WO2007086490A1 - 脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤 - Google Patents

脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤 Download PDF

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inhibitor
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choroidal neovascularization
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Susumu Ishida
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Keio University
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases associated with choroidal neovascularization, which comprises an IL-6 inhibitor as an active ingredient, and use thereof.
  • the present invention also relates to a choroidal neovascularization inhibitor containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient, and use thereof.
  • Age-related macular degeneration is a disease that causes abnormalities in the macular region of the retina, and is the leading cause of blindness in Europe and the United States.
  • the macula is located in the center of the retina and is a highly dense area of pyramidal cells among the photoreceptor cells. Light from the outside is refracted by the cornea / lens lens and concentrated in the central fovea of the macula, and the visual acuity for decoding the letters depends on the function of the same part.
  • age-related macular degeneration the macular, which is an important part in this way, degenerates due to aging.
  • CNV choroidal neovascularization
  • Inflammatory cells such as macrophages are also sources of angiogenic factors such as vascular endothelial growth facton VEGF and function to promote angiogenesis at the site of inflammation, a process called inflammatory angiogenesis. It is released.
  • drusen contains advanced glycation end-products (AGE), which are substances that enhance VEGF production, and amyloid, which stimulates retinal pigment epithelial cells that have migrated to surround drusen. Can also secrete VEGF and also generate CNV It is considered one of the mechanisms.
  • AGE advanced glycation end-products
  • CNV myopic choroidal neovascularization and idiopathic choroidal neovascularization in addition to age-related macular degeneration.
  • diseases associated with CNV may develop due to retinal pigment streak, trauma, uveitis, and the like.
  • the pathogenesis of CNV in these diseases, as in CNV in age-related macular degeneration, has been implicated in tissue damage centered on the subretinal Bmch membrane 'retinal pigment epithelium and subsequent inflammation.
  • VEGF produced by inflammation is involved in CNV
  • treatment of diseases associated with CNV has been performed with VEGF antagonists such as anti-VEGF aptamers.
  • VEGF antagonists are administered in the advanced stage when angiogenesis occurs, but there is a problem that neuropathy remains irreversibly after treatment once entered the advanced stage.
  • IL-6 is a cytodynamic force also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon j3 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Non-Patent Document 1), and it was later revealed that it is a multifunctional site force-in that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 2).
  • IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity via two proteins on cells.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Documents 4 and 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of an extracellular region in addition to a membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • the other is a membrane protein gpl30 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signaling.
  • IL-6 and IL-6 receptor form an IL-6 / IL-6 receptor complex and then bind to gpl30, thereby transmitting the biological activity of IL-6 into the cell (non- Patent Document 6).
  • An IL-6 inhibitor is a substance that inhibits transmission of IL-6 biological activity. So far, antibody against IL-6 (anti-IL-6 antibody), antibody against IL-6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibody against gpl 30 (anti-gpl30 antibody), IL-6 variant, IL-6 or IL-6 receptor partial peptides are known.
  • Non-Patent Documents 7 and 8, patent documents Donation :! ⁇ 3).
  • One such antibody is the human PM-1 antibody obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of the mouse antibody PM-1 (Non-patent Document 9), which is one of the antibodies, into a human antibody. (Patent Document 4).
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 10
  • Patent Document 1 International Patent Application Publication Number WO 95-09873
  • Patent Document 2 French Patent Application Publication Number FR 2694767
  • Patent Document 3 US Patent No.US 5216128
  • Patent Document 4 International Patent Application Publication Number WO 92-19759
  • Non-patent literature l Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-Patent Document 2 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78
  • Non-Patent Document 3 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
  • Non-Patent Document 4 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-Patent Document 5 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
  • Non-Patent Document 6 Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
  • Non-Patent Document 7 Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
  • Non-Patent Document 8 Huang, Y. W. et al "Hybridoma (1993) 12, 621-630
  • Non-Patent Document 9 Hirata, Y. et al "J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
  • Non-Patent Document 10 Seddon JM, Arch Ophthalmol. 2005 Jun; 123 (6): 774-82
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with choroidal neovascularization, which contains an IL-6 inhibitor as an active ingredient. There is. Another object of the present invention is to provide a choroidal neovascularization inhibitor containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides an IL-6 inhibitor to a subject who has developed a disease associated with choroidal neovascularization.
  • CNV is promoted by inflammation under the macular region, and the initiation or progression of angiogenesis by angiogenic factors such as VEGF.
  • VEGF angiogenic factors
  • the present invention provides the following [1] to [36].
  • a preventive and / or therapeutic agent for a disease associated with choroidal neovascularization comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the disease associated with choroidal neovascularization is age-related macular degeneration, myopic choroidal neovascularization, idiopathic choroidal neovascularization, or any of [1] to [7] Preventive and / or therapeutic agent.
  • a choroidal neovascularization inhibitor comprising an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • a method for treating a disease associated with choroidal neovascularization in a subject comprising a step of administering an IL_6 inhibitor to the subject who developed a disease associated with choroidal neovascularization.
  • FIG. 1 A photograph showing a CNV cross section of a stretched specimen obtained by lectin-staining the choroid with a confocal microscope.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of volumetric evaluation of CNV volume after IL-6 receptor antibody administration.
  • the present inventors have found that CNV development can be suppressed by administering an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to an agent for preventing and / or treating a disease associated with choroidal neovascularization, and an inhibitor of choroidal neovascularization, which contains an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the “IL-6 inhibitor” is a substance that blocks IL-6 signaling and inhibits IL-6 biological activity.
  • the IL-6 inhibitor is preferably a substance having an inhibitory action on binding of any of IL-6, IL-6 receptor and gpl30.
  • Examples of the IL-6 inhibitor of the present invention include anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gpl30 antibody, IL-6 variant, soluble IL-6 receptor variant or IL-6 or Examples thereof include partial peptides of IL-6 receptor and low molecular weight substances exhibiting the same activity as these, but are not particularly limited.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention is preferably an antibody that recognizes IL-6 receptor.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but it is preferably derived from a mammal, more preferably a human-derived antibody.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using a known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to IL-6, thereby inhibiting the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan Immunization). Examples include general meetings of academic societies and academic records (1991) 21, 166).
  • Anti-IL-6 antibody-producing hybridomas can be basically prepared using known techniques as follows. That is, using IL-6 as a sensitizing antigen and immunizing it according to the usual immunization method, the obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and by the usual screening method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • the anti-IL-6 antibody can be prepared as follows. For example, antibody acquisition HI-6 used as a sensitizing antigen of Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Im munol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol. Chem. 1990) 54, 2685-2688, and obtained by using the IL-6 gene / amino acid sequence.
  • the target IL-6 protein After inserting the gene sequence of IL-6 into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target IL-6 protein is known from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of IL-6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to the IL-6 receptor, thereby blocking the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • MR16-1 antibody Tropura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928
  • PM-1 antibody Hirata, Y. et al , J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906)
  • AUK12-20 antibody AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody
  • PM-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against HL-6 receptor
  • MR16-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor. .
  • the anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hyperidoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Thus, a monoclonal antibody-producing cell can be screened.
  • an anti-IL-6 receptor antibody can be prepared as follows.
  • the human HL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 3 25474, and the mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. JP-A 3-155795. Is Obtained by using the IL-6 receptor gene / amino acid sequence.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane, and is released from the cell membrane.
  • Soluble IL-6 receptor (Soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al "J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Soluble IL-6 receptor binds to the cell membrane. -6 receptor is substantially composed of extracellular force, and differs from membrane-bound IL-6 receptor in that the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region are deficient. As the IL-6 receptor protein, any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the IL-6 receptor gene sequence into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is transferred from the host cell or culture supernatant. Purified by a known method, and this purified IL-6 receptor protein can be used as a sensitizing antigen. In addition, cells expressing IL-6 receptor or fusion proteins of IL-6 receptor protein and other proteins may be used as sensitizing antigens.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to gpl30, thereby inhibiting the binding of IL-6 / IL-6 receptor complex to gpl30 and blocking the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • Examples of such antibodies include AM64 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 3-219894), 4B11 antibody and 2H4 antibody (US 5571513) B-S12 antibody and B-P8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199).
  • An anti-gpl30 monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen and immunized according to the usual immunization method. The obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and then monoclonal by the usual screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • Gpl30 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies can be obtained by using the gpl30 gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the target gpl30 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method, This purified gpl30 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Specifically, rodent animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • a known method is performed.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitized antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc., and suspended, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells that are subjected to cell fusion include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as other parental cells to be fused with the immune cells have already been known in various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Imm unol. 1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U. L (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS—l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (19 76) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Minorestein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3- 46) etc.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells is preferably 1 to 10 times the number of immune cells relative to myeloma cells, for example.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • Cell fusion is a PEG solution in which a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture medium and preheated to about 37 ° C, for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000.
  • PEG solution is usually added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to form the desired fused cell (hypridoma).
