JP2004201545A - 新規チロシナーゼ遺伝子melD - Google Patents
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Abstract
【効果】本遺伝子はチロシナーゼ活性を持っており、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止に利用することができる。また、この形質転換体を培養して本チロシナーゼを生産し、これを試薬として利用できるだけでなく、そのインヒビターのスクリーニングにも利用することができ、着色防止物質の開発も期待することができる。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規チロシナーゼ遺伝子に関するものである。本発明によれば、Aspergillus oryzaeより新規に単離したチロシナーゼ遺伝子を利用することにより、チロシナーゼを効率的に生産できるだけでなく、本チロシナーゼを用いたメラニンの製造、あるいはシミ・そばかすを防止するためのチロシナーゼ阻害剤の効率的なスクリーニングなど、様々な産業分野での利用を可能にするものである。
【0002】
【従来の技術】
食品が褐変する機構の一つにチロシナーゼによる、メラニン物質の生産があげられる。これは食品中のチロシンがチロシナーゼにより酸化されドーパ(DOPA)と呼ばれる物質に変化し、これが前駆体となってメラニンが合成されることによる。この反応には酸素が必要となるため、多くの場合食品が酸素にふれることにより、急速に褐変化が起こる。チロシナーゼによる食品の褐変化は、椎茸などのキノコ類からリンゴ、ナシなどの果実類まで多くの食品で見られる現象である。食品が褐変することは外観品質を著しく低下させることであり、褐変防止には多くの努力が払われてきている。
【0003】
清酒醸造においても、米麹が褐変し、最終的に酒粕中に黒い米粒として存在する「黒粕」現象が大きな問題となっている。清酒発酵中は米麹は清酒もろみ中に存在するため、酸素が必要なチロシナーゼによる酸化反応は起こらない。しかしもろみを圧搾し、酒粕を分離した時点で酸素に接触することになり、チロシナーゼによる酸化反応が進行し、麹部分のみが黒く褐変する。現在ではこのような褐反応を生じない、非褐変性の麹菌株を使用することにより黒粕を防止している。
【0004】
このよう褐変反応を遺伝子レベルで解析するため麹菌のチロシナーゼ遺伝子(melO)が取得されている(例えば、非特許文献1参照)。このmelO遺伝子には、チロシナーゼ活性を持つ蛋白がコードされており、確かにチロシナーゼ遣伝子であることが確認されている。しかしながら、本発明者らはこのmelO遺伝子の発現条件を検討した結果、本遺伝子は液体培養で強力に発現する遺伝子であり、固体培養(麹培養)ではほとんど発現していないことを明らかにした。これは米麹の褐変に関与するチロシナーゼはmelO遺伝子とは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされていることを強く示唆するものである。またこの新規チロシナーゼこそが、米麹の褐変現象はもとより味噌、醤油など麹を用いる食品の着色に大きく関与していると考えられる。従ってこれら醸造食品の褐変を防止するためには、melOとは異なる新規なチロシナーゼを単離して解析する必要がある。
【0005】
そこでフスマを用いた固体培養を行い、常法に従いmRNAを調製し、これよりcDNAライブラリーを作成した。このcDNAを網羅的に配列を決定し、EST情報を収集した。この中から、マッシュルームのチロシナーゼ遺伝子に対してホモロジーを示すクローンを抽出することができた。このESTクローンの配列を用いて、A.oryzaeゲノムライブラリーからチロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、EST配列情報から2種類のプローブを作成し、A.oryzaeゲノムDNAをテンペレートとしてPCR反応を行う。増幅されたDNA断片の塩基配列を決定し、抽出したESTクローンに対応したゲノムDNAであることを確認する。
【0006】
次に、このDNA断片をプローブとして、A.oryzaeのEMBL3ファージライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションにより目的(ポジティブ)クローンを抽出する。得られたポジティブクローンをテンペレートとして塩基配列を決定する。シーケンス解析用のプローブをいくつか作成することにより、プロモーター、ターミネーター領域を含むチロシナーゼ遺伝子の全塩基配列の決定に成功した。
【0007】
本チロシナーゼ遣伝子は、6つのイントロンに分断された7つのエキソンとして存在し、そのコーディング領域には616アミノ酸がコードされていた。melO遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは24%であったが、マッシュルームのチロシナーゼなどで保存性の高い領域については、さらに高いホモロジーを示した。以上の結果より、この遺伝子はチロシナーゼ遺伝子である可能性が高く、melB遺伝子と命名した。
【0008】
このmelB遺伝子の発現条件を検討するためノザン解祈を行った。DPY培地を用いた液体培養と白米を用いた麹培養を行い、それぞれの培養物から常法に従いRNAを抽出した。先のmelB遺伝子の一部をプローブとして、両方のRNAに対してノザンハイブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得られたRNAには全くシグナルが認められないのに対して、固体培養から得られたRNAには非常に強いハイブリダイズシグナルが検出された。これはmelB遺伝子が液体培養ではほとんど発現せず、固体培養(麹培養)で非常に強く発現していることを示すものである。
【0009】
本発明者らは、melB遺伝子について上記のことを見出し、これを特願2000−398616としてすでに出願してある(特許文献1参照)。
【0010】
【非特許文献1】
Biochim. Biophys. Acta., 1261(1), p.151, 1995
【0011】
【特許文献1】
特開2002―191366
【0012】
【発明が解決しようとする課題】
