WO2006062070A1 - 染毛剤組成物 - Google Patents

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WO2006062070A1
WO2006062070A1 PCT/JP2005/022322 JP2005022322W WO2006062070A1 WO 2006062070 A1 WO2006062070 A1 WO 2006062070A1 JP 2005022322 W JP2005022322 W JP 2005022322W WO 2006062070 A1 WO2006062070 A1 WO 2006062070A1
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WO
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hair dye
dihydroxyindole
melanin precursor
melanin
acid
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PCT/JP2005/022322
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kenzo Koike
Yoshinori Saito
Hiroshi Obata
Yukihiro Nakamura
Yoji Hata
Original Assignee
Kao Corporation
Gekkeikan Sake Co., Ltd.
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Publication date
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Priority to US11/721,017 priority patent/US7776105B2/en
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q5/00—Preparations for care of the hair
    • A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair

Definitions

  • the present invention contains a melanin precursor that is efficiently produced using an enzyme, and is excellent in dyeability, stability, and safety, and in particular, a one-component air oxidation hair dye. Concerning the composition.
  • Melanin precursors such as 5,6-dihydroxyindoline are known to be converted into melanin by oxygen in the air, and are used in air oxidation hair dyes using this. .
  • Patent Document 2 discloses MelB as a novel tyrosinase gene derived from Aspergillus oryzae.
  • Patent Document 1 JP 2002-291496 A
  • Patent Document 2 JP 2002-191366 A
  • the present invention is based on the genus Aspergillus, Neurospora, Rhizomucor, Trie hoderma and Penicillium, starting from tyrosine or a derivative thereof.
  • an enzyme or cell exhibiting catecholoxidase activity derived from a filamentous fungus selected from the group An air-oxidized hair dye composition containing a melanin precursor produced by a method including an oxidation step (A) for conversion is provided.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in L-DOPA concentration and melanin precursor concentration in the reaction solution of L-DOPA acid-oxidation reaction by tyrosinase-producing cells in Production Example 1.
  • the present invention efficiently produces a melanin precursor from tyrosine or a derivative thereof by an enzymatic reaction, and uses this as a dye, thereby improving the air-oxidation type dyeing with improved dyeability and ease of production. It relates to hair.
  • the present inventors have found that an air oxidation type hair dye containing a melanin precursor produced by an enzyme or a microbial cell containing an enzyme using a specific method exhibits excellent performance.
  • the melanin precursor used in the present invention is a dye that is produced by tyrosine or a derivative thereof and can be used for an air oxidation hair dye, that is, oxidatively polymerizes melanin by oxygen in air.
  • Specific examples include indoline derivatives such as 5,6-dihydroxyindoline, 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid, 5,6-dihydroxyindole, 5,6-dihydroxyindole- Indole derivatives such as 2-carboxylic acid can be shown.
  • DOPA is not included in the melanin precursor referred to in the present invention because DOPA has a low acid-acid polymerization rate and is not practical as a hair dye.
  • the melanin precursor in the present invention is not necessarily limited to a monomer, but includes a dimer or more oligomer that satisfies the requirements of the above-mentioned air oxidation type dye.
  • the melanin precursor used in the present invention is produced by the following method. [0011] —Acid process (A) —
  • tyrosine or a derivative thereof is used as the starting material (substrate compound).
  • specific examples include (1) D-form or L-form tyrosine, (2) D-form or L-form tyrosine [DOPA; 3- (3,4-dihydroxyphenyl) alanine], (3) dopamine (Dopamine; 3,4-dihydroxyphenethylamine), (4) tyrosine lower (C1-4) alkyl ester, (5) DOPA lower (C1-4) alkyl ester, (6) N-alkoxy ( Examples: Acetoxy) or N-alkyl (eg, ethyl) conjugated DOP A or tyrosine, and the like may be mentioned.
  • L-DOPA is more preferable in view of the affinity for enzymes that L-tyrosine and L-DOPA are preferred in that a natural melan precursor is obtained.
  • tyrosine or derivatives thereof can be used either alone or in combination of two or more.
  • Catecholoxidase activity refers to the activity of catalyzing the production of 0-quinone by the acid of catechol.
  • Enzymes having catecholoxidase activity include enzymes called catechol oxidase, monophenol oxidase, diphenol oxidase, 0-diphenolase, tyrosinase, etc. . These usually have monophenoloxidase activity.
  • laccase and peroxidase which have monophenoloxidase activity and polyphenoloxidase activity are also included in the enzyme having catecholoxidase activity.
  • tyrosinase it is preferable to use tyrosinase from the viewpoint that the natural melanin precursor can be efficiently produced because of its high affinity for L-DOPA.
  • tyrosine is used as the substrate compound, tyrosinase is preferably used.
  • Catecholoxidase may be an enzyme derived from any organism, but tyrosinase derived from filamentous fungi is preferable because of its high expression efficiency and stability in host cells.
  • an enzyme having a high reaction yield is preferable in order not to leave a starting material in the step of oxidizing the tyrosine derivative to the melanin precursor.
  • filamentous fungi include Aspergillus, Neurospora, Rhizomucor, and Trichodolema. erma) and the genus Penicillium.
  • the melB gene of Aspergillus oryzae is preferred.
  • JP 2002-191366 melD gene
  • JP 2004-201545 melD gene
  • i ⁇ melO gene Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in An enzyme that is substantially identical to the tyrosinase encoded by yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14; 1261 (1): 151-154) can be mentioned.
  • substantially identical to the above gene (melB gene, melD gene or melO gene) means that any one or more of these genes and amino acid sequences of 70% or more More preferably, it has a homology of 80% or more, most preferably 90% or more, and also has tyrosinase activity or monophenoloxidase activity.
  • Such an enzyme can efficiently perform an oxidation reaction with a high reaction yield from dopa to dopachrome, and can lower the final dopa concentration in the acidification step.
  • the enzyme can be used as it is added to the reaction solution.
  • an immobilized enzyme from the viewpoint of improving the stability of the enzyme, ease of separation after use, and avoiding protein contamination in the reaction system.
  • the enzyme immobilization method is not particularly limited, and examples thereof include known immobilization methods such as a method of cross-linking enzyme molecules with an immobilization carrier and a method of encapsulating in a gel such as alginate gel.
  • the enzyme may be a crude sample containing biological contaminants or a purified enzyme, but it is desirable that the enzyme be purified when immobilized.
  • cells showing catecholoxidase activity cells corresponding to one or more of the following ( a ) to () are used.
  • (C) A cell exhibiting high catecholoxidase activity by having a mutated gene encoding a polypeptide having catecholoxidase activity.
  • a catecholoxidase gene cloned into a vector usually used for mass expression of proteins is introduced into a host cell and incorporated into a host chromosome or this.
  • Catecholoxidase can be produced in large quantities by culturing host cells having a plasmid in a plasmid state.
  • this gene may be expressed under a promoter that is more active than the promoter that originally expresses the gene.
  • a diploid or higher cell having the possibility of holding multiple copies of the catecholoxidase gene may be used.
  • cells in which catecholoxidase activity is increased by mutation of the catecholoxidase gene or cells into which such a mutant catecholoxidase gene is introduced can also be used.
  • a cell having a high catecholoxidase activity can be obtained by using a mutant enzyme having a higher activity than that of a natural enzyme.
  • a cell in which this gene is expressed under a promoter having a higher activity than a promoter originally expressing the gene encoding the polypeptide having the catecholoxidase activity of (a) is preferred.
  • the type of cells that produce catecholoxidase is not particularly limited, but it can be cultured in large quantities. It is preferable that it is a microorganism at the point which is easy to culture. Examples of microorganisms that are easy to use include colonic bacteria, yeasts, and filamentous fungi. Among them, yeast is used because it is safe, has a high production efficiency of catecholoxidase, is a single cell, and has a high cell sedimentation rate, so that it can be separated by centrifugation at a relatively low speed after the reaction. Is preferred. Among them, Saccharomyces cerevisiae is preferred because the robustness of the cells prevents the protein derived from the cells from flowing into the reaction solution and facilitates genetic manipulation. ⁇ .
  • the cells are fixed by a known method such as a carrier binding method, a packaging method, a crosslinking method, a photocrosslinking method, or the like. It can also be used.
  • catecholoxidase such as tyrosinase
  • the expression level of catecholoxidase is small, and thus the activity of catecholoxidase is improved by transformation, etc.
  • the cells may not have sufficient catecholoxidase activity. Therefore, in the case of using either an enzyme or a cell exhibiting strong techoloxidase activity, by treating the enzyme or cell with divalent copper ion in advance, divalent copper ion is formed at the center of the catalytic activity of catecholoxidase. Coordination is preferred.
  • the enzyme or transformant is suspended in a copper sulfate solution of about 0.1 to 2 mM and allowed to stand for about 0.5 to 2 hours at about 30 to 40 ° C., which is sufficient for intracellular catecholoxidase. It is preferable to coordinate a divalent copper ion.
  • catecholoxidase selectively binds a specific peptide bond such as trypsin. It can also be activated by treatment with a protease such as an endopeptidase that cleaves. By treating with protease, the N-terminal and Z- or C-terminal sequences of the enzyme are removed, and the enzyme activity is improved.
  • cells having sex it is preferable to use cells having sex.
  • cells other than yeast use cells that have the same force tecoleoxidase activity.
  • the upper limit of cellular catecholoxidase activity is not particularly limited, but is usually about 5 U / OD.
  • the catecholoxidase activity of an enzyme or a cell is measured at 475 nm when an enzyme or a cell and lmL of a solution containing 0.8 ⁇ mol of DOPA are reacted at 30 ° C for 5 minutes.
  • the activity that increases the absorbance by 1 is defined as 1 U, and the catecholoxidase activity of the cell is divided by the density of the cells used in the reaction (absorbance at 600 nm; OD) (U
  • the melanin precursor produced by the substrate compound strength is further polymerized, and the rate at which melane is produced. Melanin precursors are rapidly generated from the substrate compound, and melanin precursors accumulate efficiently in the reaction system.
  • the concentration of the starting material (substrate compound) at the start of the reaction is usually about 10 to 60 mM, more preferably about 15 to 25 mM. If it is the said range, while a sufficient amount of melanin precursor can be obtained, the yield reduction of a melanin precursor and the unreacted substrate remain
  • DOPA, Dopamine or the like it is not preferable from the viewpoint of safety as a raw material for a hair dye. Therefore, the starting material It is preferable to consume in the present acidification step so that DOPA or Dopamine, which is a quality or intermediate, is substantially not included in the hair dye!
  • a more preferred embodiment is an oxidation step in which L-DOPA is used as a starting material and the concentration thereof is 15 mM or more at the start of the reaction and O.lmM or less at the end of the reaction.
  • the yield of acid soot products such as dopachrome in the reaction process of DOPA power by an enzyme is preferably in the range of about 30 to 70% because it is economical.
  • the pH of the reaction solution should be within the range where the enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate! However, from the viewpoint of efficiently accumulating melanin precursor in the reaction solution by suppressing the production of melanin, Usually, it is preferably maintained at about 4 to 9, more preferably about 5 to 7.
  • the pH of the reaction solution can be maintained within the above range by using a buffer solution as the reaction solution. If the salt concentration is high, the production of melanin by polymerization of the melanin precursor may be promoted. It is preferable to adjust by adding a small amount of a strong alkali such as potassium hydroxide or sodium hydroxide or a strong acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid.
  • the amount of cells in the reaction solution should be small if it is within the range of the above-mentioned catecholoxidase activity from the viewpoint of facilitating cell separation after the reaction and improving the yield of the melanin precursor.
  • a moderate cell input amount is preferably 20% by volume or less, more preferably 10% by volume or less, based on the reaction solution.
  • the reaction temperature should be within the range where the enzyme can catalyze the oxidation reaction of the substrate !, but from the viewpoint of sufficient progress of the oxidation reaction, prevention of enzyme deactivation, and suppression of melanization, it is 5-40. It is preferable to maintain at a temperature of 15 ° C., further 15 to 35 ° C., more preferably 20 to 30 ° C.
  • the reaction solution Immediately after the start of the reaction, since a large amount of oxygen is required for the acid-acid reaction, it is preferable to ventilate a large amount by stirring the reaction solution. However, if the stirring speed is too high, cell damage or the like is caused. Therefore, it is preferable to monitor the oxygen concentration in the reaction solution and reduce the aeration amount and stirring speed if the oxygen concentration does not decrease.
  • the oxygen concentration in the reaction solution is preferably maintained at about 0.1 to 8 ppm, more preferably about 1 to 2 ppm. If a large amount of foam is generated in the reaction solution by aeration or stirring, an antifoaming agent such as silicone resin may be added.
  • the reaction may be either a batch type or a continuous type! /, But a batch type is preferable in that an unreacted substrate and a product can be separated.
  • the reaction time in the case of batch type is the polymerization of melanin precursor Usually, the substrate compound is sufficiently converted to a melanin precursor while minimizing the reaction.
  • the reaction solution can be continuously collected while supplying the substrate to the reaction vessel containing cells so that the substrate concentration is about 10 to 60 mM, and further about 15 to 25 mM.
  • a certain V ⁇ is a column packed with a carrier on which an enzyme or cells are immobilized, about 1 to 1 OmM, more preferably about 3 to 6 mM, and hydrogen donor as an electron donor. Can be added.
  • the substrate compound is oxidized by the above enzyme reaction to produce dopachrome.
  • a reducing agent such as ascorbic acid or nitrous acid
  • 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid is obtained as a melanin precursor.
