WO2007069758A1

WO2007069758A1 - Ｐｐａｒリガンド活性を有する組成物

Info

Publication number: WO2007069758A1
Application number: PCT/JP2006/325140
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Morinaga; Midori Natsume; Naomi Osakabe
Original assignee: Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Priority date: 2005-12-13
Filing date: 2006-12-12
Publication date: 2007-06-21
Also published as: JP2009051732A

Abstract

本発明は、ＰＰＡＲαリガンド及び／又はＰＰＡＲγリガンド活性を有するヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸、並びに／或いは、該ヒドロキシ脂肪酸及び／又はエポキシ脂肪酸を脂肪酸構成成分として含むモノ、ジ又はトリグリセリドを含有することを特徴とする、ＰＰＡＲα及び／又はＰＰＡＲγを活性化するための組成物を提供する。本発明の組成物は、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化又は冠動脈疾患の治療、予防又は改善のために使用できる。

Description

明細書

P P A R リガンド活性を有する組成物技術^野

本発明は、 P P A R ひ及び/又は P P A R y リガンド活性を有するヒドロキシ脂肪酸及び Z又はエポキシ脂肪酸を含有することを特徴とする、 P P A R c 及び又は P P A R γを活性化するための組成物に関する。この組成物は、肝臓、'骨格筋、脂肪組織における脂肪酸代謝を調節することにより、末梢組織でのィンスリン感受性に影響を与える血中遊離 + 脂肪酸やアディポサイト力インの分泌を調節することで抗肥満、インスリン抵抗性改善、血清脂質低下作用を発揮し、動脈硬化性危険因子がー個人に集積するメタボリックシンドロームの予防又は改善に役立つ。背景技術

食生活の欧米化、慢性的な運動木足といった生活習慣により、肥満とくに内臓脂肪め蓄積が問題'視されており、内臓脂肪の蓄積は耐糖能異常、高脂血症、高血圧など生活習慣病を引き起こす要因であることが明らかとなった。また近年これら 4つの病態が一個人に重積する病態であるメタボリックシンドロームを呈する患者が増加している。メタボリックシンドロームの改善には、食事療法、運動療法あるいは禁煙や飲酒量の調整など種々の生活習慣の改善'が必須であるとされ、これらを遵守するため患者の Q O Lの著しい低下は否めなかった。一方、最近の分子生物学的なアプローチにより、肝臓、骨格筋、脂肪細胞に働きかけ、インスリン抵抗性を改善し、ひいては上記に挙げたような生活習慣病全般の予防、治療効果を有する核内レセプターであるペルォキシソ一ム増殖剤応答性受容体 (Peroxisome prol i r erator s activated receptor ： P P A R) T 発見され、創薬を目的としての P P A R リガンドに関する探索研究が盛んに行われるようになった（非特許文献 1 、非特許文献 2、非特許文献 3参照）。 P P A R (Peroxisome prol i f erators activated receptor) はリガンド依存的に転写活性を調節する核内受容体の一種であり、これまでに' 3 種類のァイソフォーム（ひ、 γ 、·' δ ) の存在が知られている。 P P A R ctは肝臓や骨格筋に高発現することが知られており、高脂血症薬として知られるフィブラ一ト系の薬剤は P P A R ctのリガンドどして働き、肝臓での脂肪酸代謝を促進させて血清脂質低下作用を示すほか、動脈硬化の発症に対して抑制的に働く H D L _コレステロールの上昇作用を有することが知られている（非特許文献 4参照）。またフイブラート系の薬剤であるフエノフィブラ一トは上記の作用の他に、ラットにおいて摂餌量を変えず体重増加を抑制することが知られている（'非特許文献 5参照）。また 2型糖尿病治療薬として知られるチアゾリジンジオン誘導体は P P A R Y を活性化し、脂肪細胞の分化を促進しアディポサイトカインの分泌量を正常に近づける他、骨格筋や肝臓での脂質代謝を改善してィンスリン感受性を改善し、脂肪組織での脂肪酸の取り込みを促進する（非特許文献 4参照）。 P P A R δ はほぼ普遍的に組織に発現する'ことが知られており、. 近年脂肪組織や骨格筋の脂肪酸代謝に関与すること、 P P A R δ選択的リガンドが抗肥満、インスリン抵抗性改善作用を持つことが報告されている（非特許文献 6参照）。このように P P A R リガンドは脂肪酸代謝を調節する'ことにより、肥満、インスリン抵抗性、高脂血症に対する治療効果を発揮する。 ·

現在、臨床ではインスリン' ¾抗性改善薬としてチアゾリジンジオン誘導体が使用されているが、チアゾリジンジオン誘導体は強力なインスリン抵抗性改善作用を示す一方で、脂肪組織重量の増加による体重増加や、体液貯留による浮腫など副作用が認められることがある。これらのことより、チアゾリジンジオン誘導体に認められる体重増加などの副作用が少ない薬剤、あるいは脂肪組織への脂肪蓄積を抑制する目的で、肝臓や骨格筋での脂肪酸代謝を亢進させる P P A R ctや P P A R 5 の活性化能を P P A R γ活性化能と併せ持つ薬剤（デュアルリガンド）の開発が進められている（非特許文献 4参照）。実際に、 P P A R ひリガンド及び P P A R Y リガンド活性能を合わせ持つ薬剤（ P P A R a /γデュアノレリガンド）としての D R F 2 6 5 5ほ、 2型糖尿病モデルマウスである d. b Z d bマウスにおいて、 P P A R α リガンド及び P P A R γ リガンド活性を示し、血清脂質低下作用、インスリン抵抗性改善、体重増加抑制効果を示し、メタボリックシンド口一ムの改善効果が期待されている薬剤であ（非特許文献 7参 ¾)。

このような背景のもとに、身近な食品'成分についても注目が集まっており、これまでポップに含まれるフムロン類（特許文献 1参照）ゃハ一ブに含まれるイソプレノール類（非特許文献 8参照）など P P A R a リガンド及び P P A R γ リガンド活性を有する成分について報告がなされている。

これまでに不飽和脂肪酸であるリノール酸、ァラキドン酸、ドコサへキサェン酸、エイコサペンタエン酸なども P P A R ひ'及び γ リガンド活性を有することが知られているが（非.特許文献, 9 )、その活性化能は弱く、不飽和結合を有するため過酸化を受けやすいなど安定性に問題がある。また生体内にて酵素反応等で生成される（内因性） P P A R リガンドとして、ァラキドン酸よりシクロォキシゲナーゼによって生成される 1 ,5 d — Δ — 1 2 , 1 4 — P G J 2力 P P A R yのリガンド活性を有していること、またリポキシゲナ一ゼによって生成される 8 ( S ) —ヒドロキシエイコサテトラェン酸（ 8 — H E T E.) が P P A R ひリガンドの活性を有していること、ァラキドン酸から生成されるロイコトリェン B 4が P P A R α リガンド活性を有していることが報告されている。またリノ —ル酸の過酸化反応により生成される 9 ーヒドロキシォクタジェン酸 ( 9 — H O D E ) 、 1 3—ヒドロキシォクタジェン酸（ 1 3 — H O D E ) が P P A R γ リガンド活性を有していることが報告されている（非特許文献 1 0 )。これらリノール酸（炭素数 1 8 )、ァラキドン酸（炭素数 2 0 ) から生成される内因性の P P A R リガンドは、ヒドロキシル基、ェポキシ基を含む脂肪酸であり、不飽和結合を 2つ以上含むヒドロキシ不飽和脂肪酸及びエポキシ不飽和脂肪酸と言える。ところで、天然物においてもヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸が存在することが知れられている（非特許文献 1 1 )。その中で代表的な'.ものとして、ヒマシ油にはリシノル酸（ 1 2 —ヒドロキシー 9—ォクタデセン酸）が豊富に含まれており、水素添加によりヒマシ硬化油（ 1 2 — ヒドロキシステアリン酸）が工業的に生産され、化粧品、ワックス等に利用されている。またサルシ一ド原油にはジヒドロキシステアリン酸やエポキシステアリン酸を含有するトリグリセリドが存在することが知られている。またヒドロキシステアリン酸は不飽和結合を有さないため安定であり'、 'これまでに， 1 2—ヒドロキシステアリン酸と中鎖脂肪酸を構成成分とする，トリグリセリド（特許文献 2参照）、ジヒドロキシステアリン酸を構成成分どするトリグリセリド（特許文献 3参照）につい.て、 'ヒドロキシ脂肪酸の低吸収性を利用した低カロリー油脂、低吸収性油脂に関する報告がなされている。 '

