WO2006106970A1

WO2006106970A1 - ３重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法

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Publication number: WO2006106970A1
Application number: PCT/JP2006/306941
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Kase; Akio Kimura; Hiroshi Kisaki; Hiroyuki Keshi; Hiroshi Ueyama; Mizuki Nishihara
Original assignee: Osaka Municipal Government; Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Osaka Municipal Government; Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2007-09-30
Also published as: CA2602611C; ES2387467T3; CN101171334A; EP1870460A1; EP2390326A1; KR20070121809A; PT2390326E; EP1870460B1; JPWO2006106970A1; EP2383338A1; DK1870460T3; US20120172577A1; US9018354B2; HK1164917A1; JP4892474B2; PT1870460E; DK2390326T3; CN101171334B; ES2489715T3; CA2602611A1

Abstract

　本発明は、コラーゲン遺伝子を導入した宿主細胞において、外来遺伝子高発現ベクターへ導入した遺伝子に由来するヒト・コラーゲンタンパク質が大量に合成され単離精製が容易で、かつ天然型コラーゲン分子と実質的に同等な構造を有するヒト・コラーゲン分子の製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、該製造方法によって製造されたコラーゲン分子を提供することも課題とする。　上記課題を解決するために、種々の哺乳動物細胞のうちでもコラーゲン分子の発現量の少ない細胞を宿主として外来遺伝子を高発現可能なベクターにコラーゲン遺伝子コンストラクトを導入することにより、宿主細胞由来のコラーゲンの混在がほとんど見られないヒト・コラーゲンを大量に製造できることを見出した。

Description

明細書

3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。より具体的には、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドの製造方法に関する。本発明の課題は生体にとって安全であり、精製取得の容易なヒト 'コラーゲンおよびヒト 'コラ一ゲンの部分ペプチドおよびその製造方法を提供することにある。さらに詳しくは、本発明は、ヒト 'コラーゲン cDNAを挿入して得られる哺乳動物発現ベクターをチヤィ- 一ズノ、ムスター卵巣 (CHO)細胞に安定形質導入することによるヒト 'コラーゲンおよびヒト ·コラーゲンの部分ペプチドの製造方法を提供することにある。

背景技術

[0002] コラーゲンは皮膚 '骨'軟骨をはじめ、ほぼ生体中の全組織に分布するタンパク質であり、細胞の足場となって組織'器官の構造を維持するなど、重要な機能を担っていることはよく知られている。一方コラーゲンは、繊維芽細胞から分泌されるコラゲナーゼおよび食細胞中に存在するコラゲナーゼにより分解される生体吸収性材料である。この様にコラーゲンは生体適合性があり、また、生体吸収性材料であるため生物素材として有用なものであると考えられている。これまでにコラーゲンは、生物素材として皮膚損傷部位の被覆材として用いられ、治癒改善が報告されて、る (非特許文献 1および 2)。

[0003] 全コラーゲンのうち 40%が皮膚に存在し、皮膚 ·腱では乾燥重量の 70%以上がコラーゲンである。従ってコラーゲンは人工皮膚の開発において重要である。また、細胞ゃ器官の培養技術にぉ、ても有用な素材として利用されて、る。このことは現在進歩の著しい再生医療分野での応用も大いに期待できるものである。また、経口摂取することにより関節リューマチが抑制されるという用途への可能性 (II型コラーゲン）なども指摘されている（非特許文献 3および 4)。このようなコラーゲンの原材料としてはこれまでは主にブタゃゥシなどヒト以外の大型動物の糸且織由来のものが用いられて [0004] 非特許文献 1 : Surg. Forum, 10, 303 (1960)

非特許文献 2 : J. Surg. Res., 10, 485-491 (1970)

非特許文献 3 : Lancet, 342, 799 (1993)

非特許文献 4: Science, 261, 1727-1730 (1993)

特許文献 1 :特開平 10— 179169

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] このようにコラーゲンは再生医療や生体移植用の生物素材あるいは医薬品として有用な物質である力従来力用いられてきたコラーゲンはブタゃゥシなどヒト以外の大型動物の組織由来のものである。コラーゲンはもともと免疫原性の低いタンパク質ではあるが、異種動物のコラーゲンを生物素材としてヒト生体内に移植、埋入あるいは投与した場合には免疫反応が低頻度ながら惹起されることが報告されている (J. Im munol, 136, 877-882 (1986)、 Biomaterials, 11, 176-180 (1990))。また、ゥシにおけるプリオン汚染の問題が発生するに至って、ゥシ由来のコラーゲンの使用が不可能となっている。さらにブタ等、現在コラーゲンの抽出に用いられている動物においてプリオン汚染と同様な問題が生じな、と、う保証はな、。以上の点にぉ、て人体に直接適用する生物素材としては、ヒト由来コラーゲンの使用が望ましい。し力しながら、ヒト組織力もコラーゲンを抽出、精製することは倫理的な問題や技術的な問題があるば力りでなぐ得られたコラーゲンが不特定の架橋を形成するため、精製が困難になるという質的な問題点もある。

[0006] 抗原性がなぐ病原体混入の危険性を排除し、さらに単離精製の容易なコラーゲンを得るために、遺伝子組換えの技術を応用したコラーゲンの製造が検討されてきた（ Biochem. Soc, 28, 350-353 (2000))。しかしながら、分子量 10万以上のコラーゲン分子をコードする cDNAを宿主細胞に導入するための発現ベクターの作製は非常に煩雑なものとなる。また従来の方法では生産量も低く実用化には程遠いものであった。さらにコラーゲンは 3本のポリペプチド鎖が会合して 3重螺旋構造をとる分子であることが知られており、このような構造は遺伝子力翻訳された一次産物がさらに複数の修飾を受けることによって形成されるが（N. Engl. J. Med., 311, 376-386 (1984))、特定の細胞のみがこのような修飾能力を保有しているものと考えられている。