  • cell fusion agents and the like unfavorable for the growth of hypridoma can be removed by repeating the operation of adding an appropriate culture solution successively, centrifuging and removing the supernatant.
  • the hyperidoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT medium is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the desired hyperpridoma to die. Next, the usual limiting dilution method is performed, and screening and cloning of the hybridoma producing the target antibody is performed.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT medium is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the desired hyperpridoma to die.
  • the usual limiting dilution method is performed, and screening and cloning of the hybridoma producing the target antibody is performed.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen protein or antigen-expressing cell, and the sensitized B lymphocytes are human myeloma. It is also possible to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or antigen-expressing cell by fusing with a cell such as U266 (see Japanese Patent Publication No. 59878).
  • human antibody residues An antigen or an antigen-expressing cell may be administered to a transgenic animal having a gene repertoire, and a desired human antibody may be obtained according to the method described above (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • the thus-prepared hyperpridoma producing monoclonal antibodies can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • PM-1 antibody-producing hybridoma is injected into the abdominal cavity of BALB mice to obtain ascites, and PM-1 antibody is purified from this ascites, or this hybridoma is treated with an appropriate medium such as 10% urine fetal serum.
  • an appropriate medium such as 10% urine fetal serum.
  • an antibody gene is cloned from a hyperidoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique.
  • Antibodies can be used (see, for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of an antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, such as Hypridoma. Isolation of mRNA can be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. et al, Anal. Biochem. 1987) 162, 156-159) etc. Prepare NA and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia). Moreover, it is possible to prepare mRNA directly by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • For cDNA synthesis and amplification 5 Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA) (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932).
  • the desired DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli and the like, and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described below.
  • an expression control region for example, an enhancer or a promoter, as described below.
  • the host cell can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a genetically engineered antibody such as a chimeric antibody, a humanized antibody, a human ( a) antibodies can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody is produced by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. (See European Patent Application Publication Number EP 125023, International Patent Application Publication Number W 0 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful for the present invention is obtained. Can do.
  • the human antibody is also referred to as a reshaped human antibody or humanized antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, is changed to the complementarity determining region of a human antibody. It is transplanted and its general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • the number of DNA sequences designed to link mouse antibody CDRs and human antibody framework regions (FRs) with a portion that overlaps the terminal region is synthesized by PCR from individual oligonucleotides.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number). See WO 92-19759).
  • the complementarity determining region forms a favorable antigen-binding site is selected. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody
  • a humanized antibody is a complementarity-determining region of a non-human mammal-derived antibody and a framework region derived from a human antibody. It consists of C region and both are useful as antibodies used in the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • humanized antibodies used in the present invention include humanized PM-1 antibodies (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • a variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected. Inheritance of selected phages By analyzing the pups, it is possible to determine the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector containing the sequence can be prepared, and a human antibody can be obtained.
  • scFv single chain antibody
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • mammalian cells When mammalian cells are used, they can be expressed by commonly used useful promoters, expressed antibody genes, DNA 3 functionally linked to the 3 'downstream, or vectors containing them. it can.
  • promoter / enhancer it is possible to enumerate the human cytomegalovirus lmmediate early promoter / enhancer;
  • promoter Z enhancers that can be used for expression of antibodies used in the present invention
  • virus promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), etc.
  • a promoter / enhancer derived from mammalian cells such as Factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ) may be used.
  • HEF1 ⁇ Factor 1 ⁇
  • the method of Mulligan et al. Mulligan, RC et al., Nature (1979) 277, 108-114
  • HEF1 ⁇ promoter / enhancer Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • E. coli In the case of E. coli, it can be expressed by functionally binding a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • a useful promoter commonly used a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and ara B promoter.
  • the method of Ward et al. Ward, ES et al, Nature (1989) 341, 5 44-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427
  • the araB promoter When using the araB promoter, the method of Better et al. (Better, S. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) is used when producing it in the periplasm of E. coli. Just do it. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the vector can include an aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like as selectable markers.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • any production system can be used.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • In vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or ( 3) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc.
  • amphibian cells such as Xenopus oocytes
  • Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be cultured in callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger. ing.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there is a production system using bacterial cells.
  • bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of animals. [0047] On the other hand, examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • Examples of mammals that can be used include goats, pigs, hidges, mice, and rabbits (Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology A ⁇ lications, 1993). In addition, silkworms can be used as insects.
  • tobacco can be used.
  • An antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene is inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used as appropriate in the transgenic goat.
  • a silkworm is infected with a baculovirus into which the target antibody gene has been inserted, and a desired antibody is obtained from the body fluid of this silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) .
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector. May be transformed at the same time, or the host may be transformed by incorporating DNAs encoding the H and L chains into a single expression vector (International Patent Application Publication No. WO94-11523). reference).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to produce antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • scFv is obtained by linking the H chain V region and L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988). 85, 5879—5883).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv may be derived from any of those described as the above antibody.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the scFv-encoding DNA is composed of a DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA encoding the L chain or L chain V region, and the sequence of those sequences.
  • a portion of the DNA encoding the desired amino acid sequence is amplified by PCR using a primer pair that defines both ends of the DNA, and then a DNA encoding a portion of the peptide linker and both ends thereof are respectively H chain, Obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined so as to be linked to the L chain.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • antibody as used in the present invention encompasses these antibody fragments.
  • a modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it is obtained by chemically modifying the obtained antibody. Ability to do S. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above can be purified from the inside and outside of the cell and from the host and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, S-mark harose F.F.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins are not limited in any way.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatographies are applied to and protected by HPL (High performance liquid chromatography). You can also use reverse phase HPLC.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance, ELISA, or the like.
  • absorbance when measuring absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure absorbance at 280 nm and calculate lmg / ml as 1.350D.
  • ELISA it can be measured as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (TAG) diluted to 0.1 ig / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was placed in a 96-well plate (Nunc) and placed at 4 ° C. Incubate and immobilize the antibody. After blocking, add appropriately diluted antibody to be used in the present invention or a sample containing the antibody, or 100 ⁇ l of HgG (manufactured by CAPPEL) as a sample, and incubate at room temperature for 1 hour.
  • the IL-6 variant used in the present invention is a substance that has binding activity to the IL-6 receptor and does not transmit the biological activity of IL-6.
  • IL-6 variant is against UL-6 receptor against UL-6 It binds competitively with IL-6, but does not transmit the biological activity of IL-6, and therefore blocks signal transmission by IL-6.
  • the IL-6 variant is produced by introducing a mutation by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of IL-6.
  • IL-6 which is the origin of the IL-6 variant, can be of any origin, but is preferably HL-6 in consideration of antigenicity and the like.
  • the secondary structure of the amino acid sequence of IL-6 can be determined using a known molecular modeling program such as W HATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting and evaluating the effect on the total number of amino acid residues to be substituted. After determining the appropriate replacement amino acid residue, by introducing a mutation that replaces the amino acid by the usual PCR method, using a vector containing the base sequence encoding the HL-6 gene as a saddle type, A gene encoding the IL-6 variant is obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector as necessary, and an IL-6 variant can be obtained according to the expression, production and purification methods of the recombinant antibody.
  • W HATIF Wide et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56.
  • IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al "EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96 -18648, W096-1786 9.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has a binding activity to IL-6 receptor or IL-6, respectively, and the biological activity of IL-6 It is a substance that does not transmit activity. That is, IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide binds to IL-6 receptor or IL-6, and captures these to specifically bind IL-6 to IL-6 receptor. Obstruct it. As a result, IL-6 does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking IL-6 signaling.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is a part of a region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. Alternatively, it is a peptide consisting of the entire amino acid sequence. Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide specifies the region involved in the binding of IL-6 to IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor And that specific It can be prepared by a generally known method based on the amino acid sequence of a part or all of the region, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • a DNA sequence encoding a desired peptide is incorporated into an expression vector, and expression of the recombinant antibody is performed. It can be obtained according to production and purification methods.
  • a method generally used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. it can.
  • an amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the amino group and the side chain functional group are protected with an appropriate protecting group.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the peptide chain support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can usually be used for the Boc method
  • TFA can be used for the Fmoc method.
  • Boc method for example, the protected peptide resin is treated in the presence of anisole in hydrogen fluoride.
  • the peptide is recovered by removing the protecting group and cleaving from the support. This is freeze-dried to obtain a crude peptide.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the peptide chain support can be performed in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by application to HPLC.
  • a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification may be used under optimum conditions.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized.
  • the peptide fraction purified in this way identification is performed by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • IL-6 partial peptide and IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098 and US Pat.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the preventive and / or therapeutic agent for a CNV-associated disease and CNV inhibitor of the present invention can be used in the prevention and / or treatment of a disease associated with CNV.
  • CNV means that choroidal blood vessels penetrate the Bruch (Bch) membrane / retinal pigment epithelium and proliferate ectopically.
