JP2002191366A - 新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 新規チロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＢ）の
クローニングが行われ、その塩基配列も決定された。ま
た、このクローニングされた上記の新規遺伝子をベクタ
ーに挿入することにより宿主（麹菌）を形質転換した。 【効果】 本遺伝子は固体培養で発現するという特徴を
有するものであり、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色
防止に利用することができる。また、この形質転換体を
培養して本チロシナーゼを生産し、これを試薬として利
用できるだけでなく、そのインヒビターのスクリーニン
グにも利用することができ、着色防止物質の開発も期待
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規チロシナーゼ
遺伝子に関するものであり、詳細には、特に固体培養に
おいて高発現する麹菌由来の新規チロシナーゼ遺伝子に
関するものである。本発明によれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅより新規に単離したチロシナーゼ
遺伝子を利用することにより、チロシナーゼを効率的に
生産できるだけでなく、清酒麹の褐変防止、醸造食品そ
の他の飲食品の着色防止、着色防止物質の開発など、様
々な産業分野での利用を可能にするものである。

【０００２】

【従来の技術】食品が褐変する機構の一つにチロシナー
ゼによる、メラニン物質の生産があげられる。これは食
品中のチロシンがチロシナーゼにより酸化されドーパ
（ＤＯＰＡ）と呼ばれる物質に変化し、これが前駆体と
なってメラニンが合成されることによる。この反応には
酸素が必要となるため、多くの場合食品が酸素にふれる
ことにより、急速に褐変化が起こる。チロシナーゼによ
る食品の褐変化は、椎茸などのキノコ類からリンゴ、ナ
シなどの果実類まで多くの食品で見られる現象である。
食品が褐変することは外観品質を著しく低下させること
であり、褐変防止には多くの努力が払われてきている。

【０００３】清酒醸造においても、米麹が褐変し、最終
的に酒粕中に黒い米粒として存在する「黒粕」現象が大
きな問題となっている。清酒発酵中は米麹は清酒もろみ
中に存在するため、酸素が必要なチロシナーゼによる酸
化反応は起こらない。しかしもろみを圧搾し、酒粕を分
離した時点で酸素に接触することになり、チロシナーゼ
による酸化反応が進行し、麹部分のみが黒く褐変する。
現在ではこのような褐変反応を生じない、非褐変性の麹
菌株を使用することにより黒粕を防止している。

【０００４】このような褐変反応を遺伝子レベルで解析
するため麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）が取得
されている（Biochim.Biophys.Acta.,1261(1)、p.151、
1995）。このｍｅｌＯ遺伝子には、チロシナーゼ活性を
持つ蛋白がコードされており、確かにチロシナーゼ遺伝
子であることが確認されている。しかしながら、本発明
者らはこのｍｅｌＯ遺伝子の発現条件を検討した結果、
本遺伝子は液体培養で強力に発現する遺伝子であり、固
体培養（麹培養）ではほとんど発現していないことを明
らかにした。これは米麹の褐変に関与するチロシナーゼ
はｍｅ１Ｏ遺伝子とは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子
にコードされていることを強く示唆するものである。ま
たこの新規チロシナーゼこそが、米麹の褐変現象はもと
より味噌、醤油など麹を用いる食品の着色に大きく関与
していると考えられる。従ってこれら醸造食品の褐変を
防止するためには、ｍｅｌＯとは異なる新規なチロシナ
ーゼを単離して解析する必要がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】発明者が解決しようと
する課題は、製麹等の固体培養でも褐変が依然として生
じている現状に鑑み、ｍｅｌＯとは異なる固体培養で大
量に発現するチロシナーゼ遺伝子を単離することであ
る。そしてこの新規チロシナーゼ遺伝子を用いて、米麹
の褐変防止など食品の褐変防止に広く利用することであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記した目的
を達成するためになされたものであって、先ず、既に単
離されているチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）の発現条
件についての検討を行い、その結果、ｍｅｌＯ遺伝子は
液体培養では大量に発現しているものの、固体培養（麹
培養）ではほとんど発現していないことを確認した。

【０００７】具体的には、ｍｅｌＯプロモーター下流に
レポーター遺伝子として大腸菌のβ−グルクロニダーゼ
（ＧＵＳ）遺伝子を連結したプロモーター解析用プラス
ミドを構築し、これを麹菌に導入して行った。すなわ
ち、この遺伝子導入株を、様々な培養条件で培養し、菌
体内のＧＵＳ活性を測定することにより、ｍｅｌＯプロ
モーター発現を定量化する。その結果、液体培養では４
０４０Ｕ／ｍｇと非常に高いＧＵＳ活性が得られたが、
固体培養では１／１００程度の活性しか認められなかっ
た。固体培養（麹培養）ではチロシナーゼ活性が認めら
れ、褐変化現象も起こる。これらの結果は、固体培養で
はｍｅｌＯとは異なる新規チロシナーゼ遺伝子が発現し
ていることを示唆するものであった。