[0007] これまでにマウス線維芽細胞、ハムスター肺細胞等を宿主とした組換えヒト ·コラーゲンの生産が試みられている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 764-768 (1987)、 J. Biol. Chem., 264, 20683-20687 (1989))。しかしこれらの例において得られるコラーゲンは分子構造としては正常であるが、ヒトと宿主細胞それぞれのコラーゲン遺伝子産物からなる混成コラーゲン分子であった。また、ヒト II型コラーゲンを発現させた例（ Biochem. J., 298, 31-37 (1994))では、その生産量が培養液 1Lあたり 0. 5〜： Lmgと低いものに過ぎず、さらに cDNA導入により発現させた II型コラーゲンに相当量の宿主由来 IV型コラーゲンの混入が認められた。そのため、導入遺伝子由来の II型コラーゲンと内在性の II型コラーゲンと分離する必要があった。

[0008] また、以上の他に酵母 (特表平 7— 501939号公報）、昆虫細胞 (特開平 8— 2397

9号公報）、バシルス'ブレビス (特開平 11— 178574号公報）、大腸菌（特開 2002 325584公報）を用いてヒト ·コラーゲンを発現させた例も見られる力コラーゲンぺプチド発現後の修飾に動物細胞におけるそれとの差異のある危険性が考えられた。以上の如くこれまでに、示されてきたいかなる方法もヒト'コラーゲンを遺伝子組換えで製造する手段としては、量的、質的ともに満足できるものではな力つた。また、これまでにコラーゲンのように ₃重螺旋構造を有するタンパク質を大量に製造する方法は検討されていな力つた。

[0009] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法を提供することにある。より具体的には、コラーゲン遺伝子を導入した宿主細胞にぉヽて、外来遺伝子高発現ベクターへ導入した遺伝子に由来するヒト 'コラーゲンタンパク質が大量に合成され単離精製が容易で、かつ天然型コラーゲン分子と実質的に同等な構造を有するヒト 'コラーゲン分子の製造方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために種々の検討を行った結果、種々の哺乳動物細胞のうちでもコラーゲン分子の発現量の少ない細胞を宿主として外来遺伝子を高発現可能なベクターにコラーゲン遺伝子コンストラクトを導入することにより、宿主細胞由来のコラーゲンの混在がほとんど見られないヒト 'コラーゲンを大量に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。このような、導入したコラーゲン遺伝子を大量に発現させ、宿主細胞にぉ、て優先的にヒト ·コラーゲンを生産させると、ぅコラーゲンの製造方法にっ、てはこれまでに報告がな、。

[0011] 即ち、本発明者らは、 3重螺旋構造を有するタンパク質の一つであるコラーゲンの発現量の少ない哺乳動物を宿主として外来遺伝子を高発現することが可能なベクタ一に、ヒト 'コラーゲン遺伝子を導入して得られたコンストラクトを導入することによって、ヒト 'コラーゲンを複雑な精製工程を必要とせず大量に製造方法を開発することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。

[0012] 即ち、本発明は、以下の〔1〕〜〔15〕を提供するものである。

〔1〕以下の（a)カゝら (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法

(a) 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAをベクターに導入する工程

(b)該ベクターを用いた遺伝子導入により、哺乳動物細胞を形質転換させる工程

(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清カゝら 3重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程

〔2〕 3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト'コラーゲンまたはその部分ペプチドである〔1〕に記載の方法。

〔3〕ヒト 'コラーゲンが少なくとも 1種類以上の _α鎖力もなるヒト 'コラーゲンである、〔2〕に記載の方法。

〔4〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト ·Ι型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。

〔5〕ヒト ·Ι型コラーゲンが α 1鎖と α 2鎖の複合体である〔4〕に記載の方法。

〔6〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト · II型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。

〔7〕ヒト 'コラーゲンが、ヒト · III型コラーゲンである〔2〕に記載の方法。

〔8〕 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNA力以下の（a)または (b)に記載の DNAカゝら選択される少なくとも 1つの DNAである、〔1〕に記載の方法。

(a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA

(b)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA

〔9〕哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞である、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。

〔10〕哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞 (HEK293)である、〔1〕〜〔8〕の、ずれ力ゝに記載の方法。

〔11〕 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが導入されるベクター力 p NOWZCMV— AAである、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。

〔12〕〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト 'コラーゲン。〔13〕以下の（a)または (b)に記載の DNAから選択される少なくとも 1つの DNAが導入されたベクター。

〔14〕〔13〕に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。

〔15〕〔13〕に記載のベクター、または〔14〕に記載の哺乳動物細胞を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。

図面の簡単な説明

[図 1]ヒト I型 a 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIal：ヒ H型 α 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd：ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori：大腸菌中での複製起点、 Neor：哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイシン耐性)を示す。

[図 2]ヒト I型《2鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIa2 :ヒ H型 α 2鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd：ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori：大腸菌中での複製起点、 Neor：哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイシン耐性)を示す。

[図 3]ヒト II型 α 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIIal: ヒト II型 a 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA:ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd:ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori:大腸菌中での複製起点、 Neor:哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイシン耐性)を示す。

[図 4]ヒト III型 α 1鎖コラーゲン発現コンストラクトを示す図である。それぞれ、 hColIIIal ：ヒト III型 a 1鎖コラーゲン cDNA、 PCMV:サイトメガロウィルスプロモーター、 BGHPA: ゥシ成長ホルモン遺伝子ポリ A付カ卩シグナル、 PSVd:ェンハンサーを欠失させたシミアンウィルス 40プロモーター、 DHFR:マウスジヒドロ葉酸還元酵素 cDNA、 SVpA:シミアンウィルス 40ポリ A付加シグナル、 ColElori:大腸菌中での複製起点、 Neor:哺乳動物細胞中での選択マーカー（G418耐性)および大腸菌中での選択マーカー (カナマイシン耐性)を示す。

[図 5]培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト I型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2 :組換え I型コラーゲンを示す。

