WO2007066737A1 - 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対 - Google Patents

核酸の複製の方法及び新規人工塩基対 Download PDF

Info

Publication number
WO2007066737A1
WO2007066737A1 PCT/JP2006/324484 JP2006324484W WO2007066737A1 WO 2007066737 A1 WO2007066737 A1 WO 2007066737A1 JP 2006324484 W JP2006324484 W JP 2006324484W WO 2007066737 A1 WO2007066737 A1 WO 2007066737A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituted
group
acid
added
hydrogen
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/324484
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ichiro Hirao
Shigeyuki Yokoyama
Original Assignee
Riken
The University Of Tokyo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Riken, The University Of Tokyo filed Critical Riken
Priority to CN2006800525963A priority Critical patent/CN101365791B/zh
Priority to US12/096,517 priority patent/US8030478B2/en
Priority to KR1020087016493A priority patent/KR101404374B1/ko
Priority to AU2006323745A priority patent/AU2006323745B2/en
Priority to JP2007549184A priority patent/JP5146957B2/ja
Priority to CA002642657A priority patent/CA2642657A1/en
Priority to EP06834239A priority patent/EP1970445B1/en
Publication of WO2007066737A1 publication Critical patent/WO2007066737A1/ja
Priority to HK09101422.7A priority patent/HK1121491A1/xx

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/044—Pyrrole radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • Et al. Have developed hydrogen isotopes (soG soC) and xanthone anolines that are different from natural tans. These were applied to PC containing pieces (89), and (). However, it requires a relatively modest and / or cumbersome method. In addition to these subjects, it is not recognized by soC and the anopines, 2 anopidines, and 7-pom- erase. Therefore, these are limited.
  • soC soC
  • 2 anopidines 2 anopidines
  • 7-pom- erase 7-pom- erase. Therefore, these are limited.
  • oo et al. Synthesized a base that has a form similar to the natural group, but lacks the ability to form a bond at the base (2). These sex bases were selectively recognized by pomerase, suggesting that, in replication, the geometrical complementarity of hydrogen rather than hydrogen bonds is important. Recently, it was developed by a series of sex bases, oesbe et al.
  • 001 4 quaternary pomerase consists of 35 quaternary pigments, 4 pomerases and conventional pomerases (eg e ococc soas e pomerase) The method according to item 3 without aspect selected from the group.
  • the deoxyribooctanoic acid to be 001 4 5 has a group of:
  • the deoxyribooctanoic acid which is 001 56, has a natural group, and is described in item 4 of the non-embodiment.
  • the deoxybodic pentanoic acid that is 016 7 is
  • deoxycarbonyl pentacarboxylic acid having a group represented by: 5.
  • Deoxybodic pentanoic acid which is 00198 is the following
  • the deoxycarbonyl pentacarboxylic acid having a group represented by: 5.
  • Is hydrogen is a substituted or substituted C C achi, is a substituted
  • a nucleic acid that has a group represented by and forms a base that has a group represented by and forms a base.
  • the base of 003 1 4 is
  • Shigeo wheat which is said to have been written in the breath by Hata Ihata I3, which is made into a cedar from the groo that is composed of Le Ge.
  • Aspect 3 selected from the group consisting of
  • Is a photogroup An acid containing a quorum having a group represented by is transcribed as a type, reverse transcription replication is performed, and a quo having the above group is incorporated at a position of the quo having the group 2 above.
  • the above-mentioned manufacturing method comprising:
  • the acid containing a quorum having a group represented by is transcribed as a mold, and reverse transcription replication is performed by transferring the above-mentioned group 2 to the position of the quo having a group.
  • the above-mentioned manufacturing method comprising:
  • the antisense is a body or an apta.
  • Quadrant having a group represented by.
  • Quadrant having a group represented by.
  • the quadrant 5 which is 3 or a C 2 C achi group.
  • 006 007 a is 5 s C (P 75) OCT and
  • Ply, 55, and • 35 quad pentanoic acid were used for C.
  • the data were averaged over a set of 3 and 8 data sets.
  • the replication property is further improved.
  • the utilization of modified pentanoic acid reduces the loading rate compared to that of the non-converted one, the artificially incorporated reaction can be practically used by the selection. Well proceed.
  • the method for the hydroxyl group of the acid at the v-position of deoxyribooctanoic acid is not particularly limited, and the following method can be used.
  • 13 (5) (6) herein discloses the corresponding quads in the case of substituted ano groups.
  • 47 also discloses the laws of Adequo.
  • methiano, methiano, mecapto, o, and ano can be synthesized by a method known to those skilled in the art.
  • Cyclic pomerases consist of groups of 35, which are pigments, 4 pomerases and conventional pomerases (e.g. e ococc soas e pomerase). To be selected.
  • the group of groups in the present invention is not particularly limited, and for example, deoxybox having the following groups is used.
  • the group 0104 and the deviation of 2 also show excellent selection and efficiency in replication even when used as the deviation of the template. In addition, it shows excellent selection and efficiency for transcription.
  • the oxo-octanoic acid which is 0,06 or, may have a natural group.
  • Deokinokudo no Aden ( ), Guan (G), and ton (C) tin () are known.
  • deoxycarbonyl pentanoic acid, in which the hydroxyl group of the acid at the v-position is substituted, is effectively used as well.
  • the deoxyquinodecanoic acid of 0108 may have a group of or a natural group. of ,
  • the method for producing the nucleic acid is as described above.
  • the deoxy quinodecanoic acid of 0109 Akira can be used as in the above-mentioned production process of Akira.
  • a nucleic acid having a group represented by [0117] means that a nucleobase and a sugar group are bound by a bond. It should be noted that the acid-base is intended to include Ade, guar, ton, tin, ura, and the conductors of these groups. The type of conductor is not particularly limited, and specific examples thereof include the group represented by the above and the group represented by 2. Quo means that the amount of the quads mentioned above is not available. More preferred is one, or three. Quad or Quad, 2 Deokibo, or Gege has 2nd place 2
  • the hydroxyl group of the acid at the V-position is substituted with a group selected from the group consisting of nitrogen, ano, methano, methano, mecapto group and o. Hope that. Minutes, quads, quads, quads, or the composition found in these conductors. Quo whose minutes are is minutes of, and Deokiki quo, which is minutes, is minutes of.
  • the thia group is a substituent, or the 4- and / or 5-position is selected from the group consisting of a methyl group, an aryl group, a to group and a chi group. It may be replaced by more groups.
  • 0120 also includes a case where s is a hydrogen atom or a case where it is a hydrogen atom or an amino group.
  • s is a case where is an ano group
  • s is a case of hydrogen, and s is described separately according to the following.
  • 0121 can be either or. Of, for example, s.
  • For C for example, express s.
  • s includes s and the like.
  • s and s may be collectively referred to as s.
  • 0 22 is not fixed, but preferably,
  • 0 (124) is more preferable than 0124.
  • the group of Ming, the quad containing it, and the quo can be synthesized by the method of. Physically, for example, 3 Is 2 ano 3 to 4 quinine (compound of 1) (4) to 7 (2) 3 4 5 b 3 ii (s) quad 5 acid and 5 adon (1 or The method for synthesizing 4) is disclosed. In addition, Implementation 11 is 7 (2) 3
  • the practice discloses a method for synthesizing quad 5 acids of 4 (2 2 3 b gin (s) 4 (2) 2 3 b gin ().
  • Adonates can also be synthesized using methods similar to those physically disclosed in this specification and / or known to those skilled in the art.
  • 0131 Ochin also called, is a member of the Vitan group. It is known that biotin binds to Avidi specific, which is a protein contained in, to form a complex. Therefore, a quad having otine as a substituent specifically binds to an avidin protein. For this reason, it can bind when avid is bound, including quads that have biotin bound, so that nucleic acids can be immobilized and separated, and nucleic acids that bind to specific molecules (such as If it becomes, for example,
  • the photomolecule is capable of utilizing the photomolecule of, but preferably 5
  • the large wavelength of is, and the fluorescence large wavelength of is. Also,
  • the absorption wavelength of R is 578 and that of fluorescence is 578.
  • the large wavelength of S is 8 and the large wavelength of fluorescence is 8.
  • the large wavelength of X is, and the large wavelength of fluorescence is.
  • the large wavelength of is, and the large wavelength of fluorescence is.
  • the large wavelength of 5 X is 5 and the large wavelength of fluorescence is 5.
  • the 6 X large wavelength is, the fluorescence large wavelength is
  • a quad or a quad having a group of formula 2 having a substituted photomolecule is capable of producing a group depending on the type of fluorescent molecule.
  • the photomolecule may be directly bonded through the ano group or may be bonded through the anchor.
  • the type of anchor is not particularly limited, and those skilled in the art can use it. Although not limited to the above, preferably 1 and 11 below.
  • 0139 R is a photogroup.
  • 2 is a group, it is referred to herein as Pa or Pa depending on the context.
  • P is a group, it is referred to herein as P or P, depending on the context.
  • Pa, Pa, P, P, etc. may be collectively referred to as Pa.
  • 040 is not fixed, but preferably 2 or less
  • 6 is Pa or Pa conductor
  • 72 is P or
  • Pa can be introduced from its source, for example, picaboride, for example, dc 3 29 8 ec 8 757 4.
  • the Pa conductor can be basically synthesized by conducting from Pa.
  • a conductor that introduces a poppy in the 4th position of Pa is described in oo ed ee ⁇ 3 ⁇ 45 5 45 8 (2 3) (28).
  • p2carboaldehyde (j) p2carboaldehyde (7) was synthesized.
  • a nucleic acid having a group having a group of 0, a group having a group of 2 and a group having a group of 2 is formed.
  • more quanta means a nucleic acid molecule bound in the 5 3 direction. Including one, two, or. , R, or. Also, is reverse-transcribed as a mold. Is also included.
  • a quo having a group of formula 2 is a quo having a group of formula 2 Exist on two nuclei that form two by. Or, Quo may exist on the same book. In this case, the base may form a single structure.
  • Quo having a group of 0150 and a group having a group of 2 can be incorporated into the nucleus by replication, transcription, reverse transcription reaction, or the like. Alternatively, it may be incorporated by or by chemical synthesis, as well as a quad or quad having a natural group.
  • a base is formed in the process of transcription, or reverse transcription of nucleic acid.
  • a quo having a group of is a part of, and a quo having a group of 2 is a part of, or vice versa.
  • a quo having a group may be a part, and a quo having a group 2 may be a part.
  • the outline of the stem of 0153 is shown in Fig. C.
  • the effects on the production of the Ming stem are shown, for example, in 2b e, 3b and 82.
  • Is hydrogen is a substituted or substituted C C achi, is a substituted
  • 3 is a group selected from a substituted C 2 C3 group or a substituted or substituted C C3 group, and
  • An acid containing a quorum having a group represented by is transcribed as a type, reverse transcription replication, and a quo having the above group is incorporated at a position of the quo having the above group 2.
  • 0159 is also the following 2
  • the acid containing a quorum having a group represented by is transcribed as a type, and the reverse transcription replication is performed, and the quo having the group 2 is incorporated at a position of the quo having the group
  • 0165 is further intended to provide an acid prepared by the method described above or containing a quo having a group of formula 2.
  • Nucleic acid into which the bright quan is incorporated is used as an antisense or as a vaccine or tag.
  • Antisense is or that suppresses the appearance of a particular gene. It was named as a complement to the partial sequence of the target gene sequence (sense). It is used as a method to adjust the gene expression.
  • Antisense or embedded with Mingo Quo contains a group Create something with different complementarity to the target compared to using only natural groups. Is a component of. Apta, a nucleic acid obtained by the o-section method and having the function of binding to a certain element of a tank
  • the quasi nucleic acid (or) (eg, synthetic) of the present invention may be a part of a tank or a peptide. It is used as a light gene fragment or light source.
  • natural genes with more additions of the quanta of the present invention, or combinations of these are also included.
  • nucleic acid into which a quat having an explicit group is incorporated is incorporated.
  • Is a phenomenon in which two (ds) are decomposed and the expression of the gene is suppressed.
  • a typical example of Wataru is ds.
  • Isa () belonging to 111a sets up 2 23 s s o e fe R s with about 2 ongs on the 3rd end. s is incorporated into s white matter called SC and decomposes the sequence R. It has been shown to be a phenomenon that is conserved in a wide range of species such as, (human, mouse, etc.), nematode, plant, leopard, and so on. Nucleic acids that incorporate a quat having an explicit group can be used as s in interactions or as part of undergoing degradation.
  • a quad pentanoic acid having a group represented by is provided.
  • 0172 is the following 2
  • Is hydrogen is a substituted or substituted C C achi, is a substituted
  • a quad pentanoic acid having a group represented by is provided.
  • the R ano group includes a meth-, iso-, and benzoi-substituted ano group.
  • 0 80 is the same as
  • Example 8 was synthesized in Example 1 as a substance contained in 0181.
  • Is hydrogen is a substituted or substituted C C achi, is a substituted
  • 0186 R is the same as 2.
  • 0187 R is the same as 2.
  • 0189 a a is a system that enables singularity and copying. a represents s Pa and.
  • b a is a system that allows singularity and copying.
  • b shows the structures of 5 '(dP) and 5'adonic acid as for PC and ply length.
  • c a is a system that allows singularity and copying. c indicates the PC width, the ply length, the ken, and the stem that functions at 7.
  • 2a 2a e for stem quats and plies with s Pa. 2a is a row of plies for the entrance test.
  • 2b shows the ratio of (d P) to the group by e o.
  • 2c shows the ratio of (d P, Pa, G, C, and modified d P, s and) to the group by e o.
  • 2d 2a e for stem quats and plies with s Pa shows the result of applying 5 between eo and 5 with dPa P and a form containing dPa in the absence of ds P.
  • 2e is a type, including Pa, plus a series (ds P and P) by eo or eo "
  • 3a 3a is the width and the PC width of the piece containing s Pa. 3a shows the experiment. (5e) was prepared by ply length using synthetically synthesized (9e and 8e) containing s and Pa.
  • 3b 3a is the width and the width of the piece containing s Pa. 3b shows the first (cycling) and 5 and a post-cycling sample of the PCR product. Cycle your PC at (94C, O / 545C, O / 565C, 4) x 4 x
  • Co containing only groups is a cyclized P C at (94. C, O. 5 45. C, O. 5 72. C,).
  • 3c 3a is the width and the PC width of the piece containing s Pa. 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab. (D) and (e) with stem (d) and (e) after dsP P (cf) or non-existent of (c) and PC's pre-PC after (s) PC or after natural-only Syc PC () Kenting in ().
  • 0193c is the result of the dPa P of PC (cycl).
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, and Pa is incorporated at this position in the reaction. Therefore, only at this position, the gap between G and C disappears.
  • 3d 3a is the cage and PC width of the piece containing s Pa. 3c follows the procedure described for 3a b. The result of PC setting is shown. 3d is the result of the dPa P after the cycle PC.
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, and Pa is incorporated at this position in the reaction. Therefore, only at this position, the gap between G and C disappears.
  • 3e 3a is the width and the width of the piece containing s Pa.
  • 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab.
  • 3e is the result of the dPa P after the cycle PC.
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, and Pa is incorporated at this position in the reaction. Therefore, only this place, the gap between G and C disappears.
  • 3 3a is the width and width of the PC containing s Pa.
  • 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab.
  • 3f is the result of the dPa P quantification after PC (cycling) under the condition that s Pa does not exist in nature.
  • the P in the template, which corresponds to the fourth group, is completely replaced (the fourth group).
  • 39 3a is the width and the PC width of the piece containing s Pa.
  • 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab.
  • 3 is the result of the ken in the presence of dPa P of PC (cycl).
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, but since there is no group forming the s singularity, this drop is almost eliminated.
  • 3h 3a is the width and the PC width of the piece containing s Pa.
  • 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab.
  • Figure 3 is the result of the Kening in the presence of dPa P after the Cyclo PC.
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, but since there is no group forming the s singularity, this drop is almost eliminated. However, the base Obstacles are also observed. The size of this overlook was naturally increased by the increase in the number of PC cycles.
  • 3 3a is the width and width of the PC containing s Pa.
  • 3c shows the result of PC determination according to the procedure described for 3ab.
  • Figure 3 is the result of the Kening in the presence of dPa P after the Cyclo PC.
  • the fourth group is a group corresponding to the s position of the template, but since there is no group forming the s singularity, this drop is almost eliminated. However, uptake of the base is also observed. The size of this overlook was naturally large due to the increase in the number of PC cycles.
  • 4a 4 is at 7 mediated by s Pa.
  • 4a 4b is a skit of the experiment.
  • 4b 4 is at 7 mediated by s Pa. 4a 4b is a skit of the experiment.
  • 4c 4 is at 7 mediated by s Pa. 4c indicates a target using Pa P, Pa P or S P () or a natural P () (s Pa Pa, or C) in the absence thereof.
  • 4d 4 is at 7 mediated by s Pa.
  • 4d 4 e shows the result of 2 C analysis of quaternic acid obtained from the transcript (7 e).
  • 4e 4 is at 7 mediated by s Pa.
  • 4d 4 e shows the result of 2 C analysis of quaternic acid obtained from the transcript (7 e).
  • 5a 5 is for child 7 containing anti.
  • 5a is a natural product of Pa P (3) or s P (2) Use (4 and co 4) of P (2 or 3)
  • 5c 5 is for child 7 containing anti.
  • 5b 5c are the
  • 5d 5 is for child 7 containing anti.
  • 5d is in the large intestine stem (S Roc e)
  • 6 6 shows the strip rows for PC, Ken and test.
  • P0 is the number of plies
  • 1 is the count of hands that correspond to u products
  • o is the counsel of the end of the world. The determined values are shown in the table below.
  • 13 3 shows the results of die-tanking of two PCs using ply.
  • 15 5 shows the result of die-tanking of 4 PCs using ply.
  • 16 6 shows the result of die tokening of 5 PCs using ply.
  • 17 7 shows the result of die tokening of 6 PCs using ply.
  • Numeral 199 shows the result of die tokening of eight PCs using ply.
  • 21 2 shows the scan of anti-containing anions in the stem from the large intestine
  • 22 22 is a quad of 7 (2) 3 4 S b Shows skis for conductors. Drugs and (a) Cubis (toin) radium, 2 (tosta) on, (b) Radium, boron, Tanno, Chi (c) (d) a 2 Deoki 3 5 Tooi pentora Ku
  • 23 23 is a quad conductor of 4 pibode hydrate, 4 pi pibobode hydrate, 6 ano 9 (2 deoxy
  • 24a 24 is 7 (2) 3 4 5 b gin (s) Shows the spec of odds. 24a is the (z OSO d) spectrum of 6.
  • 24b 24 shows the spectrum of quads of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24b is a (27 z OSO d) spect (7 9) of 6.
  • 24c 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24c is a spect (OSO d) of 6.
  • 24d 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24d is O Spect (OSO d).
  • 24e 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24e is the C (75 z S d) spectrum of 6.
  • 24 24 shows the spectrum of quads of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24f is a 2 COS spectrum of 6.
  • 249 24 shows the spectrum of quads of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24 is a 2 OS spectrum of 6.
  • 24h 24 has a spectrum of 7 (2) 3 4,5 b gin (s) quads. 24 is a 6 2 SQC spectrum.
  • 24 24 indicates the spectrum of the quad of 7 (2) 3 445 b gin (s). 24 is a 2 C spectrum of 6.
  • 24 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2 3 4 5 b gin (s. 24 shows the 2 C spectrum of 6 ( ).
  • 24 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4 S b gin (5). 241 is a 2 COS spectrum.
  • 24m 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24 is the 2 OS spectrum of.
  • 24n 24 indicates the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24 is the 2 SC spectrum.
  • 24 24 shows the spectrum of quads of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24 is a 2 C spectrum.
  • 24p 24 shows the spectrum of the quad of 7 (2) 3 4,5 b gin (s). 24 is the 2 C spectrum ().
  • 25a 25 indicates the spectrum of quads of Phi Phi 2 borahdede 4 pipi 2 25a is the (3 z S d) spectrum of 7.
  • 25b 25 is Phibobodehi 4 Phi Phi 2
  • 25c 25 indicates the spectrum of the quads of Phi Phi 2 borahdede 4 Phi Phi 2 borah. 25c is a 2 COS spect of 7. 25d 25 indicates the spectrum of the quads of Phi Phi 2 Cabo Dehide 4 Phi Phi 2 Cabo Dehide. 25d is a 7 2 SQC spectrum.
  • 25e 25 indicates the R-spectrum of the quad of Phi Phi 2 bordehide 4 pi Phi 2 cmergedehi. 25e, 7 of 2
  • 259 25 shows the R-spectrum of the quads of Phi Phi 2 bordehide 4 pi Phi 2 cabohide. 25 is the (3 z S d) spectrum of 8.
  • 25h 25 is Pabo 2 Phi Phi 2 Phi Phi 2
  • 25 25 indicates the R-spectrum of the quads of Phi Phi 2 Cabo Dehydr 4 Phi Phi 2 Cabo Dehydr. 25 is a 2 COS spect of compound 8.
  • 25 25 indicates the R-spectrum of the quads of Phi Phi 2 Cabo Dehydr 4 Phi Phi 2 Cabo Dehydr. 25 is the 2 O S spectrum of compound 8.
  • 25k 25 indicates the R-spectrum of the quad of Phi Phi 2 bordehydr 4 pi Phi 2 bordehyde. 25 is a 2 SQC spectrum of 8.
  • 25 25 indicates the R-spectrum of the quads of Phi Phi 2 Cabo Dehydr 4 Phi Phi 2 Cabo Dehydr.
  • the 251 is the 2 C spectrum of compound 8.
  • 25m 25 is Phi Phi 2 Shows the spect's spect spectrum. 25 is the O-spect (OSO d) of 7.
  • 25n 25 indicates the R-spectrum of the quad of Phi 2 Cabo Dehydr 4 Puphi 2 Cabo Dehydr. 25 is the O-spect (OSO d) of 8.
  • 27 27 is the S-spectrum of deoquinic acid.
  • 28a 28a is the (27 z O) spectrum of deoquine 5 Y adonate.
  • 28b 28b is the (g z O) spectrum of deoquine 5 adonate.
  • 29a 29a is 7 (2) 3 (2 deoki j
  • 29b 29b is 7 (2) 3 (2 deoki j
  • 30b 3b shows the (27 z O) spectrum of (j) pi 2 carbode 5 (9).
  • 30c 3c is the (27 z O spectrum of 4 Puphi (j) 2 cabohide 5 (2. 31a 3 a is 7 (2) 3 (j) 3. 31
  • 31b 3 b shows the P (g z O) spectrum of (j) p 2 carbode 5 (9). 31c 3 c is 4 pp (j) pi 2
  • 33 33 indicates a skid for a quad conductor of 7 (2) 34 S b. Medicine and (a)
  • 34 34 shows the skid of a 2-topi () quad conductor. Medicine and (a) a 2 Deoki 3 5 Tooi
  • 35 35 is 4 (2) b.
  • 36 36 is (j) 4 (e.
  • 38a 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24).
  • 38a is the (3 z SO d6) spectrum of 24.
  • 38b 38 shows the spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cannodes (24.
  • 38b shows 2 13
  • 38c 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24). 38c is a 24 COS spectacle of 24.
  • 38d 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24). 38d has 24 2 OS specs.
  • 38e 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24). 38e is a 24 2 QC spectrum.
  • 38 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24). 38f is the 2 C spectrum of 24.
  • 389 38 shows the R-spectrum of (j) 4 (quad) puppies 2 cadhide (24). 38 is the 2 C-spectrum () of 24.
  • Phi 2 Kadehid 5 Tosto (28) is shown by ionic color.
  • 43a 43 indicates the spectrum of (j) 4 (Ochinaduppi) Pi 2 cadhide 5 toss (28). 43a has 28 (3 z O) spects
  • 43b 43 indicates the spectrum of (j) 4 (Ochinaduppi) pi2cadehide5host (28). 43b is a 28 2 COS spect.
  • 44a 44a shows the formation of biotinylated Pa P (o Pa P 28).
  • 44b 44b shows the transcription and analysis of R-biotin by 7 using s Pa.
  • 44c 44c is the true result of the biotin experiment of R-child with 7 using s Pa. 4 is .
  • the model obtained by the computer, 52 is the result when using the PC width type.
  • 44d 44d is a true indicator of the effect of biotin analysis.
  • the biotin-streptavidin complex was separated from the 7-quadruplicate gel, and the () of the complex was determined from time to time.
  • 44e 44e is the result of the analysis of 52 e containing o Pa or in the 59th position 32
  • 45 45 indicates a skid of a 2-topic 4-quad conductor.
  • 48 48 shows the entry scheme in (55 e), and the result, of P bound with an element, which is produced by using cement.
  • 49 49 shows the entry scheme and its consequences in the (7 e) of Pa bound to a fluorophore using a 7 R polymerase.
  • the conductor was manufactured in 8 columns (Scoa RPP 25 X4 6coecooes).
  • 7 (2) 3 4 5 b described in 22. Physically, 7 (2) 3 445 b gin (4) is 2 ano 3 to 4 gin (compound (
  • the 2022 quad pentanoic acid was synthesized according to the method disclosed in the prior art document (4345). 5 For adonic acid, the standard method (43) was modified. 9 2 marked quads. 2 4 3 2 It was turned on by Benzos 4. The quadruple conductors are
  • the dried quad (o, compound 9 or 3) was dried with. It was dissolved in gin (OOu) xanthane (34. To this was added 2 4 3 2 benzoso 4 ondioxane (O 2, .o), followed by .5 bis (tothian).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

　本発明は、核酸の複製の方法及び新規人工塩基対に関する。 　本発明の核酸の複製の方法は、複製反応においてアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、メルカプト基及びフルオロ基、からなる群から選択される基で、γ位のリン酸の水酸基が置換されている、デオキシリボヌクレオシド　５’－三リン酸を基質として用いることを特徴とする。本発明の新規人工塩基対は、７－（２－チエニル）－イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン（Ｄｓ）又はその類似体と、ピロール－２－カルバルデヒド（Ｐａ）又はその類似体とが、塩基対を形成していることを特徴とする。                                                                         