【０００８】固体培養と液体培養で発現する遺伝子が異
なる現象は、既にグルコアミラーゼ遺伝子で証明されて
いる。すなわち、麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）には２種類
のグルコアミラーゼ遺伝子が存在する。１種類はグルコ
アミラーゼＡ遺伝子（ｇｌａＡ）であり、液体培養にお
いて発現し、固体培養ではほとんど発現しない。一方も
う１種類のグルコアミラーゼ遺伝子Ｂ（ｇｌａＢ）は固
体培養でのみ大量に発現する。そしてこのｇｌａＢ遺伝
子にコードされるグルコアミラーゼ蛋白は、糖含量が非
常に高いなど固体培養での活性維持に非常に有用な性質
を持っている。このように麹菌は、同じ活性を持つ酵素
であっても、培養条件によって異なる遺伝子を発現させ
ていることが明らかとなっている。チロシナーゼにおい
ても液体培養と固体培養では異なる遺伝子が発現されて
いる可能性は非常に高い。

【０００９】そこで、固体培養で発現しているチロシナ
ーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、フスマ培養を
行ったＡ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍＲＮＡを調製し、
このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡライブラリーを構築
する。このライブライリーの塩基配列を網羅的に決定
し、各配列と既知遺伝子データーベースとのホモロジー
を検索する。これらのｃＤＮＡクローンからの糸状菌チ
ロシナーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを検
索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅの新規チロシナ
ーゼ遺伝子を単離する。単離したチロシナーゼ遺伝子の
ノザン解析を行うことにより、本遺伝子が固体培養で特
異的に発現している遺伝子であることを確認する。

【００１０】また本遺伝子のアンチセンスＲＮＡ解析等
を行うことにより、本遺伝子がチロシナーゼ活性を持つ
蛋白をコードしかつ、米麹の褐変現象に関与しているこ
とを証明する。以下に、本発明の詳細について述べる。

【００１１】まずｍｅｌＯ遺伝子と米麹の褐変性を検討
するため、ｍｅｌＯプロモーターの発現解析を行った。
まずＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ１）
（Ｈ. Ishidaら、J. Ferment． Bioeng．８６、 301-30
7、1998 ）のPstＩ、SalＩギャップに、melO遺伝子の開
始コドンATG上流１１００ｂｐを挿入し、図９に示すよ
うなプロモーター解析用プラスミドを構築する。このプ
ラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーターの
支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することに
なり、ＧＵＳ活性を測定すればプロモーターの発現量が
定量化できる。作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚ
ａｅ １０１３−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子
であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復
した株を形質乾換体として選択した。さらに得られた形
質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが染
色体のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれ
た株をｍｅｌＯプロモーター解析株として以下の検討を
行った。このｍｅｌＯ解析株を液体培養と固体培養（米
麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測定した。その
結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性
が認められたのに対して、固体培養では４８Ｕ／ｍｇと
非常に低い活性しか得られなかった。

【００１２】更に、培養温度に対する影響についても検
討した。固体培養で特異的に発現する遺伝子ｇｌａＢ
は、培養温度を４０℃以上の高温で培養すると発現誘導
が認められ、実際の米麹培養においても培養後期に品温
が４０℃以上にまで上昇する。しかしｍｅｌＯ遺伝子
は、高温では発現が抑制され、逆に２０℃などの低温で
発現誘導が認められた。これらの結果は、ｍｅｌＯ遺伝
子は固体培養、特に麹培養においてほとんど発現してい
ないことを示している。しかしながら、固体培養におい
てもチロシナーゼ活性は認められ、褐変現象も起こって
いる。これは固体培養で生産されるチロシナーゼはｍｅ
ｌＯとは異なる新規なチロシナーゼ遺伝子にコードされ
ていることを強く示唆するものである。

【００１３】そこでフスマを用いた固体培養を行い、常
法に従いｍＲＮＡを調製し、これよりｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。このｃＤＮＡを網羅的に配列を決定
し、ＥＳＴ情報を収集した。この中から、マッシュルー
ムのチロシナーゼ遺伝子に対してホモロジーを示すクロ
ーンを抽出することができた。このＥＳＴクローンの配
列を用いて、Ａ．ｏｒｙｚａｅゲノムライブラリーから
チロシナーゼ遺伝子の単離を試みた。具体的には、ＥＳ
Ｔ配列情報から２種類のプローブを作成し、Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅゲノムＤＮＡをテンペレートとしてＰＣＲ反応を
行う。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、抽出
したＥＳＴクローンに対応したゲノムＤＮＡであること
を確認する。

