WO2007015511A1

WO2007015511A1 - Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、およびｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法。

Info

Publication number: WO2007015511A1
Application number: PCT/JP2006/315285
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Kanamaru; Makoto Ueda; Ryuuji Miki; Hirokazu Nanba
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-02-08
Also published as: JP5291934B2; EP1918375A1; EP1918375B1; US20110086396A1; US8227228B2; JPWO2007015511A1; EP1918375A4

Abstract

　本発明は、キャンディダ　インターメディア（Candida intermedia）から単離・精製された新規Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、当該Ｄ－アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、および当該Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を導入された形質転換体、並びに、該形質転換体を培養し、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ製造する方法に関する。また、本発明は、ラセミ体アミノ酸に当該Ｄ－アミノ酸オキシダーゼを作用させることによる、Ｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンの製造方法、より好適な実施態様としては、ラセミ体アミノ酸に、該Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素及び補酵素再生能を有する酵素を作用させてＬ－アミノ酸を製造する方法。本発明によれば、Ｌ－アミノ酸、２－オキソ酸、又は環状イミンを効率的かつ工業的に製造することができる。

Description

明細書

D_アミノ酸ォキシダーゼ、および L_アミノ酸、 2_ォキソ酸、又は環状ィミンの製造方法。

技術分野

[0001] 本発明は、微生物の生産する新規な D アミノ酸ォキシダーゼ、これをコードする D NA、及び D アミノ酸ォキシダーゼを生産する能力を有する微生物あるヽは形質転換体を用いた D—アミノ酸ォキシダーゼの製造方法、また、 D—アミノ酸ォキシダーゼを用いた効率的な L アミノ酸、 2—ォキソ酸、又は環状ィミンの製造方法に関するものである。

関連出願の相互参照

[0002] 日本国特許出願 2005— 224505号（2005年 8月 2日出願）および日本国特許出願 2006— 119408号（2006年 4月 24日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。

背景技術

[0003] L アミノ酸の製造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成法など種々の方法が知られている。抽出法では蛋白質加水分解物力もの大規模な精製設備が必要となる。化学合成法で製造されるアミノ酸は通常ラセミ体であるため、光学活性体を製造するためには、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。発酵法では生成物濃度が低ぐ抽出法同様大規模な精製設備を必要とし、また、非天然型のアミノ酸の合成には適して!/ヽなヽ。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を回避して、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。

L—アミノ酸の酵素的合成法としては、例えばラセミ体のアミノ酸に D—アミノ酸ォキシダーゼを作用させる方法が知られている。

[0004] D—アミノ酸ォキシダーゼ（酵素番号 [EC 1. 4. 3. 3])は、酸素の存在下、 D—アミノ酸を酸化し、過酸化水素、 2—ォキソ酸、およびアンモニアを生成する酵素である。この D—アミノ酸ォキシダーゼは、例えばラセミ体アミノ酸を立体選択的に酸ィ匕して、 L アミノ酸および 2—ォキソ酸を生成するなど、産業上有用な活性を持つことが知られている。また、 L アミノ酸は医薬品等の合成中間体や甘味料として有用な化合物である。

[0005] D アミノ酸ォキシダーゼを産生する微生物としては、例えばトリゴノプシスノリアビリス（Trigonopsis variabilis) (特許文献 1)、フザリウムォキシスポラム（Fusarium ox ysporum) (特許文献 2)、キャンディダトロピカリス（Candida tropicalis) (非特許文献 1)等が知られており、各々の酵素は精製、単離され、その性質が明らかにされている。また、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、トリゴノプシスノリアビリス（Trigonopsis variabilis) (特許文献 3)、フザリウムソラニ (Fusarium solani) (特許文献 4)、ロドトルーラグラシリス（Rhodotorula gracilis) (特許文献 5)、キャンディダボイディ-一 (Candida boidinii) (非特許文献 2)由来の遺伝子について知られている。これら形質転換体により D—アミノ酸ォキシダーゼを高生産するためには、多くの場合、発現を抑制した状態で培養した後、誘導物質を添カロするなどの手段で酵素を高生産化させる方法が知られている。

[0006] また、キャンディダ属に含まれるキャンディダインターメディア（Candida intermedia )に関しては、粗酵素液の状態で D アミノ酸ォキシダーゼ活性があることが知られている (非特許文献 3)。

[0007] さらに、 L—アミノ酸の酵素的合成法としては、例えばラセミ体のアミノ酸に D ァミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させて、 L アミノ酸を製造する立体反転反応による製造方法が知られている（非特許文献 4、 5)。しかし、非特許文献 4、 5に開示の方法では、高価な市販酵素や微生物から精製された酵素を使用する必要があり、工業的に使用するには課題を抱えていた

[0008] この課題に対しては、例えば、 D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体を育種、培養し、ラセミ体アミノ酸に作用させて L—アミノ酸を製造する方法が知られている（特許文献 6)。し力しながら、この特許文献 6に記載されている実施例によると、当該形質転換体を用いた反応により生成する L アミノ酸の濃度は約 25mMと、工業的に製造を行なうには低！ヽ濃度である。

特許文献 1：特公昭 62— 501677号公報

特許文献 2：特開平 11— 318439号公報

特許文献 3：特開昭 63— 71180号公報

特許文献 4 :欧州特許出願公開第 EP364275号

特許文献 5 :国際公開第 WO97Z040171号パンフレット

特許文献 6：国際公開第 WO05Z090950号公報

^^特干文献 1： Some Properties of Peroxisomeassociated D— Ammo Acid Oxid ase f rom Candida tropicalis", Agricul. and Biol. Chemistry, 1986年， 50卷， 10 号， 2637 頁

特 S干文献 2： Characterization and High-level Production of D— Amino Acid Oxida se in Candida boidinn， Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001年， 65巻， 3号， 627頁非特言午文献 3： "Production of D- Amino Acid Oxidase by Candida tropicalis", J. Fer ment. TechnoL, 1977年， 55巻， 1号， 13頁

非特言午文献 4： "Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to the L- Enantiomer〃， J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1990年， 13巻， 947頁

非特言午文献 5 : "Enzymatic synthesis of chiralintermediates for Omapatrilat,an antihy pertensive drug", Biomolecular Engineerin, 2001年， 17巻， 167頁

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明で得た D アミノ酸ォキシダーゼは、酸素の存在下、 D アミノ酸を酸ィ匕し、過酸化水素、 2—ォキソ酸およびアンモニアを生成する酵素である。さらに、この D— アミノ酸ォキシダーゼをアミノ酸脱水素酵素と組み合わせる力、またはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせることで、ラセミ体アミノ酸が、ケト酸ある、はイミノ酸を経て、 L -アミノ酸へと定量的に変換される立体反転反応に利用できる有用な酵素である。

[0010] 本発明の目的は新規の D アミノ酸ォキシダーゼを提供することにある。また、本発明の目的は、当該 D アミノ酸ォキシダーゼのアミノ酸配列、その遺伝子の塩基配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を提供することにある。

[0011] また、本発明の好適な実施形態の目的は、 D アミノ酸ォキシダーゼを高生産し、かつアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を同時に生産する形質転換体を提供することにある。

[0012] さらに本発明は、当該 D—アミノ酸ォキシダーゼあるいは形質転換体を利用した効率的な L—アミノ酸、 2—ォキソ酸、又は環状ィミンの製造方法を提供することにある。課題を解決するための手段

[0013] 本発明者らは上記課題に鑑み、キャンディダインターメディア（Candida intermedia )力も D アミノ酸ォキシダーゼを単離、精製し、 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成し、高活性な形質転換体を育種した。本発明で得た D アミノ酸ォキシダーゼの場合、発現の抑制と誘導物質の添加などの手段を用いることなく形質転換体を培養した場合でも、高生産が可能であった。本発明で得られた D—アミノ酸ォキシダーゼを単独、あるいはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせてラセミ体アミノ酸に作用させることにより、 2—ォキソ酸又は L アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至つた。

[0014] 更に本発明者らは鋭意研究した結果、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体を育種した。通常、複数の異なる酵素遺伝子を有する形質転換体では、個々の酵素遺伝子を単独で有する形質転換体に比べて、各酵素の生産量は低下することが予想される。しかし、驚くべきことに、本発明の好適な実施形態における D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体は、 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子のみを有する形質転換体に比べて、 D アミノ酸ォキシダーゼの培養液当たりの活性値が 50倍以上にまで向上することを見出した (後述の実施例 12に対応)。

[0015] これまで、 D アミノ酸ォキシダーゼの遺伝子と、少なくとも 1つ以上の D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチド (例えば、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生酵素)の遺伝子を有する形質転換体において、 D アミノ酸ォキシダーゼの活性力 D—アミノ酸ォキシダーゼの遺伝子のみを有する形質転換体に比べて著しく向上したという例は知られていない。例えば、前述の特許文献 6 (国際公開第 WO05/090950号公報）においても、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体にぉヽて、 D—アミノ酸ォキシダーゼの活性力 D—アミノ酸ォキシダーゼの遺伝子のみを有する形質転換体に比べて向上したと、う事例は示されて、な、。

[0016] 上記各遺伝子を有する形質転換体が、 D アミノ酸ォキシダーゼの遺伝子を単独で有する形質転換体と比較して D アミノ酸ォキシダーゼの活性が顕著に向上することは、本発明者独自の試みによって見出された。そして、本発明の好適な実施形態で得られた D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体をラセミ体アミノ酸に作用させることにより、効率的に L アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。

[0017] 即ち、本発明は、以下の 1または複数の特徴を有する。

[1]本発明の特徴の一つは、キャンディダインターメディア（Candida intermedia)由来の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、下記の理化学的性質を有するポリペプチドである：

(1)分子量

分子量約 252,000

サブユニットの分子量約 42,000；

(2)作用温度の範囲

温度範囲少なくとも 20°C〜60°C ;

(3)作用 pHの範囲

pH範囲少なくとも 6〜： LO. 5。

[2]本発明の特徴の一つは、以下の（a)、（b)又は (c)のポリペプチドである：

(a)配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド；

(b)配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列にお!、て 1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および Z又は付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチド；

(c)配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列と 69%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチド。

[3]本発明の特徴の一つは、前記 [1]又は [2]のポリペプチドをコードする DNAである。

[4]本発明の好適な実施形態の DNAは、以下の（d)、（e)又は（f)の DNAである：

(d)配列表配列番号 2に示される塩基配列力なる DNA;

(e)配列表配列番号 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA。

(f)配列表配列番号 2に示される塩基配列と 67%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA

[5]本発明の特徴の一つは、前記 [3]又は [4]の DNAをベクターに挿入して得られる組換えプラスミドである。

[6]本発明の好適な実施形態の組換えプラスミドは、更に、 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAがベクターに挿入された組換えプラスミドである。

[7]本発明の特徴の一つは、前記 [5]の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。

[8]本発明の好適な実施形態は、更に、 D—アミノ酸ォキシダーゼ以外の酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAが導入された [7]の形質転換体である。

[9]本発明の特徴の一つは、前記 [1]又は [2]のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とする D -アミノ酸ォキシダーゼの製造方法である。

[10]本発明の特徴の一つは、前記 [1]又は [2]のポリペプチド、又は当該ポリぺプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式（1)： [0018] [化 1]

[0019] (式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（2)：

[0020] [化 2]

[0021] (式中、 Rは前記と同じ)で表される L アミノ酸、又は、一般式（3)：

[0022] [化 3]

[0023] (式中、 Rは前記と同じ)で表される 2—ォキソ酸を製造する方法である。

[11]本発明の特徴の一つは、 [1]又は [2]のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式 (4)：

[0024] [化 4]

[0025] (式中、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖)で表される環状アミノ酸に作用させ、一般式 (5) :

[0026] [化 5]

[0027] (式中 R'は上記と同じ)で表される環状 L アミノ酸、又は、一般式 (6)

[0028] [化 6]

[0029] (式中 R'は上記と同じ)で表される環状イミンを製造する方法である。

[12]本発明の特徴の一つは、 [1]又は [2]のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（1)：

[0030] [化 7]

[0031] (式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（2)：

[0032] [化 8]

[0033] (式中、 Rは前記と同じ)で表される L アミノ酸を製造する方法である。

[13]本発明の特徴の一つは、 [1]又は [2]のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式 (4)：

[0034] [化 9]

[0035] (式中、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖)で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、一般式 (5)：

[0036] [化 10]

[0037] (式中 R'は上記と同じ)で表される環状 L アミノ酸の製造方法である。

[14]本発明の特徴の一つは、 D アミノ酸ォキシダーゼの生産量向上方法であって、 D アミノ酸ォキシダーゼをコードする DNA、及び、少なくとも 1種の当該 D ァミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAで、宿主微生物を形質転換することを特徴とする方法である。