  • 5,6-dihydroxyindole is produced by spontaneous decarboxylation of dopachrome, or by dopachrome totemerase contained in the cells, or by non-enzymatic isomeric reactions. Produces 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid from dopachrome.
  • the reaction yield of these melanin precursors is preferably 20 to 70%, more preferably 40 to 70%.
  • the substrate compound When dopamine, for example, is used as the substrate compound, a quinone form of donomin is formed by the acid of the substrate compound.
  • a quinone form of donomin is formed by the acid of the substrate compound.
  • the reaction is stopped and reduced using a reducing agent such as nitrous acid, 5,6-dihydroxyindoline is obtained. If this reaction solution is further retained, dihydroxyindole is produced.
  • the melanin precursor may contain a water-soluble oligomer obtained by polymerizing about 2 to 5 molecules thereof.
  • a melanin precursor that generates melanin other than black can be prepared.
  • the produced melanin precursor also has a polymerized melanin, which can be used for toning hair dyes.
  • Acidifying step (A) as a method for producing a melanin precursor used in the hair dye of the present invention is It is a reaction by the indicated enzyme or fungus body.
  • the post-treatment step (B) for use in the hair dye is described below.
  • the enzyme or cells used in addition to the melanin precursor, the enzyme or cells used, and also the protein produced by the damage of the cells by aeration and agitation were used.
  • Quality or cellular power This includes effluxed proteins and melanin polymerized from melanin precursors. Therefore, in order to use as dyes for hair dyes, it is necessary to remove them from the reaction solution. Enzymes or cells can be removed by means of ultrafiltration, filtration, centrifugation, etc., and the recovered enzymes or cells can be reused by returning them to the container for the acidification process. Can do. Proteins and melanin can be removed by means such as ultrafiltration and gel filtration chromatography.
  • the melanin precursor obtained in the oxidation step (A) is in a state before it becomes a polymer having a molecular weight of 3000 or more (melanin), that is, in the state of various monomer power oligomers having an indole or indoline skeleton (molecular weight 3000). And mainly contains dopachrome or 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid.
  • this lanthanum precursor may be blended as a dye for an air oxidation hair dye to prepare a composition.
  • the melanin precursor obtained in the acidifying step of the present invention is acid-polymerized and blended into hair cosmetics (leave-on type or wash-out type) as melanin having a molecular weight of 3000 or more. It is also possible to do. Examples include shampoos, rinses, conditioners, styling agents, setting agents, permanent agents, waxes, glazing agents, hair restorers and the like.
  • the step of increasing the concentration of any of 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid in the melanin precursor solution shown below according to the purpose (step 0)] After passing, it is preferable to mix with a hair dye.
  • This step may be performed before or after the above-described collection step (removal of enzymes, cells, proteins, melanin, etc. from the reaction solution), or may be performed later, or both of the following steps (
  • the recovery step may be performed in the environment of I), and the time of the recovery step may be included in the processing time of step (I).
  • Dyeing through the process of increasing the concentration of 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid It is preferable to mix with hair.
  • 5,6-dihydroxyindole is the main component and a small amount of 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is contained, a more natural color tone is obtained when the hair dye is used. Can be dyed.
  • Means for increasing the concentration of any of the above compounds in step (I) include (i) pH adjustment treatment, addition of GO water-soluble organic solvent, (iii) addition of inorganic salt, (iv) treatment with buffer solution (V) Addition of an antioxidant and the like. These may be used in combination of two or more types.For example, the above process can be completed more efficiently by combining any one or more of the above (at the time of OpH adjustment (ii) to (v)). .
  • pH 5 to ll, further pH 5 to 10, and further pH 6 to 9 are preferably converted to indole derivatives.
  • precipitation occurs with strong acidity, and acid-acid polymerization is accelerated and melanin is generated with strong alkalinity.
  • the treatment is preferably carried out under anaerobic conditions, but the presence of oxygen is not necessarily denied if a sufficient yield can be obtained in step (I).
  • the composition of the melanin precursor can be adjusted to increase the ratio of the desired compound by adjusting the pH to the neutral to weakly acidic side or the alkaline side.
  • the conversion of dopachrome or 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole occurs immediately at a pH of 5 or more and less than 8, and is immediately from 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,5.
  • Conversion to 6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is likely to occur at pH 8 and below 11. That is, 5,6-dihydroxyindole is produced in the neutral to acidic region, and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is efficiently produced in the alkaline region.
  • the temperature during pH adjustment is preferably 5 to 40 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the treatment time may be maintained by using the time required for the 5,6-dihydroxyindoline derivative to change.
  • the conversion product (5,6-dihydroxyindole derivative) is relatively stable if it is 30 minutes or longer. Therefore, after step (I), if it is in an oxygen-blocked state, You can leave it for more than a week.
  • water-soluble organic solvent an organic solvent having compatibility of 10% by weight or more in water (dissolving in 10g or more in 90g of water) can be used.
  • organic solvents such as methanol, ethanol and benzyl alcohol, polyethylene Polyhydric alcohols such as glycol and glycerin, ketones such as acetone, organic acids such as lactic acid and quenoic acid, fatty acids such as acetic acid and propionic acid, alkanolamines such as alkylamines and monoethanolamine, etc.
  • ethanol and acetone are more preferable from the viewpoint of safety.
  • Promoting the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole, especially by addition of alcohols, polyhydric alcohols, ketones, organic acids or fatty acids can do.
  • alcohols polyhydric alcohols, ketones, organic acids or fatty acids
  • the addition of 50% by weight of ethanol accelerates the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole by about a factor of two.
  • the addition of the above alkylamines or alkanolamines can promote the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid. it can.
  • the selectivity from 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is more than 70% selective. It becomes possible to convert.
  • the aqueous organic solvent is preferably added to the reaction solution so as to have a concentration of about 5 to 70% by weight, more preferably about 30 to 60% by weight in the total amount. Even if the amount of the solvent added is large, there is an effect that the conversion rate is fast and the produced melanin can be removed. However, if it is within the above range, the 5,6-dihydroxy is sufficiently practical. The ratio of indole derivatives can be improved and post-treatment can be performed safely.
  • an alkali metal salt, alkali earth metal salt or copper (II) salt of an acid selected from hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid and carbonic acid can be used.
  • copper (II) salts can promote the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, and other than copper (II) salts
  • the inorganic salt of can promote the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole.
  • the inorganic salt concentration in the reaction solution is preferably 40% by weight or less, more preferably 0.1 to 20% by weight, and further preferably 1 to 5% by weight from the viewpoint of conversion efficiency and prevention of precipitation of salt and melanin.
  • copper sulfate is added to the reaction solution so as to be about 0.1 to 20 mM, preferably about 5 to 10 mM, and maintained for about 10 to 30 minutes, for example.
  • the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid in the melanin precursor to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is promoted.
  • Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution.
  • Examples of the phosphate buffer include sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, sodium citrate monophosphate buffer, and tris monophosphate buffer. Treatment with a phosphate buffer can promote the conversion of 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid.
  • Ascorbic acid sodium ascorbate, sodium sulfite, etc. can be used as an acid-proofing agent.
  • sodium ascorbate sodium ascorbate
  • sodium sulfite sodium sulfite
  • Ascorbic acid sodium ascorbate, sodium sulfite, etc.
  • sodium ascorbate sodium sulfite, etc.
  • sodium ascorbate sodium ascorbate
  • sodium sulfite sodium sulfite
  • Ascorbic acid sodium ascorbate, sodium sulfite, etc.
  • Ascorbic acid sodium ascorbate, sodium sulfite, etc.
  • the liquid containing the melanin precursor is preferably concentrated by removing water by a known method such as reverse osmosis concentration, spray drying, or freeze concentration. Furthermore, the single product or mixture of melanin precursors can be preserved in any form such as a concentrated state or a dry powder state.
  • Indoline derivatives such as 5,6-dihydroxyindoline and 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid are in a powdered salt state (preferably Hydrochloride, bromate, etc.), preferably stored in the absence of oxygen.
  • Indole derivatives such as 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid can be stored in solution or powder in the absence of substantial oxygen.
  • indoline derivatives such as 5,6-dihydroxyindoline and 5,6-dihydroxyindrin-2-carboxylic acid are non-oxygenated and blocked from water until use. It is preferable to store it in a dry state (including powder and suspended in oil). Immediately before use, it is mixed with a common hair dye base such as water or an alkaline agent, and immediately applied to the hair. It is preferable to use it as an agent. In this case, although it is an air-acid hair dye, it is preferable to use a two-part or three-part type that involves operations such as mixing, because the stability of the melanin precursor is also preferred.
  • indole derivatives such as 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid are stable in an aqueous solution in a non-oxygen state. It is preferable in that it can be used as a mold hair dye and is easy to use. From the standpoint of production, stability and hair dyeing performance, the specific force of 5,6-dihydroxyindole in the melanin precursor preferred by 5,6-dihydroxyindole is more than 60% in the area ratio of absorbance at 280 nm. It is preferable.
  • 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid can be used as a hair dye composition for temporary dyeing because melanin obtained by polymerization has high water solubility.
  • a simple one-component air-oxidized hair dye that can be taken out of the container and left on the hair for a while is possible. It is possible to dye the gray hair to the natural color of melanin. It is preferable among 5,6-dihydroxyindole cameranin precursors to be a one-component hair dye, but if the hair dyeing performance is exhibited, other melanin precursors are contained up to about half. You can do it.
  • the content of the melanin precursor in the hair dye composition of the present invention is 0.01 to 10% by weight, and further 0.05 to 5% by weight from the viewpoint of hair dyeing performance. / 0 , more preferably 0.1 to 1% by weight.
  • This content can be appropriately changed depending on the purpose of use of the hair dye, and when the hair is dyed deeply (black) to the target level with a single hair dye, about 0.5 to 1% by weight is preferred. In the case of a hair dye that gradually and repeatedly dyes hair so that gray hair does not stand out, 0.1 to 0.4% by weight is preferred.
  • the blending amount is 0.01% by weight or more, hair dyeing is possible although it is very small, so it is suitable for hair dyes or color rinse dyes that are handled by hand, and hair cosmetics. Can be used.
  • the pH of the hair dye composition of the present invention is preferably adjusted to 6 to 11, and more preferably 7 to 10.5.
  • alkaline agents such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, guanidine, alkylamine, basic amino acid, carbonate and the like are used.
  • alkylamines include monoethanolamine.
  • Specific examples of basic amino acids include algin, lysine, histidine, and the like.
  • Specific examples of carbonates include sodium carbonate, potassium carbonate, and guanidine carbonate. -Gin and sodium bicarbonate.
  • inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, citrate, and lactic acid can be appropriately used. Two or more kinds of pH adjusters may be used in combination, and the content is preferably 0.01 to 20% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight of the total composition! /.
  • a water-compatible organic solvent can be contained.
  • Water compatibility Organic solvents include lower alcohols such as ethanol and propanol; glycols such as ethylene glycol and propylene glycol; ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethanolinoate, ethylene glycol monobutenoateenole And carbitols such as diethylene glycol monomethino enoate ether and diethylene glycol monobutyl ether; benzyloxyethanol, benzyl alcohol and the like.
  • the above lower alcohols and glycols Is preferred.
  • Two or more water-compatible organic solvents can be used in combination.
  • benzyloxyethanol or benzyl alcohol when used, it is preferably used in combination with other solvents, particularly lower alcohols or glycols.
  • the content of the water-compatible organic solvent is preferably 5 to 50% by weight, more preferably 10 to 40% by weight, and further preferably 15 to 30% by weight of the total composition from the viewpoint of dyeability.
  • an amino acid particularly cysteine
  • an existing acid dye or a direct dye (acidic dye, basic dye, dissociative dye) may be added as a toning component.
  • the content thereof is preferably 0.001 to 5% by weight, more preferably 0.01 to 2% by weight, and even more preferably 0.05 to 1% by weight, depending on the purpose.
  • the hair dye composition of the present invention can take the form of cream, gel, lotion, foam or the like by adjusting the viscosity by adding a thickener.
  • thickeners examples include hydroxyethyl senorelose, hydroxyethinoresenorelose and glycidinoretrimethenoreammonum chloride etherenole, methinoresenorelose, canoleboxymethylenoresenorelose and other cenorelose derivatives; xanthan gum, Examples thereof include natural gums such as guar gum; synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone, cross-linked polyattaric acid or salts thereof, polyacrylic acid or salts thereof, and polyacrylamide.
  • the type and amount to be blended can be determined according to the target viscosity, and the viscosity is preferably 100 to 50,000 mPa's.
  • the hair dye composition of the present invention does not thicken, a light feeling of use is obtained.
  • a thickener to increase the viscosity, the dyeing power is not impaired, and there is a risk of dripping. It can be used without.
  • the hair dye composition of the present invention may contain a nonionic surfactant as a foaming agent and Z or a homogenizing agent.
  • the nonionic surfactant include polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene vinyl ether and polyoxyethylene stearyl ether; polyoxyethylene alkyl phenyl ethers such as polyoxyethylene nonyl phenyl ether and polyoxyethylene phenyl phenyl ether; Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, fatty acid alkylolamide, polyoxyethylene-sec-tetradecyl ether and the like can be mentioned.
  • the content of the nonionic surfactant is preferably 0.01 to 30% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight.
  • Antioxidants include ascorbic acid such as ascorbic acid, sodium ascorbate and ascorbic acid esters, inorganic salts such as sodium sulfite, cysteine derivatives such as cysteine and N-acetyl cysteine, and antiacids such as rosemary extract and tea extract.
