ES2531290T9 - Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas - Google Patents

Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas Download PDF

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Description

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(k)
el polipéptido de (i) o (j), en donde la secuencia heteróloga o el dominio de enlazamiento heterólogo comprende,
o consiste de, un dominio de enlazamiento de NAD, NAD (P), calcio, tiamina, FAD, zinc, ADN y/o lipoilo;
(l)
polipéptido de (i), en donde la secuencia de señal heteróloga direcciona la proteína codificada a una vacuola, el retículo endoplasmático, un cloroplasto o un gránulo de almidón.
En un aspecto, la actividad de la d-aminoácido transferasa comprende catalizar la transferencia de un grupo químico, catalizar la transaminación, catalizar la reacción: D-alanina + 2-oxoglutarato <=> piruvato + D-glutamato, y/o catalizar una reacción de oxidación-reducción, catalizar la remoción de átomos de hidrógeno, y/o catalizar la reacción: D-amino ácido + H2O + aceptor <=> un 2-oxo ácido + NH3 + aceptor reducido.
La invención provee polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden un polipéptido de la invención y carece de una secuencia de señalización o de una preprosecuencia. La invención provee polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden un polipéptido de la invención y tienen una secuencia de señalización heteróloga o una preprosecuencia heteróloga.
En un aspecto, un polipéptido de la invención tiene actividad de d-aminoácido transferasa que comprende una actividad específica a aproximadamente 37°C en el rango de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1.000 unidades por miligramo de proteína, desde aproximadamente 500 a aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína, desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína, o desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En aspectos alternativos, los polipéptidos de la invención, tienen actividad de d-aminoácido transferasa en el rango de entre aproximadamente 0.05 a 20 unidades por gramo, o 0.05, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50, 0.60, 0.70, 0.80, 0.90, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más unidades por gramo, en donde una unidad es igual a una micromol de producto liberada por minuto por mg de enzima. En una realización, para transaminasas, una unidad de actividad es igual a una umol de alfa-cetoácido o cetona producido por minuto por mg de enzima (formado a partir del respectivo alfa-aminoácido o amina). En una realización alternativa, para transaminasas, una unidad de actividad es igual a una umol de alfa-aminoácido o amina producida por minuto por mg de enzima (formada a partir del respectivo alfa-cetoácido o cetona).
En un aspecto, los polipéptidos de la invención comprenden al menos un sitio de glicosilación o adicionalmente comprenden un polisacárido. La glicosilación puede ser una glicosilación con enlazamiento a N, por ejemplo, en donde el polipéptido es glicosado después de ser expresado en P. pastoris o en S. pombe.
La invención provee preparación de proteínas que comprenden un polipéptido de la invención, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, una pasta, un sólido o un gel. La invención provee heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención y un segundo dominio. El segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero es una proteína de fusión. El segundo dominio puede ser un epítopo o una etiqueta.
La invención provee homodímeros o heterodímeros que comprenden un polipéptido de la invención. La invención provee polipéptidos inmovilizados, en donde el polipéptido comprende una secuencia de la invención, o una subsecuencia de la misma, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio, por ejemplo, en donde el polipéptido es inmovilizado sobre o dentro de una célula, una vesícula, un liposoma, una película, una membrana, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un microelectrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, una disposición, un tubo capilar, un cristal, un tableta, una píldora, una cápsula, un polvo, un aglomerado, una superficie, un estructura porosa, o materiales tales como virutas de madera, palos, pulpa, papel y materiales derivados de los mismos.