[図 6]培養上清中の糸且換えヒト I型コラーゲンのペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1：組換えヒト I型コラ一ゲン（185 g/mL)、レーン 2：組換え I型コラーゲン (20倍濃縮)を示す。

[図 7]精製組換えヒト I型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウェスタンプロッティングによる検出を示す写真である。 A.抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体による検出、レーン 1 :ヒト I型コラーゲン（50 /z g/mL)、レーン 2 :組換え I型コラーゲン、レーン 3 :組換え I型コラーゲンのペプシン分解物を示す。 B.抗ヒト I型コラーゲン α 2鎖抗体による検出、レーン 1 :ヒト I型コラーゲン（10 g/mL)、レーン 2 :糸且換え I型コラーゲン、レーン 3：組換え I型コラーゲンのペプシン分解物を示す。

[図 8]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト II型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2 : 組換え II型コラーゲンを示す。

[図 9]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト II型コラーゲン（10 g/mL)、レーン 2 :組換え II型コラ一ゲン（10倍希釈)を示す。

[図 10]培養上清中の糸且換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1：ヒト II型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2：組換え II型コラーゲン (5倍濃縮)を示す。

[図 11]培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解物のウェスタンブロッテイングによる分析を示す写真である。レーン 1：ヒト Π型コラーゲン（10 g/mL) 、レーン 2 :糸且換え II型コラーゲンを示す。

[図 12]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト III型コラーゲン（100 g/mL)、レーン 2：組換え III型コラーゲンを示す。

[図 13]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンおよびそのペプシン分解物のウェスタンブロッテイングによる分析を示す写真である。レーン 1 :ヒト III型コラーゲン（10 g/m L)、レーン 2 :組換え III型コラーゲン（10倍希釈）、レーン 3 :組換え III型コラーゲンぺプシン分解物を示す。

[図 14]培養上清中の組換えヒト III型コラーゲン精製物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を示す写真である。 A. I型コラーゲン、レーン 1 :ヒト I型コラーゲン、レーン 2 :糸且換え I型コラーゲンを示す。 B. III型コラーゲン、レーン 1 :ヒト III型コラーゲン、レーン 2 :組換え III型コラーゲンを示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施するための最良の形態を示し、本発明についてさらに詳しく説明する。

本発明は、以下の（a)から (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法に関する。

(c)該形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清カゝら 3重螺旋構造を有するタンパク質を回収する工程。

[0015] 本発明の「3重螺旋構造を有するタンパク質」とは、 3重螺旋構造を有する限り特に限定されないが、好ましくはコラーゲンまたはコレクチンを、より好ましくはコラーゲンを挙げることが出来る。 3重螺旋構造を有するタンパク質とは、培養製造段階で 3重螺旋が構築されるタンパク質であってもよいし、培養製造後の精製等の操作により 3 重螺旋構造が構成されるものであってもよい。 3重螺旋構造を取りうるタンパク質である力 1本鎖構造の状態で大量に製造させてもよい。

[0016] コラーゲンには 20数種類の異なった型、またそれらを構成する約 25種類の a鎖が存在することが知られており、それらをコードする遺伝子はそれぞれクローニングされ、塩基配列が解明されている（"Connective Tissue and Its Heritable Disorders", ppl 45-165, Weily-Liss Inc.発行（1992))。そして、これらの遺伝子はいずれも、当業者に公知の遺伝子組換え技術（例えば〃 Molecular Cloning"第 2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press発行（1989))によって本発明において用いられる外来遺伝子を高発現することの可能なベクターに導入することが可能である。本発明で用いるヒト 'コラーゲン cDNAはこれらのクローニングされたコラーゲン cDNAのどれであってもよく、またこれらコラーゲンの部分ペプチドも含む。

[0017] 本発明のコラーゲンの由来は特に限定をされないが、好ましくは哺乳動物由来、より好ましくはヒト由来のコラーゲンを挙げることが出来る。

さらにコラーゲンのァミノ配列の一部を置換'欠失等改変したものや、コラーゲン由来でないアミノ酸配列を付加したものも本発明のコラーゲンに含まれる。また、ベクタ一を宿主哺乳動物細胞に導入し、タンパク分子を発現してヽる形質導入細胞を得る方法は公知であり、本発明にお、ても同様の方法を適用することができる。

[0018] 上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞にぉ、てコラーゲンが組換えタンパク質として合成されて、ることは以下によって調べることができる。すなわち巿販のヒト 'コラーゲンに特異的に結合する抗体を用いてウェスタンブロッテイング等の免疫化学的な方法によりコラーゲンペプチドであることを確認することができる。通常コラーゲンは SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Nature, 227, 680-685 (1970)) においては、分子量通りには泳動されないため、コラーゲンをマーカーとして同時に電気泳動後、 Matsudairaらの方法 (J. Biol. Chem., 261, 10035-10038 (1987))に従つてナイロン膜あるいは-トロセルロース膜に転写し、抗コラーゲン抗体との反応性を調ベることができる。さらに発現ベクターによって生産された組換えコラーゲン産物の中に、 3重螺旋構造を有する分子が存在することは次のようにして調べることができる。

[0019] 通常の繊維性コラーゲンは、 3つのサブユニット ( a鎖）から形成される 3本鎖の分子で、分子内に 3重螺旋構造を有している。そして、 3重螺旋構造を有するコラーゲンはペプシン消化に対して耐性を有することが知られている。そこで、上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清を酸性条件下にてペプシン消化し、ペプシン耐性な構造を有するかを調べることにより、このタンパク質試料に 3本鎖分子が存在してヽることを示すことができる。

[0020] 即ち、本発明にお、ては、ペプシン処理を施したタンパク質試料を、還元条件下の SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、得られた組換えコラーゲンは天然コラーゲンと同様のペプシン耐性を示すことが明らかになり、上記の外来遺伝子高発現ベクターが導入された細胞の培養上清中にはペプシン処理に対して耐性の性質を有するコラーゲンペプチドが含まれると推察された。以上の結果から、本発明の発現ベクターは、宿主細胞において生体内に見られるのと同等な特性即ち、ぺプシン耐性なコラーゲンを合成させる能力を持つことが示される。