Description

の 製の 法及び新
術分野
０００1 出願は、2 5 2 9日に提出された日本国出願 2 5 356883およ び2 6 7 日に提出された日本国出願 2 6 898 6に基 先 権を主張し、その 本明細書中に取り込まれる。
０００2 、核酸の 製の 法及び新 に関する。
０００3 、 ( )およびG C の 補性により増幅し、並びに触媒お よびガンドとして機能する。し しながら、天然 タン ク質における2 の なる ア ノ 比 て、天然 の にお ては 4 の なる 基 らなる ク オ で 成されて ると 数の制限が、 および 子の 能を限定して る。 ステムは、核酸の 基の 類を増やして遺伝情報を拡張する ことができるので、この 題の 決法となる( 5)。 とし ては、ポ メラ ゼ 応により、 および に特別な ク オ 類 の 入を可能にする高 特異 補性が要求される。これが可能になれ ば、天然に存在する 基の数により制限される現在の 伝子工学が、
ステムを使用する新規 術により取り替えられ得る。
０００4 を作成する最初の みは、 e eらにより行われた(
6 7)。 らは、天然 の タ ンとは異なる水素 タ ンで 、イソ ン イソ ト ン( soG soC)およびキサント ン ア ノピ の 、 の を開発した。 これらの 、 を含有する 片のPC ( 8 9)、および ( )に適用された。し しながら、 実度は比較的 はな 、そして また は面倒な方法が必要とされる。これらの 題に加えて、 soCおよび ア ノピ の 2 ア ノピ ジン類 、 7 ポ メラ ゼにより として認識され な 。したが てこれらの の 制限されて る。 ０００5 で、 ooらは、天然 基に類似の形を有するが、塩基 にお て 合を形成する能力を欠 性塩基を合成した( 2)。これらの 性塩基は、 ポ メラ ゼにより選択的に認識されたこと ら、複製にお ては 、水素 合相互 よりむしろ の 何学的な形の相補性が重要であること が示唆された。 近、一連の 性塩基 o esbe らにより開発され、そして 大腸 来の ポ メラ ゼ1の グメントにより、これらの
中に相補 に導入された( 3 5)。し しながら、 、複製 にお て、形の相補性に従わずに、 性塩基 で非 入が生じた(
4)。さらに、転写にお て機能するこれらの の はな 。
０００6 タ ンおよび形の相補性の 念を組み合わ ることにより、 ら は、2 ア ノ 6 (2 ン(5)と2 ジン( )との (
6 7)、並びに2 ア ノ 6 (2 ン( )と との ( 8)の、 を開発した。 sおよびの6位の大きな 、天然 基との まし な ( o o a e a )を 率的に抑制し、そし て、 7 ポ メラ ゼにより、鋳型 sまたは に相補して、 および 基 の ( ク オ ド5 3 ン )が部位 中に導入された。この
、機能性の A 子を開発する手法として実用 が可能であるが( 9 2 )、複製におけるs および の 、転写における 選択 と比 てそれほど高 はな ( 6 8)
０００7 題解決のために、複製 転写( 能性 の )、ある は、複製・ ・ 訳の ( 能性タン ク質の創 )にお て、効率、選択 に優れた新規な人 工 求される。
０００8 下の 、参考 献としてその 容が本明細書中に援用される。
W 2 ０ 58
2 WO2 4 ０ 77 3
3 W 2 5 ０26 87
4 2 5 226492
Benne ・A B gs a e P Ba e sb T・ R J cz k nThe RNAWo d edsGes ea d R F Cech T R Ak s J F 63 8 Cod p gHabo abo a o Pess Cod p gHabo NewYok 999
2 He A A Romesbe g F E Be o dA C Ga dT a gme g a es aphabe C Op Chem Bo 7 727 733 2003
J 3 Mose M J P de J R E z ma c epa o a expa dedge e c oma o s s em N cecAcdsRes 3 5048 5053 2003
J 4 Be gs om D E O hogo a basepa sco e oevove Chem B o 8 20 2004
f5 Be e A smo A M he cboog Na Rev 6 533 5 43 2005
6 Pcc J A Ka ch T Mo o e E Be e A E z ma c copo a o o a ewbasepa oDNAa dRNAexe ds hege e caphabe Na e343 33 37 990
J 7 w ze C Y Mo o e E Be e A E z ma c ecog o o hebasepa be wee soc d ea d sog a os e Bochems 32 0489 0 496 993
8 smo A M e a PCRamp ca o o DNAco a g o s a d adbasepa sb va a s o eve se a sc pase omH ma mm ode ce c V s N cecAcdsRes 32 728 735 2004
9 Joh so he C B Ma sha D J Mose M J P de J R A h dbasepa o hepo me asecha eac o se g soCa d soG N cecAcdsRes 32 937 94 2004
Ahe J D Ba Ch A M Ba e sb T R e e cede e m a o o cecacdsco a g5 meh soc os ea d sog a e de ca o a d sgh opo me ase ep ca o o he o a a ceobases N cecA cdsRes 33 3 76 3 84 2005
f Mo aes J C Koo E T E ce ep ca o be wee o h do ge bo ded ceosdeshapea aogs Na c Bo 5 950 954 998 2 Koo E T Mo aes J C G cka K M Mmck g hes c ea d u c o o DNA sghs oDNAs ab a d ep ca o A gew Chem Ed 39 990 009 2000
N cSf 3 McM D e a E o s owadexpa so o hege e caphabe DNApo me ase ecog o o ahgh s abe se pa gh dophobcbase J Am Chem oc 2 585 586 999
N cSf 4 W Y e a E o s owadexpa so o hege e caphabe op m za o o ebaseh dophobc e ac o s J Am Chem oc 22 762 7632 2 000
N cSf 5 Ogawa A K e a E o s owad heexpa so o hege e caph abe oma o s o agea d ep ca o w h a a h dophobcbasepa s J Am Chem oc 22 32743287 2000
J 6 F wa a T Kmo o M g ama H H ao Yoko ama hess o 6 2 he p e ceosdede va ves ha om a a basepa s w hp d 2 o e ceosdes Boo g Med Chem e 222 2223 200 N cSf 7 H ao e a A a a basepa o copo a gam oacda aogs opo e s Na Bo ech o 20 77 82 2002
8 M s T Kmo o M Ha ada Y Yoko ama H ao A ef ce a a basepa o abase pa expa ded a sc p o s s em J Am Che m oc 24 8652 8658 2005
W M9 Kmo oM e a e spec c copo a o o apho o c oss k g compo e oRNAb T7 a sc p o meda edb a a basepa s Chem Bo 47 55 2004
J 20 Mo ama K Kmo o M M s T Yoko ama H ao e spec cbo a o o RNAmoec esb a sc p o s g a a basepa s
N cecAcdsRes 33 e 29 2005
W M2 Kawa R e a e spec c o esce abe go RNAmoec esb spec c a sc p o s g a a basepa s J Am Chem oc pess J 22 Ma a TJ Koo ET Aspec cpa e o abascdamage D NA Na e399 704 708 999
f23 Do b e Tabo o g A M Rchadso C C Ee be ge T C s a s c eo abace ophageT7DNA ep ca o compexa 22A eso o Na e39 25 258 998
24 Kee J R Mao Bama J C Beese Vs a z gDN A ep ca o aca a ca ac veBac sDNApo me asec s a Na e39 304307 998
J 25 Mo aes J C Koo E T F c o a h doge bo d gmapo h em o gooveb d g acks o sxDNApo me ases Bochems 39 2979 29 88 2000
W 26 M s T e a A a a h dophobcbasepa w hshapecom peme a bewee p oe 2 cabadeh dea d9 meh mdazo 45 bp d e J Am Chem oc 25 5298 5307 2003
? W 27 Mo aes J C Koo E T M o goove e ac o sbewee po me asea dDNA Mo eesse a o ep ca o ha Wa so C ckh doge bo ds J Am Chem oc 2 2323 2324 999
S28 H ao e a A wo a a base pa s s em owad heexpa s o o hege e ccode J Am Chem oc 26 3298 3305 2004
29 Tae E ch z P G Romesbe g F E E o s owadexpa so o hege e caphabe Rep ca o o DNAw h heebasepa s J Am Chem oc 237439 7440 200
W M30 Pe ska J e a Compa so bewee DNAme g hemod amc s a dDNApo me ase de Poc Na Acad c U A85 6252 6256 988
3 Goodma M F C egho Boom B Pe ska J Boche mca bass o DNA ep ca o de C Rev Bochem Mo Bo 28 83 26 993
J 32 Kmo o M Yoko ama H ao A a a ve o adoac v es ge ceo de se o assa o a a ss o D
? NA ep ca o de b s ga a oma edDNAse e ce Bo ech o e 26 999 005 2004
Ck33 Ohs k T e a U a a basepa o spec c a sc p o Poc Na Acad c U A98 4922 4925 200
34 M s T Kmo o M a o A Yoko ama H ao A a a h dophobcbase 4 pop p oe 2 cabadeh de asa e ce pa gpa e o 9 meh mdazo 45 bp d e Boo g Med Chem e 3 45 5 45 8 2003
f35 Cha R Th W G PCRP me edsDe e bach C W Dvekse G 37 5 Cod p gHabo abo a o Pess Cod p gHabo NewYok 995
36 Hme o H Hasegawa T Ueda T Wa a abe K hmz M Co ve so o am oac a o spec c om RNAT o RNA e v o N cec
AcdsRes 8 68 5 68 9 990
37 Bedo e e H Recog o o RNAT b os RNAs he ase Bochme 72 589 598 990
38 M de B A e a N ceo demod ca o a he phospha e ea ds o he mpoved de o HV eve se a sc pase N cecAcdsRes 33 4 865 4873 2005
39 M s T K am a A Kmo o M To T a o A H ao Yoko ama A a a h dophobcbasepa w hshapecompeme a bew ee p oe 2 cabadeh dea d9 meh mdazo 45 bp d e J Am Chem o c 25 5298 5307 2003
J 40 M s T Kmo o M a o A Yoko ama H ao A a a h dophobcbase 4 pop p oe 2 cabadeh de asa e ce pa gpa e o 9 meh mdazo 45 bp d e Boo g Med Chem e 3 45 5 45 8 2003
4 DeRoos K B aem k C A Deazap ede va ves V A e ws hess o a d3 deaza ade ea d ea edcompo d Rec e 88 263 2 74 963
J 42 Ro a d V Ko e a M homme J Co ve e p epa a o o 2 deox 35 d O p o o a D e ho pe o a os cho de he ccomm 27 3505 35 997
43 dwg J Ecks e F Rapda de ce s hess o 5 O ho phospha es 5 O phospha es a d2 3 c cophospho ohoa es s g2 ch o o 4H 32 be zodoxaphospho 4 o e J O g Chem 54 63 635 989
44 eve s J D Ness R K Fe che J H G hesesw hpa a be z a eds ga s X des o hes hess o hea ome c56 dmeh D bo a os be zmdazoe Rbazoes Compa so o heco de sa o o 23 5 O be zo D bo a os bomdea d235 O be zo D bo a os cho dew h56 dmeh be zmdazoe J O g Chem 33 806 8 0 968 W M45 Kovacs T Ovos mpes hess o 5 v a d5 eh 2 deox d e 5 phospha es Te ahedo e 29 4525 4528 988
46 T G Ga e B Jo es R A Ta se po ec o E c e O e Fask heses o Po ecedDeox ceosdes J Am Chem oc 04 3 6 3 9 982
47 mbe M He ma Wohgem h Kab ze H R Jah W Ge e M hess cha ace za o a dapp ca o o wo ceosde ph ospha ea aog es GTP NH2 a dGTP F E J Bochem 269 3270 3278 200 2
48 K o e D G K ba ov V A am kov V V Ge e a mehod o hes hess o ATPgamma de va ves FEB e 70 05 08 976
W M9 K J Mo ga a dD P Mo e N op oe Thepepa a o a d pope es o 2 a d3 op oe Te ahedo 22 57 62 966 ０００9 、以下の 27を提供することを目的とする。
００1０ の 製の 法であ て、複製 応にお てア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位 の ン酸の水酸基が置換されて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン酸を基 として、 ( まし はこれを通常の と組み合わ て) ることを特徴とする、方法 ００ 2 ア ノ基である、態様 の 載の 。
００12 3 応にお て、 キ ク ア 性を有する ポ メラ ゼを 用 る、態様 又は2に記載の 。
００13 4 ク ア 性を有するポ メラ ゼが、3 5 ク ア 性を有する、ク グメント、 4 ポ メラ ゼ び好 来の ポ メラ ゼ( えば、 e ococc s o a s 来の e ポ メラ ゼなど) らなる群 ら選択される、態様 な し3の ずれ 項に記載の 。 ００14 5 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、 の 基を 有する、態様 な し4の ずれ 項に記載の 。
００15 6 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、天然 の 基を有 する、態様 な し4の ずれ 項に記載の 。
００16 7 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、以下の
００17
Figure imgf000009_0001
００18 ここにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。 で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である、態様 な し5の ずれ 項に記載の 。
００19 8 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、以下の 2 ００2０
Figure imgf000010_0001
００21 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のc cア キ 、置換され た若し は 換のc cア 、又は置換された若し は 換のc c3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である、態様 な し5の ずれ 項に記載の 。
００22 9 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
００23 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ
、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されており、
の 基を有する、デオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
００24 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ
、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されており、
の 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
００25 2 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ
、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて るデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸の、態様 な し8の ずれ 項に記載の の 製 のための 法における、 としての 。
００26 3 下の 0027
Figure imgf000011_0001
００28 ここにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして、
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ 、
以下の 2
００29 4
Figure imgf000011_0002
００3０ ここにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換さ
3 れ 若し は 換のC Cア 、
2 3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ とが、塩基 を形成して る核酸。
００31 4 の 基が、以下の
7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ 2)7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ
3)7 ( 2 ) 3 4 5 b 3 イ 4)5 ア ノ 7 (2 ) 3 4 S b 3 ユ芸;
A5)5 アミノー7-(2-チフ ンドリル)-3H-イミダンド[4 5-b]Lゴリラ レ ー3-イル ユ芸;
A6)5 アミノー7-( H-2-イミダンドリル)-3H-イミダンド[4 5-b]Lゴリラ レ ー3 イ ユ
ル芸;
。
A7)4 (2 ラ コ 二 ノレ)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b]ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;
。
A8)4 (2 チア ユ
ンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b]ヒリジン Ⅰ イル芸;
。
A-9)4-( H-2-イミダンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b]ヒリジン Ⅰ イ ユ ル芸: 。
A-Ⅰ０)6-アミノー4-(2-ラ コ 二 ノレ)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b]ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;
A-Ⅰ )6-アミノー4-(2-チフ ンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b] 。
ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;刀乏び
A-Ⅰ2)6-アミノー4- H-2-イミダⅠグリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b] 。
ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸 からなるグルーオから 杉てされる、息崇ィ畠Ⅰ3に言已 の椎亥 麦。
息崇ィ畠Ⅰ5: 三巳2の埋孟基が、以下の
B )2-ガくノレミルーⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸 B2)2-ガくノレミルー4-ョ@ドーⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B3)2-ガくノレミルー4-メチル ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B4)2-ガくノレミルー4-(-プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ ル芸; B5)2-ガくノレミルー4-(2
Figure imgf000012_0001
-呈 奥アミノLゴ二 ノレ)-Ⅰ ユ
H-ピロールーⅠ イル芸; B6)2 ホルミルー4-(3-呈 奥アミノ Ⅰ プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールー Ⅰ イ ユ
ル芸;
B7)2-ニトローⅠH-ピ ユ
ロールーⅠ イル芸;
B8)2-ニトロー4-ョ@ドーⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
Bg)2-ニトロー4-メチル ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B０)2-ニトロー4-(-プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸; B )2-ニトロー4-(2-呈 奥アミノLゴ二 ノレ)-ⅠH-ピロー ユ
ルーⅠ イル芸;刀乏び 。
2)2 ト 4 3 ア ノ プ ヒ の
イ 基
らなるグ プ ら選択される、態様 3に記載の 。
００33 6 、逆転写、複製 訳の 程で、塩基 を形成して る、態様 3な し 5の ずれ 項に記載の 。
００34 7 下の
００35 5
Figure imgf000013_0001
００36 こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の 2
００37
Figure imgf000013_0002
００38 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC 、
2 Cア
3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。 で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 を 、前記 2の 基を有する ク オ の な位置に、前記 の 基を 有する ク オ を組み込む
ことを含む、前記 製方法。
００39 8 下の 2
H 7
Figure imgf000014_0001
００41 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され 若し は 換のc cア 、又は置換された若し は 換のc c3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の
００42 8
Figure imgf000014_0002
００43 こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 を 、前記 の 基を有する ク オ の な位置に、前記 2の 基を する ク オ を取り込む
ことを含む、前記 製方法。
００44 9 7または 8に記載の 法によ て調製された、 又は式 2の 基を有する ク オ を含む 。
００45 2 、アンチセンス し は 、 ボ イム、アプタ である、態様 9に記載の 。
００46 2 下の
００47
Figure imgf000015_0001
００48 ここにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン 。
００49 22 下の 2
００5０ b
Figure imgf000015_0002
００51 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC Cア 、又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、 4
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン 。
００52 23 下の 3
００53 11
Figure imgf000016_0001
００54 ここにお て、
5
は、水素 置換ア ノ基であり、
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は 又はC である。
で表される 基を有する5 O (4 4 トキ ト ) 3 O (2
ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド。
００55 24 下の 4
００56 2
Figure imgf000016_0002
００57 ここにお て、
7
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC ア
2 C 、
3 又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
8
は、ホ ト 基であり、
7 8
ただし、 が水素 プ ピ 基で、 が 基の場合を除 。
で表される 基を有する5 (4 4 トキ ト ) 3 2 ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド。
００58 25 8に記載の 法によ て調製された、 2で表される 基を有する
3
ク オ を含む であ て、 2の が、ビオチン又は蛍光分子で 換 されたC Cア キ 、C 、
2 Cア
3 又はC キ 基
2 Cア
3 である、 。
3 ００59 26 22に記載の ク オ ド 5 ン酸であ て、 が、ビオチ ン又は蛍光分子で 換されたC Cア キ 、C2 Cア 、
3 又はC2 Cア キ 基である、前記 ク オ ド 5 ン 。
００6０ 27 24に記載の5 (4 4 トキ ト ) 3 O (2 ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ドで 7
あ て、 が、ビオチン又は蛍光分子で 換されたC Cア キ 、C2 Cア
3 、又はC Cア キ 基である、前記5 (4 4 トキ ト ) 3 O (2 ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド。
題を解決するための
００61 らは、上記 題解決のために 究に努めた結果、本 明を想 した ００62 明の ステムの 発の
、複製 転写の 応にお て、効率および に優れた人工 を得るために、 自分たちが開発した の を組み合わ るこ とによ て構築される を研究した。
００63 、2 ア ノ 6 (2 9 イ (s (
33)と2 ピ イ (Pa ( 26)の み合わ が、転写にお て高度な選択 および 率を示すことを見出した( 4 公 開)。そして、 明にお てさらに、sのプ ン 6 2 の 子の をC に置換し2位のア ノ基を水素に えた、 、 アザ、 ア ノ した7 (2 チ 3 4 5 3 イ ( s を作成し、 sとPa の の 合を調 た。その 果、 sとPaの 、複製 転写 お て、どちらが 型、又は基 とな ても高度な選択 および 率を示すことを見 出し、 明を想 した。
００64 体的には、7 (2 ) 4 S b ジン( 5)およびピ
2 カ デヒド(Pa)間、並びに sおよび4 プ ピ ピ 2 カ デヒド(Pa )( a)間の疎 性塩基 oでの および にお て 高 選択 を示すことが見出された( 。)。 製にお て、 らは、通常の 5 ン 5 ン酸である5 ア ド ン ( b)の を組 み合わ 、さらに、3 5 ク ア 性を有する ポ メラ ゼを用 ることにより、 s Pa を含有する 片のPC 幅を可能にする高 選 択 を達成した。さらに、これらの 、 7 ポ メラ ゼによる通常 の 中に相補 に導入された。
００65 より 細には、 らは、以下の2 の 念を考慮することにより P
を設計した ) の を高めるために、天然 基とは異なる形の疎 性塩基を採用し( 2 22) 2ポ メラ ゼとの 用に必要な( 23 25)、プ トン 、例えば、 sの4位の窒 ( およびGの3位に対 応)およびPaのア デヒド (Cおよび の2位の 基に対応)を追加した( a) ００66 性塩基 の 命的な問題は、塩基の形の相補性に従わな 性塩基
性塩基 の ( えば、 s s )が効率よ 形成されてしま ことである(
4 29)。 製における P" の を試験するために、 らは、 キ ク ア 性を欠 グメント( e o)を使用し た ク オ 入実験により、 の 成能を調 た( 2")(
3 32)
００67 験に用 る (d s PおよびdPa P)と sまたはPaを含む は、化 学的に合成された( 1 。 験の 、 s Pa および 成のそれぞれの がそれ以外の み合わ の の の よりも高 ことを示した( 2bおよび 2)
００68 グメントによる の ク オ 入実験。
００69
Figure imgf000019_0001
００7０ a を 5 s C (P 7 5) O C T お よび ・ O ア ンを含有する ( )中で、5
プライ 、 5 5 、および ・ 3 5 ク オ ド5 ン酸を用 て、 Cで 35 た。 3な し8のデ タセットで 平均 された。
００71 b・ 差を に示す。
００72 C ク オ ド5 ン および5 素で2 インキ ベ ョ した後にお ても産物は、ほとんど 出されな た( 2
００73 d・この 語の 、 である。 ００74 2 グメントによる の ク オ 入実験。
００75 2
Figure imgf000020_0001
0076 a・アッ を 5 s C (P 7 5) O C T よ び ・ O ア ンを含有する ( )中で 5
プライ 、 5 5 、および ・ 3 5 ク オ ド5 ン酸を用 て、 Cで 35 た。 デ タは3な し8のデ タセットで平 均 された。
0077 b・ 差を に示す。
0078 c・ 5 ク オ ド5 ン および5 素で2 インキ ベ ョンした後にお ても産物は、ほとんど 出されな た( 2 )
0079 d・ である。
し しながら、鋳型 sに対してd s P( 5
2・ )が効 m 率よ M
込まれてしま 、 sに対するdPa Pの ( 6 X )よりも m M ・ 2