  • CNV is thought to be caused by inflammatory cells, mainly macrophages soaked to engulf drusen accumulated in the vicinity of the retinal pigment epithelium due to oxidative stress due to aging.
  • Angiogenic factors such as VEGF are produced by inflammatory cells as a result of persistent low-inflammatory inflammatory responses, resulting in inflammatory angiogenesis.
  • Typical diseases associated with CNV include age-related macular degeneration, myopic choroidal neovascularization, idiopathic choroidal neovascularization, and the like.
  • Age-related macular degeneration refers to a disease that causes visual loss mainly in the form of dislocation (distortion) or central dark spot because the macular degenerates with age.
  • exudative age-related macular degeneration is a disease with a poor prognosis that causes rapid and severe visual loss, and its central pathology is CNV.
  • Optometrists show exudative changes such as retinal pigment epithelial detachment, serous retinal detachment, subretinal hemorrhage, and hard vitiligo.
  • Myopic choroidal neovascularization is the most common cause of decreased visual acuity in people with pathological myopia, and when a new blood vessel is formed in the macula, a fiber that causes a dark spot in the center of the visual field It often causes sex pigmented scars.
  • Intense myopia which is common in Japanese, is that the length of the front and back of the eye (axis of the eye) is abnormally prolonged, and this causes various fundus lesions peculiar to myopia such as CNV at the posterior pole of the fundus. , Cause visual impairment.
  • Idiopathic choroidal neovascularization can be diagnosed when myopia, uveitis, trauma, collagen disease, infection, etc., which often occur in one eye of a young woman, can be denied. Small neovascular tissue and exudative changes such as bleeding and edema are observed under the retina. Involvement of inflammation is suggested by the fact that it may improve in several months in response to anti-inflammatory steroids.
  • Diseases associated with CNV of the present invention are not limited to the above-mentioned diseases, but include posterior uveitis, traumatic choroidal rupture, retinal pigment striae, histoplasma ophthalmopathy, etc. Also included are diseases with CNV caused by disorders of the pigment epithelium level and other diseases that cause subsequent inflammatory angiogenesis.
  • treatment of a disease associated with CNV means to suppress or ameliorate symptoms caused by the above-mentioned disease in a disease associated with CNV.
  • suppression of ongoing CNV and suppression of neuroretinal dysfunction due to abnormal neovascular bleeding and plasma component leakage also mean treatment of diseases associated with CNV.
  • preventing diseases associated with CNV refers to suppressing the onset of CNV in the inflammatory stage before angiogenesis proceeds.
  • “suppressing CNV” refers to suppressing angiogenesis, suppressing an inflammatory reaction in the retina (suppressing proliferation of inflammatory cells in the retina), and blood vessels caused by inflammatory cells. It also means inhibiting the production of nascent factors. Inflammatory reactions in the retina may be due to accumulation of waste products generated by metabolism such as drusen, or may be due to trauma.
  • CNV whether or not CNV is suppressed can be confirmed by detecting the size (volume) of angiogenesis by fluorescent fundus contrast examination or the like.
  • CNV can be regarded as being suppressed when the angiogenic volume is decreased.
  • the detection of CNV is not limited to this, and can be performed by a known method, and can also be performed by the method described in Examples.
  • the disease accompanied by CNV progresses, it shows visual acuity such as metastasis and central dark spot.
  • visual acuity such as metastasis and central dark spot.
  • the IL-6 signal transduction inhibitory activity of the IL-6 inhibitor used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma line (S6B45, KPM M2), a human Rennelt T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell MH60.BSF2 is cultured, and IL-6 is added thereto. At the same time, 3H-thymidine uptake of IL-6-dependent cells can be measured by coexisting with an IL-6 inhibitor.
  • U266 an IL-6 receptor-expressing cell, is cultured, 1251 labeled IL-6 is added, and at the same time, an IL-6 inhibitor is added, thereby binding 1251 labeled IL- Measure 6.
  • a negative control group that does not contain an IL-6 inhibitor was established, and the results obtained from both were compared. Inhibitory activity can be evaluated.
  • -6 inhibitors are useful as preventive and / or therapeutic agents for diseases associated with CNV and as CNV inhibitors.
  • the subject to which the preventive and / or therapeutic agent for a disease involving CNV of the present invention and the CNV inhibitor are administered is a mammal.
  • the mammal is preferably a human.
  • the preventive and / or therapeutic agent for CNV-related diseases and the CNV inhibitor of the present invention can be administered in the form of pharmaceuticals, and are orally or parenterally administered systemically or locally. can do.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc. can be selected, and the administration method is selected appropriately depending on the patient's age and symptoms be able to.
  • Effective doses are selected in the range of O.Olmg to lOOmg per kg body weight.
  • a certain dose can be selected from 1 to 1000 mg, preferably 5 to 50 mg per patient.
  • an effective dosage is an amount that is free to the extent that free antibody is present in the blood.
  • Per month (4 weeks) 0.5mg to 40mg, preferably lmg to 20mg divided into 1 to several times, eg 2 times / week, 1 time Z week, 1 time Z2 week, 1 time / 4
  • Intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, etc.
  • a method of administration Dosing schedule is 2 times / week or 1 time / week to 1 time / 2 weeks, 1 time / 3 weeks, 1 time / 4 weeks while observing post-dose status and observing blood test values. It is also possible to adjust the length by increasing the interval.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as preservatives and stabilizers may be added to the preventive and Z or therapeutic agent for CNV-related diseases and the CNV inhibitor.
  • the pharmaceutical acceptable carrier may itself be a material having the above-mentioned CNV growth inhibitory effect, or may be a material that does not have the inhibitory effect and can be administered together with the above-mentioned drug.
  • a material that does not have a CNV growth inhibitory effect may be a material that has a synergistic or additive stabilizing effect when used in combination with an IL-6 inhibitor.
  • Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, Glycerin fatty acid esters such as glyceryl monomyristate and glycerin monostearate; polyglycerin fatty acid esters such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate and decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene Sonorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, poly
  • Polyoxyethylene sorbite fatty acid ester such as polyoxyethylene sorbite tetrastearate and polyoxyethylene sorbite tetraoleate
  • Polyoxyethylene glyceryl fatty acid ester such as polyoxyethylene glyceryl monostearate
  • Polyethylene such as polyethylene glycol distearate Glycol fatty acid esters
  • polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene lauryl ether
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl etherol such as pill ether, polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether
  • Polyoxyethylene alkyl phenyl ether such as polyoxyethylene nonyl phenol ether
  • Polyoxyethylene castor oil Polyoxyethylene Polyoxyethylene Polyoxyethylene hydrogenated castor oil such as hydrogenated castor oil (polyoxyethylene hydrogen castor oil); polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene
  • Examples of the surfactant also include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; Polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl sulfate having an average addition mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms; such as ester sodium lauryl sulfosuccinate Alkyl sulfosuccinic acid ester salts having an alkyl group having 8 to 18 carbon atoms; natural surfactants such as lecithin, glyceguchi phospholipids; fingophospholipids such as sphingomyelin; carbon atoms i 2 to 18 Typical examples include sucrose fatty acid esters of these fatty acids.
  • surfactants can be added to the agent of the present invention.
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycols such as poloxamers (such as Pull Knick F-68 (registered trademark)).
  • the amount of added force of the surfactant varies depending on the type of surfactant used.
  • 20 or polysorbate 80 it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL, and more preferably 0.005 to 2 mg / mL.
  • the buffering agent includes phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, darconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid.
  • organic acids such as formic acid, triethanolamine, fumaric acid, etc., or carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like can be mentioned.
  • a solution preparation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution preparations.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the drug of the present invention contains other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin and gelatin immunoglobulin, sugars such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols. It ’s okay.
  • amino acids include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and the like, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochloride, phosphate salt, that is, phosphate. Amino acid).
  • the preferred pH value is determined by appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • the use of phosphate is particularly advantageous in that a stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as gnoretamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine
  • neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine
  • aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol, and the like.
  • the drug of the present invention when used as an aqueous solution for injection, it contains, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sonolebitonore, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride). Can be mixed with an isotonic solution.
  • the aqueous solution is used in combination with a suitable solubilizing agent (for example, alcoholic (eg ethanol), polyalkanol (propylene glycol, PEG etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50) etc.). Also good.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and the like.
  • examples include salts, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbyl palmitate,
  • examples of chelating agents such as L-ascorbic acid stearate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate. I can do it.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid], etc.
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, Nanoparticles and nanoforces can also be used (see Remington's Pharmaceutical Science 1 edition, ⁇ slo Ed., 1980, etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547_556; EP 133,988).
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is selected appropriately or in combination according to the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for treating a disease associated with choroidal neovascularization in a subject, comprising a step of administering an IL-6 inhibitor to a subject who has developed a disease associated with CNV.