[0021] 本発明の 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法および精製方法を以下に示す力これらの方法に限定されるものではない。

本発明で宿主細胞として培養に用いられる哺乳動物細胞は特に限定されないが、好ましくは、 CHO細胞または HEK293細胞を挙げることが出来る。

[0022] 本発明で用いられる CHO細胞または HEK293細胞は、懸濁培養することにより大量培養化が可能である。例えば、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドをコードする cDNAを共に有するヒト ·コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換え CHO細胞 1 X 10⁸〜1 X 10⁹個を 100mL〜lLの培養液でシェーカーフラスコまたはスピナ一フラスコで培養することが可能である。これを適当な時間培養した後、培養上清を集めタンパク質を大量に抽出することができる。

[0023] 弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト •コラーゲンまたはヒト.コラーゲンの部分ペプチドをコードする cDNAを共に有するヒト 'コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換え CHO細胞の培養上清においては、 3重螺旋構造を有する 3本鎖コラーゲン分子と同時に正常な 3本鎖分子を形成しな力つたコラーゲンも存在する。前述のように、 3重螺旋構造を有しないコラーゲン分子はペプシンによって消化される。このため、 3重螺旋構造を有しないコラーゲン分子はペプシンによって分解除去することができる。この処理によって同時にコラーゲン以外の培養上清中のタンパク質も分解除去することができる。以上の性質を利用して、弱化ネオマイシンリン酸転位酵素遺伝子、マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト 'コラーゲンまたはヒト 'コラーゲンの部分ペプチドをコードする cDNAを共に有するヒト 'コラーゲン発現ベクターを形質導入して得られた組換え CHO細胞の培養上清中に存在する全タンパク質を直接ペプシン処理し非コラーゲン性タンパク質を分解除去するとともに、 3重螺旋構造を有しないコラーゲンも分解除去することができる。

[0024] 本発明にお、て対象とするヒト 'コラーゲンは、現在知られて!/、る I型から XXI型コラ一ゲンを含むすべてのヒト 'コラーゲンであり、これらのコラーゲンの部分ペプチドも含む。本発明のコラーゲンの型は特に制限をされないが、代表例として、 I型、 II型、 III 型、 IV型、 V型、 VII型、 IX型、 XI型、 XII型、 XVII型、または XVIII型等を挙げることが出来、このましくは、 I型、 II型、 III型を挙げることが出来る。 I、 IV、 V、 IX、 XI型はそれぞれ 2,3種類の α鎖からなり、 II、 III、 VII、 XII、 XVII、 XVIII型はそれぞれ 1種類の α鎖からなる。これらはそれぞれ、 -. i a l (I)] o; 20)、 II型： [ひ 1(11)]

2 3、 III型： [ α 1(ΙΠ)]

3、 IV i 1 (IV)] a 2(IV)、 V型： [ α ΐ (V)] a 2(V)と α 1 (V) a 2 (V) a 3 (V)、 VII型： [ a 1(VII

2 2

)]、 IX型： 1 (IX) 2 (IX) 3 (IX), XI型： 1 (XI) 2 (XI) 3 (XI), ΧΠ型： [ l(XII)]

3

、 XVII型： [ a 1 (XVII)]、または XVIII型： [ a 1 (XVIII)]という分子構成を持つ力本発明のコラーゲンの分子構成は特に限定されるものではない。また、本発明のコラーゲンの分子構成は、天然のコラーゲン由来の分子構成に限定されるものでなぐ種類のことなる 3種類の α鎖を人為的に複合させてもよい。

[0025] 本発明の I型コラーゲンの a 1鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 1に、 I型コラーゲンの (X 2鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 4に、 II型コラーゲンの a 1鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 7に、 III型コラーゲンの a 1鎖をコードする DNAの塩基配列を配列番号： 10にそれぞれ示す。

[0026] 本発明のコラーゲンをコードする DNAとして、好ましくは配列番号： 1、 4、 7、 10のいずれかに記載の塩基配列力なるオリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号： 1、 4、 7、 10のいずれかに記載の塩基配列力なるオリゴヌクレオチドに、選択的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドを挙げることが出来る。選択的にノ、イブリダィズするとは、あら力じめ定められた配列をもつ分子（すなわち第 2のポリペプチド）力 DNAまたは RN Aの試料中に存在する場合、適切にストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件の下で、ハイブリダィズする、二本鎖になる、または本質的に互いにのみ結合する核酸分子を指す。ストリンジェントな条件とは、例えば、通常、 42°C、 2 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 2 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、さらに好ましくは、 65 。C、 0.1 X SSCおよび 0.1%SDSの条件である力これらの条件に特に制限されない。ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジエンシーを実現することが可能である。

[0027] 本発明にお、て製造されるコラーゲンは、 N末端および C末端にプロペプチドが結合している、プロコラーゲン分子の状態であってもよいし、プロペプチドが除去された状態であってもよい。

本発明において、「コラーゲンの部分ペプチド」とは、コラーゲンをコードする cDNA の 20%以上（例えば 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90%)のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをいう。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、非コラーゲンアミノ酸配列を付加したものも含む。

[0028] 本発明にお、て「コラーゲン発現量の少な、哺乳動物細胞」とは、 1 X 10⁶細胞 Z mLで培養した場合に 50ngZmL以下のコラーゲン生産量である細胞のことを!、、、より好ましくは、 CHO細胞、 HEK293細胞を好適に挙げることができる。本発明にお V、て「高発現」とは、 10 gZmL以上のコラーゲン発現、好ましくは 50 μ gZmL以上のコラーゲン発現をいう。