率であ た。この s s対は、問題とされる 基の形の相補性に従わな 性塩基 性塩基 の 成であるため、 型 造を変形さ てし ま 。その 果、鋳型 sに対してd s Pが導入されると、その後の複製の 長 が停止してしま 。 えば、 sを含む を用 て、dPa Pとd s Pの を含む 液中でプライ 応を〒 と、d s Pの 加とともに(dPa PのO ・ 5または 等 ) sに対してd s Pが取り込まれてしま ので、3 5 ク ア 性を有する グメント( e o)によるプライ
阻害された( 2d、 ン3および4)
００8０ そこで複製におけるこの の 質的な問題を解決するために、
らはさらに、 として sの 5 ン酸である5 ア ド ン ( b) (d s P 表 る)
N 示す を採用した。 らは、鋳型 sに対してd s Pの
N
( g 3
m M ・ )が有意に減少することを発見した。し し、更なる 、鋳型 Paに対するd s P Nの (
max ・ 7X
M 6 )が、 型 Paに対する の (
m M 4・ 3X )に近 ベ にまで低下 してしま ことであ た。この 、 の5 ア ド ン (d P)を使用す ることにより 決することができた。d Pの わりにd Pを用 ることにより、鋳型 Paに対するd s P Nの 、鋳型Paに対するd Pの (
N ma M 3
・ )よりも37 なり、Pa s の 選択 を保 ことができた ００81 したが て、 らは、通常の5 ン酸であるdPa P dG P dC Pお よびd P、と5 ア ド ン酸であるd s P を組 わ
Nおよびd P て
N み合 用することにより、複製にお て の 相補 な選択 を達成し た( 2c)
００82 d s Pの では、鋳型 sに対するPaの 入の後のプライ
、 害されること無 進行した( 2d、 ン5および6)。さらに、鋳型Paに 対するd s Pの の
N 入、または に対するd P 入後のプライ 長も
N
率的に進行した( 2e、 ン2および 2e、 ン 4)。 味深 ことに、鋳型P aに対してd Pが誤 て 入された場合のその後の伸 よりも、鋳型Paに対 するd Pの た 入後の 応のほ が著し その 率が低下した( 2e、 ン4および5
００83 の をさらに改善するために、 らは、 ステムに お て3 5 ク ア 性を有する ポ メラ ゼを使用した。
e o 用 ることにより、望まし な Paおよび s が形成された後 のプライ 応の 著し 低下し、プライ
辺で中断された( 2d ン 、並びに 2e ン9 7および 8) ００84 したが て、 らは好まし は、3 5 ク ア 性を有する ポ メラ ゼに通常の5 ン 5 ン を組み合わ て、複製にお て、 およびG C 共に機能する特異
ステムを作成した。
００85 、塩基 の な形の相補性で 成されるが、両者間の 合の 用を欠 。 製にお て、好まし は実用 ベ で高 忠実度で C 幅を可能にする3 5 ク ア 性を有する(e o cease of ce ) ポ メラ ゼに対する として通常の5 ン 5 ン 酸である5 ア ド ン との み合わ によ て、この 対は特 に高 選択 を示す。 基を含有する 片の 、
基の を加えた デオキ ク オ による ケン ングにより確認、 可能である。さらに、 の 補性は、通常の 7 による のこ れらの 基の 入も仲介することができる。
００86 、以下の 3 ち ずれ 、ある はこれらの み合わ を用 た、 新規な ステムを提供する。
００87 ) 応にお てア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン酸を基 として る
2) 応にお て、 ク ア 性を有する ポ メラ ゼを そして、 を利用する。 ００88 上、本 明の 解のために 明を想 するに至る経緯を説明したが、 明 の 上記 明に限定されず、請求の 囲の によ て定められる。
００89 の 製方法
、 様にお て の な 製方法を提供する。 明の 、 複製 応にお てア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて る、 オキ ボ ク オ ド 5 ン酸を基 として ることを特徴とする。
００9０ 応にお て となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸のv位の ン 酸の水酸基を上記の 換することによ て、複製 応の がさらに向 上する。このよ 修飾5 ン酸の利用により、 の り込み 率が無 換の ものと比較して低下する場合であ ても、選択 の 上により、人工 を組み込 んだ 応が実質的に利用 能なよ に進行する。
００91 まし は、前記 ア ノ基である。
００92 デオキ ボ ク オ ド 5 ン酸のv位の ン酸の水酸基の 法は特 に限定されず、 の 法を用 て ことができる。 えば、本明細書の 1 3 ( 5) ( 6)は、置換 ア ノ基の場合の 応する ク オ ド らの を開示する。ある は、 47も、 ア ド ク オ の 法 を開示して る。
００93 メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト 、 オ 、ア ノ 外の 合も同様に、当業者に公 の 法を用 て合成することが可能である。
００94 、上記 の 外は特に限定されず、 の 法に従 て
とが可能である。 定されるわけではな が、例えば、複製 応にお て好まし な な 成を防ぐために、 キ ク ア 性を有する ポ メラ ゼを用 ることが好ま 。 キ ク ア 性を有するポ メラ ゼは、 3 5 ク ア 性を有する、ク グメント、 4 ポ メラ ゼ、 び好 来の ポ メラ ゼ( えば、 e ococc s o a s 来の e ポ メラ ゼ らなる群 ら選択される。
００95 明の 法の 様として、 の 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸を基 として ることができる。 年、天然 異なる水素 式をもち、 体障害によ て天然 基との を排除できるよ の 出の 究が行われ、 の が報告されて る。
の 合を利用した組み合わ や 基の 性を利用した組み合わ 等が知ら れて る。 、これらの 基を有する核酸にお て、 v位の ン酸の 水酸基を修飾することによ て、転写、複製及び 又は翻 応における選択 、 効率を上昇さ ることを可能にした。
００96 明における 基の 類は特に限定されず、例えば、下記の の 意の 基を有するデオキ ボ ク オ の 用が される。
００97 2 ア ノ 6 メチ ア ノプ ン( )と2 ア ノ 6 プ ン(s (
33)
2 。
ア ノ 6 (2 ) g プ ン 9 イ (5)と2 ( ) 3 イ ( )( 、 7)
2 ア ノ 6 (2 9 イ ( )と2
3 イ ( )( 3、 8)
ピ 2 カ デヒド(Pa)と7 メチ イ 4 5 b ジン(Q)(
26、 34)
はさらに、新規な人工 を考案し、 2 5 8 4日に特許 願を行 た( 2 5 226492 )。 、ピ 2 カ デヒド(Pa)と 2 ア ノ 6 (2 ) g プ ン 9 イ (5)との に関す る。 、特にPaを 型としsを とする 応にお て優れた選択 を示す。
００98 たに、 らは 明にお て、さらなる新規 を提供する。
新 明の 応に有効に使用し 。よ て、限定されるわけ ではな が、 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸は、以下の ００99
Figure imgf000025_0001
０1００ こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である。
０1０1 ある は、 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸は、以下の 2 ０1０2 4
Figure imgf000025_0002
０1０3 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC ア
2 C 、
3 又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である。
０1０4 の 基及び 2の は ずれも、 、鋳型の ずれとして使用された場合 にお ても複製 応にお て優れた選択 、効率を示す。さらに、転写 応にお ても優れた選択 、効率を示す。
０1０5 明にお て提供される式 の 基と 2の 基との新 に て は、 明の に基 の 目にお て詳述する。
０ ０6 ある は、 なる オキ ボ ク オ ド 5 ン酸は、天然 の 基を 有するものであ てもよ 。デオキ ボ ク オ ドの の 、アデ ン( )、グア ン(G)、 ト ン(C) チ ン( )の4 類が知られて る。これらの の 基の 合も の 基の 合と同様に、 v位の ン酸の水酸基が置換さ れて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン酸も、 として の 応に 有効に使用し 。
０1０7 キ ク が
はまた、ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて る、デ オキ ボ ク オ ド 5 ン酸を提供する。
０1０8 明のデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸は、 の 基を有するも のであ ても、天然 の 基を有するものであ てもよ 。 の 、
の に ては、核酸の 製方法に関して上述した通りである。
０1０9 明のデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸は、上述した 明の の 製の 法における、 としての 用することができる。
０11０ く
、複製、転写及び 訳の ての 応にお て、効率および に 優れた人工 を得るために、 自分たちが開発した の を 組み合わ ることによ て構築される を研究した。その 果、 2 ア ノ 6 ( 2 ) 9 イ (s ( 7 33)と2 ピ イ (Pa ( 26)の み合わ が、転写にお て高度な選択 および 率を示すことを見出した( 4 公開)。
０111 そして、 明にお てさらに、sのプ ン 6 2 の 子の を C に置換し2位のア ノ基を水素に えた、 、 アザ、 ア ノ した7 (2
) 3 4 5 b 3 イ ( s)を作成し、 sとPaの の 合を調 た。その 果、 sとPaの 、複製 転写にお て、どちらが 型、又は基 とな ても高度な選択 および 率を示すことを見出 し、 明を想 した。
０ 2 よ て、 はその 様にお て、以下の
０113 5
Figure imgf000027_0001
０114 ここにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして、
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ 、
以下の 2
０115 6
Figure imgf000027_0002
０116 ここにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC Cア 、
2 3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ とが、塩基 を形成して る核酸を提供する。 ０117 明における ク オ ドとは、核酸塩基と糖の還 とがグ ド 合によ て結合した 物を意味する。なお、 酸塩基 は、アデ 、グア 、 ト ン、チ ン、ウラ 、 びこれら 基の 導体も含む 念である。 導体の 類は特に限定されるものではな が、具体的には、例えば、上記 で表される 基、 2で表される 基、などが挙げられる。 ク オ は、前記 ク オ ドの 分が、 ン ステ を て る 物を 。より好まし は、一、 、又は 三 ン ステ である。 ク オ ド又は ク オ の 、 2 デオキ ボ 、ある は ゲ などの 2位に有する2
であ てもよ 。 定されるわけではな が、 ン 、ア ノ 、メ チ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択さ れる基で、 V位の ン酸の水酸基が置換されて ることが望ま 。 分及び ン 、 ク オ ド、 ク オ 、ある はこれらの 導体にみられる構 成をと て ればよ 。 分が である ク オ は の 分となり、 オキ ボ であるデオキ ボ ク オ は の 分となる。
2
０118 の 基にお て、 の 、チア 基は、 換 である ある は、4位及び 又は5位が、メチ 、ア ノ 、 ト 基及び キ 基 らなるグ プより 立して選択される一 またはそれより多 の基で 換さ れて てもよ 。
2
０119 明の の 基の 、 が置換された又は無 換の2 基のものを 、本明細書にお て文脈により、 s又は s 呼称する。 明の の
2
基の 、 が置換された又は無 換の2 基のものを、本明細書にお
2 て文脈により、 又は 呼称する。 明の の 基の 、 が置換された又は無 換の 2 基のものを、本明細書にお て文 脈により、 又は 呼称する。
０12０ の は、本明細書にお ては、例えば、 s 合、 が水素ある はア ノ基の ずれの 合も含む。これに対して、先行 術文献では、例えば、 がア ノ 基の場合に s 、水素の 合には s と、 の 様に応じて 別して記載してある場 合もある。
０121 は、 であ てもC でもよ 。 の 、例えば、 s 表 現する。C の 合、例えば、 s 表現する。 細書にお て例えば、 s は s 等を含む。さらに、文脈により、 s 、 s を総称して s 表現する場合もある。
０ 22 定されるわけではな が、好まし は、 の 以下の
7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ ( s) 。
2)7 (2 チア ) 3 4 5 b 3 イ ( ) 3)7 ( 2 ) 3 4 5 b 3 イ 4)5 ア ノ 7 (2 ) 3 。
4 S b 3 イ ( s)
5)5 ア ノ 7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ ( )
6)5 ア ノ 7 ( 2 ) 3 4 5 b 3 イ
7)4 (2 ) 2 。
3 b ジン イ ( s) 8)4 (2 チア ) 2 。
3 b ジン イ ( ) 9 。
)4 ( 2 ) 2 3 b ジン イ
。
)6 ア ノ 4 (2 ) 2 3 b ジン イ ( s)
。
6 ア ノ 4 (2 ) 2 3 b ジン イ ( )
。
2)6 ア ノ 4 ( 2 ) 2 3 b ジン イ 基
らなるグ プ ら選択される。
０123 基の ち、 と 4は s 7と は sである。 2と 5は 8と は である。 3と 6は、 、 gと 2は、 である。
。
０124 より好まし は、 7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ 。
( s) 2)7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ ( ) 4)5 ア ノ 7 (2 。
) 3 4 5 b 3 イ ( s)、 5)5 ア ノ 7 (2 ) 3 4 5 b
3 イ ( )である。最も好まし は7 (2 ) 3
4 5 b 3 イ ( s)( 1の 又は 4)である。
０125 明の の 基、 びこれを含む ク オ ド、 ク オ は、 の 法を 用 て合成することが可能である。 体的には例えば、 細書の 3 は、2 ア ノ 3 ト 4 ク ジン( 1の 合物 )( 4 ) ら、7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ ( s)の ク オ ド 5 ン酸及び5 ア ド ン ( 1の 又は 4) を合成する方法を開示して る。また、実施 11 は、7 (2 ) 3
4 5 ジン( 11の 合物4)( )の ク オ ド 5 ン酸を 合成する方法を開示して る。
０ 26 さらに、実施 は、4 (2 2 3 b ジン( s) 4 (2 ) 2 3 b ジン( )の ク オ ド 5 ン酸を合成する方法を開示して る。
０127 また、その他の本 明の の 基を有する ク オ ド、 ク オ 、 5
ア ド ン酸も、本願 細書に 体的に開示 同様 法及び 又は当業者に 知 の 法を用 て合成することができる。
3
０128 明の 2の 基にお て、 は、水素、 、置換された若し は 換 のC Cア キ 、置換された若し は 換のC Cア 、
1 3 又は置換 された若し は 換のC Cア キ 基 ら選択される基である。
０129 ア キ 、ア ア キ 、さらに、低級ア キ 、 ゲン 、ヒド 、ア ノ 、ア キ ア ノ 、 環 らなる グ プより 立して選択される一 またはそれより多 の基で 換されて てもよ
０13０ ある は、上記ア キ 、ア ア キ 、さらに、ビオチ ン又は蛍光分子で 換されて てもよ 。
０131 オチンは とも呼ばれ、ビタ ン 群の 種である。ビオチンは、 に含 まれる タン ク質であるアビジ 特異 に結合し、複合体を形成することが知ら れて る。よ て、置換 として オチンを有する ク オ ド等は、アビジンタン ク 質に特異 に結合する。このため、ビオチンが結合した ク オ ド等を含む 、アビジ を結合した と結合さ ることができるので、核酸を固定 、分離するこ とができ、特定の 子に結合する核酸( タ など を固定化すれば、例えば、
3 特定 質の 出や単離に、また、診断 薬として利用できる。 2の 基における のア キ 、ア ア キ オチンを導入するためには、 ア ノ基を介して オチンを直接結合さ てもよ 、 ンカ を介して結合さ てもよ
０132 光分子は、 の 光分子を利用 能であるが、好まし は、5 カ ボ
オ セイン(5 ) 6 カ ボ オ セイン(6 ) 5 カ ボ テトラメチ ダ ン(5 R カ ボ テトラメチ ダ ン(6 R 5 メチ ア ノ タ ン ス ホン ( S 5 カ ボ キ 2 4 4 5 7 7 キサク オ セイン( X) 6 カ ボ キ 2 4 4 5 7 7 キサク オ セイン( X) 5 カ ボ キ 2 4 7 7 テトラク オ セイン(5 6 カ ボキ 2 4 7 7 テトラク オ セイン(6 ) 5 カ ボキ X ダ ン( 5 OX) 6 カ ボキ X ダ ン(6 X)、およびそれらの 導体 ら なる より選択される。 オ セイン は、一般的に開 型及び ピ 型の二通りで表記される。
０133 えば、 の 大波長は 、蛍光 大波長は である。また、
R の吸 大波長は 、蛍光 大波長は578 である。 S の 大波長は 、蛍光 大波長は 8 である。 Xの 大波長 は 、蛍光 大波長は である。 の 大波長は 、蛍光 大波長は である。 5 Xの 大波長は 、蛍光 大波長は 5 である。6 Xの 大波長は 、蛍光 大波長は であ
3
る。 光分子で 換されて る を有する式2の 基を有する ク オ ド又は ク オ は、蛍光分子の 類に応じて の 出を〒 ことが可能である。よ て、 2
3
の 基における のア キ 、ア ア キ 光分子で 換された 基を有する ク オ を含む 、標識 として 相互 用する物質 出のプ として使用され 。また、 光分子によ て
3 が異なるため、多重 色に使用することも可能である。 2の 基における のア キ 、ア ア キ 光分子を導入するためには、ア ノ 基を介して 光分子を直接結合さ てもよ 、 ンカ を介して結合さ てもよ 。 3
０134 なお、 2の 基における のア キ 、ア ア キ
ンカ を介して オチンまたは 光分子を結合さ る場合、 ンカ の 類は特に限 定されず、当業者は 能である。 ンカ は限定されるわけではな が、好 まし は、下記の 1および11
０135 7
Figure imgf000032_0001
０136 1 、 は な し5の 数 ら選択される ０137 8
Figure imgf000032_0002
０138 11 、 、 な し5の 数 ら 立に選択される
らなる より選択される。
０139 Rは、ホ ト 基である。 2の 基にお て、 が 基の場合 、本明細書にお て文脈により、 Pa又は Pa 呼称する。 が ト 基の 場合、本明細書にお て文脈により、 P 又は P 呼称する。 Pa 、 Pa 、 P 、 P 等を総称して、 Pa 呼称する場合もある。
040 定されるわけではな が、好まし は、 2の 以下の
)2 ホ ピ イ (Pa) 2)2 4 ド ピ イ
3)2 4 メチ ピ イ
4)2 4 ( イ ) ピ イ 5)2 4 (2 ア ノ ) ピ イ 6)2 ホ 4 (3 ア ノ プ イ ) ピ
イ
7)2 ト ピ イ (P )
8)2 ト 4 ド ピ イ
g)2 ト 4 メチ ピ イ
)2 ト 4 ( プ ピン イ ) ピ イ
2 ト 4 (2 ア ノ ) ピ イ
2)2 ト 4 (3 ア ノ プ イ ) ピ イ 基
らなるグ プ ら選択される。
０141 基の ち、 6は Pa又は Pa 導体であり、 7 2は P 又は
P 導体である。
０142 より好まし は、 2 ピ イ (Pa ( 1の
9)、 4)2 4 ( プ ピン イ ) ピ イ ( 1の 2 )である。
０143 明の 2の 基を有する ク オ ド、 ク オ は、 の 法を用 て合 成することが可能である。 えば、Paは、その 料である例えば、ピ 2 カ ボア デヒドは、例えば、 d c 3 29 8 e c 8 757 4 ら 入することができる。また、Pa 導体は、基本的にPa ら 導することによ て合成できる。 えば、Paの4位にプ ピ を導入した 導体は、 oo ed e e ・ 3 ・45 5 45 8(2 3)( 28)に記載されて る。 ０144 明細書の 1では、実施 1 3 2)にお て、ピ 2 カ ボア デヒド (j )ピ 2 カ ボア デヒド( 7)を合成した。また、 ( 3)にお て、4 プ ピ 2 ピ ア デヒド ( 6)( 4 ) ら、4 プ ピ (j )ピ 2 カ ボア デヒド( 8)を合成した。さらにこれらの ク オ ド 5 ン酸及び5 ア ド ン酸が合成された( 9 2 ) ０145 また、本明細書の 11 では、 2 ト ピ ( 合物 ( 49 ) ら、2 ト ピ ( )(P )の ク オ ド 5 ン酸が合成され た。
０146 、 の 基を有する ク オ 、 2の 基を有する ク オ とが を形成して る、核酸を提供する。 明細書にお て とは、 より多 の ク オ が、5 3 向に結合した核酸 の 子を意味する。 明の 、一本 二本 又は を含む。 、 R 、又は であ てもよ 。また、 には、 を 型として 逆転写してなる。 も含まれる。ある は、核酸は3 、4 成し 。 ０147 らは、核酸のさらなる機能 張をめざして、 基をも ク オ ド又は ク オ の 取り組んだ。 たに開発された人工 の 様とし て、 の 基を有する ク オ 、 2の 基を有する ク オ との が 含まれる。 の 基を有する ク オ 2の 基を有する ク オ は、 ずれも、複製 転写 ずれの 構にお ても、 としても 型としても 率及 び 又は高 をも て機能する。
０148 の 基と 2の 基の 、例えば、 sおよびPa間では有意な水素 合相互 用が存在しな にも わらず( s Pa )、 s Pa 成 の および 、天然 の 成のそれと 度に高 屹のである。こ の s Pa 、先に開発された親水性s よりも高 率を示す。 s Paの な形状は互 に適合するが、天然 プ ン類及びピ ジン類の 形状とは相違する。この な立体 合が、天然 基との まし な を排除し、その 果、複製 転写にお て P 選択 が得られ ると考えられる。このよ に、形状 補性は複製 における特異 な 成に重要な役割を果たす。
０149 明の、 の 基を有する ク オ 式2の 基を有する ク オ とは、 なる2本の核 上に存在して により二本 を形成し 。ある は、 ク オ は同一の 本の 上に存在してもよ 。この 合、塩基 により、一本 プ 造を形成してもよ 。
０15０ 明の の 基を有する ク オ 2の 基を有する ク オ は、 複製、転写 逆転写 応により、 又は 等の核 取り込むことが可能 である。ある は、天然 基を有する ク オ ド又は ク オ 同様に、化学 合成によ て 又は に取り込んでもよ 。
０151 、転写 逆転写 の 法に従 て ことが可能である。 定され るわけではな が、例えば、転写 7 R ポ メラ ゼ( a a a等)、複製 、ク グメント( )、逆転写 Re e se a sc ase X ( )( fe Sce ce )を使用することが可能である。
０152 定されるわけではな が、 明の 様にお て、核酸の 、転写 、又は逆転写の 程で、塩基 を形成して る。 明の 、転写 程で を形成して る場合、 の 基を有する ク オ が の 部であり、 2の 基を有する ク オ が の 部であ てもよ し、ある はその逆に 2の 基を有する ク オ が の 部であり、 2の 基を有する ク オ が の 部であ てもよ 。
０153 明の ステムの 要を図 cに示した。 明の ステムの 製における効果は、例えば、 2b e、 3b 、 8 2 に示されて る。
明の ステムの における効果は、例えば、 4c 、 5a に示されて る。 ０154 の 製方法
はまた、以下の
０155 9
Figure imgf000035_0001
０156 こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、 2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の 2
０157
Figure imgf000036_0001
０158 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換さ
3 れ 若し は 換のC 2 C3ア 、又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 、前記 2の 基を有する ク オ の な位置に、前記 の 基を 有する ク オ を組み込む
ことを含む、前記 製方法を提供する。
０159 はまた、以下の 2
０16０ 2
Figure imgf000036_0002
０161 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC ア
2 C 、
3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、 は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の
０162
Figure imgf000037_0001
０163 こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 を 、前記 の 基を有する ク オ の な位置に、前記 2の 基を 有する ク オ を取り込む
ことを含む、前記 製方法を提供する。
０164 で表される 基を有する ク オ 、 2で表される 基を有する ク オ の 義に ては、本明細書の 明の に基 の 目 にお て前述した通りである。
０165 はさらに、上記 明の 法によ て調製された、 又は式2の 基を有する ク オ を含む 酸を提供することを目的とする。
０166 明の ク オ が組み込まれた核酸は、 、アンチセンス し は 、 ボ イム又は タ として使用され 。アンチセンス し は とは、ある特定の 伝子の 現を抑える 又は である。 的と する遺伝子配列(センス )の 部分配列に対して相補 味で名付 けられた。 為的に 伝子 現を調節する手法として使用され 。 明の ク オ が組み込まれたアンチセンス 又は は、 基を含むため 的に対する相補性が天然 基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製し 。 は、 を構成 分とする の 称である。アプタ 、 oセ ク ョン法によ て得られた、タン ク の 定の 子に結合する機能を有 する核酸である
また、 明の、 ク オ が組み込まれた核酸( 又は )( えば、 、合成 )は、タン ク 、ペプ の 一部を ドするものであ て もよ 。 明の 遺伝子 片やプ などとして使用され 。 然の 伝 子の 全部を本 明の 換した 様、天然の 伝子に本 明の ク オ を はそれより多 付加したもの、又はこれらを組み合わ たものも 明に包含される。
０167 さらにまた、 明の 基を有する ク オ が組み込まれた核酸は、
( e fe e ce R )にお ても利用 能である。
、二本 (ds )によ てその が分解され、その 伝子の 現が抑制される現象である。 渉の 型的な例としては、ds は、 。111 ァ に属する イサ ( )により、 3 端の側に2 基程度 のオ ングを有する 2 23 基のs s o e fe R )にプ セッ ングされる。 s は SC 呼ばれるs 白質 合体に取 り込まれ、配列 R を分解する。 、 (ヒト、 ウス等 )、線虫、植物、 ョウジョウ 、 類などの 範な生物種 で保存されて る現象 であることが示されて る。 明の 基を有する ク オ が組み込ま れた核酸は、 渉におけるs として、または分解を受ける の 部と して利用 能である。
０168 ク オ 5
、さらに以下の
０169
Figure imgf000038_0001
０17０ こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン酸を提供する。
０171 基などの式 の 造に て、デオキ ボ ク オ に て上述した通り である。
０172 はさらにまた、以下の 2
０173
Figure imgf000039_0001
０174 こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換さ
3 れ 若し は 換のC Cア 、又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン酸を提供する。
０175 基などの式2の 造に て、デオキ ボ ク オ に て上述した通り である。
０176 さらに、 以下の 3
０177
Figure imgf000039_0002
０178 こにお て、
5
は、水素 置換ア ノ基であり、
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は 又はC である。
で表される 基を有する5 (4 4 トキ ト ) 3 (2
ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド、を提供 する。
０179 R ア ノ基は、メチ 、イソ 、ベンゾイ 換されたア ノ 基を含む。
2
０ 8０ は、 の 同様である。
０181 3に含まれる 物の として、実施 1で 8を合成した。
０182 3の 、例えば、複製及び における 型の 合成における 原料として有用である。
０183 さらにまた、以下の 4
０184 2
Figure imgf000040_0001
０185 こにお て、
7
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換さ
3 れ 若し は 換のC ア
2 C 、
3 又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
8
は、ホ ト 基であり、
7 8
ただし、 が水素 プ ピ 基で、 が 基の場合を除 。
で表される 基を有する5 O (4 4 トキ ト ) 3 O (2
ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ドを提供 する。
7 3
０186 Rは、 2の 同様である。
8 4
０187 Rは、 2の 同様である。
０188 4の 例えば、複製及び における 型の 学合成における 原料として有用である。
０189 a a は、特異 および 写を可能とする ステムに て 。 aは、 s Pa および を示す。
b a は、特異 および 写を可能とする ステムに て 。 bは、PC およびプライ 長のための としての 5 ン (d P)および 5 ア ド ン酸の構造を示す。
c a は、特異 および 写を可能とする ステムに て 。 cは、PC 幅、プライ 長、 ケン ング、および 7 にお て機能する ステムを示す。
2a 2a eは、 s Pa を使用した ステムの ク オ およびプライ 験に て 。 2aは、 ク オ 入実験 のための プライ の 列である。
2b 2a eは、 s Pa を使用した ステムの ク オ およびプライ 験に て 。 2bは、 e oによる 基に対する (d P)の 率を示す。
2c 2a eは、 s Pa を使用した ステムの ク オ およびプライ 験に て 。 2cは、 e oによる 基に対する ( d P、 Pa、G、C、および 、並びに修飾 d P、 sおよび )の 率を示す。
2d 2a eは、 s Pa を使用した ステムの ク オ およびプライ 験に て 。 2dは、d s Pまたはd s P の または非存在にお て、dPa Pおよび sを含有する 型を用 て、 e oにより5 間のプライ 応を行 た結果を示す。 2e 2a eは、 s Pa を使用した ステムの ク オ およびプライ 験に て 。 2eは、 e oまたはe o"に よる一連の ( d s Pおよび P)を加えて、Paを含む 型、ある
N N N N
は、天然 の 型を用 た3 間のプライ 。 G Pが 応に存在しな ので、全長産物は主に33 eになる。
3a 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3aは、実験のスキ を示す。 ( 5 e )を、 sおよびPaを含有する 的に合成された (9 eおよび8 e )を用 てプライ 長により調製した。
3b 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3bは、はじめの ( サイク ) びに5およ び サイク の後のPCR 物の ガ スゲ 示す。 は、PC をサ イク (94C、O・ 5 45C、O・ 5 65C、4 )で ・ 4 ット x