しかし、これら天然に存在するヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸について、 P P A R ひリガンド及ぴ /又は P P A R γ リガンドとしての活性、まだそれを示唆するような脂肪糸,田胞分化に関する活性や β酸化酵素の活性化に関わる活性については.報告がされていない。またこれら天. 然に存在するヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸に関して、体脂肪蓄積や肝脂肪蓄積抑制効果、抗肥満、インスリン抵抗性改善効果及び糖尿病改善効果、脂質代謝改善による高脂血症改善効果についてはいずれも開示されていない。

非特許文献 1 船橋徹「メタボリックシンドロームの診断」医学のあゆみ V o 1 2 1 3 (6 ), 5 7 3 — 5 7 8 , ( 2 0 0 5 ),医歯薬出版（東京、日本）

非特許文献 2 坂田利家「肥満症の治療」医学のあゆみ V o 1 2 1 3 (6 )， 6 0 1 — 5 4 8 , ( 2 0 0 5 ) , 医歯薬出版（東京、日本）非特許文献 3 島野仁「 P P A Rsの機能と病態」ザ · リピッド V o 1 . 1 3 , 1 2 - 1 3 , ( 2 0 0 2 ) ,メディカルレビュー社（東京、日本） ' 非特許文献 4 田中十志也 Γ P P A R作動薬の将来」メタボリックシンドローム病態の分子生物学， 1 4 1 — 1 5 5 , ( 2 0 0 5 ) ，南山'堂 (東京、日本） ' ,

非特許文献 5 C h a p u t E . e t a 1 . B B R C , 2 7 1 , 4 4 5 - 4 5 0 , ( 2 0 0 0 )

非特許文献 6 酒井寿郎「 P P A R δ'と代謝症候群」細胞工学 V. O

, 2 3 , N O 2 , 6 5 — 1 6 8 , ( 200 4 ) ,秀潤社（東京、日本）非特許文献 7 V 1 k r a m a d l t h y a n R K . e t a 1 . b e s R e s . ， 1 1 ( 2 )■ , , 2 9 2 ― 3 0 3 , ( 2 0 0 3 )

非特許文献 8 Τ a k a h a s h i N e t a 1 . F E B S し e t e r s， 5 1 4 , 3 1 5 - 3 2 2 , ( 2 0 0 2 )

非特許文献 9 Κ r e y G . e t a 1 . M o 1 E n d o c r i n に， 1 1 ( 6 ) , 7 7 9 - 9 1 , , ( 1 9 9 7 )

非特許文献 1 0 D e 1 e r i v e P e t a 1 . ' F E B S L e n t e r s , 4 7 1 , 3 4 — 3 8 , 2 0 0 0

非特許文献 1 1 T H E L I P D H A N D B O O K 9 - 2 2 特許文献 1 日本特開 2 0 0. 4 — 2 2 4 7 9 5号公報

特許文献 2 日本特許第 3 1 1 9 8 9 5·.号

特許文献 3 '日本特開 2 0 0 1 — 1 4 9 0 1 2号公報発明の開示

本発明は肝臓、骨格筋又は脂肪組織における脂肪酸代謝を調節することにより、末梢組織でのインスリン感受性に影響を与える血中遊離脂肪酸やアディポサイトカインの分泌を調節することで抗肥満、インスリン抵抗性改善、血清脂質低下作用を発揮し、動脈硬化性危険因子が一個人に集積するメタボリックシンドロームの予防及び改善に役立つ、 P P A R α リガンド及び Ζ又は P P A R y リガンド活性を有する組成物を提供することを目的としている。発明の概要

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒ K口キシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸が,優れた P P A R _α リガンド及び/又は P P A R γ リガンド活性を有することを見出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

( 1 ) P P A R α リガンド及び又は P'P A R γ リガンド活性を有する 1種以上のヒドロキシ脂肪酸及び/又は 1 種以上のエポキシ脂肪酸を含有することを特徴とする、 P P A R ひ及び又は P P A R γ を活性化するための組成物。

( 2 )前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が飽和脂肪酸である、 ( 1 ) 記載の組成物„

( 3 ) 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、ヒドロキシカプリノレ酸、ヒドロキシカプリン酸、ヒドロキシラウリン酸、. ヒドロキシミ .リスチン酸、ヒドロキシパルミチン酸、ジヒドロキシパルミチン酸、エポキシパルミチン酸くヒ 'ドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、エポキシステアリン酸、. ヒ.ドロキシべヘン酸及びジヒド口キシベヘン酸からなる群かち選択される、（ 2 ) 記載の組成物。

( 4 ) 前記ヒドロ'キシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、 2—ヒドロキシカプリン酸、 1 2 — ヒドロキシラウリ.ン酸、 2 — ヒドロキシミリスチン酸、 2 — ヒドロキシパルミ'チン酸、 2— ヒドロキシステアリン酸、 1 0— ヒドロキシステアリン酸、 1 2— ヒドロキシステアリン酸、エリス口一 9， 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸、スレオー 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸、シス一 9 , 1 0 —エポキシステアリン酸及びトランス一 9 , 1 0 —エポキシステアリン酸からなる群から選択される、（ 3 ) 記載の組成物。

( 5 ) 前記ヒドロキシ飽和脂肪酸及び/又はエポキシ飽和脂肪酸が、 1 0 ーヒドロキシステアリン酸、シス一 9， 1 0—エポキシステアリン酸及びスレオー 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸からなる群から選択される ' 1種又は 2種以上である、（,3 ) 記載の組成物。

( 6 )前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が不飽和脂肪酸である、 ( 1 ) 記載の組成物。 '

(マ）前記不飽和脂肪酸が 1つの不飽和結合を有するものである、（ 6 ) 記載の組成物。

( 8 ) 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、ヒドロキデセン酸、ヒドロキシォクタデセン酸、ジヒドロキシォクタデセン酸及びエポキシォクタデセン酸からなる群から選択される、（ 6 )記載の組成物。

( 9 ) 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、ヒドロキシォレイン酸、ジヒドロキシォレイン酸及びエポキシォレイン酸からからなる群から選択される、（ 6 ) 記載の組成物。