発明者が解決しようとする課題は、上記melO、melBのチロシナーゼ遺伝子以外にも褐変を起こすチロシナーゼ遺伝子が麹菌に存在する可能性を探り、その遣伝子を特定することにある。
【0013】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、ゲノム情報よりAspergillus oryzae中に存在するチロシナーゼ遺伝子を見つけ出すことにある。具体的には麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム情報の結果を解析し、その結果、チロシナーゼに相同性を示した予測遺伝子を見出した。これをmelDと命名した。
【0014】
次に、このmelD遺伝子の機能を推定するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。melD遺伝子コード領域(1.7kb)を大腸菌高発現用ベクターpET23b(Novagen社製)に挿入し、常法に従って形質転換体の培養を行った。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はpET23bで形質転換したものの菌体破砕液に比べて極めて高いチロシナーゼ活性を示した。
【0015】
従って、我々が単離したmelD遺伝子には、チロシナーゼ活性を有する蛋白がコードされており、このチロシナーゼが麹菌における褐変現象に関与していることが示された。このように本発明に係るmelD遺伝子は新規なものであって、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子あるいはその一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつを指示するものである(以下、単にmelD遺伝子ということもあり、その塩基配列を配列表の配列番号2、及び、図面の図4、図5に示す。)
【0016】
本発明において、このようにして単離したmelD遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、チロシナーゼ又はチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を製造するものである。なお、本発明において、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質にはチロシナーゼも包含するものであって、そのアミノ酸配列は配列番号1(図1〜図3)に示される。
【0017】
本発明によれば、このようにして製造した新規チロシナーゼ(又はその酵素活性を有するタンパク質)は、試薬として各方面で有効に利用することができるほか、メラニンの製造に用いることができる。また、そのインヒビターをスクリーニングすることにより、麹や各種飲食品の褐変防止剤あるいはシミ、そばかすなどの防止剤を新たに開発することも期待される。
【0018】
以下、本発明の詳細について述べる。
【0019】
まず、麹菌ゲノム解析コンソーシアムにより配布されたゲノム解析結果のうち、チロシナーゼに相同性を示した予測遺伝子Con1534 mid−Con1534−3973−r1について妥当性を検討した。
【0020】
本遺伝子はゲノムコンティグ1534番の逆鎖上にコードされ、36396−35397bpがプロモーター領域、35396−34020bpがコード領域、34019−33720bpがターミネーター領域、イントロンは含まないと予測されている。推定されるアミノ酸配列は、既に知られているA.oryzaeのチロシナーゼmelOと37%の相同性を示した。
【0021】
しかしながら、予測されるアミノ酸配列を詳細に検討したところ、上記アミノ酸配列はチロシナーゼ活性に必要とされる銅原子の配位領域Cu(A)を欠いていることが明らかとなった。そこで、melOおよび同じく既に知られているA.oryzaeのチロシナーゼmelBのアミノ酸配列を元に改めて解析を行ったところコード領域は35799−34020bpであることが示され、新たに予測されたアミノ酸配列にはCu(A)領域が含まれており正しく予測されていると考えられた。
【0022】
そこで、Con1534 mid−Con1534−3973ーr1に含まれる遺伝子をmelDと命名し、全長2677bpのうち、そのプロモーター領域は1−598bp、コード領域は599−2374bp、ターミネーター領域は2375−2677bpとした。開始コドンの−122bpにはTATA boxが存在した。
【0023】
新たに予測した遺伝子melDの配列を元にmelD遺伝子の単離を試みた。具体的には、ゲノム配列情報から2種類のプライマーを作成し、A.oryzaeゲノムDNAをテンペレートとして宝酒造株式会杜製Pyrobestを用いてPCR反応を行った。上記2種類のオリゴDNAの内、一方は、オリゴDNA#1であって、その塩基配列は配列番号3(図6)に示され、他方は、オリゴDNA#2であって、その塩基配列は配列番号4(図7)に示される。増幅されたDNA断片の塩基配列を決定し、予測したmelD遣伝子に対応したゲノムDNAであることを確認した。
【0024】
melDチロシナーゼ遺伝子は予測どおりイントロンを含まず、そのコーディング領域には592アミノ酸がコードされていた。melO遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは36%、melB遺伝子とは23%であったが、銅原子配位領域であるCu(A)、Cu(B)領域においてはいずれにおいてもアミノ酸配列が極めて良く保存されていた。
【0025】
次に、melD遺伝子の機能を確認するため、本遺伝子の大腸菌への導入を試みた。melD遺伝子のコード領域(1776bp)を大腸菌高発現用ベクターpET23b(Novagen社製)のEcoRIサイトに挿入し、melD発現プラスミドpET23b−melDを新たに構築した(図12)。これを特許生物寄託センターにFERM P−19069として寄託した。この新規組換えプラスミドpET23b−melDを常法にしたがって大腸菌に導入した。得られた新規形質転換体をEscherichia coli TmelD−14と命名した。
【0026】
得られた形質転換体を培養した。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液はpET23bで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いチロシナーゼ活性を示した。