  • examples include vitamins such as plant extracts, tocopherol, and tocopherol acetate, and scavengers such as BHT.
  • ascorbic acid is preferred. Considering the use pH, sodium ascorbate is preferred.
  • a chelating agent such as EDTA or a salt thereof, 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid or a salt thereof can be used as a component for improving stability.
  • the hair dye composition of the present invention includes components used for ordinary hair dyes, For example, surfactants, stabilizers, buffers, fragrances, feel improvers, chelating agents, solubilizers, preservatives and the like other than those described above can be appropriately blended depending on the purpose.
  • surfactants for example, surfactants, stabilizers, buffers, fragrances, feel improvers, chelating agents, solubilizers, preservatives and the like other than those described above can be appropriately blended depending on the purpose.
  • a preferred form of the hair dye composition of the present invention is a slow dyeing hair dye that is used repeatedly.
  • An aerosol form is preferred.
  • a pressure-resistant container such as an aerosol can
  • a propellant such as compressed gas, liquid gas, etc. generally used for aerosol products can be used.
  • compressed gas nitrogen gas, carbon dioxide gas, argon gas, etc. are used, and as liquid gas, liquid gas is used. Examples include petroleum gas, lower saturated hydrocarbons, and dimethyl ether.
  • Two or more of these propellants can be used in combination, and in order to obtain an appropriate injection speed, it is preferable to contain 1 to 20% by weight, more preferably 3 to 15% by weight, in the total composition. Further, it is preferable to adjust the internal pressure of the aerosol can after filling to be 3 to 5 kg / cm 2 G (25 ° C.).
  • the melanin precursor obtained in the acidifying step of the present invention is acid-polymerized and blended into hair cosmetics (leave-on type or wash-out type) as melanin having a molecular weight of 3000 or more.
  • hair cosmetics include shampoos, rinses, conditioners, styling agents, set agents, permanent agents, waxes, tanning agents, hair restorers and the like.
  • the dosage form include aerosol, foam, cream, liquid, and paste.
  • the melB tyrosinase gene of Aspergillus oryzae was cloned. Aspergillus oryzae OSI-1013 strain (FERM P-16528) was inoculated into steamed rice, and 1.5 g of the koji koji was weighed and completely crushed in liquid nitrogen. 240 ⁇ g of total RNA was extracted using ISOGEN manufactured by Nippon Gene. 1 ⁇ g of mRNA was purified from 120 ⁇ g of total RNA using Oligotex-dT30 ⁇ Super> manufactured by Takara Bio Inc. A cDNA library was prepared from this mRNA using the SMA RT cDNA Library Construction Kit manufactured by Clontech, and only melB cDNA was amplified by PCR. The obtained PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis to amplify only the target band of about 1.8 Kbp. In addition, as a result of base sequence analysis, it was confirmed that the intron sequence was successfully removed!
  • the cDNA obtained in the above 1 was transferred to an expression vector pET23b for Escherichia coli manufactured by Invitrogen, an expression vector for yeast Saccharomyces cerevisiae (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-265177), and an expression vector for Aspergill us oryzae (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-224381).
  • pET23b for Escherichia coli manufactured by Invitrogen an expression vector for yeast Saccharomyces cerevisiae
  • Aspergill us oryzae Japanese Patent Laid-Open No. 2001-224381
  • an example of expression in yeast shows that the melB cDNA amplified by PCR is inserted into the Smal region immediately below the promoter of the expression vector having the SED1 promoter motor and ADH1 terminator. did.
  • a fragment containing melB cDNA obtained by cutting at the Stu I site present inside the URA3 marker was purified as an introduction cassette.
  • the yeast as a host was a uracil-requiring strain derived from the Practical Yeast Association 9 used for sake brewing.
  • the tyrosinase activity of the bacterial cells was measured as follows. Suspend part of the cells in water, and add 0.1 mL of 10 mM L-DOPA (dissolved in 0.005N hydrochloric acid) at 30 ° C and 0.1 mL of 1M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to O.lmL. After adding the mixture and reacting at 30 ° C for 5 minutes, the cells were removed by centrifugation at 15,000 rpm for 30 seconds, and the absorbance at 475, the maximum absorption wavelength of DOPA, was measured. The amount of cells was adjusted so that the reaction force after the reaction was within the absorbance power of 10.3 at 475 nm.
  • the recombinant yeast obtained in 2 above was cultured by a conventional method, the cells were collected by centrifugation, and then washed with distilled water. The cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 2 mM copper sulfate, about 10 times the weight of the cells, and allowed to stand at 4 ° C. The cells were collected by centrifugation and washed with 0.1 M EDTA solution to remove excess copper ions. The washed cells were suspended in 0.2 M acetate buffer (pH 3.0) and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After activation The cells were collected by centrifugation and used as activated cells.
  • Tris-HCl buffer pH 8.0
  • the cells were collected by centrifugation and washed with 0.1 M EDTA solution to remove excess copper ions.
  • the washed cells were suspended in 0.2 M acetate buffer (pH 3.0) and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After activation The cells were collected
  • the reaction temperature was adjusted to 25 ° C. Immediately after the start of the reaction, a large amount of oxygen was required, so the aeration rate and the stirring speed were maximized.
  • the pH was adjusted to 5.5 by adding sulfuric acid and potassium hydroxide. The reaction was performed for 40 minutes.
  • the sample to be injected is 20 mM sodium nitrite (Na
  • Dopachrome is quantified as reduced leucodopachrome (5,6-dihydroxyindolin-2-carboxylic acid) under the above measurement conditions.
  • 5,6-dihydroxyindole is quantified based on the standard substance (alkaline hydrolyzate of 5,6-diacetoxindole), and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid has a peak area at 280 nm. Comparison by ratio.
  • the maximum absorption wavelength of 5,6-dihydroxyindole is 300 nm
  • the maximum absorption wavelength of 5,6-dihydroxyindolecarboxylic acid is 320 nm.
  • the melanin precursor solution obtained in the above step 4 uses yeast cells having a strong cell wall. Therefore, the protein that has flowed out of the microbial debris existing in the melanin precursor solution Is absent or almost absent. However, when used as a hair dye, protein contained in a trace amount may become an allergen, and thus the protein was removed by ultrafiltration.
  • an ultrafiltration module Molsep FS10-FUS0181 (fraction molecular weight 10,000) manufactured by Daisen Membrane Co. was used.
  • the solution obtained by filtration was subjected to SDS-PAGE, and silver staining was performed to confirm that the protein was deproteinized.
  • the ability to measure the absorbance at 280 is not good enough because dopachrome itself has an absorption at around 280 nm, and because the indole has high reactivity, it reacts with the color reagent. Because it is easy.
  • silver staining it is considered to be protein after ultrafiltration The band was undetectable.
  • the melanin precursor contained in the solution obtained in the above step 5 is mainly dopachrome, that is, 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid.
  • dopachrome that is, 5,6-dihydroxyindoline-2-carboxylic acid.
  • the melanin precursor was non-enzymatically converted.
  • the methods were pH adjustment, organic solvent addition, phosphate buffer addition, metal ion treatment, etc., and any method could be converted efficiently.
  • the abundance ratio of the melanin precursor shown below is based on the area ratio of absorbance at 280.
  • the precursor was adjusted by pH. Stored at 40 ° C for 2 hours in the absence of oxygen.
  • acidic to neutral pH 5 to less than 8
  • the proportion of 5,6-dihydroxyindole increases more than 50% in the precursor, 80% or more under optimum conditions
  • pH 8 ll The proportion of 6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid increased.
  • a sediment was formed, which was unsuitable for treatment.
  • Ethanol was added to the melanin precursor solution (mainly containing dopachrome) obtained in the above step 5 so as to be 50% by volume of the total amount and treated at room temperature for 2 hours.
  • Dopachrome was efficiently converted to 5,6-dihydroxyindole (more than 10 times the ratio of 5,6-dihydroxyindole to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid). Similar effects were observed when methanol, acetone, acetone, 2-propanol or acetonitrile was used instead of ethanol.
  • a PH6.0 0.1M phosphate buffer containing a melanin precursor was obtained.
  • This precursor solution was stored at about ⁇ 20 ° C. for 7 days.
  • Dopachrome was efficiently converted to 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid by storing at low temperature in a phosphate buffer containing phosphate as the acid component (5,6-dihydroxyindole-2- More than 5 times the ratio of carboxylic acid to 5,6-dihydroxyindole).
  • step 5 To the melanin precursor solution (mainly containing dopachrome) obtained in step 5 above, add sodium chloride sodium salt to a final concentration of 2.5% and let stand at room temperature for 45 minutes. -Conversion to dihydroxyindole was accelerated compared to the non-added system. In addition, when sodium ascorbate solution was added instead of sodium chloride, a significant amount of 5,6-dihydroxyindole accumulated (the abundance of 5,6-dihydroxyindole in the melanin precursor was 90%
  • step 5 To the melanin precursor solution (mainly containing dopachrome) obtained in step 5 above, add copper sulfate to a final lm M and let stand at room temperature for 15 minutes. Conversion to dihydroxyindole-2-carboxylic acid was facilitated (5,6-dihydroxyindole-2-force ratio of rubonic acid to 5,6-dihydroxyindole was more than 3 times).
  • Melanin precursor solutions (such as dopachrome, 5,6-dihydroxyindole and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid) could be concentrated as follows.
  • a cross-flow type reverse osmosis concentrator manufactured by Nitto Denko Matex Co., Ltd.
  • This device circulates the solution between the closed tank containing the melanin precursor solution and the reverse osmosis concentration module NTR7410-HG-S4F, and the pure water produced by the reverse osmosis concentration module is obtained from this module. Guided to the permeate tank. Pure water As a result, the melanin precursor is concentrated in the tank.
  • Circulation was performed by a pump at a pressure of 2 MPa. About 31 L of the melanin precursor solution obtained in step 5 was concentrated to about 4 L by operating for about 30 minutes. During this concentration operation, almost no polymer melanin was produced in the melanin precursor permeate, and the 5,6-dihydroxyindole concentration as an index rose from about 9 mM to about 67 mM, and the recovery rate was extremely high. .
  • Tyrosinase activity 1.9 4.4 Tyrosinase gene from Aspergillus oryzae having U / OD (m
  • melanin precursor solution 1 was obtained by treatment near pH 6, ultrafiltration, and reverse osmosis membrane concentration. More than 90% of this solution is detected as a melanin precursor at 280 by HPLC, and 5,6-dihydroxyindole is 10%, and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid is 10%. It was the following. Indoline content was less than 1%. The starting material L-DOPA was not detected. Indoline content was less than 1%. The starting material L-DOPA was not detected. The absence of protein was confirmed by SDS-polyarylamide electrophoresis. By this method, a melanin precursor comprising 5,6-dihydroxyindole suitable as a hair dye as a main component (90% or more of melanin precursor content) could be produced efficiently.
  • the hair dye lg obtained in 1 was applied to a white hair tress lg and dyed at 30 ° C. for 15 minutes. Thereafter, it was washed with water, shampooed, hair rinsed, and then dried. This operation was repeated 5 times every 7 days.
  • the dyed tress was measured with a spectrocolorimeter (CM-2002 manufactured by Minolta), and evaluated by the color difference ( ⁇ E) calculated according to the following formula.
  • the ⁇ values of the white hair tress were 1st: 15, 3rd: 28, 5th: 38, and gradually became black.
  • melanin precursor solution 1 (including about 0.05 g of melanin precursor), 0.5 g of softanol 90, 0.1 g of xanthan gum, 0.3 g of stearyltrimethylammonium chloride, polyoxyethylene-methylpolysiloxane copolymer was mixed with 0.01 g of ethanol, 10 g of ethanol and the remaining water to prepare 100 g of a hair dye.