( 1 0 ) 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、 1 2， 1 3 —エポキシォレイン酸、 9 , 1 0 —エポキシ一 1 2—^クタデセン酸、 1 2— ヒドロキシ一 9—ォクタデセン酸及び 1 2 , 1 3 —ジヒドロキシォレイン酸からなる群から選択される、（ 9 ) 記載の組成物。

' ( 1 1 ) ( 1 ) '〜（ 1 0 ) のいずれかに,記載のヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸を、脂肪酸構成成分として少なくとも 1 つ含むモノグリセリド、ジグリセリド、卜リグリセリド、 .又はそれらの混合物を含有することを特徴どする、 P P A R α及び又は P P A R y を活性化するための組成物。

( 1 2 ) インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化又は冠動脈疾患を治療し、予防し又は改善するための、（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の組成物。

( 1 3 ) 飲食品である、（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の組成物。

( 1 4 ) 医薬品である、（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の組成物。

( 1 5 ) 皮膚外用剤である、（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の組成物。 ( 1 6 ) 飲食品又は医薬品に添加するためのものである、（ 1 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の組成物。

( 1 7 ) 飲食品が健康食品である（ 1 3 ) 又は（ 1 6 ) に記載の組成物。本発明の P P A R ひリガンド及び又は P P A R Y リガンド活性を有するヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸を含有することを特徴とする、 P P A R ά .及び Z又は Ρ Ρ A R y を活性化するための組成物は、骨格筋、.脂肪組織における脂肪酸代謝を調節することにより、末梢組織でのインスリン感受性に影響を与える血中遊離脂肪酸やアディポサイト力インの分泌を調節することができる。 ' . まこ、本発明の組成物は、抗肥満、インスリン抵抗性改善及びノ又は血清脂質低下作用を発揮し、動脈硬化性危険因子が一個人に集積するメタボリックシンドロームを予防し又は改善するための作用効果を有しており、医薬品又は飲食品（例えば健康食品として利用することが可能である。

本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005- 359 1 1 3 号の明細書及びノ又は図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1 は、 '実施例 3における各種の脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸及びェポキシ脂肪酸の P P A R a ガンド活性を表すグラフである

図 2は、実施例 3における各種の脂肪酸、 - ヒドロキシ脂肪酸及びェポキシ脂肪酸の P P A R ガンド活性を表すグラフである

図 3は、実施例 3における各種の脂肪.酸、ヒドロキシ脂肪酸及びェポキシ脂肪酸の P P A R y J ^] ガンド活性を表すグラフである

図 4は、実施例 3における各種の脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸及びェポキシ脂肪酸の P P A R y V ガンド活性を表すグラフである

図 5は、実施例 6における 3 — ヒドロキシー 3 —メチルグノレタリノレー

C o A ( H G - C o A ) 合成酵素の遺伝子発現誘導を表すグラフである。縦軸はコント P一ル（ C ) での発現量を 1 としたときの相対値を示す。略記については以下の通りである： H S A ; 1 0 —ヒロキシステアリン酸、 D H S A スレォ一 9 ， 1 0 —ジヒドロキシステァリン酸、

E O D A ；シス一 9 J 1 0 一エポキシステアリン酸、 o i e ；ォレイン酸、 S t e ; ステアリン酸、 W y ; Wy l 4 , 6 4 3。

図 6は、実施例 6における P P A R αアンタゴニストによる HMG-GoA 合成酵素の遺伝子発現誘導の抑制を表すグラフである。縦軸はコ.ントロ

—ル（ C) での発現量を 1 としたときの相対値を示す。略記については以下の通りである： W y ; Wy 1 4 , 6 4 3、 H S A ; 1 0—ヒドロキシステアリン酸、 D H S A ；スレオー 9 , ' 1 0 —ジヒドロキシステア, リン酸、 E O D A ; シス一 9， 1 0—エポキシステアリン酸。

図 7の写真は、実施例 7における P P A R γ リガンドとしての脂肪細胞分化誘導を表す顕微鏡観察図である。略記については以下の通りである： S t e ；ステアリン酸、 O l e ；ォレイン酸、 H S A .; 1 ひ一ヒド口'キシステアリン酸、 D H S A ; スレオ一 9 , 1 0—ジヒドロキシステアリン酸、 E O D A ; シス一 9 , 1 0—エポキシステアリン酸、 T r o ； T r o g l i t a z o n e _Q 発明を実施するための最良の形態 '

本発明は、ある種のヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸が P P A R ひ又は P P A R γ リガンド活性のレ、.ずれか、或いは、その両方を有する. とレ、う知見に基づく。このような活性のために、該脂肪酸は P P A R ct 及び/又は P P A R γ を'活性化することができる。 ' 本発明の組成物は、上記ヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸をそれぞれ単独で力、、或いは、各 1種'以上の任意の組合せで含むことができる。或いは、本発明の組成物は、上記ヒドロキシ脂肪酸及び又はェポキシ脂肪酸の少なくとも 1つを脂肪酸構成成分とするモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド又はそれらの混合物の形態で含むことができる。これらのグリセリドは、生体内で加水分解されてヒドロキシ脂肪酸又はエポキシ脂肪酸に変換され、上記のリガンド活性を発現することができる。この場合、ダリセリドは、所謂プロドラッグとして機能する。本明細書中で使用される「 P P A R ひ及び/又は P P A R γ を活性化する」という用語は、ヒドロキシ脂肪酸又はエポキシ脂肪酸がリガンドとして P P A R ひ及び/又は P P A R y に作用することによつて、該受容体を活性化することを意味する。

本発明との関連で、 P P A Rひ及び/又は P P A R γの活性化を通して、以下のものに限定されるものではないが、肝臓での脂肪酸代謝の促進、 HD L—コレステロールの上昇作用、脂肪細胞の分化促進.によるアディポサイトカインの分泌量の正常化、体重増加の抑制、骨格筋や肝臓での脂質代謝の改善、インスリン感受性の改善、脂肪組織での脂肪酸の取り込みの促進などが起こる（非特許文献 4、 5及び 6 )。このような生物学的作用のために、本発明の組成物は、 P P A R ひ及び/又は P P A R γ に関連する疾患又は症状、例えばインスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化、冠動脈疾患等、を治療し、予防し又は改善するために有用である。

本明細書中で使用される「治療する」という用語は、患者が P P A R ひ及び/又は P P A R y に関連する疾患又は痺状に罹患している間になされ、該疾患若しくは症状の悪化を低减するか又は該疾患若しぐは症状の進行を遅滞若しくは遅延させるこど意図する。

本明細書中で使用される「予防」という用語は、患者が P P A R ひび/又は P P A R γ に関連する疾患又は症状に罹患し始める前になされ、該疾患又は症状の悪化を抑制又は低减することを意図する。，本明細書中で使用される「改善」とい.う用語は、 P P A R a及び/又は P P A R γ に関連する疾患又は症状に罹患している力、又は疾患に罹患するリスクのある患者の状態を改善することを意味する。