【００１４】次に、このＤＮＡ断片をプローブとして、
Ａ．ｏｒｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーか
ら、プラークハイブリダイゼーションにより目的（ポジ
ティブ）クローンを抽出する。得られたポジティブクロ
ーンをテンペレートとして塩基配列を決定する。シーケ
ンス解析用のプローブをいくつか作成することにより、
プロモーター、ターミネーター領域を含むチロシナーゼ
遺伝子の全塩基配列の決定に成功した。

【００１５】チロシナーゼ遺伝子は、６つのイントロン
に分断された７つのエキソンとして存在し、そのコーデ
ィング領域には６１６アミノ酸がコードされていた。ｍ
ｅｌＯ遺伝子とのアミノ酸レベルでのホモロジーは２４
％であったが、マッシュルームのチロシナーゼなどで保
存性の高い領域については、さらに高いホモロジーを示
した。以上の結果より、この遺伝子はチロシナーゼ遺伝
子である可能性が高く、ｍｅｌＢ遺伝子と命名した。

【００１６】このｍｅｌＢ遺伝子の発現条件を検討する
ためノザン解祈を行った。ＤＰＹ培地を用いた液体培養
と白米を用いた麹培養を行い、それぞれの培養物から常
法に従いＲＮＡを抽出した。先のｍｅｌＢ遺伝子の一部
をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイブ
リダイゼーションを行った。その結果液体培養から得ら
れたＲＮＡには全くシグナルが認められないのに対し
て、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハイブ
リダイズシグナルが検出された。これはｍｅｌＢ遺伝子
が液体培養ではほとんど発現せず、固体培養（麹培養）
で非常に強く発現していることを示すものである。

【００１７】次に、ｍｅｌＢ遺伝子の機能を推定するた
め、本遺伝子の麹菌への導入を試みた。プロモーター、
ターミネーターを含むｍｅ１Ｂ遺伝子（４．２ｋｂ）を
麹菌の形質転換用ベクターｐＩＮ９３に挿入し、麹菌宿
主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業技術研究所
寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）株に導入した。ｍｅｌ
Ｂ遺伝子を単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ
株：工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ
Ｐ−１８１３４）を用いて麹を作成した所、宿主株に較
べて高い褐変性を示した。次にこれらの麹の抽出液のチ
ロシナーゼを比較した結果、ＴｍｅｌＢ株の活性は宿主
株に比べて２倍に上昇していることが明らかとなった。

【００１８】従って、我々が単離したｍｅｌＢ遺伝子に
は、チロシナーゼ活性を有する蛋白がコードされてお
り、このチロシナーゼが麹菌の固体培養における褐変現
象に強く関与していることが示された。このように本発
明に係るｍｅｌＢ遺伝子は新規なものであって、従来既
知のチロシナーゼとは異なる新規チロシナーゼをコード
する遺伝子、該新規チロシナーゼ活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子、これらの遺伝子の少なくともひ
とつを含有する遺伝子、から選ばれる少なくともひとつ
を指示するものである（以下、単にｍｅｌＢ遺伝子とい
うこともあり、その塩基配列を配列表の配列番号２、及
び、図面の図４、図５、図６に示す。）

【００１９】本発明において、このようにして単離した
ｍｅｌＢ遺伝子は、これを宿主に導入して発現せしめ、
チロシナーゼ又はチロシナーゼ酵素活性を有するタンパ
ク質を製造するものである。なお、本発明において、チ
ロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質にはチロシナー
ゼも包含されるものであって、そのアミノ酸配列は配列
番号１（図１、図２、図３）に示される。

【００２０】本発明によれば、このようにして製造した
新規チロシナーゼ（又はその酵素活性を有するタンパク
質）は、試薬として各方面で有効に利用することがで
き、他方、このようにして単離したｍｅｌＢ遺伝子につ
いては、これを遺伝子破壊、遺伝子発現抑制等を行うこ
とによって、麹や各種飲食品の褐変を防止することがで
きるし、また、このｍｅｌＢ遺伝子にコードされるチロ
シナーゼは上記のように試薬として利用するほか、その
インヒビターをスクリーニングすることにより、麹や各
種飲食品の褐変防止剤を新たに開発することも期待され
る。以下、本発明の実施例について述べる。

【００２１】

【実施例１】ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での
発現強度 先ず、ｍｅｌＯ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強
度について、図９に示すプロモーター解析用プラスミド
ｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを構築し、これを用いて発現強度を
測定した。

【００２２】ＧＵＳ遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＧＳ
１）は、形質転換用マーカーであるＡ．ｏｒｙｚａｅの
ｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 21
8、p.99-104、1989）と、レポーター遺伝子である大腸
菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄ
Ａ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sc
i., p.8447-8451、1986）を含む。このプラスミドのｕ
ｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイ
ト）に、ｍｅｌＯプロモーターを挿入し、得られたこの
プラスミドを麹菌に導入すると、ｍｅｌＯプロモーター
の支配下でレポーター遺伝子（ＧＵＳ）が発現すること
になり、ＧＵＳ活性を測定すれば、プロモーターの発現
量が定量化できるのである。