【0027】
従って、我々が単離したmelD遺伝子には、チロシナーゼ活性を有するタンパク質がコードされていることが明らかとなった。このように本発明に係るmelD遺伝子は新規なものであって、既述のように、従来既知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコードする遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくとも1つを含有する遺伝子、から選ばれる少なくとも一つを支持するものである。
【0028】
さらに、本遺伝子産物であるmelDチロシナーゼの諸性質を検討したところ、pH依存性、酸活性化条件、基質反応性などいずれにおいても既存のチロシナーゼ(melB)とは異なる性質を有していた。
【0029】
以上のように、我々は既に単離されているチロシナーゼ遺伝子(melO、melB)とは異なる新規チロシナーゼ遺伝子(melD)を単離する事に成功した。
【0030】
【実施例1】
melD遺伝子の大腸菌への導入
melD遺伝子のコード領域(1776bp)をA.oryzaeゲノムDNAをテンペレートとして宝酒造株式会社製PyrobestによりオリゴDNA#3(配列番号5:図8)、オリゴDNA#4(配列番号6:図9)を用いて増幅した断片を制限酵素EcoRIで処理し、大腸菌高発現用ベクターpET23b(Novagen社製)のEcoRIサイトに挿入し、得られた組換えベクターpET23b−melD(FERM P−19069)を用いて常法にしたがって大腸菌の形質転換を行った。
【0031】
得られた形質転換体(Escherichia coli TmelD−14)をLB培地にて2日間液体培養した後、菌体破砕液のチロシナーゼ活性を常法にしたがって測定した。その結果、得られた形質転換体の菌体破砕液は、ベクター(pET23b)のみで形質転換したものの菌体破砕液に比べてきわめて高いチロシナーゼ活性を示した(表1)。
【0032】
【0033】
【実施例2】
melBとmelDの至適pHの同定
melBとmelDの精製酵素を用いてL−DOPAと反応液中でそれぞれ反応させた。反応のpHを3.2から7.6まで変化させ、その至適pHを調べた。いずれの酵素もpH5.6の時に活性が最大になった。その結果を図10(melB)、図11、(melD)に示す。図中、NaOAc−AcOHは酢酸ナトリウム緩衝液、NaPBはリン酸ナトリウム緩衝液、Tris−HClは塩酸トリス緩衝液をそれぞれ示す。
【0034】
【実施例3】
melB、melDの酸処理による活性化
チロシナーゼは酸処理によって活性化する。そこで、pHを2.2から6.0と変化させ、酸処理を行い、活性化させた。その結果を表2、表3に示す。
活性の大きさは最大の活性を100とした時の相対値(比活性)で示す。その結果、最大の活性化には、melDの方がより中性に近いpHが有効であった。
【0035】
【0036】
【0037】
【実施例4】
melB、melDのDOPAに対する反応性
melB、melDそれぞれの反応液中の酵素濃度は0.1mg/mlであり、いずれも酸処理活性化したものを用いた。また、反応は15℃で行った。その結果を表4、表5に示す。これによるとmelDはmelBに比べてDOPAに対する反応性が高いといえる。
【0038】
【0039】
【0040】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の褐変性を示すチロシナーゼ(melD)を大量に生産することが可能となり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止、着色防止物質の開発など様々な産業分野に利用することを可能にするものである。また本発明は、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画期的な技術である。
【0041】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】新規チロシナーゼ(melD)のアミノ酸配列を示す。
【図2】同上続きを示す。
【図3】同上続きを示す。
【図4】新規チロシナーゼ遺伝子melDの塩基配列を示す。
【図5】同上続きを示す。
【図6】オリゴDNA#1を示す。
【図7】オリゴDNA#2を示す。
【図8】オリゴDNA#3を示す。
【図9】オリゴDNA#4を示す。
【図10】melB由来酵素の至適pHを示すグラフである。
【図11】melD由来酵素の至適pHを示すグラフである。
【図12】melD発現用プラスミドpET23b−melDを示す。
Claims (7)
- 配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有するチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質。
- 下記の(A)、又は(B)に示す遺伝子のDNA。
(A)配列表の配列番号2に記載の塩基配列の内、請求項1に記載のタンパク質をコードする遺伝子のDNA。
(B)(A)に記載の遺伝子のDNA、あるいは、その一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、チロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のDNA。 - 請求項2に記載のDNAの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
- 組換えベクターpET23b−melD(FERM P−19069)。
- 請求項3又は4に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
- 宿主が大腸菌である請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項5又は6に記載の形質転換体を利用すること、を特徴とするチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質を生産する方法。
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