本発明における有効成分としてのヒドロキシ脂肪酸とは、少なくとも 1 つの水酸基を含む飽和又は不飽和脂肪酸を指し、一方、エポキシ脂肪酸は、少なくとも 1つのエポキシ基を含む飽和又は不飽和脂肪酸を指す。水酸基の好ましい数は、 1 〜 3個、より好ましくは 1 〜 2個である。エポキシ基の好ましい数は、 1 〜 2個、より好ましくは 1個である。不飽和結合の好ましい数は、 1 〜 3個、より好ましくは 1 〜 2個、さらに好ましくは 1個である。すなわち、本発明のヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸は、脂肪酸部に不飽和結合を含まないヒドロキシ飽和脂肪酸、エポキシ飽和脂肪酸、不飽和結合を含むヒド口キシ不飽,和脂肪酸、不飽和結合を含むエポキシ不飽和脂肪酸に分けられる。また、本発明によれば、ヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の炭素数は 8 〜 2 2が好ましく、ヒド.口キシル基又はエポキシ基を少なくとも 1 つ含み、その位置は限定されない。 ' 本発明の好適なヒドロキシ飽和脂肪酸'又はエポキシ飽和脂肪酸は、 P P A R a及び又は P P A R y リガンド活性を有するものであり、これに限定される'ものではないが、例えばヒド口キシカプリル酸、ヒドロキシカプリン酸、ヒドロキシラウリン酸、ヒドロキシミリスチン酸、ヒド '口キシパルミチン酸、ジヒドロキシパルミチン酸、ェポキシパルミチシ酸、ヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、エポキシステアリン酸、ヒドロキシべヘン酸及びジヒドロキシベ'ヘン酸を含む。

さらに具体的には、本発明の好適なヒド口キシ飽和脂肪酸又はェポキシ飽和脂肪酸は、例えば 2 —ヒドロキシカプリル酸、 8 —ヒドロ'キシカプリル酸、 2 — ヒドロキシカプリン酸、 1 0 — ヒドロキシカプリン酸、 1 2 — ヒドロキシラウリン酸、 2 — ヒドロキシミリスチン酸、 6 — ヒド口キシミリスチン酸、 '2 — ヒドロキシパルミ,.チン酸、 3 — ヒドロキシノヽ。ルミチン酸、 1 ひ一ヒドロキシパルミチン酸、 9 , 1 0 —エポキシパルミチン酸、 9 , 1 0 — ジヒドロキシパル.ミチン酸、 2 — ヒドロキシステアリン酸、 1 0 — ヒドロキシステアリン酸、 ' 1 2 — ヒドロキシステアリン酸、スレオ一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸、エリス口一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸、シス一 9 , 1 0 — エポキシステアリン酸、トランス一 9 , 1 0—エポキシステアリン酸、及び 1 1 ， 1 2 —ジヒドロキシべヘン酸を含む。

さらに好適なヒドロキシ飽和脂肪酸及びエポキシ飽和脂肪酸が、 1 0 ーヒドロキシステアリン酸、シス一 9 , 1 0—エポキシステアリン酸及びスレオ一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸からなる群から選択される 1種又は 2種以上である。本発明ではきらに、上記のとおり、匕ドロキシ不飽和脂肪酸及び/又はエポキシ不飽和脂肪酸を有効成分とすることができる。そのようなポ飽和脂肪酸の例は、不飽和結合を 1つ含む脂肪酸であり、例えばヒド口キシデセ酸、ヒドロキシォクタデセン酸、ジヒドロキシォクタデセン酸、エポキシォクタデセン酸、ヒドロキシォレイン酸、ジヒドロキシォレイン酸、エポキシォレイン酸などを挙げることができる。，. さらに具体的には、ヒドロキシ不飽和'脂肪酸及びエポキシ不飽和脂肪酸は、.， P P A R α及びノ又は P P A R γ リガンド活性を有するものであり、これに限定されるものではない力；、例えば 1 0— ヒドロキシ一 2 — デセン酸、 1 2 , 1 3—エポキシォレイン酸、 9， 1 0—エポキシ一 1 2 ーォクタデセン酸、 1 2 —ヒドロキシー 9—ォクタデセン酸及び 1. 2 , 1 3 —ジヒドロキシォ 'レイン酸を贪む。

本発明の上記ヒドロキシ脂肪酸又はエポキシ脂肪酸の P P A R α又は Ρ Ρ A R γ リガンド活性は、レポ一タージーンアツセィ（ L e h m a n n . J M e t a 1 . , J o u r n a l B i o l o g i c a l C h e m i s t r y , 2 7 0 ( 2 2 ) , 1 2 9 5 3 - 1 2 9 5 6 , ( 1 9 9 5 )) を用いて測定した際に、従来から P P A R α又は P P A R γ リ. ガンド活性を有することが知られているリ一ル酸と比べて、より高いリガンド活性の誘導が認められる（図 1 〜図 4 )。

'下記に一般式（ I ) 〜（V I ) で表ざれる一部のヒドロキン脂肪酸、エポキシ脂肪酸の構造式を示す。

- 13 - トランス一 9 , 1 0 —エポキシステアリン酸

本発明の P P A Rひリガンド及び /又は P P A R γ リガンドであるヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸は、その薬学的に許容される塩とすることができる'。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、力リゥム塩、カルシゥム塩のようなアル力リ金属およびアル力リ土類金属塩、あるいは酸付加塩などが挙げられる。

また、本発明の P P A R ct リガンド及び又は P P A R γ リガンドであるヒドロキシ脂肪酸、ェポキシ脂肪酸は溶媒和物とすることができる。このような溶媒和物としては、水和物、アルコール和物およびアセトン和物などが挙げられる。

本発明の P P A R α 'リガンド及び又は P P A R γ リガンドであるヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸は、脂肪酸の形態のみならず、公知のエステル交換反応などグリセリドを合成する手及び油脂の分別操作により、これらの脂肪酸を脂肪:酸構成成分として少なくとも 1 つ含むノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドの形態で利用することができる。これまでにェポギシステアリン酸についてヒ卜での消化吸収が報告されており（W i l s o n R . e t a 1 , E u r o p e a n j o u r n a 1 o f c l i n i c a l i n v e s t i g a t i o n , 3 2 , 7 9 - 8 3 , ( 2 0 0 2 ) )、ヒドロキシ脂肪酸又はエポキシ脂肪酸を含有するグリセリドは、消化吸収された後、遊離脂肪酸を生じることで本発明の P P A R a リガンド及び/又は P P A R y リガンド活性を発揮する。

本発明の P P A R ct リガンド及びノ又は P P A R γ リガンドである、ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸、及びそれらを脂肪酸構成成分として含有するグリセリドを製造する方法としては、微生物によるォレイン酸からの製造、アルコールやアセトン、へキサンなどの有機溶媒にで.油脂を分別する溶媒分別、溶媒を甩いない乾式分別、水蒸気蒸留、分子蒸留が挙げられる。或いは、グリセロールと脂肪酸とのエステル化反応、グリセリドと脂肪酸との間のエステル交換反応などの慣用の化学手法を用いることによって、目的のグリセリドを製造することができる。これ 'らの製造方法により、遊離脂肪酸としでのヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸、あるいはヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸を含有する各種グリセリドとして得ることができる。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体とともに含んでなる医薬品として提供することができる。この医薬品.は、具体的には、メタボリックシンドロームの予防剤又は改善剤、メタボリックシンドロームから起こりえる生活習慣病、例えばインスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化又は冠動脈疾患などの予防剤、. 改善剤又は治療剤として適用される。

医薬品どして用いる場合には、前記ヒドロ.キシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸は、経口又は非経口（例えば、静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与など）のいずれかの投与経路で、ヒト又はヒ卜以外の動物に投与することができる：。また、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。. 具体的には主として静注、筋注などの注射剤、カブセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、' 丸剤、細粒剤、' トローチ錠などの経口剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水性坐剤などの各種製剤形態に調製することができる。