Las transferasas de la invención pueden ser utilizadas o formuladas solas o como mezcla (un "cóctel") de transferasas y oxidorreductasas y otras enzimas hidrolíticas tales como celulasas, mananasas, proteasas, lipasas, amilasas o enzimas rédox tales como lacasas, peroxidasas, catalasas, oxidasas o reductasas. Pueden ser utilizadas formuladas en forma sólida tal como un polvo, una preparación liofilizada, un gránulo, una tableta, una barra, un cristal, una cápsula, una píldora, un pella, o en una forma líquida tal como en una solución acuosa, un aerosol, un gel, una pasta, una suspensión, una emulsión acuosa/oleosa, una crema, una cápsula, o en suspensión vesicular o micelar. Las formulaciones de la invención pueden comprender cualquiera o una combinación de los siguientes ingredientes: polioles tales como polietilenglicol, un polivinílico alcohol, un glicerol, un azúcar tal como una sacarosa, un sorbitol, una trehalosa, una glucosa, una fructosa, una maltosa, una manosa, un agente gelificante tal como una goma guar, una carragenina, un alginato, un dextrano, un derivado celulósico, una pectina, una sal tal como cloruro de sodio, un sulfato de sodio, un sulfato de amonio, un cloruro de calcio, un cloruro de magnesio, un cloruro de zinc, un sulfato de zinc, una sal de un ácido graso y un derivado de un ácido graso, un quelante de metales tal como un EDTA, un EGTA, un citrato de sodio, un agente antimicrobiano tal como una ácido graso o un derivado de un ácido graso, un parabeno, un sorbato, un benzoato, un compuesto modulador adicional para bloquear el impacto de una enzima tal como una proteasa, una proteína voluminosa, tal como una BSA, un hidrolizado de trigo, un compuesto borato, un aminoácido o un péptido, un compuesto modulador apropiado de pH o temperatura, un emulsificante tal
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Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
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31
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25, 26 D-AT Clon
33
889, 890 D-AT Subclón
34
27, 28 D-AT Clon
34
887, 888 D-AT Subclón
35
131, 132 D-AT Clon
35
909, 910 D-AT Subclón
36
53, 54 D-AT Clon
36
865, 866 D-AT Subclón
37
29, 30 D-AT Clon
37
895, 896 D-AT Subclón
38
125, 126 D-AT Clon
38
907, 908 D-AT Subclón
39
133, 134 D-AT Clon
39
911, 912 D-AT Subclón
40
127, 128 D-AT Clon
40
899, 900 D-AT Subclón
41
137, 138 D-AT Clon
41
901, 902 D-AT Subclón
24
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
42
139, 140 D-AT Clon
42
903, 904 D-AT Subclón
43
129, 130 D-AT Clon
43
905, 906 D-AT Subclón
44
33, 34 D-AT Clon
44
969, 970 D-AT Subclón
45
219, 220 D-AT Clon
45
973, 974 D-AT Subclón
46
39, 40 D-AT Clon
46
971, 972 D-AT Subclón
47
1, 2 D-AT Clon
47
975, 976 D-AT Subclón
