다.
도 14는 siRNA 고분자 화합물 접합체 11로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 11로 구성된 나노입자의 경우 5.61-10.1nm(최고점 8.72nm)의 크기를 가진 것이 45.6%를 차지함을 알 수 있다.
도 15는 siRNA 고분자 화합물 접합체 12로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 12로 구성된 나노입자의 경우 4.85-5.61nm의 크기를 가진 것이 23.6%, 21.0-32.7nm의 크기를 가진 것이 23.5%, 68.1-78.8nm의 크기를 가진 것이 23.1%를 차지함을 알 수 있다.
도 16은 siRNA 고분자 화합물 접합체 13으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 13로 구성된 나노입자의 경우 4.85-8.72nm(최고점 5.61nm)의 크기를 가진 것이 84.6%를 차지함을 알 수 있다.
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 13으로 구성된 나노입자의 경우 siRNA 접합체 12를 제외하고 4-8 nm의 크기를 가진 것이 대부분이었다. siRNA 접합체 12의 경우 나노입자가 가진 사이즈가 다양하게 측정되었는데, 이는 측정하는 과정에서 초음파 분산기를 통해 균질화하여도, 시간이 경과함에 따라 각 나노입자들이 응집되는 현상을 나타내기 때문인 것으로 여겨진다. 도 12 내지 16에서 알 수 있듯이 측정된 siRNA 접합체로 구성된 나노입자의 사이즈는 100nm 이하의 크기를 나타내며, 이는 음세포 작용(pinocytosis)을 통해 세포내로 섭취되기에 충분한 크기이다(Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009).
실시예 5. siRNA 고분자 화합물 접합체와 트랜스팩션 물질(transfection reagent)을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 8을 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주에서 서바이빈 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 5-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(Hela)는 RPMI 1640 배양배지(GIBCO, Invitorgen, 미국)에 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 서열번호 1의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 8를 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주에서 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 5-2-1. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주 1.3×105 을 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, Lipofectamine™ 2000(Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체(25pmole/㎕) 0.8 또는 4㎕를 첨가하고(최종 20, 100 nM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 200㎕ 씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간동안 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2-2. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-2-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 5-2-2-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-2-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 5-2-2-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 서바이빈 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 증류수로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 HMBS(Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC(Ubiquitin C), YWHAZ(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activtion protein, zeta polypeptide)를 표준 유전자로 하여 상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 동일한 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 17). mock은 트랜스펙션 물질만이 처리된 대조군을 의미한다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 친수성 고분자 화합물인 PEG가 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 말단 변형 형태에 따라 siRNA의 RNAi 효과에 변화가 나타남을 알 수 있다. 특히, 접합체 6 내지 8의 말단 변형 형태는 3' 말단 부위에 PEG를 접합시킨 접합체로서 변형시키지 않은 siRNA와 유사한 정도의 발현 저해를 나타내어, siRNA의 RNAi 메카니즘상 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)와 복합체를 형성하는 데 있어 입체장애(steric hindrance)를 적게 주는 것으로 예상된다. 또한, 대부분의 siRNA-PEG 접합체는 저농도(20nM) 조건이 고농도(100nM) 처리 조건에 비해 높은 목표 유전자 mRNA의 발현 저해를 나타내어, 고농도 조건일수록 PEG로 인해 siRNA가 RISC와 결합하는 것이 방해되는 것으로 예상된다.
실시예 5-3. 긴 서열의 siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 목표유전자의 발현 억제
siRNA 서열번호 1 내지 4의 염기서열에 siRNA 고분자 화합물 접합체 4 구조로 말단 변형을 유도한 siRNA를 이용하여, 트랜스펙션 물질과 함께 siRNA 친수성 고분자 화합물 접합체로 세포를 트랜스펙션시켰을 때 목표 유전자의 mRNA 발현 저해를 분석하였다.
실시예 5-3-1. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주 1.3×105 을 상기 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
한편, Lipofectamine™ 2000 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체(25pmole/㎕) 0.8 또는 4㎕를 첨가하고(최종 20, 100 nM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 200㎕ 씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간동안 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-3-2. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-3-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 5-3-2-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-3-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 5-3-2-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 서바이빈 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 HK 유전자인 HMBS, HPRT1, UBC, YWHAZ를 표준 유전자로 하여, 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 18). mock은 트랜스펙션 물질만이 처리된 대조군을 의미하고 19mer, 23mer, 27mer, 31mer는 각각 서열번호 1 내지 4를 나타낸다. 5'P+P는 siRNA 고분자 화합물 접합체 4의 구조를 나타내며, 각 20nM, 100nM의 조건으로 처리한 뒤 목표 유전자의 발현 저해 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 18에 나타나는 바와 같이, 긴 사슬의 naked siRNA의 형태를 siRNA 고분자 화합물 접합체 4의 형태로 변형시키는 경우 원래의 naked siRNA에 비하여 목표 유전자 mRNA의 발현 저해 효과의 차이를 나타내지 않아, 긴 사슬의 siRNA를 변형시키는 경우 짧은 사슬에 비하여 PEG로 인해 오는 입체장애 현상이 감소됨을 파악할 수 있었다. 즉, 긴 사슬의 siRNA의 경우 RNAi의 작용기전에서 다이서(dicer)에 의해 siRNA가 19+2 구조로 절단이 되어 절단된 siRNA가 RISC 복합체에 결합하여 RNAi작용 기전을 일으킨다. 이 때문에 긴 사슬의 siRNA의 양말단 부위에 PEG가 부여된 경우 서열번호 1번에 비하여 PEG가 붙어있지 않은 siRNA가 다량 존재하여 RISC 복합체와 상대적으로 높은 상호작용을 갖고, 이로부터 RNAi 유도효과가 유지되는 것으로 보인다.