これらの各種製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、及び安定化剤などを用いて常法により製造することができる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット及び結晶セルロースなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クェン酸カルシゥム、デキストリン、炭酸マグネシウム及び合成ケィ酸マグネシウムな'どが、結合剤としては、例えばメチルセルロース又はその塩、ェチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース及びポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレンダリコール及び硬化植物油などが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、グェン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソ一ダ及びリン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。

本発明の組成物は、飲食品又は医薬品に添加して前記のような疾患の治療、予防又は改善のための飲食品又は医薬品として提供できる。：飲食品の形態としては特に制限はなく、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシングなどに用いられる油脂全般、栄養ドリンク、紅茶、緑茶などの飲料、錠菓、ゼリー状などの菓子の他、麵、ノン、米飯などの穀類加ェ品、ソーセージ、ハム、かまぼごなどの練り製品、バター、ョ一グルトなどの乳製品、ふりかけ、調味料などが挙げられる。

飲食品の好ましい例は、健康食品である。，上記の賦形剤や添加剤と、上記定義のヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪 '酸又はダリセリドとを組み合わせて、ドリンク、タブレット、顆粒、粉末、ゲルなどの任意の形態とすることができる。容器には、メタボ.リックシンドローム、それに起因する生活習慣病などの疾患、例えばィンスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化、冠動脈疾患などの予防又は改善に有効である旨のラベルを貼付することができる。

本発明の組成物は、皮膚外用剤に添加して前記のような疾患の、治療予防又は改善のための皮膚外用剤として提供できる。本明細書において、「皮膚外用剤」とは、外皮（頭皮を含む）に適用する外用剤を意味するものであり、例えば、外皮に適用される化粧料、医薬品、医薬部外品等を含む。また、その剤型も、水溶液系、可溶化系、乳化系、ゲル系、ェァゾール系など、任意の剤型を含む。例えば本願発明の皮膚外用剤はクリーム製剤とすることができる。、

本発明の医薬品における有効成分としての投与量又は摂取量は、受容者、受容者の年齢及,び体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組みわせなどに依存して决定できる。例えば、肥満、高脂血症、動脈硬化、慢性心疾患などを治療、予防又は改善するために、本発明の組成物を医薬として経口投与する場合、その用量は通常成人 1 日 1.人当り 0. 5〜：！ O O m gZk g体重（好ましくは :！〜 5 0 m gZk g体重）であり、非経口的に投与する'場合は 0. 0 5〜 5 0 m g Z k g体重（好ましくは 0. 5〜 5 0 m g k g体重）であり、これを 1 日 1 回又は数回に分けて投与することができる。

また飲食品として摂取する場合に、飲食品中の有効成分としての.含有量は通常 0. 0 0 0 1 〜： I 0 0重量％、好ましく'は 1 〜 9 5重量％、程度であり、有効成分として成人 1 日 1 人当たり 3 0 m'g〜 3 0 g間の範囲（好ましぐは 3 0 0111 _§ 〜 2 8. 5 g ) の ^取量となるように摂取すればよい。

また本発明の医薬品あるいは飲食品のいずれにおいても、有効成分としてのヒドロキシ脂肪酸又はエポキシ脂肪酸の組成は、' 単一でもよいし、又は 2種以上の混合物でもよいし、或いは.これらヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸の少なぐとも 1 を脂肪酸構成成分とするグリセリドの形態でもよい。 . 実施例

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

実施例 1

医薬品の配合例

(例 1 ) 錠組成物

以下に示す配合比率にて、各物質をよく混合し、この混合物を打錠して一錠 3 0 O m gの錠組成物を得た：ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有卜リグリセリド 250. Omg トウモロコシデンプン 14. 5mg 結晶セノレ口一ス ·， 25. Omg カノレボキシメチノレセノレロース 10. 5mg

(例 2 )カプセル組成物

以下に示す配合比率にて、各物質をよぐ混合したものをカプセルに充填してカプセル組成物を得た：

ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド 1 50. Omg 乳糖 70. Omg トウモロコシデンプン 38. Omg ステアリン酸マグネシウム 2. Omg .

(例 3 ) 散剤

以下に示す配合比率にてまずヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有卜リグリセリドと乳糖をよく混合した後、ヒドロキシプロピルセル口― スを加えて造粒する。これを乾燥後に整粒し、軟質無水ケィ酸を加えてさらによぐ混合して、散剤を得た：

ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド 200mg 乳糖 791 . Omg ヒドロキシプロピノレセノレ口一ス： 4. Omg 軟質無水ケィ酸 5. Omg

(例 4 ) 注射剤

以下に示す配合比率にて、まずヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリドをポリオキシエチレン硬化ヒマシ油によく混合した後、無水エタノールを適量加えて全量 l m L として注射剤を得た。この溶液を生理食塩水で希釈することにより投与が可能となる：

ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド 200. Omg ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 200. Omg 無水エタノール適量

実施例 2 飲食品の配合例

(例 1 ) 食用調合油脂

以下の配合比率にて、攪拌機を用いて溶解を行い、食用調合油脂を製造した：

ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド 10.0g 大豆油 ' 90. Gg

(例 2 ) マーガリン

以下の材料を混合し、 'コンビネータ一を用い急冷混捏処理してマーガリンを得た： '

菜種油 37.0g ビドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有卜リグリセリド 2.0g 菜種硬化油 42.0g 水 17.0g 食 4m. 0.5g レシチン 0.5g モノグリセリド ' 0.4g 香料適量カロチン微量

(例 3 )■ ドレツシング

以下の配合比率にて、まず大豆サラダ油、ヒドロキシ脂肪酸、ェポキシ脂肪酸含有トリグリセリドを除く原料を攪拌機付の加温可能な容器に投入し、プロペラ攪拌機を用いて攪拌しながら品温が 90°Cまで加熱し、品温を 90°Cに保持しながら 25分間攪拌した。その後品温が 20°Cになるまで冷却して大豆サラダ油、ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリドと合わせてドレツシングを得た：

水 46.6g キサンタンガム 0. lg 果糖ぶどう糖液 5.0g 食塩 5. Og M S G 0.3g 米酢 10. Og こしょう ' . 適量ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド 10. Og 大豆サラダ油 22. Og

(例 4 ) マヨネーズ '

以下の配合比率でまず大豆サラダ油、 'ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド、加塩卵黄を除く原材料を混合攪拌しながら 9 0 °Cまで加熱し、 9 0 °Cに保持しながら ' 2 5分間攪拌を行った。 2 0 °C まで冷却した後、大豆サラダ油、ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸含有トリグリセリド、加塩卵黄を合わせて減圧下で攪拌し、マヨネーズを得た：

大豆サラダ油 ' 45. Og ヒドロキシ脂肪酸、ェポキシ脂肪酸トリグリセリド ■ 30.0g 水， 8.4g 砂糖〗 1.0g グルタミン酸ナトリウム 0.3g 粉末マスタ一ド 0.3g 食塩 ' 1.0g 米酢 4.0g 加塩卵黄 10.0g 実施例 3 ヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の、 P P A R ひ及び P P A R V リガンド活性測定