[0029] 本発明にお、て「外来遺伝子を高発現することの可能なベクター」とは、例えば該ベクターに含まれる哺乳動物細胞における薬剤選択マーカー遺伝子の働きが微弱であるため哺乳動物細胞染色体上の転写の盛んな領域に選択的に挿入されることを特徴とするベクターであることを、、、好ましくは pNOWZCMV— AAベクターを挙げることができる。 pNOWZCMV— AAベクターは特開平 10— 179169号公報に公知である。本発明において、培養方法は浮遊、付着培養いずれでもよい。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0030] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

〔実施例 l〕pNOWZCMV— AAベクターの調製

?^0¹\^7じ1^¥—^べクターは公知の方法（特開平10—179169号公報）により調製したものを使用した。

[0031] 〔実施例 2〕コラーゲン発現ベクターの作製（1)：ヒ H型 α 1鎖 cDNAの単離

ヒト I型 α 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされ、その塩基配列が報告されている（EMBL遺伝子データベース登録名 ΝΜ 000088) οその配列を配列番号： 1 に示す。ヒト I型 a lcDNAはヒト精巣由来 cDNAよりポリメラーゼ'チェーン 'リアクション（PCR)法（"PCR Technology", Stockton Press発行（1989))により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来 cDNA (ベタトン'ディッキンソン社)を铸型として配列番号： 2の

ライマーとして配列番号：1の全長の配列を PCR法により増幅した。すなわち、市販の PCR増幅キット（TaKaRa LA Taq with GC Buffer:タカラバイオ社）を用い、 94°C、 5分間の加熱処理後、変性（94°C、 20秒）、プライマーアニーリング（60°C、 30秒）、増幅（72°C、 3分 30秒）の 3ステップを 35回繰り返し、更に 72°C、 7分間の処理をして反応を終了した。以後、本実施例に記載の PCR反応はすべて同様の反応サイクルにて実施した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novagen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligati on kit ver.2：タカラバィォ社)を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有するコロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DN Aより切り出したヒト I型 a 1鎖コラーゲンをコードする DNA断片と実施例 1で調製した外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— AAの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コロニーを培養することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIal、図 1)が得られた。

〔実施例 3〕コラーゲン発現ベクターの作製 (2)：ヒト I型 (X 2鎖 cDNAの単離ヒト I型 a 2鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告されている（EMBL遺伝子データベース登録名 NM 000089) oその配列を配列番号： 4に示す。ヒト I型 a 2cDNAはヒト肝臓由来 cDNAより PCR法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来 cDNA (和光純薬工業)を铸型として配列番号： 5のオリゴヌクレオチ

て配列番号： 4の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novage n社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト I型 (X 2鎖コラーゲンをコードする DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— AAの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コ口-一を培養することによりプラスミド DNA (pNOW— hColIa2、図 2)が得られた。

[0033] 〔実施例 4〕コラーゲン発現ベクターの作製 (3)：ヒト II型 (X 1鎖 cDNAの単離

ヒト II型 a 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告されている（EMBL遺伝子データベース登録名 NM 001844.1) oその配列を配列番号： 7 に示す。ヒト II型 α lcDNAはヒト精巣由来 cDNAより PCR法により増幅された。すなわち、ヒト精巣由来 cDNA (ベタトン'ディッキンソン社)を铸型として配列番号： 8のォ

して配列番号： 7の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Nova gen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社）上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト II型 α 1鎖コラーゲンをコードする DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— ΑΑの Not Iと Xba

I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コロニーを培養することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIIal、図 3)が得られた

[0034] 〔実施例 5〕コラーゲン発現ベクターの作製 (4)：ヒト III型 α 1鎖 cDNAの単離

ヒト III型 a 1鎖コラーゲンの遺伝子は既にクローユングされその塩基配列が報告されている（EMBL遺伝子データベース登録名 X14420)。その配列を配列番号： 10に示す。ヒト III型 α lcDNAはヒト肝臓由来 cDNAより PCR法により増幅された。すなわち、ヒト肝臓由来 cDNA (和光純薬工業)を铸型として配列番号： 11のオリゴヌクレオ

として配列番号： 10の全長の配列を PCR法により増幅した。得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により分離し、 PCR産物クロー-ングベクター（pT7Blue kits : Novagen社）とライゲーシヨンキット（DNA ligation kit ver.2：タカラバイオ社）を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue株に連結された DNAを導入後、 LB寒天培地 (ディフコ社)上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 4コロニーを培養することによりプラスミド DNAが得られた。このプラスミド DNAより切り出したヒト III型 α 1鎖コラーゲンをコードする DNA断片と外来遺伝子高発現ベクター pNOWZCMV— ΑΑの Not Iと Xba I切断物とを DNA ligation kit ver.2を用いて連結した。大腸菌 XL— I Blue 株に連結された DNAを導入後 LB寒天培地上に出現したアンピシリン耐性の性質を有する 1コロニーを培養することによりプラスミド DNA (pNOW—hColIIIal、図 4)が得られた。

[0035] 〔実施例 6〕ヒト I型コラーゲンの生産：発現ベクター pNOW— hColIalと pNOW— hC olIa2によるヒト I型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立

実施例 2および 3で得られた pNOW—hColIalと pNOW—hColIa2の各々 1 gをリポフエクチン法 (キアゲン社製エフエタテントランスフエクシヨン試薬)を用いて、 25c m²の培養フラスコ中の 150万個の DHFR欠損 CHO細胞（CHO細胞 DG44株； Dr. Gail Urlaubから譲受）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従つた。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後、 50万個の細胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタイタ一プレート 10 枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培養し、 197ゥエル中の生存細胞を lmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Is cove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコンフルェントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社） lmLを各ゥエルに加え再び培養上清を廃棄した。これ〖こ 0. 5mLの CHO細胞用 CD培地 Pro CH04 (タカラノィォ社)をカ卩えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 96時間培養した。続いて培養上清中のヒト I型コラーゲンの生産量の検討を行なった。