ポ メラ ゼを用 て増幅された。 基のみを含有する co は、P C をサイク (94。C、O・ 5 45。C、O・ 5 72。C、 )で ・ ット x
ポ メラ ゼを用 て増幅された。
3c 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 ステムを用 た (d )、および (e )サイク PC の後の、または天然 のみの サイク PC ( )の後の、PC 前の (c )およびPC 物の、dPa Pの ( c f)または非存在 ( )での ケン ング。
０19０ 3cは、PC ( サイク )のdPa Pの での ケン ングの 果であ る。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であり、 ケン ング 応ではこの 置にPa 組み込まれる。よ て、この 位のみ 、G、C、 の ずれのピ クも消失する。
3d 3a は、 s Pa を含有する 片の ケ グおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3dは、 サイク PC 後のdPa P の での ケン ングの 果である。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であり、 ケン ング 応ではこの 置にPa 組み込ま れる。よ て、この 位のみ 、G、C、 の ずれのピ クも消失する。
3e 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3eは、 サイク PC 後のdPa Pの での ケン ングの 果である。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であり、 ケン ング 応ではこの 置にPa 組み 込まれる。よ て、この 位のみ 、G、C、 の ずれのビ クも消失する。
3 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3fは、天然 のみでs Pa が存在しな 条件下でのPC ( サイク )後のdPa Pの での ケン ングの 果である。4 目の 基に相当する、鋳型の 中の P 、完全に に置き換わ て る(4 目の )
39 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3 は、PC ( サイク )のdPa P の 存在 での ケン ングの 果である。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であるが、 s 特異 な を形成する 基が存在し な ため、この 降のビ クはほとんど 滅する。
3h 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3 は、 サイク PC 後のdPa P の 存在 での ケン ングの 果である。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であるが、 s 特異 な を形成する 基が存在し な ため、この 降のビ クはほとんど 滅する。ただし、塩基の な取 込み( み過し)も観察される。この み過しのビ クは、PC サイク 数の 増加によりわず に大き な た。
3 3a は、 s Pa を含有する 片の ケン ングおよ びPC 幅に て 。 3c は、 3a bに関して説明した要領に沿 て PC 定を行 た結果を示す。 3は、 サイク PC 後のdPa Pの 存在 での ケン ングの 果である。4 目の 、鋳型の sの な位置に対応する 基であるが、 s 特異 な を形成する 基が存在 しな ため、この 降のビ クはほとんど 滅する。ただし、塩基の な 取り込み( み過し)も観察される。この み過しのビ クは、PC サイク 数 の増加によりわず に大き な た。
4a 4は、 s Pa により 介される 7 に て 。 4a 4 bは、実験のスキ である。
4b 4は、 s Pa により 介される 7 に て 。 4a 4 bは、実験のスキ である。
4c 4は、 s Pa により 介される 7 に て 。 4cは、Pa P、Pa Pまたは s Pの ( )または非存在 における天然 P( ) ( s Pa Pa 、 またはC)を用 た ゲ を示す。
32
P G Pで 識した。 の 率を、天然 基 らなる ( またはC) らの との 較により決定した。それぞれの
( )は、3 のデ タセット ら された。
4d 4は、 s Pa により 介される 7 に て 。 4d 4 eは、転写 ( 7 e )の ク ア ら られた ク オ 3 ン酸の2 C 析の 果を示す。
4e 4は、 s Pa により 介される 7 に て 。 4d 4 eは、転写 ( 7 e )の ク ア ら られた ク オ 3 ン酸の2 C 析の 果を示す。
5a 5は、 アンチ を含有する 子の 7 に て 。 5aは、Pa P(3 )または s P(2 )の における、天然 P(2または3 )の ( 4および co 4)を用 た
ゲ の 果を示す。 、内部に P G Pで 識した。 の 、 co 4 らの プ との 較により
CUA
した。それぞれの ( )は、 3 のデ タセット ら された。 5b 5は、 アンチ を含有する 子の 7 に て 。 5b 5cは、 および の ク ア
CPaA CUD
化 ら られた ク オ ド3 リ 酸の2 C 析の 果を示す。
5c 5は、 アンチ を含有する 子の 7 に て 。 5b 5cは、 および の ク ア
CPaA CUD
ら られた ク オ ド3 ン酸の2 C 析の 果を示す。 5d 5は、 アンチ を含有する 子の 7 に て 。 5dは、大腸 ステム( S Roc e)における
ア ノ に て 。 P G Pで内部 識された
、 ステム中で3 Cで3 分のインキ ベ ョン 、ア ノ され た をO・ 2 s (P 4 75)および3 を含有する アク ア ド で電気 して解析した。
6 6は、PC 、 ケン ングおよび の 験のための 片の 列を 示す。
7a 7は、化学合成された 片の 列を示す。
7b 7は、 合成された 片の 列を示す。
8 8は、 co を含有する の、dPa P 存在 での タ ネ タ ケン ングを示す。このビ ク タ ン s Pa を含 有する PC のピ ク タ ンを 較することにより s Pa PC における を調 ることができる。
9 9は 3 のd S P dPa P d P dG P dC P dT Pと らのPC 物の イタ ネ タ ケン ングを示す。 の サイク (b e または サイク (c の後の、はじめの (a dおよびPC 物の、dPa Pの (a c)または非存在 (d f)における ケン ング。 d Pの わりに、d Pを使用してPC を行 と、 実度は有意に減少した(e 1０ は 5 し は3 プライ を用 たPC 物のオ トラジオグラ を示す。 P 5 び非 3 プライ 、又は P 3 び非 5 プライ を用 て (a)又は co (b)を含む e ポ メラ ゼのための ( )中でPC を行 た。 、 3、5、 5回のPC サイク の後の各 液 ら、その ( 1)を アク ア ド 7 ゲ 上で分析した。 イオイメ ジングアナライザ を用 て、 ゲ 上の産物を分析し、定量した。 サイク あたりの ( )を、以下の
ト 。 を用 たカ イダグラ によ て計算した。 X( ) こで、 は、 PC サイク の数( 、3、5 )であり、 は、最初の ピ 数であり、そして 、 は、 サイク 後の産物の ピ 数である。 fは、以下の式 ら決定した。
、
０ P X( ) こ 、
０ u o a で P０は プライ の数であり、1 は、 u 産物に相当する ンドのカウントであり、そして1
o は、 ン中の ンドの カウン である。 定された 値を以下の表に示す。
０191 2 2
Figure imgf000046_0001
11 、 s Paを含有する 的に合成された 片の なる (a d ) ら調製された 2 4 片のPC 物の、dPa P 存在 での イタ ネ タ ケン ングの 果を示す。この 果 ら、化学合成した P を含む 片の 度が、PC 後のビ ク タ ンに影響して ることがわかる。 すなわち、先に求めたPC における s Pa の (99 8 )は した 片の 度に依存して るので、その 99 8 よりもさらに高 と考えられる。
12 2は、 3 co らのPC 物の ガ スゲ により決定された、増幅 率に て 。 PC 物を、4 ガ スゲ 上で検出し、 ジウム イドによ て 色した。そして、 oec a a e X Po ステム Q a O eソ トウ ア( o ad)を用 て された ンドの 度を定量した。 下の式を用 て増幅 率を決定した。 ( C 物の ) (PC のためのインプ、 の ) 、3 4デ タ ト ら した。 きで示してある。
13 3は、プライ を用 た場合の 2 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
14 4は、プライ を用 た場合の 3 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
15 5は、プライ を用 た場合の 4 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
16 6は、プライ を用 た場合の 5 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
17 7は、プライ を用 た場合の 6 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
18 8は、プライ を用 た場合の 7 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
19 9は、プライ を用 た場合の 8 らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
2０ 2 は、プライ を用 た場合の g らのPC 物の、ダイタ ネ タ ケン ングの 果を示す。
21 2 は、大腸 来の ステムにおける アンチ を 含有する のア ノ のスキ を示す
22 22は、7 (2 ) 3 4 S b の ク オ ド 導体のための スキ を示す。 薬及び (a) ク ビス(ト イン) ラジウム、2 (ト スタ ) オ ン、 (b) ラジウム 、ホウ ナト ウム、 タノ 、 チ (c) (d) a 2 デ オキ 3 5 ト オイ ス ペント ラ ク
C (e) 、メタノ (f) ㈲4 4 トキ ト ク 、ピ
)2 テトライソプ ピ ジア イト、テトラゾ 、 C C ( ( 、ピ ジン、次 で ク 、 ク メタン ( ) ( )2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、ビス(ト チ アン ウム)ピ 、
で1 ジン、水、 (5 酸の場 )、1 ジン、 (5 2 4 2 4 ア ド 酸の場 ) ①テトラ j ノ ス、 ク ( )アン ア メタノ 。 o ト オイ 、 4 4 トキ ト 、 c
23 23は、ピ 2 カ ボア デヒド、4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ド 導体、 6 ア ノ 9 (2 デオキ
ン 5 ア ド 酸の合 スキ を示す。 薬及び a) a 2 デオキ 3 5 ト オイ ス ペ ント ラ ク 、C (b)アン ア メタノ (c)4 4 トキ ト ク 、ピ (d)2 ア ソプ ピ ア ノ ク イト、 ソプ ピ チ ア ン、 (e) トンスポ ンジ、P C 、ト メチ 、次 で、ト チ ア ン、ビス(ト チ アン ウ ム)ピ 、 (f) a C 、次 で、2 3 5 ト ベンジ
ク ( ) 、 ク メタン ( )2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、ビ ス(ト チ アン ウム)ピ 、 、次 で、1 ジン、水、 (5 ア ド 酸の場 ) o ト オイ 、 4 4 トキ ト 、 c
24a 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の オ ドの スペクト を示す。 24aは、 6 の ( z OSO d)スペクト である。
。
24b 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24bは、 6 の (27 z OSO d)スペクト (7 9 )である。
。
24c 24は、 7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24cは、 6の スペクト ( OSO d )である。
。
24d 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24dは、 O スペクト ( OSO d )である。
。
24e 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24eは、 6の C (75 z S d)スペクト である。
。
24 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24fは、 6の2 COS スペクト である 。
249 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24 は、 6の2 O S スペクト で ある。
。
24h 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を : 。 24 は、 6の2 SQCスペクト であ る。
。
24 24は、 7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24は、 6の2 Cスペクト である 。
24 24は、7 (2 3 4 5 b ジン( s の ク オ ドの スペクト を示す。 24は、 6の2 Cスペクト ( )である。
。
24k 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す 3
。 24 は 1
、 C (75 z、 OSO d)スペクト である。
。
24 24は、 7 (2 ) 3 4 S b ジン( 5)の ク オ ドの スペクト を示す。 241は、 2 COS スペクト であ る。
。
24m 24は、 7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24 は、 の2 O S スペクト である。
。
24n 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24 は、 2 S Cスペクト で ある。
。
24 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24 は、 2 Cスペクト で ある。
。
24p 24は、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( s)の ク オ ドの スペクト を示す。 24 は、 2 Cスペクト ( )である。
25a 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの スペクト を示す。 25aは、 7の (3 z S d)スペクト である。
25b 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2
3 カ ボア デヒドの ク オ ドの スペクト を示す。 25bは、 7の1 C (75 z S d)スペクト である。
25c 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの スペクト を示す。 25cは、 7の2 COS スペクト である。 25d 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの スペクト を示す。 25dは、 7の2 SQCスペクト である。
25e 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25eは、 7の2
Cスペクト である。
25 25 。 。
は、 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25fは、 7の2 O S スペクト である。
259 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25 は、 8の (3 z S d)スペクト である。
25h 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2
13 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25 は、 合物 8の C (75 z S d)スペクト である。
25 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25は、 合物 8の2 COS スペクト である。
25 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25は、 合物 8の2 O S スペクト スペクト である。
25k 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25 は、 8の2 SQCスペクト である。
25 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 251は、 合物 8の2 Cスペクト である。
25m 25は、ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 ア デヒドの ク オ ドの スペクト を示す。 25 は 7の O スペクト ( OSO d )である。
。
25n 25は ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ドの Rスペクト を示す。 25 は 8の O スペクト ( OSO d )である。
26 26は、デオキ ン 5 ア ド ン酸の
イオン カラム タ ンを示す。 26 の 果、黒 28 の 果である。
27 27は、デオキ ン 5 ア ド ン酸の S ススペクト である。
28a 28aは、デオキ ン 5 Y ア ド ン酸の (27 z O)スペクト である。
28b 28bは、デオキ ン 5 ア ド ン酸の ( g z O)スペクト である。
29a 29aは 7 (2 ) 3 (2 デオキ j
)3 4 5 b 5 ア ド ン ( )と5 ン ( )の (27 z O)スペクト を示す。
29b 29bは 7 (2 ) 3 (2 デオキ j
)3 4 5 b 5 ア ド ン ( )と5 ン ( )のP ( g z O)スペクト を示す。
3０a 3 aは 7 (2 ) 3 (j ) 3
4 5 b 5 ン ( 4)の (3 z O)ス ペクト を示す。
3０b 3 bは (j )ピ 2 カ ボア デヒド 5 ( 9)の (27 z O)スペクト を示す。
。
3０c 3 cは 4 プ ピ (j ) 2 カ ボア デヒド 5 ン ( 2 の (27 z Oスペクト を 示す。 31a 3 aは 7 (2 ) 3 (j ) 3 。 31
4 5 b 5 ン ( 4)の ( g z O)ス ペクト を示す。
31b 3 bは (j )ピ 2 カ ボア デヒド 5 ( 9)の P ( g z O)スペクト を示す。 31c 3 cは 4 プ ピ (j )ピ 2 カ
31
ボ 5 ン ( 2 の ( g z Oスペクト を 示す。
32 32は Sの クト スプ イオント ススペクト ( S
35 4０ 7 2
S)の 果を示 。 C O PS 924・ 7( ) 46 58(2 )
35 4０ 7 2
定値 924 2( ) 46 7 (2 )
。
33 33は 7 (2 ) 3 4 S b の ク オ ド 導体のための スキ を示す。 薬及び (a) ク ビス(ト
ス ィン) ラジウム、2 (ト スタ ) アゾ 、 (b) ラジウ ム 、ホウ ナト ウム、 タノ 、 (c) (d) a 2 デオキ 3 5 ト オイ ス ペント ラ ク C (e)アン ア メタノ (f)4 4 トキ ト ク 、 ピ )2 ソプ ピ ア ノ ク
イト、 ソプ ピ チ ア ン ( ) 、ピ ジン、次 で ク 、 ク メタン ()2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、ビス(ト チ アン ウム) ピ 、1 ジン、水、 o1 ト オイ 、 4 4 トキ ト 、 c
34 34は 2 ト ピ ( )の ク オ ド 導体の スキ を 示す。 薬及び (a) a 2 デオキ 3 5 ト オイ
ス ペントフラ ク C (b)アン ア メタノ (c 4 4 トキ ト ク 、ピ (d 2 ア
ソプ ピ ア ノ ク イト、 ソプ ピ チ ア ン、 (e) 、ピ ジン、次 で、 ク 、 ク メタン (f)2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト
チ ア ン、ビス(ト チ アン ウム)ピ 、1 ジン、水、 o ト オイ 、 4 4 トキ ト 、 c
35 35は 4 (2 ) b 。
2 3 ジン( s) 4 (2 ) 2 3 b ジン( )の ク オ ド 導体のため の スキ を示す。 薬及び (a) CP c、次 で、メタンス ク 、 (b) a C COC C C (c) a 2 デオキ 3 5 ト オイ ス ペント ラ ク 、C C (d) ク ビス(ト イン) ラジウム、2 (ト スタ ) オ ン又は2 (ト スタ ) アゾ 、 (e)アン ア メ タノ (f)4 4 トキ ト ク 、ピ ( )2 チ
ソプ ピ ア ノ ク イト、 ソプ ピ チ ア ン ( ) 、ピ ジン、次 で ク 、 ク メタン ()2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、ビス(ト チ アン ウム)ピ 、1 ジン、水、 o ト オイ 、 4 4 トキ ト 、 c
36 36は (j ) 4 ( オ 。
チンア ド プ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28)のための スキ を示す。 および a) a C 、次 で2 3 5 ト ベンジ ク (b) 、 ク メタン c)3 ( ク ア ド) プ 、テトラキス(ト イン) ラジウム、C 、ト チ ア ン、 (d)4 4 メチ ト ク 、ピ (e)
、ピ ジン、次 で、 ク 、 ク メタン (f)2 ク 4 3 2 ベンゾ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン 、ビス(ト チ アン ウム) ス ト、 、次 で、1 ジン、水、
( ) オチン キ スク ン 、 、炭酸ナト ウム ( 8 6)、次 で 4 4 トキ ト 、 c 。 37 37は、4 ピ 2 カ デヒドの ク オ ドの
(5 z SO d6)スペクト を示す。
38a 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38aは、 24の (3 z SO d6)スペクト である。 38b 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ ノ デヒド( 24の スペクト を示す。38bは、 2 13
4の C (75 z SO d6)スペクト である。 38c 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38cは、 24の2 COS スペクト である。
38d 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38dは、 24の2 O S スペクト である。
38e 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38eは、 24の2 QCスペクト である。
38 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38fは、 24の2 Cスペクト である。
389 38は、 (j ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の Rスペクト を示す。38 は、 24の2 Cスペクト ( )である。
39 39は、 5 (4 4 トキ ト )
4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ ノシ デヒド( 25)の (5 z SO d6)スペクト を示す。
4０ 4 は、 (2 3 チ 4 (3 ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 26) の (5 z SO d6)スペクト を示す。
41 4 は、 (j ) 4 ( ア ノ プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 27)および (
) ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28)の 、 イオン カラ による タ ンを示す。
42 42は、 (j 4 ( ア ノ プ ピ ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 合物27 上のスペクト )お よび (j ) 4 ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28 下のスペクト )の S 1 ススペクト を示す。
43a 43は、 (j ) 4 ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28)の スペクト を示す。 43aは、 28の (3 z O)スペクト
2 で ある。
43b 43は、 (j ) 4 ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28)の スペクト を示す。 43bは、 28の2 COS スペクト である。
43c 43は、 (j ) 4 ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス ト( 28)の
3
スペクト を示す。 43cは、 28の1
( g z O)スペクト で ある。
44a 44aは、ビオチン されたPa P( o Pa P 28)の化 造を 示す。
44b 44bは、 s Pa を用 た 7 によるR 子の ビ オチン に ての、転写および 析の スキ を示す。
44c 44cは、 s Pa を用 た 7 によるR 子の ビ オチン 験で得られた ゲ の 真である。 ン 4はライゲ ョンにより得られた 型、 ン5 2はPC 幅された 型を用 た場合の 果である。 型としては、 6( ン )および対照として co 2( ン3、4、7、8、 、 2)を用 、 o Pa Pの (2 )または
32 非存在 、天然 Ps(2 )ととも転写 応を行 た。 P G Pで 識した。
44d 44dは、ビオチン の 析のための トアッ の 果を示 す 真である。ライゲ ョンにより得られた 型である 6およびPC (2 サイク )された 型である co 2 ら、 o Pa Pを用 て転写された 52 e R 、ならびに、ライゲ ョンにより得られた 型である co 5およ び co 6 ら、ビオチン された P( o P)を用 て転写された、 52 e R をスト プトアビジ 混合した。ビオチン スト プトアビジン 合体と 、 7 アク ア ド 7 ゲ 上で分離され、そして 複合体の ( )を ンドの 度 ら決定した。
44e 44eは o Paまたは を59位に含む 52 e の 析の 果を示す 32
真である。 5 端を で 識された 、 ase ( )また はア カ ( )で部分 した。ア カ した の 部をスト プトア ビジン ビ ズで処理して、 o P 含む ( S )を捕捉 、その りを電気 した。それぞれの 化した アク ア ド 7 ゲ 上で分析した。
45 45は、2 ト ピ の4 ク オ ド 導体の スキ を示 す。 薬及び (a) ヨ ドスク ン 、C (b) プ ピ
ト チン、Pd(PP ) C 、 又は (2 プ ピ ) ク
3 2 2
ア ド、Pd(PP ) C 、ト チ ア ン、 (c) 4 4 トキ ト ク 、ピ (d) 2 ア ソプ ピ ア ノ ク
イト、 ソプ ピ チ ア ン、 (e) 、ピ ジン、次 で ク 、 ク メタン ( ) 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン、 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、ビス(ト チ ア ン ウム) ン 、1 ジン、水、 4 4 トキ ト 、 c 。
46 46は dP P ROX dP P dP Pの スキ を示す。 薬及び (a) C Pd P(C ) 、
6 5 3 4
チ ア ン、室温、次 で、 (2 プ ピ ) 6 ト オ ア ド キサンア ド (b) C、ピ ジン、室温 (c) 、ピ ジン、室温、次 で、 ク 、 ク メタン、 C (d) 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、 ビス( ト チ アン ウム) ン 、 、次 で、1 ジン、水、 、室温 (e) R キ スク ン ステ ( 又は OX)
O・ a C 3 a2CO (
3 P 8 5)、室温、8 間、次 で、 47 47は 2 Pa P Pa P A Pa Pの スキ を示す。 薬及び (a) C Pd P(C 、ト
6 5 3 4
チ ア ン、室温、次 で、 (2 プ ピ ) 6 ト オ ア ド キ サンア ド (b) C、ピ ジン、室温 (c) 、ピ ジン、室温、次 で、 ク 、 ク メタン、 C (d) 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 キサン、ピ ジン、ト チ ア ン、 ビス(ト チ アン ウム) ン 、 、次 で、1 ジン、水、
(e) R キ スク ン ステ ( 又は
) O・ a CO (
3 a2CO3 P 8 5)、室温、8 間、次 で O
48 48は、ク グメントを用 た 製による、ア ノ 素を結合 した P の (55 e )中 の 入のスキ ム びその 果を示す。
49 49は、 7 R ポ メラ ゼを用 た による、蛍光 素を結合した Paの ( 7 e )中 の 入のスキ ム びその 果を示す。
下、実施 によ て 明を具体的に説明するが、これらは 明の 術的 囲を限定するためのものではな 。 業者は本明細書の 基 て 易に本 明に修飾・ 更を加えることができ、それらは 明の 術的 囲に含まれる。 ０193 1 合成
・ 般的な方法及び 料
試薬及び 、標準 な より購入し、さらなる精製な 使用した。 2 ク トグラ ィ (2 C)は、 4 光指示薬( e c )を含む ・ 25 カゲ 6 用 て、転写 応を タ した。 C P ペクト は、J 27 スペクト メ タ (3００ z 6００ z) に記録した。 C18カラム(Wa e s c obo d S e e 5 X g )を備えたG so P C ステム上で、 ク オ ド 製を行 た。 、 クス 25カラム(3 X 5 )
8カラム(S c o a RPP 25 X4 6 c o ec oo es)で、 ン 導体を 製した。
０194 分解 ススペクト ( S) クト スプ イオン ススペクト (
S S)を、 Wa e C ステムを備え X し は J 7 ススペクト メ タ Wa e s イク スZ 4 上に記録した。
、 P 65 スペクト 光計(J SCO)で行 た。
０195 ピ 2 カ ボア デヒド( 39) 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド( 4 )は、先行文献に記載されたよ に合成した。 ０196 2・ 物の 成の
7 (2 ) 3 4 5 b の 、 22に記載の 応によ て行 た。 体的には、7 (2 ) 3 4 5 b ジン( 4)は、2 ア ノ 3 ト 4 ク ジン( 合物 (
4 ) ら3 程で合成した(72 ) (2 ) 3 4 5 b のデオキ ボ ク オ ド( 6)は、 ク 2 デオキ 3 5 ト オイ ス ペント ラノ ス( 42)
4のナト ウム との 応、続 、メタノ アン ウムを用 た化合物5 らの、ト オイ 基の脱 によ て、化合物4 ら 一産物 して収率6 得られた。 ０197 7 (2 チ ) 3 4 5 b の ク オ ド 、2 Cで、 ク 酸を用 て、テトラ j ノ ス 4の 応によ て合成された。 、アン ア メタノ による 護及び P P Cによる精製の 、収率29 得られた。
０198 分解 ススペクト ス ピ によ て、 ク オ ド6 皿の構造 を確認した( ・ 般的な方法及び の 目における 6 皿の スペクト )。 6 の プ トンピ クは、 トを示した 。また、 6 C S Cは、 、 4 5 b ジン 基部分の 3 との間で グ ド 合が形成されて ることを示し た。さらに、 らは、 2 S 2 Cスペクト によ て、 6 の 、 4 5 b ジン環の7位にお て結合し て ることを確認した。 6 皿の ノ 構造は、2 O S
O によ て 体であることが確認された。 O 験の 要な結果は、 プ トンの 、 合物6 皿にお て 、 4 グナ の2 3 強、そして、 2 グナ の8 9 強を与える、 ことである。 O 験にお て、 2プ トンを照射した場合、 グナ の9 強、 2 3 グナ の3 5 強が得られた。よ て、 O 験に基 て、化 合物6 の ノ 構造は、 造と定められた。 6は、定法によ て に変換され、そして、 (6)P の 量体は、 クト スプ イオン スス ペクト メト ( S S)でその 成を確認した。 ピ 2 カ ボア デヒ ド、4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒドの ク オ ド 導体、 6 ア ノ 9 (2 デオキ j ン 5 ア ド ン における三量体の ススペクト を参照)。 4の ク オ ド5 ン酸は、 応の として、定法( 43)で合成した。