  • the "subject” refers to an organism to which a preventive and / or therapeutic agent for a disease involving CNV of the present invention and a CNV inhibitor are administered, and a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the “part of the living organism” is not particularly limited, but preferred is the choroid or a peripheral portion of the choroid.
  • administering includes oral or parenteral administration.
  • Oral administration can include administration in the form of oral agents, and as oral agents, the dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions is selected. That power S.
  • Parenteral administration can include administration in the form of injections.
  • injections include intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Can do.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to an area where treatment is desired.
  • administration can be by local injection during surgery, use of a catheter, or targeted gene delivery of DNA encoding the peptides of the invention.
  • Known treatments for diseases involving CNV for example, laser photocoagulation, submacular surgery, foveal translocation, photodynamic therapy, drug therapy, etc. may be administered at the same time or at intervals. .
  • C57BL / 6 mice were treated with laser photocoagulation to induce CNV.
  • Laser Three days after the photocoagulation treatment the protein level and mRNA level of IL-6 in the choroid were examined by ELISA and RT-PCR, respectively. As a result, it became clear that the levels of IL-6 protein and mRNA level in the choroid of CNV mice were significantly higher than those of normal age-adapted control mice (P 0.05).
  • rat anti-mouse IL-6 receptor monoclonal antibody MR16-1 was intraperitoneally administered at 10 zg / g body weight (BW) or 100 ⁇ g / g BW immediately after photocoagulation.
  • BW body weight
  • an extension specimen in which the choroid was lectin-stained was prepared, and the CNV volume was evaluated by calculating the total area of CNV per 1 ⁇ m using a confocal microscope (Figs. 1 and 2).
  • the volume of CNV was determined by treatment with MR16-1 (mice treated with a concentration of 10 ⁇ g / g BW: 400427 + 95917 ⁇ Mice treated with a concentration of 100 ⁇ g / g BW: 290256 + 74982 ⁇ m 3 ) markedly dose-dependently compared to mice treated with vehicle alone (496216 + 81286 ⁇ m 3 ) (Figs. 1 and 2).
  • the therapeutic agent of the present invention is intended to suppress inflammation associated with CNV, and may be used in an inflammatory stage before angiogenesis is advanced by VEGF. It is thought that the neuroretinal function decline due to bleeding from abnormal neovascular vessels and leakage of plasma components without neurological damage remaining irreversibly as in the treatment after entering the stage.
  • Anti-VEGF Abutamas treatment currently approved in several world-class countries (US, Canada, Brazinore, etc.) and under clinical trials in Japan has a regression effect on angiogenesis, resulting in milder visual loss than the control group However, it has not improved vision. This means that irreversible degeneration is left when the neural network is damaged by bleeding or edema, suggesting the limitations of anti-angiogenic therapy once angiogenesis has progressed. Yes.
  • Photodynamic therapy the only treatment approved by the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan for CNV of age-related macular degeneration, is a treatment that locally enhances the coagulation system in new blood vessels and blocks the new blood vessels through thrombus formation. However, the vision prognosis of this treatment is not as satisfactory as anti-VEGF Abutaman.
  • the therapeutic agent of the present invention is a treatment aiming at a better visual prognosis, and it is expected to be a great gospel for an age-related macular degeneration patient who cannot expect a sufficient improvement in visual acuity with the existing treatment.

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Abstract

　本発明者らは、脈絡膜血管新生が黄斑部網膜下における炎症により促進されることに着目し、VEGFなどの血管新生因子による血管新生の開始または進行を抑制する薬剤の開発を行った。具体的には、レーザー光凝固処置をしたマウスに、抗IL-6受容体モノクローナル抗体を投与することにより、脈絡膜血管新生の発達が阻害されることを明らかにした。

Description

明 細 書
脈絡膜血管新生を伴う疾患の治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する脈絡膜血管新生を伴う疾患の予 防及び/又は治療剤、およびその利用に関する。また、 IL-6阻害剤を有効成分とし て含有する脈絡膜血管新生阻害剤、およびその利用に関する。
背景技術
[0002] 加齢黄斑変性は、網膜の黄斑部に異常が生じる疾患であり、欧米では失明原因の 首座を占めており、 日本国でも近年の急激な高齢者人口の増加に伴レ、、増加の一 途をたどっている。黄斑は網膜の中心に位置し、視細胞のうち錐体細胞の密度の高 い部位である。外部からの光線は角膜 ·水晶体のレンズにより屈折し黄斑のとくに中 心窩に集中するようできており、文字を解読する視力は同部位の機能に依存する。 加齢黄斑変性では、このように重要な部位である黄斑が加齢により変性するため、お もに変視 (歪視） ·中心暗点という形で視力低下をきたす。
[0003] 加齢黄斑変性のうち、滲出型は急速で重篤な視力低下をきたす予後不良の疾患 であり、その中心的病態は脈絡膜血管新生（choroidal neovascularization:以下 CNV と標記することもある）である。 CNVとは、脈絡膜の血管が B ch膜'網膜色素上皮を 貫通して異所性に増殖することをいう。滲出型の加齢黄斑変性では、この未熟な血 管網からの出血や脂肪を含んだ血漿成分の漏出が神経網膜の機能を急速に低下さ せる直接の原因となっている。 CNVは、黄斑部網膜下に蓄積したドルーゼンを貪食 するために浸潤したマクロファージを中心とした炎症細胞によって惹起されると考えら れている。マクロファージなどの炎症細胞は血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factonVEGF)などの血管新生因子の産生源でもあり、炎症部位における血 管新生を促進するように機能し、この過程は炎症性血管新生とよばれる。また、ドル 一ゼンには VEGF産生を亢進する物質である糖化最終産物（advanced glycation end -products:AGE)やアミロイド が含まれており、ドルーゼンを囲い込みに遊走してき た網膜色素上皮細胞がそれらによって刺激され VEGFを分泌することも CNVの発生 機序のひとつと考えられている。
[0004] CNVを伴う疾患としては、加齢黄斑変性症の他にも、近視性脈絡膜血管新生、特 発性脈絡膜血管新生が挙げられる。また、網膜色素線条、外傷、ぶどう膜炎等に起 因して、 CNVを伴う疾患が発症することもある。これらの疾患における CNVの発症機 序も加齢黄斑変性における CNVと同様、黄斑部網膜下の Bmch膜'網膜色素上皮を 中心とした組織傷害とそれに続発する炎症の関与が示唆されている。
[0005] 最近の研究では炎症に伴って産生される VEGFが CNVに関与することが証明され ており、抗 VEGFァプタマ一などの VEGF拮抗剤により CNVを伴う疾患の治療が行な われており、一定の成果を上げている。し力 ながら、 VEGF拮抗剤は血管新生が発 生する進行期に投与されるが、いったん進行期に入ってからの治療では神経障害が 不可逆的に残ってしまうという問題点がある。
[0006] IL-6は B細胞刺激因子 2(BSF2)あるいはインターフェロン j3 2とも呼称されたサイト力 インである。 IL-6は、 Bリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（ 非特許文献 1)、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイト力インであ ることが明らかになった（非特許文献 2)。 IL-6は、 Tリンパ球系細胞の成熟化を誘導 することが報告されてレ、る（非特許文献 3)。
[0007] IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、 I L-6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白質の IL-6受容体である (非特許 文献 4、 5)。 IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に 、主にその細胞外領域からなる可溶性 IL-6受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kDの膜蛋白質 gpl30である。 IL-6と IL-6受容体は IL-6/IL-6受容体複合体を形成し、次いで gpl30 と結合することにより、 IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献 6)。
[0008] IL-6阻害剤は、 IL-6の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。これまでに、 IL -6に対する抗体 (抗 IL-6抗体）、 IL-6受容体に対する抗体 (抗 IL-6受容体抗体）、 gpl 30に対する抗体 (抗 gpl30抗体）、 IL-6改変体、 IL-6又は IL-6受容体部分ペプチド等 が知られている。
[0009] 抗 IL-6受容体抗体に関しては、レ、くつかの報告がある（非特許文献 7、 8、特許文 献:！〜 3)。その一つであるマウス抗体 PM-1 (非特許文献 9)の相捕性決定領域（CDR ； complementarity determining region )をヒト抗体へ移植することにより得られたヒトイ匕 PM-1抗体が知られている（特許文献 4)。
[0010] 近年、加齢黄斑変性症の患者では炎症性サイト力インである IL-6が亢進していると レ、う報告がある（非特許文献 10)。し力 ながら、 CNVを伴う疾患における IL-6の役割 は明らかになっていなかった。
[0011] なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
特許文献 1：国際特許出願公開番号 WO 95-09873
特許文献 2 :フランス特許出願公開番号 FR 2694767
特許文献 3 :米国特許番号 US 5216128
特許文献 4 :国際特許出願公開番号 WO 92-19759
非特許文献 l : Hirano， T. et al.， Nature (1986) 324, 73-76
非特許文献 2 : Akira， S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
非特許文献 3 : Lotz, M. et al. , J. Exp. Med. (1988) 167， 1253-1258
非特許文献 4 : Taga， T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
非特許文献 5 : Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
非特許文献 6 : Taga， T. et al. , Cell (1989) 58, 573-581
非特許文献 7 : Novick， D. et al. , Hybridoma (1991) 10, 137-146
非特許文献 8 : Huang, Y. W. et al" Hybridoma (1993) 12， 621-630
非特許文献 9 : Hirata, Y. et al" J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
非特許文献 10 : Seddon JM, Arch Ophthalmol. 2005 Jun; 123(6):774-82
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 IL-6阻害剤を 有効成分として含有する脈絡膜血管新生を伴う疾患の予防及び/又は治療剤を提 供することにある。また、本発明は IL-6阻害剤を有効成分として含有する脈絡膜血管 新生阻害剤の提供を課題とする。
さらに本発明は、 IL-6阻害剤を、脈絡膜血管新生を伴う疾患を発症した対象に投 与する工程を含む、脈絡膜血管新生を伴う疾患を治療する方法の提供も課題とする 課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、 CNVが黄斑部網膜下における炎症 により促進されることに着目し、 VEGFなどの血管新生因子による血管新生の開始ま たは進行を抑制する薬剤の開発を行った。具体的には、レーザー光凝固処置により CNVを誘導したマウスに、抗 IL-6受容体モノクローナル抗体を投与することにより、 C NVの発達が阻害されることを見出した。
即ち、本発明者らは、 IL-6阻害剤を投与することにより、 CNVの発達を抑制すること が可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
[0014] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔36〕を提供するものである。
〔l〕IL-6阻害剤を有効成分として含有する、脈絡膜血管新生を伴う疾患の予防及び /又は治療剤。
〔2〕IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の予防及び /又は治療剤。
〔3〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の予 防及び/又は治療剤。
〔4〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の予防及 び/又は治療剤。
〔5〕抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔2〕 または〔3〕に記載の予防及び Z又は治療剤。
〔6〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の予防及び/ 又は治療剤。
〔7〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔6〕に記載の 予防及び/又は治療剤。
〔8〕脈絡膜血管新生を伴う疾患が、加齢黄斑変性症、近視性脈絡膜血管新生、特 発性脈絡膜血管新生であることを特徴とする〔1〕〜〔7〕のレ、ずれかに記載の予防及 び/又は治療剤。 〔9〕 IL-6阻害剤を有効成分として含有する、脈絡膜血管新生阻害剤。
〔10〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕に記載の脈絡膜 血管新生阻害剤。
〔11〕IL_6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕に記載の 脈絡膜血管新生阻害剤。
〔12〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔10〕または〔11〕に記載の脈 絡膜血管新生阻害剤。
〔13〕抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔10 〕または〔11〕に記載の脈絡膜血管新生阻害剤。
〔14〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔10〕または〔11〕に記載の脈絡膜 血管新生阻害剤。
〔15〕抗体がキメラ抗体、ヒトイ匕抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔14〕に記 載の脈絡膜血管新生阻害剤。