[ 15]本発明の特徴の一つは、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAと、当該 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAとを挿入断片として含み、前記 D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAのみを挿入断片として含む組換えプラスミドに比べて D アミノ酸ォキダーゼの生産量が向上した糸且換えプラスミドである

[ 16]本発明の特徴の一つは、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA、及び、当該 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAとで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体であって、前記 D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする D NAのみで形質転換された形質転換体に比べて D—アミノ酸ォキシダーゼ活性が向上した形質転換体である。

[17]本発明の特徴の一つは、 [16]の形質転換体を培養し、培養物中に D ァミノ酸ォキシダーゼを蓄積させ、これを採取することを特徴とする D アミノ酸ォキシダーゼの製造方法である。

[18]本発明の特徴の一つは、 [16]の形質転換体を、前記式（1)で表されるラセミ体アミノ酸、又は、前記式 (4)で表される環状アミノ酸に作用させ、前記式（2)で表される L—アミノ酸、又は、前記式（5)で表される環状 L—アミノ酸を製造する方法である。

[0038] 本発明のその他の特徴およびその効果は、以下の実施形態および図面によって明らかにされる。

発明の効果

[0039] 本発明は上述の構成力なり、新規な D—アミノ酸ォキシダーゼを効率よく製造することができる。また、当該 D—アミノ酸ォキシダーゼ、または、当該 D—アミノ酸ォキシダーゼを生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良く L—アミノ酸、 2—ォキソ酸、又は環状イミンを製造することができる。

[0040] 本発明の好適な実施形態では、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を生産する形質転換体を利用することで、効率良く L—アミノ酸を製造することができる。これらの好適な実施形態によれば、各酵素を生産する形質転換体を別々に培養する必要がなぐ反応の基質となるラセミ体アミノ酸の種類によっては、 D—アミノ酸ォキシダーゼの生産量が不十分なため大量の培養液を必要とする等の技術的課題が解決される。

図面の簡単な説明

[0041] [図 1]図 1は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド PCDA003の構成を示す図である。

[図 2]図 2は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼの D— Pheに対する Km値を示すグラフである。

[図 3]図 3は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼの作用温度と相対活性との関係（至適温度を含む)を示すグラフである。

[図 4]図 4は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼの作用 pHと相対活性との関係（至適 pHを含む)を示すグラフである。

[図 5]図 5は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼの処理温度と残存活性との関係 (温度安定性を含む)を示すグラフである。

[図 6]図 6は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼの処理 pHと残存活性との関係 (pH安定性を含む)を示すグラフである。

[図 7]図 7は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子、ロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミド pFTLBD Aの構成を示す図である。 [図 8]図 8は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子、フエ-ルァラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミド pF TPBDAの構成を示す図である。

[図 9]図 9は、本発明の実施形態としてのロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミド PFTLBの構成を示す図である。

[図 10]図 10は、本発明の実施形態としてのフエ二ルァラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミド pFTPBの構成を示す図である。

[図 11]図 11は、本発明の実施形態としての D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド pSTNDAの構成を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0042] 以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。

[0043] 1.ポリペプチド

まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。

1)作用

酸素の存在下、 D—アミノ酸を酸ィ匕し、 2—ォキソ酸、過酸化水素、およびアンモ- ァを生成する。

2)分子量

分子量約 252,000

サブユニットの分子量約 42,000；

3) D—フエ-ルァラニンに対する Km値

約 1. 7mM ;

4)作用温度の範囲

温度範囲少なくとも約 20°C〜約 60°C、至適温度約 40°C〜約 50°C ; (温度範囲とは酵素が好適に作用する温度範囲であり、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度である。本酵素は上記温度範囲以外の温度でも作用する。 ) 5)作用 pHの範囲

pH範囲少なくとも約 6〜約 10. 5、至適 pH約 8. 5〜約 9. 5 ;

(pH範囲とは酵素が好適に作用する pH範囲であり、至適 pHは酵素が最も好適に作用する pHである。本酵素は上記範囲以外の pHでも作用する。 )

6)温度安定性

40°C以下で安定；

7) pH安定性

pH7. 8〜8. 7で安定;

8)比活性（1分間に 1 μ molの過酸ィ匕水素を生成する酵素量を lunitと定義する）純粋酵素 lmgあたり 44. 8unit (30°C) o

実施形態の D アミノ酸ォキシダーゼは、他の D アミノ酸ォキシダーゼと比べて、例えば以下のような異なる性質を有している。

(a) 至適温度が 30〜40°C、至適 pHが 7. 5〜8であるフザリウム'ォキシスポラム（F usarium oxysporum) (特開平 11 318439)の D—アミノ酸ォキシダーゼとは、至適温度、至適 pHが異なる。

(b) 分子量 43, 000のサブユニットからなるホモ 2量体構造であるトリゴノプシス'バリアビリス（Trigonopsis variabilis) (特公昭 62— 501677、特開招 63— 71180)の D アミノ酸ォキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性 31. 6%)。

(c) 分子量 38, 000の単量体構造であるキャンディダ ·ボイディ-一 (Candida boidi nii) (Biosci. Biotechnol. Biochem.ゝ 2001年、 65卷、 3号、 627項； Yeastゝ 2000年、 16 卷、 1217頁）の D アミノ酸ォキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性 60. 1%)。

(d)分子量 41, 000のホモ 2量体構造であるロドトルーラ 'グラシリス（Rhodotorula gra cilis) (WO97/040171 ; Protein expression and purificationゝ 1998年、 14卷、 289 頁）の D アミノ酸ォキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性 28. 9%)。

(e)フザリウム.ソラ - (Fusarium solani) (EP364275)の D アミノ酸ォキシダーゼとは、アミノ酸配列で大きく異なる（アミノ酸配列相同性 29. 0%)。

(f)分子量 39, 000の単量体構造であるキャンディダ 'トロピカリス（Candida tropicalis ) (Agricul. and Biol. Chemistry, 1986年、 50卷、 10号、 2637項）の D—アミノ酸ォキシダーゼとは、酵素の構造が異なる。

[0045] なお、実施形態における「相同性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示として GENETYX Ver. 7遺伝情報処理ソフトウェア ZWindows版 (ゼネティックス社製）のホモロジ一検索を使用した

[0046] 2. D—アミノ酸ォキシダーゼ活性測定

実施形態において、ポリペプチドの D—アミノ酸ォキシダーゼ活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ペルォキシダーゼを用いた酵素法で定量することができる。酵素法による過酸ィ匕水素の定量は次のように実施する。

[0047] 酵素溶液を適宜希釈し、 50mM DL フエ-ルァラニン、 0. 80mM 4—アミノアンチピリン、 1. 31mM N ェチル N— (2 ヒドロキシ一 3—スルフォプロピル）一 m—トルイジン、 6uZml ペルォキシダーゼ（TOYOBO Inc.社製）、および 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)からなる発色液と 1 : 5で混合し、 30°Cで 30分間反応させ、 555nmの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量する。実施形態では、特に明記しない場合を除き、本方法を用 V、て D -アミノ酸ォキシダーゼ活性を測定した。

[0048] 3.微生物

実施形態のポリペプチドは、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する微生物力取得できる。本発明で用いる D アミノ酸ォキシダーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できる力工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。

[0049] D アミノ酸ォキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター属（Arthrobacter)、ァスペルギルス属（Aspergillus)、キャンディダ属（Candida)、タリプトコッカス属（Cryptococ cus)、クルブラリア属（Curvularia)、ェクソフィアラ属 (Exophiala)、フサリウム属（Fusari um)、ジべレラ属 (Gibberella)、ノヽンセヌラ属 (Hansenula)、クオエッケラ属 (Kloeckera) 、タリべロマイセス属 (Kluyveromyces)、ニューロスポラ属 (Neurospora)、ピキア属 (Ph ichia)、ロドスポリディウム属 (Rhodosporidium)、ロドトノレラ属 (Rhodotorula)、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces)、トリゴノプシス属（Trigonopsis)、バーチシリウム属（V erticillium)、及びャロヴィァ属 (Yarrowia)等が挙げられる。

[0050] なかでもキャンディダ（Candida)に属する微生物が好ましぐキャンディダ 'インターメディア（Candida intermedia)がより好ましぐ更に好ましくは、キャンディダ'インターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株である。

[0051] なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、 UV照射や、 N— メチル N，一-トロ一 N -トロソグァ-ジン（NTG)、ェチルメタンスルフォネート（ EMS)等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。

[0052] 本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュ一クロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、ォレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモ-ゥム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、炭酸カルシゥム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽ェキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。

[0053] 更に、 D アミノ酸ォキシダーゼの生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これら D アミノ酸ォキシダーゼ生産増強物質の培地中濃度は、 0. 001重量％以上、 10重量％以下、好ましくは 0. 01 重量％以上、 1重量％以下の範囲から選ばれる。

[0054] 培養は通常好気的に行い、温度として 10°C以上、 60°C以下、好ましくは 20°C以上、 50°C以下の範囲、 pHとしては 3以上、 11以下、好ましくは pH5以上、 9以下の範囲が用いられ、培養時間は 1日以上、 5日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式の、ずれの培養方法でもよ!/、。

[0055] 培養終了後に培養液力遠心分離などにより菌体^^め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトダラフィ一法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。

[0056] 4.アミノ酸配列

本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号 1に示されるポリペプチドをあげることができる。

[0057] また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および Z又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号 1に示されるアミノ酸配列と 69%以上、好ましくは 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上、より好ましくは 99% 以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよ！/、。

[0058] 「数個のアミノ酸」とは、 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは 20アミノ酸以下であり、より好ましくは 15アミノ酸以下、さらに好ましくは 10アミノ酸以下、最も好ましくは、 5、 4、 3、または 2個以下である。

[0059] また、「D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件にお、て、配列番号 1に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチドを用いた場合の 10%以上、好ましくは 40%以上、より好ましくは 60%以上、さらに好ましくは 80 %以上の活性を示すポリペプチドのことを！、う。

[0060] 5. DNA

本発明の実施形態としての「DNA」について説明する。本発明の DNAは、上記のようなポリペプチドをコードする DNAであればよ!、。配列表の配列番号 2で示される DNAであってもよ、し、配列表配列番号 2に示される塩基配列におヽて 1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、かつ D— アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAであってもよい。

[0061] 「数個の塩基」とは、 DNAによってコードされるポリペプチドが D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは 50塩基以下であり、より好ましくは 30塩基以下、さらに好ましくは 20アミノ酸以下、最も好ましくは、 1 0、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、または 2個以下である。

[0062] また、配列番号 2で示される塩基配列と 67%以上、好ましくは 70%以上、 75%以上、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上、より好ましくは 99%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリぺプチドをコードする DNAであってもよ!/ヽ。

[0063] また、本発明の DNAとしては、配列表配列番号 2で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAにストリンジェントな条件でハイブリダィズし、かつ、 D—ァミノ酸ォキサダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAであってもよい。

[0064] ここで「配列表配列番号 2に示す塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」とは、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンハイブリダィゼーシヨン法等を実施した際に、配列表配列番号 2に示す塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNAと、特異的にハイブリッドを形成し得る DNAを言う。

[0065] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会社製)の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダィズさせた後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩ィ匕ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が行われる条件である。

[0066] 本発明の DNA(D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子）は、前述したような D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する微生物から取得することができる。目的の DNAを取得するには、例えば以下の方法によることができる。 [0067] まず、 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する微生物より精製された D—アミノ酸ォキシダーゼにリジルエンドべプチダーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、 HPLC等を用いて得られたポリペプチドを精製し、気相プロテイン ·シークェンサ一などで、内部アミノ酸配列を決定する。次に既知 D—ァミノ酸ォキシダーゼの相同配列部位にもとづ、て設計した DNAプライマーを合成する。

[0068] 次に、 D—アミノ酸ォキシダーゼの起源となる微生物より、染色体 DNAを単離する。染色体 DNAは、培養された細胞から、 UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (M O BIO Laboratories, Inc.社製）等を用いて得られる。この染色体 DNAを铸型に、上記の DNAプライマーを用いて PCRを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。

[0069] 次に、既に取得した部分遺伝子のさらに N末側と C末側をコードする DNA断片を、インバース PCR法により取得することができる（例えば Nucleic Acids Res., 16, 8186 ( 1988)を参照)。この DNA断片の塩基配列を決定し、部分遺伝子の塩基配列とあわせることで、翻訳開始部位力終止コドンまでを含むと推定される D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の全長塩基配列を得る。