[0036] 〔実施例 7〕pNOW— hColIalと pNOW— hColIa2形質導入細胞クローンによるヒ H 型コラーゲンの生産量の検定生産量の検定は SDS ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の 1 2. 5 Lと等量のトリス SDS jS— MEサンプル処理液（第一化学）を混合し、 95°C、 5 分間の熱処理を行なった。これを SDS ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 ATTO社 )に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、 12. 5〜100 ₈ !11しの濃度のヒト1型コラーゲン（コスモバィォ社）を同様に処理して用いた。

[0037] 〔実施例 8〕ヒト I型コラーゲンの生産

G418耐性細胞株のうち、ヒト I型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培養し安定ィ匕させた。ヒト I型コラーゲンの産生レベルは、培地当たり 85 gZmL (4日間）であった。

[0038] 〔実施例 9〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンの SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析

遺伝子増幅により得られたヒト I型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液 IS CHO-CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm²培養フラスコ中で 1 X 10⁶個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の 12. 5 μ Lと等量のトリス SDS β MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合し、 95°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS ポリアクリルアミドゲル（PAGEL 、 ATTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシ一ブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアクリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 g ZmLの濃度のヒト I型コラーゲンを同様に処理して用いた。図 5にヒト I型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清の SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ H型コラーゲンひ 1鎖と考えられる 150k Da、 170kDaの位置のポリペプチドおよび組換えヒト I型コラーゲン α 2鎖と考えられる 130kDa、 150kDaの位置のポリペプチドが検出された。

[0039] 〔実施例 10〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンのペプシンによる分解と SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析

ヒト I型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清のペプシン分解は 99. 7 %酢酸を培養上清に最終濃度 0. 5Mになるように加え、これにペプシン (シグマ社）を最終濃度 24ユニット ZmLとなるように添加した後 20°C、 2時間で実施した。以下のペプシン分解は同様にして実施した。ペプシンによる分解によって得られたサンプルは SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては 185 μ gZmLの市販の組換えヒト I型コラーゲン（ベタトン'ディッキンソン社）を用いた。図 6にペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒ H型コラーゲンは巿販のヒト I型ァテロコラーゲンと同様に a 1鎖と考えられる 130kDaの位置のポリペプチドおよび a 2鎖と考えられる 120kDaの位置のポリペプチドとして検出された。このことはヒト I型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト I型コラーゲンが含まれて、ることを示していた。

[0040] 〔実施例 11〕培養上清中の組換えヒト I型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる分析

SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト I型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後、 2 g/mLの濃度の抗ヒト I型コラーゲン ex 1鎖抗体とそれに引き続いてホースラッデイシュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ャギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、 50 gZmLの組換えヒト I型コラーゲン (ベタトン'ディッキンソン社）を用いた。ヒト I型コラーゲン α 2鎖の検出は抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体のかわりに抗ヒト I型コラーゲン _α 2鎖抗体を用いて実施した。比較対照としては、 10 gZmLのヒト I型コラーゲンを用いた。図 7にウェスタンブロッテイングによる分析結果を示す。培養上清中に抗ヒト I型コラーゲン α 1鎖抗体が結合できる組換えヒト I型コラーゲン α 1 鎖と考えられる 170kDaの位置のポリペプチドおよび抗ヒト I型コラーゲン (X 2鎖抗体が結合できる組換えヒト I型コラーゲン α 2鎖と考えられる 130kDa、 150kDaの位置のポリペプチドが検出された。

[0041] 〔実施例 12〕培養上清中のヒト I型コラーゲンの精製

ヒ H型コラーゲンを含む培養上清 lOOmLを用いて以下の様に精製を行った。遠心濃縮フィルター（VIVASPIN20(MWCO 10,000：ザルトリウス社)〖こて 4°Cで 3,000 rpmの遠心分離により 0. 45 μ mのメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した 100 mLの培養上清を 30mLに濃縮した。

4°Cで 30mLの 90%硫酸アンモ-ゥム溶液を上記濃縮培養上清中に攪拌しながら徐々に加えて塩析し、全ての硫酸アンモ-ゥムをカ卩えてから 1時間攪拌した。その後、氷中にて 1時間静置した後、高速冷却遠心器にて 4°Cで 18,OOOrpm X 30分間遠心分離を行った。塩析によって不溶化した溶液中のコラーゲンは溶液上に浮くのでそれを回収し、 5mLの D— PBS (シグマ社）で完全に溶解させた。これを 0. 45 m のメンブランフィルター（ミリポア社）でろ過した後に D— PBSで平衡化した Superose 6 (アマシャムバイオサイエンス社)を用いたゲルろ過により精製し、最初に出現するピ一クを分取した。集めたピークのフラクションを VIVASPIN6(MWCO100,000)で約 20倍に濃縮し、濃縮したコラーゲン溶液に D— PBSを適量加えてさらに濃縮し、低分子フラグメントを除去した。この D— PBSを加える操作を少なくとも 3回以上行った。

元の培養上清 lOOmLにっき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約 300 μ L になるように濃縮したものを SDS— PAGEにより電気泳動して精製度の確認を行つた。

[0042] 〔実施例 13〕ヒト II型コラーゲンの生産試験：発現ベクター pNOW— hColIIalによるヒト1型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立

1 μ gの pNOW— hColIIalを 25cm²の培養フラスコ中の 150万個の CHO細胞 DG 44株にリポフエクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後 50万個の細胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Isc ove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタイタープレート 10枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培養し、 126 ゥエル中の生存細胞を ImLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコンフルェントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社製） 1 mLを各ゥエルに加え再び培養上清を廃棄した。これに 0. 5mLの CHO細胞用無血清培地細胞用 CD培地 ProCH04 (タカラバイオ社)を加えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 96時間培養した。続いて培養上清中のヒト II型コラーゲンの生産量の検討を行なった。