０199 ピ 2 カ ボア デヒド( 5) 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド( 6)の ク オ ド 導体の 、 23に記載された反応 によ て 成された。 5 6のデオキ ク オ ド 導体の 、報 告されて る( 39 4 )。 5 6の ク オ ドは、2 3 5 ト ベンジ ク ド( 44) 化合物 5 又は 6のナト ウム との 応、続 、 での 理による ジ 基の脱 によ て合成された。これにより、 2 程で各 7( 5 ) 合物 8( 7 )の ク オ ドが得られた。
０2００ ( 25における 7 8の Rスペクト を参照) 分解 ススペクト ス ピ によ て 7 8の 造を確認した。 7 8の C S Cスペクト は、 素にお て、 ピ 基部分 の間で グ ド 合が形成されて ることを示した。 合物 7 8の ノ 構造は、 ( O S スペクト )によ て確認された。 ０2０1 O S スペクト 験の 要な結果は以下の りである。 プ トンの 、 4 グナ の3 4 強を与えた。 2 ( 又は 3 ) トンが 射された場合は、 5 グナ の9 強が得られた。 合物 7 8の O S スペクト は、 4 、 C Oプ トンの 、並びに 5と 2 ( 又は 3 )の間に、ク スピ クを示した。 て、化合物 7 8の ノ 構造は、 O に基 て、 造と定められた。 合物 7 8の ク オ ドは、定法( 45)によ て、 ボ ク オ ド 5 ン酸に変換 された。
０2０2 ク オ ド 5 ン酸は、先行 術文献( 43 45)に開示の 法に従 て合成した。 5 ア ド ン酸の合 、定法( 43)を変 更して行 た。 9 2 の された ク オ ドを。 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 によ て、 ン した。 された ク オ ド ン 導体を、 ン酸での 理によ て 2 3
、 P ジオ
ク オ ク ン酸に変換さ た。 水での 理の 、得られた 5 ト メタ ン酸を濃アン ア水で処理し、 ク オ ド 5 ア ド ン酸 を与えた。
０2０3 5 ア ド ン酸の精 、 イオン 、 クスカラ ク トグラ ィ P P Cによ て行われた。デオキ ン 5 ア ド ン酸の カラム タ ン クト スプ イオン ススペクト は、 ( 26 27)に示した。 ０2０4 5 ア ド ン酸の合成にお て、デオキ の5 ン酸も形 成され、そして、 の 度の 値 ら、 5 ア ド ン 5 ン との 、4・ 8汀であ た。 22は、デオキ の5 ン P) 比較して速 溶出され、 カラム 製によ て分離された。 5 ア ド ン酸の分 、 S Sスペクト によ て確認した。 22 Pの 差は、 zであ た。 P Cによる最終 製後、 ク オ ド5 ア ド ン 酸を リ チ ア ク として得た。そして Rスペク ス ピ
)によ てその 造を確認した。デオキ ン 5 ア ド 酸 及び 合物6の ン グナ は、 6 7 8の5 ン酸のそ れと比較して、 トした( 5 52 ・ ・ )。この 、グアノ の5 ア ド ン酸でも観察された。
０2０5 3・ 成の 体的な説明
( )2 ア ノ 3 ト 4 (2 ) ジン( 2)
(5 )中の2 ア ノ 3 ト 4 ク ジン( )(
4 )( 74 O o1) ク ビス(ト イン) ラジウム(1 )( 35 、 ・ 5 o)の 、ア ン 囲気 2 (ト スタ チオ 。
ン(3 8 2 o)を えた。 られた 合物を Cで4 した。 合物を水(25 )に注ぎ、そして、 チ (25 X3)で 出した。 O 上で乾燥さ た後、 減圧 で留 した。 、 チ ン チ
汀 ら49 として る ラッ カゲ ク トグラ に装填 した。 2・ 7 の 2( チ ン チ 9 上で fO 3 )が の 率で得られた。
０2０6 (27 z C C ) 6
8 7(d J 5 z)
7 4(dd J 5・ z)
7 2 dd J 3・ 6 z)
7 7(dd J 5・ 3 6 z
6 77(d J 5 z) 5 66(bs 2 ) ０2０7 S ( 3 ト ックス)
C OS ( ) 222 337 222 337
9 8 3 2
０2０8 (2)2 3 ア ノ 4 (2 ) ジン( 合物3)
3 タノ 65 1の チ 中の、 2(2 6 、9・ o)と46 6 ラジウム ( )との 合物に、28 1の ウ ナト ウム 溶液を Cで加えた。 られた 合物をOCで した。 合物に43 1の5 アン ウム 溶液を加えた。 合物を、セライトで 過した。 5 の水を加えた。 タノ チ を 発さ た後、混合物を チ で 出した(25 ) 上で乾燥さ た後、 した。 、 チ ン チ ( 9汀 ら93 7)を にして ラッ カゲ ク トグラ ィ にて精製した。 ・46 の 合物3( チ ン チ 9 上 で fO 24)が82 率で得られた。
０2０9 (27 z C C ) 6
7 64(d J 5 z)
7 4 (dd J 5・ z)
7 23(dd J 3・ 5 z)
7 4(dd J 5・ 3 5 z)
6 74(d J 5 z)
4 26(bs 2 ) 3 72(bs 2 )
０21０ S ( 3 ト ックス)
C S ( ) 92 595 92 588
9 ０ 3
０211 (3)7 (2 ) 3 4 5 b ジン( 4)
3(956 、5・ O o)の ( 5 )を、 2 間、環 した。
合物 、 上で、24 1の28 O を加えた。 られた 過し、 O テ で 、そして6 Cで 2 さ て7 (2
) 3 4 5 b ジン(97 96 )を得た。
０2 2 (3 z S d
3 2 (s ) 8 48(s ) 8 3 ( 2 ) 7 78(dd J ・ 5 z)
7 54(d J 5 z)
7 25(dd J 3・ 8 4 g z)
０213 C (75 z S ) 6
3 2 28 28 7 29 24
3 3 6 37 6 43 44
44 9 48 66
０214 S ( 3 ツクス)
C ( ) 2 2 439 2 2
０ 8 3 444 ０215 (4)7 (2 ) 3 2 デオキ 3 5 (ト オイ )
3 4 5 b ジン( 5)
4(4 3 2 O o) C C (32 )に a (g6 2 4 、鉱油 6 )を加えた。 られた 合物を
した。 合物に 2 デオキ 3 5 ト オイ
ス ペント ラ ク ド(933 、2・4 o)( 42)を加え た。 2・ 5 した後、反応 合物を 水によ て分離した 。 塩水で3 し、 上で乾 さ た後、 で留 した 。 カゲ カラ ク トグラ ィ (C 1 、 ・ 5 メタノ )によ て産物を 製し 5を得た(7 4 65 )
０216 (27 z C C ) 6
8 32(d J 5 3 z) 8 26(s )
8 6(dd J 3・ 8 2 z)
7 93( 4 ) 7 5 (dd J 5・ 2 z)
7 47(d J 5 3 z) 7 22( 5 )
6 68(dd J 8・ 6 5 8 z)
5 82( ) 4 69( 3 )
3 8(ddd J 4 2 8・ 6 6 4 z
2 86(ddd J 4 2 5・ 8 2 O z) 2 43(s 3 ) 2 37(s 3 )
０217 S ( 3 ツクス)
C OS ( ) 554 75 554 748
3 28 3 5
０218 (5)7 (2 ) 3 (2 デオキ j ) 3
4 5 b ジン( 6)
。
・ 33 (2 4 o)の 5に OCでアン ア メタノ ( 2 )を 加えた。 液を 2 した。 、 、 、塩化メチ タノ (97 3 ら93 7)を として ツ カゲ ク トグラ ィ で 製した。 7 の 6が94 率で得られた。
０219 (3 z SO d) 6
8 75(s ) 8 35(d J 5 z)
8 3 (d J 3 7 z) 7 83(d J 5 z)
7 65(d J 5 z) 7 28( J 4 2 z)
6 54( J 6 g z) 5 34(d J 4 z)
5 ( J 5 7 z) 4 46( )
3 9 ( ) 3 6 ( 2 )
2 8 ( ) 2 37( )
０22０ C (75 z SO d) 6
47 44 4 43 62 37 6
32 3 29 78 29 6
28 7 3 93 87 88 83 72
7 8 6 74 39 4
０221 S ( 3 ツクス)
C OS ( ) 3 8 9 2 3 8 9 5
5 6 3 3
０222 a 3
4
E 2・ 25 ン ナト ウム 6・ 8 。
０223 (6 7 (2 3 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト
3 4 5 b ジン( 7) 6の3 7 ( O o)部分を、乾燥ピ で3 さ た。これに、5 の ピ を加え、さらに、 トキ ト ク ド(356 、 ・ o) を加えた。 合物を 一晩 した後、水(5 )に注ぎ、 チ ン(5 )で 出した。 上で乾燥さ た後、 減圧 で留 した。 、 チ ン チ (9汀 ら 3 7)を として ラッ カゲ ク トグラ ィ にて精製した。 の 7を89 率で得た。
０224 (27 z C C
8 29(d J 5 z) 8 22(s )
8 7(dd J 3・ 8 z)
7 49(dd J 5・ z)
7 44(d J 5 z) 7 37( 2 )
7 27( 5 ) 7 2 ( 3 ) 6 78( 4 )
6 57(dd J 6・ 5 6 2 z)
4 66( ) 4 2( ) 3 75(s 3 )
3 75(s 3 )
3 42(dd J ０ 4 6 z)
3 38(dd J ０ 5 4 z)
2 86( )
2 56(ddd J 3 8 6・ 5 4 6 z)
2 6(d J 3 5 z)
０225 S ( 3 ト ックス)
C OS ( ) 62
4 3 5 22 9 62 223
36 3
０226 (7)7 (2 ) 3 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト )
3 4 5 b 2
ソプ ピ イト( 8)
7(425 、O・ o)を、無水ピ で3 、次 で、無水アセ ト で3 、共 た。これを無水アセ ト (4 6 1 中に溶 し、262 1( ・ 8 2 o)の2 テトライソプ ピ イト、 ・45 テトラゾ の ト ( 68 1)を加えた。この 合物を した。 合物に9 1の メタノ を加えた後、混合物を水(5 )に注ぎ、 ト チ ア ン( )を含む チ ン(5 X3)で 出した。 上で 乾燥さ た後、 減圧 で留 した。 、2 ト チ ア ン( )を含 む、 キサン チ (4汀 ら3 2)を として ラッ カゲ ク トグラ ィ で 製した。49 の 8を87 率で得た。
０227 (27 z S d
8 65( ) 8 27( ) 8 23( )
7 8 ( ) 7 62( ) 7 26( 3 )
7 8( 7 ) 6 75( 4 ) 6 54( )
4 8 ( ) 4 3( )
3 84 3 4 ( ) 3 2 ( 3 )
2 82 2 4 ( 3 ) ( 2 )
3
０228 P ( g z S ) 6
48 76 48 4
０229 S ( 3 ト ックス)
C OSP ( ) 82 3298 82 3325
45 5 5 6
０23０ (8) (2 ) 3 (2 デオキ 3
) 3 4 S b ジン( 9)
7( 24 、 ・ 2 o)を無水ピ で3 、共 した。これを無水ピ ジン(2 )で し、さらに38 1( 4 o)の 酸を加えた。 られた 合物を、室温で2 した。 合物を水(5 )に注ぎ、 チ ン(5 )で 出した。 上で乾燥さ た後、 減圧 で留 した。 2 の チ ンに し、これに Cで2 の ク 酸を加えた。 合 物を2Cで 5 した後、8 1の 酸水素ナト ウム 溶液に注ぎ、これに 42 1の水を加え、 チ ン(5 X3)で 出した。 上で乾燥さ た後 、 減圧 で留 した。 、 チ ン チ (9汀 ら32を として ラッ カゲ ク トグラ ィ にて精製した。 の 合物9 を88 率で得た。
０231 (27 z C C ) 6
8 29(d J 5 4 z)
8 8(dd J 3・ 8 z)
8 3(s ) 7 53(dd J 5・ z)
7 5 (d J 5 4 z)
7 2 (dd J 5・ 3 8 z
6 69( ) 6 37(dd J 5 4 z)
5 58( ) 4 28( ) 3 96( 2 )
3 32(ddd J 5 9 5 g z)
2 4 ( ) 2 2(s 3 )
０232 S ( 3 ツクス)
C OS ( ) 36 8 36 993
7 8 3 4
０233 (9) (2 ) 3 (j ) 3 4 5 b ジン( )
4(8 、 4 o)、テトラ j ノ ス( 3 O 、 ・4 o) ク (2 )の 2 Cで5 間加熱した。 ら れた暗色の にメタノ アン ア(4 1)を加え、室温で 8 した 。 減圧 で留 、 3 C C を加え、そして、産物を逆 P Cによ て精製して化合物 を得た(3g 29 2 )。
０234 (3 z SO d) 6
8 78(s ) 8 36(d J 5 2 z)
8 3 (dd J ・ 3 7 z)
7 84(dd J ・ 9 5 z)
7 66(d J 5 2 z)
7 28(dd J 3・ 7 5 O z)
6 8(d J 5 8 z 5 49(d J 6 O z
5 26( J 6 5 z) 5 2 (d J 4 g z) 4 67( J 5 8 z) 4 2 ( J 4 g z)
4 ( ) 3 7 ( ) 3 59( )
０235 C (75 z SO d) 6
47 29 44 7 43 9 37
32 3 3 8 29 86 29 4
28 4 2 87 76 85 57
73 48 7 43 6 43
０236 S ( 3 ツクス)
C OS ( ) 334 862 33 87
5 6 3 4 4
０237 ( )7 (2 ) 3 5 (4 4 トキ ト ) j
。
3 4 5 b ジン( 2)
(gg 、O o)を無水ピ で3 、共 、そして ジン(3 )中に溶 した。この 夜に、4 4 トキ ト ク ド( 6 、 ・ 3 o)を加え、混合物を 2 した。 合物を5 a CO に注ぎ、そして で 出した。 塩水で3 O で乾 さ 、そして溶媒を減圧 で留 した。 物を カゲ カラ ク トグラ ィ ( メタノ C C )で 製 2を得た
( 3 7 )
０238 (6 z C C ) 6
8 39(s ) 8 28(d J 5 2 z)
8 25(d J 3 4 z) 7 52( 2 5 7 z)
7 22( 2 ) 7 4( 7 ) 6 69( 5 )
6 4(d J 6 2 z) 4 77( )
4 48( ) 4 34(d J 4 6 z)
3 7 (s 6 ) 3 46(dd J 3・4 5 z)
3 23(dd J 2・ 9 5 z)
０239 S ( 3 クス
C OS ( ) 636 2 68 636 2 73
36 34 3 6 ０24０ ( )7 (2 ) 3 (2 3
) 3 4 5 b ジン( 3)
2( 2 、O・ o)を無水ピ で3 、共 した。これを無水ピ ジン( g )に し、さらに7 1( 76 o)の 酸を加えた。この 合 物を、室温で7 した。 合物を5 a CO (5 ) チ (5 だ。 和食塩水で した。 で有機 さ た 後、 減圧 で留 した。 で2 した後、C C ( に
2 2
し、 9 1の ク 酸を Cで加えた。この 合物を Cで 5 した。 合物を5 a CO 3に注ぎ、C 2 2 出した。 和食塩水で 、そして、 で有機 さ た後、 減圧 で留 した。 物を、2 メタノ チ ン 液を として ツ カゲ ク トグラ にて精製した。 77 の 3を93 率で得た。
０241 (3 z SO d) 6
8 79(s ) 8 37(d J 5 2 z)
8 29(dd J ・ 2 3 7 z)
7 84(dd J ・ 5 z)
7 68(d J 5 2 z)
7 27(dd J 3・ 7 5 z)
6 38(d J 6 8 z)
6 2(dd J 5・ 6 6 6 z)
5 54( 2 ) 4 26( ) 3 7 ( 2 )
2 4(s 3 ) 98(s 3 )
０242 C (75 z SO d) 6
69 55 69 22 46 98 44 39
43 85 36 74 32 5 3 2
3 29 32 28 4 4 36
85 2 83 63 72 34 7 23 6 5
2 44 2 3 ０243 S ( 3 ト ックス)
C OS ( ) 4 8 73 4 8 49
9 2０ 3 6
。
０244 ( 2) (j ) 2 カ ボア デヒド( 7) 。
2 カ ボア デヒド( 、3・ o)のC ( 8 1)に、 a (6 分散 、 、3・ o)を 、室温で45 した。
で、これに2 3 5 ト ベンジ ク ド(3 o)(
44のC ( 8 1を加えた。 合物を 4 した。 物を チ び水で分離し、そして、有機 和食塩水で3
aSOで乾燥さ た後、減圧 した。 、 カゲ ク トグ ラ ( キサン中の2 チ によ て溶出)で 製し (2 3 5 ト ベンジ )ピ 2 カ ボ ア デヒド(5 6 )を得た。 (2 3 5 ト ベンジ )ピ 2 カ ボ ア デヒド(5 6 、 ・ O o)をト ンで した後、残 C
。
( 7 1)を えた。この 78Cで ( 、3・ )を 、2・ 5 次 で5 メタノ C 1 (25 )を えた。 液を 78。Cで した後、28 ( 5 )を加えた。 で、反応 合物を、室 温に達するまで した。 物を C 2 2 2Oによ て分離し、そして C 3 、減圧 した。 物を逆 C 8 P Cで 製し (B )ピ 2 カ ボア デヒドを得た( 8 5 2 )。
０245 (27 z SO d) 6
9 54(s ) 7 74(s )
7 6(dd J ・ 6 4 O z)
6 39(d J 4 3 z)
6 3 (dd J 3・ 4 O z)
5 27(d J 5 6 z)
5 5(d J 4 g z
5 ( J 5 3 z) 4 2( 2 ) 3 85( ) 3 52( 2 )
０246 C (75 z S ) 6
79 4 3 68 28 24 24 94
23 89 34 84 33 75 64
69 5 6 82
０247 S ( 3 ツクス)
C０ 4 O5 ( 228 872 228 863
０248 ( 3)4 プ ピ ( )ピ 2 カ ボア デヒ ド( 8)
4 プ ピ (j )ピ 2 カ ボア デヒド( 8)は、 7の 法と同様に、4 プ ピ 2 ピ ア デヒド( 6)( 4 )(266 、2・ O o) ら 成された。 P P Cで 製して、 8が得られた(3g 7 2 )。
０249 (3 z SO d) 6
9 5 (s ) 7 9 (s )
7 9(d J 8 z) 6 32(d J 3 6 z)
5 32(d J 5 5 z) 5 7( J 5 2 z)
5 5(d J 4 2 z) 4 ( )
3 86( )
3 66(ddd J 3・4、5・ 3 g z)
3 55(ddd J 3・ 6、4・ 9 2 z)
97(s 3 )
０25０ C (75 z S ) 6
79 6 3 5 3 43 26 3
6 22 89 62 85 26 84 49
75 86 73 7 69 3 6 53 3 79
０25 S ( 3 クス
C3 6 O5 ( ) 266 28 266 23 ０252 ( 4)7 (2 ) 3 4 5 b の ク オ ド 5 ン酸の合
された ク オ ド( o、 合物9又は 3)を で して乾燥さ た。 ジン( OOu ) キサン(3 4 に溶解した。これ に、 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン ジオキ サン ( O 、 ・ o)を えた。 後、 ・ 5 ビス(ト チ アン 。
ウム ン ト チ ア ン( (3 1、 ・ o 液を反応 合物に素早 えた。この した。 で、こ れに ピ (98 2、 )(2 ) 液を加えた。 5 後、 5 1の5 a SO 液を 、次 で5・ の水をこれに加えた。 液を 3 した後、2 の アン ア水を加えて、室温で2 間、アン ノ を行 た。 減圧 で留 、産物を 、 クス( 5)カ ラ ク トグラ ィ (5 ら の 配によ て溶出)で 製し、 次 でC 8 P Cカラム( ら3 oのC OO ト チ ア ン ウム の 配によ て溶出)で 製し、 ク オ ド 5 ン酸 を得た。
０253 7 (2 ) 3 (2 デオキ ) 3 4 5 b 5 ン ( )
(27 z O) 6
8 5 (s ) 8 9(d J 5 3 z)
7 78(d J 3 6 z) 7 56(d J 4 g z)
7 36(d J 5 3 z) 7 2( J 4 g z)
6 4 ( J 7 3 z) 4 6( )
4 4( 2 ) 3 ( 8 J 7 3 z)
2 72( ) 2 46( )
9( 27 J 7 3 z)
3
０254 P ( 9 z O
9 9 (d P J 2 z) 72 d P J 2 z)
22 5 ( P J 2 z)
０255 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O PS 555 97 ( ) 555 69 ( ) 15 8 3 2 3 ０256 7 (2 ) 3 (8 ) 3 4 5 b
5 ン ( 4
(3 z O) 6
8 74(s ) 8 32(d J 5 4 z)
8 (d J 3 5 z)
7 68 dd J ・ 5 z)
7 64(d J 5 z)
7 25(dd J 3・ 5 5 z)
6 25(d J 6 O z)
4 82( ) 4 57( ) 4 36( )
4 2 2 ) 3 8 J 7 3 z)
9( 27 J 7 3 z)
3
０257 P ( g z O) 6
9 8 (d P J 2 z)
3(d P J 8 g z)
22 7 ( P J 2 8 g z)
０258 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O PS 57 97 ( ) 定値 57 74 ( ) 15 8 3 3 3 ０259 ( 5)アデ ン又は7 (2 ) 4 5 b ジン( 4 3、47 48)の ク オ ド 5 ア ド ン酸の合
された ク オ ド( o 2 46又は 9 を で して乾燥さ た。 ジン( 1) キサン(3 41 液中に溶解した。これに 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 の キサン ( 、 ・ o1)を えた。 後、 ・ 5 。
ビス(ト チ アン ウム) ン (3 、 ・ o) ト チ ア ン( 4 の 液を、反応 合物に素早 、室温で した。 で、 ピ (98 2、 ) (2 )を加えた。 5 後、 5 u の5 a SO 液を加えた。 減圧 で留 した後、残 2 1の28 アン ア水を えた。 6 。Cで5 (デオキ の5 ア ド ン酸の場 )、又は室温で2 ( 6の5 ア ド ン酸の場 )、アン ノ を行 た。 減圧 で留 した後、産物を デッ クス( 5)カラ ク トグラ ィ (5 ら の 配によ て溶出)で 製し 次 でC 8 P Cカラム( ら3 oのC O ト チ アン ウム の 配によ て溶出)で 製し ク オ ド 5 ア ド 酸を得た。
０26０ 6 ア ノ 9 (2 デオキ j ) ン 5 ア ド ン ( 合物22)
(27 z ) 6
8 35(s ) 8 (s )
6 37( J 6 g z) 4 6( )
4 3( 2 ) 3 5( 8 J 7 3 z)
2 7 ( ) 2 48( )
3( 27 J 7 3 z)
3
０261 P ( g z O) 6
5 (d P J 9 5 z)
77(d P J 9 5 z)
22 4( P 2 z)
０262 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O P 489 ( ) 488 98 ( ) ０ 7 6 3 ０263 7 (2 ) 3 (2 デオキ j ) 3 。
4 5 b 5 ア ド ン ( の ア ド ン )
(27 z O) 6
8 57(s ) 8 6(d J 5 3 z)
7 85(d J 3 6 z) 7 58(d J 4 g z)
7 45(d J 5 3 z) 7 5( J 4 6 z)
6 48( J 6 g z 4 8(
4 5( 2 ) 3 3( 8 J 7 3 z)
2 75( ) 2 5 ( )
( 27 J 7 3 z)
3
０264 P ( g z O) 6
5 (d P J 2 z)
75(d P J 9 5 z)
22 ( P J 2 8 z)
０265 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O P 554 99 ( ) 555 ( ) 15 9 4 3 ０266 ( 6)ピ 2 カ ボア デヒド 4 プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド( 45)の ク オ ド 5
( )ピ 2 カ ボア デヒド( o)( 7)又は4 プ ピ (j )ピ 2 カ ボア デヒド( o)( 合物 8) プ トンスポンジ( 、O・ o)を含む メ チ 。
ン (5 は )に、OCでP C ( 2は1、 ・ o)を加え、O。Cで2 した。 合物に チ ア ン( 2 、 ・ o)を加え、次 で、これに、 ・ 5 ビス(ト チ アン ウム) ン ( 、 ・ o) の 液を加えた。 5 後、 ・ 5 酸水素ト チ アン ウム 溶液( 5 を加えて、反応を終了した。 られた 物を、 、 クス( 25)カラ ク トグラ ィ 5c X3 c 5 ら の 配によ て溶出)で 製し 次 でC 8 P Cカラム(S c o a RPP c o ec oo e ら3 oのC O ト チ アン ウム の 配によ て溶出)で 製した。
０267 ( )ピ 2 カ ボア デヒド 5 ン (
9)
(27 z ) 6
9 28(s ) 7 64(s )
7 ０8(d J 3 g z)
6 45(d J 4 z) 6 32( )
4 32( 2 ) 4 ( 3 )
3 ０3( 8 J 7 3 z)
( 27 J 7 3 z
3
０268 P ( g z ) 6
5 (d P J 9 5 z)
3(d P J 2 z)
22 9 ( J 2 z)
０269 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C 6 O P3 465 97 ( ) 465
4 85 ( ) ０ ０27０ 4 プ ピ (B )ピ 2 カ ボア デヒド 5 ン ( 2 )
27 z 6
9 28(s ) 7 7 (s ) 7 8(s )
6 4 (d J 4 O z) 4 3 ( 2 )
4 3( 3 ) 3 6( 8 J 7 3 z)
86(s 3 ) 4( 27 J 7 3 z)
3
０271 P ( g z O) 6
(d P J 9 5 z) 2(d P J 9 5 z)
22 8 ( P J 2 z)
０272 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O P 5 3
3 99 ( ) 5 3
3 94 ( ) 8 4 ０273 1 合成 2
・ 7 (2 ) 3 4 5 b ジン( 4)( )の ク オ ド 導体の ( 33)
基の導入の (a)に2 (ト スタ ) アゾ を用 た以外 は、 22に示した 7 (2 ) 3 4 5 b ジン( 1 の 4)( s)の ク オ ド 導体の 成と同様に行 た。
０274 ただし、ア イト ( )に ては、実施 3(7)の7 (2 ) 3
2 デオキ 5 (4 4 トキ ト ) j 3
4 5 b 2 ソプ ピ
イト( 8)の 成で 2 テトライソプ ピ イ ト、 ・45 テトラゾ の ト 液を用 たが、本実施 では、2 。 ソプ ピ ア ノ ク イト、 ソプ チ ア ン、 を用 た。 異なるが、生成する は同じである。 ０275 2 2 ト ピ ( )(P )の ク オ ド 導体の ( 34)
( ) (2 デオキ ) 2 ト ピ ( 3)の 2 ト ピ ( )( 49)(224 2・ O o)を ト (2 )に溶解さ 、 (8 6 分散 2・ O o)を加えた。
3 した後、2 デオキ 3 5 ト オイ
ス ペント ラ ク ド(855 2・ 2 o)を加えて 2 し た。 液を チ 水で 、有機 を水と 和食塩水で した。
を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で 製して化合物2を 722 (78 ) 。 2(722 )にメタノ ックアン ア(5 1)を加えて オイ 基の脱 護を 2 間で行 、 カゲ カラ で 製後、最終 製を P Cで行 3を2 (82 ) 。
０276 3 (27 z SO d6) 6
7 76(bs ) 7 26(dd J ・ 6 3 6 z)
6 59( J 5 g z) 6 3 ( J 3 6 z)
5 27(d J 4 3 z) 5 3( J 5 3 z)
4 23( 3 85( 3 59( 2
2 42( ) 2 9( )
０277 クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O 227 7 ( ) 定値 227 3 ( ) 9 5 2
C O 229 8 ( ) 定値 229 6 ( ) 9 3 5 2
０278 (2) 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト ) j
2 ト ピ 2 ソプ ピ イト( 5)の
3(228 ・ O o)を で した後、ピ ジン( )を 4 4 トキ ト ク ド(373 ・ o)を えて し た。 液を チ 5。 a CO 溶液で し、有機 塩水 で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で 製 して 合物4を493 (93 ) 。
。 ０279 4(265 ・ 5 o) 。
を で した後、 (2 5 ) チ ア ン( 3 1 ・ o)を加えた 夜に 2
ソプ ピ ア ノ ク イト( 23 1 ・ o)を えて した。 メタノ (5 )を加え チ (2 )で希釈し 5。 a CO を加えて した。 塩水で 、無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製して、 5 を 5 (86 ) 。
０28０ (3 (2 デオキ 2 ト ピ 5 ン
( 合物7)の 4( 5g O・ o)を で した後、ピ ジン(3 1)を加え、無 水 (57 ・ o)を加えて反応 液を 2 した。 液 を チ 5 a COで 5 a CO 溶液で した。
を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 ト ンで した後、塩 チ ン3 に 溶解さ た。この ク (3 4 を Cで加えて 5 間、 Cで した。 5 a CO 溶液を反応 加えて 、有機 5 a C で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製して 6を73 (9 ) 。
０281 6( O・ o)を で した後、ピ ジン( 5 4 キ サン(45 ) えた後、 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ォ 4 オン( 8 キサン )を加えて した。ト チ ア ン( 5 ビス(ト チ アン ウム) ン (45 ・ 5
)を反応 加えて した。 ジン(3 ピ ジン O 98 2 )を加えて 5 、5 a SO 溶液(22 5 )を加えて反応 液を濃縮した。 (7 5 )を加えて 3 、 28 アン ア水を3 1 えて 2 した。 液を濃縮、凍結 した Se ade 5で (5 ら ・ O
) 、 P Cで最終 製を行 目的とする化合物7を得た。
０282 7
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O P 466 97 ( ) 定値 466 7 (
9 4 4 2 3 ０283 3・ 4 ( ) 2 3 b ジン( s) 4 ( )
2 3 b ジン( )の ク オ ド 導体の ( 35) ( )4 ド 2 3 b ジン( 合物3)の
2 3 b ジン( )(5 3 45 o)を チ (45 )に溶解し、 チ (3 )に溶解した タ ク 安息香酸( 4 54 o) 液を Cで しながら 間 けて して えた。 室温で3 後、 Cで した。 、 チ で 、減圧 で乾燥した。こ れを (3 )に溶解 、 3 Oを Oになるまで加え、室温で 間、 でで した後、沈 テ で して オキ を3・ 5 (58 ) 。 オキ (3 O 2 o)を ( )に溶解し5 Cで加熱した 。メタンス ク ド(4 7 1 6 o)の (6 4 1) 液を7 Cで 、この 液を75Cで2 した。 液を氷に加えた後、 Cで O の aO を用 て中和した。 、生成した して水で した後、6 Cで減圧 して目的とする化合物2を2・ 7 (8 ) 。 ０284 2(2 7 8 o) a ( 3 88 o)を ト (28 1)に溶解 し、室温で しながらC C C1(3 5 5 o)を加えた。 液を C で 2 間加熱した。 液を 温に戻した後、 溶液(28 1)と a SO3 溶液(28 1)を順次 えて 5 した。 チ を 加えて 、有機 和食塩水でさらに洗浄した。 を無水硫酸ナト ウム で乾燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製し 4 ド チ ピ 2 3 b ジン(2 O )ならびに4 ド 2 3 b ジン( 合 物3)(2 3 )を得た。4 ド チ ピ 2 3 b ジン(2・ 7・ o)は タノ (7 )に溶解し、メタノ 中の28 ナト ウムメト キ ( 4 1 7・ O o)を加えて 間加熱 流した。 液を濃縮 、 チ アン ウムク ド 溶液で 、有機 アン ウムク ド 溶液で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、先に得られた 3(2 3 )とあわ て タノ で再結 して化合物3(4 0 92 )を得た。 ０285 (2) 2 デオキ 3 5 (ト オイ ) j