[0070] 得られた塩基配列の解析から、染色体 DNAより得られる D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子中にイントロンの存在が推定される場合は、以下に示すような方法でイントロンを除去した D -アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を取得することができる。

[0071] まず、 D—アミノ酸ォキシダーゼの起源となる微生物を培養して得た菌体から、 ISO GEN (-ツボンジーン社製）を用いて全 RNAを抽出し、 TaKaRa RNA LA PCR Kit (A MV) Ver.1.1 (TaKaRa社製）を用いて、全 RNAを铸型に相補鎖 DNA (cDN A)を調製する。インバース PCR法により得られた上記 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子全長配列の N末端、 C末端部分の塩基配列からプライマーを設計する。設計したプライマ一を用いて、 cDNAを铸型に PCRを行い、イントロンを含まない全長配列力オーブンリーディングフレームを決定する。決定されたオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列に基づ、て、 D—アミノ酸ォキシダーゼ酵素の内部アミノ酸配列を含むことを確認すればよい。

[0072] 6.形質転換体'ベクター上記方法によって取得した DNA、または該 DN Aをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。

[0073] 宿主、ベクターとしては、「組換え DNA実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成 8年 3月 22日改定）に記載の宿主一ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、シユードモナス（Pseudo monas)属、フラボバタテリゥム（Flavobacterium)属、バチノレス（Bacillus)属、セラチア（ Serratia)属、コリネバタテリゥム（Corynebacterium)属、ブレビバタテリゥム（Brevibacte rium)属、ァグロノくクテリゥム (Agrobacterium)属、ァセトノクタ一 (Acetobacter)属、グルコノバクタ一（Gluconobacter)属、ラクトバチルス (Lactobacillus)属、ストレプトコッカス（Streptococcus)属またはストレプトマイセス（Streptomyces)属に属する微生物を用いることがでさる。

[0074] ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてェシエリヒア'コリ（Escherich ia coli)、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、 pUC18、 pUC19、 pBR322、 pACYC18 4、 pSTV28、 pSTV29、 pSC101、 pT7Blue、又は pUCNT、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネータ一、ェンハンサー、 SD配列、複製開始部位 (ori)、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クロ一ユング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。

[0075] 形質転換体の一例として、キャンディダ.インターメディア（Candida intermedia) NB RC0761株から上記のようにして取得した DNAを pUCNT (WO94/03613参照）に組み込んだ組換えプラスミド PCDA003を用いてェシエリヒア'コリ（Escherichia coli ) HB101、および JM109を形質転換し、形質転換体エシリヒア 'コリ（Escherichia c oli) HB101 (pCDA003)、および JM109 (pCDA003)を得ることができる。

[0076] 本発明で得られた形質転換体ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pCDAO 03)は、 2006年 7月 10曰に受領番号 FERM BP— 10639として（原寄託曰 2005 年 7月 19日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、また、形質転換体ェシエリヒア.コリ（Escherichia coli)jM109 (pCDA003)は、 2006年 7月 10 日に受託番号 FERM BP— 10638として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD：〒 305— 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号）に寄託されている（原寄託日 2005年 6月 28日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管)。

[0077] なお、本発明で用いた組換え DNA技術は当該分野にぉ、て周知であり、例えば、 Molecularし loning 2nd Edition (Cold bpnng Harbor Laboratory Press, 1989)、 Curren t Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley- Interscie nce)に記載されている。

[0078] 7.形質転換体等の培養

本発明の D アミノ酸ォキシダーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、 L—アミノ酸又は 2—ォキソ酸の製造に禾 IJ用することがでさる。

[0079] 微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースゃシユークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニゥム塩、ァンモ-ァ水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカ一などが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。

[0080] 培養は温度範囲 25°C力も 40°Cで行える力 25°Cから 37°Cが特に好ましい。また、 pHは 4から 8で培養できる力 5力ら 7. 5が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。

[0081] 必要に応じてイソプロピル 1 チォー j8— D—ガラタトサイド (IPTG)、ラタトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。

[0082] 8. L アミノ酸等の製造方法実施形態で得られる D アミノ酸ォキシダーゼを使用すること〖こよる、効率的な L— アミノ酸、 2—ォキソ酸、又は環状ィミンの製造方法について説明する。 2—ォキソ酸は、ラセミ体アミノ酸に D—アミノ酸ォキシダーゼを作用させ、 D—アミノ酸を酸ィ匕することにより得ることができる（光学分割反応)。本反応において D—アミノ酸から 2—才キソ酸に至るまでの中間体としてイミノ酸が生成すると推測される力イミノ酸は加水分解反応により、すぐに 2—ォキソ酸へと変換され、最終的に 2—ォキソ酸のみが得られる。環状イミンは環状アミノ酸に D アミノ酸ォキシダーゼを作用させることで得ることができる。 L—アミノ酸は、前記分割反応の残基質として得ることも可能であるし、前記反応で生成する 2—ォキソ酸、イミノ酸、あるいは環状イミンを、さらにアミノ酸脱水素酵素に接触せしめ、反応させることにより、 L アミノ酸へと変換することもできる（立体反転反応）。

[0083] 9.アミノ酸脱水素酵素

ここで、アミノ酸脱水素酵素とは、アンモニアの存在下、 2—ォキソ酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフエ二ルァラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン 2—力ルボン酸レダクターゼを挙げることができる。本発明で用いるアミノ酸脱水素酵素としては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。

[0084] 微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できる力例えば、公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバクテリウム属 (Brevibacterium)、ロドコッカス属 (Rhodococcus)、スポロサルシナ属 (Sporosarci na)、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces)、マイクロバタテリゥム属（Micro bacterium)、ハルモナス属（Halomona)、クロストリジゥム属（Clostridium)、バチルス属 (Bacillus)、ニューロスポラ属 (Neurospora)、ェシエリヒア属 (Escherichia)、ァエロバタター属（Aerobactor)などが挙げられる。

[0085] 好ましくはバチルス属（Bacillus)に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくは、バチルスパディウス（Bacillus badius) IAM11059、バチルス 'スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC3341由来の酵素が挙げられる。バチルス 'バディウス（Bacillus badius) IAM11059はフエ-ルァラニン脱水素酵素を生産する微生物であり、欧州特許第 EP256514号および Bisci.Biotechnol.Biochem.、 1995年、 59卷、 10 号、 1994頁で公知である。

[0086] また、バチルス ·スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC3341は、ロイシン脱水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス'サチルス（Bacillus subtilis )のロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で 100%—致する。遺伝子配列では 1095塩基中、 14塩基が異なっている。バチルス'サチルス（Bacillus s ubtilis)の遺伝子配列は、 Nature、 1997年、 390卷、 249頁および NCBIデータベースのァクセッションナンバー CAB14339で公知である。また、ピロリン一 2—カルボン酸レダクターゼが-ユーロスポラ属 (Neurospora)、ェシエリヒア属 (Escherichia)、ァエロパクター属（Aerobactor)に属する微生物で生産されることは、 Methods Enzymol.、 19 62年、 5卷、 882頁で述べられている。

[0087] アミノ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり

、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株力アミノ酸脱水素酵素遺伝子をクロー-ングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DNA技術については当該分野において周知である。

[0088] 10.補酵素再生系 (補酵素再生能を有する酵素）

上記アミノ酸脱水素酵素による反応は、 NADHのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素 NADHは酸ィヒ型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ)を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、 D アミノ酸ォキシダーゼおよびアミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。

[0089] 補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース 6—リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。

[0090] 好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ属（Candida)、クロイツケラ属 (Kloeckera)、ピキア属（Pichia)、リポマイセス属 (Lipomy ces)、シユードモナス属 (Pseudomonas)、モラキセラ属 (Moraxella)、ノヽィホマイクロビゥム属 (Hyphomicrobium)、ノラコッカス属 (Paracoccus)、チォノシラス属 (Thiobacillu s)、アンシロバクター属（Ancylobacter)等が挙げられる。

[0091] 好ましくはチォバシラス属（Thiobacillus)、アンシロバクター属（Ancylobacter)に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチォバシラス 'エスピー (Thiob acillus sp.) KNK65MA (FERM BP— 7671)、アンシロバクタ^ ~ ·アクアティカス（A ncylobacter aquaticus) KNK607M株（FERM BP— 7335)由来の酵素が挙げられる。

[0092] ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えば WO03Z03 1626記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株カもギ酸脱水素酵素遺伝子をクロー-ングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DNA技術については当該分野にお、て周知である。

[0093] このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としては WO03 Z031626記載の、チォバシラス'エスピー（Thiobacillus sp.) KNK65MA (FERM BP— 7671)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するェシエリヒア'コリ (Escherich ia coli) HB101 (pFTOOl) (FERM BP— 7672)又はエシリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pFT002) (FERM BP— 7673)、又は WO02Z46427記載の、ァンシロバクタ^ ~ ·アクアティカス（Ancylobacter aquaticus) KNK607M株 (FERM B P— 7335)由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシリヒア 'コリ（Escherichia c oli) HBlOl (pFAOOl) (FERM BP— 7334)を挙げることができる。

[0094] これら形質転換体によるアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素の生産、前述のアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるアミノ酸脱水素酵素の生産、あるいはギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、国際公開第 W O03Z031626号公報に記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良ぐ必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。

[0095] 11.カタラーゼの添カロ

D—アミノ酸ォキシダーゼ反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添カロしない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができる力 D—アミノ酸ォキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸ィ匕水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。

[0096] カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できる力工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できる力例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、マイクロコッカス属（Micrococcus)、ロドシユードモナス属 (Rhodopseudomonas)等がある。また、市販の酵素も使用することもできる。巿販酵素としては例えば、 Catazyme25L (Novozyme社製）、 CATALASE (Beef Liver) (P- L Bio chemcals'Inc.社製)力ある ₀

[0097] 12.形質転換体等のバリエーション

本発明において使用する D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。

[0098] 本発明において、生産された D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。

[0099] 更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定ィ匕して得た固定ィ匕酵素として用いられ得る。固定ィ匕は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。

[0100] 本発明の好適な実施形態としての、上記 D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例として D アミノ酸ォキシダーゼを挙げると、後述の実施例に示される方法等に従、、同活性を示す菌株カも D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子をクローユングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成し、これを用いて、特に限定されない力ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)等の宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を得ることができる。

[0101] さらに、複数の酵素遺伝子を有する形質転換体を育種することにより、各酵素を同一の菌体で生産することが可能となる。複数の酵素遺伝子を有する形質転換体を育種する方法としては、同一のベクターに複数の酵素遺伝子を挿入した組換えプラスミドを形質転換する方法、それぞれの酵素遺伝子を異なる複製開始部位 (ori)、及び異なる薬剤耐性遺伝子を有する別々のベクターに挿入し、得られた複数の組換えプラスミドを同一の宿主微生物に形質転換する方法等を挙げることができる。

[0102] 上記に述べた方法により、 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子のみを有する形質転換体に比べて、 D—アミノ酸ォキシダーゼの培養液当たりの活性値が 1. 3倍以上、 2倍以上、 10倍以上、さらには 50倍以上に向上した、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体を育種することが可能である（後述の実施例 12に対応)。

[0103] ベクターとしては前記「6.形質転換体'ベクター」の項で、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子用として例示したベクターが同様に使用できる。

[0104] 13. L アミノ酸等の生産

本発明の光学分割反応による L アミノ酸、 2—ォキソ酸又は環状ィミンの生産、又は立体反転反応による L—アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。

[0105] 両酵素反応の基質として、前記一般式（1)で表されるラセミ体アミノ酸において、置換基を有して、てもよ、炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して!/、てもよ！/、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリ一ル基を表す。上記 Rにおける置換基を有して、てもよ、炭素数 1〜20のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、 1 メチルプロピル基、力ルバモイルメチル基、 2—力ルバモイルェチル基、ヒドロキシメチル基、 1ーヒドロキシェチル基、メルカプトメチル基、 2—メチルチオェチル基、（1ーメルカプト 1ーメチル）ェチル基、 4 アミノブチル基、 3 グァ -ジノプロピル基、 4 (5 )一イミダゾールメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 n ブチル基、 t ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、 2 ヒドロキシェチル基、 3 ァミノプロピル基、 2— シァノエチル基、 3 シァノプロピル基、 4 （ベンゾィルァミノ）ブチル基、又は、 2— メトキシカルボ-ルェチル基、などが挙げられる。