  • LPG propellant

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Abstract

　チロシン又はその誘導体を出発物質とし、アスペルギルス（Aspergillus）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、リゾムコール（Rhizomucor）属、トリコデルマ（Trichoderma）属及びペニシリウム（Penicillium）属からなる群より選ばれる糸状菌に由来するカテコールオキシダーゼ活性を示す酵素又は細胞を用いて、メラニン前駆体に変換する酸化工程(A)を含む方法により製造されたメラニン前駆体を含有する空気酸化型染毛剤組成物。

Description

明 細 書
染毛剤組成物
技術分野
[0001] 本発明は、酵素を用いて効率的に製造されたメラニン前駆体を含有し、染色性、安 定性、安全性に優れる染毛剤組成物、特に一剤式空気酸化型染毛剤組成物に関す る。
背景技術
[0002] 5,6-ジヒドロキシインドリンなどのメラニン前駆体は、空気中の酸素によりメラニン色 素に変換することが知られており、これを利用して空気酸化型染毛剤に使用されてい る。
[0003] 染毛剤に使用されるメラニン前駆体の入手方法としては、化学合成反応による製造 があるが、副反応による収率の低下、目的反応生成物の単離等による時間的負担、 コスト高、溶剤の残留による影響の懸念などの問題がある。また、酵素反応によるメラ ニン前駆体の製造技術として、ラッカーゼを用いたインドール類又はインドリン類の製 造方法が知られている（特許文献 1)。しかし、使用するラッカーゼは、漆等の植物か ら精製等することが必要であった。また、製造の効率性、並びに得られるメラニン前駆 体の染色性及び安定性を兼ね備えたものでな ヽと 、う点にぉ 、て、十分ではなかつ た。
[0004] 一方、特許文献 2には、新規な麹菌由来のチロシナーゼ遺伝子として MelBが開示 されている。
[0005] 特許文献 1：特開 2002-291496号公報
特許文献 2：特開 2002-191366号公報
発明の開示
[0006] 本発明は、チロシン又はその誘導体を出発物質とし、ァスペルギルス (Aspergillus) 属、ニューロスポラ (Neurospora)属、リゾムコーノレ (Rhizomucor)属、トリコデノレマ (Trie hoderma)属及ぴぺニシリウム (Penicillium)属からなる群より選ばれる糸状菌に由来 するカテコールォキシダーゼ活性を示す酵素又は細胞を用いて、メラニン前駆体に 変換する酸化工程 (A)を含む方法により製造されたメラニン前駆体を含有する空気酸 化型染毛剤組成物を提供するものである。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]製造例 1におけるチロシナーゼ産生細胞による L-DOPAの酸ィ匕反応の反応液 中の L-DOPA濃度及びメラニン前駆体濃度の推移を示す図である。
発明を実施するための形態
[0008] 本発明は、チロシン又はその誘導体から、酵素反応により効率良くメラニン前駆体 を製造し、これを染料として使用することによって、染色性や製造の簡便性を向上さ せた空気酸化型染毛剤に関する。
[0009] 本発明者らは、特定の方法を用いて酵素あるいは酵素を含有する菌体により製造 したメラニン前駆体を含有する空気酸化型染毛剤が優れた性能を示すことを見出し た。
[0010] 本発明で使用するメラニン前駆体とは、チロシン又はその誘導体力 製造され、か つ空気酸化型染毛剤に利用できる染料、すなわち空気中の酸素ですみやかに酸ィ匕 重合しメラニンを形成する物質であり、具体例としては、 5,6-ジヒドロキシインドリン、 5, 6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸等のインドリン誘導体、 5, 6-ジヒドロキシインド ール、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸等のインドール誘導体などを示すこ とができる。 DOPAはその酸ィ匕重合速度が遅く染毛剤用染料としての実用性に乏し いため、本発明にいうメラニン前駆体に含まない。また、チロシンからの酸化反応中 間体として、ドーパクロム、インドールキノン等が存在する力 これらは短期間しか安 定でなく長期間 (例えば 1ヶ月）の安定性を有しないため、染毛剤用染料としては利 用できない。従って、これらも本発明にいうメラニン前駆体には含まない。ただし、そ れらの中間体から一般的な化学処理等により上記の空気酸ィヒ型染毛剤としての要 件を持つ安定な化合物が製造できたときは、そのような安定な化合物は本発明にい うメラニン前駆体に含まれる。更に、本発明におけるメラニン前駆体は、必ずしもモノ マーに限られるものではなぐ上記の空気酸化型の染料の要件を満たす二量体以上 のオリゴマーをも含むものとする。本発明で使用するメラニン前駆体は、以下の方法 により製造される。 [0011] —酸ィ匕工程 (A)—
<出発物質 >
出発物質 (基質化合物）としては、チロシン又はその誘導体が使用される。具体例と しては、（1)D体又は L体のチロシン、（2)D体又は L体のドー 〔DOPA;3- (3,4-ジヒド ロキシフエ-ル)ァラニン〕、（3)ドーパミン（Dopamine ;3,4-ジヒドロキシフエネチルァミン )、（4)チロシンの低級 (C1-4)アルキルエステル、（5)DOPAの低級 (C1-4)アルキルエス テル、（6)N-アルコキシ（例；ァセトキシ)化又は N-アルキル（例；ェチル)ィ匕された DOP A又はチロシン等が挙げられ、これらの異性体であってもよい。中でも、天然型メラ- ン前駆体が得られる点で、 L-チロシン及び L-DOPAが好ましぐ酵素に対する親和性 の点で、 L-DOPAがより好ましい。これらチロシン又はその誘導体は、いずれかを単 独で、又は 2種以上を組み合わせて用いることができる。
[0012] <カテコールォキシダーゼ活性を示す酵素 >
カテコールォキシダーゼ活性とは、カテコールの酸ィ匕による 0-キノンの生成を触媒 する活性をいう。カテコールォキシダーゼ活性を有する酵素（以下、「カテコールォキ シダーゼ」と略称する）には、カテコールォキシダーゼ、モノフエノールォキシダーゼ、 ジフエノールォキシダーゼ、 0-ジフエノラーゼ、チロシナーゼ等と称されている酵素が 含まれる。これらは、通常、モノフエノールォキシダーゼ活性を有する。このほかモノ フエノールォキシダーゼ活性は有して 、な 、が、ポリフエノールォキシダーゼ活性を 有して ヽるラッカーゼ、ペルォキシダーゼもカテコールォキシダーゼ活性を有する酵 素に含まれる。これらのうち、 L-DOPAに対して親和性が高いために天然型メラニン 前駆体を効率よく製造できる点で、チロシナーゼを使用することが好ましい。なお、基 質ィ匕合物としてチロシンを用いる場合は、チロシナーゼを用いることが好ま 、。
[0013] カテコールォキシダーゼは、どのような生物に由来する酵素であってもよいが、発 現効率が良ぐかつ宿主細胞内で安定であることから、糸状菌由来のチロシナーゼ が好ましい。また、チロシン誘導体からメラニン前躯体に酸化反応を行う工程におい て、出発物質を残存させないために、反応収率 (基質に対する酸化生成物の比率） が高い酵素が好ましい。このような糸状菌としては、ァスペルギルス (Aspergillus)属、 ニューロスポラ (Neurospora)属、リゾムコーノレ (Rhizomucor)属、トリコデノレマ (Trichod erma)属及びべ-シリウム（Penicillium)属等が挙げられる。中でも、熱に対して比較 的安定であり、かつ安全性が確かめられている点で、ァスペルギルス属糸状菌のチ ロシナーゼが好ましぐ具体的には、ァスペルギルス'オリゼ（Aspergillus oryzae)の m elB遺伝子（特開 2002-191366号公報）、 melD遺伝子（特開 2004-201545号公報）又 i^melO遺 子 (Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gen e, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells. Biochim Biophys Acta. 1995 Mar 14;1261(1):151- 154)にコードされるチロシナーゼと実質的 に同一である酵素を挙げることができる。
[0014] 本発明にお 、て、上記遺伝子 (melB遺伝子、 melD遺伝子又は melO遺伝子）と「実 質的に同一」とは、これらのうちいずれか 1以上の遺伝子と、アミノ酸配列として 70% 以上、更に好ましくは 80%以上、最も好ましくは 90%以上の相同性を有し、かつチロ シナーゼ活性又はモノフエノールォキシダーゼ活性を有して ヽることを ヽぅ。このよう な酵素は、ドーパからドーパクロムへの反応収率が高ぐ効率的に酸化反応を行うこ とができ酸ィ匕工程での最終ドーパ濃度を低くすることができる。
[0015] 上記酵素は、そのまま反応液に添加して使用することができる。また、酵素の安定 性向上、使用後の分離の容易さ、反応系へのタンパク質混入の回避の点から、固定 化酵素とすることも好ましい。酵素の固定ィ匕方法は特に限定されず、例えば、固定ィ匕 担体により酵素分子間を架橋する方法、アルギン酸ゲルのようなゲルに内包させる方 法等の公知の固定化方法が挙げられる。酵素は、生物由来の夾雑物を含む粗標品 でもよぐ精製酵素でもよいが、固定ィ匕する場合は精製されたものであることが望まし い。
[0016] <カテコールォキシダーゼ活性を示す細胞 >
カテコールォキシダーゼ活性を示す細胞としては、以下の (a)〜( の 1以上に該当 する細胞を用いる。
(a)カテコールォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を本来 発現させているプロモーターより高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を発現させ ている細胞。
(b)カテコールォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を複数コ ピー有する細胞。
(C)カテコールォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異した遺伝子 を有することにより高いカテコールォキシダーゼ活性を示す細胞。
(d)チロシナーゼ活性ィ匕処理されることにより高 ヽカテコールォキシダーゼ活性を示 す細胞。
[0017] (a)については、例えば、タンパク質の大量発現用に通常用いられているベクターに カテコールォキシダーゼ遺伝子をクロー-ングしたものを宿主細胞に導入し、宿主染 色体に組み込むか又はこれをプラスミド状態で有する宿主細胞を培養することにより 、カテコールォキシダーゼを大量に産生させることができる。これにより、その遺伝子 を本来発現させているプロモーターより高活性のプロモーターの下でこの遺伝子を 発現させればよい。
[0018] (b)につ ヽては、例えば、カテコールォキシダーゼ遺伝子を複数コピー保持する可 能性のある 2倍体以上の細胞にカテコールォキシダーゼ遺伝子を導入したものを用 いればよい。また、例えば実用酵母の中には、 3倍体や 4倍体の細胞も存在するため 、これらも好適に使用できる。このようにして、その遺伝子本来よりコピー数を多くする ことにより、高いカテコールォキシダーゼ活性を示す細胞とすることができる。
[0019] (c)については、カテコールォキシダーゼ遺伝子の変異により、カテコーノレオキシダ ーゼ活性が高くなつた細胞又はこのような変異カテコールォキシダーゼ遺伝子を導 入した細胞も使用できる。このようにして、天然型酵素より高い活性を示す変異型酵 素とすることにより、高いカテコールォキシダーゼ活性を示す細胞とすることができる
[0020] (d)については、 2価銅イオンを配位させる処理や、 pH2.8〜3.2程度の酸性溶液で の処理などを施すことにより、そのカテコールォキシダーゼ活性を高めた細胞を用 ヽ ることちでさる。
[0021] 中でも、（a)のカテコールォキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝 子を本来発現させているプロモーターより高活性のプロモーターの下でこの遺伝子 を発現させて 、る細胞が好ま 、。
[0022] カテコールォキシダーゼを産生させる細胞の種類は、特に限定されないが、大量培 養が容易である点で微生物であることが好ましい。使用し易い微生物としては、大腸 菌、酵母及び糸状菌を挙げることができる。中でも、安全で、カテコールォキシダー ゼの産生効率が良ぐ更に単細胞であり、かつ細胞の沈降速度が速いため、反応後 に比較的低速回転の遠心分離で分離できる点で、酵母を用いることが好ましい。中 でも、菌体が堅牢であるために菌体由来のタンパク質の反応液中への流出が抑えら れ、かつ遺伝子操作が容易である点で、サッカロミセス'セレピシェ（Saccharomyces c erevisiae) 好 ¾;し ヽ。
[0023] なお、細胞は、効率的な利用、使用後の分離の容易さの点から、担体結合法、包 括法、架橋法、光架橋法等の公知の方法で固定ィ匕したものを用いることもできる。
[0024] <活性化処理 >
チロシナーゼ等のカテコールォキシダーゼが活性を示すためには、触媒活性中心 に 2価銅イオンが配位することが必要である。野生型細胞ではカテコールォキシダー ゼの発現量が少ないため、その細胞内に存在する 2価銅イオンの配位により十分な 活性を示すが、形質転換等によりカテコールォキシダーゼの発現量が向上して!/ヽる 細胞では十分なカテコールォキシダーゼ活性が得られない場合がある。従って、力 テコールォキシダーゼ活性を示す酵素、細胞のいずれを用いる場合も、酵素又は細 胞を、予め 2価銅イオンで処理することにより、カテコールォキシダーゼの触媒活性 中心に 2価銅イオンを配位させることが好ましい。具体的には、酵素又は形質転換体 を 0.1〜2mM程度の硫酸銅溶液等に懸濁し、 30〜40°C程度で 0.5〜2時間程度静置 することにより、細胞内のカテコールォキシダーゼに十分に 2価銅イオンを配位させる ことが好ましい。
[0025] また、カテコールォキシダーゼの中でもチロシナーゼ、特にァスペルギルス'ォリゼ 由来のチロシナーゼは、 PH2.8〜3.2程度の酸性溶液で処理することにより、成熟化し 、活性化する。従って、カテコールォキシダーゼ活性を示す酵素、細胞のいずれを用 いる場合も、例えば、 20〜200mM程度の酢酸ナトリウム緩衝溶液 (pH = 3)に懸濁し、 O〜40°C程度で 0.5〜 1時間程度静置することにより、カテコールォキシダーゼ活性を 一層向上させることが好まし 、。
[0026] また、カテコールォキシダーゼは、トリプシン等の特定のペプチド結合を選択的に 切断するエンドべプチダーゼのようなプロテアーゼで処理することによつても活性ィ匕 することができる。プロテアーゼ処理することにより、酵素の N末端及び Z又は C末端 側の配列が取り除かれ、酵素活性が向上する。
[0027] 細胞が酵母である場合において、 L-DOPAを基質として用いたときは、 0.1 U/OD
600 以上、更には 0.5 U/OD 以上、更には 1U/OD 以上のカテコールォキシダーゼ活
600 600
性を有する細胞を用いることが好ましい。酵母以外の細胞の場合も、同様の力テコー ルォキシダーゼ活性を有する細胞を用いればょ 、。細胞のカテコールォキシダーゼ 活性の上限は特に限定されないが、通常 5U/OD 程度である。
600