【００２３】そこで本例においては、先述のｐＮＧＳ１
のＰｓｔ１／ＳａｌＩギャップに、ｍｅｌＯ遺伝子の開
始コドンＡＴＧの上流１１００ｂｐを挿入し、構築され
たプロモーター解析用プラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１
３：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１６５２８として既に寄託されている）の
ｎｉａＤ変異株（硝酸資化能欠損株、Ｎｉｔｒａｔｅ
Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ：本菌株は、工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７７０
７として既に寄託されている）に導入し、マーカー遺伝
子であるｎｉａＤ遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回
復した株を形質転換体として選択した。さらに得られた
形質転換体をサザン解析を行い、導入したプラスミドが
染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込ま
れた株をｍｅｌＯプロモーター解析株として、以下の検
討を行った。

【００２４】このｍｅｌＯ解析株について、液体培養と
固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測
定した。その結果、液体培養では４０４０Ｕ／ｍｇと非
常に高い活性が認められたのに対して、固体培養では４
８Ｕ／ｍｇと非常に低い活性しか得られなかった。この
ことから、麹の褐変にはｍｅｌＯ遺伝子は関与していな
いと考えられ、麹には他のチロシナーゼ遺伝子が存在す
ることが示唆された。

【００２５】

【実施例２】ｍｅｌＢ遺伝子のクローニング フスマ培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブ
ラリー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Ａ．ｏｒｙｚ
ａｅのｍｅｌＯ遺伝子に相同性の高いクローンＪＺ４４
９５を選択した。次にこのクローンをプローブとしてＥ
ＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリゼーＯ
−１０１３株（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託
ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の染色体ジーンライブラリ
ーより、プラークハイブリダイゼーション法によりｍｅ
ｌＢ遺伝子をクローニングした。プローブとしては、２
種類のオリゴＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡをＰＣＲ法に
より増幅したＤＮＡを用いた。

【００２６】上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、
オリゴＤＮＡ＃１であって、その塩基配列は配列番号３
（図７）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃２であっ
て、その塩基配列は配列番号４（図８）に示される。

【００２７】この方法により約１００００個のファージ
クローンの中から、上記のプローブとハイブリダイズす
るクローンλＴＲ９９を単離した。上記のオリゴＤＮＡ
をプライマーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列
を決定し、本クローンが確かに目的のｍｅｌＢ遺伝子で
あることを確認した。

【００２８】

【実施例３】ｍｅｌＢ遺伝子の塩基配列の決定 ポジティブクローンλＴＲ９９株をテンペレートとして
ｍｅｌＢ遺伝子の全塩基配列の決定を行った。プロモー
ター部分、コーディング領域、ターミネーター部分をあ
わせて４．２ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図
４、図５、図６）。上記配列の内、１位置から１４３６
位置までがプロモーター部分であり、１４３７位置から
３６３５位置までがコーディング領域であり、３６３６
位置から４１７４位置までがターミネーター部分であ
る。

【００２９】ｍｅｌＯ遺伝子とのホモロジー検索の結果
から、ｍｅｌＢ遺伝子には６つのイントロンが存在し、
そのコーディング領域は、２．２ｋｂｐであって（更に
詳細には、１４３７位置のＡＴＧから３６３５位置のＧ
ＣＣまでの２１９９ｂｐ）、塩基配列から推定されるタ
ンパク質は６１６残基であることが明らかとなった（配
列番号１：図１、図２、図３）。なお、ｍｅｌＯ遺伝子
とｍｅｌＢ遺伝子の構造の比較を下記表１に示す。

【００３０】 （表１） 遺伝子構造 ─────────────────────────────────── ｍｅｌＯ ｍｅｌＢ ─────────────────────────────────── エキソン ２ ７ イントロン １ ６ コーディング領域 １６７１ｂｐ ２１９９ｂｐ 生産物（アミノ酸残基） ５３９ａａ ６１６ａａ 分子量 約６７ｋＤａ 約７６ｋＤａ 発 現 液体培養 固体培養 ───────────────────────────────────

【００３１】

【実施例４】ｍｅｌＢ遺伝子の発現強度 ｍｅｌＢ遺伝子の固体培養と液体培養での発現強度につ
いて、実施例１と同様にして、図１０に示すプロモータ
ー解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを構築し、これ
を用いて発現強度を測定した。