[0106] 置換基を有していてもよい炭素数 7〜20のァラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、 4ーヒドロキシベンジル基、 2 フルォロベンジル基、 3—フルォ口べンジル基、 4 フルォ口べンジル基、又は、 3, 4—メチレンジォキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有して!/ヽてもよヽ炭素数 6〜20のァリール基としては、フエ-ル基、または 4—ヒドロキシフエ-ル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シァノ基、カルボキシル基、アルキル基、ァラルキル基、ァリール基、アルカノィル基、ァルケ-ル基、アルキ-ル基、ァルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。

[0107] また、前記一般式 (4)で表される環状アミノ酸にお、て、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖である。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シァノ基、カルボキシル基、アルキル基、ァラルキル基、ァリール基、アルカノィル基、ァルケ-ル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。

[0108] 14.光学分割反応

分割反応では、上記基質に前述の D アミノ酸ォキシダーゼを作用させ、水性溶媒中で反応を行なう。上記反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添カロすることで D アミノ酸ォキシダーゼの反応で生成する過酸ィ匕水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。また、反応に FADを添カ卩してもよい。 FA Dは D アミノ酸ォキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。 FADの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは 0当量以上、 10当量以下、さらに好ましくは 0当量以上、 1当量以下、さらに好ましくは 0当量以上、 0. 1当量以下である。

[0109] 15.立体反転反応

立体反転反応では、上記基質に前述の D—アミノ酸ォキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することで D—アミノ酸ォキシダーゼの反応で生成する過酸ィヒ水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。

[0110] また、上記反応に FADを添カ卩してもよい。 FADは D—アミノ酸ォキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。 FADの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは 0当量以上、 10当量以下、さらに好ましくは 0当量以上、 1当量以下、さらに好ましくは 0当量以上、 0. 1当量以下である。

[0111] また、上記立体反転反応には NAD等の補酵素を添加してもよい。 NAD等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在する NAD等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、 NAD等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。 NAD等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは 0当量以上、 2当量以下、さらに好ましくは 0. 00001当量以上、 0. 1当量以下、さらに好ましくは 0. 0001当量以上、 0. 01当量以下である。補酵素添加量の上限は特に制限されないが、経済性の点から、通常は 2当量以下、好ましくは 0. 1当量以下、より好ましくは 0. 01当量以下である。

[0112] また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添カ卩してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは 0当量以上、 10当量以下、さらに好ましくは 0当量以上、 2当量以下、さらに好ましくは 0. 1当量以上、 1. 5当量以下である。

[0113] 上記光学分割および立体反転反応の基質の仕込み濃度は 0. 1% (WZV)以上、 9 0% (w/v)以下、好ましくは 1% (w/v)以上、 60% (w/v)以下で溶解または懸濁した状態で反応を行ヽ、上記分割および立体反転反応における反応温度は 10°C以上、 80°C以下、好ましくは 20°C以上、 60°C以下の適当な温度で調節し、 pH4以上、 12以下、好ましくは pH6以上、 11以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記分割および立体反転反応は、ノツチ法または連続方式で行い得る。

[0114] 本発明の分割および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸ェチル、酢酸ブチル、トルエン、クロ口ホルム、 n—へキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との 2層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。

[0115] 16.立体反転反応のバリエーション

次に、立体反転反応のより好適な実施態様として、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を用いたラセミ体アミノ酸力の L アミノ酸の製造方法について説明する。本実施態様では、ラセミ体のアミノ酸と前述の D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。

[0116] 本実施態様では、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼとしては、前記「11.カタラーゼ」の項で挙げたものを使用することができる。

[0117] 本発明において、形質転換体を培養することにより生産された D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素は、酵素自体として用いることができるほか、形質転換体もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、形質転換体の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、ァセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。

[0118] また、本発明における D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の酵素遺伝子を導入した形質転換体を酵素反応に用いた場合、培養によって得られた菌体を未破砕のまま使用することにより、反応収率の向上、及び Z又は反応時間の短縮を図ることができる（後述の実施例 13、 14に対応)。

[0119] この「未破砕」または「菌体を破砕せずに用いる」という概念には、菌体に対して物理的または化学的処理の、ずれも施さな、場合だけでなく、その菌体の細胞の膜透過性を高めるために当業者に周知の処理 (例えば、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、アセトン乾燥処理、またはトルエン、界面活性剤等の添加処理)を施す場合も含む。

[0120] 更にそれらの各酵素は、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定ィ匕して得た固定ィ匕酵素として用いられ得る。固定ィ匕は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。

[0121] また、上記反応に FADおよび Zまたは NAD等を添カ卩してもよい。 FAD、 NAD等の添加量は、前述の通りである。

[0122] また、上記立体反転反応にアンモニア、又はその塩を添カ卩してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは 0当量以上、 10当量以下、さらに好ましくは 0. 3当量以上、 2当量以下、さらに好ましくは 0. 8当量以上、 1. 5当量以下である。

[0123] 本実施態様では、前述の一般式（1)で表されるラセミ体アミノ酸、及び一般式 (4) で表される環状アミノ酸を基質として用いることができ、その仕込み濃度、反応温度、反応 pH等の条件も前述の通りである。

[0124] 17.生成物の単離

生成した L アミノ酸、 2—ォキソ酸、又は環状ィミンの単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。

実施例

[0125] 実施例および参考例の一覧は以下の通りである。

実施例 1： D アミノ酸ォキシダーゼの単離 ·精製

実施例 2： D アミノ酸ォキシダーゼの性質

実施例 3： D アミノ酸ォキシダーゼの内部アミノ酸配列決定

実施例 4： D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の単離

実施例 5： D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成実施例 6： D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を含む組換え体 DNAを用ヽた形質転換体の作成実施例 7：精製 D アミノ酸ォキシダーゼを利用した分割反応による L アミノ酸又は 2—ォキソ酸の合成

実施例 8： D アミノ酸ォキシダーゼ活性菌を利用した分割反応による L アミノ酸合成

実施例 9：形質転換体を利用した分割反応による L アミノ酸又は 2 ォキソ酸の合成

(1) DL-フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンおよびフエ-ルビルビン酸の合成

(2) DL-フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンおよびフエ-ルビルビン酸の合成

(3) DL— 4—フルォロフエ-ルァラニンから L— 4—フルォロフエ-ルァラニンの合成

(4) DL ノルパリンから L ノルパリンおよび 2 ォキソ吉草酸の合成

(5) β—クロ口一 DL ァラニンから j8—クロ口一 L—ァラニンの合成

実施例 10：形質転換体を利用した L—アミノ酸の合成

( 1) DL フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンの合成

(2) DL-フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンの合成

(4) DL ノルパリンから L ノルパリンの合成

(5) DL ロイシンから L ロイシンの合成

参考例 1 :フ二ルァラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種

参考例 2：ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種

実施例 11 : D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の活性を有する形質転換体の作成

[1]D アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

[2] D アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

[3] D アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

[4] D アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

実施例 12：形質転換体を用いた D—アミノ酸ォキシダーゼの生産

実施例 13 : D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したし -ノルバリンの合成

実施例 14 : D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したし - tert -ロイシンの合成

比較例 1： D アミノ酸ォキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用した L ノルパリンの合成

参考例 3：ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種

参考例 4：ロイシン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種

参考例 5：フ二ルァラニン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種

参考例 6： D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体の育種。

[0126] 以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

[0127] (実施例 1) D アミノ酸ォキシダーゼの単離 ·精製

キャンディダ 'インターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株を、試験管内で滅菌した 6mlの培地（グルコース 1. 65%、 NH H PO 0. 5%、 KH PO 0. 25%、

4 2 4 2 4

MgSO 0. 1%、 FeCl · 6Η ΟΟ. 002%、コーンスティープリカ一 0. 1%、滅菌前 ρΗ

4 3 2

5. 2)に植菌して 30°Cで 12時間、好気的に振とう培養した。この培養液 4mlを 2L坂口フラスコ内で滅菌した 400mlの培地（シユークロース 1. 65%、NH H PO 0. 5%

4 2 4

、 KH PO 0. 25%、 MgSO 0. 1%、 FeCl - 6H O0. 002%、コーンスティープリカ一 0. 1%、 FADO. 0005%、 D—ァラニン 0. 089%、滅菌前 pH5. 2、ただし、 FAD および D—ァラニンは 0. 02 mフィルターにてろ過滅菌後、別に添カ卩した。 )に植菌して 25°Cで 22時間、好気的に振とう培養した。

[0128] 培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、 50mM Tris (トリス (ヒドロキシメチル）ァミノメタン）—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に硫酸アンモ-ゥムを 40から 60%飽和でカ卩えた時に塩析する沈殿を遠心分離で取得した。この画分を 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0) に溶解、同緩衝液で透析後、 DEAE— TOYOPEAL (東ソ一社製）にアプライして力ラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で 0Mから 0. 4Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分に終濃度 1Mとなるように硫酸アンモ-ゥムを溶解した後、 Phenyl— TO YOPE AL (東ソ一社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)で 1M力 0Mの硫酸アンモ-ゥムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、 RESOURCE Q 6ml (アマシャムフアルマシア社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行ない、 50mM Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0)で洗浄後、同緩衝液で 0M力 0. 4Mの塩ィ匕ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。ここで得られた活性画分を限外濾過膜 (分画分子量 10, 000)を用いて濃縮した後、 Sup erdex 200 HR 10/30 (アマシャムフアルマシアバイオテック社製）にアプライして FPLCによるゲルろ過を行い、 0. 15Mの塩化ナトリウムを含む 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)で溶出した。ここで得られた活性画分を SDS—ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、 D -アミノ酸ォキシダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。

[0129] (実施例 2) D—アミノ酸ォキシダーゼの性質

実施例 1で得られた精製 D—アミノ酸ォキシダーゼの性質を以下のように調べた。

[比活性]

D—アミノ酸ォキシダーゼの活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ペルォキシダーゼを用いた酵素法で定量することによりおこなった。酵素法による過酸化水素の定量は次のように実施した。 50mM DL—フエ-ルァラニン、 0. 80mM 4—アミノアンチピリン、 1. 31mM N—ェチル N— (2 ヒドロキシ一 3—スルフォプロピル )—m—トルイジン、 6uZml ペルォキシダーゼ（TOYOBO Inc.社製）、および 5 OmM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)からなる発色液 250 1と適宜希釈した酵素液 5 0 1を混合し、 30°Cで 30分間反応させ、 555nmの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸ィ匕水素量を定量した。このとき 1分間に 1 μ molの過酸ィ匕水素を生成する酵素量を lunitと定義した。また、タンパク質の定量は、 BSAを標準タンパク質として Bradford法で行った。精製した D—アミノ酸ォキシダーゼの比活性は 44. 8unitZmgタンパク質（30°C)であった。

[0130] また、以下に示す酵素の性質を調べる際の D アミノ酸ォキシダーゼ活性の測定は、次のように実施した。 lOOmM DL フエ-ルァラニンおよび 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)からなる基質溶液 250 1を 30°C (作用温度の範囲、至適温度を調べる際には各温度)で 5分間保温後、適宜希釈した酵素液 50 1と混合し、 30°C (作用温度の範囲、至適温度を調べる際には各温度)で 5分間反応させた後、 3N HC1を 10 1添カ卩して反応を停止した。その後、 30°Cにて 5分間保温した、 0. 80m M 4 ァミノアンチピリン、 1. 31mM N ェチル N— (2 ヒドロキシ一 3—スルフォプロピル）— m—トルイジン、 6uZml ペルォキシダーゼ（TOYOBO Inc.社製）、および 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)からなる発色液 500 1を、前記反応液 100 1と混合し、 555nmの吸光度を測定、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量した。

[0131] [Km値の測定]

D— Pheを基質として、様々な基質濃度で活性測定を行ない、 D— Pheに対する K m値を求めた。図 2に示す結果から、 D— Pheに対する Km値は約 1. 7 (1. 6以上、 1 . 8以下) mMであった。図 2において、横軸は基質濃度の逆数、縦軸は活性の逆数である。

[0132] [作用温度の範囲'至適温度]

作用温度の範囲と至適温度を調べた。 30°Cでの活性を 100%とした場合の各温度での相対活性を図 3に示した。本酵素は少なくとも検討した 20〜60°Cの範囲でよく作用し、至適温度は 40°C〜50°Cであった。 [0133] [作用 pHの範囲 ·至適 pH]