[0043] 〔実施例 14〕pNOW— hColIIal形質導入細胞クローンによるヒト II型コラーゲンの生産量の検定

生産量の検定は SDS—ポリアクリルアミド電気泳動法にて実施した。培養上清の 7 . 5 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合し、 95°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 ATTO 社）に重層し、電気泳動にて展開した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポリアクリルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンの検出と定量を行なった。比較対照としては、 12. 5〜100 gZmLの濃度のヒト II型コラーゲン（コスモバイオ社）を同様に処理して用いた。

[0044] 〔実施例 15〕 G418耐性細胞株の遺伝子増幅

G418耐性細胞株のうち、ヒト II型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培養し安定ィ匕させた後に、 MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに 5nMの MTXを含む培地で 1週間、 25nMの MTXを含む培地で 1週間、 50nMの MTXを含む培地で 1週間、 250nMの MTXを含む培地で 3週間、 1 Mの MTXを含む培地でさらに 3 週間増幅させたところ、 25nMの MTXの時点でヒト II型コラーゲンの産生レベルは培地当たり gZmL (4日間）に上昇した。遺伝子増幅に用いる MTX濃度は一般に ΙΟηΜ〜： L0 μ Μの間の多段階とされ、最終濃度としては 10 μ Μがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の榭立には問題がある。このため低濃度 MTXで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では 1 μ Μまでとした。また通常セレクションを含めた ΜΤΧ暴露期間は 6〜 12ケ月とされるのに対して、本実験では約 9週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なヒト II型コラーゲンの産生量増加がみられた。以下の G418耐性細胞株の遺伝子増幅も同様にして実施した。

[0045] 〔実施例 16〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析

遺伝子増幅により得られたヒト II型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液 IS CHO-CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm²培養フラスコ中で 1 X 10⁶個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間培養した後培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の 7. 5 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学）を混合し、 9 5°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 A TTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシ一プリリアントブルー染色液 (アマシャムバイオサイエンス社)で処理することによりポリアタリルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 /z gZ mLの濃度のヒト II型コラーゲン (コスモノィォ社)を同様に処理して用いた。図 8にヒト Π型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ HI型コラーゲンと考えられる 170kDa、 200kDaの位置のポリペプチドが検出された。

[0046] 〔実施例 17〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる分析

SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト II型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後 1 μ g/mLの濃度の抗ヒト II型コラーゲン鎖抗体 (コスモノィォ社)とそれに引き続いてホースラッディシュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、 10 /z g/mLのヒト II型コラーゲン（コスモバイオ社)を用いた。培養上清中に抗ヒト II型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒト II型コラーゲンと考えられる 170kDaのポリペプチドが検出された（図 9)。

[0047] 〔実施例 18〕培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンのペプシンによる分解と SDS— ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびウェスタンブロッテイングによる分析

ペプシンによる分解によって得られたサンプルは SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行なった。比較対照としては、 100 gZmLのヒト II型コラーゲン (コスモバイオ社）を用いた。図 10にペプシンによる分解産物の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒト II型コラーゲンは市販のヒト II型ァテロコラーゲンと同様に 130kDaのポリぺプチドとして検出された。このことはヒト II型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には実質的に天然型と同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト II型コラーゲンが含まれて！/、ることを示して！/、た。ウェスタンブロッテイングによる分析にお!ヽても同様の結果が得られた（図 11)。

[0048] 〔実施例 19〕ヒト III型コラーゲンの生産試験。発現ベクター pNOW— hColIIIalによるヒト III型コラーゲンの遺伝子導入と G418耐性初期クローンの確立

1 gの pNOW— hColIIIalを用いて 25cm²の培養フラスコ中の 150万個の CHO 細胞 DG44株にリポフエクチン法を用いて遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。 48時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後 30万個の細胞を lOOmLの 0. 8mgZmLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地にて希釈後、 96ウェルマイクロタイタ一プレート 10枚（960ゥエル）中に播き、 5%炭酸ガス存在下で 37°C、約 3週間培養したところ、 117ゥエルにのみ細胞の生存が見られた (G418耐性株)。生存細胞を ImLの 0. 8mg/mLの G418を含む 10%透析ゥシ胎児血清添加 Iscove' s Modified Dalbecco' s Medium培地とともに 24ゥエルプレートに移しコンフルェントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後 PBS (インビトロジェン社） ImLを各ゥエルに加え再び培養上清を廃棄した。これに 0. 5mLの CHO細胞用無血清培地 CHO— S— SFM Π (インビトロジェン社)を加えて 5%炭酸ガス存在下で 37°C、 72時間培養した。続いて培養上清中のヒト III型コラーゲンの生産量の検討を行なった。

[0049] 〔実施例 20〕 pNOW—hColIIIal形質導入細胞クローンによるヒト III型コラーゲンの生産量の検定

生産量の検定はドットプロット法にて実施した。ナイロンメンブレン上に 72時間培養上清 1 μ Lと市販のヒト III型コラーゲン（ベタトン'ディッキンソン社）の CHO細胞用無血清培地 CHO— S— SFM IIによる 2倍希釈系列（0. 125〜8 gZmL)と CHO— S - SFM IIそれぞれ 1 μ Lをドットし、 1時間の風乾、ブロックエースによるブロッキングの後 1 μ gZmLの濃度の抗ヒト III型コラーゲン抗体 (コスモノィォ社)とそれに引き続ヽて HRP標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体はスーパーシグナルウェストピコ試薬にて HRPの活性を検出する方法でルミノキヤプチヤーを用いて行なつた o

[0050] 〔実施例 21〕 G418耐性細胞株の遺伝子増幅

G418耐性細胞株のうち、ヒト III型コラーゲン産生が最も高力つたクローンを継代培養し安定ィ匕させた後に、 MTXによる遺伝子増幅を行った。始めに 15nMの MTXを含む培地で 2週間、 60nMの MTXを含む培地で 2週間、 250nMの MTXを含む培地で 2週間、 1 μ Μの MTXを含む培地でさらに 4週間増幅させたところ、ヒト III型コラ一ゲンの産生レベルは培地当たり 225 μ g/mL (3日間）に上昇した。