[0028] 更に、カテコールォキシダーゼ活性を示す酵素、細胞の!/、ずれを用いる場合も、 1 molの L-DOPAを基質として用いた場合に、通常 5 X 105 U/mol以上、更には 5 X 106U /mol以上となるようにすることが好ましい。 L-DOPA lmol当たりのカテコールォキシダ ーゼ活性の上限は特に限定されないが、通常 5 X 107 U/mol程度もあれば十分であり 、それ以上はコスト高となる。
[0029] なお、本発明にお 、て、酵素又は細胞のカテコールォキシダーゼ活性は、酵素又 は細胞と 0.8 μ molの DOPAを含む溶液 lmLを 30°Cで 5分間反応させた場合の 475nm における吸光度を 1増加させる活性を 1Uとし、細胞のカテコールォキシダーゼ活性 は、これを反応に用いた菌体の密度（600nmにおける吸光度； OD )で除したもの（U
600
ZOD )とする。
600
[0030] 本発明方法においては、基質に対してカテコールォキシダーゼが過剰に存在する 状態とすることにより、基質ィ匕合物力 生成したメラニン前駆体が更に重合してメラ- ンが生成する速度より速く基質化合物からメラニン前駆体が生成し、反応系にメラ二 ン前駆体が効率良く蓄積する。
[0031] <反応 >
反応開始時の出発物質 (基質ィ匕合物）の濃度は、通常 10〜60mM程度、更には 15 〜25mM程度とすることが好ましい。上記範囲であれば、十分量のメラニン前駆体を 得ることができるとともに、メラニン生成量が増加し過ぎることによるメラニン前駆体の 収率低下や未反応基質の残存が生じない。また、出発物質として DOPA、 Dopamine 等を用いた場合は、染毛剤の原料としては安全性上好ましくない。そのため、出発物 質又は中間体である DOPA又は Dopamineを実質的に染毛剤中に含まな!/、ように、本 酸ィ匕工程で消費するのが好ましい。より好ましい態様としては、 L-DOPAを出発物質 とし、その濃度が反応開始時に 15mM以上、反応終了時に O.lmM以下となるような酸 化工程が挙げられる。また、酵素による DOPA力 の反応工程におけるドーパクロム 等の酸ィ匕生成物の収率は、おおよそ 30〜70%の範囲とするのが経済的であり好まし い。
[0032] また反応液の pHは、酵素が基質の酸化反応を触媒できる範囲であればよ!、が、メ ラニンの生成を抑えて反応液中に効率良くメラニン前駆体を蓄積させる点から、通常 4〜9程度、更には 5〜7程度に維持することが好ましい。反応液の pHは、反応液とし て緩衝液を用いることにより上記範囲に維持することもできる力 塩濃度が高いとメラ ニン前駆体の重合によるメラニンの生成が促進される場合があるため、水酸ィ匕カリウ ム、水酸ィ匕ナトリウム等の強アルカリ又は硫酸、塩酸等の強酸を少量添加することに より調整することが好ましい。
[0033] 反応液中の細胞量は、反応後の菌体分離を容易とし、メラニン前駆体の収率を向 上する点から、前述のカテコールォキシダーゼ活性となる範囲内で、少なければ少な いほど良ぐ細胞投入量は、反応液に対して 20容量％以下、更には 10容量％以下が 好ましい。
[0034] 反応温度は、酵素が基質の酸化反応を触媒できる範囲であればよ!、が、十分な酸 化反応の進行、酵素の失活防止、メラニン化の抑制の点から、 5〜40°C、更には 15〜 35°C、更には 20〜30°Cに維持することが好ましい。
[0035] 反応開始直後は、酸ィ匕反応に大量の酸素が必要であるため、反応液を攪拌するこ とにより大量に通気することが好ましい。ただし、攪拌速度が速すぎると細胞の損傷 等を引き起こすため、反応液中の酸素濃度を監視し、酸素濃度が低下しなくなれば 通気量及び攪拌速度を減少することが好ましい。反応液中の酸素濃度は 0.1〜8ppm 程度、更には l〜2ppm程度に維持することが好ましい。通気や撹拌により反応液中 に大量の泡が生じる場合は、シリコーン榭脂のような消泡剤を添加してもよ 、。
[0036] 反応は、バッチ式及び連続式の何れでもよ!/、が、未反応の基質と生成物を分離で きる点でバッチ式が好ましい。バッチ式の場合の反応時間は、メラニン前駆体の重合 反応を最小限に抑えつつ基質ィ匕合物を十分メラニン前駆体に変換する点から、通常
10分〜 2時間程度、更には 30分〜 1時間程度とするのが好ましい。
[0037] 連続式の場合は、基質濃度が 10〜60mM程度、更には 15〜25mM程度になるように 細胞を含む反応容器に基質を供給しつつ反応液を連続的に回収すればょ 、。ある Vヽは酵素又は細胞を固定化した担体を充填したカラムに 1〜 1 OmM程度、更には 3〜 6mM程度になるような基質と、電子供与体として基質の 2倍濃度の過酸化水素とを添 加すればよい。
[0038] 基質ィ匕合物としてチロシン又は DOPAを用いる場合は、上記酵素反応により基質化 合物が酸化されてドーパクロム（Dopachrome)が生成する。ここで、ァスコルビン酸、 亜ニチオン酸等の還元剤を用いて反応を停止及び還元させれば、メラニン前駆体と して、 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸が得られる。また、この反応液を更に 保持すれば、ドーパクロムの自発的な脱炭酸により 5,6-ジヒドロキシインドールが生成 し、あるいは、細胞中に含まれるドーパクロムトートメラーゼにより、あるいは非酵素的 な異性ィ匕により、ドーパクロムから 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸が生成す る。これにより、ドーパクロム、 5, 6-ジヒドロキシインドール及び 5,6-ジヒドロキシインドー ル -2-カルボン酸を含むメラニン前駆体が得られる。これらのメラニン前躯体の反応収 率は、好ましくは 20〜70%、更に好ましくは 40〜70%である。
[0039] また基質ィ匕合物として、例えばドーパミン (Dopamine)を用いる場合は、基質化合物 の酸ィ匕によりドーノ ミンのキノン体が生成する。ここで、亜ニチオン酸などの還元剤を 用いて反応を停止及び還元させれば、 5,6-ジヒドロキシインドリンが得られる。また、こ の反応液を更に保持すればジヒドロキシインドールが生成する。更に、メラニン前駆 体には、これらが 2〜5分子程度重合した水溶性オリゴマーが含まれる場合もある。
[0040] 基質化合物として、アルキルエステルを用いると、黒色以外のメラニンを生成するメ ラニン前駆体を調製することが可能となる。具体的な例としては、チロシンェチルエス テル、 DOPAェチルエステル等を出発物質として使用すると、生成したメラニン前駆 体力も重合したメラニンは黄色となり、染毛剤の調色に使用することができる。
[0041] 後処理工程 (B)—
本発明の染毛剤に用いるメラニン前駆体の製造方法としての酸ィ匕工程 (A)は、上に 示した酵素あるいは菌体による反応である。以下に、染毛剤に使用するための後処 理工程 (B)を記載する。
[0042] (1)メラニン前駆体の回収
酸ィ匕工程 (A)により得られたメラニン前駆体を含む反応液には、メラニン前駆体のほ かに、使用した酵素又は細胞、更には通気及び撹拌により細胞が破損して生じたタ ンパク質又は細胞力 流出したタンパク質や、メラニン前駆体が重合したメラニンも含 まれる。従って、染毛剤用の染料として利用するためには、これらを反応液から除去 する必要がある。酵素又は細胞の除去は、限外ろ過、ろ過、遠心分離等の手段によ り行うことができ、回収された酵素又は細胞は、酸ィ匕工程用の容器に戻すことにより、 再利用することができる。また、タンパク質やメラニンの除去は、限外ろ過、ゲルろ過 クロマトグラフィー等の手段により行うことができる。
[0043] 酸化工程 (A)で得られたメラニン前駆体は、分子量 3000以上の高分子体 (メラニン） となる以前の状態、すなわちインドールあるいはインドリン骨格を持つ種々のモノマー 力 オリゴマーの状態（分子量 3000未満）であり、主としてドーパクロムあるいは 5,6-ジ ヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸を含んでいる。本発明においては、この ¾ ^ラニン 前駆体を空気酸化型染毛剤の染料として配合し、組成物を調製してもよ ヽ。
[0044] また、本発明の酸ィ匕工程で得られたメラニン前躯体を酸ィ匕重合し、分子量 3000以 上のみのメラニンとして、毛髪用化粧料 (リーブオンタイプ、あるいは洗い流しタイプ） に配合することも可能である。例えば、シャンプー、リンス、コンディショナー、スタイリ ング剤、セット剤、パーマ剤、ワックス、艷出し剤、育毛剤等が挙げられる。
[0045] (2)メラニン前駆体組成の調整
本発明では、 目的に応じて、以下に示すメラニン前駆体溶液中の 5,6-ジヒドロキシ インドール及び 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸のいずれかの濃度を高める 工程〔工程 0)〕を経た上で、染毛剤に配合することが好ましい。本工程は、上記の回 収工程 (反応液からの酵素、細胞、タンパク質、メラニン等の除去)の前に行っても、 後に行ってもよぐ更には両者を兼ねて、以下に示す工程 (I)の環境下で回収工程を 行い、工程 (I)の処理時間に回収工程の時間を含めてもよい。 5,6-ジヒドロキシインド ール及び 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の濃度を高める工程を経て、染 毛剤に配合することが好ましい。より好ましい態様として、 5,6-ジヒドロキシインドール を主成分とし、それに対し少量の 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸を含む状 態であると、染毛剤にした場合により自然な色合いに染めることができる。
[0046] 工程 (I)における上記いずれかの化合物濃度を高める手段としては、（i)pH調整処理 、 GO水溶性有機溶媒の添加、（iii)無機塩の添加、（iv)緩衝液による処理、（V)酸化防止 剤の添加等が挙げられる。これらは、 2種以上を組み合わせて用いてもよぐ例えば、 上記 (OpH調整時に (ii)〜(v)のいずれか 1以上を組み合わせると、より効率的に本ェ 程を完了することができる。
[0047] (i)pH調整処理
pHの調整範囲としては、 pH5〜ll、更には pH5〜10、更には pH6〜9が好ましぐこ の範囲であると効率よくインドール誘導体への変換が進行する。それに対し、強酸性 では沈殿がおこり、強アルカリ性では酸ィ匕重合が加速されメラニンが生成してしまう。 また、処理は嫌気条件下で行うことが好ましいが、工程 (I)において十分な収量が得ら れるのであれば、必ずしも酸素の存在は否定されるものではな 、。
[0048] ここで、 pHを中性〜弱酸性側に、又はアルカリ性側に調整することによって、所望 の化合物の比率が高まるようにメラニン前駆体の組成を調整することができる。例え ば、ドーパクロムあるいは 5, 6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸から 5, 6-ジヒドロキ シインドールへの変換は pH5以上 8未満で起こりやすぐ 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2 -カルボン酸から 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸への変換は pH8以上 11以 下で起こりやすい。すなわち、中性〜酸性領域では 5,6-ジヒドロキシインドールが生 成し、アルカリ領域では、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸が効率良く生成 する。
[0049] pH調整時の温度は、 5〜40°C、更には 15〜30°Cが好ましぐ通常室温状態で pH調 整を行えばょ 、。処理時間も 5,6-ジヒドロキシインドリン誘導体が変化する時間を指 標に保持すればよい。温度にもよるが 30分以上であればよぐ変換物（5,6-ジヒドロキ シインドール誘導体）は比較的安定であるので、工程 (I)の後、酸素遮断状態であれ ば長期間、例えば 1週間以上放置しても差し支えない。
[0050] (ii)水溶性有機溶媒の添カロ 水溶性有機溶媒としては、水に 10重量％以上相溶性を有する (水 90gに 10g以上溶 解する）有機溶媒を用いることができ、例えばメタノール、エタノール、ベンジルアルコ ール等のアルコール類、ポリエチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類、 アセトン等のケトン類、乳酸、クェン酸等の有機酸類、酢酸、プロピオン酸等の脂肪 酸類、アルキルアミン類、モノエタノールァミン等のアルカノールァミン類などが使用 できる。これらのうち、安全性の点で、エタノール、アセトンがより好ましい。
[0051] 特にアルコール類、多価アルコール類、ケトン類、有機酸類又は脂肪酸類の添カロ により、 5, 6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸から 5, 6-ジヒドロキシインドールへの 変換を促進することができる。例えば、エタノールの 50重量％の添加で、 5,6-ジヒドロ キシインドリン- 2-カルボン酸から 5,6-ジヒドロキシインドールへの変換が約 2倍に促進 される。また、上記アルキルアミン類又はアルカノールァミン類の添カ卩により、 5,6-ジヒ ドロキシインドリン- 2-カルボン酸から 5, 6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸への 変換を促進することができる。例えば、モノエタノールァミンの 5〜50重量％の添カロに より、 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸から 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カル ボン酸へ 70%以上の選択性で変換することが可能となる。
[0052] 水溶液有機溶媒は、反応液に全量中の 5〜70重量％程度、更には 30〜60重量％ 程度の濃度となるように添加することが好ましい。溶媒添加量は、多くても特に問題 はなぐ逆に変換速度が速くなる、生成してしまったメラニンを除去できるという効果が あるが、上記範囲であれば、実用上十分に 5,6-ジヒドロキシインドール誘導体の比率 を向上させることができるとともに安全に後処理を行うことができる。
[0053] (iii)無機塩の添カロ
無機塩としては、塩酸、硝酸、硫酸及び炭酸から選ばれる酸のアルカリ金属塩、ァ ルカリ土類金属塩又は銅 (II)塩を使用することができる。これらのうち、銅 (II)塩は 5,6- ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸の 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸への 変換を促進することができ、また銅 (II)塩以外の無機塩は 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2 -カルボン酸の 5,6-ジヒドロキシインドールへの変換を促進することができる。反応液 中の無機塩濃度は、変換の効率性、塩やメラニンの析出防止の点から、 40重量％以 下、更には 0.1〜20重量％、更には 1〜5重量％が好ましい。 [0054] 無機塩の添加として、例えば硫酸銅による処理を挙げると、反応液に 0.1〜20mM程 度、好ましくは 5〜10mM程度となるように硫酸銅を添加し、例えば 10〜30分間程度保 存することにより、メラニン前駆体中の 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸の 5,6- ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸への変換が促進される。