4 ド ピ 2 3 b ジン( 4)の
3(95 3・ g o)の ト (39 ) 、 a ( 56 6 分散 3・ g o)を加えた。 した後、 2 デオキ 3 5 ジ ト オイ ス ペント ラ ク ド( 8 ・ 2 を加えて ・ 5 した。 液を チ ア ク ク ド 溶液で 、有機 アン ウムク ド 溶液と 和食塩水で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で 製し て 4を ・ 8 (77 ) 。
。
０286 (3) (2 デオキ ) 4 (2 ) 2
3 b ジン( 7)および (2 デオキ ) 4 (2 の 。
2 3 b ジン( 8)の
4(7 5 ・ 2 o) ク ビス(ト ス ィン) ラジウム(4 2 ・ 6 o の ( 2 (ト スタ オ ン(6 ・ 8 o)を加えて Cで した。 液を チ 水で 分 、有機 を水、次 で、飽和食塩水で した。 を無水硫酸ナト ウム で乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で 製して 5を586 (88 ) 。 ０287 5(58 )にア ア メタノ (5 )を えてト オイ 基の脱 護を 2 間で行 、 カゲ カラ で 製後、最終 製を P Cで行 7を3 4 (9 ) 。
０288 6および 8の 、2 (ト スタ ) アゾ を用 た以 外は同様に行 た。 4(6 ・ O o) ら 成し ( 449 8 ) 8(245 97 )を得た。
０289 7 (3 z SO d6) 6
8 27(d J 5 z) 7 87(d J 3 8 z)
7 83(d J 3 6 z) 7 79(d J 5 z)
7 4 (d J 5 O z)
7 28(dd J 3・ 7 5 O z)
6 93(d J 3 8 z)
6 76(dd J 6・ 8 2 z)
5 28(d J 4 z)
5 2( J 5 6 z) 4 39( )
3 85( ) 3 56( 2 ) 2 57( )
2 26(
０29０ 8 (3 z SO d6) 6 8 38(d J 5 z) 8 3(d J 3 2 z)
8 d J 3 z 7 6 d J 3 7 z
7 72(d J 5 z) 7 5(d J 3 7 z)
6 79(dd J 6・ 8 O z)
5 29(d J 4 O z) 4 5 ( J 5 5 z)
4 4 ( ) 3 86( ) 3 57( 2 )
2 58( ) 2 26( )
０291 (4) 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト ) j
。
4 (2 ) 2 3 b 2
ソプ ピ イト( ) 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト ) j 4 (2 ) 2 3 b 2 ソプ ピ イト(
2)の
7(3 ・ g o)を で した後、ピ ジン(g )を 、4 4 トキ ト ク ド(386 ・ o)を えて し た。 チ 5。 a CO で分 、有機 塩水 で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で 製 して 9を57 (97 ) 。
。
０292 9(2g O・ o)を で した後、 (2 4 1) ソ プ ピ チ ア ン( 23 1 ・ 7 o)を加えた 夜に
2 ソプ ピ ア ノ ク イト( 5 ・ o を加えて した。 メタノ (5 を加え チ (2 )で希釈し5。 a CO を加えて した。
塩水で し、無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製して を345 (9 ) 。
０293 様に および 2の 8(22 ・ 7 o) ら 成し (424 99 ) 合物 2(227 86 )を得た。 ０294 (5) (2 デオキ ) 4 (2 ) 2 3 b 5 ン ( 5)および (2 デオキ j
) 4 (2 ) 2 3 b 5 ン ( 6)の
9(2 ・4 o)を で した後、ピ ジン(4 1)を加え、無 水 (75 ・ o)を加えて反応 液を 2 した。 液 を チ 5 a CO 溶液で 、有機 5 a CO 溶液で した。この を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 ト ンで した後、 残 チ ン4 に溶解さ た。この ク (4 4 を でで加えて 5 間、 Cで した。 5 a CO 溶液を反応 加えて 、有機 5 a CO 溶液で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾 燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製して 3を 25 (87 ) 。
０295 3(36 O・ o)を で した後、ピ ジン( 4 キ サン(3 ) えた後、 2 ク 4 3 2 ベンゾ ス ィン 4 オン( キサン )を加えて した。ト チ ア ン( ) ビス(ト チ アン ウム) ン (3 ・ 5 )を反応 加えて した。 ジン(2 ピ ジン O 98 2 )を加えて 5 、5 a SO 溶液( 5 を加えて反応 液を濃縮した。 (5 )を加えて 3 、 28 アン ア水を2 えて 2 した。 液を濃縮、凍結 した
Se ade 5で (5 ら ・ O 配し、 P Cで最終 製を行 目的とする化合物 5を得た。
０296 様に化合物 4および 6の (2 ・ 34 o) ら 成し 4( 8 89 ) 6( o スケ )を得 た。
０297 5
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O PS 554 98 ( ) 55
6 8 2 2 3 4 73 o ０298 6
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O PS 555 97 ( ) 定値 555
3 3 82 ( 5 7 2 ０299 111 物学的実験
・
実施 では、 に明記しな 限り以下の 法を用 た。
０3００ e o"を用 た ク オ 入実験
ク オ 入実験を、文献にしたが て行 た( 3 32) 5 端を6 オ セインで 識したプライ (2 e )を (35 e )と、2 C 2 T 、および ・ ア ンを含有する O s C (P 7 5) 中で、 Cの や な4C の 却によりア した。プライ X ク ア 性を欠 グメント( e o、 e s a S )の (2 ) 混合した。 合物を2 インキ ベ ト 、次 で、 d P (3fX )をこの 加えて、 Cで反応を開始した。 用した 素の (5 5 O )、反応 ( 35 )、およびd Pの ( 3 5 X を調節 、 25 下の を与える条件で測定を行 た。 応を 4 のストップ (9 5 ホ ムア ドおよび2 )で停止し、そして混合物を直ちに75Cで3 間加熱した。 物をGe eSca ソ トウ ア( ジョン3・ )を装備した自動 377 ク ンサ で解析した( 32)。 ( )を反応の 囲を反応 間で割ること[こより 算し、そして使用した 素濃度に対して 素 濃度を標準 した(2 )。 力学 ( および )
M m を d P に対する d P の ネス ウ プ ット ら 。 数を、3な し8のデ タセット ら した。
０3０1 を用 たプライ
5 プライ (23 e および (35 e の 、 4 C および 2 T を含有する2 s C (P 7 5) 中でア した。 (4 5 )を 上で5 d P (2f ) 混合し、次 で、これに、 e o ( ット)または e o ( ット)( A R勺を含有する酵素 ( 1)を加えることで反応を開始した。 液を C で3または5 インキ ベ ト 、そして s 塩、2
、および ・ 5 P を含む ( )を添加することにより、反 応を終結さ た。この 液を直ちに75Cで3 間加熱し、次 で 5 アク ア ド 7 で電気 した。ゲ 上の産物を、 イオイメ ジ グアナライザ ( デ S25 )で解析した。
０3０2 ケン ング
ジデオキ サイク ケン ング (2 4 を、 o dPa Pの ま たは非存在 、 ・ 3 o および4 o17ライ またはプライ 2を含 有する8 の ead Reac o ( e ed os s e s)で、 P C Po a e a Co o e ( Reseac ) で行 た 25サ イク のPC (96。C、 5 。C、5 6 。C、4 )の後で、残存する色素タ ネ
TM
タ をCe e スピンカラム( ed os s e s)で反応 液 ら取り 除 た後、この 液を Cで減圧 で乾燥した。 ホ ムア ド (4 ) で 、そして6 アク ア ド 6 を装着した 377
ク ンサ で解析した。 デ タを、 ed os s e s P S ク ン ング 3・ 2ソ トウ アで解析した。
０3０3 PC
P C Co o eを用 て、反応を O C、 O ( ) SO 2 SO O o X 3 d P( Pa G C および ) びにd P ( sおよび ) x プライ およびプライ 2、 2・ 3 片、並びに ・ 4 ット x\ e ポ メラ ゼ( e a d o abs)の2 s C (P 8 8)中で行 た。PC サイク は、94。C、O・ 5 45。C、O・ 5 65。C、4分で行 た。 ント PC では、 ・ 2 d Pおよび ・ ッ の e ポ メラ ゼを使用し、そして伸長 応のステップを72C 間で行 た。PC を4 ガ スゲ 上で ジウム イドにより染色し、 された ンドの 度を oec a a e X Po S s e およびQ a O eソ トウ ア( o ad)を使用して定量 した。 ケン ング 析のために、PC 、 、ゲ (7 アク ア ド 7 ゲ )またはろ ( c oco
3 および c o Z)により された。
7
(2 )を、24 C 2 スペ ジン、 5 T 、O・ o X 3 P 3 Pa P 3 s P、 O G P 2 ( 7 e の 成のための)または ・ 5 ( 成のための)、および2・ 5 ット x\ 7 R ポ メラ ゼ( A )を含有する4 s C (P 8 )中で 実行した。 率を調 るために、 7 e の 成では、2 P G P(Pe e G Pの わり)、 の 成では、 P G P ( e s a )をそれぞれ えて転写を行 た。 Cで、 3 ( 7 e 成の )または6 ( 成の )インキ ベ ョンの後に、 を含む 液を加えて反応を停止した。この 液を、 75Cで3 間加熱し、そして 5または2 ( 7 e )または ( ) アク ア ド 7 ゲ により 、産物を、 イオイメ ジングアナライザ で解析した。 ク オ の 析の際は( 7 33)、転写 、2 P Pまたは 32
P P( e s a )で内部 識した。 、産物を、 の 5 ナト ウム (P 4 5)中で、 Cで2 間、 ・ 75 ットの ase により した。 7 eの 析では、 ・ 5 ットの大 (S a)を消化
26０
液中に加えた。 産物を2 ( P ト、 、 e c )により 析した。 元日の 、イソ アン ア (66 3 3 )、2 元日の 、イソプ ピ ア C (7 5 またはPa のための75 5 )をそれぞれ用 た。 Cプ ト上の標 ク オ のスポットを イオイメ ジングアナライザ により 析した。 ０3０5 2 gのPC 物の オキ サイク ケン ング それぞれの のPCRは、P C ント ラ を用 て、 O C、 O ( ) SO 2 SO O o
4 2 4 4 X 3 の d P( Pa、G、C ) P ( s ) x の プライ プライ 2、 2・ 3 の ( 2 9)、 ・ 4 \の e ポ メラ ゼ( e a d o abs)を含む s C ( 8 8 中で行 。 。
た。PCRのサイク は、94C、O・ 5 45C、O・ 5 6 。
5C、4分で 行 た。 ケン ングのために、PC 物をゲ (7 アク ア ド 7 ゲ )又は濾 ( c oco 3 c o Z)によ て 製した。dPa P 、ある は、非存在 ケン ングを行 、6 アク ア ド 6 を装着した 377 ク ンサ で、配列 を決定した。
０3０6 の 基の 、dPa Pの 下及び非存在 での ケン ング ら られた双方のピ ク タ ンを 較することによ て確認すること ができる。
０3０7 大 ステムに ける アンチ を含有 る のア ノ
物のア ノ 化は、 イナ チ ン を加えた製造業者のプ ト
32 に従 た ステム( S 、 )中で調 た。 Pで分子 内 識された ( 4 )を、3 Cで3 間、 ステム(254 中で インキ ベ トした。 ナト ウム(P 4 5)で 和さ た ノ で、 を抽 出し、そして、 ・ 2 s 酸及び3 を含む (P 4 75 ) 、4Cで アク ア ド を用 た電気 で分析した( 5d、 2 ) ０3０8 2 sを含有する 片の ケン ング
Paである4 プ ピ ピ 2 カ デヒド(Pa ) ク オ ドの ン 導体(dPa P)( 34)を加えた デオキ ク オ 結に よる ケン ング ( 33 により、 s Pa の 置を確認した。 e oによる sに対するdPa Pの ( 4 2・ 2 、鋳型 sに対するdPa Pの ( 5 m M ・ 7 )に比 て3・ 9 なる( 2)。したが て、 5 ケン ングは、 dPa Pを加えて、 a ポ メラ ゼの ケン ングキットである e (a ed os s e s)を用 て行われた。 ケン ングおよびその後の実験 のために、 s Pa を含有する2 ( 5 eおよび 74 e
4)は 的に合成された 片をプライ 長または連結す ることにより調製した( 6)
０3０9 5 C s 3 GPa を含有する の ケン ングでは、 ・ 5 d Pa Pを加えることにより sに対して天然 基の タ ネ タ が 導入されな なるので、鋳型 sに対応する 立のみ G C の ずれのピ クも消失する( 3 )。すなわち、この ケン ングでピ クが現れずに が認められた位置が非 基の 置を示して る。
０31０ 外の 異な た配列を含む では、dPa P での ケン ングで 明ら な タ ンを示さな たものもあ た( 3 2 )。し し、dPa P 存在 での ケン ングでは、鋳型 sの 降の ビ クはほとんど 滅するので( 3 dPa P および非存在 でのそれぞ れの ケン ングのピ ク タ ンを 較することにより、 中の非 基 の 置を確認することができる( えば、 3cおよび3 )
０311 3 s Pa を含有する 片のPC
s Pa を含有する 4( 6)( 5 eまたは 74 e、2・ 3 )のPC 幅を 3 5 ク ア 性を有する ， ポ メラ ゼ( 4 ット u ポ メラ ゼ e a d o abs) およびd s P 、
N dPa P d P dG P dC P
N およびd Pの 合物( ・ 3 )を使用して行 た。PC 。
サイク は、94Cで3 、4 。
5Cで3 、および Cで4 、で行 た。
０312 らは、はじめに の 幅の および を試験した( 3a) サイク のPC の後( 3b)、産物をdPa P 、ある は での ケン ングにより 析した( 3dおよび3 )。 えて、さらなる サイク のPC ( 体で サイク )を サイク PC 物の 部を使用して行 た( 3eおよ び3) サイク および サイク のPC 物のdPa P での ケ ン ングは、はじめの の ケン ング 類似のビ ク タ ンを与えた。dP a P での ケン ングにお て( 3 3) 中の非
基の 置に続 読み過し(
「ead o )のピ クは、PC サイク 数の増加によ りわず に大き な た。したが て、読み過しピ クの さは、PC 幅により s Pa 対 ら天然 対 の を決定するために使用することができる。
、 s Pa の わりに を含有する ント
片のdPa P での ケン ングにより得られた読み過しのビ クの ( 8)とPC 物の み過しピ クの ( 3 3)を、比較することにより決定さ れた。 サイク および サイク の後の 中の s Pa の
、それぞれ～ および3 4 であ た。この 法を用 て、 の ア ド ン酸の使用が、PC における s Pa の を増加して ることもわ た。d Pを使用しな で、d s P dPa Pおよび d Pを使
N 用した
N
のPC 、変異 が上昇した。 および サイク の後で、 s Pa の 、それぞれ～5 および～ であ た( 9)。また、d s Pおよ びdPa Pの 存在 での サイク のPC にお て、 中の s Pa 、完全に に置き換わ て た( 3f)
の 、ゲ 上のPC 物を 素で染色する、ある は、 プ ライ を使用した産物のオ トラジオグラ により、それらの ンドの 度 ら評価 した。その ( 3 ) は サイク のPC で 5倍に増幅され、天然
( co )は サイク のPC で37倍に増幅された。より 確な効率 は、5 または3 P プライ を使用してPC 物のオ トラジオグラ に より得られた( )。 ( )。
を用 てサイク ごとの ( )を決 定した。ここで、 は産物の ピ 数であり、 ははじめの ピ 数であり、そし て はPC サイク の数である( 35) を用 た サイク のPC の ( )は、5 プライ らの 長に対しては ・ 38であり、3 プライ らの 長に対しては ・ 29であ た。そして co を通常の 件下でPC 幅した場合には、 はそれぞれ ・43および ・ 35であ た。したが て、
ステムにおけるPC のサイク ごとの 、従来の
ステムにおけるものの76 88 である。 上で得られたPC 物の およ び ケン ング ら決定された s Pa の 率 ら、 中の s Pa PC における 実度( が二倍に増幅されるときの)は、99・ 8 上と計算される。し しながら、この 実度は、PC 幅における s Pa の よりむしろ、 的に合成されたはじめの 片の 度に依存するこ とがわ た( )。したが て、 ステムの 99 8 より も なり 屹のと考えられる。
０314 らは、 P 辺の な た配列を含む他の (
2 4)の 幅も検討した。 サイク のPC の後、各 6 ら3 倍に 増幅され( 2)、 の s Pa の 3 であ た( 3 2 )。 5 X( ) 3 列を含有する 4の であ た。こ こでX sまたはPaであり、そして 2である。これらの 片の サイク の PC の後の増 5 であ た。この の ア ド ン酸 の取り込みに続 て、 sまたはPaの が連続して取り込まれる場合に起こる。した が て 5 sA 3および5 Pa 3 列を除 て、 基を含有 する全ての 、 幅に使用 能である。
０315 4 s Pa 介される 7
s Paおよび s Pa 、 7 ポ メラ ゼによる s P Pa Pおよ びPa Pの の部 入を相補 介した。 s PaまたはPa 含 有する (35 e )を使用して、転写を検討した( 4aおよび4b)。
32
基の ク オ ド ン酸を加えて3 間の 写を行 た後、 で 識され た ゲ 上で解析した( 4c)。 Pa P および sを含有する全長の
( 7 e )の 、天然 基 らなる を用 た天然 基のみ の のもの( 4c ン9) 比 て28 9 であ た( 4c ン 2 5 お よび7)。 基を含む の にお て、 基の を 加えな た場合の の 有意に減少した( 4c ン3 6および8) 32 ０316 7 にお て s Paおよび s Pa の 選択 、内部
ク オ 成を解析( 7 33)することにより確認した( 4 および4e、並びに 3)
０317 3・ 7 ク オ
０3 8 3a
Figure imgf000092_0001
０319 3b
Figure imgf000093_0001
０32０ a 4 5に示されたよ 、 ( ント R 9 R 又は ント
4 23 32 39 の に取り込まれた ク オ の
b Pa 又は s
c 値は以下 式を用 て決定した ０321 の ) ての (3 リン ) の X ( 32P Pの5 の ０322 d ク オ の に記載してある。
０323 e 括弧 に示してある。
０324 出されず。
32
０325 識された ase により消化し、生じた ク オ ド3 ン酸を2 ク トグラ (2 C)により 析した。 基を 含有する 型を使用する にお て、 sおよびPaに対応する スポットが2 C上に現れ、そして 基の 状に類似した天然 の た ( えば、Pa Pに対するC Pおよび P、並びに s Pに対する PおよびG P )に対応するスポットは ずれも観察されな た( 4d、 sおよび 4e、 P a)。 全に天然 基 らなる 型を使用する にお て、Paまたは sに対 応するスポットは観察されな た( 4d、 およびG、並びに 4e、 およ びC)o2 上の各 ク オ のスポットの 、産物 列 ら予測され る理論 にきわめて近 ( 3、 ント 23)、その 果 ら転写における s Paまたは s Pa の 95 上と見積もられた。
０326 らは、応用例として、 アンチ であるC Pa 、CPa C s、およびC s を含有する (85 e )を 7 により調製した。ここ では、大腸 の 列を採用した。
０327 Pa PまたはPa Pの 7 e 物 の 比較的低 たが、Pa 含有するより (85 e )の 高 率を示した 85 eの
C アンチ を持 のものと比較して88 93 であ た( 5a )。 ク オ 析のために、転写 P Pまたは P P で内部 識した。 ク オ が の5 に位置して るので、
32
ク オ の3 ン酸は Pのみで 識される。したが て 32
、転写 P Pで 識された場合のみ、 ク オ に対応す るスポットが2 により検出される( 5bおよび5 )。 sに対するPa 、および Paに対する sの 入の 、 96 上であ た ( 3、 ント 24 39)
０328 られた を使用して、 らは、大腸 出液中でのア ノ を検討した( S Co Roc e a os cs) CPa およびC s アンチ をも は 全 ア ノ されず、大腸 来の ア ノ 素の 識を排除することがわ た( 5d ン7 ) また、C PaおよびC sア チ を持 はア ノ された( 5d ン 4)。これらの アンチ を持 のア ノ の ，注は、大腸 "およびその の 識の ( 36 37)とよ 一致する。 上の結 、 基の の部 入を確認するものでもある。
０329 オチン き たPa Pの
ビオチン されたPa P 8 ) 4 ( オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ デヒド 5 ト ォス 28 Pa P)は、 36に示すスキ によ て合成した。
０33０ ( ) ( ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 24)の ( 36のスキ における反 応(a) (c))
2 3 5 ト ベンジ ノ ス( O 、2・ o)およびCC (34 、3・ o)を含む (4 6 1)に キサメチ ラスト ア ド(562 、3・ o)を 78Cで加えた。 液を 78Cで2 間、そして 3 間、 した( ) (25 ) 、4 ヨ ド ピ 2 カ ボ ア デヒド( 合物23)(83 、3・ 7 o)に、 a (6 オイ デ ィス ジョン 5 、3・ 7 o)を加えた。 合物を 3 し た。 で、 中の2 3 5 ト ベンジ ク ド( )を加えた。 合物を 2 した。 チ および 水で分 した。 4 3 2 4で乾燥さ 、そして 下で した。 カゲ カラ ク トグラ ィ ク メタン ノ で )で 製し (2 3 5 ト ベンジ ) 4 ピ 2 カ デヒドを得た。
０331 (2 3 5 ト ベ 。
ンジ ) 4 2 カ デヒドの ク メタン( 5 ) 、 ( 、8・ 5 )を 78 。Cで加えた。 合物を2 、そしてC 中の5 メタノ (3 ) を加えた。 液を 78Cで した後、28 (4 1)を加え
4
そして反応 合物を 温になるまで した。 液をC および Oに加えた。
2 2 2
C 3 、分 および 、そして 減圧 した。
。
を逆 C 8 P Cで 製して、 (j ) 4
2 カ デヒド( )を得た。
。
０332 ( ) 4 2 カ デヒド( 76
・ o、 ノ を含有する)を ジン ト ンで さ た。 (
) 4 ピ 2 カ デヒド( 76 )、テトラキス( ト イン) ラジウム(2g 、O・ o) C ( 、O・ O o 1)、およびト チ ア ン( 5u 、 ・ o)の ( 8 1) 、3 ( ク ア ド) プ ( 75 o)の (75 は )を加え た。 応物を 2 した。 O c Oで 、有機
で乾燥さ 、減圧 した。 カゲ カラ ク トグラ ( ク メタン メタノ )、および P P Cで 製し、 24を 性体として得た( 23 26 、3 階の )。 24の 、 ( 38)および 分解 量分析により確認した。 24の QCスペクト ( 38e)および Cスペクト ( 38fおよび 38 )は、 グ ド 合が、 素にお て およびピ 基部位との間に形成されたことを示した。また、 24の O S スペクト ( 38d)のク スピ クは、 ( 25)のそれと 類似しており、そして および 4プ トンの間のク スピ クを示したため、
24の の は と された。
０333 24
(3 z S d6) 6 9 54(d J 8 z) 9 ( J 5 2 z)
8 (s ) 7 8(d J 8 z)
6 49(s ) 6 34(d J 3 5 z)
5 35(d J 5 6 z) 5 ( 2 )
4 7(d 2 J 5 4 z) 4 ０2( 2 )
3 88( )
3 68(ddd J 3・4 5・ 3 2 z
3 57(ddd J 3・ 5 5・ 2 z)
3
C (75 z S d6) 6
8 28 63 78 3 88 3 49
26 85 5 23 9 23 85 26
85 4 76 83 76 4 69 75
67 6 96 3 2
S( 3 A ト クス)
C C ( )
5 7 2 6 2 39 464 39 462 (2) (2 3 ) 4 ( ク ア ド) プ ピ ピ 2 カ デヒド( 26)の ( 36のスキ における (d) (e))
０334 24( 8 ・ 3 o)を で3 、 。
した。 ジン(3 )中の 残査に、4 4 トキ ト ク ド( 3 、O・ o)を加えた。 合物 を 、そして O cおよび5 a COに加えた。
a で 上で乾 さ 、そして した。 カゲ ク トグラ ( ク メタン メタノ )で 製して の 2 5を収率95 得た。
。
０335 25( 88 、O・ o)を で3 た。 ジン(2 7 1) 中の残 無水 3 、 ・ o 加えた。 合物を 2
、そして O cおよび5 a COに加えた。 aCで やし、 a 上で乾 さ 、そして した。 ク メタン(27 1)中の残査に (27 1)を Cで加えた。 合物を Cで 5 5 性炭酸水 素ナト ウム 溶液 注ぎ ク メタンで 出した。 上で乾燥さ た後、 液を減圧 した。 カゲ ク トグラ ( ク メタン メタノ )で 製 の 26を収率92 得た。
25
(5 z S d6) 6
9 56(s ) 9 5( J 5 O z)
7 72(s ) 7 38 7 2 ( )
6 87(d 4 J 7 z) 6 47(s )
6 34(d J 3 3 z)
5 47(d J 5 3 z)
5 3(d J 5 7 z
4 2 4 ( 5 ) 3 73(s 6 )
3 22( 2 )
S( 3 ト クス)
C C ( ) 693
2 77 693
36 35 2 8 72
26
(5 z S d6) 6
9 5 (s ) 9 (bs ) 8 6(s )
7 24(d J 3 z) 6 64(d J 5 O z)
6 48(s ) 5 43( J 5 O z)
5 35 J 5 z 5 32 J 4 z
4 7( 3 ) 3 73( ) 3 62( )
2 ０7(s 3 ) 2 (s 3 )
S( 3 ト クス)
C C ( ) 475 675 475 687
9 2 2 8 2
(3) (j ) 4 (3 オチンア ド プ ピ ) ピ 2 カ ノシ デヒド 5 ト ォス ト( 28)の ( 36の における反応( ) ( ))o
０337 された ク オ ド26(47 、O・ o)を に溶解し、減圧
した。 ジン( ０ )および キサン(3 )に溶解した。 キサン中 の2 ク 4 3 2 ベンゾ 4 の ( O 、 ・ o)を えた。 後、ト チ ア ン( 4 および
。
・ 5 ビス(ト チ アン ウム) ス ト(3 、 ・ o)を 反応 合物に素早 えた。 合物を した。 で、ピリ
(98 2 )中の ヨ ド (2 )を加えた。 5 後、 a SOの5。
( 5 4 を加えた。 の 分を ポ ョンで除き、そして次 で (5 )を 加えた。 合物を 3 、そして次 で、 ア ン ア(2 )で室温、 2 理した。 液を減圧 、そして生成
Se ade ( 25)カラ ク トグラ ィ (5 ら の アグラジ ントで 出した)で 製し、そして次 で、C 8 P C(
ト チ アン ウム ら3 C C のグラジ ントにより 出した)によ り 製して、 ク オ ド 5 ト ォス ト27を得た。
０338 燥後、 ・ a CO aCO (
3 2 3 5 8 6)中の 27 を、ビオチン キ スク ン (9 、 液中 ・ 4 ) 室温で 3 さ た。 合物を28。 (2 )で 理した。
Se ade ( 25)カラ ク トグラ ィ (5 ら の アグラジ ントにより 出した)、および でC 8 P C( ト チ アン ウム 、 ら3 C C のグラジ ントにより 出した)により 製し 、 ク オ ド 5 ト ォス ト28を、 26 ら 4 率で得た。 合 物28の 、 R( 43aおよびb)、 P ( 43c)、および 量分析 ( 42)により確認、した。 28の オチン 分のプ トン グナ は、以前に合 成した オチン Pのそれと同一であり、 O中の P Rスペクト は、 ク オ 5 ト ォス に対応する 型的な の グナ を示した。
０339 27
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S) C O P 5 9 O( ) 5 8 98( ) 3 9 4 2 3
28
(3 z O) 6
9 36(d J g z) 7 86(s )
7 2 (d J 7 z) 6 44(d J 4 z)
4 39 4 3 ( 3 ) 4 23 4 ( 4 )
4 6(d 2 J 3 7 z) 3 8( )
3 ( 24 J 7 3 z)
2 82(dd J 4・ 9および 3 z)
2 6 (d J 3 O z)
2 23 2 J 7 O z) 6 4 )
32( 2 2 ( 36 J 7 3 z
3
P ( 7 z O) 6
8 9 (d P J 6 5 z)
67(d J 2 z)
22 3 ( P J 2 z)
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O PS 745 7( ) 745 7( ) 23 33 6 4 3
J スペクト ( O ン ナト ウム 7 )
4 3
a 258 (E ) 3 8 ( 9 5 )
s を 7 による の 典 ビオ ン およびPC 幅の 方における s Pa の および 能性 に てより 細に試験するために、 52 e R 子の ビオチン を行 た。
R A ビ 5 e
32
(2 1)は 3 P G P 2 P 4 o Pa P( オチン されたPaの に記載したよ に 合成した) および3 ( 6および co 2( 6 )、それぞれに て、ラ イゲ ョンにより得られた およびPC 幅した 型を用 た)を用 て、6 Cで行 た。
０341 ライゲ ョンにより得られた co 5および co 6( 6 )を用 た 対照 応に ては、転写は、2 Bo P( オチン 6 5 ト ォス ト、 ・アプライ サイ ンス)の または非存在 、2 P G PおよびC Pのみとともに行 た。 、 7～ アク ア ド 7 ゲ 上で分析及び 製した。
０342 オチン 、スト プトアビジ を用 た トアッ によ て
32
検出した。 2 o1の 識した および OO o1のスト プトアビジン(P o e a)の 合物( )を、5 aCおよび O を含む O s C (P 7 6)中で、2 Cで インキ ベ トした。ビオチン スト プトアビジン 合体を、7 アク ア ド 7 ゲ 上の電 により分析した。 o Pa 置を決定するために、 ( 52 e )を 、 ア カ ォス ァタ ゼ( a a a)で5 端を脱 ン した後、 P P( キン・ )で 識した。 識された を、 ase で、4・ 7 、 ・ 7 、および ・ 7 大 を含む 3 。
3 ク ン ナト ウム (P 5 ) 、55Cで 2 間、ならびに、ア カ で、 ・ 6 を含む ナト ウム (P g ) 。
、9 Cで 5 間、部分 した。ア カ 化した (9 X )を、 5 aCを含む 2 s C (P 7 6)( 4 混合し、そして混合物( )をス ト プトアビジン ビ ズ( 4 )( e a d o abs)とともに5 間、 室温でインキ ベ ト 、ビオチン された を捕捉した。 の (5 )を、 他の消 した試料と共に アク ア ド 7 ゲ 上で分析した。 ０343
ビオチンが連結されたPa( Pa)は、ライゲ ョンにより得られた およびP C 幅した 型を用 て、 P を介した 7 によ て 入さ れた。 ( 52 e ) の o Paの 入を解析するために、 6 co 2 ( 6 )を用 て、天然 P(2 )および o Pa P(2または4 ) 7 写を行 た。 s Pa を伴 、 天然 基のみを含む 片である co 2を用 た場合( 44c、 ン 3、 7および ) 比較して、47 85 であ た( 44c、 ン2、6および )。ライ ゲ ョンにより得られた 6 およびPC 幅した 6 型を用 た では、 o Pa Pの 存在 にお て、完全長産物の量が有意に低下した( 44 c、 ン 、5および9)。これらの 、 6をPC 幅した際に、 s Pa の 対 の き換えがほとんど起こらな たことを示す。 ０344 R の o Pa 入選択 、スト プトアビジ を用 て、ビオチン