실시예 6. 트랜스팩션 물질 없이 siRNA 고분자 화합물 접합체만을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 14를 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 6-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(Hela)는 RPMI 1640 배양배지(GIBCO/Invitorgen, 미국)에 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 6-2. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
전기 실시예 6-1에서 배양된 종양세포주 1.3×105 을 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건으로 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 900㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
한편, Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5(1nmole/㎕) 5 또는 10㎕를 첨가하고(최종 500nM, 1μM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
한편, Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 14(1nmole/㎕) 5 또는 10㎕를 첨가하고(최종 500nM, 1μM 처리), 고주파음에 의한 분해(sonication)를 통하여 siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체로 구성된 미셀을 균등화하여 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 100㎕ 씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 1㎖을 첨가하였다. 여기에 24 시간동안 추가적으로 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하여 , siRNA 고분자 화합물 복합체 처리 후 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 6-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 6-2에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 6-3-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 6-2에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 6-3-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 서바이빈 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 HMBS(Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC(Ubiquitin C), YWHAZ(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activtion protein, zeta polypeptide)를 표준 유전자로 하여, 상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 19).
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 접합체 2 내지 5의 siRNA PEG 접합체의 경우 트랜스펙션 물질을 통해 트랜스펙션된 결과와는 다르게 siRNA 고분자 화합물 접합체 1에 비하여 서바이빈 mRNA 발현량이 많이 저해되었으며, siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5의 경우 농도가 낮은 경우(500nM)에서 높은 농도에 비하여 높은 RNAi 효과를 나타내었다. 또한, 접합체 9 내지 14의 siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체는 siRNA 친수성 고분자 화합물 접합체 2 내지 5에 비하여 동일 농도(500nM) 처리하였을 경우, 대체로 서바이빈 mRNA 발현량 저해가 높지 않은 결과를 보였다. 하지만, 고농도 조건(1μM) 조건에서 처리한 경우, 특히 siRNA 고분자 화합물 접합체 14에서 높은 서바이빈 mRNA 발현량 저해 효과를 나타냈다.
서열목록 참조

Claims (21)

  1. 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체:
    A-X-R-Y-B.
    (상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물, X, Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
  2. 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체:
    A-X-R.
    (상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 siRNA(R)의 단일가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 접합체.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 소수성 고분자 화합물(A)는 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 소수성 고분자 화합물(A)는 C16-C50의 포화탄화수소 또는 콜레스테롤인 접합체.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 공유결합(X,Y)은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 접합체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합인 접합체.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 접합체.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 친수성 고분자 화합물(A 또는 B)는 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 접합체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 친수성 고분자 화합물은 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군으로부터 선택되는 접합체.
  11. 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000019
    [상기에서, R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5∼120까지의 정수이고; X는 수소, 4-모노메톡시트리틸기, 4,4'-디메톡시트리틸기 또는 4,4',4"-트리메톡시트리틸기이다.]
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 고형 지지체가 CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 CPG는 직경이 40∼180 ㎛이고, 공극 크기가 500Å∼3000Å인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
  14. 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 구조식 Ⅳ를 갖는 3'-PEG-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
    [구조식 Ⅳ]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000020
  15. 1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG를 형성하는 단계;
    2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)]을 형성하는 단계;
    3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
    4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
    5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
    6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 하기 구조식 Ⅳ 3'-PEG-CPG의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000021
    [구조식 Ⅰ]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000022
    [구조식 Ⅱ]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000023
    [구조식 Ⅲ]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000024
    [구조식 Ⅳ]
    Figure PCTKR2010003039-appb-I000025
    [상기에서, R은 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬 또는 헤테로아릴이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
  16. 1) 청구항 11에 기재된 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
    2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 청구항 1 또는 청구항 2의 siRNA 접합체의 제조방법.
  17. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 siRNA 접합체로 구성된 나노입자.
  18. 1) 청구항 17에 기재된 나노입자를 준비하는 단계; 및
    2) 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 나노입자는 경구투여 또는 정맥주사의 방법으로 체내에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  20. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 siRNA 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 청구항 17에 기재된 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
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