[0055] (iv)緩衝液による処理
緩衝液としては、リン酸緩衝液が挙げられる。リン酸緩衝液としては、リン酸ナトリウ ム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、クェン酸一リン酸ナトリウム緩衝液、トリス一リン酸緩 衝液が挙げられる。リン酸緩衝液による処理で、 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボ ン酸の 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸への変換を促進することができる。
[0056] (V)酸化防止剤の添カロ
酸ィ匕防止剤としては、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム 等が使用でき、ァスコルビン酸ナトリウムを 2.5重量％添加すると 5,6-ジヒドロキシイン ドリン- 2-カルボン酸力 5,6-ジヒドロキシインドールへの変換速度が促進される。
[0057] (3)メラニン前駆体の濃縮'保存
メラニン前駆体を含む液は、逆浸透濃縮、スプレードライ、凍結濃縮等の公知の方 法で水分を除去してメラニン前駆体を濃縮することが好ましい。更に、メラニン前駆体 の単品又は混合物は、そのまま、濃縮状態、乾燥粉末状態等のいずれの形態でも保 存することができる。
[0058] 更に、特定のメラニン前駆体の保存方法を例示すると、 5,6-ジヒドロキシインドリン、 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸等のインドリン誘導体は、粉末状の塩の状態 (好ましくは塩酸塩、臭素酸塩等)で、好ましくは酸素非存在下で保存するのが好まし い。また、 5,6-ジヒドロキシインドール、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸等の インドール誘導体は、実質的な酸素非存在下で溶液あるいは粉末状態で保存できる
[0059] 染毛剤として利用する形態としては、 5,6-ジヒドロキシインドリン、 5,6-ジヒドロキシィ ンドリン- 2-カルボン酸等のインドリン誘導体は、使用時まで非酸素状態かつ水とは 遮断された状態 (粉末状、油剤への懸濁状態を含む)で保管するのが好ましぐ使用 直前に、水、アルカリ剤等一般的な染毛剤基剤と混合し、直ちに毛髪に塗布し、染毛 剤として使用するのが好ましい。この場合には、空気酸ィ匕型染毛剤ではあるが、混合 等の操作を伴う二剤式又は三剤式とすることが、メラニン前駆体の安定性力も好まし い。
[0060] 一方、 5,6-ジヒドロキシインドール、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸等のィ ンドール誘導体は、非酸素状態であれば水溶液中でも安定であるので、一剤式の空 気酸化型染毛剤とすることができ、使用が簡単である点で好ましい。製造のしゃすさ 、安定性及び染毛性能からは、 5,6-ジヒドロキシインドールが好ましぐメラニン前駆 体中の 5,6-ジヒドロキシインドールの比率力 280nmにおける吸光度の面積比で 60% 以上であることが好ましい。一方、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸は、重合 して得られるメラニンの水溶性が高 、ため、一時染め用の染毛剤組成物に利用する ことができる。
[0061] 染毛剤組成物
以上のようにして得られたメラニン前駆体を染毛剤に配合することによって、容器か ら出して髪に着けてしばらく放置するだけの簡便な一剤式の空気酸化型の染毛剤が 可能となり、白髪をメラニンの自然な色合いに染めることができる。一剤式の染毛剤と するためには、 5,6-ジヒドロキシインドールカメラニン前駆体の中で好ましいが、染毛 性能が発揮されれば、他のメラニン前駆体が半分程度まで含まれて ヽてもよ ヽ。
[0062] 本発明の染毛剤組成物におけるメラニン前駆体の含有量は、染毛性能の観点力 、 0.01〜10重量％、更には 0.05〜5重量。 /0、更には 0.1〜1重量％が好ましい。この含 有量は、染毛剤の使用目的によって適宜変えることができ、一回の染毛で目的のレ ベルまで濃く（黒く）染毛する場合は、 0.5〜1重量％程度が好ましぐ徐々に繰り返し 染毛して、白髪を目立たせなくするような染毛剤の場合には、 0.1〜0.4重量％が好ま しい。また、配合量が 0.01重量％以上あれば、ごくわずかずつではあるが染毛が可 能であるため、手で扱う様な染毛剤あるいはカラーリンス用染料、毛髪用化粧料の場 合等に使用できる。
[0063] 本発明において使用されるメラニン前駆体の製造においては、生体内と同様の酵 素反応を用いることによって、触媒による化学反応などで生じる副生成物を除去する ための複雑な精製操作を必要としな 、と 、うメリットがある。メラニン関連物質以外の 副生成物がほとんど存在しないことや天然に存在するものと同じメラニン前駆体を用 いるため、他の化学合成による製造法あるいは一般的な酸ィ匕染毛剤と比べて、安全 面でも優れた効果が期待される。
[0064] 本発明の染毛剤組成物の pHは 6〜11、更には 7〜10.5に調整することが好ましい。
pH調整には、例えば水酸ィ匕ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、アンモニア、グァニジン、ァ ルキルァミン、塩基性アミノ酸、炭酸塩等のアルカリ剤が用いられる。アルキルァミンと してはモノエタノールァミンが挙げられ、塩基性アミノ酸の具体例としては、アルギ- ン、リジン、ヒスチジン等が挙げられ、炭酸塩の具体例としては、炭酸ナトリウム、炭酸 カリウム、炭酸グァ-ジン、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。また、アルカリ剤と併用 して、塩酸、硫酸、リン酸、クェン酸、乳酸等の無機あるいは有機酸を適宜用いること ができる。 pH調整剤は、 2種以上を併用してもよぐまたその含有量は、全組成の 0.0 1〜20重量％、更には 0.1〜 10重量％が好まし!/、。
[0065] 染毛剤の補完成分として、水相溶性有機溶剤を含有させることができる。水相溶性 有機溶剤としては、エタノール、プロパノール等の低級アルコール；エチレングリコー ル、プロピレングリコール等のグリコール類；エチレングリコールモノメチルエーテル、 エチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、エチレングリコーノレモノブチノレエーテノレ等 のエチレングリコーノレモノエーテノレ；ジエチレングリコーノレモノェチノレエーテノレ、ジェ チレングリコールモノブチルエーテル等のカルビトール類；ベンジルォキシエタノール 、ベンジルアルコール等が挙げられ、なかでも上記低級アルコール及びグリコール類 が好ましい。水相溶性有機溶剤は、 2種以上を併用することもでき、特にベンジルォ キシエタノール、ベンジルアルコールを使用する場合は、他の溶剤、特に低級アルコ ール、グリコール類と併用するのが好ましい。水相溶性有機溶剤の含有量は、染色 性の点から、全組成の 5〜50重量％、更には 10〜40重量％、更には 15〜30重量％ が好ましい。
[0066] 本発明の染毛剤には、調色成分として、アミノ酸 (特にシスティン)や、既存の酸ィ匕 染料、直接染料 (酸性染料、塩基性染料、解離型染料)を添加することができる。そ れらの含有量は、 目的にもよるが 0.001〜5重量％、更には 0.01〜2重量％、更には 0. 05〜1重量％が好ましい。 [0067] 本発明の染毛剤組成物は、増粘剤の添カ卩による粘度の調整によってクリーム、ゲル 、ローション、フォーム等の形態をとることができる。増粘剤としては、ヒドロキシェチル セノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロースとグリシジノレトリメチノレアンモニゥムクロリドと のエーテノレ、メチノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロース等のセノレロース誘導体； キサンタンガム、グァーガム等の天然ガム類;ポリビニルピロリドン、架橋型ポリアタリ ル酸又はその塩、ポリアクリル酸又はその塩、ポリアクリルアミド等の合成高分子が挙 げられる。これらの配合する種類や配合量は、 目的粘度によって決定することができ 、粘度は 100〜50000mPa'sが好ましい。本発明の染毛剤組成物は、増粘しない場合 には軽い使用感が得られるが、増粘剤を添加して増粘させることにより、染色力を損 なうことなぐまた液だれの心配なく使用することができる。
[0068] また、本発明の染毛剤組成物には、起泡剤及び Z又は均一化剤として、非イオン 界面活性剤を含有させることができる。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシェチ レンォレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル等のポリオキシェチレ ンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル、ポリオキシェチレ ンォクチルフエニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリ ォキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルキロールアミド、ポリオキシェ チレン- sec-テトラデシルエーテル等が挙げられる。非イオン界面活性剤の含有量は 、 0.01〜30重量％、更には 0.1〜10重量％が好ましい。
[0069] また、本発明の染毛剤組成物には、安定性確保のためには酸ィ匕防止剤の添加が 望ましい。酸化防止剤としては、ァスコルビン酸、ァスコルビン酸ナトリウム、ァスコル ビン酸エステル等のァスコルビン酸類、亜硫酸ナトリウム等の無機塩類、システィン、 Nァセチルシスティン等のシスティン誘導体、ローズマリーエキス、茶エキス等の抗酸 化作用を示す植物エキス、トコフエロール、酢酸トコフエロール等のビタミン類、 BHT 等のスカベンジャー類などが挙げられる。これらのうち、ァスコルビン酸類が好ましぐ 使用 pHを考慮すると、ァスコルビン酸ナトリウムが好ましい。そのほか安定性を向上さ せる成分として、 EDTA又はその塩、 1-ヒドロキシェタン- 1,1-ジホスホン酸又はその塩 等のキレート剤を使用することもできる。
[0070] 本発明の染毛剤組成物には、上記成分以外に、通常の染毛剤に用いられる成分、 例えば上記以外の界面活性剤、安定化剤、緩衝剤、香料、感触向上剤、キレート剤 、可溶化剤、防腐剤等を、 目的に応じ、適宜配合することができる。
[0071] 本発明の染毛剤組成物の好ましい形態としては、繰り返し使用する徐染型染毛剤 が挙げられる。また、エアゾールの形態が好ましい。
[0072] 本発明の染毛剤組成物をエアゾール型とするには、耐圧容器 (エアゾール缶等）に 、染毛剤組成物と共に噴射剤を充填すればよい。噴射剤としては、一般にエアゾー ル製品に用いられる圧縮ガス、液ィ匕ガス等が使用でき、圧縮ガスとしては、窒素ガス 、炭酸ガス、アルゴンガス等が、液ィ匕ガスとしては、液ィ匕石油ガス、低級飽和炭化水 素類、ジメチルエーテル等が挙げられる。これらの噴射剤は、 2種以上を併用すること もでき、適度な噴射速度を得るために、全組成中に 1〜20重量％、更には 3〜15重量 %含有させるのが好ましい。また充填後のエアゾール缶の内圧が 3〜5kg/cm2G (25 °C)となるように調整するのが好ましい。
[0073] また、本発明の酸ィ匕工程で得られたメラニン前躯体を酸ィ匕重合し、分子量 3000以 上のみのメラニンとして、毛髪用化粧料 (リーブオンタイプ、あるいは洗い流しタイプ） に配合可能である。このような毛髪ィ匕粧料としては、例えばシャンプー、リンス、コンデ イショナ一、スタイリング剤、セット剤、パーマ剤、ワックス、艷出し剤、育毛剤等が挙げ られる。剤型としては、エアゾール、フォーム、クリーム、液状、ペースト等が挙げられ る。
実施例
[0074] 製造例 1 メラニン前駆体の製造
1.ァスぺノレギノレス ·ォリゼのチロシナーゼ遺伝子のクローニング
麹菌 Aspergillus oryzaeの melBチロシナーゼ遺伝子をクローユングした。 麹菌 Aspergillus oryzae OSI- 1013株（FERM P- 16528)を蒸米に接種し、製麹した 麹を 1.5g秤量し、液体窒素中で完全に破砕した。 日本ジーン社製 ISOGENを用いて 、 240 μ gの全 RNAを抽出した。 120 μ gの全 RNAからタカラバイオ株式会社製 Oligotex - dT30〈Super〉を用いて、 1 μ gの mRNAを精製した。この mRNAを、 Clontech社製 SMA RT cDNA Library Construction Kitにより cDNAライブラリーを作成し、 PCRにより melB cDNAのみを増幅した。 得られた PCR産物はァガロースゲル電気泳動で、目的の約 1.8Kbpのバンドのみが 増幅されていることを確認した。また、塩基配列解析の結果、正常にイントロン配列が 取り除かれて!/ヽることも確認した。
[0075] 2.酵母への組み込み
上記 1により得られた cDNAを、 Invitrogen社製大腸菌用発現ベクター pET23b、酵母 Saccharomyces cerevisiae用発現ベクター（特開 2003- 265177号公報）、麹菌 Aspergill us oryzae発現ベクター（特開 2001-224381号公報）に発現可能な状態で接続するこ とにより、各菌体内でのチロシナーゼの大量発現が可能となる。
特に、酵母における発現例（特開 2003-265177号公報に準じる）を示すと、 SED1プ 口モーターと ADH1ターミネータ一を持つ発現ベクターのプロモーター直下の Smal部 位に、 PCRにより増幅した melB cDNAを挿入した。 URA3マーカー内部に存在する Stu I部位で切断することにより得られる melB cDNAを含む断片を導入用カセットとして精 製した。このとき、宿主としての酵母は、清酒の醸造に用いられる実用酵母'協会 9号 由来のゥラシル要求性株を用いた。
[0076] 3.組換え酵母のチロシナーゼ活性ィヒと測定
(3-1)チロシナーゼ活性測定
菌体のチロシナーゼ活性の測定は次のようにして行った。菌体の一部を水に懸濁 し、その O.lmLに 30°Cの 10mM L- DOPA (0.005Nの塩酸に溶解） 0.8mL及び 1Mリン 酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0) 0.1mLを添カ卩し、 30°Cで 5分間反応させた後、 15,000rpm で 30秒間遠心分離を行うことにより菌体を取り除き、 DOPAの吸収極大波長である 475 における吸光度を測定した。菌体量は、反応後の反応液の 475nmにおける吸光度 力 1 0.3に収まるように調整した。
[0077] (3-2)チロシナーゼの活性化処理
前記 2で得られた組換え酵母を常法により培養し、遠心分離によって菌体を回収し 、次いで蒸留水で洗浄した。菌体を、菌体重量の 10倍程度の、 2mMの硫酸銅を含む 50mM Tris-HCl緩衝液 (pH8.0)に懸濁し、 4°Cでー晚静置した。菌体を遠心分離に より回収し、過剰な銅イオンを除去するため 0.1Mの EDTA溶液で洗浄した。洗浄した 後の菌体を 0.2Mの酢酸緩衝液 (pH3.0)に懸濁し、室温で 1時間静置した。活性化後 の菌体は遠心分離で回収し、活性化菌体とした。