【００３２】ｐＮＧＳ１のＰｓｔＩ／ＳａlＩギャツプ
に、ｍｅｌＢ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上流１．４ｋｂ
ｐを挿入し、プロモーター解析用プラスミドｐｍｅｌＢ
−ＧＵＳを構築した。（図１０）このプラスミドを麹菌
に導入すると、ｍｅｌＢプロモーターの支配下でレポー
ター遺伝子（ＧＵＳ）が発現することになり、ＧＵＳ活
性を測定すればプロモーターの発現量が定量化できる。
作成したプラスミドを麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ １０１３
−ｎｉａＤ株に導入し、マーカー遺伝子であるｎｉａＤ
遺伝子が導入されて、硝酸資化能が回復した株を形質転
換体として選択した。さらに得られた形質転換体をサザ
ン解析を行い、導入したプラスミドが染色体のｎｉａＤ
ｌｏｃｕｓに１コピーだけ組み込まれた株をｍｅｌＢ
プロモーター解析株として以下の検討を行った。

【００３３】このｍｅｌＢ解析株について、液体培養と
固体培養（米麹培養）を行い、菌体内のＧＵＳ活性を測
定した。その結果、液体培養では４５Ｕ／ｍｇと低い活
性しか得られなかったのに対して、固体培養では２８５
０Ｕ／ｍｇと非常に高い活性が得られた。また、液体培
養では褐変が認められなかったのに対し、固体培養では
褐変が認められた。このことから、麹の褐変にはｍｅｌ
Ｂ遺伝子が関与しているものと考えられた。

【００３４】また、ノザン解析を行った。上記と同じ液
体培養と固体培養（麹培養）を行い、それぞれの培養物
から常法に従いＲＮＡを抽出した。ｍｅｌＢ遺伝子の一
部をプローブとして、両方のＲＮＡに対してノザンハイ
ブリダイゼーションを行った。その結果液体培養から得
られたＲＮＡには全くシグナルが認められなかったのに
対して、固体培養から得られたＲＮＡには非常に強いハ
イブリダイズシグナルが検出された。

【００３５】

【実施例５】ｍｅｌＢ遺伝子の麹菌への導入 得られたプロモーター、ターミネーターを含むｍｅｌＢ
遺伝子（４．２ｋｂ）を麹菌の形質転換用ベクターｐＩ
Ｎ９３に挿入した、ｍｅｌＢ発現プラスミドｐｍｅｌＢ
−ｎｉａを構築した（図１１）。このｐｍｅｌＢ−ｎｉ
ａを麹菌宿主ｎｉａＤ変異株（工業技術院生命工学工業
技術研究所寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７）株に常法に
従い導入した。このようにして得た、ｍｅｌＢ遺伝子を
単コピーで導入した形質転換体（ＴｍｅｌＢ−１１株）
をアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）ＴｍｅｌＢ−１１と命名し、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１８１３４
として寄託した。そして、この形質転換体（ＴｍｅｌＢ
−１１株）を用いて麹を作成した。

【００３６】その結果、遺伝子導入株では宿主株に比べ
て高い褐変性が観察された。このことから遺伝子導入株
ではｍｅｌＢが強く発現していることが示唆された。

【００３７】

【実施例６】ｍｅｌＢ遺伝子を利用した麹の褐変防止 ｍｅｌＢ遺伝子を抑制するために、まずｍｅｌＢのアン
チセンス遺伝子を作成した。これをアスペルギルス・オ
リゼーＭ−ＮＳ４（国税庁醸造研究所より分与）に導入
し、固体培養（麹培養）を行った。これにより通常のｍ
ｅｌＢのｍＲＮＡがアンチセンス遺伝子のｍＲＮＡと結
合し、蛋白を作れなくなる。その結果、アンチセンス遺
伝子を導入した株の麹の褐変が抑制された。

【００３８】また、次に上記の株にｍｅｌＢのパーシャ
ル遺伝子を多コピー導入し、固体培養（麹培養）を行っ
た。これによりタイトレーションが起こり、本来のｍｅ
ｌＢの働きが弱くなる。その結果、やはり麹の褐変が抑
制された。これらのことから、ｍｅｌＢを抑制すること
により、麹の褐変が抑制されることが分かった。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、麹菌の褐変性を持つチロ
シナーゼ（ｍｅｌＢ）を大量に生産することが可能とな
り、清酒麹の褐変防止、醸造食品の着色防止、着色防止
物質の開発など様々な産業分野に利用することを可能に
するものである。また本発明は麹菌の酵素を麹菌で生産
させるため、生産される酵素蛋白は非常に安全性が高
く、食品、医薬品、化粧品産業などへも応用が可能な画
期的な技術である。