作用 pHの範囲と至適 pHを調べた。 pH6. 0力ら 7. 5の範囲ではリン酸カリウム緩衝液を、 ρΗ7. 5力ら 8. 8の範囲で ίま Tris—塩酸緩衝液を、 pH8. 8力ら 10. 5までの範囲では炭酸ナトリウム緩衝液を使用し、 pH8. 0での活性を 100%とした場合の各 pHでの相対活性を図 4に示した。本酵素は少なくとも検討した pH6〜10. 5の範囲で作用し、至適 pHは 8. 5〜9. 5であった。

[0134] [温度安定性]

本酵素の温度安定性を、各温度で 10分間処理した後の残活性で調べたところ、図 5に示すように 40°C以下で安定であった。

[0135] [pH安定'性]

pH安定性について調べた。本酵素を 30°C、 16時間、各 pHで処理した後の残活性を pH8. 0の活性を 100%として示したのが図 6である。なお、 pH6. 2力 8. 1の範囲ではリン酸カリウム緩衝液を、 pH7. 6から 8. 7の範囲では Tris—塩酸緩衝液を、 pH8. 7から 10. 4までの範囲では炭酸ナトリウム緩衝液を使用した。本酵素は pH7 . 8〜8. 7の間で比較的安定であった。

[0136] [分子量の測定]

ゲルろ過クロマトグラフィー法により標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約 252,000 (230,000以上、 280, 000以下）であった。また、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約 42, 000 (39, 000以上、 45, 000以下）であり、本発明の D アミノ酸ォキシダーゼは同一のサブユニットからなる 6量体構造であった。

[0137] [基質特異性]

精製 D アミノ酸ォキシダーゼの基質特異性を調べた。前記酵素活性測定における基質 DL フエ二ルァラニンをそれぞれの基質に変更し、酵素活性を測定した。表 1は、 D— Pheに対する活性を 100%としたときの相対活性値を示す。

表 1 :相対活性値

[0138] [表 1]

[0139] (実施例 3) D—アミノ酸ォキシダーゼの内部アミノ酸配列決定

実施例 1で精製した D—アミノ酸ォキシダーゼにリジルエンドべプチダーゼを 4Mの尿素存在下で作用させた。生成したポリペプチド断片を逆相 HPLCで精製した後、気相プロテイン ·シークェンサ一を用、て D—アミノ酸ォキシダーゼの内部アミノ酸配列を決定した。

[0140] (実施例 4) D—アミノ酸ォキシダーゼ遣伝子の単離

実施例 1と同様の方法でキャンディダ 'インターメディア（Candida intermedia) NBR C0761株を培養して得た菌体から、 UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MO BI O Laboratories, Inc.社製）を用いて染色体 DNAを調製した。

[0141] 次いで、既知 D—アミノ酸ォキシダーゼ配列相同部位にもとづいて設計した DNA プライマー（Primer— 1：配列表の配列番号 3、及び、 Primer— 2：配列表の配列番号 4)を用いて、先に得た染色体 DNAを铸型に PCRを行った。 PCRは、铸型 DNA1 OOngに Ex taqDNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製） 0. 25 ^ 1, lO X Ex taq buf fer (タカラバイオ社製） 5 1、 2. 5mM各 dNTP溶液 4 1、 20 Mプライマー水溶液各 1 μ 1を添カ卩し、さらに脱イオン水を加えて総量が 50 1になるように調整した反応液を調製し、熱変性（94°C、 60秒）、アニーリング (40°C、 60秒）、伸長反応（72°C、 60秒)を 30サイクル繰り返した後、 4°Cまで冷却することにより行なった。

[0142] その結果、目的の D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の一部、塩基数約 750bp (部分遺伝子と称す)の DNA断片を取得した。

[0143] 次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素の N末端側、 C末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けた DNAプライマー（Primer— 3：配列表の配列番号 5、及び、 Primer— 4 :配列表の配列番号 6)を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体 DNAを制限酵素 Hindiで分解したものを T4 DNAリガーゼを用いて環化させて得た DNAを铸型に、インバース PCRを行った。 PCRの条件はァ- 一リング温度を 57°Cとしたこと以外は、上記と同様にして行なった。

[0144] これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む塩基数約 1 . 5kbpの DNA断片を取得した。この DNA断片の塩基配列を決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号 7に示す開始コドン力終止コドンまでを含む D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。その塩基配列の解析から、染色体 DNAより得られた D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子は、 2個のェキソンと 1個のイントロンを含んで、た。

[0145] イントロンを除いた D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を取得するために以下の操作をおこなった。まず、実施例 1と同様の方法でキャンディダインターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株を培養して得た菌体から、 ISOGEN (二ツボンジーン社製 )を用いて調製した全 RNAを铸型に、 TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1 (Ta KaRa社製)を用、て相補鎖 DNA (cDNA)を調製した。 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子の N末端、 C末端部分にそれぞれ制限酵素 Ndel及び Saclの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Primer— 5：配列表の配列番号 8、 Primer— 6：配列表の配列番号 9)を用いて、この間の DNAを、 cDNAを铸型にした PCRにより増幅することで、イントロンを除く配列表配列番号 2に示されるオープンリーディングフレームの DNA断片を取得した。

[0146] PCRの条件は、铸型とした cDNAの使用量を 50ng、アニーリング温度を 60°Cとしたこと以外は、後述の実施例 10— 1と同様にして行なった。

[0147] 得られた DNA断片がコードすると推定されるアミノ酸配列が、実施例 3で決定した D -アミノ酸ォキシダーゼの内部アミノ酸配列を含むことを確認し、取得した DNA断片が実施例 1の精製酵素をコードする遺伝子であることを確認した。

[0148] (実施例 5) D—アミノ酸ォキシダーゼ遣伝子を発現する組換えプラスミドの作成

実施例 4で得られた DNA断片を制限酵素 Ndelと Saclで切断し、その DNA断片と、同酵素で切断したベクタープラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報の明細書に基づいて当業者が製造可能）とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、図 1の制限酵素地図で表され、 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計された PCDA003を取得した。

[0149] (実施例 6) D アミノ酸ォキシダーゼ遣伝子を含む組換え体 DNAを用いた形質転換体の作成

実施例 5で得られたプラスミド pCDA003をェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HBl 01および JM109のコンビテントセルと混合することで形質転換を行い、培地（トリブトン 10g、イーストエキス 5g、塩ィ匕ナトリウム 10g、寒天 15g、アンピシリン 100mg、脱ィオン水にて 11にメスアップ、滅菌前 pH7. 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する )にプレーティングして、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を含む組換え体 DNAを含有する形質転換体エシリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pCDA003) (FERM

BP— 10639)また ίお M109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)をコロニーとして取得した。

[0150] 得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した 6mlの培地（トリプトン 16 g、イーストエキス 10g、塩ィ匕ナトリウム 5g、アンピシリン 100mg、脱イオン水にて 11にメスアップ、滅菌前 pH7. 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、 37 °Cで 23から 29時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の D— アミノ酸ォキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液 0. 05mlを用いて、実施例 2に示す方法で D アミノ酸ォキシダーゼ活性を測定したところ、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性が確認された。

[0151] また、上記得られた形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 (pCDA 003)を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地（トリプトン 16g、イーストエキス 10g、塩ィ匕ナトリウム 5g、アンピシリン 100mg、脱イオン水にて 11にメスアップ、滅菌前 pH7. 0、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、 37°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液カゝら遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spi n Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド pCDA003を回収した。

[0152] なお、形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pCDA003)は、 20 06年 7月 10日に受託番号 FERM BP— 10639として（原寄託日 2005年 7月 19日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、また形質転換体エシリヒア 'コリ（Escherichia coli)jM109 (pCDA003)は、 2006年 7月 10日に受託番号 FERM BP— 10638として（原寄託日 2005年 6月 28日の国内寄託株を、ブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管)、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (〒 305— 8566 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号）に寄託されて、る。

[0153] (実施例 7)精製 D—アミノ酸ォキシダーゼを刺用した分割反による L—アミノ酸又は 2—ォキソ酸の合成

実施例 1で精製した D—アミノ酸ォキシダーゼ 25 g、 DL—フエ-ルァラニン 10m g、カタラーゼ (Catazyme25L、 Novozyme社製） 2 1、 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0) 1mlを使用して、 30°Cで 13時間反応した後、反応液を HCIO水溶液（

4 pHl. 5)で 50倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 HPLC 分析は次に示す条件で実施した。カラム： CROWNPAK CR+ (4. 6mm X 150m m、ダイセル社製）、溶離液: HCIO水溶液 (pHl. 5)、流速： 0. 9ml/min.、カラ

4

ム温度： 30°C、検出： 210nm。その結果、 47. 5mol%の反応収率で、光学純度 10 0%eeの L—フエ-ルァラニンが得られた。また、反応液を 10mMリン酸カリウム緩衝液 (_PH2. 0)Zァセトニトリル =3Zlで 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、 2—ォキソ酸を定量した。

[0154] HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： COSMOSIL 5C18ARII (4. 6 mm X 250mm,ナカライテスタ社製）、溶離液： 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0)Zァセトニトリル =5Zl、流速： 1. Oml/min. 、カラム温度： 30°C、検出： 210η m。その結果、反応収率 44. 4mol%でフエ-ルビルビン酸が生成した。

[0155] (実施例 8) D—アミノ酸ォキシダーゼ活件菌を刺用した分割反による L—アミノ酸実施例 1と同様の方法で培養したキャンディダ 'インターメディア（Candida intermedi a) NBRC0761株の培養液 4ml分の菌体を遠心分離により集菌し、 2mlの 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁してガラスビーズにより物理的に菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液 125 1、 DL —フエ-ルァラニン 1. 25mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 0. 05 1、 50mM Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0) 125 1を使用して、 30°Cで 16時間反応した後、反応液を HCIO水溶液 (pH l . 5)で 50倍希釈して、遠心上清を HPLCで分

4

祈した。

[0156] HPLC分析は実施例 7に示す条件で実施した。その結果、 54. 5mol%の反応収率で、光学純度 93. 7%eeの L フエ-ルァラニンが得られた。

[0157] (実窗列 9)形晳転椽体を利用した分割反による L アミノ酸又は 2—ォキソ酸の実施例 6で得た D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア ·コリ（Escherichia coli) HB 101 (pCDA003) (FERM BP— 10639)又 ίお M 109 (pC DA003) (FERM BP— 10638)を培養液から遠心分離により集菌し、 0. 1M Tri s—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。それらの粗酵素液を、 DL—フエ二ルァラニン、 DL— 4— フルォロ一フエ-ルァラニン、 DL ノルパリン、または、 13—クロ口一 DL ァラニンのそれぞれに作用させて、対応する L—アミノ酸、又は 2—ォキソ酸を合成した。以下、各合成反応の実施例を示す。

[0158] (9— 1) DL フエ-ルァラニンから L フエ-ルァラニンおよびフエ-ルビルビン酸の合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli) HB 101 (pCDA003) (FERM BP— 10639)の培養液 10ml分の菌体を遠心分離により集菌し、 1mlの 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液 100 μ 1、 DL—フエ-ルァラニン 10mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 N ovozyme社製） 2 1、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0) 0. 95mlを使用して、 3 0°Cで 18時間反応した。反応液を HCIO水溶液 (pH l . 5)で 50倍希釈して、遠心上

4

清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 [0159] HPLC分析は実施例 7と同条件で実施した。その結果、 50. 8mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L フエ-ルァラニンが得られた。また、反応液を 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0)Zァセトニトリル =3Zlで 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、 2 ォキソ酸を定量した。 HPLC分析は実施例 7に示す条件で実施した。その結果、反応収率 41. 9mol%でフエニルピルビン酸が生成した。

[0160] (9— 2) DL フエ-ルァラニンから L フエ-ルァラニンおよびフエ-ルビルビン酸の合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分の菌体を遠心分離により集菌し、 1mlの 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液 50 μ 1、 DL—フエ-ルァラニン 10mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 No vozyme社製） 2 1、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0) 0. 95mlを使用して、 30 °Cで 19時間反応した。反応液を HCIO水溶液 (pHl. 5)で 50倍希釈して、遠心上

4

清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。

[0161] HPLC分析は実施例 7と同条件で実施した。その結果、 49mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L フエ-ルァラニンが得られた。また、反応液を 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0)Zァセトニトリル =3Zlで 100倍希釈して、遠心上清を HP LCで分析し、 2—ォキソ酸を定量した。 HPLC分析は実施例 7に示す条件で実施した。その結果、反応収率 48mol%でフエ-ルビルビン酸が生成した。