〔16〕IL_6阻害剤を、脈絡膜血管新生を伴う疾患を発症した対象に投与する工程を 含む、対象において脈絡膜血管新生を伴う疾患を治療する方法。
〔17〕IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔16〕に記載の方法。 〔18〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔16〕に記載 の方法。
〔19〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔17〕または〔18〕に記載の方 法。
〔20〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔17 〕または〔18〕に記載の方法。
〔21〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔17〕または〔18〕に記載の方法。 〔22〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔21〕に記 載の方法。
〔23〕脈絡膜血管新生を伴う疾患の予防及び/又は治療剤を製造するための、 IL-6 阻害剤の使用。
〔24〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔23〕に記載の使用。 〔25〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔23〕に記載 の使用。
〔26〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔24〕または〔25〕に記載の使 用。
[27]抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔24 〕または〔25〕に記載の使用。
〔28〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔24〕または〔25〕に記載の使用。 〔29〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔28〕に記 載の使用。
〔30〕脈絡膜血管新生阻害剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
〔31〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔30〕に記載の使用。 〔32〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔30〕に記載 の使用。
〔33〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔31〕または〔32〕に記載の使 用。
〔34〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔31 〕または〔32〕に記載の使用。
〔35〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔31〕または〔32〕に記載の使用。 〔36〕抗体がキメラ抗体、ヒトイ匕抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔35〕に記 載の使用。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]脈絡膜を lectin染色した伸展標本を confocal microscopeで撮影し、 CNV断面を 示した写真である。
[図 2]IL-6受容体抗体投与後の、 CNVの体積を容積測定により評価した結果を示す グラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明者らは、抗 IL-6受容体抗体を投与することにより、 CNVの発達を抑制するこ とが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 [0017] 本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する、脈絡膜血管新生を伴う疾患の 予防及び/又は治療剤、および脈絡膜血管新生阻害剤に関する。
[0018] 本発明において「IL-6阻害剤」とは、 IL-6によるシグナル伝達を遮断し、 IL-6の生物 学的活性を阻害する物質である。 IL-6阻害剤は、好ましくは IL-6、 IL-6受容体及び g pl30のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
本発明の IL-6阻害剤としては、例えば抗 IL-6抗体、抗 IL-6受容体抗体、抗 gpl30抗 体、 IL-6改変体、可溶性 IL-6受容体改変体あるいは IL-6又は IL-6受容体の部分べ プチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定され るものではない。本発明の IL-6阻害剤としては、好ましくは IL-6受容体を認識する抗 体を挙げることが出来る。
[0019] 本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動 物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
本発明で使用される抗 IL-6抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノク ローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6抗体として、特に哺 乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましレ、。哺乳動物由来のモノクローナル抗体 としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は I L-6と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害して IL-6の生物学的活 性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 MH166(Matsuda, T. et al.， Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956)や SK2抗体（Sato, K. et al.， 第 21回 日本免疫学会総会、学術記録 (1991)21 ， 166)等が挙げられる。
[0020] 抗 IL-6抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにし て作製できる。すなわち、 IL-6を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に したがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と 融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリー ユングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得 の感作抗原として使用されるヒ HL-6は、 Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550、 J. Im munol.(1988)140, 1534-1541、あるいは Agr. Biol. Chem.(1990)54, 2685-2688に開 示された IL-6遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。
IL-6の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 IL-6蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 IL-6蛋白質 と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
[0021] 本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又 はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6受容体抗 体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノ クローナル抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手 法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがあ る。この抗体は IL-6受容体と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1993) 90， 11924-11928)、 PM- 1抗体 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906)、 AUK12-20抗体、 AUK64-7抗体あるいは AUK146-15抗体（国際特許出 願公開番号 WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒ HL-6受容体に対す る好ましレ、モノクローナル抗体としては PM-1抗体が例示され、またマウス IL-6受容体 に対する好ましいモノクローナル抗体としては MR16-1抗体が挙げられる。
[0022] 抗 IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を 使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、 IL-6受容体を感作抗原として使用し て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナ ルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗 体取得の感作抗原として使用されるヒ HL-6受容体は、欧州特許出願公開番号 EP 3 25474に、マウス IL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平 3-155795に開示され た IL-6受容体遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。
[0023] IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現してレ、るものと細胞膜より離脱してレ、るもの
(可溶性 IL-6受容体) (Yasukawa, K. et al" J. Biochem. (1990) 108, 673-676)との二 種類がある。可溶性 IL-6受容体は細胞膜に結合している IL-6受容体の実質的に細 胞外領域力 構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領 域が欠損している点で膜結合型 IL-6受容体と異なっている。 IL-6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、 いずれの IL-6受容体を使用してもよい。
IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を 形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6受容体蛋白 質を公知の方法で精製し、この精製 IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよ レ、。また、 IL-6受容体を発現している細胞や IL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融 合蛋白質を感作抗原として用いてもょレ、。
[0024] 本発明で使用される抗 gpl30抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノ クローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 gpl30抗体として、特 に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましレ、。哺乳動物由来のモノクローナル 抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗 体は gpl30と結合することにより、 IL-6/IL-6受容体複合体の gpl30への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 AM64抗体（特開平3-219894)、4B11抗体ぉょび2H4抗体（ US 5571513) B-S12抗体および B-P8抗体（特開平 8-291199)などが挙げられる。
[0025] 抗 gpl30モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し 、以下のようにして作製できる。すなわち、 gpl30を感作抗原として使用して、これを通 常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって 公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生 細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよレ、。例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される gpl30は、欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。
gpl30の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の gpl30蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 gpl30蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 gpl30を発 現している細胞や gpl30蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用い てもよい。
[0026] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではなレ、が、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげっ 歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一 般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行 われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline )や生理食塩水等 で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント 完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与するのが 好ましレ、。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳 動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい 免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0027] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、 すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Imm unol. (1979) 123, 1548—1550)、 P3X63Ag8U. l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81， 1-7)、 NS—l (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(19 76) 6, 511-519 )、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8， 405-415 )、 SP2/ 0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276, 269-270)、 F〇（de St. Groth, S. F. et al, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 )、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313- 323)、 R210 (Galfre, G. et al, Nature (1979) 277, 131-133 )等が適宜使 用される。 [0028] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミ ノレシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3 -46)等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス（HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジ メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
[0029] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫 細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば 、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、こ の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0030] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、予め、 37°C程度に加温した PEG溶液、例えば、平均分子量 1000〜6000程度の PEG溶液を通常、 30〜60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする 融合細胞（ハイプリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細 胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液（ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。当該 H AT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅 するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を 実施し、 目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニン グが行われる。
[0031] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作 Bリンパ球をヒトミエ ローマ細胞、例えば U266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性 を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 59878参照）。さらに、ヒト抗体遺 伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与 し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 WO 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602、 WO 94/25585、 WO 96/34096、 WO 96/ 33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常の 培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが 可能である。