活性ィ匕菌体のチロシナーゼ活性を上記 (3-1)の測定方法により測定したところ、 1.9 〜4.4 U/OD であった。このようにして測定した各形質転換株を以下に用いた。
600
[0078] 4.ドーパクロムの蓄積反応
上記 3で得られた酵母の形質転換体を用いて、 L-DOPAを基質としてメラニン前駆 体であるドーパクロムの蓄積反応を行った。
7.9gの L-DOPAを 0.03Nの硫酸 500mLに溶解させた後、 2Nの水酸化カリウムを用 いて PH5.5に調整した。この L- DOPA溶液に、手順 3により得られた組換え酵母菌体 を 2.7 X 105 U/L (反応液 1Lあたり菌体の活性値が 1.35 X 105 U/Lとなる量）を、 5L容 反応槽に投入し、反応液量を 2Lとして反応を開始した。
反応温度は 25°Cとなるように、調節した。反応開始直後は大量の酸素が必要である ため、通気量及び攪拌速度を最大とした。硫酸及び水酸ィ匕カリウムの添カ卩によって p Hを 5.5に調節した。 40分間反応を行った。
反応液中の撹拌及び通気量は DO (容存酸素量)を指標に 2〜7ppmに調節した。 反応中に適宜サンプリングを行い、下記に示す定量方法でドーパクロム、 5,6-ジヒド ロキシインドールを測定した。反応液中の L-DOPA濃度及びメラニン前駆体濃度の 推移を図 1に示す。
この反応条件では 5,6-ジヒドロキシインドールカルボン酸の生成はごくわずかである ことから、前駆体濃度はドーパクロム濃度と 5,6-ジヒドロキシインドール濃度の合計で 示した。条件により多少異なるが、反応終了時のドーパクロム濃度は、 5,6-ジヒドロキ シインドール濃度よりも 3〜5倍高ぐ主成分はドーパクロムといえる。なお、 L- DOPA を完全に消費した (HPLCによる測定の検出限界以下)状態をもって、反応終了の判 断基準を設定した。この検出限界以下の状態をもって、実質的に含まれないと定義 する。
メラニン前駆体濃度の経時的変化と、記録してぉ 、た酸素濃度及び PH維持のため の酸、アルカリ添加量の経時的変化などを照合し、なお、 DOPAを完全に消費するた めに、 40分間反応を行った。
[0079] <メラニン前駆体の各成分の定量方法 > メラニン前駆体は、 Waters社製 HPLC Alliance2695-2996を用いて、以下の条件で 各成分を検出及び定量した。
成分の分離には Imtakt社製逆相カラム Unison UK-C18 (4.6 X 150mm)を用い、移 動相として 1.5%リン酸溶液 (A液)及び 99.9%メタノール (B液)を用い、移動相中の B 液が初発 0%、 5分後に 50%となるようにグラジェントを設けた。流速は 1.0mL/minとし た。
注入するサンプルは、サンプル 10 Lに対し、 20mMの亜ニチオン酸ナトリウム（Na
2
S 0 )を 100 L及び 1.5%のリン酸（H PO )溶液を 890 L添カ卩し、 0.45 mのフィルタ
2 4 3 4
一で濾過することにより調製した。これを上記カラムに 20 L注入して測定を行った。 ドーパの検出は、極大吸収波長である 280應における吸光度でモニターした。ドー パクロムは上記測定条件では還元されたロイコドーパクロム（5,6-ジヒドロキシインドリ ン- 2-カルボン酸）として定量される。 5,6-ジヒドロキシインドールは標準物質（5,6-ジ ァセトキシインドールのアルカリ加水分解物）を元に定量し、 5,6-ジヒドロキシインドー ル- 2-カルボン酸は 280nmにおけるピークエリア面積の比率で比較した。 5,6-ジヒドロ キシインドールの極大吸収波長は 300nmであり、 5,6-ジヒドロキシインドールカルボン 酸の極大吸収波長は 320nmである。
5.メラニン前駆体溶液の除タンパク
上記 4の工程で得たメラニン前駆体溶液は、強固な細胞壁を有する酵母細胞を用 V、て 、るため、メラニン前駆体溶液中に存在する菌体の破片ゃ菌体から流出したタ ンパク質は存在しないか、又はほとんど存在しない。しかし、染毛剤として用いる場合 、微量に含有するタンパク質がアレルゲンとなる可能性があるため、限外ろ過によりタ ンパク質除去を行った。
限外ろ過装置として、ダイセンメンブラン社製限外濾過モジュール ·モルセップ FS10 -FUS0181 (分画分子量 1万）を用いた。ろ過により得られた溶液を SDS-PAGEに供し 、銀染色を行うことにより、除タンパクされていることを確認した。一般に行われている ように 280應における吸光度を測定する方法を採用しな力つたのは、ドーパクロム自 身が 280nm付近に吸収を持つこと、及び、インドールの反応性が高いため呈色試薬 と反応し易いなどの理由による。銀染色の結果、限外濾過後はタンパク質と考えられ るバンドは検出されな力つた。
[0081] 6. ドーパクロムから 5,6-ジヒドロキシインドール及び 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-力 ルボン酸への変換 (メラニン前駆体の変換方法）
上記 5の工程で得られた溶液に含まれるメラニン前駆体は主にドーパクロム、すな わち 5,6-ジヒドロキシインドリン- 2-カルボン酸である力 染毛剤として染毛性能ある!/ヽ は保存安定性に優れている 5,6-ジヒドロキシインドール及び 5,6-ジヒドロキシインドー ル -2-カルボン酸を生成するために、非酵素的にメラニン前駆体を変換する処理を行 つた。方法は、 pH調整、有機溶媒の添加、リン酸緩衝液の添加、金属イオン処理な どであり、いずれの方法でも効率的に変換できた。
なお、以下に示すメラニン前駆体の存在比率は、 280 における吸光度の面積比 によるものである。
[0082] (6-1) pH調整による前駆体溶液の組成コントロール
上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液 (主にドーパクロムを含む）につ 、て pH による前駆体の調整を行った。酸素が存在しない状態とし、 40°Cで 2時間保存した。 酸性〜中性付近 (pH5以上 8未満)で処理すると、 5,6-ジヒドロキシインドールの比率 が高まり（前駆体中の 50%以上、最適条件では 80%以上）、 pH8 llで処理すると、 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の比率が高まった。なお、 pH2 4では沈 殿が生成し、処理には不適であった。
[0083] (6-2)有機溶媒の添カ卩によるメラニン前駆体溶液の組成コントロール
上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液 (ドーパクロムを主に含む）に対し、全 量の 50容量％になるようにエタノールを添カ卩し、室温で 2時間処理した。ドーパクロム が効率的に 5, 6-ジヒドロキシインドールに変換された（5,6-ジヒドロキシインドールの 5, 6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸に対する比率 10倍以上）。エタノールに代え 、メタノール、アセトン、アセトン、 2-プロパノール又はァセトニトリルを使用した場合に も、同様の効果が認められた。
また、上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液に対し、全量の 50容量％になる ように、 2-アミノエタノールを添加し、室温で 2時間処理した。ドーパクロムが効率的に 5, 6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸に変換された（5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の 5,6-ジヒドロキシインドールに対する比率 5倍以上）。
[0084] (6-3)リン酸緩衝液による前駆体溶液の組成コントロール
上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液 (ドーパクロムを主に含む）に、 1Mリン 酸緩衝液を添加することにより、メラニン前駆体を含む PH6.0の 0.1Mリン酸緩衝液とし た。この前駆体溶液を— 20°C程度で 7日間保存した。酸成分としてリン酸を含むリン 酸緩衝液中で低温保存することにより、ドーパクロムが効率よく 5,6-ジヒドロキシインド ール- 2-カルボン酸に変換された（5, 6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の 5,6- ジヒドロキシインドールに対する比率 5倍以上)。
[0085] (6-4)塩ィ匕ナトリウム又はァスコルビン酸ナトリウムによる前駆体溶液の組成コントロー ル
上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液 (ドーパクロムを主に含む）に、最終濃 度 2.5%になるように塩ィ匕ナトリウムを添加し室温で 45分間静置すると、ドーパクロムの 5,6-ジヒドロキシインドールへの変換が無添加系に比べ促進した。また、塩化ナトリウ ムの代わりに、ァスコルビン酸ナトリウム溶液を添加すると、著量の 5,6-ジヒドロキシィ ンドールが蓄積した (メラニン前駆体中の 5,6-ジヒドロキシインドールの存在比率 90%
) o
[0086] (6-5)銅 (II)塩によるメラニン前駆体溶液の組成コントロール
上記 5の工程で得られたメラニン前駆体溶液 (ドーパクロムを主に含む）に最終 lm Mとなるように硫酸銅を添カ卩して、室温で 15分間静置し、ドーパクロムの 5,6-ジヒドロキ シインドール- 2-カルボン酸への変換が促進された（5, 6-ジヒドロキシインドール- 2-力 ルボン酸の 5,6-ジヒドロキシインドールに対する比率 3倍以上）。
[0087] 7.メラニン前駆体溶液の濃縮
メラニン前駆体溶液（ドーパクロム、 5, 6-ジヒドロキシインドール及び 5,6-ジヒドロキシ インドール- 2-カルボン酸など）は以下のようにして濃縮できた。濃縮には、海水から 純水を製造するのに用いられるクロスフロー型逆浸透濃縮装置（日東電工マテックス 社製)を用いた。この装置は、メラニン前駆体溶液を入れた密閉タンクと逆浸透濃縮 モジュール NTR7410-HG-S4Fとの間で溶液を循環させるものであり、逆浸透濃縮モ ジュールにより生成する純水は、このモジュールから透過水タンクに導かれる。純水 の生成に伴い、タンク内にメラニン前駆体が濃縮される。循環はポンプにより圧力 2M Paで行った。約 30分間の操作により手順 5で得られた約 31Lのメラニン前駆体溶液が 約 4Lに濃縮された。この濃縮操作中にメラニン前駆体透過液中には高分子メラニン はほとんど生成しておらず、指標とした 5,6-ジヒドロキシインドール濃度は約 9mMから 約 67mMに上昇し、回収率は極めて高かった。
[0088] 実施例 1
1.染毛剤組成物の調製
(1)染毛剤用のメラニン前駆体糸且成物として以下のものを用いた。
チロシナーゼ活性：1.9 4.4 U/OD を有する麹菌由来のチロシナーゼ遺伝子 (m
600
elB)を導入した組換え酵母（Saccharomyces cerevisiae)を用いた酸化工程で約 20m Mの L-DOPAより生成したドーパクロム（約 10 15mM)を遠心分離の上清として回収 した（工程収率:約 50 65%)
更に、 pH6付近での処理及び限外濾過、逆浸透膜濃縮により約 1重量％のメラニン 前駆体溶液 1を得た。本溶液は、 HPLC法にて 280 でメラニン前躯体として検出さ れるものは、その 90%以上が 5, 6-ジヒドロキシインドールであり、 5, 6-ジヒドロキシイン ドール- 2-カルボン酸はその 10%以下であった。インドリン類は 1%以下であった。出 発物質の L-DOPAは検出されな力つた。インドリン類は 1%以下であった。出発物質 の L-DOPAは検出されなかった。タンパク質が含まれていないことは、 SDS-ポリアタリ ルアミド電気泳動法により確認した。本方法により染毛剤に適した 5,6-ジヒドロキシィ ンドールを主成分 (メラニン前躯体含有量の 90%以上）とするメラニン前躯体を効率 的に製造することができた。
[0089] (2)上記メラニン前駆体溶液 1を 30g (メラニン前駆体として約 0.3gを含む)用いて下記 組成の染毛剤 (本発明品 1) 100gを調製した。調製に当たっては酸素の混入を防ぐた め、嫌気条件下で行った。これを原液とし、それぞれを噴射剤 (LPG)と共にエアゾー ル容器に充填した (原液：噴射剤 = 90 : 10,重量比)。
[0090] メラニン前駆体溶液 1 30g (メラニン前駆体として約 0.3g)
キサンタンガム 0.2g
アンモニア水（28重量0 /0) 0.5g エタノーノレ 10g
ソフタノール 90 (日本触媒社製） 0.5g
水 バランス
酸化防止剤 M. _
合計 100g
[0091] 2.染毛試験 (測色計による評価）
1で得られた染毛剤 lgを白髪トレス lgに適用し、 30°Cで 15分間染色した。その後、 水洗、シャンプー、ヘアリンス、次いで乾燥した。 7日おきにこの操作を計 5回繰り返し た。染色したトレスを分光測色計 (ミノルタ社製 CM-2002)により測色し、下式に従って 算出した色差（ Δ E)により評価した。
[0092] A E= {(L -L )2+(a— a )2+(b— b )2}1/2
1 0 1 0 1 0
(L ,a ,b )：染色前の白髪トレスの測色値
0 0 0
(L ,a ,b )：染色後の白髪トレスの測色値
1 1 1
白髪トレスの Δ Ε値は、 1回目： 15、 3回目： 28、 5回目： 38となり、徐々に黒くなつた。
[0093] 3.安定性
40°C保存、 2週間後の HPLCによるメインピークの定量値はほとんど変化せず、高い 安定性が確認された。
[0094] 実施例 2 染毛剤組成物（フォームタイプ）
メラニン前駆体溶液 1を 5g (メラニン前駆体として約 0.05gを含む）、ソフタノール 90を 0.5g、キサンタンガムを 0.1g、塩化ステアリルトリメチルアンモ-ゥムを 0.3g、ポリオキ シエチレン ·メチルポリシロキサン共重合体を 0.01g、エタノールを 10g及び残部の水 を混合し、染毛剤 100gを調製した。調製に当たっては酸素の混入を防ぐため、嫌気 条件下で行った。これを原液とし、それぞれを噴射剤 (LPG)と共にエアゾール容器に 充填した (原液:噴射剤 = 90 : 10,重量比)。

Claims

請求の範囲
[1] チロシン又はその誘導体を出発物質とし、ァスペルギルス (Aspergillus)属、ニュー ロスポラ (Neurospora)属、リゾムコーノレ (Rhizomucor)属、トリコテノレマ (Trichoderma) 属及びべ-シリウム（Penidllium)属からなる群より選ばれる糸状菌に由来するカテコ ールォキシダーゼ活性を示す酵素又は細胞を用いて、メラニン前駆体に変換する酸 化工程 (A)を含む方法により製造されたメラニン前駆体を含有する空気酸化型染毛 剤組成物。
[2] メラニン前駆体力 酸ィ匕工程 (A)の後、 5,6-ジヒドロキシインドール及び Z又は 5,6- ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の濃度を高める処理を含む後処理工程 (B)を行 うことにより製造されたものである請求項 1記載の空気酸ィ匕型染毛剤組成物。
[3] 5,6-ジヒドロキシインドール及び Z又は 5,6-ジヒドロキシインドール- 2-カルボン酸の 濃度を高める処理が、（i)pH調整処理、（ii)水溶性有機溶媒の添加、（iii)無機塩の添カロ 、 Gv)緩衝液による処理、（V)酸ィ匕防止剤の添加から選ばれる 1種又は 2種以上である 請求項 2記載の空気酸化型染毛剤組成物。