48
253, 254 Deshidrogenasa Clon
48
961, 962 Deshidrogenasa Subclón
48
963, 964 Deshidrogenasa Subclón
48
965, 966 Deshidrogenasa Subclón
48
967, 968 Deshidrogenasa Subclón
35, 36
D-AT Clon
9, 10
D-AT Clon
85, 86
D-AT Clon
77, 78
D-AT Clon
153, 154
D-AT Clon
155, 156
D-AT Clon
201, 202
D-AT Clon
221, 222
D-AT Clon
235, 236
D-AT Clon
203, 204
D-AT Clon
237, 238
D-AT Clon
239, 240
D-AT Clon
159, 160
D-AT Clon
165, 166
D-AT Clon
211, 212
D-AT Clon
249, 250
D-AT Clon
177, 178
D-AT Clon
223, 224
D-AT Clon
169, 170
D-AT Clon
179, 180
D-AT Clon
181, 182
D-AT Clon
25
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
63, 64
D-AT Clon
107, 108
D-AT Clon
109, 110
D-AT Clon
111, 112
D-AT Clon
113, 114
D-AT Clon
115, 116
D-AT Clon
123, 124
D-AT Clon
225, 226
D-AT Clon
227, 228
D-AT Clon
247, 248
D-AT Clon
217, 218
D-AT Clon
205, 206
D-AT Clon
183, 184
D-AT Clon
185, 186
D-AT Clon
241, 242
D-AT Clon
243, 244
D-AT Clon
229, 230
D-AT Clon
231, 232
D-AT Clon
187, 188
D-AT Clon
189, 190
D-AT Clon
191, 192
D-AT Clon
207, 208
D-AT Clon
99, 100
D-AT Clon
55, 56
D-AT Clon
57, 58
D-AT Clon
193, 194
D-AT Clon
233, 234
D-AT Clon
215, 216
D-AT Clon
195, 196
D-AT Clon
199, 200
D-AT Clon
197, 198
D-AT Clon
209, 210
D-AT Clon
141, 142
D-AT Clon
157, 158
D-AT Clon
245, 246
D-AT Clon
59, 60
D-AT Clon
61, 62
D-AT Clon
47, 48
D-AT Clon
26
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
213, 214
D-AT Clon
171, 172
D-AT Clon
167, 168
D-AT Clon
173, 174
D-AT Clon
175, 176
D-AT Clon
65, 66
D-AT Clon
67, 68
D-AT Clon
69, 70
D-AT Clon
71, 72
D-AT Clon
73, 74
D-AT Clon
79, 80
D-AT Clon
81, 82
D-AT Clon
93, 94
D-AT Clon
91, 92
D-AT Clon
95, 96
D-AT Clon
97, 98
D-AT Clon
117, 118
D-AT Clon
119, 120
D-AT Clon
121, 122
D-AT Clon
101, 102
D-AT Clon
103, 104
D-AT Clon
105, 106
D-AT Clon
89, 90
D-AT Clon
135, 136
D-AT Clon
259, 260
Deshidrogenasa Clon
261, 262
Deshidrogenasa Clon
263, 264
Deshidrogenasa Clon
327, 328
Deshidrogenasa Clon
335, 336
Deshidrogenasa Clon
353, 354
Deshidrogenasa Clon
355, 356
Deshidrogenasa Clon
321, 322
Deshidrogenasa Clon
341, 342
Deshidrogenasa Clon
265, 266
Deshidrogenasa Clon
287, 288
Deshidrogenasa Clon
267, 268
Deshidrogenasa Clon
269, 270
Deshidrogenasa Clon
301, 302
Deshidrogenasa Clon
27
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
413, 414
Deshidrogenasa Clon
433, 434
Deshidrogenasa Clon
423, 424
Deshidrogenasa Clon
303, 304
Deshidrogenasa Clon
425, 426
Deshidrogenasa Clon
393, 394
Deshidrogenasa Clon
297, 298
Deshidrogenasa Clon
299, 300
Deshidrogenasa Clon
567, 568
Deshidrogenasa Clon
515, 516
Deshidrogenasa Clon
465, 466
Deshidrogenasa Clon
387, 388
Deshidrogenasa Clon
409, 410
Deshidrogenasa Clon
411, 412
Deshidrogenasa Clon
375, 376
Deshidrogenasa Clon
407, 408
Deshidrogenasa Clon
391, 392