トアッ によ て評価した。スト プトアビジ オチンとの 非常 に強 、特異 であること ら トした の 、転写による オチン (すなわち、ビオチン の )とほぼ同じと考えられる。 の 量である2 o Pa P、およびライゲ ョンにより得られた 6 型を 用 た にお て、9 オチン され( 44d、 ン2)、そして o Pa P 度を増加さ ると(4 ) 96。に向上した( 44d、 ン4) 。 基に対する o Pa Pの た 入に ては、2または4 o Pa Pの co 2を 型として た 写実験で評価したところ、ビオ チン の はそれぞれ9および であ た( 44d、 ン6および7) これらの た 、 52 e の 基の あたりわず ・ 6 ( 体で9 )、および ・ 2 ( 体で 6 ) 算された。PC (2 サイク ) された 型を用 た にお て、 o Paの 、 3 4 ほど減少した( 44d、 ン9および )。この値は、配列 ( 3)によ て見積も た P 位の (3 4 ) 一致した。 味深 ことに、天然 基に対する o Paの た 、天然 および人工 基の の PC (2 サイ ク )された co 2 型を用 た にお て、増加しな た( 44d、 ン 3および 4)。したが て、天然 基に対する sおよびPaの た 、P C 幅の 常に低 と考えられた。
０345 また、 s Pa 7 における選択 、天然 ( ) 較した。 中の G、Cおよび に対する o Pの た 入を評価するために、鋳型 ド 域に、 を のみ ( 。。
5)および を含まな 対照 ( co 6)を合成した( 6 )。 co 5および co 6を 型に用 る では、 または2 o Pおよび 他の天 (2 P G PおよびC P)を用 る以外は、 s Pa の と同じ 件で行 た。 co 5の にお ては、 に対する o の 入により、転写 完全に オチン された( 44d、 ン 6。し しながら、 co 6の にお て、鋳型 中の G、Cおよび に対する o の た 入によ て2 オチン された( 44d、 ン 8)。したが て、 天然 基に対して o Pa Pが誤 て 入される割合(9 および 、それぞ れ 44d、 ン6および7)は、天然 基に対して オチンを連結した P( o P)が誤 て 入される割合(2 )よりも低 ことが明ら にな た。この o が誤 て 入された割合(2 )が、天然 に対して o Pa Pが2 o 等 在する条件にお てさえ、 o Paが天然 基に対して て 入される 割合( 6 )よりも高 たことは特筆す きである。よ て、 sに対する o Paの に対する o の よりもわず に効率が悪 が、 7 にお て、 鋳型 中の 基部位に対する o Paの た 入を排除する選択 、 鋳型 中の G、 およびCの 位に対する o の た 入を排除する選 択 よりも高 。
における o Paの 位を決定するために、ビオチン の 列 を解析した。 o P 対して正確に転写 に導入されたのであれ
32
ば、転写 59位が オチン されて る。 5 端が で 識された ア カ または ase で部分 、電気 でその産物を解析した。 o Pa を含む の ラダ にお て、59 eよりも大き 片に対応する ンド が トした( 44e、 ン2および8)。また、ア カ した 片をスト プトアビ ジ で処理して オチン 片を捕捉 、その りを電気 した場合、59 eよ りも大き はほぼ 失した( 44e、 ン2および9。これらの 、転写 59位における部位 な o Paの 入を示すものである。さらに、PC (2 サイク )された 型を用 た ( 44e、 ン7 2)は、ライゲ ョンに より得られた 型を用 て得られた ( 44e、 ン 6) 同じ タ ンを生 じた。
０347 したが て、この 法による の部 ビオチン化は、 の 性を損失 することな 、 子を固定するのに有用である。ビオチンのよ な大きな で 修飾された人工 Paが に効率よ み込まれたので、 オ ォアを連結 したPaなど、一連の ， 4 Pa もまた、 に組み込むことができる。
。
０348 2 ト ク オ 仝
2 ト ピ の4 ク オ ド 導体は、 45に示すスキ によ て 合成した。
。
０349 ( ) (2 デオキ ) 4 ヨ ド 2 ト (
45の )の
(2 デオキ j ) 2 。
ト (7 、3・ o)をC ( )に溶解し、 ヨ ドスク ン ( 38 、6・ o)を 加え、室温で 2 した。 液を チ 水で分 、有機層を水で 2 した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 カゲ カラム(C C eO 5 )および P C(25 4 C C 4 5 C 、5 )で 製して を6 7 (56 ) 。
2 g (3 )
０35０
(5 z S d6) 6
7 9 (d J 2 z) 7 4 (d J 2 z)
6 54( J 5 6 z) 5 27(d J 4 5 z)
5 ( J 5 2 z) 4 23( )
3 83( ) 3 65( ) 3 56( )
2 4 ( ) 2 23( )
S ( 3 a )
( ) 354 979 定値 354 9784 (2) (2 デオキ ) Z L 2 ト ピ ( 2の
(2 デオキ ) 4 ヨ ド 2 ト ピ ( )(28 O 7g o Pd(PP ) C 56 O 8 o)を (7
3 2 2
g )に 、ト チ ( L )スズ(48 u 、 ・ 6 o)を えた。
Cで ・ 5 加熱し、 を濃縮 カゲ カラム(C 。O 、 5 )および P C (34 35 C 3 ) して 合物 2を 25 (6 ) 。
０351 2
(3 z S d6) 6
7 92(d J 2 2 z) 7 27(d J 2 2 z)
6 55( J 5 7 z 5 28(d J 4 5 z
5・ ( J 5 2 z) 4 24( )
3 85( )
3 67(ddd J 3・ 6 5・ 3 2・ z)
3 57( ) 2 43( ) 2 23( )
99(s 3 )
3
C (75 z S d6) 6
36 2 29 7 7 8 5 29
88 74 88 3 86 75 72 9 69 2
6 83 42 58 4 29
S ( 3 a
C O ( ) 267 98 267 99
2 5 2 5
。 (3) (2 デオキ ) 4 ( ク ア ド L ) 2 ト ピ ( 3)の )
(2 デオキ ) 4 ヨ ド 2 ト ピ ( )(354 o) Pd(PP ) (58 O 5 o) C (3 O 6 o)、ト チ ア ン(2 9 1、 ・ 5 o)を (3 5 )に (2 プ ピ ) ク ア ドの ( 5 、 ・ o)を 加えて 2 した。 液を チ 水で分 、有機層を水で 3 した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラム(C C e 2 )および P C(34 35 C C 2 )で 製し て 3を 7 (8 ) 。
０352 3 (3 z S d6) 6
9 ( J 5 3 z 7 98(d J 2 z
7 33(d J 2 z) 6 54( J 5 8 z)
6 47(s ) 5 27(d J 4 5 z)
5 ( J 5 2 z) 4 23( )
4 7(d 2 J 5 4 z) 3 84( )
3 66(ddd J 3・ 5 5・ 2 2 z)
3 56(d J 4・ 6 2 2 z) 2 43( )
2 23( )
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S)
C O C 39 3 ( ) 定値 389 85 ( ) 4 5 6 3 2 (4) 2 デオキ 5 (4 4 トキ ト ) j ラノ 。
4 プ ピ 2 ト 2
ソプ ピ イト( 合物6)の
2(2 O・ o)を で した後、ピ ジン(7 5 )を加え 、4 4 トキ ト ク ド(28 O・ o)を えて
した。 液を チ 5。 a COで 、有機 和食塩水 で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラ で (C eO 2 )して 4を365 (86 ) 。 合物 ( g O・ o)を で した後、 ( 7 1) ソプ ピ チ ア ン(87 ・ 5 を加えた 2 ソプ ピ ア ノ ク イト(82 1 ・ o)を加えて した。 メタノ (5 41を加え (2 )で希釈し 5 a COを加えて した。 塩水で 、無水硫酸ナト ウ ムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラム(C C キサン 4 2 ト チ ア ン)で 製して 6を223 (87 ) 。
０353 4
(3 z S d6) 6
7 65(d J 2 2 z 7 4 7 2 (
6 89(d 4 J 8 8 z) 6 59( J 5 3 z)
5 37(d J 5 O z) 4 3 ( )
3 97( ) 3 75(s 6 )
3 2 (d 2 J 4 z) 2 48 2 32( 2 )
92(s 3 )
S ( 3 a )
C
33 33 2O ( ) 569
7 2288 定値 569 2246
6
(3 z C ) 6
7 62 7 55 (d d J 2 2 z)
7 48 7 44( 2 ) 7 39 7 2 ( 8 )
6 87( 4 ) 6 68( ) 4 56( )
4 25( ) 3 88 3 3 ( 6 )
3 82(s s 6 ) 2 85 2 7 ( )
2 63( J 6 4 z) 2 46( J 6 4 z)
2 36 2 2 ( ) 95 93(s s 3 )
2 ０ ( 2 )
S ( 3 a )
C OP ( ) 769 3366 定値 769 3 66 42 5０ 4 8
(5 (2 デオキ 4 プ ピ 2 ト ピ 5 ン ( 9)の 4( 6 ・ 28 o)を で した後、ピ ジン(2 8 1)を加え 、無水 (5341 ・ o)を加えて反応 液を 2 した。
液を チ 5。 a COで 5。 a COで した。
を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 ト ンで した後、塩 チ ン28 1に 溶解さ た。この ク (28 4 を Cで加えて 5 、 Cで した。 5。 a COを反応 加えて 、有機 5。 a COで した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラ で 製して 7を78 (9 2 ) 。 7(3 O・ o)を で した後、ピ ジン( 4 キサン(3 を えた後、2 ク 4 3 2 ベンゾ 4 オン( O キサンの )を加え て した。ト チ ア ン( ) ビス(ト チ アン ウム) ン (3 中の ・ 5 )を反応 加えて した。 ジン(2 ピ ジン中の 。 O 98 2 )を加えて 5 、5。 SO ( 5 )を加えて反応 液を濃縮した。 (5・ 1)を加えて 3 、28 アン ア水を2 1 えて 2 した。 液を濃縮、凍結 した後、 Se ade 5で ( 5 O R ) 、 目的とする化合物9を得た。
０354 7
(3 z S d6) 6
7 9 (d J 2 z) 7 3 (d J 2 z)
6 6 ( J 6 4 z) 5 22( 2 )
4 3( ) 3 65( 2 )
2 62(ddd J 3・ 6・ 4 3 z)
2 43( ) 2 8(s 3 ) 2 (s 3 )
S ( 3 a )
C O ( ) 3 9 87 定値 3 9 66 4 7 2 6
9
クト スプ イオン ススペクト ス ピ ( S S) C O P 5 4 98 ( ) 定値 5 5 95 ( ) 2 7 4 2 3 (6) (2 デオキ 3 j ) 4 ( ク 。
ア ド プ ピ ) 2 ト ( 8)の
3(3 5 ・ 78 o)を で した後、ピ ジン(7 8 1)を加え 、4 4 トキ ト ク ド(2g O・ o)を えて
した。 液を チ 5 a COで 、有機 和食塩水 で した。 を無水硫酸ナト ウムで乾燥後、濃縮 、 カゲ カラム(C C c 9 )で 製して 合物5を526 (97 ) 。 5(5 5 ・ 74 o)を で した後、ピ ジン(7 4 1)を加え、無水 (2 8 1 3・ o)を加えて反応 液を 2 した。 液を チ 5 a COで 5 a COで した。 を無水硫酸ナ ト ウムで乾燥後、濃縮 ト ンで した後、塩 チ ン74 1に溶解さ た。こ の ク (74 41を Cで加えて 5 間、 Cで した。 5 a COを反応 加えて 、有機 5 a COで した。
を無水硫酸ナト ウムで乾燥、濃縮 、 カゲ カラム(C eO 5
)で 製して 8を289 (9 2 ) 。
０355 5 (3 z SO d6) 6
9 7( J 5 3 z) 7 67(d J 2 2 z)
7 4 7 2 ( )
6 89(dd 4 J ・ 7 8 g z)
6 59( J 5 4 z) 6 48(s )
5 38(d J 4 g z) 4 29( )
4 2(d 2 J 4 4 z) 3 99( )
3 74(s 6 ) 3 7( 2 )
2 46 2 33( 2 )
S ( 3 a
C C ( ) 694 723 定値 694 729 35 34 3 8 2 8 (3 z SO d6) 6
9 2( J 5 3 z) 7 96(d J 2 2 z)
7 36(d J 2 2 z) 6 6 ( J 6 3 z)
6 49(s ) 5 23( 2 )
4 8(d 2 J 5 4 z) 4 3( )
3 68( 2 )
2 63(ddd J 3・ 6・ 4 3 z)
2 44( ) 2 7(s 3 )
S ( 3 a )
C C ( )
6 8 3 2 434 522 定値 434 549
2 dP P ROX dP P dP Pの 実施 では、dP Pに関する誘導体として、 2 dP P ROX dP P dP Pを、 46に示す スキ に従 て合成した。こ れらの 導体は、例えば (PC プライ )で 中に導入することが 可能である。ア ノ基の誘導体は、 入後の の 用 ることが出来、それ 以外の を結合した 導体は、 の 識、ならびに、 などに 応用が可能である。
０356 ( ) (2 デオキ ) 4 3 (6 ト オ
ア ド キサンア ド) プ ピ 2 。
ト ( 46の (a)) ( 。
2 デオキ ) 4 ド 2 ト (35 4 、 o、 ノ を含む)を5 ナス ラス 、無水アセ ト で 2 行 た。 ウ (3 6 o1))、テトラキスト イン ラジウム( )(58 5 o1)を加え、これらを無水 (5 )に溶解さ 、 室温で さ ながらト チ ア ン(2 ・ 5 o)を 、 室温で した。これに (2 プ ピ ) 6 ト オ ア ド キサンア ド( 、 ・ 5 o)の (4 ) 液を 、室温で一晩 した。
液を減圧 、得られた カゲ カラ ク トグラ C 、C C )およびC 8 P C(39 4 C C O 、 5 3 2 2 3 2
)で 製し、 目的 ァス 物質(4 8 83 )として得た。
０357 (27 z S d6) 6
9 38(b s ) 8 28( J 5 3 z)
7 95(d J 2 O z) 7 3 (d J 2 O z)
6 54( J 5 6 z) 5 29(d J 4 O z)
5 2 5 ０ ( 4 3 4 2 (
4 5(d 2 J 5 3 z) 3 83( J 4 O z)
3 7 3 5 ( 2 ) 3・ 4( 2 J 7 3 z)
2 5 2 3 ( ) 2 3 2 7( )
2 8( 2 J 7 3 z) 58 4 ( 4 )
28 6( 2 )
S ( 3 a )
C O ( ) 49 ・ 754 定値
2０ 26 3 4 7 49 ・ 76 (2) (2 デオキ 3 j ) 4 3 6 ト オ ア ド キサンア ド プ ピ 2 ト ピ ( (b) (c))
(2 デオキ ) 4 3 (6 ト オ ア 。
ド キサンア ド) プ ピ 2 ト (394 8 3 o)を5 ナス ラス 、無水ピ で 3 行 た。これを無水ピ ジン(4 ) に溶解さ 、塩化 トキ ト チ (286 84 o1)を加え、室温で 間半 した。 液を チ ノ 中に加え、 を除去した。
酸水素ナト ウム 溶液で 、 グネ ウムで乾燥さ た後、 し た。 られた カゲ カラ ク トグラ ( 5 C O 、C 1 )で 製し、ト 体を ァス 物質(543 )として得た。 (2 デオキ 5 トキ ト ) 4 3 6 ト オ ア ド キサンア ド プ ピ 2 ト ピ (542 、684 o)を3 ナス ラス 、無水ピ で 3 行 た。これを ピ ジン(7 )に溶解さ 、 水物( 69 ・ o)を加え、室温 で一晩 した。 液を チ で希釈し、有機 酸水素ナト ウ ム 溶液および 和食塩水で 、 グネ ウム上で乾燥さ た後、
した。 られた を無水 ク メタン(68 )に溶解さ 、 Cで さ ながら ク (68 を加え 5 した。 液を 酸水 素ナト ウム 溶液に加え、 ク メタンで 出し 合わ た有機
グネ ウム上で乾燥させた後、 した。 られた 物質を カゲ カラ ク トグラ (2 C O C C )で 製し、 目的 ァス
3 2 2
(328 77 2 )として得た。
０358 (3 z S d6) 6
9 39(b s ) 8 3 ( J 5 4 z)
7 94(d J 2 2 z) 7 33(d J 2 2 z)
6 6 ( J 6 3 z) 5 3 5 ( 2 )
4 2 4 ( ) 4 6(d 2 J 5 4 z)
3 75 3 5 ( 2 ) 3 6( 2 J 7 O z)
2 62(ddd J 3・ 6・ 4 2 z)
2 5 2 3 ( ) 2 5 2 ( 2 )
2 7(s 3 ) 6 4 ( 4 )
3 2 ( 2 )
S ( 3 a )
C O ( ) 533 859 定値 533 9 7 22 28 3 4 8
(3) (2 デオキ ) 4 3 (6 ア ノ キサンア ド) プ ピ 2 ト ピ 5 ン ( dP P) ( (d))
(2 デオキ 3 ) 4 3 6 ト オ ア ド キサンア ド プ ピ 2 ト ピ ( O o1を O ナス ラス 、無水ピ で 3 行 たのち、反 応 器をア ンガスで満たした。これに無水ピ ジン( )および ジオ サン(3 )を加えて溶解さ 、2 ク 4 2 3 ン 4 の キサン ( o)を加えて
したのちに、ト チ ア ン( は )およびビス(ト チ アン ウ 。
ム) ン酸の ・ 5 (3 を加えて した。
ジン (2 )を加え、室温で 5 5。 硫酸水素ナト ウム 溶液( 5 )を加えた後に反応 液を減圧 した。 られた 物質に 水(5 を加え、室温で3 した後に アン ア (2 を加えて8 した。これを A Se ade 5カラ ク トグラ ィ ( 5 3 c の5 )およびC 8 P C(
ト の ・ ト チ アン ウム 7 ) にて精製し、 目的 を得た。
０359 (3 z ) 6
7 79(s ) 7 3 (s )
6 68( J 5 6 z) 4 6 4 5 ( )
4 3 4 ( 5 ) 3 3( 8 J 7 3 z)
2 9 ( 2 J 7 5 z) 2 62 2 5 ( )
2 46 2 3 ( ) 2 24( 2 J 7 O z)
63 5 ( 4 ) 38 ( 2g )
3
P ( 2 z O) 6
8 26 5 22 5
S ( S )
C O 633 8 定値 633
8 28 4 5 3
(4) (2 デオキ ) 4 3 6 ( オ セイン 5 カ ボ ) キサンア ド プ ピ 2 ト ピ 5 ン ( dP P) ( (e))
dP P(6 )を ・ 酸水素ナト ウム 溶液(P 8・ 5 ・ 72 に溶解さ 、5 カ ボ オ セイン キ スク ン
ステ ( S )(3 7 7・ 8 o)の (5 )を加えて、 と さ ながら 室温で8 さ た。これに アン ア ( 5 )を加え と さ ながら5 さ た。これを さ た後、
Se ade A 5カラ ク トグラ ィ ( 5 3 c
の5 )およびC 8 P C( ト の ・ ト チ アン ウム 7 )にて精製し、 目的 を得た ０36０ (3 z O) 6
8 29(s ) 8 4(d J 7 5 z)
7 58(b s ) 7 26(d 7 5 z)
7 6 6 ( 7 ) 6 39(b s )
4 5 4 3 ( ) 4 4 3 9 ( 5 )
3 5 3 3 ( 2 ) 3 2( 8 J 7 3 z)
2 4 2 ( 4 ) 75 5 ( 4 )
45 ( 2g )
3
P ( 2 z O) 6
86 86 23 3
S ( S )
C O P 99
39 38 4 2 3 2 定値 99 56 (5) (2 デオキ ) 4 3 6 ( X 5 カ ボ ) キサンア ド プ ピ 2 ト ピ 5 ン ( OX dP P) ( (e))
dP P(6 o1)を ・ 酸水素ナト ウム 溶液(P 8・ 5 ・ )に溶解さ 、5 カ ボキ X ダ ン キ スク ン ステ ( OX S )(5 、 7・ 9 o1)の ( )を加えて、 と さ ながら 室温で 8 さ た。これに アン ア ( 5 )を 加え と さ ながら5 さ た。これを さ た後、 S e ade 5カラ ク トグラ ィ ( 5 3 c 、濃度 の5 O )およびC 8 P C( 2 5 ト ・ ト チ アン ウム 7 にて精製し、 目的 を得 た。
０361 (3 z O) 6
8 28(s ) 8 3(d J 8 g z)
7 47(s ) 7 9(d J 7 7 z)
6 68(b s ) 6 55(b s )
6 43(b s ) 6 g(b s )
4 4 4 2 ( ) 4 5 3 7 ( 5 )
3 6 3 2 ( ) 3 2( 8 J 7 3 z)
2 95 2 7 ( 4 ) 2 65 2 4 ( 4 )
2 4 2 ( 3 ) 2 5 7 ( g )
6 5 ( 4 ) 5 ( 2g )
3
P ( 2 z O) 6
9 59 23 27
S( S )
C O P3 49 28 定
51 56 6 9 値 48 77
2 Pa P Pa P A RA Pa P 実施 では、 Pa Pに関する誘導体として、 2 Pa P
Pa P Pa Pを 47に示す スキ て合成した。これ らの 導体は 例えば 中に導入することが可能である。ア ノ基の誘導 体は、 入後の の 用 ることが出来、それ以外の を結合した 導体は、 の 識、ならびに などに応用が可能である。 ０362 ( ) ( ) 4 (3 (6 ト オ ア ド キサン ア ド) プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド ( 47の (a))
( ) 4 ヨ ドピ 2 カ ボア デヒド( 77 5 o ノ を含む)を O ナス ラス 、無水アセ ト で 2 た。 ( 5 8 o))、テトラキスト イン ジウム( )(2g 2 o)を加え、これらを無水 (2 5 )に溶解さ 、室 温で さ ながらト チ ア ン( 75 o)を 、 室温で した。これに (2 プ ピ ) 6 ト オ ア ド キサンア ド( 9 8 75 o)の (2 ) 液を 、室温で一晩 した。 液を 減圧 、得られた カゲ カラ ク トグラ ( 。 C O C C )およびC 8 P C(22 24 C C O 5 )で 3 2 2 3 2
、 目的 ァス 物質( 26 、収率5 )として得た。
０363 (27 z SO d6) 6
9 52(d J 66 z) 9 38(b s )
8 27( J 5 3 z) 7 96(s )
7 3(d J 6 z) 6 32(d J 3 6 z)
5 42 5 32(b s ) 5 8 5 ( 2 )
4 8 3 9 ( 4 ) 3 9 3 8 ( )
3 7 3 5 ( 2 ) 3 2 3 ( 2 )
2 8( 2 J 7 3 z) 55 4 ( 4 )
3 ( 2 )
S ( 3 a )
C O ( )
3 3 7 49
2 27 8 定値 49 8 5 (2) (2 3 ) 4 ( 6 ト オ ア ド キサンア ド) プ ピ ピ 2 カ ボア デヒ ド ( (b、 (c))
( ) 4 (3 (6 ト オ ア ド キサンア 。
ド) プ ピ 2 カ ボア デヒド( 22 25 o)を ナス ラス 、無水ピ で 3 行 た。これを無水ピ ジン(4 )に 溶解さ 、塩化 トキ ト チ (8g 263 o)を加え、室温で2 間半 した。 液を チ ノ 中に加え、 を除去した。 酸水 素ナト ウム 溶液で 、 グネ ウムで乾燥さ た後、 した。 られた カゲ カラ ク トグラ ( 5 C O C 製し、ト 体を ァス 物質( 5 )として得た。 (5 トキ ト ) 4 (3 (6 ト オ ア ド キサンア ド) プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド( 4g 、 88 o)を O ナス ラス 、無水ピ で 3 行 た。これを無水 ピ ジン(2 )に溶解させ、 水物(53 56 o)を加え、室温で一晩 した。 液を チ で希釈し、有機 酸水素ナト ウム 溶 液および 和食塩水で 、 グネ ウム上で乾燥さ た後、 し た。 られた を無水 ク メタン( g )に溶解さ 、 Cで さ なが ら ク (28 )を加え、 5 した。 液を 酸水素ナト ウム 溶液に加え、 ク メタンで 出し、合わ た有機 グネ ウム上で乾燥さ た後、 した。 られた 物質を カゲ カラ ク トグラ ( 5 C O C C )で 製し、 目
2 的 ァス 3 2
(g 63 2 )として得た。
０364 (27 z SO d6) 6
9 49(s ) 9 39(b s )
8 28( J 5 3 z) 8 3(s )
7 2 (d J 6 z) 6 63(d J 5 3 z)
5 44(b s ) 5 4 5 2 ( 3 )
4 2 4 ( ) 4 5(d 2 J 5 3 z)
3 8 3 5 ( 2 ) 3 2 3 ( 2 )
2 4 9 ( 8 ) 55 4 ( 4 )
3 ( 2 )
S ( 3 a )
C O ( ) 574 2 2 定値 574 2 6 25 3 3 3 9
(3) (j ) 4 3 (6 ア ノ キサンア ド) プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド 5 ン ( Pa P) ( (d
(2 3 ) ト ア ド キサンア ド プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド(5 7 o)を ナス ラス 、無水ピ で 3 行 たの ち、反応 器をア ンガスで満たした。これに無水ピ ジン( u および ジオキサン(3 を加えて溶解さ 、2 ク 4 2 3
4 の キサン ( o)を加えて
したのちに、ト チ ア ン( u およびビス(ト チ アン ウム) ン酸の ・ 5 (3 を加えて した。
ジン (2 )を加え、室温で 5 5 硫酸 水素ナト ウム 溶液( 5 u を加えた後に反応 液を減圧 した。 られた 物質に水(5 )を加え、室温で3 した後に アン ア (2 )を 加えて8 した。これを Se ade 5カラ ク トグラ ィ ( ・ 5 3 c の5 )およびC 8 P C( ト の ・ ト チ アン ウム
7 )にて精製し、 目的 を得た。
０365 S ( S )
C 19 29 3O5P3 632 8 定値 632
(4) (j ) 4 3 6 ( オ セイン 5 カ ボ ) キサンア プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド 5 ン ( Pa P) ( (e))
合成した Pa Pの 3量を ・ 酸水素ナト ウム 溶液 ( 8・ 5、 2・ 5 )に溶解さ 、5 カ ボ オ セイン キ スク ン ステ (g o1)の (2 L)を加えて、 と さ ながら 室温で9 さ た。これに アン ア ( )を加え と さ ながら さ た。これを さ た後、 Se a de 5カラ ク トグラ ィ ( 5 3 c の
)およびC 8 P C( ト の ・ ト チ アン ウム 7 )にて精製し、 目的 を得た。
０366 (3 z ) 6 9 7(s ) 8 2 (s )
7 93(d J 7 g z) 7 62(b s )
7 3(d J 7 g z) 7 6 6 ( 7 )
6 (d J 3 2 z) 4 25 3 8 ( 7 )
3 4 3 2 ( 2 ) 3 4( 8 J 7 3 z)
2 6( 2 J 6 4 z) 65 4 ( 4 )
4 ( 2g
3
P ( 2 z O) 6
9 38 23 25
S ( S )
C O P 99 3 定値 989
4０ 39 3 2 3 78 (5) (B ) 4 3 6 (テトラメチ ダ 5 カ ボ ) キサンア ド プ ピ ピ 2 カ ボア デヒド 5 ン ( Pa P) ( (e))
合成した Pa Pの 3量を ・ 酸水素ナト ウム 溶液 ( 8・ 5 2・ 5 ) に溶解さ 、5 カ ボ テトラメチ ダ ン
キ スク ン ステ ( R S )( O g o)の ( )を加えて、 と さ ながら 室温で9 さ た。これに ア ン ア ( )を加え と さ ながら8 さ た。これを さ た後、 Se ade 5カラ ク トグラ ィ ( 5 3 c
の5 )およびC 8 P C( 2・ 5 5 ト の ・ ト チ アン ウム 7 )にて 精製し、 目的 を得た。
０367 (3 z ) 6
9 7(s ) 8 26(s )
8 2(d J 7 g z) 7 69(s )
7 35(d J 7 g z 7 (d J g 4 z
7 (d J g 4 z) 6 88 6 7 ( 3 ) 6 39(d 2 J g 2 z) 6 6(d J 3 5 z)
4 2 ( J 4 g z) 4 3 8 ( 6 )
3 55 3 3 ( 2 ) 3 25 3 ( 3 )
2 25( 2 J 6 3 z) 75 5 ( 4 )
4 ( 2g )
P ( 2 z O) 6 84 56 23 22 S ( S )
C
44 49 5O9P3 44 22 定値 44 9
ク た
(55 e 中 の
実施 では、 ンカ を介してア ノ ( )を結合した P ( dP P dP P)( で作成)を用 て、複製に よるこれらの 中 の り込みを調 た。
０368 体的には、以下のよ な実験手法を採用した。 の 置に sを含む
( e a e 55 e s 2 s 3 s 4 s 5 s( 33 37)また は対照( 38)) オ セインで 識されたプライ (P e 2 e ) らなる二本 をふ む ( に、 で希釈されたデオキ ク オ ド ン (5 )と3 5 ク ア 注を欠 した
グメント(2 5 )を混合し、プライ 応を行 た(2 u スケ )。
5 s C (P 7 5) O C O 5
S 中で 2 e a P e または2 d Ps( G C dP Pも dP P O・ グメント(G スケア)を用 て行われた。 Cで5 応を行 た後、この (2 4 を加えて反応を停止さ た。その 液を75Cで3 間加熱した後、反応 物を アク ア ド 7
による電気 で解析した。 物の ンドを イメ ジアナライザ( oec a a e、 イオラッド、 ド)により検出した。
０369 果を図48 Cに示す。P の の 存在 と比較して、 d P P( 48 C)または dP P( 48C)の で全長の 物 量が増加したこと ら、鋳型 中の sに相補して、 中にこれらの dP Pが取り込まれることがわ た。
０37０ 7 R A メラ ゼを用 た 表を結仝
aの ( 7 e 中 の
実施 では、蛍光 ( R を ンカ を介して結合した Pa( Pa P R Pa P ( で作成 を用 て 、転写によるこれらの 中 の り込みを調 た。
０371 体的には、以下のよ 実験手法を採用した。 O a を含む O
s C (P 7 6)中で、鋳型 (35 e 4 )とそのプ タ 分の (2 e )のア ングを行 た。 、4 s C (P 8 ) 24 C 2 スペ 5
32
T O o X 中で 2 P G P Ps
又は Pa P 2 、および5 7 ポ メラ ゼ( a a a)を用 て行われた。 Cで3 応を行 た後、 この (2 を加えて反応を停止さ た。その 液を75Cで3 間加熱した後、転写 2 アク ア ド 7 による電気 で 解析した。
０372 果を図49に示す。 sを含む を用 た場合のみ、電気 上で転写
( 7 e )の ンドの 動度が遅 なること ら、鋳型 sに相補して、 中にこれらの Pa Pが導入されたことがわ た。 、天然 のみの ント ( 49 側の o eの ン) 比較して、 Pa Pは 4 R Pa Pは であ た。
上 用の ， ０373 らは、複製および 実用 ベ の 選択 を有する
ステムを開発し、これにより遺伝ア ァベットを拡張した新たな イオテクノ の 出が可能になる。 s Pa 、これを含む 片をPC 幅することができる。さらに、 s Pa により、通常の 7 sおよびPa を部位 中に導入することもできる。したが て、 ステムは、新たな 機能性の および を作成するための新 術を提供する。 えて、修 飾 および 性塩基 、複製および の 構のさらなる解明にお ても 学的に重要である。
０374 製にお て、 らは、 s s、天然 のよ 望まし な を防ぐために、5 ア ド ン および 常の5 ン酸を 組み合わせることにより の 選択 を達成した。 5 ア ド ン酸は、 の 相補性を認識するための ポ メラ ゼ として有用である。 近、別の5 ン酸である、5 P ア ノ タ ン 5 ネ ト ン酸が、逆転写の 実度を改善することが報告された ( 38)。これらの 、 ポ メラ ゼの ン酸の認 、通常の ン の 何学的 合よりも の 確な 何学的 合を必 要とすることを示唆する。 5 ア ド ン および3 5 ク ア 性を有するポ メラ ゼの み合わ は、他の非 にも適用が可能で ある。
０375 s Pa 、 性塩基 が転写にお て機能する最初の例を提供し、こ れは既に複製で示されたよ に、 性の が転写にお ても 間の形 の相補性が重要性であることを示唆する。
０376 s Pa ステムは、新規 能性 子を作り出すために非常に有用で ある。4 プ ピ ピ 2 デヒド(Pa )も、鋳型 sに対して相 補 に部位 に導入されるので、4位を修飾した一連のPa 導体 も 中に導入することも可能である。その際に は、 P を含 む 片のPC により増幅することができる。したが て、 s Pa ステ ムは、任意の 置に機能性の ンポ ネン を導入した核酸を作成するための 力な道具となる。