[0162] (9— 3) DL— 4 フルォロフエ-ルァラニンから L— 4 フルォロフエ-ルァラニンの合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分の菌体から実施例（9— 2)と同様に調製した粗酵素液 50 1、 DL— 4 フルォロフエ-ルァラ-ン 10mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 2 1、 0. 1M Tris— 塩酸緩衝液 (pH8. 0) 0. 95mlを使用して、 30°Cで 19時間反応した。反応液を HC1 O水溶液 (pHl. 5)で 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析した。 [0163] HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： CROWNPAK CR+ (4. 6mm X 150mm,ダイセル社製）、溶離液： HCIO水溶液（pHl. 5)、流速： 0. 5ml/min

4

.、カラム温度： 30°C、検出： 210nm。その結果、 51mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L— 4 フルォロフエ-ルァラニンが得られた。

[0164] (9 4) DL ノルバリンから L ノルパリンおよび 2—ォキソ吉草酸の合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分の菌体から実施例（9— 2)と同様に調製した粗酵素液 50 /z l、 DL ノルパリン 10mg、カタラーゼ（Catazyme25Lゝ Novozyme社製）2 1、 0. 1M Tris 塩酸緩衝液（ρΗ8. 0) 0. 95mlを使用して、 30°Cで 1時間反応した。反応液を 2mM CuSO水溶液

4 Zメタノール = 19Zlで 10倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。

[0165] HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： Develosil ODS— HG3 (4. 6m m X 150mm,野村化学社製） +SUMICHIRAL OA— 5000 (4. 6mm X 150m m、住化分析センター社製）、溶離液： 2mM CuSO メタ

4水溶液 Z ノール = 19Zl、流速： 0. 7ml/min.、カラム温度： 30°C、検出： 254nm。その結果、 50. 3mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L ノルパリンが得られた。また、反応液を 10mM リン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0) /ァセトニトリル = 3/1で 10倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、 2—ォキソ酸を定量した。 HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： COSMOSIL 5C18ARII (4. 6mm X 250mm、ナカライテスタ社製）、溶離液： 10mMリン酸カリウム緩衝液 (pH2. 0) /ァセトニトリル = 19/1、流速： 1. Oml/min.、カラム温度： 30°C、検出： 210nm。その結果、変換率 58. 8mol%で 2 ォキソ吉草酸が生成した。

[0166] (9— 5) β—クロ口一 DL ァラニンから j8—クロ口一 L ァラニンの合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分の菌体から実施例（9— 2)と同様に調製した粗酵素液 50 1、 β—クロ口一 DL ァラニン 5mg 、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 2 1、 0. 1M Tris 塩酸緩衝液（ pH8. 0) 0. 95mlを使用して、 30°Cで 1時間反応した。反応液を 2mM CuSO水溶液 Zメタノール = 19/1で 5倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 HPLC分析によるアミノ酸の定量は、実施例（9 4)と同条件で実施した。その結果、 47. lmol%の反応収率で、光学純度 99. 2%eeの β クロロー Lーァラニンが得られた。

[0167] (実施例 10)形皙転椽体を禾 11用した L アミノ酸の合成

実施例 6で得た D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア ·コ U (Escherichia coli) HB101 (pCDA003) (FERM BP— 10639)、および JM109 ( PCDA003) (FERM BP— 10638)を各培養液力も遠心分離により集菌し、それぞれ、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、 0. 1M Tris— 塩酸緩衝液 (PH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たフエ-ルァラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を各培養液から遠心分離により集菌し、それぞれ、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。それらの粗酵素液を、 DL フエ-ルァラニン、 DL— 4—フルォロ一フエ-ルァラニン、 β クロロー DL ァラニン、 DL ノルパリン、または DL 口イシンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応する L アミノ酸を合成した。

[0168] ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。ギ酸脱水素活性を有する形質転換体であるェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pF T002) (FERM BP— 7673)を、試験管内で滅菌した 10mlの培地（トリプトン 16g、イーストエキス 10g、塩化ナトリウム 5g、水 11、滅菌前 pH7)に接種して、 30°Cで 24時間振とう培養した。また、後述する参考例 1に示す方法で育種したフエ-ルァラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、および後述する参考例 2に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液のそれぞれは次のようにして得た。フエ-ルァラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体のそれぞれを、試験管内で滅菌した 10mlの培地 (トリプトン 16g、イーストエキス 10g、塩ィ匕ナトリウム 5g、水 11、滅菌前 pH7)に接種して、 30°Cで 24時間振とう培養した。

[0169] ( 10— 1) DL フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンの合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli) HB101 (pCDA003) (FERM BP— 10639)の培養液 10ml分、前記のフエ二ルァラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液 10ml分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液 10ml分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ lmlの 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ 5 0 1、 DL フエ-ルァラニン 10mgゝカタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製 ) 2 l、NAD⁺0. 18mg、ギ酸アンモ-ゥム 7. 0mg、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液（p H8. 0) 0. 85mlを使用して、 30°Cで 13時間反応した。反応液を HCIO水溶液 (pH

4

1. 5)で 50倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 HPLC分析によるアミノ酸の定量は実施例 7と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体ァミノ酸 95. 6mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L フ -ルァラニンが得られた。

[0170] (10- 2) DL-フエ-ルァラニンから L -フエ-ルァラニンの合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分、前記のフエ二ルァラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液 10ml分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液 10ml分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ lmlの 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ 5 0 1、 DL フエ-ルァラニン 10mgゝカタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製 ) 2 l、NAD⁺0. 18mg、ギ酸アンモ-ゥム 7. 0mg、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液（p H8. 0) 0. 85mlを使用して、 30°Cで 19時間反応した。反応液を HCIO水溶液 (pH

4

1. 5)で 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 HPLC 分析によるアミノ酸の定量は実施例 7と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸 95mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L フ -ルァラニンが得られた

[0171] ( 10— 3) DL— 4 フルォロフエ-ルァラニンから L— 4 フルォロフエ-ルァラニンの合成

上記実施例（10— 2)と同様に調製した各形質転換体の粗酵素液をそれぞれ 50 μ 1、 DL— 4 フルオローフエ-ルァラニン 10mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novo zyme社製） 2 1、 NAD+0. 18mg、ギ酸アンモ-ゥム 7. Omg、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0) 0. 85mlを使用して、 30°Cで 19時間反応した。反応液を HCIO水

4 溶液 (pHl. 5)で 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。 HPLC分析は実施例（9— 3)と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸 1 03mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L 4 フルォロフ -ルァラニンが得られた。

[0172] (10— 4) DL ノルバリンから L ノルパリンの合成

前記の D アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escher ichia coli)jM109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の培養液 10ml分、前記のロイシン脱水素酵素活性形質転換体の培養液 10ml分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液 10ml分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ lmlの 0 . 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られたェシエリヒア'コリ（Escherichia co 1 JM1O9 (pCDA003) (FERM BP— 10638)の粗酵素液 100 μ 1、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の各粗酵素液をそれぞれ 50 μ 1、 DL ノルパリン 50mgゝカタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 10 1、 NAD+0. 89mg、ギ酸アンモ-ゥム 16. lmg、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH8. 0) 0. 8mlを使用して、 30°Cで 3時間反応した。反応液を 2mM CuSO

4 水溶液 Zメタノール = 19/1で 100倍希釈して、遠心上清を HPLCで分析し、ァミノ酸を定量した。 HPLC分析は実施例（9—4)と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸 95. 6mol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L ノルパリンが得ら [0173] ( 10— 5) DL ロイシンから L ロイシンの合成

上記 10— 4と同様に調製したェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)jM109 (pCDAOO 3) (FERM BP- 10638)の粗酵素液 30 μ 1、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液 25 μ 1、およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液 100 1、 D L ロイシン 50mg、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 10 μ 1、 NAD+0 . 89mg、ギ酸アンモ-ゥム 16. lmg、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液（pH8. 0) 0. 8ml を使用して、 30°Cで 6時間反応した。反応液を MilliQ水にて 50倍希釈後、 1NHC1 にて反応を停止し、遠心上清を HPLCで分析し、アミノ酸を定量した。

[0174] HPLC分析は次に示す条件で実施した。カラム： SUMICHIRAL OA— 5000 (4 . 6mm X 150mm,住化分析センター社製）、溶離液： 2mM CuSO水溶液 Z2—

4

プロパノール = 19/1、流速： 0. 9ml/min.、カラム温度： 30°C、検出： 254nm。その結果、対ラセミ体アミノ酸 103. lmol%の反応収率で、光学純度 100%eeの L一口イシンが得られた。

[0175] (参者例 ί)フエ二ルァラニン脱, 7k泰酵泰活件有する形皙転橼体の音糠

バチルス'パディウス（Bacillus badius) IAM11059株を滅菌した培地（トリプトン 1 . 0%、イーストエキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、脱イオン水に溶解、滅菌前 pH 7. 0)に植菌後、 30°Cで 48時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、 Marnmr法を用いて染色体 DN Aを得た。 Bisci. Biotechnol. Biochem.、 1995年、 59卷、 10号、 1994頁で公知であるバチルス 'パディウス（Bacillus badius) IAM11059株のフエ-ルァラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列を基に、遺伝子の N末端、 C末端部分にそれぞれ制限酵素 Ndel及び Pstlを結合させた DNAプライマー（Primer— 7 :配列表の配列番号 10、及び、 Pr imer-8：配列表の配列番号 11)を設計し、前記染色体 DNAを铸型に PCRを行なつた。 PCRの条件はアニーリング温度を 50°Cとしたこと以外は、後述の実施例 11 1と同様にして行なった。得られた DNA断片を制限酵素 Ndelと Pstlで切断し、その DNA断片と、同酵素で切断したベクタープラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z0 3613号公報の明細書に基づいて当業者が製造可能）とを T4 DNAリガーゼを用 V、て結合することで、フ -ルァラニン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) H B101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、フエ-ルァラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。

[0176] (参者例 2)ロイシン脱水素酵素活件を有する形皙転椽体の音糠

バチルス 'スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC3341株を滅菌した培地 C (トリプトン 1. 0%、イーストエキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、脱イオン水に溶解、滅菌前 pH7. 0)に植菌後、 30°Cで 48時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液力遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、 Marmur法 (J.Mol.Biol. ,3,208(1961)参照）を用いて得た染色体 DNAを铸型に、 DNAプライマー（Primer— 9 :配列表の配列番号 12、及び、 Primer— 10 :配列表の配列番号 13)を用いて PC Rを行なった。 PCRの条件はアニーリング温度を 50°Cとしたこと以外は、後述の実施例 11— 1と同様にして行なった。 PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 Eco RIと Saclで切断し、その DNA断片と、同酵素で切断したベクタープラスミド pUCT(p UCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）の Ndelサイトを破壊したプラスミドベクター）とを、 T4 DNAリガーゼを用 V、て結合することで、ロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを取得した。

[0177] 得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37 °Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを回収した。

[0178] (実窗列 11) D_アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱,水素酵素、及び捕酵素再牛.能を有する酵素の活件を有する形皙転椽体の作成

(11— 1) D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

実施例 6で得られた、キャンディダ'インターメディア（Candida intermedia) NBRC0 761株由来の D—アミノ酸ォキシダーゼを発現できるように設計された発現プラスミド PCDA003を铸型に、 DNAプライマー（Primer— 11：配列表の配列番号 14、及び、 Primer— 12 :配列表の配列番号 15)を用いて PCRを行なった。 PCRは、铸型 DN AlOOngに PyrobestDNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製） 0. 25 1、 10 X Pyrobe st Bufferll (タカラバイオ社製） 5 1、 2. 5mM各 dNTP溶液 4 μ \, 20 μ Μプライマ一水溶液各 2 1を添カ卩し、さらに脱イオン水を加えて総量が 50 1になるように調整した反応液を調製し、熱変性 (96°C、 30秒)、アニーリング (60°C、 30秒)、伸長反応 (72°C、 90秒)を 25サイクル繰り返した後、 4°Cまで冷却することにより行なった。

[0179] PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 Kpnlと BamHIで切断し、その DN A断片と、後述の参考例 4で得られたロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド pFTLBをそれらの酵素で切断した断片とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計された図 7に示すプラスミド pFT LBDAを取得した。

[0180] 得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセル（タカラバィォ社製）と混合し形質転換を行なうことで、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 (pFTLBDA)を育種した。

[0181] ( 11— 2) D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

後述の参考例 4で得られたロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド _PFTLB、及び後述の参考例 6で得られた D—アミノ酸ォキシダーゼを発現できるように設計されたプラスミド pSTNDAの両者を、ェシエリヒア •コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTLB, pSTNDA)を育種した。