[0032] 当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを 通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドー マをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法など が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方 法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗 IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平 3-139293に開示 された方法により行うことができる。 PM-1抗体産生ハイブリドーマを BALBんマウスの 腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、本ハイプリ ドーマを適当な培地、例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5%BM-Condimed HI (Boehringe r Mannheim製）含有 RPMI1640培地、ハイプリドーマ SFM培地（GIBCO-BRL製）、 PF ΗΜ-Π培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清から PM_1抗体を精製する 方法で行うことができる。
[0033] 本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイプリドーマからクロー二 ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Borrebaeck C. A. K. an d Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the U nited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイプリドーマから、抗体の 可変（V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば 、グァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法（Chomczynski, P. et al, Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全 R NAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直 接調製すること力 Sできる。
[0034] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの 合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行 うことができる。また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5し Ampli FINDER RACE Ki t (Clontech製）および PCRを用いた 5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA(1988)85, 8998- 9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989)1 7， 2919-2932)を使用することができる。得られた PCR産物から目的とする DNA断片を 精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌 等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、例えば、デォキシ法により確認する。
目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領 域 (C領域）をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体 の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んで あよい。
[0035] 本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領 域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに 組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる こと力 Sできる。
[0036] 本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改 変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒトイ匕（Humanized)抗 体、ヒト (h醒 an)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造 すること力 Sできる。
[0037] キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域 をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 W 〇 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ること ができる。
[0038] ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の 哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体の相補性決定領域 へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出 願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework reg ion)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有す るように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られた DNA をヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これ を宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位 を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適 切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のァミノ 酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
[0039] キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体 C領域が使用される。ヒト抗体 C領域としては、 C γが挙げられ、例えば、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3又は C γ 4を使用することができる。また 、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。 キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域から なり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由 来のフレームワーク領域および C領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低 下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
[0040] 本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化 PM-1抗体が挙げ られる（国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用 いて、パンユングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可 変領域を一本鎖抗体（scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発 現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝 子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定 すること力 Sできる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を 含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は 既に周知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791 , WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0041] 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺 乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNAあるいはそれを含むベクタ 一により発現させることができる。例えばプロモーター/ェンハンサ一としては、ヒトサ イトメカロウイノレス目 U期フロモ■ ~タ' ~ /ェンノヽンサ" ~ (human cytomegalovirus lmmedia te early promoter/ enhancer;を挙^ること力できる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェンハン サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (S V40)等のウィルスプロモーター/ェンハンサーゃヒトェロンゲーシヨンファクター 1 α ( HEF1 α )などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェンハンサーを用いればよい。 例えば、 SV40プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mulliganらの方法（Mu lligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 108-114)、また、 HEF1 αプロモーター/ェ ンハンサーを使用する場合、 Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322 )に従えば容易に実施することができる。
[0042] 大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列 、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロ モーターとしては、 lacZプロモーター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプ 口モーターを使用する場合、 Wardらの方法（Ward, E. S. et al , Nature (1989) 341 , 5 44-546 ; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 )、 araBプロモーターを使 用する場合、 Betterらの方法（Better, Μ· et al. Science (1988) 240, 1041-1043 )に 従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合 、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用す ればよい。ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォ 一ルド（refold)して使用する（例えば、 WO96/30394を参照）。
[0043] 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイ ノレス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー 数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフ ヱラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝 子等を含むことができる。
[0044] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。
抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生 系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる
[0045] 真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系が ある。動物細胞としては、（1)哺乳類細胞、例えば、 CHO、 COS,ミエローマ、 BHK(bab y hamster kidney), HeLa、 Veroなど、（2)両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵 母細胞、あるいは (3)昆虫細胞、例えば、 sf9、 sf21、 Tn5などが知られている。植物細 胞としては、ニコチアナ 'タバクム (Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、こ れをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Sacch aromyces)属、例えばサッカロミセス'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌 、例えばァスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばァスペルギルス'二ガー（Aspergill us niger)などが知られている。
[0046] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された 細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う 。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができ、牛 胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した 細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivoにて抗体を産生してもよい。 [0047] 一方、 in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系 が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。 哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシなどを用いることができる (Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology A卯 lications, 1993)。また、昆虫としては、カイ コを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。 これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産 生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をャギ カゼインのような乳汁中に固有に産 生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に揷入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が揷入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚 を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジェニックャギ又はそ の子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックャギから産生される 所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジヱニックャ ギに使用してもよい。 （Ebert, K.M. et al.， Bio/Technology (1994) 12， 699-702 )。 また、カイコを用レ、る場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコ に感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al.， Nature (1985) 315, 592-594)。さらに、タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用べク ター、例えば pMON530に挿入し、このベクターを Agrobacterium tumefaciensのような バクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば Nicotiana tabacumに感染させ 、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994 )24, 131-138)。
[0048] 上述のように in vitro又は in vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H 鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同 時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現 ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 W〇 94-11523参照）。
[0049] 本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片や その修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、 Fab, F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv)が挙げられる。 具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに 導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M.S. et al., J. Immunol. (19 94) 152, 2968—2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 17 8， 476-496、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497 - 515、 Lamoyi, E.， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al ·， Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9， 132-137参照）。
[0050] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結することにより得られる。この scFvにお いて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリンカ一、好ましくは、ペプチドリンカ一を介して連結 される（Huston, J. S. et al.、 Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883)。 s cFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれ の由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、例えばアミノ酸 1 2-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