レポータージーンアツセィを用いて P P A R α リガンド活性及び Ρ Ρ A R γ リガンド活性を測定した。ヒト P P A R a及び P P A R yのリガンド結合部位配列と酵母の転写因子である G A L - 4 の D N A結合タンパクのキメラ分子を発現するレポータープラスミドを作製し（ p B I N D— P P AR ひ、 p B I N D— P P A R y )、これらと G A L— 4の D N A結合配列の下流にホタルルシフヱラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミド（ p G 5 — 1 u c )とを、アフリカミドリザル腎臓細胞（ C V— 1 細胞）に F u G e n e 6 ( R o c h e社）を用いて一過性にトランスフェクシ.ョンした。尚、 p B 'I N D— P P A Rベクタ一にはトランスフエクシヨン効率を補正するためのゥミシイタケルンフェラ一ゼが組み込まれていた。既存の P P A R リガンド、ヒドロキシ脂肪酸及びェポキシ.脂肪酸をジメチルスルフォキシドに溶解して、トランスフエクションした細胞に添加し、 2 4時間後にルシフェラーゼの発光'を測定してリガンド活性を求めた。尚、 P P A R依存的な遺伝子の転写活性（ P P A R リガンド活性）は以下のように定義した。

P P A R依存的な遺伝子の転写活性（ P P A R リガンド活性） = ( p G 5 - 1 u c によるホタルルシフェラーゼ活性） I ( p B I N D - P P A Rによるゥミシィタケルシフェラーゼ活性）

図 1及び図 2にコントロールにおける転写活性を Γとしたときのヒド口キシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の P P A R ひリガンド'活性を示す。尚ここで言うユントロールとはジメチルスルフォキシドのみを添加したものを言う。 '各ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸ともに、濃度依存的に P P A R ひリガンド活性を有しており、不飽和脂肪酸であるォレイン酸、. リノール酸より強いリガンド活性を有してお:り、また現在臨床で利用されている P P A R a リガンドであるべザフイブラートと同程度若しくはそれ以上の活性化能を有していることが.明らかとなつた。

図 3及び図 4にコント口一'ノレにおける転写活性を 1 としたときのヒド口キシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の P P A R y リガンド活性を示す。尚ここで言うコントロールとはジメチルスルフォキシドのみを添加したものを言う。各ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸ともに、濃度依存的に P P A R 7 リガンド活性を有しており、不飽和脂肪酸であるォレイン酸、リノール酸より強いリガンド活性を有していることが明らかとなった。図 1 、図 2、図 3、図 4 に示した結果より、各ヒドロキシ脂肪酸、ェポキシ脂肪酸は P P A R ひリガンド活性及び Z又は P P A R γ リガンド活性を有していることが明らかとなった。実施例 4 ヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸を含有する、組成物 A 及び組成物 Bの体脂肪率低減効果 ·

P P A R ひ及び y のリガンド摂,取にょり、脂質代謝が改善され、肝臓脂肪率、，体脂肪率、脂肪組織重量の減少が期待される。食餌性肥満誘発マウスにおいてヒド口キシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の効果を確認するために以下の実験を行った。 I C Rマウス 6週齢雄性マウスを各群 1 5 匹、 3群に分け 1 週間の予備飼育後、表 1記載の高脂肪食で 4週間飼育した。飼育中、組成物 A又は組成物 Bを、それぞれ 1 %カルボキシメチルセルロースに溶解して 1 日 1 回経口投与した。投与した組成物 A及び組成物 B中の 3種のヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸含有量を表 2 に示す。また組成物 A及び組成物 Bの P P A R α活性と γ リガンド活性とを実施例 3 と同様の方法で測定した。

表 1

表 2

単位：（μ g /マウス / d a y ) またコントロール群にはカルボキシメチルセルロースのみを投与した 4週間飼育後、ペントバルビタール麻酔を行い、体脂肪率と肝臓脂肪率とを P I X I m u s 2 ( G Eルナ一社製）で測定した。測定後、鼠径部脂肪組織及び腸間膜脂肪組織を摘出し重量を測定した。

表 3に示すように組成物 A及び組成物 Bはそれぞれ P P A R ct リガ.ンド活性及び P P A R a y リガンド,活性の両方を有していた。また表 4に示すよう,にコントロール群に比べ組成物 A投与群については体脂肪率、肝臓脂肪率及び鼠径部脂肪組織重量に有意な减少を認め、組成物 B投与群において有意な体脂肪率、鼠径部脂肪組織重量及び腸間膜脂肪組織,重量の低下を認めた。これらの結果より、 P P A R ct リガンド活性及び P P A R γ リガンド活性を有する、ヒドロキシ脂肪酸とエポキシ脂肪酸とを含む組成物'を摂取することにより、体脂肪率、肝臓脂肪率、鼠径部脂肪組織重量及び腸間膜脂肪組織重量の減少が認められ、これらの効果はビド口キシ脂肪酸、ェポキシ脂肪酸により P P A R ひ及び P P A R. γが活性化され、脂質代謝の改善がされたことによると推察された。

表 3

単位：コントロールの活性を 1. としたときの相対比

各サンプル 5 0 0 μ g _ m L添加時の活性を示す表 4

平均値土標準誤差（n = 15)

* コントロール群と比較して有意差あり。実施例 5 組成物 Aに含有されるグリセリド型ヒドロキシ脂肪酸及びグリセリド型エポキシ脂肪酸のアル力リ加水分解と P P A R リガンド活性の測定

本発明のヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸を含有するグリセリドは、消化吸収された後、遊離'脂肪酸を生じることで本発明の P P A R ct リガンド及び又は P P A R γ リ 'ガンド活性を発揮すると考えられる。グリセリド型のヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸を消化することにより'.、. 遊離脂肪酸型のヒ 'ドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸が、 P P A R リガンド活性を有しているかについて確認を行うことにした。実施例 4で用いた組成物 Aは'、遊離脂肪酸型のヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸の他に、グリセ'リド型のヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸を含有している。組成物 Aを 0 . 5 N水酸化ナトリウム Zメタノール溶液で加水分解を行い、ヒドロキシ脂肪酸、エポキシ脂肪酸をへキサン：エーテル =

1 ： 1 を用レ、て抽出し、丄 C Z M Sにて定量を行った。 P P A R a リガンド活性及び P P A R γ リガンド活性は実施例 3記載の方法で測定した。表 5に示すようにアルカリ処理前の組成物 Αに比較して、アルカリ処理後において、 1 0 — ヒドロキシステアリン酸、スレオ一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸及びシス— 9 , 1 0 —エポキシステアリン酸の含有量が増加した。また表 6に示すようにアル力リ処理前の組成物 Aに比較.して、アルカリ処理後において P P A R c リガンド活性及び P P A R y リガンド活性の上昇が認められた。これらの結果より、組成物 A中に含まれるグリセリド型のヒドロキシ脂肪酸及びエポキシ脂肪酸は、消化吸収された後、遊離脂肪酸を生じることで本発明の P P A R ひリガンド活性及び Z又は P P A R' Y リガンド活性を発揮することが確認された。，表 5

単位：組成物 A中に含まれる含有量を 1 としたときの相対値（倍）表 6

単位：組成物 Αの活性値を 1 としたときの相対値（倍）

125 μ g/mL添加時の活性値実施例 6 肝細胞 H e D G 2における HMG _ C o A合成酵素の遺伝子発現誘導と P P A R a アンタゴニストによる発現誘導の抑制