[0051] 〔実施例 22〕培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析

遺伝子増幅により得られたヒト III型コラーゲンを大量に生産している細胞クローンを細胞培養液 IS CHO - CD (アイエスジャパン社）を用いて 25cm²培養フラスコ中で 1 X 10⁶個/ mLになるように調製した。これを 5%炭酸ガス存在下に 37°Cで 96時間培養した後、培養液を回収し、遠心分離操作により細胞を除き培養上清とした。培養上清の 6 μ Lと等量のトリス SDS β—MEサンプル処理液 (第一化学社)を混合し、 9 5°C、 5分間の熱処理を行なった。これを SDS—ポリアクリルアミドゲル（PAGEL、 A TTO社）に重層し、電気泳動にて展開した。以下の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動は同様にして実施した。電気泳動終了後ポリアクリルアミドゲルをクマシ一プリリアントブルー染色液 (アマシャムバイオサイエンス社)で処理する事によりポリアタリルアミドゲル中のヒト III型コラーゲンの検出を行なった。比較対照としては、 100 ZmLの濃度のヒト III型コラーゲン (ベタトン'ディッキンソン社)を同様に処理して用いた。図 12にヒト III型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析結果を示す。培養上清中に組換えヒ ΗΠ型コラ一ゲンと考えられる 140kDa、 170kDaの位置のポリペプチドが検出された。

[0052] 〔実施例 23〕培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンのウェスタンブロッテイングによる分析

SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動終了後のポリアクリルアミドゲルをトランスファー緩衝液に浸した後、常法に従ってポリアクリルアミドゲル中のヒト III型コラーゲンを PVDFメンブレンに転写した。ブロックエースによるブロッキングの後 1 μ g/mLの濃度の抗ヒト III型コラーゲン鎖抗体 (コスモバイオ社)とそれに弓 Iき続、てホースラッディシュペルォキシダーゼ (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体を反応させた。反応した抗体は HRPの活性を検出する方法で TMBペルォキシダーゼ試薬 (フナコシ社)を用いて行なった。比較対照としては、 100 gZmLのヒト III型コラーゲン（ベタトン'ディツキンソン社)を用いた。培養上清中に抗ヒト III型コラーゲン鎖抗体が結合できる組換えヒト III型コラーゲンと考えられる 140kDa、 170kDaの位置のポリペプチドが検出された (図 13)。

ペプシン処理を施した場合、培養上清中の組換えヒト III型コラーゲンは市販のヒト III 型ァテロコラーゲン（ベタトン.ディッキンソン社）と同様に 130kDaの位置のポリぺプチドとして検出された。このことはヒト III型コラーゲン生産細胞クローンより得られた培養上清中には天然型と実質的に同等のペプシン耐性の性質を持つ組換えヒト III型コラーゲンが含まれて、ることを示して、た。

[0053] 〔実施例 24〕培養上清中のヒト I型および III型コラーゲンの精製

ヒト I型または III型コラーゲンを含む培養上清 lOOmLを用いて実施例 12と同様に操作して精製を行った。元の培養上清 lOOmLにっき最終的に得られた精製コラーゲン溶液が約 300 Lになるように濃縮したものを SDS— PAGEにより電気泳動して精製度の確認を行った (図 14)。産業上の利用可能性

[0054] 本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準かつ天然型により近い組換えヒト · コラーゲンの生産を可能にする発現ベクターおよびヒト 'コラーゲン生産細胞を提供することができる。また、ヘテロトリマーのヒト 'コラーゲン生産細胞を提供することもできる。

[0055] 本発明の製造方法は、コラーゲンのみならず、 3重螺旋構造を持つコレクチン等のタンパク質にも適用することが可能である。

さらに、本発明のコラーゲンの製造方法において、種類の異なる α鎖を同時に発現させることで、天然では本来製造されることのな、（これまでに発見されて、な、）新規な分子構成の 3重螺旋構造を持つコラーゲンを大量に製造できる可能性がある。これらの新規な分子構成の 3重螺旋構造を持つコラーゲンは、既知のコラーゲンとは異なった性質を持っていることが考えられ、新規の材料としての応用が期待される

Claims

請求の範囲

[I] 以下の（a)から (c)の工程を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法。

[2] 3重螺旋構造を有するタンパク質が、ヒト 'コラーゲンまたはその部分ペプチドである請求項 1に記載の方法。

[3] ヒト 'コラーゲンが少なくとも 1種類以上の α鎖力もなるヒト 'コラーゲンである、請求項 2 に記載の方法。

[4] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · Ι型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。

[5] ヒト · Ι型コラーゲンが oc 1鎖と oc 2鎖の複合体である請求項 4に記載の方法。

[6] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · II型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。

[7] ヒト 'コラーゲンが、ヒト · III型コラーゲンである請求項 2に記載の方法。

[8] 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが、以下の（a)または (b)に記載の DNAカゝら選択される少なくとも 1つの DNAである、請求項 1に記載の方法。

[9] 哺乳動物細胞がチャイニーズノ、ムスター卵巣 (CHO)細胞である、請求項 1〜8のいずれかに記載の方法。

[10] 哺乳動物細胞がヒト胎児腎蔵細胞 (HEK293)である、請求項 1〜8のいずれかに記載の方法。

[I I] 3重螺旋構造を有するタンパク質をコードする DNAが導入されるベクターが、 pNO WZCMV— AAである、請求項 1〜10のいずれかに記載の方法。

[12] 請求項 1〜1 1のいずれかに記載の方法に従って製造されたヒト 'コラーゲン。

[13] 以下の（a)または (b)に記載の DNA力も選択される少なくとも 1つの DNAが導入されたベクター。 (a)配列番号： 1、 4、 7、または 10のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA

[14] 請求項 13に記載のベクターを保持する哺乳動物細胞。

[15] 請求項 13に記載のベクター、または請求項 14に記載の哺乳動物細胞を含む、 3重螺旋構造を有するタンパク質を製造するためのキット。