Claims

求の
の 製の 法であ て、複製 応にお てア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる群 ら選択される基で、 v位の ン酸 の水酸基が置換されて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン酸を基 として ることを特徴とする、方法。
2 、ア ノ基である、請求 に記載の 。
3 応にお て、 キ ク ア 性を有する ポ メラ ゼを用 る、 請求 又は2に記載の 。
4 ク ア 性を有するポ メラ ゼが、 3 5 ク ア 性を 有する、ク グメント、 4 ポ メラ ゼ び好 来の ポ メ ラ ゼ らなる群 ら選択される、請求 な し3の ずれ 項に記載の 。5 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、 の 基を有する、 請求 な し4の ずれ 項に記載の 。
6 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、天然 の 基を有する、請 求 な し4の ずれ 項に記載の 。
7 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、以下の
Figure imgf000123_0001
こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である、請求 し5の ずれ 項に記載の 。
8 となるデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸が、以下の 2
2
Figure imgf000124_0001
こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のc cア キ 、置換され た若し は 換のc 2 cア 、
3 又は置換された若し は 換のc2 c3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸である、請求 な し5の ずれ 項に記載の 。
9 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる 群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて る、デオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
０ ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる 群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されており、 の 基を有する、デオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる 群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されており、 の 基を有するデオキ ボ ク オ ド 5 ン 。
2 ア ノ 、メチ ア ノ 、 メチ ア ノ 、メ カプト基及び オ 、 らなる 群 ら選択される基で、 v位の ン酸の水酸基が置換されて るデオキ ボ ク オ ド 5 ン酸の、請求 な し8の ずれ 項に記載の の 製のた めの 法における、 としての 。
3 下の
3
Figure imgf000125_0001
こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして、
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ 、
以下の 2
4
Figure imgf000125_0002
こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC Cア 、又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ とが、塩基 を形成して る核酸。
4 の 基が、以下の
7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ
2)7 (2 ) 3 4 5 b 3 イ
3)7 ( 2 ) 3 4 5 b 3 イ 4)5 ア ノ 7 (2 ) 3 4 S b 3 A5)5 アミノー7-(2-チフ ンドリル)-3H-イミダンド[4 5-b]Lゴリ ノレ ー3-イル ユ芸;
A6)5 アミノー7-( H-2-イミダンドリル)-3H-イミダンド[4 5-b]Lゴリ ノレ ー3 イ ユ
ル芸;
A7)4 (2 ラ コ 二 ノレ)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b] 。
ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;
A8)4 (2 チアンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b] 。
ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;
A-9)4-( H-2-イミダⅠグリル)-H-ロロ[2 3-b] ?リジン Ⅰ イ 三 ル茎: 。
A-Ⅰ０)6-アミノー4-(2-ラ コ 二 ノレ)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b]ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;
A-Ⅰ )6-アミノー4-(2-チフ ンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3-b] 。
ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸;刀乏び
A-Ⅰ2)6-アミノー4-( H-2-イミダンドリル)-ⅠH-Lゴロロ[2 3- 。
b]ヒリジン Ⅰ イ ユ
ル芸 からなるグルーオから 杉てされる、請求Ⅰ頁Ⅰ3に言已 の椎亥 麦。
[15] 三巳2の埋孟基が、以下の
B )2-トノレミルーⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸 B2)2-トノレミルー4-ョ@ドーⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B3)2-トノレミルー4-メチル ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B4)2-ト ユ ノレミルー4-(-プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールーⅠ イル芸; B5)2-トノレミルー4-(2-呈 奥アミノLゴ二 ノレ)-Ⅰ ユ H-ピロールーⅠ イル芸; B6)2-卜ノレミルー4-(3-呈 奥アミノ Ⅰ プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールー Ⅰ イ ユ
ル芸;
B7)2-ニトローⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B8)2-ニトロー4-ョ ユ
@ドーⅠH-ピロールーⅠ イル芸;
Bg)2-ニトロー4-メチル ⅠH-ピロールーⅠ イ ユ
ル芸;
B０)2- ユ
ニトロー4-(-プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールーⅠ イル芸; B )2-ニトロー4-(2-葺換アミノゴ二 レ)-H-ロールーⅠ イ 三 ル茎;Ⅰ乏び B 2)2-ニトロー4-(3-呈 奥アミノ Ⅰ プロピン Ⅰ イル)-ⅠH-ピロールーⅠ イ 基
らなるグ プ ら選択される、請求 3に記載の 。
6 、逆転写、複製 訳の 程で、塩基 を形成して る、請求 3な し 5の ずれ 項に記載の 。
7 下の
5
Figure imgf000127_0001
こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の 2
6
Figure imgf000127_0002
こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、
3 置換され 若し は 換のC Cア 、又は置換された若し は 換のC C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 を 、前記 2の 基を有する ク オ の な位置に、前記 の 基を 有する ク オ を組み込む
ことを含む、前記 製方法。
8 下の 2
7
Figure imgf000128_0002
こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC Cア 、
2 3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を調製する方法であ て、
以下の
8
Figure imgf000128_0001
こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ を含む 酸を 型として転写、逆転写 複製 を 、前記 の 基を有する ク オ の な位置に、前記 2の 基を する ク オ を取り込む
ことを含む、前記 製方法。
9 7または 8に記載の 法によ て調製された、 又は式2の 基 を有する ク オ を含む 。
2０ 、アンチセンス し は 、 ボ イム、アプタ
である、請求 9に記載の 。
2 下の
9
Figure imgf000129_0001
こにお て、
は、水素 ア ノ基であり、
2
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は、 又はC である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン 。
22 下の 2
０
Figure imgf000129_0002
こにお て、
3
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換され た若し は 換のC C は置換された若し は 換のC C
2 3ア 、又
2 3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、 4
は、ホ ト 基である。
で表される 基を有する ク オ ド 5 ン 。
23 下の 3
11
Figure imgf000130_0001
こにお て、
5
は、水素 置換ア ノ基であり、
は、置換された若し は 換の2 、置換された若し は 換の 2 、又は置換された若し は 換の 2 基であり、 そして
は 又はC である。
で表される 基を有する5 O (4 4 トキ ト ) 3 O (2
ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド。
24 下の 4
2
Figure imgf000130_0002
こにお て、
7
は、水素、 、置換された若し は 換のC Cア キ 、置換さ
3 れ 若し は 換のC ア
2 C 、
3 又は置換された若し は 換のC2 C3 ア キ 基 ら選択される基であり、そして、
8
は、ホ ト 基であり、
7 8
ただし、 が水素 プ ピ 基で、 が 基の場合を除 。
で表される 基を有する5 O (4 4 トキ ト ) 3 2 ソプ ピ イト)デオキ ボ ク オ ド。
25 8に記載の 法によ て調製された、 2で表される 基を有する ク オ
3
を含む であ て、 2の が、ビオチン又は蛍光分子で 換されたC Cア キ 、C2 C3ア 、又はC2 C3ア キ 基である、前記 26 R 、ビオチン又は蛍光分子で 換されたC Cア キ 、C2 Cア
3
、又はC Cア キ 基である、請求 22に記載の ク オ ド 5 ン 。
7
27 Rが、ビオチン又は蛍光分子で 換されたC Cア キ 、C2 Cア
3
、又はC Cア キ 基である、請求 24に記載の5 (4 4 トキ ト ) 3 O (2 ソプ ピ イト) デオキ ボ ク オ ド。
PCT/JP2006/324484 2005-12-09 2006-12-07 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対 WO2007066737A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006800525963A CN101365791B (zh) 2005-12-09 2006-12-07 核酸的复制方法及新型人工碱基对
US12/096,517 US8030478B2 (en) 2005-12-09 2006-12-07 Method for nucleic acid replication and novel artificial base pairs
KR1020087016493A KR101404374B1 (ko) 2005-12-09 2006-12-07 핵산의 복제방법 및 신규한 인공 염기쌍
AU2006323745A AU2006323745B2 (en) 2005-12-09 2006-12-07 Method for replicating nucleic acids and novel unnatural base pairs
JP2007549184A JP5146957B2 (ja) 2005-12-09 2006-12-07 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対
CA002642657A CA2642657A1 (en) 2005-12-09 2006-12-07 Method for replicating nucleic acids and novel unnatural base pairs
EP06834239A EP1970445B1 (en) 2005-12-09 2006-12-07 Method for nucleic acid replication and novel artificial base pairs
HK09101422.7A HK1121491A1 (en) 2005-12-09 2009-02-16 Method for nucleic acid replication and novel artificial base pairs

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005356883 2005-12-09
JP2005-356883 2005-12-09
JP2006-189806 2006-07-10
JP2006189806 2006-07-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007066737A1 true WO2007066737A1 (ja) 2007-06-14

Family

ID=38122882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/324484 WO2007066737A1 (ja) 2005-12-09 2006-12-07 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8030478B2 (ja)
EP (1) EP1970445B1 (ja)
JP (1) JP5146957B2 (ja)
KR (1) KR101404374B1 (ja)
CN (1) CN101365791B (ja)
AU (1) AU2006323745B2 (ja)
CA (1) CA2642657A1 (ja)
HK (1) HK1121491A1 (ja)
WO (1) WO2007066737A1 (ja)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009099073A1 (ja) * 2008-02-07 2009-08-13 The University Of Tokyo 非天然塩基を含む改変ｔＲＮＡ及びその用途
WO2009123216A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
WO2011043385A1 (ja) 2009-10-06 2011-04-14 独立行政法人理化学研究所 特異な塩基対を形成する人工塩基対
WO2013073602A1 (ja) * 2011-11-18 2013-05-23 独立行政法人理化学研究所 標的タンパク質に結合する核酸断片
US10513706B2 (en) 2014-04-09 2019-12-24 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
US10610571B2 (en) 2017-08-03 2020-04-07 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
US10626138B2 (en) 2013-08-08 2020-04-21 The Scripps Research Institute National Institutes Of Health (Nih), U.S. Dept Of Health And Human Services (Dhhs) Method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
US10696720B2 (en) 2016-06-24 2020-06-30 The Scripps Research Institute Nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
JP2021518127A (ja) * 2018-03-21 2021-08-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート
US11077195B2 (en) 2019-02-06 2021-08-03 Synthorx, Inc. IL-2 conjugates and methods of use thereof
WO2022131350A1 (ja) * 2020-12-18 2022-06-23 タグシクス・バイオ株式会社 Ｄｎａアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
US11834689B2 (en) 2017-07-11 2023-12-05 The Scripps Research Institute Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
US11879145B2 (en) 2019-06-14 2024-01-23 The Scripps Research Institute Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms
US11919934B2 (en) 2018-02-26 2024-03-05 Synthorx, Inc. IL-15 conjugates and uses thereof

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5649018B2 (ja) 2005-08-04 2015-01-07 タグシクス・バイオ株式会社 新規人工塩基対及びその利用
EP3369820B1 (en) * 2015-10-30 2021-12-08 TAGCyx Biotechnologies Inc. Dna aptamer capable of bonding to vwf
WO2017205336A1 (en) * 2016-05-23 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleotide derivatives and methods of use thereof
JP2022519020A (ja) * 2019-01-31 2022-03-18 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 非天然塩基対を用いて核酸を配列決定する方法
CN111214484B (zh) * 2020-01-21 2021-04-06 北京工商大学 一种共轭聚合物和聚集诱导发光小分子共掺的纳米粒子及其制备方法和应用
KR20220125170A (ko) 2021-03-04 2022-09-14 전북대학교산학협력단 인공 염기 화합물, 이를 포함하는 핵산 및 이의 용도, 및 핵산 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR200604211T1 (tr) * 1999-02-12 2007-02-21 Daiichi Sankyo Company Limiteddaiichi Sankyo Company Limited Yeni nükleosid ve oligonükleotid analoglarıYeni nükleosid ve oligonükleotid analogları
JP3893057B2 (ja) 1999-07-15 2007-03-14 独立行政法人科学技術振興機構 新規な核酸塩基対
WO2004007713A1 (ja) 2002-07-17 2004-01-22 Riken 新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用
US20110087015A1 (en) 2003-09-10 2011-04-14 Riken Nucleoside and nucleotide having an unnatural base and use thereof
JP5649018B2 (ja) 2005-08-04 2015-01-07 タグシクス・バイオ株式会社 新規人工塩基対及びその利用

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIARO I. ET AL.: "Idenshi ni Aratana Moji o Kumikomu -Jinkoteki na Sosuisei Enkitai no Kaihatsu-", BIONICS, vol. 3, no. 12, 1 December 2006 (2006-12-01), pages 68 - 71, XP003014228 *
HIRAO I. ET AL.: "An unnatural hydrophobic base pair system: site-specific inCorp. of nucleotide analogs into DNA and RNA", NAT. METHODS, vol. 3, no. 9, September 2006 (2006-09-01), pages 729 - 735, XP003014227 *
HIRAO I. ET AL.: "III Shinki Idenshi to Tanpakushitsu o Sosei suru Shinki Idenshi no Jinko Sosei", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 48, no. 11, 2003, pages 1496 - 1502, XP003014225 *
HIRAO I. ET AL.: "Non-hydrogen-bonded base pairs for specific transcription", NUCLEIC ACIDS SYMP. SER., no. 49, September 2005 (2005-09-01), pages 33 - 34, XP003008209 *
HIRAO I.: "Seimei o Tsukuru Ichi Seimei System no Rikai ni Nozomu Kagaku Idenshi Joho no Kakucho o Mezashita Jinko Enki Tai no Sekkei Kaihatsu", CHEMISTRY & CHEMICAL INDUSTRY, vol. 59, no. 8, 1 August 2006 (2006-08-01), pages 848 - 851, XP003014229 *
LECONTE A.M. ET AL.: "Amplify this! DNA and RNA get a third base pair", NAT. METHODS, vol. 3, no. 9, September 2006 (2006-09-01), pages 667 - 668, XP003014226 *
MITSUI T. ET AL.: "An unnatural hydrophobic base pair with shape complementarity between pyrrole-2-carbaldehyde and 9-methylimidazo(4,5)-pyridine", J. AM. CHEM. SOC., vol. 125, no. 18, 2003, pages 5298 - 5307, XP003008207 *
See also references of EP1970445A4 *
STUMBER M. ET AL.: "Synthesis, characterization and application of two nucleoside triphosphate analogues, GTPgammaNH2 and GTPgammaF", EUR. J. BIOCHEM., vol. 269, no. 13, 2002, pages 3270 - 3278, XP003014224 *

Cited By (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009099073A1 (ja) * 2008-02-07 2009-08-13 The University Of Tokyo 非天然塩基を含む改変ｔＲＮＡ及びその用途
JP5679147B2 (ja) * 2008-02-07 2015-03-04 独立行政法人理化学研究所 非天然塩基を含む改変ｔＲＮＡ及びその用途
EP2246428A1 (en) * 2008-02-07 2010-11-03 The University of Tokyo Modified trna containing non-natural nucleotide and use thereof
US8715984B2 (en) 2008-02-07 2014-05-06 Riken Modified tRNA containing unnatural base and use thereof
EP2246428A4 (en) * 2008-02-07 2011-04-13 Univ Tokyo MODIFIED TRNA WITH NON-NATURAL NUCLEOTIDE AND USE THEREOF
CN101981186A (zh) * 2008-03-31 2011-02-23 塔古西库斯生物株式会社 可高选择性且高效率地进行pcr扩增的新型dna
US8426569B2 (en) 2008-03-31 2013-04-23 Riken DNA capable of being amplified by PCR with high selectivity and high efficiency
JP5424414B2 (ja) * 2008-03-31 2014-02-26 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
KR101556426B1 (ko) * 2008-03-31 2015-10-02 탁시스 바이오 가부시키가이샤 고선택ㆍ고효율로 ｐｃｒ 증폭이 가능한 신규 ｄｎａ
AU2009232716B2 (en) * 2008-03-31 2015-02-05 Tagcyx Biotechnologies Novel DNA capable of being amplified by PCR with high selectivity and high efficiency
WO2009123216A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 独立行政法人理化学研究所 高選択・高効率でｐｃｒ増幅が可能な新規ｄｎａ
CN102741266A (zh) * 2009-10-06 2012-10-17 塔古西库斯生物株式会社 形成特异碱基对的人工碱基对
JPWO2011043385A1 (ja) * 2009-10-06 2013-03-04 独立行政法人理化学研究所 特異な塩基対を形成する人工塩基対
WO2011043385A1 (ja) 2009-10-06 2011-04-14 独立行政法人理化学研究所 特異な塩基対を形成する人工塩基対
US8895712B2 (en) 2009-10-06 2014-11-25 Riken Artificial base pair capable of forming specific base pair
US9873879B2 (en) 2011-11-18 2018-01-23 Tagcyx Biotechnologies Nucleic acid fragment binding to target protein
US9540650B2 (en) 2011-11-18 2017-01-10 Tagcyx Biotechnologies Nucleic acid fragment binding to target protein
WO2013073602A1 (ja) * 2011-11-18 2013-05-23 独立行政法人理化学研究所 標的タンパク質に結合する核酸断片
JPWO2013073602A1 (ja) * 2011-11-18 2015-04-02 独立行政法人理化学研究所 標的タンパク質に結合する核酸断片
US10626138B2 (en) 2013-08-08 2020-04-21 The Scripps Research Institute National Institutes Of Health (Nih), U.S. Dept Of Health And Human Services (Dhhs) Method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
US11634451B2 (en) 2013-08-08 2023-04-25 The Scripps Research Institute Method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
US10513706B2 (en) 2014-04-09 2019-12-24 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
US11466279B2 (en) 2014-04-09 2022-10-11 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
US10696720B2 (en) 2016-06-24 2020-06-30 The Scripps Research Institute Nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
US10696719B2 (en) 2016-06-24 2020-06-30 The Scripps Research Institute Nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
US11834479B2 (en) 2016-06-24 2023-12-05 The Scripps Research Institute Nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
US11834689B2 (en) 2017-07-11 2023-12-05 The Scripps Research Institute Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
US11622993B2 (en) 2017-08-03 2023-04-11 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of autoimmune diseases
US11701407B2 (en) 2017-08-03 2023-07-18 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
US10610571B2 (en) 2017-08-03 2020-04-07 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
US11919934B2 (en) 2018-02-26 2024-03-05 Synthorx, Inc. IL-15 conjugates and uses thereof
JP7342017B2 (ja) 2018-03-21 2023-09-11 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート
JP2021518127A (ja) * 2018-03-21 2021-08-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート
US11077195B2 (en) 2019-02-06 2021-08-03 Synthorx, Inc. IL-2 conjugates and methods of use thereof
US11879145B2 (en) 2019-06-14 2024-01-23 The Scripps Research Institute Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms
WO2022131350A1 (ja) * 2020-12-18 2022-06-23 タグシクス・バイオ株式会社 Ｄｎａアプタマーのスクリーニングに使用可能な新規人工塩基を有するデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびこれを含有する核酸

Also Published As

Publication number Publication date
US20100036111A1 (en) 2010-02-11
EP1970445B1 (en) 2012-09-26
CN101365791A (zh) 2009-02-11
JPWO2007066737A1 (ja) 2009-05-21
JP5146957B2 (ja) 2013-02-20
CA2642657A1 (en) 2007-06-14
HK1121491A1 (en) 2009-04-24
CN101365791B (zh) 2012-07-25
KR101404374B1 (ko) 2014-06-09
KR20080093986A (ko) 2008-10-22
AU2006323745B2 (en) 2012-11-22
EP1970445A4 (en) 2009-07-29
EP1970445A1 (en) 2008-09-17
US8030478B2 (en) 2011-10-04
AU2006323745A1 (en) 2007-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007066737A1 (ja) 核酸の複製の方法及び新規人工塩基対
Xue et al. A vitamin-C-derived DNA modification catalysed by an algal TET homologue
ES2827227T3 (es) Métodos y sondas para identificar alelos génicos
JP2013528372A (ja) エンドリボヌクレアーゼ組成物およびその使用方法
JP2011512871A5 (ja)
CN107760686B (zh) Dkk-1蛋白的核酸适配体及其应用
CN113593636B (zh) 测序结果分析方法、系统及计算机可读存储介质和电子设备
WO2019114675A1 (zh) 一种核酸适体及其在识别并结合cd171中的应用
Gao et al. Progress in the isolation of aptamers to light-up the dyes and the applications
Yin et al. Ginseng omics for ginsenoside biosynthesis
CN107064515A (zh) 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒
CN109799350B (zh) 蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用
Wen et al. Transcriptomic and proteomic analyses reveal the common and unique pathway (s) underlying different skin colors of leopard coral grouper (Plectropomus leopardus)
CN108289924A (zh) 阻断组蛋白识别结构域的小分子
WO2016119448A2 (zh) 不同种属微生物间种类和丰度比较的人工外源性参照分子
WO2023202030A1 (zh) 一种小分子rna的高通量测序文库构建方法
Duan et al. Proteome evaluation of homolog abundance patterns in Arachis hypogaea cv. Tifrunner
CN114621958B (zh) 特异性识别atp的单链dna适配体序列及其应用
US20230041228A1 (en) Small Molecule Inhibition of Micro-RNA-210 Reprograms an Oncogenic Hypoxic Circuit
US20220267839A1 (en) Target validation, binding site identification, and profiling of rna targets
US20140024540A1 (en) Ligand identification
KR101392970B1 (ko) 민감도와 특이도가 향상된 표적 핵산의 검출방법
Hirose et al. A Case Study on the Keap1 Interaction with Peptide Sequence Epitopes Selected by the Peptidomic mRNA Display
CN109439655A (zh) 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法
Merritt et al. Parallel analysis of mutant human glucose 6‐phosphate dehydrogenase in yeast using PCR colonies

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007549184

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087016493

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006323745

Country of ref document: AU

Ref document number: 3527/CHENP/2008

Country of ref document: IN

Ref document number: 2006834239

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006323745

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20061207

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680052596.3

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2642657

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12096517

Country of ref document: US