【００４０】

【配列表】 <110> Gekkeikan Inc., Ltd. <120> Novel Tyrosinase-encoding Gene melB <130> 6365 <141> 2000-12-27 <160> 4 <210> 1 <211> 616 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 1 Met Pro Tyr Leu Ile Thr Gly Ile Pro Lys Asp Pro Lys His Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Arg Lys Asp Ile Asp Asp Trp Tyr Leu Glu Gln Thr Ser Ala 20 25 30 Gly Ser Asn Arg Ile Gln Leu Thr Leu Phe Val Glu Ala Leu Thr Val 35 40 45 Ile Gln Asn Arg Pro Leu Asn Asp Gln Leu Ser Tyr Phe Arg Leu Ala 50 55 60 Gly Ile His Gly Ala Pro Trp Thr Glu Trp Asp Gly Val Pro Gly Gly 65 70 75 80 Gln Lys Asp Ser Lys Gly Asn Pro Thr Gly Phe Cys Val His Asn Asn 85 90 95 Tyr Thr Phe Pro Thr Trp His Arg Val Tyr Val Thr Leu Tyr Glu Gln 100 105 110 Val Ile Tyr Glu Ala Met Leu Asp Phe Ile Lys Gln Asn Val Pro Gln 115 120 125 Asn Gly Lys Ala Asp Trp Glu Asn Glu Ala Lys Gln Trp Arg Leu Pro 130 135 140 Tyr Trp Asp Phe Ala Arg Phe Ala Arg His Gly His Asp Asn Thr Gln 145 150 155 160 Gly Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ile Leu Val Thr Met Pro Met Val Lys 165 170 175 Val Leu Val Pro Gly Gln Pro Gly Lys Gln Leu Ser Lys Pro Asn Pro 180 185 190 Leu Tyr Arg Phe Gln Met Gln Thr Leu Met Gly Thr Leu Glu Arg Pro 195 200 205 Tyr Ala Ile Thr Ser Gln Lys Thr Glu Glu His Gly Trp Ser Phe Asp 210 215 220 Leu Pro Phe Asp Lys Cys Gln Ser Thr Thr Lys Tyr Gly Leu Leu Glu 225 230 235 240 Asn Tyr Asn Ala Asp Val Trp Ala Asp Gly Gly Gln Asn Trp Leu Arg 245 250 255 Ala Asn Leu Ala Leu Asn Glu His Pro Trp Tyr Gln Asn Leu Asp Gly 260 265 270 Trp Asp Ser Val Pro Thr Leu Gln Asp Met Thr Phe Arg Leu Leu Thr 275 280 285 Thr Gly Gly Leu Asn Trp Gly Glu Phe Ser Ser Thr Arg Tyr Asp Asp 290 295 300 Lys Lys Glu Glu Thr Gln Pro Lys Asn Asn Glu Gln Ala Pro Lys Asn 305 310 315 320 Trp Met Asn Leu Glu Ala Ile His Asn Asn Val His Asn Trp Val Gly 325 330 335 Gly Phe Met Phe Ser Arg Pro Gly Arg His Asp Leu Lys Leu Trp Gly 340 345 350 Ala Gly His Met Ser Ser Val Pro Val Ala Ala Tyr Asp Pro Ile Phe 355 360 365 Trp Leu His His Cys Asn Ile Asp Arg Leu Thr Ala Ile Trp Gln Thr 370 375 380 Val Asn Ser Gly Ser Trp Phe Asn Asp Asp Lys Ser Lys Val Ser Lys 385 390 395 400 Asp Asp Asp Leu Arg Pro Phe His Arg Phe Cys Glu Lys Thr Arg Lys 405 410 415 Val Val Phe Phe Arg Ser Asp Asp Val Lys Asp Trp Arg Ser Leu Asn 420 425 430 Tyr Asp Tyr Ala Ile Thr Lys Asp Ala Ser Arg Ile Arg Lys Glu Ile 435 440 445 Ser Asp Leu Tyr Gly Gln Arg Thr Lys Glu Val Tyr Lys Asp Phe Gly 450 455 460 Glu Glu Asp Tyr Ile Leu Ser Ile Arg Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu Gly 465 470 475 480 Gly Lys Pro Phe Gln Ile Asn Ile Phe Phe Gly Asp Val Asp Gly Lys 485 490 495 Asp Phe Tyr Asp Ala Arg Ser Gln Asn Phe Val Gly Ser Val Phe Asn 500 505 510 Phe Ser Gly Ser Leu Glu Asp Ser Asn Cys Asp Lys Cys Ala Gln Gln 515 520 525 Glu Gln Giu Gly Val Leu Ser Val Ser Gln Leu Pro Ala Arg Leu Ala 530 535 540 Val His Tyr Tyr Lys Lys Gln Asn Lys Gly Glu Val Pro Thr Pro Arg 545 550 555 560 Tyr Val Val Val Asn Ser Gln Gly Lys Ala Glu Ala Glu Val Lys Val 565 570 575 Glu Val Ala Leu His Lys Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Asp Ala Pro Ala 580 585 590 Arg Gly Gly Ser Asp Asp Tyr Arg Arg Val Ala Asp Gly Lys Arg Ala 595 600 605 Glu Val Asp Asp Ala Tyr Arg Ala 610 615 <210> 2 <211> 4174 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 2 cggatccgcc gaagctaatg agtttatcac gaaat tccgc gaagtagccg aatcatcggt 60 ggtgtccacc ttgcccatgg cctgcgaagt aggaaagtag taccaactgg atgggtcttc 120 aaggacaacc acgcttagat ggacaggaga ggtggttggc ttagtggatg gctggacggc 180 ggcgacctgt tcaacttcgc tgcgcacgga tgtgaggtcg cccattcctg gtgtcttagg 240 tatggagaca agtacagctg ttgcagggtt agacgtggtc caggattgt t tgcatagagt 300 aatgatcgga tgatgtactg taggatgagg tcaccctttg cagcagaacc ttcggaatga 360 taagcggctg tctggatagg aagactacac agattacctg tgcaaattca ccagaccacc 420 gcacagacag tcaatctatg aagggcatta tggagggagc cagtgcaggg acaactcaga 480 cagcaaacta atgcagccag aataggtaaa gaccatgcag gatagtcgcg actcgcagct 540 gttggagggg ttgaatatgt cgaggcgccc tatgacaatc aactactcga gcaaaaagac 600 acggccccca gcctgatcac tcactccgga gtctaagggg gatatggcat cctatacgca 660 acctagctag tcggatcatt catcgttcct ctagcgcctc ggcttccggc gcgcaaccca 720 atgcggggtt ctttgcattt gggcagtcaa ctagattata