[0182] ( 11— 3) D—アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

実施例 6で得られた、キャンディダ'インターメディア（Candida intermedia) NBRCO 761株由来の D—アミノ酸ォキシダーゼ発現できるように設計された発現プラスミド p CDA003を铸型に、 DNAプライマー（Primer— 13 :配列表の配列番号 16、及び、 Primer- 14：配列表の配列番号 17)を用いて PCRを行なった。 PCRの条件は実施例 11— 1と同様にして行なった。 PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 Pstl で切断し、その DNA断片と、後述の参考例 5で得られたフエ二ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド pFTPBをそれらの酵素でした断片とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合した。リガーゼ反応で得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行ない、得られた形質転換体のうち、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子が、フエ二ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素と同方向になるように挿入されたプラスミドを保持してヽるものを、プラスミドの DNA配列をシークェンスすることにより選択した。この結果、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、フエ二ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現するように設計された図 8に示すプラスミド pFTPBDAを取得した。

[0183] このプラスミド pFTPBDAをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し、再度形質転換を行なうことで、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTPBDA)を育種した。

[0184] (11—4) D—アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成

後述の参考例 5で得られたフ二ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド pFTPB、及び後述の参考例 6で得られた D— アミノ酸ォキシダーゼを発現できるように設計されたプラスミド pSTNDAの両者をェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、 D—アミノ酸ォキシダーゼ、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTP B, pSTNDA)を育種した。

[0185] (実施例 12)形質転換体を用!ヽた D アミノ酸ォキシダーゼの生産

実施例 11、後述の参考例 6、及び実施例 6にて得られた各形質転換体のそれぞれを、滅菌した表 2に示す各培地に植菌後、 30°Cで 24時間振とうして好気的に培養した。

[0186] 得られた培養液カゝら遠心分離により菌体を集菌し、 0. 1M Tris—塩酸緩衝液 (p H8. 0)に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の D アミノ酸ォキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、以下に示す方法で D アミノ酸ォキシダーゼ活性を測定した結果を表 2に示す。

[0187] この結果より、キャンディダ'インターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株由来の D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を単独で有する形質転換体ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101 (pCDA003)、及びェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pSTNDA)に比べて、同 D アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子と共にロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を有する形質転換体エシリヒア，コリ (Escherichia coli) HB 101 (pFTLBDA)、ェシエリヒア.コリ（Escherichia coli) HB 10 1 (pFTLB, pSTNDA)、及び同 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子と共にフエ-ルァラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を有する形質転換体ェシェリヒア.コリ（Escherichia coli) HB 101 (pFTPBDA)、ェシエリヒア'コリ（Escherichia co Ι ΗΒΙΟΙ (pFTPB, pSTNDA)が高い D アミノ酸ォキシダーゼ活性を示した。 (D アミノ酸ォキシダーゼ活性活性測定方法）

D アミノ酸ォキシダーゼの活性測定は、実施例 2に示す方法で行った。

[0188] [表 2] Run 形質転換体培地 D-アミノ酸ォキシタ'-セ'活性

(注 1 ) (%) (注 2)

1 E. coli HB101 (pCDA003) A 1 00

2 E. coli HB101 (pFTLBAD) A 1479

3 E. coli HB101 (pFTPBAD) A 5225

4 E. coli HB101 (pSTNDA) B 1 00

5 E. coli HB101 (pFTLB, pSTNDA) B 1 38

6 E. coli HB101 (pFTPB, pSTNDA) B 1 73

(注 1 )

培地 A : トリフ。トン 1.6%、ィ一ストエキス 1氣塩化ナトリウム 0.5%、アンピシリン 0.01 %を脱ィ

才ン水に溶解、滅菌前 pH7.0 (アンピシリンは滅菌後に添加）培地 B : 培地 Aにクロラムフ： 1：ニコ -ル 0.01 %を滅菌後に添加

(注 2) Run1 - 3は Run1の D-アミノ酸ォキシタ' -セ'活性を 100とした相対値、

Run4- 6は Run4の D-アミノ酸ォキシタ' -セ'活性を 100とした相対値で表す。

[0189] 列 i3) D アミノ酸ォキシダーゼ、 Πイシン脱, 7kま泰、びギ脱ま酵素の活件有する形皙転橼体禾 II用した L ノルパリンの合成

実施例 11—1で得られた D—アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB 10 l (pFTLBDA)を、滅菌した培地 A (トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%、塩化ナトリウム 0. 5%、アンピシリン 0. 01%、脱イオン水に溶解、滅菌前 pH7. 0、ただしァンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、 33°Cで 48時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液力も遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の 10倍になるように懸濁した。ラセミ体ノルバリン lOOmgに、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性 13u分の上記菌体懸濁液、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme 社製） 2 1、 TritonX- 100 2 1、 NADO. 59mg、及びギ酸アンモ-ゥム 43mgを添加し、さらに 5Mアンモニア水溶液を用いて pHを 8. 0に調整した後、脱イオン水を添加して 2mlになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて 30°Cにて振とうし、 2N硫酸にて 8. 0にコントロールしながら 8時間反応した。生成した L—ノルノ《リンの収率、及び光学純度を高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用いて分析した結果、ラセミ体に対し 93. 3%の反応収率で、光学純度 100%eeの L ノルパリンが得られた。

[0190] この結果より、 D—アミノ酸ォキシダーゼの活性を有する形質転換体とロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用した後述の比較例 1と比較して、菌体を破砕しなくとも高い反応性を示すことが示された。

(HPLC分析条件）カラム： SUMICHIRAL OA— 5000 (4. 6mm X 250mm,住化分析センター社製）、移動相： 2mM硫酸銅水溶液 Zメタノール =95Z5、流速： 1 mlZ分、カラム温度： 30°C、検出： 254nm

[0191] (実施例 14) D アミノ酸ォキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活件を有する形皙転椽体を刺用した L tert—ロイシンの合成

実施例 13と同様の方法にて培養した形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli ) HB101 (pFTLBDA)の培養液カゝら遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の 10倍になるように懸濁して菌体懸濁液とした。この懸濁液の一部を超音波処理にかけることにより菌体を破砕して、粗酵素液を調製した。

[0192] ラセミ体 tert—口イシン 50mgに、 D アミノ酸ォキシダーゼ活性 20u分の上記菌体懸濁液、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novozyme社製） 5 1、 NADO. 79mg、及びギ酸アンモ-ゥム 19mgを添カ卩し、さらに 5Mアンモニア水溶液を用いて pHを 8. 0 に調整した後、脱イオン水を添加して lmlになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて 30°Cにて振とうし、 2N硫酸にて 8. 0にコントロールしながら 42時間反応した。生成した L tert ロイシンの収率及び光学純度を実施例 3と同様の方法にて分析した結果、ラセミ体に対し 93. 3%の反応収率で、光学純度 100%eeの L tert ロイシンが得られた。

[0193] また、菌体懸濁液の代わりに上記粗酵素液を同量使用した場合は、ラセミ体に対し 93. 3%の反応収率で、光学純度 83. 2%eeの L tert—口イシンが得られた。これらの結果から、粗酵素液を使用する場合よりも、未破砕の菌体 (菌体懸濁液)を使用する場合のほうが反応性が向上することがわ力つた。

[0194] (比例 1) D—アミノ酸ォキシダーゼの活件を有する形皙転椽体、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活件を有する形皙転椽体を利用した L ノルパリンの合成

実施例 6で得られた、 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒァ'コリ（Escherichia coli) HB101 (pCDA003) (FERM BP— 10639)を、滅菌した培地 Aに植菌後、 37°Cで 30時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液力も遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の 10倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波処理にかけることにより菌体を破砕して、 D— アミノ酸ォキシダーゼを含む粗酵素液を得た。また、後述する参考例 4に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTLB)を、滅菌した培地 Aに植菌後、 33 °Cで 48時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の 10倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波により菌体を破砕して、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。

[0195] ラセミ体ノルバリン 50mgに、上記ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pCD A003)の菌体懸濁液を実施例 13の場合と同量、エシリヒア 'コリ（Escherichia coli) HBlOl (pFTLB)を実施例 13の場合と同量、カタラーゼ（Catazyme25L、 Novoz yme社製） 1 1、 NADO. 30mg、及びギ酸アンモニクム 16mgを添カロし、さらに 5M アンモニア水溶液を用いて pHを 8. 0に調整した後、脱イオン水を添カ卩して lmlになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて 30°Cにて振とうし、 2N硫酸にて 8. 0にコントロールしながら 9時間反応した。生成した L ノルパリンの収率及び光学純度を実施例 3と同様の方法にて分析した結果、ラセミ体に対し 78. 3%の反応収率で、光学純度 47. 9%eeの L ノルパリンが得られた。

[0196] また、各形質転換体の菌体懸濁液の代わりに粗酵素液を同量使用して同様の反応を行なった場合は、ラセミ体に対し 79. 5%の反応収率で、光学純度 100%eeの L ノルパリンが得られた。この結果から、 D—アミノ酸ォキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用した L ノルパリンの製造においては、未破砕の菌体を使用すると反応性が低下することが示された。

[0197] (参者例 3)ギ酸脱水酵活件を有する形皙転椽体の音糠

チォバシラス.エスピー（Thiobacillus sp.)KNK65MA株（FERM BP— 7671)の培養菌体から国際公開第 WO03Z031626号に記載の方法に従って得た染色体 D NAを铸型に、 DNAプライマー（Primer— 15 :配列表の配列番号 18、及び、 Prime r 16：配列表の配列番号 19)を用いて PCRを行なった。 PCRの条件はァユーリング温度を 50°Cとしたこと以外は、実施例 11—1と同様にして行なった。 PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 Ndelと EcoRIで切断し、その DNA断片と、同酵素で切断したベクタープラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、ギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをェシエリヒアコリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。

[0198] 得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37°Cで 24 時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを回収した。

[0199] ( {列 4)ロイシン脱, 7kまま活件、 ¾びギ ! 脱,71まま活件する転橼体の音糠

参考例 2で得られたロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを EcoRIと Saclで切断し、ロイシン脱水素酵素遺伝子を含む DNA断片を TaKaRaRE COCHIP (タカラバイオ社製)を用いて回収し、回収したその DNA断片と、参考例 3 で得られたギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを同酵素で切断した断片とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計された図 9に示すプラスミド pFTLBを取得した。

[0200] 得られたプラスミド pFTLBをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 (pFTLB) を育種した。

[0201] 得られた形質転換体ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTLB)を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド PFTLBを回収した。

[0202] (» ί列 5)フエ-ルァラユン脱, 7k 活件、 ¾びギ脱, 7k 活件をする形皙転椽体の音糠

バチルス ·パディウス（Bacillus badius) IAM11059株を滅菌した培地（トリプトン 1. 0%、イーストエキス 0. 5%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、脱イオン水に溶解、滅菌前 _PH7 . 0)に植菌後、 30°Cで 48時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、 Marnmr法を用いて得た染色体 DNAを铸型に、 DNAプライマー（Primer— 17 :配列表の配列番号 20、及び、 Pri mer- 18 :配列表の配列番号 21)を用いて PCRを行なった。 PCRの条件はァニーリング温度を 50°Cとしたこと以外は、実施例 11—1と同様にして行なった。 PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 EcoRIと Pstlで切断し、その DNA断片と、参考例 3で得られたギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを同酵素で切断した断片とを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、フエ二ルァラニン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計された図 10に示すプラスミド p FTPBを取得した。

[0203] 得られたプラスミド pFTPBをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで、フエ二ルァラニン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) HB101 ( pFTPB)を育種した。

[0204] 得られた形質転換体ェシエリヒア 'コリ（Escherichia coli) HB101 (pFTPB)を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Aに植菌後、 37°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミド抽出を行い、フエ-ルァラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミド pFTPBを回収した。

[0205] (参者例 6) D—アミノ酸ォキシダーゼ活件を有する形皙転椽体の音糠

ベクタープラスミド PSTV28 (タカラバイオ社製）を铸型に、 DNAプライマー（Prime r 19 :配列表の配列番号 22、及び、 Primer— 20 :配列表の配列番号 23)を用いて PCRを行なった。 PCRの条件は実施例 11—1と同様にして行なった。 PCRにより得られた DNA増幅断片を制限酵素 Nedlで切断し、 T4 DNAリガーゼを用いて再結合することで、同ベクタープラスミドのマルチクローユングサイト近傍に Nedlサイトが挿入されたベクタープラスミドを取得した。