Deshidrogenasa Clon
485, 486
Deshidrogenasa Clon
603, 604
Deshidrogenasa Clon
605, 606
Deshidrogenasa Clon
517, 518
Deshidrogenasa Clon
543, 544
Deshidrogenasa Clon
429, 430
Deshidrogenasa Clon
443, 444
Deshidrogenasa Clon
365, 366
Deshidrogenasa Clon
445, 446
Deshidrogenasa Clon
431, 432
Deshidrogenasa Clon
449, 450
Deshidrogenasa Clon
467, 468
Deshidrogenasa Clon
379, 380
Deshidrogenasa Clon
367, 368
Deshidrogenasa Clon
405, 406
Deshidrogenasa Clon
383, 384
Deshidrogenasa Clon
357, 358
Deshidrogenasa Clon
415, 416
Deshidrogenasa Clon
395, 396
Deshidrogenasa Clon
385, 386
Deshidrogenasa Clon
369, 370
Deshidrogenasa Clon
28
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
397, 398
Deshidrogenasa Clon
435, 436
Deshidrogenasa Clon
453, 454
Deshidrogenasa Clon
469, 470
Deshidrogenasa Clon
447, 448
Deshidrogenasa Clon
473, 474
Deshidrogenasa Clon
389, 390
Deshidrogenasa Clon
427, 428
Deshidrogenasa Clon
451, 452
Deshidrogenasa Clon
399, 400
Deshidrogenasa Clon
455, 456
Deshidrogenasa Clon
417, 418
Deshidrogenasa Clon
403, 404
Deshidrogenasa Clon
419, 420
Deshidrogenasa Clon
251, 252
Deshidrogenasa Clon
371, 372
Deshidrogenasa Clon
475, 476
Deshidrogenasa Clon
457, 458
Deshidrogenasa Clon
459, 460
Deshidrogenasa Clon
461, 462
Deshidrogenasa Clon
463, 464
Deshidrogenasa Clon
477, 478
Deshidrogenasa Clon
479, 480
Deshidrogenasa Clon
481, 482
Deshidrogenasa Clon
629, 630
Deshidrogenasa Clon
519, 520
Deshidrogenasa Clon
521, 522
Deshidrogenasa Clon
589, 590
Deshidrogenasa Clon
359, 360
Deshidrogenasa Clon
361, 362
Deshidrogenasa Clon
381, 382
Deshidrogenasa Clon
363, 364
Deshidrogenasa Clon
625, 626
Deshidrogenasa Clon
549, 550
Deshidrogenasa Clon
551, 552
Deshidrogenasa Clon
501, 502
Deshidrogenasa Clon
571, 572
Deshidrogenasa Clon
601, 602
Deshidrogenasa Clon
29
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
573, 574
Deshidrogenasa Clon
575, 576
Deshidrogenasa Clon
577, 578
Deshidrogenasa Clon
611, 612
Deshidrogenasa Clon
579, 580
Deshidrogenasa Clon
523, 524
Deshidrogenasa Clon
553, 554
Deshidrogenasa Clon
503, 504
Deshidrogenasa Clon
505, 506
Deshidrogenasa Clon
507, 508
Deshidrogenasa Clon
509, 510
Deshidrogenasa Clon
525, 526
Deshidrogenasa Clon
373, 374
Deshidrogenasa Clon
421, 422
Deshidrogenasa Clon
483, 484
Deshidrogenasa Clon
511, 512
Deshidrogenasa Clon
527, 528
Deshidrogenasa Clon
555, 556
Deshidrogenasa Clon
529, 530
Deshidrogenasa Clon
591, 592
Deshidrogenasa Clon
557, 558
Deshidrogenasa Clon
559, 560
Deshidrogenasa Clon
593, 594
Deshidrogenasa Clon
581, 582
Deshidrogenasa Clon
613, 614
Deshidrogenasa Clon
595, 596
Deshidrogenasa Clon
597, 598
Deshidrogenasa Clon
599, 600
Deshidrogenasa Clon
583, 584
Deshidrogenasa Clon
615, 616
Deshidrogenasa Clon
619, 620
Deshidrogenasa Clon
621, 622
Deshidrogenasa Clon