ミトユンドリアでケトン体の合成を行う 3 —ヒドロキシ一 3 —メチノレグルタリノレ一 C o A (HMG - C o A) 合成酵素は P P A R ひリガンドによつて遺伝子発現が誘導されることが知られている。肝細胞 H e p G 2 を用いて 1 0—ヒドロキシステアリン酸（H S A)、スレォ '一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステア'リン酸（ D H S A ) 及びシス一 9 , 1 0 _ェポキシステアリン酸（E O D A) が HMG _ C o A合成酵素の遺伝子発現を誘導するかについて検討を行った。 1 2 ゥエルのシャーレに H e p G 2 を 2 . 5 X 1 0 ⁴個とな'るように播種し、 2 4時間培養した。その後、ジメチルスルフォキシド終濃度 0 . 1 %になるように H S A、 D H S. A又は E O D Aを添加して 4 8時間培養した。陽性対照として P P A R ひァゴニストである W y 1 4， 6 4 3 ( W y ) を添力□し、 '月旨肪酸の比較としてォレイン酸（O l e )、ステアリン酸（ S t e ) を同様に添加した。 P P A Rアンタゴニストを添加する試験においては、 P P A Rアンタゴニストである GW 6 4 7 1 をサンプル添加の： L時間前に終濃度が ⁵ ； u Mとなるように添カ卩した。 .4 8.時間後に R N e a, s y m i n i k i t (キァゲン社）を用いて、添付マニュアルに従って m R N Aを調製した。分光光度計にて R N A量の測定を ήつた後に、 F i r s t s t r a n d c D N A s y n t h e s i s k i t. ( F e 'r m e n t a s个土) を用いて 1 / gの R N Aから、添付マニュアルに従って c D N Aを調製した。得られた c D N Aを基に HMG— C o A合成酵素の発現誘導を T a q m a n プローブと反/ Ϊ キッ卜として T a q m a n u n i v e r s a 1 P C R m a s t e r m i x (アプライドバイオシステムズ社）を用いて、 A B I P R I S M 7 0 0 0 (アプライドバイオシステムズ社）を用いたリアルタイム P C Rにて定量した。尚、内部標準遺伝子として解糖系酵素であるグリセルアルデヒド 3 — リン酸デヒドロゲナ一ゼ（ G A P D H) の遺伝子発現量で補正し、コントロール（ジメチルスルフォキシドのみ添加）での発現量を 1 としたときの HMG— C o A合成酵素遺伝子発現量を示した。， .

図 5に示すように H S A、 D H S A及び E O D Aは添加濃度依存に HMG - C o A合成酵素の遺伝子発現を誘導することが明らかどなった。 O 1 e 、. S t e添加では発現誘導が認められなかったことより、発現の誘導における H S A、 D H S A、 E O D Aの水酸基、エポキシ基の関与が示唆された。また図 6 に示すように、あらかじめ P P A R αアンタ,ゴ二ストである GW 6 4 7 1 を添加することで、 H S A、 D H S A及び E O D Aによる HMG— C o A合成酵素の遺伝子発現の誘導が抑制されることが明らかとなった。' これらの結果より H S A、 D H S A及び E O D . Aは P P A R ひ .リガンドとして肝臓での脂質代謝に関与する可能性が示 '唆された。

実施例 7 3 T 3 - L 1 細胞における脂肪細胞分化誘導試験

3 T 3 — L 1 細胞は P P A R γ リガンド存在下で脂肪細胞へと分化することが知られている。 3 T 3 - L 1 細胞を用いて 1 0— ヒドロキシステアリン酸（ H S A )、スレオ一 9， 1 0—ジヒドロキシステアリン酸（ D H S A) 及びシス一 9， 1 0 —エポキ^ステアリン酸（E O D A) が脂肪細胞への分化を誘導する力こついて検討を行った。 1 0 c mシャーレにて子牛血清（ 1 0 %) を含む D M EM培地を用いて 3 T 3 _ L 1細胞を培養し、 8 0 %コンフルェントの段階で 1 2 ウエノレシャーレに 1 · 2 X 1 0 ⁵ c e 1 1 sノ w e 1 1 となるように播種して 3 日間培養した。 3 日後、子牛胎児血清（ 1 0 %) を含む DM EM培地に交換し、さらに 2 日間培養した。その後、子牛胎児血清（ 1 0 %)、インシュリン（ 5 g /m L ) 及びデキサメタソン（ 0. 2 5 W M) を含有する DM EM培地に、 H S A、 D H S A又は E O D Aを添加した分化誘導培地を用いて、 2 日ごとに培地交換を行い 1 4 日間培養した。陽性対照としては P P A R y リガンドである T r o g 1 i t a z o n e (T r o ) を添加し、月旨肪酸の比較としてォレイン酸（O l e )、ステアリン酸（ S t e ) を同様に添加した培地にて培養した。 1 4 日後に脂肪細胞への分化の度合を調べるため、オイルレッド Oにて脂肪滴を染色し、顕微鏡下で観察した。また実施例 6記載の方法にて細'胞ょり m R N Aを調製し、 c D N Aを合成した後、脂肪細胞への分化マーカーとして脂肪酸結合タンパク（ a P 2' )、リポタンパクリパゼ（ L P L ) 及びアディポネクチン（A c r p 3 0 ) の遺伝子発現量を定量した。尚、内部標準遺伝子として解糖系酵素であるグリセルァルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナ一ゼ G A P DHの遺伝子発現量で補正し、 'コントロール（ジメチルスルフォキシドのみ添加）での発現量を 1 としたときの各遺伝子発現量'を示した。

図 7 に示すように H S A、 D H S A又は E 'Ο D Aの添加により、細胞内にオイルレッド Oで赤.く染色される脂肪滴の蓄積が観察されたが、 Ό 1 e 、 S t e添加では観察されなかつた。，また,、表.7 に示すように脂肪細胞への分化マ一カーとして a P 2、 L P L及び A c r p 3 0の遺伝子発現を定量したところ、 H S A、' D H S A又は E O D Aの添加により遺伝子発現が確認された。これらの結果より、. H S A、 ' D H S A及び E O D Aは P P A R y リガンドとして脂肪細胞に作用する可能性が示唆され卞遺伝子発現定量結果

aP2 LPL Acrp30

Control 1.0±0.3 ： 1. 0±0.2 1.0±0.2

Ste (50〃 M) 2.8±0.2 1. 3±0.2 1.5±0.5

Ole (50/i M) 1.2±0.4 2. 0±0.5 2.7±0.5

Tro (10 M) 1157.4±67.4 47 .5±7.0 14.5±1.3

HSA (50 i M) 21.6±2.1 62. 0±11.8 37.7±2.4

DHSA (50 M) 27.9±2.1 19 .7±6.4 11.5±2.2

EODA (50 μ (Λ) 7.9±1.0 23 .6±6.4 10.8±2 1

Mean ± S. E. n = 3 単位： Control での遺伝子発現量を 1 としたときの相対値実施例 8 スレオ- 9 1 0 -ジヒドロキシステアリン酸による脂質代謝改善効果