[4] メラニン前駆体が、ァスペルギルス 'ォリゼ（Aspergillus oryzae)の melBチロシナー ゼ遺伝子、 melDチロシナーゼ遺伝子又は melOチロシナーゼ遺伝子にコードされるチ ロシナーゼと実質的に同一である酵素を用いて製造されたものである請求項 1〜3の Vヽずれかに記載の空気酸化型染毛剤組成物。
[5] メラニン前駆体力 カテコールォキシダーゼ活性を示す細胞として大腸菌（Escheric hia coli)、酵母又は糸状菌を用いて製造されたものである請求項 1〜3のいずれかに 記載の空気酸化型染毛剤組成物。
[6] メラニン前駆体が、 L-ドーパ (L- DOPA)を出発物質とし、その濃度が反応開始時に 1 5mM以上、反応終了時に O.lmM以下である酸ィヒ工程 (A)を経て製造されたものであ る請求項 1〜5のいずれかに記載の空気酸化型染毛剤組成物。
[7] メラニン前駆体中の 5,6-ジヒドロキシインドールの比率力 280nmにおける吸光度の 面積比で 60%以上である請求項 1〜6のいずれかに記載の空気酸化型染毛剤組成 物。
[8] DOPAエステル又はチロシンエステルを出発物質として用いて製造されたメラニン 前駆体を含有する請求項 1〜7のいずれかに記載の空気酸化型染毛剤組成物。 pH6〜llである請求項 1〜8のいずれかに記載の空気酸ィ匕型染毛剤組成物。 出発物質又は中間体であるドーパ（DOPA)又はドーノ ミン (Dopamin)を実質的に 含有しな 、請求項 1〜9の 、ずれかに記載の空気酸化型染毛剤組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007326804A (ja) * 2006-06-07 2007-12-20 Kao Corp 毛髪化粧料
JP2011045302A (ja) * 2009-08-27 2011-03-10 Gekkeikan Sake Co Ltd 微生物酵素製剤およびその製造方法

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2910282B1 (fr) 2006-12-21 2009-06-05 Oreal Composition de teinture directe comprenant un tensio-actif cationique, un bioheteropolysaccharide, un tensio-actif amphotere ou non ionique et un colorant direct
FR2910281B1 (fr) 2006-12-21 2009-10-16 Oreal Composition de teinture d'oxydation comprenant un tensio-actif cationique, un bioheterooolysacchardie, un tensio-actif amphotere ou non ionique et un precurseur de colorant
JP5570161B2 (ja) * 2009-08-27 2014-08-13 月桂冠株式会社 メラニン前駆体を含む染料溶液及びその製造方法
JP5511268B2 (ja) * 2009-08-27 2014-06-04 月桂冠株式会社 メラニン前駆体含有溶液及びその製造方法
US8231689B2 (en) * 2009-11-13 2012-07-31 Warner Babcock Institute For Green Chemistry, Llc Coloring composition containing an aromatic compound and an initiator
EP2501374A4 (en) * 2009-11-13 2013-11-06 Warner Babcock Inst For Green Chemistry Llc COLORING COMPOSITION CONTAINING AROMATIC COMPOUND AND INITIATOR
US8821839B2 (en) 2010-10-22 2014-09-02 Conopco, Inc. Compositions and methods for imparting a sunless tan with a vicinal diamine
US8118880B1 (en) * 2010-11-15 2012-02-21 Warner Babcock Institute For Green Chemistry, Llc Coloring composition containing L-DOPA and L-arginine and forming a non-covalent derivatization complex
US8398959B2 (en) 2010-12-06 2013-03-19 Conopco, Inc. Compositions and methods for imparting a sunless tan with functionalized adjuvants
US8961942B2 (en) 2011-12-13 2015-02-24 Conopco, Inc. Sunless tanning compositions with adjuvants comprising sulfur comprising moieties
WO2014020517A2 (en) * 2012-07-30 2014-02-06 Myko Tech Private Limited Production of extracellular tyrosinase enzyme using the fungus gliocephalotrichum for various applications
JP6045325B2 (ja) * 2012-12-12 2016-12-14 花王株式会社 毛髪化粧料
CN108042374A (zh) * 2013-06-28 2018-05-18 朋友株式会社 气溶胶式毛发化妆品组合物的第2试剂
EP2873412A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 Unilever PLC A hair colour composition and method of colouring hair
JP6659727B2 (ja) 2015-05-12 2020-03-04 ロレアル ケラチン繊維のための組成物
WO2017182373A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Evolva Sa Production of glycosylated melanin precursors in recombinant hosts
CN106109258B (zh) * 2016-07-06 2019-05-17 南京普瑞彩生物科技有限公司 黑色素前体物质染发剂的制备方法及其使用方法
WO2018013609A2 (en) 2016-07-11 2018-01-18 The Regents The University Of California Synthetic melanin nanoparticles uses thereof
CN107280995B (zh) * 2017-06-21 2020-06-16 曲阜师范大学 一种赖氨酸-出芽短梗霉黑色素生物染发剂及其制备方法
EP3669318A1 (de) * 2017-08-16 2020-06-24 Henkel AG & Co. KGaA Verfahren und vorrichtung zur computergestützten haarbehandlungsberatung
JP7303540B2 (ja) * 2019-06-21 2023-07-05 日本メナード化粧品株式会社 角質細胞のメラニンの染色液とそれを利用した染色方法
CN110575402A (zh) * 2019-11-05 2019-12-17 四川大学 一种人造黑色素彩色染发剂
WO2021096692A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 Northwestern University Artificial melanin nanoparticles and precursor molecules as hair dyes
CN110981782A (zh) * 2019-12-25 2020-04-10 广州星业科技股份有限公司 一种高效制备5，6-二羟基吲哚的方法
WO2021157413A1 (ja) * 2020-02-06 2021-08-12 住友ベークライト株式会社 化粧料、および、環式化合物またはその誘導体の製造方法
CN112972300A (zh) * 2021-02-02 2021-06-18 同济大学 一种聚多巴胺染发剂及其制备方法
CN113244119B (zh) * 2021-05-27 2022-10-04 天津大学 基于酶法氧化酪氨酸衍生物进行彩色染发的方法
CN114146029A (zh) * 2021-12-16 2022-03-08 四川美拉宁高分子材料有限公司 一种含曲霉发酵产物的黑色素仿生染发剂及其制备方法
CN115581629A (zh) * 2022-10-28 2023-01-10 天津大学 基于酶法氧化提高染发稳定性的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01233210A (ja) * 1988-03-15 1989-09-19 Kao Corp 染毛剤組成物及び染毛方法
JPH0377813A (ja) * 1989-08-19 1991-04-03 Rinjiro Saruno 毛髪用組成物
JPH07506359A (ja) * 1992-04-29 1995-07-13 ブリストルーマイヤーズ　スクイブ　カンパニー ５，６−ジヒドロキシインドールと亜塩素酸塩酸化剤を含む髪染め組成物及びそれによる染色法
JP2002191366A (ja) * 2000-12-27 2002-07-09 National Research Inst Of Brewing 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢ
JP2004201545A (ja) * 2002-12-24 2004-07-22 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＤ

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2539202A (en) * 1947-12-11 1951-01-23 Samuel M Peck Method of dyeing animal fibers
JPS5147778B2 (ja) * 1973-12-01 1976-12-16
US5492541A (en) * 1985-08-02 1996-02-20 Clairol Incorporated Dye compositions containing 5,6-dihydroxy indoles and a foam generator
WO1992000373A1 (en) * 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5413612A (en) * 1992-04-29 1995-05-09 Clairol Incorporated Composition and method for dyeing hair with indolic compounds in the presence of a chlorite oxidant
FR2698376B1 (fr) * 1992-11-20 1995-02-24 Oreal Procédé de préparation de pigments mélaniques par bioconversion et utilisation des pigments obtenus en cosmétique.
US5704949A (en) * 1996-02-16 1998-01-06 Clairol Incorporated Process for the manufacture of a hair dye product containing 5,6-dihydroxyindole
US5792220A (en) * 1997-05-16 1998-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Dyeing hair with melanin procursors in the presence of iodate and peroxide
JP3792467B2 (ja) 2000-02-15 2006-07-05 月桂冠株式会社 アスペルギルス属由来の新規なプロモーター
DE10100938A1 (de) * 2001-01-10 2002-07-11 Henkel Kgaa Indol-/Indolin-Hybridfarbstoffe und -hybridfarbstoffvorprodukte
JP4653333B2 (ja) 2001-03-30 2011-03-16 花王株式会社 インドール類又はインドリン類の製造法
JP3984025B2 (ja) * 2001-11-07 2007-09-26 花王株式会社 染毛剤組成物
JP4312980B2 (ja) * 2001-12-26 2009-08-12 花王株式会社 染毛剤組成物
JP2003265177A (ja) 2002-03-13 2003-09-24 Gekkeikan Sake Co Ltd タンパク質の高発現システム

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01233210A (ja) * 1988-03-15 1989-09-19 Kao Corp 染毛剤組成物及び染毛方法
JPH0377813A (ja) * 1989-08-19 1991-04-03 Rinjiro Saruno 毛髪用組成物
JPH07506359A (ja) * 1992-04-29 1995-07-13 ブリストルーマイヤーズ　スクイブ　カンパニー ５，６−ジヒドロキシインドールと亜塩素酸塩酸化剤を含む髪染め組成物及びそれによる染色法
JP2002191366A (ja) * 2000-12-27 2002-07-09 National Research Inst Of Brewing 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢ
JP2004201545A (ja) * 2002-12-24 2004-07-22 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＤ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1820491A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007326804A (ja) * 2006-06-07 2007-12-20 Kao Corp 毛髪化粧料
JP2011045302A (ja) * 2009-08-27 2011-03-10 Gekkeikan Sake Co Ltd 微生物酵素製剤およびその製造方法

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