561, 562
Deshidrogenasa Clon
563, 564
Deshidrogenasa Clon
587, 588
Deshidrogenasa Clon
513, 514
Deshidrogenasa Clon
531, 532
Deshidrogenasa Clon
533, 534
Deshidrogenasa Clon
30
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
535, 536
Deshidrogenasa Clon
585, 586
Deshidrogenasa Clon
617, 618
Deshidrogenasa Clon
627, 628
Deshidrogenasa Clon
623, 624
Deshidrogenasa Clon
537, 538
Deshidrogenasa Clon
565, 566
Deshidrogenasa Clon
539, 540
Deshidrogenasa Clon
541, 542
Deshidrogenasa Clon
569, 570
Deshidrogenasa Clon
607, 608
Deshidrogenasa Clon
609, 610
Deshidrogenasa Clon
487, 488
Deshidrogenasa Clon
545, 546
Deshidrogenasa Clon
495, 496
Deshidrogenasa Clon
497, 498
Deshidrogenasa Clon
499, 500
Deshidrogenasa Clon
489, 490
Deshidrogenasa Clon
491, 492
Deshidrogenasa Clon
493, 494
Deshidrogenasa Clon
547, 548
Deshidrogenasa Clon
401, 402
Deshidrogenasa Clon
377, 378
Deshidrogenasa Clon
437, 438
Deshidrogenasa Clon
439, 440
Deshidrogenasa Clon
441, 442
Deshidrogenasa Clon
271, 272
Deshidrogenasa Clon
273, 274
Deshidrogenasa Clon
293, 294
Deshidrogenasa Clon
275, 276
Deshidrogenasa Clon
277, 278
Deshidrogenasa Clon
279, 280
Deshidrogenasa Clon
281, 282
Deshidrogenasa Clon
283, 284
Deshidrogenasa Clon
285, 286
Deshidrogenasa Clon
291, 292
Deshidrogenasa Clon
289, 290
Deshidrogenasa Clon
255, 256
Deshidrogenasa Clon
31
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
295, 296
Deshidrogenasa Clon
257, 258
Deshidrogenasa Clon
471, 472
Deshidrogenasa Clon
323, 324
Deshidrogenasa Clon
325, 326
Deshidrogenasa Clon
305, 306
Deshidrogenasa Clon
331, 332
Deshidrogenasa Clon
343, 344
Deshidrogenasa Clon
345, 346
Deshidrogenasa Clon
337, 338
Deshidrogenasa Clon
309, 310
Deshidrogenasa Clon
307, 308
Deshidrogenasa Clon
347, 348
Deshidrogenasa Clon
329, 330
Deshidrogenasa Clon
339, 340
Deshidrogenasa Clon
311, 312
Deshidrogenasa Clon
313, 314
Deshidrogenasa Clon
315, 316
Deshidrogenasa Clon
317, 318
Deshidrogenasa Clon
349, 350
Deshidrogenasa Clon
351, 352
Deshidrogenasa Clon
333, 334
Deshidrogenasa Clon
319, 320
Deshidrogenasa Clon
675, 676
Oxidorreductasa Clon
671, 672
Oxidorreductasa Clon
673, 674
Oxidorreductasa Clon
643, 644
Oxidorreductasa Clon
645, 646
Oxidorreductasa Clon
647, 648
Oxidorreductasa Clon
649, 650
Oxidorreductasa Clon
663, 664
Oxidorreductasa Clon
807, 808
Oxidorreductasa Clon
697, 698
Oxidorreductasa Clon
699, 700
Oxidorreductasa Clon
837, 838
Oxidorreductasa Clon
715, 716
Oxidorreductasa Clon
717, 718
Oxidorreductasa Clon
701, 702
Oxidorreductasa Clon
32
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
687, 688
Oxidorreductasa Clon
703, 704
Oxidorreductasa Clon
719, 720
Oxidorreductasa Clon
709, 710
Oxidorreductasa Clon
711, 712
Oxidorreductasa Clon
713, 714
Oxidorreductasa Clon
689, 690