[0051] scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領域をコードする DNA、およ び L鎖又は、 L鎖 V領域をコードする DNAを铸型とし、それらの配列のうちの所望のァ ミノ酸配列をコードする DNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNAおよびその両 端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。
また、一旦 scFvをコードする DNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター 、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、その宿主を用いて常法に従って、 scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により 産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
[0052] 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を 使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。こ のような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得 ること力 Sできる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
[0053] 前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製 すること力 Sできる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィ二ティークロマトグ ラフィ一により行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとして は、例えば、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。プロテイン Aカラム に用いる担体として、例えば、 HyperD, POROS、 S印 haroseF.F.等が挙げられる。そ の他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限 定されるものではない。
例えば、上記ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター 、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体 を分離、精製すること力 Sできる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトダラ フィ一は HPLし (High performance liquid chromatography)に適用しネ守る。まに、 申目 HPLC (reverse phase HPLC)を用いてもよレ、。
[0054] 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA等により行うことができ る。すなわち、吸光度の測定による場合には、 PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの 吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.350Dとして算出する。また、 ELISAによる場合は以下の ように測定することができる。すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6)で 1 /i g/mlに希 釈したャギ抗ヒト IgG(TAG製） 100 μ 1を 96穴プレート（Nunc製）にカロえ、 4°Cでー晚イン キュベーシヨンし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使 用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒ HgG (CAPPEL製) 100 μ 1を添カ卩し、室温にて 1時間インキュベーションする。
[0055] 洗浄後、 5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト IgG (BIO SOURCE製） ΙΟΟ μ Ιをカ卩え、室温にて 1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュ ベーシヨンの後、 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて 405nm での吸光度を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
[0056] 本発明で使用される IL-6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有し、且つ IL-6の 生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、 IL-6改変体は IL-6受容体に対 UL-6 と競合的に結合するが、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナ ル伝達を遮断する。
[0057] IL-6改変体は、 IL-6のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入 して作製される。 IL-6改変体のもととなる IL-6はその由来を問わなレ、が、抗原性等を 考慮すれば、好ましくはヒ HL-6である。
具体的には、 IL-6のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、 W HATIF (Vriend et al.， J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 )を用いてその二次構造を 予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行わ れる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒ HL-6遺伝子をコードする塩基配列を 含むベクターを铸型として、通常行われる PCR法によりアミノ酸が置換されるように変 異を導入することにより、 IL-6改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応 じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方 法に準じて IL-6改変体を得ることができる。
IL-6改変体の具体例としては、 Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93 、及び Savino et al" EMBO J. (1994) 13, 1357-1367、 WO 96-18648、 W096-1786 9に開示されている。
[0058] 本発明で使用される IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、各々 IL-6 受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、且つ IL-6の生物学的活性を伝達しなレ、物 質である。即ち、 IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは IL-6受容体又は I L-6に結合し、これらを捕捉することにより IL-6の IL-6受容体への結合を特異的に阻 害する。その結果、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達 を遮断する。
[0059] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸 配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常 10〜80、好ましくは 20〜5 0、より好ましくは 20〜40個のアミノ酸残基からなる。
[0060] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において、 IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した 領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子 工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
[0061] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製す るには、所望のペプチドをコードする DNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組 換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
[0062] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製する には、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相 合成法を用いることができる。
具体的には、続医薬品の開発第 14卷ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店 1991 年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶 性である支持体に合成しょうとするペプチドの C末端に対応するアミノ酸を結合させ、 ひ-アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸を C末端から N末端 方向の順番に 1アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はぺプチ ドの α -ァミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド 鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種 類により Boc法と Fmoc法に大別される。
[0063] このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支 持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、 Boc法ではフッ化水素又 はトリフルォロメタンスルホン酸を、又 Fmoc法では TFAを通常用いることができる。 Boc 法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をァニソール存在下で処理す る。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結 乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、 Fmoc法では、例えば TFA中で上 記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことが できる。
[0064] 得られた粗ペプチドは、 HPLCに適用することにより分離、精製することができる。そ の溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-ァセトニトリル系溶媒を使用して 最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当 する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分につ いて、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解 析等により同定する。
IL-6部分ペプチド及び IL-6受容体部分ペプチドの具体例は、特開平 2-188600、特 開平 7-324097、特開平 8-311098及び米国特許公報 US5210075に開示されている。
[0065] 本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等 の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよレ、。このようなコンジュゲート抗体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修 飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれ らのコンジュゲート抗体も包含される。
[0066] 本発明の CNVを伴う疾患の予防及び/又は治療剤、および CNV阻害剤は、 CNV を伴う疾患の予防及び/又は治療において使用することが可能である。
本発明において、 CNVとは脈絡膜の血管がブルッフ（B ch)膜 ·網膜色素上皮を 貫通して異所性に増殖することを示す。 CNVは、加齢黄斑変性では加齢による酸化 ストレスによって網膜色素上皮の近傍に蓄積されたドルーゼンを貪食するために浸 潤したマクロファージを中心とした炎症細胞によって惹起されると考えられている。慢 性の弱い炎症反応が持続していく中で、炎症細胞により VEGF等の血管新生因子が 生産され、その結果として炎症性血管新生が起こる。 CNVにおいて増殖した未熟な 血管網からの出血や脂肪を含んだ血漿成分の漏出は、神経網膜の機能を急速に低 下させ、重篤な視力障害をもたらす疾患の原因となる。
[0067] CNVを伴う疾患としては、加齢黄斑変性症、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡 膜血管新生等が代表的なものとして挙げられる。
加齢黄斑変性症とは、黄斑が加齢により変性するため、おもに変視（歪視） ·中心暗 点という形で視力低下をきたす疾患をいう。なかでも滲出型の加齢黄斑変性症は急 速で重篤な視力低下をきたす予後不良の疾患であり、その中心的病態は CNVである 。検眼的には網膜色素上皮剥離、漿液性網膜剥離、網膜下出血、硬性白斑などの 滲出性変化を示す。
[0068] 近視性脈絡膜血管新生は、病的近視を有する人の視力低下原因として最も多い 疾患であり、黄斑部に新たに血管が形成されると、視野の中心に暗点をきたす線維 性色素性瘢痕をしばしば引き起こす。 日本人に多い強度近視の本態は目の前後の 長さ（眼軸）が異常に延長することであり，それに伴って眼底後極部に、 CNV等の様 々な近視特有の眼底病変を生じ，視力障害の原因となる。
また、特発性脈絡膜血管新生とは、若年女性の片眼に発症することが多ぐ近視、 ぶどう膜炎、外傷、膠原病、感染などを否定できる場合に診断できる。網膜下に小型 の新生血管組織と出血、浮腫などの滲出性変化を認める。抗炎症ステロイドに反応 して数ケ月で改善することがあることからも炎症の関与が示唆されている。
[0069] 本発明の CNVを伴う疾患は、上記の疾患に限定されず、後眼部ぶどう膜炎、外傷 性脈絡膜破裂、網膜色素線条、ヒストプラズマ眼症等、ブルッフ（Bmch)膜'網膜色 素上皮レベルの障害とそれに続発する炎症性血管新生を引き起こす他の疾患に起 因する CNVを伴う疾患も含まれる。
[0070] 本発明において「CNVを伴う疾患の治療」とは、 CNVを伴う疾患において、上記の 疾患によって引き起こされる症状を抑制または改善することを意味する。また、進行し ている CNVの抑制、および異常な新生血管からの出血や血漿成分の漏出による神 経網膜の機能低下を抑制することも、 CNVを伴う疾患の治療を意味する。また、「CN Vを伴う疾患の予防」とは、血管新生が進行する以前の炎症段階において CNVの発 症を抑制することをいう。
[0071] 本発明において「CNVを抑制する」とは、血管新生を抑制することに加え、網膜内 における炎症反応を抑制（網膜内における炎症細胞の増殖を抑制）することや、炎症 細胞による血管新生因子の生産を抑制することも意味する。網膜内における炎症反 応は、ドルーゼン等の新陳代謝で生じる老廃物の蓄積によるものでもよいし、外傷に よるものであってもよい。
[0072] 本発明において、 CNVが抑制されたか否かの確認は、蛍光眼底造影検查等により 血管新生の大きさ（体積)を検出することにより行うことが出来る。本発明の薬剤を投 与することにより、血管新生の体積が減少している場合に、 CNVが抑制されたとみな すことが出来る。 CNVの検出はこれに限定されず公知の方法により行うことができ、 実施例に記載の方法によっても行うことができる。
また、 CNVを伴う疾患が進行するに伴い変視、中心暗点等の視力低下を呈するが 、本発明の薬剤を投与することによりこれら視力低下の改善が得られた場合には、 C NVを伴う疾患の患者に対して有用であると見なすことができる。
[0073] 本発明で使用される IL-6阻害剤の IL-6シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる 方法により評価することができる。具体的には、 IL-6依存性ヒト骨髄腫株（S6B45，KPM M2)、ヒトレンネルト Tリンパ腫細胞株 KT3、あるいは IL-6依存性細胞 MH60.BSF2を培 養し、これに IL-6を添加し、同時に IL-6阻害剤を共存させることにより IL-6依存性細 胞の 3H -チミジン取込みを測定すればよレ、。また、 IL-6受容体発現細胞である U266 を培養し、 1251標識 IL-6を添加し、同時に IL-6阻害剤を加えることにより、 IL-6受容 体発現細胞に結合した 1251標識 IL-6を測定する。上記アツセィ系において、 IL-6阻 害剤を存在させる群に加え IL-6阻害剤を含まない陰性コントロール群をおき、両者で 得られた結果を比較すれば IL-6阻害剤の IL-6阻害活性を評価することができる。
[0074] 後述の実施例に示されるように、抗 IL-6受容体抗体の投与により、 CNVの発達が抑 制されることが認められたことから、抗 IL-6受容体抗体等の IL-6阻害剤は CNVを伴う 疾患の予防及び/又は治療剤、および CNV阻害剤として有用であることが示唆され た。
本発明の CNVを伴う疾患の予防及び/又は治療剤、および CNV阻害剤が投与さ れる対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
[0075] 本発明の CNVを伴う疾患の予防及び/又は治療剤、および CNV阻害剤は、医薬 品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所 的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注 射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重 1 kgあたり O.Olmgから lOOmgの範囲で選ばれる。あるレ、は、患者あたり l〜1000mg、好ま しくは 5〜50mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば 抗 IL-6受容体抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投 与量であり、具体的な例としては、体重 lkgあたり 1ヶ月（4週間）に 0.5mgから 40mg、好 ましくは lmgから 20mgを 1回から数回に分けて、例えば 2回/週、 1回 Z週、 1回 Z2 週、 1回 /4週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの 方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後状態の観察および 血液検査値の動向を観察しながら 2回/週あるいは 1回/週から 1回 /2週、 1回 /3 週、 1回 /4週のように投与間隔を延ばしてレ、くなど調整することも可能である。