スレオ- 9， 1 0 -ジヒドロキシステアリン酸（D H S A) の脂質代謝.改善効果について C 5 7 B L Z 6 J雄を用いて評価を行った。 6週齢 C 5 7 B LZ 6 J雄（日本クレア社、東京、日本）を 3群（ 8匹/群）に分け、表 8に示すようにコントロールのコーン油を D H S Aで 0. 3 %、 1 % 置き換えた試験食、水を自由摂取させて 1.週間飼育した。 1 適間後、非絶食の状態でエーテル麻酔下にて心臓より全血採血を行い、肝臓を摘出して重量を測定した後に液体窒素で凍結した。得られた血漿中の中性脂肪（T G) 量'及び遊離脂肪酸（N E F A) 量を、それぞれトリグリセライド Eテス卜ヮコ一（和光純薬工業、東京、日本）及び N E F A Cテズトヮコー（和光純薬工業）を用いて測定した。凍結保存した肝臓、約 2 0 m gからの m R N A及び c D N Aの調製を施例 6記載の方法で行つた。肝臓にて P P A R _α リガンドにより発現が誘導される遺伝子として、血中脂質の分解に関与するリボタンパクリパーゼ（ L P L )、脂肪酸の < 酸化に関与するチトクローム P 4 5 0 4 a 1 4 (C y p 4 a l 4 )、脂肪酸の 3酸化に関与するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ I ( C P T— 1 )、ァシル C o Aォキシダ一ゼ（ A c o X 1 )、エノィ ,ル C o Aヒドラターゼ / 3 — ヒドロキシルァシノレ C o' Aデヒドロゲナ一ゼ (H D) が知られている。これら遺伝子発現についてリアルタイム P C Rによる定量を行った。尚、內部標準遺伝子として解糖系酵素であるグリセルアルデヒド 3 — リン酸デヒドロゲナ一ゼ G A P D Hの遺伝子発現量で補正し、コントロール群での発現量を 1 としたときの各遺伝子発現量を示した。試験食組成（数値は重量％)

P P A R ひリガンドは中性脂肪（ T G ) 量及び遊離脂肪酸（N E F A) 量を低下させることが知られている。 .表 9に示すように血漿脂質値の測定を行った結果、コントロール群に比較して D H S A 0. 3 %群及び D H S A 1 %群において有意な T G量の低下が認められた。また D H S A 1 %群において有意な N E F A量の低下が認められた。 P P A Rひを介した血漿脂質値の低下メ力ニズムとして、肝臓への脂肪酸の取り込みと、脂肪酸代謝の亢進が知られている。そこで、これまでに P P A R ひリガンドでの発現誘導が知られている、 L P' L、 C y p 4 a l 4、 C P T _ 1 、 A c o x 1及び HDの遺伝子発現の定量を行った。表 1 0に示すように、コントロールに比較して D H S A 0. 3 %群、 D H S A 1 %群において L P L、 A c o x l 、 HDの有意な遺伝子発現の増加が確認された。また D H S A 1 %群において C y p 4 a 1 4の有意な遺伝子発現の増加が確認された。これらの結果より D H S Aは P P A R α リガンドとして肝臓に作用し、肝臓への脂肪酸の取り込みと、脂肪酸代謝の亢進により、血漿脂質の低下作用を発揮していることが示唆された。表 9 血漿脂質値

Mean ± S. E. n = 8 肝臓での遺伝子発現定量結果

Mean 土 S .E . n = 8

単位：ユントロール群での遺伝子発現量を 1. としたときの相対値産業上の利用可能性

本発明の P P A R ひリガンド活性及び/又は P P A R γ リガンド活性を有するヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸、並びに或いはこれらの脂肪酸を構成成分とするグリセリドを含有することを特徴とする、 P P A R ひ及び/又は P P A R γ を活性化するための組成物は、肝臓、骨 . 格筋、脂肪組織における脂肪酸代謝を調節することにより、末梢組織でのインスリン感受性に影響を与える血中遊離脂肪酸やアディポサイトカインの分泌を調節することで抗肥満、インスリン抵抗性改善、血清脂質低下作用を発揮し、動脈硬化性危険因子が一個人に集積するメタボリックシンドロームを治療し、予防し又は改善するための医薬品又は飲食品として利用可能である。 . 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . P P A R ct リガンド及び/又は P P A R y リガンド活性を有する 1 種以上のヒド口キシ脂肪酸及び/又は 1 種以上のエポキシ脂肪酸を含有することを特徴とする、 P P A R ひ及び又は P P A R γ を活性化するための組成物。 ' '

2 . 前,記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はェポキシ脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項 1記載の組成物。 .

3 . 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂^酸が、ヒドロキシカブリル酸、ヒドロキシカプリン酸、ヒドロキシラウリン酸、ヒドロキシミリスチン酸、ヒドロキシパルミチン酸、ジヒドロキシ'パノレミチン酸、ェポキシパルミチン酸、ヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、エポキシステアリン酸、ヒロキシべヘン酸及びジヒドロキシべヘン酸から''なる群から選択される、請項 2記載の組成物。

4 . 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキ^脂肪酸が、 2 —ヒドロキシ力プリン酸、 1 2'—ヒドロキシラウリン酸、 2 —ヒドロキシミリスチン酸、 2 — ヒドロキシパルミチン酸、 2—ヒドロキシステアリン酸、 1 0 —ヒドロキシステアリン酸、 1 2—ヒドロキシステアリン酸、エリス口 — 9 , 1 0—ジヒドロキシステアリン酸、スレオー 9 , 1 0—ジヒドロキシステアリン酸、シス一 9 , 1 0 —エポキシステアリン酸及びトランスー 9 , 1 0 _エポキシステアリン酸からなる群から選択される、請求項 3記載の組成物。

5 . 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、 1 0 —ヒドロキシステアリン酸、シス一 9 , 1 0 _エポキシステアリン酸及びスレオ一 9 , 1 0 —ジヒドロキシステアリン酸からなる群から選択される 1種又は 2 種以上である、請求項 3記載の組成物。 .

6 . 前,記ヒドロキシ脂肪酸及び/又,はエポキシ脂肪酸が不飽和脂肪酸である、請求項 1記載の組成物。

7 . 前記不飽和脂肪酸が 1 つの不飽和結合を有するものである、請求項 6記載の組成物。

8 . 前記ドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、ヒドロキシデセン酸、ヒドロキシォクタデセン酸、ジヒドロキシォクタデセン酸及びェポキシォクタデセン酸からなる群から選択される、請求項 6記載の.組成物

9 . 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、ヒドロキシォレィン酸、. ジヒドロキシォレイン酸及びエポキシォレイン酸からからなる群から選択される、請求項 8記載の組成物。

1 0 . 前記ヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸が、 1 2 , 1 3 — エポキシォレイン酸、 9， 1 0—エポキシ一 1 2 —ォクタデセン酸、 1 2 —ヒドロキシ一 9 —ォクタデセン酸及び 1 2 , 1 3 —ジヒドロキシォレイン酸からなる群から選択される、請求項 9'記載の組成物。

1 1 . 請求項 1 に記載のヒドロキシ脂肪酸及び/又はエポキシ脂肪酸を、脂肪酸構成成分として少なくとも 1 つ含むモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、又はそれらの混合物を含有することを特徴とする、

P P A R α及び又は P P A R γ を活性化するための組成物。

1 2 . インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化又は冠動脈疾患を治療し、予防し又は改善するための、請求項 1 又は請求項 1 1 に記載の組成物。

1 3 . . 飲食品である、請求項 1又は請求項 1 1 に記載の組成物。

1 4 . 医華品である、請求項 1 又は請求項 1 1 に記載の組成物。

1 5 . 皮膚外用剤である、請求項 1 又は請求項 1 1 に記載の組成物。

1 6 . 飲食品又は医薬。に添加十るためのものである、請求項 1又は請求項 1 1 に記載の組成物。

1 7 . 前記飲食品が健康食品である請求項 1 3又は請求項 1 6に記載の組成物。 ■ ■