tacagatctg cggcctgcag 780 aacatggatc tgaaccacga gcatacatat cctcaggaaa tagatgcgtg ccacgtctac 840 gggaggggtg ataattcaga gatggtgcct gggctgaaga cctccggtgt gggtactcgg 900 agccgcatct gcaccaatga aggcaacgcg caatccaccc acttaaagtg gacgatcaat 960 attgacatgc tgcaggtagc tgcctcgtaa ggtgaactat ccttagtaaa agcatgaatg 1020 ccacgtctac aggcggggta ataacaacga taattcaact gacatcatta tccagtcctt 1080 tacttcaggc atgagaagtg gtttacaaca tcaggcgcgg cgtcagatct cgccgtccca 1140 atgaaggcaa tgcgcgatac accatcccgc taaatacgag agaacgaaac agtgttgtca 1200 ttgcagtagt ggaatgtatg ctgcagccaa ctgagttcat cctaagatgg gaagtgcccc 1260 ctccgggcaa cgctggtaat gcggactttt ggatgccttc ttccatcaag cctatacttc 1320 tacatataat gggtcacaga tccataatac ttcagggatg aggagaagac ctgccatata 1380 cactccaacg tcagattcag ctccactcca tctgagtacc attcgcgccg gccaaaatgc 1440 cctacctcat caccggtatc ccaaaggatc ctaagcaccc tcttcccatc cgaaaagata 1500 ttgatgactg gtatctcgag cagaccagtg cgggaagtaa ccgcatccag ctcactctat 1560 ttgtggaagc cttgaccgtg atccaaaacc gccccttgaa tgaccagctg tcgtacttcc 1620 gtctggccgg tatccatggc gctccctgga cagagtggga cggggtgcct ggtggtcaaa 1680 aggactccaa aggaaatccg acggggttct gcgtgcataa caattacacc tttccgacat 1740 ggcatcgggt gtatgtgacc ttgtacgagg tgcgcttgtc tctcatcaga cctcatgtga 1800 ttctagactt attggtattt gtatactaac agaaatttag caagtgattt atgaagccat 1860 gcttgacttc atcaagcaaa atgtgccaca gaatgggaaa gctgactggg agaatgaagc 1920 caagcaatgg cgtctccctt actgggactt tgcccggttc gcccggcatg gacacgacaa 1980 tacccaaggc gatgaacttc gattgcccat tctggtcacg atgcccatgg tcaaggtcct 2040 cgtgccgggg caaccaggca agcagctaag caagcccaat cccctttaca ggtttcaaat 2100 gcaaaccctc atggggacct tggaacgccc atacgcgatc acgagtcaaa agaccgaaga 2160 acacggctgg tctttcgatc tgccggtggg tttcactttt ccttattcct tagtcctgat 2220 tctcacattg gtttcagttc gacaaatgcc agtccaccac caagtatggt cttctggaaa 2280 actacaacgc cgacgtgtgg gcggacggtg gccagaactg gctgcgggct aacctggcat 2340 tgaacgagca tccctggtac cagaacctag atggctggga ctcggttcca accttacaag 2400 atatgacgtt ccgcctgctg acaactggag gtcttaactg gggggaattt tccagcactc 2460 ggtacgatga caagaaagaa gaaacccagc ccaagaataa tgaacaagcc cctaagaact 2520 ggatgaactt agaagctatt cacaacaacg tccatgtacg tacgcagtat cccaggtcaa 2580 gagagttata tagctaatgt tttacagaac tgggtgggag gattcatgtt cagccgtcca 2640 ggacgacacg acttgaaact ctggggtgct ggccatatga gcagtgttcc agtggccgcg 2700 tatgatccga ttttctggct gcaccattgg taagcgctcc atattttctg cgcagtagaa 2760 cacgataata acgcggaggg gtgcagcaat atcgacaggc tcactgcaat ctggcagacc 2820 gtaaactctg gcagctggtt taatgacgat aagagcaaag tatctaaaga tgacgacctg 2880 cgtcccttcc acaggttttg tgaaaaaacc aggaaggttg tgtttttcag gtctgacgat 2940 gtgaaggatt ggcgatcctt gaattatgat tacgctatca ctaaagatgc gagcagaatt 3000 aggaaagaga tttccgacct gtacgggcaa agaacaaaag aggtgtacaa ggacttcggc 3060 gaggaagact atattctcag catccggtac agccggtagg tgtacttcta ggacgactcc 3120 ccaagacagt cgagacttgt cgctgaccgg ggctcaggta tgcattggga ggcaagccgt 3180 tccagatcaa catcttcttc ggtgacgtgg atggcaagga cttctacgac gccagatcgc 3240 agaattttgt gggcagtgtc ttcaacttca gcggcagcct tgaggacagt aactgtgaca 3300 agtgcgctca gcaagagcaa gagggtgttt tgtctgtgtc ccagcttcca gccagattgg 3360 cagtccacta ctacaaaaag cagaacaaag gcgaggttcc aacaccgcgt tacgtcgtgg 3420 tgaatagtca gggcaaggta agcgttcctt ggtgaagtga taacgaggca ccctgctcat 3480 ttcttttgaa ataggctgag gcggaggtaa aagtggaagt tgccctgcat aagactgagg 3540 gtacgttcta tgacgctcct gcccgcggtg gcagcgatga ctaccgcagg gtggccgatg 3600 gaaagcgtgc cgaagtggac gatgcttatc gcgcctgata tttggacagg acgacttcat 3660 tcacgcatcc ttagcgtgag atgattggcg gacactaggt gcatatgtac agtccatgtc 3720 aatgtatctt cgaaaccccg cccagttaaa cgttccatat agaatactct tatttcaccc 3780 ccctagactt gggccgtctt gtcctccaac gtgaaggccc ctcacaagac ttgtagtcgg 3840 cgccttgaga actttcgtag cctcccgacc caaagaatgg ctctcacctc cacgcttccc 3900 tcactaccct cttcaccacg tgtactcatc attctggtta tcttcttgga cgccagggtg 3960 actcctgaag aggtacgagg gacccattct cgcatagaat ctctagatta tgtttttgcc 4020 agattagtcc gccgtaccta tagcgactaa taaccttcat ggacacggaa ttcaccagca 4080 taagtatgcc ctggtcaagt tcagtcatat atatctaggc gaaaggactc gcacttataa 4140 tacacatagc gctagactca ggcgctaggc ctac 4174 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ctccactcca tctgagtacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ccaccgtttt ttcggctttg 20