[0076] 本発明において CNVを伴う疾患の予防及び Z又は治療剤、および CNV阻害剤に は、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許 容しうる担体とは、それ自体は上記の CNVの増殖抑制効果を有する材料であっても よいし、当該抑制効果を有さない材料であってもよぐ上記の薬剤とともに投与可能 な製剤上許容される材料を意味する。また、 CNVの増殖抑制効果を有さない材料で あっても、 IL-6阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を 有する材料であってもよい。
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、 緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる
[0077] 本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート 、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステア レート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン 脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソ ノレビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェ チレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリ
ステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビット テトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシェチレ ングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエ チレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキ シエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェ チレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロ ピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキ シエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテノレ；ポリオキシエチレンノニルフエ二 ノレエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒ マシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェ チレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導 体;ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の H LB6〜： 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
[0078] また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩;ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜： 18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数 i 2〜： 18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を 典型的例として挙げることができる。
[0079] 本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添 加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベー ト 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリ ソルベート 20及び 80が特に好ましレ、。また、ポロキサマー（プル口ニック F— 68 (登録 商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好まし レ、。
[0080] 界面活性剤の添力卩量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート
20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0.001〜100mg/mLであり、好ましく は 0.003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは 0.005〜2mg/mLである。
[0081] 本発明において緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
[0082] また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよレ、。緩衝液の濃度は一般には l〜500mMであり、好ましくは 5〜100mMであり 、さらに好ましくは 10〜20mMである。
[0083] また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチ ンゃ免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖ァ ルコールを含んでレ、てもよレ、。
[0084] 本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル二チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましい アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル二チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグノレタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、バリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ヱ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することちできる。
[0085] 本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス， トレハロース、ラフイノース等を挙げること力 Sできる。
[0086] 本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシ トール等を挙げることができる。 [0087] 本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖や その他の補助薬（例えば、 D-ソノレビトーノレ、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナト リウム）を含む等張液と混合することができる。また該水溶液は適当な溶解補助剤（例 えばアルコーノレ (エタノール等)、ポリアルコーノレ (プロピレングリコール、 PEG等)、非ィ オン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO-50)等）と併用してもよい。
[0088] 所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化 防止剤等を含有してもよい。
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げること力 Sできる。
[0089] また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチルヒドロキシァニソール、 α —トコフエロール、酢酸トコフエロール 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
[0090] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ [メ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プでノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition ,〇sl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al.， J.Biomed.Mater.Res. 1981， 15: 167-277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983， 22: 547_556;EP第 133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中力 適宜あるいは組合 せて選択されるが、これらに限定されるものではない。 [0091] 本発明は、 IL-6阻害剤を、 CNVを伴う疾患を発症した対象に投与する工程を含む 、対象において脈絡膜血管新生を伴う疾患を治療する方法に関する。
[0092] 本発明において、「対象」とは、本発明の CNVを伴う疾患の予防及び/又は治療剤 、および CNV阻害剤を投与する生物体、該生物体の体内の一部分をいう。生物体は 、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含 む。
また、「生物体の体内の一部分」については特に限定されないが、好ましくは脈絡 膜または脈絡膜の周辺部位を挙げることが出来る。
[0093] 本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含 まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤 としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型 を選択すること力 Sできる。
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤とし ては、点滴などの静脈注射、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を 挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療 の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することがで きる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。 例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコード する DNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。 CNVを伴う疾患の公 知の治療法、例えば、レーザー光凝固、黄斑下手術、中心窩移動術、光線力学療法 、薬物療法等と同時に又は時間を隔てて本発明の薬剤が投与されてもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0094] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0095] 〔実施例 1〕
CNVモデルマウスを使って、 CNVの発達における IL-6受容体に関するシグナル伝 達の役割を調べた。
まず、 CNVを誘導するため、 C57BL/6マウスをレーザー光凝固で処置した。レーザ 一光凝固処置 3日後のマウスについて、脈絡膜における IL-6のタンパク質レベルおよ び mRNAレベルをそれぞれ ELISA、 RT-PCRによって調べた。その結果、 CNVマウス の脈絡膜における IL-6タンパク質のレベルおよび mRNAレベル力 正常な年齢適応 対照マウスよりも顕著に高い (Pく 0.05)ことが明らかとなった。
[0096] 次に、ラット抗マウス IL-6受容体モノクローナル抗体 MR16-1を光凝固後すぐに、 10 z g /g body weight (BW)または 100 μ g /g BWで腹腔内投与した。光凝固 1週間後、 脈絡膜を lectin染色した伸展標本を作製し、 confocal microscopeを用いて 1 μ m毎の CNVの面積和を算出することにより、 CNVの体積を評価した（図 1、 2)。
[0097] その結果、 CNVの体積は、 MR16-1での処置（10 μ g/g BWの濃度で処置したマウス ： 400427+95917 μ
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100 μ g/g BWの濃度で処置したマウス： 290256+74982 μ m3) により、賦形剤（vehicle)のみで処置したマウス（496216+81286 μ m3)と比較して用量 依存的に顕著に抑制された（図 1、 2)。
[0098] 以上の結果より、 IL-6受容体に関するシグナル伝達の阻害は、結果として CNVの 発達を抑制することが明らかとなった。これらの結果は、 AMDに関連する CNVを抑制 するための治療方針としての、 IL-6受容体阻害の可能性を示唆する。
産業上の利用可能性
[0099] 本発明の治療剤は、 CNVに伴う炎症を抑制することを目的にしており、 VEGFにより 血管新生が進行する以前の炎症段階で用いてもよぐその場合には、血管新生の進 行期に入ってからの治療のように神経障害が不可逆的に残ることなぐ異常な新生血 管からの出血や血漿成分の漏出による神経網膜の機能低下を抑制することができる と考えられる。
[0100] 現在世界数力国（アメリカ 'カナダ ·ブラジノレなど）で販売承認され日本では臨床試 験中の抗 VEGFアブタマ一治療では、血管新生の退縮効果が認められコントロール 群よりも視力低下が軽度であるものの、視力改善には至っていない。これは、神経網 膜が出血や浮腫で傷害されると不可逆的な変性を残すことを意味しており、一度血 管新生が進行してしまつてから行う抗血管新生療法の限界を示唆している。また、加 齢黄斑変性の CNVに対して日本で厚生労働省の認可を得ている唯一の治療である 光線力学療法は、新生血管において局所的に凝固系を亢進させ血栓形成により新 生血管を閉塞させる治療であるが、この治療法の視力予後も抗 VEGFアブタマ一と同 様で満足できるものではない。
このように加齢黄斑変性の臨床現場では、神経網膜に機能障害がおよぶ前の、より 早期の病態を標的にする治療法の開発が望まれている。この点で、本発明の治療剤 は、より良い視力予後をめざす治療であり、現存の治療では充分な視力改善が見込 めない加齢黄斑変性患者には大きな福音となることが期待される。

Claims

請求の範囲
[I] IL-6阻害剤を有効成分として含有する、脈絡膜血管新生を伴う疾患の予防及び/ 又は治療剤。
[2] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の予防及 び/又は治療剤。
[3] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の 予防及び/又は治療剤。
[4] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の予防及 び/又は治療剤。
[5] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 2 または 3に記載の予防及び/又は治療剤。
[6] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の予防及び/ 又は治療剤。
[7] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 6に記載 の予防及び/又は治療剤。
[8] 脈絡膜血管新生を伴う疾患が、加齢黄斑変性症、近視性脈絡膜血管新生、特発性 脈絡膜血管新生であることを特徴とする請求項:!〜 7のいずれかに記載の予防及び
/又は治療剤。
[9] IL-6阻害剤を有効成分として含有する、脈絡膜血管新生阻害剤。
[10] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9に記載の脈絡膜 血管新生阻害剤。
[II] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9に記載の 脈絡膜血管新生阻害剤。
[12] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 10または 11に記載の脈絡 膜血管新生阻害剤。
[13] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
0または 11に記載の脈絡膜血管新生阻害剤。
[14] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 10または 11に記載の脈絡膜血 管新生阻害剤。
[15] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 14に記載 の脈絡膜血管新生阻害剤。
[16] IL-6阻害剤を、脈絡膜血管新生を伴う疾患を発症した対象に投与する工程を含む、 対象において脈絡膜血管新生を伴う疾患を治療する方法。
[17] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 16に記載の方法。
[18] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 16に記載の 方法。
[19] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 17または 18に記載の方法
[20] 抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
7または 18に記載の方法。
[21] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 17または 18に記載の方法。
[22] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 21に記載 の方法。
[23] 脈絡膜血管新生を伴う疾患の予防及び/又は治療剤を製造するための、 IL-6阻害 剤の使用。
[24] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 23に記載の使用。
[25] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 23に記載の 使用。
[26] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 24または 25に記載の使用
[27] 抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 2
4または 25に記載の使用。
[28] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 24または 25に記載の使用。
[29] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 28に記載 の使用。
[30] 脈絡膜血管新生阻害剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
[31] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 30に記載の使用。
[32] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 30に記載の 使用。
[33] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 31または 32に記載の使用
[34] 抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 3
1または 32に記載の使用。
[35] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 31または 32に記載の使用。
[36] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 35に記載 の使用。
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