[0206] 得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した 6ml の培地（トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%、塩ィ匕ナトリウム 0. 5%、クロラムフエ二コール 0. 01%、脱イオン水に溶解、滅菌前 pH7. 0、ただしクロラムフエ-コールは滅菌後に添加する）に植菌後、 37°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体^^菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGE N社製)を用いてプラスミドを回収した。

[0207] 次!、で、実施例 6で得られた、キャンディダ.インターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株由来の D -アミノ酸ォキシダーゼを発現できるように設計された発現プラスミド PCDA003を制限酵素 Ndelと Saclで切断し、 D—アミノ酸ォキシダーゼ遺伝子を含む DNA断片を TaKaRaRECOCHIP (タカラバイオ社製）を用いて回収し、回収したその DNA断片と、同酵素で切断した上記方法で得られたプラスミドとを、 T4 DNAリガーゼを用いて結合することで、 D—アミノ酸ォキシダーゼを発現できるように設計された図 11に示すプラスミド pSTNDAを取得した。

[0208] 得られたプラスミドをェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101のコンビテントセルと混合し形質転換を行なうことで D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有する形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pSTNDA)を得た。得られた形質転換体ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB101 (pSTNDA)を、試験管内にて滅菌した 6mlの培地 Cに植菌後、 37°Cで 24時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製 )を用いてプラスミド pSTNDAを回収した。

Claims

請求の範囲

[1] キャンディダインターメディア（Candida intermedia)由来の D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、下記の理化学的性質を有することを特徴とするポリペプチド：

(1)分子量

分子量約 252,000

サブユニットの分子量約 42,000；

(2)作用温度の範囲

温度範囲少なくとも 20°C〜60°C ;

(3)作用 pHの範囲

pH範囲少なくとも 6〜： L0. 5。

[2] キャンディダインターメディア（Candida intermedia) NBRC0761株に由来する請求項 1記載のポリペプチド。

[3] 以下の（a)、（b)又は（c)のポリペプチド：

[4] 請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードする DNA。

[5] 以下の（d)、（e)又は（f)の DNA:

(d)配列表配列番号 2に示される塩基配列力なる DNA;

(e)配列表配列番号 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および Zまたは付加された塩基配列を有し、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA:

(f)配列表配列番号 2に示される塩基配列と 67%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA [6] 請求項 4又は 5に記載の DNAをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。

[7] 前記ベクターカ¾11。18、 pUC19、 pBR322、 pACYC184、 pSTV28、 pSTV29、 pSC101、 pT7Blue、又は pUCNT、若しくはそれらの誘導体である請求項 6記載の組換えプラスミド。

[8] 前記糸且換えプラスミドが図 1の制限酵素地図にて特定される PCDA003である請求項 6記載の組換えプラスミド。

[9] 更に、 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる活性を有するポリペプチドをコードする D

NAがベクターに挿入された、請求項 6記載の組換えプラスミド。

[10] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAが、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び Z又は、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAである請求項 9に記載の組換えプラスミド。

[11] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAとして、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA及び補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAが挿入された請求項 10記載の組換えプラスミド。

[12] 前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素、又はフ二ルァラニン脱水素酵素である請求項 10又は 11記載の組換えプラスミド。

[13] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である請求項 10〜 12のいずれか 1項に記載の組換えプラスミド。

[14] 前記組換えプラスミドが、図 7の制限酵素地図にて特定される pFTLBDA、又は図 8 の制限酵素地図にて特定される pFTPBDAである請求項 11に記載の組換えプラスミド。

[15] 請求項 6記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体

[16] 前記宿主微生物がェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)である請求項 15に記載の形質転換体。

[17] 前記形質転換体がェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) HB 101 (pCDA003) (FER M BP— 10639)また ίお M109 (pCDA003) (FERM BP— 10638)である請求項 15に記載の形質転換体。

[18] 更に、 D アミノ酸ォキシダーゼ以外の酵素活性を有するポリペプチドをコードする D

NAが導入された請求項 15記載の形質転換体。

[19] 前記 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAが、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び Z又は補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAである請求項 18に記載の形質転換体。

[20] 前記 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAとして、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA及び補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAが導入された請求項 19に記載の形質転換体。

[21] 前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素、又はフ二ルァラニン脱水素酵素である請求項 19又は 20記載の形質転換体。

[22] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である請求項 19〜21のいずれか 1項に記載の形質転換体。

[23] 請求項 6記載の組換えプラスミド、及び、前記 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAを挿入断片として含む組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる請求項 18〜22のいずれか 1項に記載の形質転換体。

[24] 請求項 9〜 14の、ずれか 1項に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる請求項 18記載の形質転換体。

[25] 前記宿主微生物がェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)である請求項 18〜24のいずれか 1項に記載の形質転換体。

[26] 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とする D アミノ酸ォキシダーゼの製造方法。

[27] 前記微生物が、請求項 15〜25のいずれ力 1項に記載の形質転換体、又は、キャンディダ属に属する微生物である、請求項 26に記載の D アミノ酸ォキシダーゼの製造方法。

[28] L アミノ酸または 2 ォキソ酸の製造方法であって、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式 (1) :

[化 1]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（2)： [化 2]

(式中、 Rは前記と同じ)で表される L アミノ酸、又は、一般式（3)：

[化 3]

(式中、 Rは前記と同じ)で表される 2 ォキソ酸を製造する方法。

[29] 環状 L アミノ酸又は環状ィミンの製造方法であって、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式 (4) : [化 4]

(式中、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖)で表される環状アミノ酸に作用させ、一般式 (5) :

[化 5]

(式中 R'は上記と同じ)で表される環状 L アミノ酸、又は、一般式 (6)

[化 6]

(式中 R'は上記と同じ)で表される環状イミンを製造する方法。

[30] 請求項 15〜17のいずれか 1項に記載の形質転換体を用いる、請求項 28又は 29記載の製造方法。

[31] カタラーゼの存在下に反応を行う、請求項 28〜30のいずれ力 1項に記載の製造方法。

[32] L アミノ酸の製造方法であって、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（1)： [化 7]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（2)： [化 8]

(式中、 Rは前記と同じ)で表される L アミノ酸を製造する方法。

環状 L アミノ酸の製造方法であって、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリべプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式 (4)：

[化 9]

(式中、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖)で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、一般式 (5)：

[化 10]

(式中 R'は上記と同じ)で表される環状 L アミノ酸の製造方法。

[34] 前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素又はフ二ルァラニン脱水素酵素である、請求項 32又は 33記載の製造方法。

[35] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である請求項 32〜34のいずれか 1項に記載の製造方法。

[36] 請求項 15〜25の、ずれか 1項に記載の形質転換体を用いる請求項 32又は 35の、ずれか 1項に記載の製造方法。

[37] D アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の

3酵素を共発現する形質転換体を用いる、請求項 36記載の製造方法。

[38] 前記形質転換体の菌体を破砕せずに用いる、請求項 37記載の製造方法。

[39] カタラーゼの存在下に反応を行う、請求項 32〜38のいずれ力 1項に記載の製造方法。

[40] D アミノ酸ォキシダーゼの生産量向上方法であって、 D アミノ酸ォキシダーゼをコードする DNA、及び、少なくとも 1種の当該 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAで、宿主微生物を形質転換することを特徴とする方法。

[41] 前記 D アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAが、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び Z又は、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAである、請求項 40記載の方法。

[42] 前記アミノ酸脱水素酵素がロイシン脱水素酵素、又は、フ二ルァラニン脱水素酵素である請求項 41記載の方法。

[43] 前記ロイシン脱水素酵素が、バチルス 'スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC33

41株由来である請求項 42記載の方法。 [44] 前記フエ-ルァラニン脱水素酵素力バチルス'パディウス（Bacillus badius) lAMl l

059株由来である請求項 42記載の方法。

[45] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又は、グルコース脱水素酵素である請求項 41〜44のいずれか 1項に記載の方法。

[46] 前記ギ酸脱水素酵素が、チォバシラス ·エスピー（Thiobacillus sp.) KNK65MA株 (

FERM BP— 7671)由来である請求項 45に記載の方法。

[47] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAとして、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAの両方を形質転換する、請求項 40〜46のいずれ力 1項に記載の方法。

[48] 前記宿主微生物が、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli)である請求項 40〜47のいずれか 1項に記載の方法。

[49] D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAと、当該 D— アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAとを挿入断片として含み、前記 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAのみを挿入断片として含む組換えプラスミドに比べて D—アミノ酸ォキダーゼの生産量が向上した組換えプラスミド。

[50] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする

DNAが、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び Z又は、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAである、請求項 49記載の組換えプラスミド。

[51] 前記アミノ酸脱水素酵素がロイシン脱水素酵素、又は、フ二ルァラニン脱水素酵素である請求項 50記載の組換えプラスミド。

[52] 前記ロイシン脱水素酵素が、バチルス 'スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC33

41株由来である請求項 51記載の組換えプラスミド。

[53] 前記フエ-ルァラニン脱水素酵素力バチルス 'バディウス（Bacillus badius) lAMl l

059株由来である請求項 51記載の組換えプラスミド。

[54] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又は、グルコース脱水素酵素である請求項 50〜53のいずれか 1項に記載の組換えプラスミド。 [55] 前記ギ酸脱水素酵素が、チォバシラス ·エスピー（Thiobacillus sp.) KNK65MA株 ( FERM BP— 7671)由来である請求項 54に記載の組換えプラスミド。

[56] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリぺプ

ポリペプチドをコードする DNAとして、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAの両方が挿入された請求項 49〜55 の!、ずれか 1項に記載の組換えプラスミド。

[57] D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA、及び、当該 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DN Aとで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体であって、前記 D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAのみで形質転換された形質転換体に比べて D—アミノ酸ォキシダーゼ活性が向上した形質転換体。

[58] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAが、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び Z又は、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAである、請求項 57記載の形質転換体。

[59] 前記アミノ酸脱水素酵素がロイシン脱水素酵素、又は、フ二ルァラニン脱水素酵素である請求項 58記載の形質転換体。

[60] 前記ロイシン脱水素酵素が、バチルス 'スファエリカス（Bacillus sphaericus) NBRC33 41株由来である請求項 59記載の形質転換体。

[61] 前記フエ-ルァラニン脱水素酵素力バチルス'パディウス（Bacillus badius) lAMl l 059株由来である請求項 59記載の形質転換体。

[62] 前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又は、グルコース脱水素酵素である請求項 58〜61のいずれか 1項に記載の形質転換体。

[63] 前記ギ酸脱水素酵素が、チォバシラス ·エスピー（Thiobacillus sp.) KNK65MA株 ( FERM BP— 7671)由来である請求項 62に記載の形質転換体。

[64] D—アミノ酸ォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAを挿入断片として含む組換えプラスミド、及び、前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードする DNAを挿入断片として含む組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる請求項 57〜63のいずれか 1項に記載の形質転換体。

[65] 前記 D—アミノ酸ォキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリぺプ

ポリペプチドをコードする DNAとして、アミノ酸脱水素酵素をコードする DNA、及び、補酵素再生能を有する酵素をコードする DNAの両方が導入された請求項 57〜64 の!、ずれか 1項に記載の形質転換体。

[66] 請求項 49〜56の、ずれか 1項に記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる、請求項 57記載の形質転換体。

[67] 前記宿主微生物が、ェシエリヒアコリ（Escherichia coli)である請求項 57〜66の!ヽずれか 1項に記載の形質転換体。

[68] 請求項 57〜67のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養し、培養物中に D—アミノ酸ォキシダーゼを蓄積させ、これを採取することを特徴とする D—アミノ酸ォキシダーゼの製造方法。

[69] L—アミノ酸、又は、環状 L—アミノ酸の製造方法であって、請求項 57〜67のいずれ力 1項に記載の形質転換体を、一般式（1)：

[化 11]

(式中、 Rは置換基を有していてもよい炭素数 1〜20のアルキル基、置換基を有して V、てもよ、炭素数 7〜20のァラルキル基、もしくは置換基を有して、てもよ、炭素数 6〜20のァリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸、又は、一般式 (4)：

[化 12]

COOH (式中、 R'は置換基を有してもよい炭素数 2〜7のアルキル鎖)で表される環状アミノ酸に作用させ、一般式 (2) :

[化 13]

(式中、 Rは前記と同じ)で表される L一アミノ酸、又は、一般式 (5)

[化 14]

(式中 R'は上記と同じ)で表される環状 L一アミノ酸を製造する方法。

D—アミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び、補酵素再生能を有する酵素の 3酵素を共発現する形質転換体を用いる、請求項 69記載の製造方法。