【図面の簡単な説明】

【図１】新規チロシナーゼ（ｍｅｌＢ）のアミノ酸配列
を示す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】同上続きを示す。

【図４】新規チロシナーゼ遺伝子ｍｅｌＢの塩基配列を
示す。

【図５】同上続きを示す。

【図６】同上続きを示す。

【図７】オリゴＤＮＡ＃１を示す。

【図８】オリゴＤＮＡ＃２を示す。

【図９】解析用プラスミドｐｍｅｌＯ−ＧＵＳを示す。

【図１０】解析用プラスミドｐｍｅｌＢ−ＧＵＳを示
す。

【図１１】ｍｅｌＢ発現用プラスミドｐｍｅｌＢ−ｎｉ
ａを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 石田 博樹 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 総合研究所内 (72)発明者 秦 洋二 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 総合研究所内 (72)発明者 川戸 章嗣 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 総合研究所内 (72)発明者 安部 康久 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 総合研究所内 (72)発明者 赤尾 健 広島県東広島市鏡山三丁目７番１号 国税 庁醸造研究所内 (72)発明者 秋田 修 広島県東広島市鏡山三丁目７番１号 国税 庁醸造研究所内 (72)発明者 一島 英治 八王子市丹木町１−236 創価大学工学部 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 CA04 DA11 EA04 GA11 4B050 CC03 DD03 LL02 LL05 4B065 AA63X AA63Y AB01 AC14 BA02 CA28 CA41

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   を有するチロシナーゼ酵素活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号２の塩基配列で示される、請求
   項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくと
   もコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
4. 【請求項４】 組換えベクターｐｍｅｌＢ−ｎｉａ。
5. 【請求項５】 請求項３又は４に記載の組換えベクター
   を麹菌に導入してなる形質転換体。
6. 【請求項６】 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
   ＴｍｅｌＢ−１１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８１３４）。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載の形質転換体を利
   用すること、を特徴とするチロシナーゼ酵素活性を有す
   るタンパク質を生産する方法。