Oxidorreductasa Clon
681, 682
Oxidorreductasa Clon
705, 706
Oxidorreductasa Clon
721, 722
Oxidorreductasa Clon
809, 810
Oxidorreductasa Clon
811, 812
Oxidorreductasa Clon
813, 814
Oxidorreductasa Clon
815, 816
Oxidorreductasa Clon
839, 840
Oxidorreductasa Clon
695, 696
Oxidorreductasa Clon
707, 708
Oxidorreductasa Clon
791, 792
Oxidorreductasa Clon
745, 746
Oxidorreductasa Clon
747, 748
Oxidorreductasa Clon
855, 856
Oxidorreductasa Clon
857, 858
Oxidorreductasa Clon
859, 860
Oxidorreductasa Clon
861, 862
Oxidorreductasa Clon
863, 864
Oxidorreductasa Clon
773, 774
Oxidorreductasa Clon
723, 724
Oxidorreductasa Clon
775, 776
Oxidorreductasa Clon
633, 634
Oxidorreductasa Clon
635, 636
Oxidorreductasa Clon
749, 750
Oxidorreductasa Clon
725, 726
Oxidorreductasa Clon
825, 826
Oxidorreductasa Clon
751, 752
Oxidorreductasa Clon
777, 778
Oxidorreductasa Clon
683, 684
Oxidorreductasa Clon
685, 686
Oxidorreductasa Clon
753, 754
Oxidorreductasa Clon
33
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
755, 756
Oxidorreductasa Clon
779, 780
Oxidorreductasa Clon
827, 828
Oxidorreductasa Clon
781, 782
Oxidorreductasa Clon
757, 758
Oxidorreductasa Clon
829, 830
Oxidorreductasa Clon
851, 852
Oxidorreductasa Clon
849, 850
Oxidorreductasa Clon
817, 818
Oxidorreductasa Clon
831, 832
Oxidorreductasa Clon
793, 794
Oxidorreductasa Clon
823, 824
Oxidorreductasa Clon
843, 844
Oxidorreductasa Clon
845, 846
Oxidorreductasa Clon
819, 820
Oxidorreductasa Clon
759, 760
Oxidorreductasa Clon
783, 784
Oxidorreductasa Clon
785, 786
Oxidorreductasa Clon
833, 834
Oxidorreductasa Clon
835, 836
Oxidorreductasa Clon
795, 796
Oxidorreductasa Clon
797, 798
Oxidorreductasa Clon
799, 800
Oxidorreductasa Clon
801, 802
Oxidorreductasa Clon
761, 762
Oxidorreductasa Clon
803, 804
Oxidorreductasa Clon
805, 806
Oxidorreductasa Clon
763, 764
Oxidorreductasa Clon
765, 766
Oxidorreductasa Clon
767, 768
Oxidorreductasa Clon
769, 770
Oxidorreductasa Clon
771, 772
Oxidorreductasa Clon
787, 788
Oxidorreductasa Clon
789, 790
Oxidorreductasa Clon
841, 842
Oxidorreductasa Clon
729, 730
Oxidorreductasa Clon
731, 732
Oxidorreductasa Clon
733, 734
Oxidorreductasa Clon
34
E08869698
21-08-2015
Par Clon/subclón
SEQ ID NO: Actividad Tipo de secuencia (clon o subclón)
735, 736
Oxidorreductasa Clon
727, 728
Oxidorreductasa Clon
691, 692
Oxidorreductasa Clon
693, 694
Oxidorreductasa Clon
847, 848
Oxidorreductasa Clon
853, 854
Oxidorreductasa Clon
651, 652
Oxidorreductasa Clon
653, 654
Oxidorreductasa Clon
655, 656
Oxidorreductasa Clon
657, 658
Oxidorreductasa Clon
659, 660
Oxidorreductasa Clon
661, 662
Oxidorreductasa Clon
637, 638
Oxidorreductasa Clon
631, 632
Oxidorreductasa Clon
639, 640
Oxidorreductasa Clon
641, 642
Oxidorreductasa Clon
737, 738
Oxidorreductasa Clon
739, 740
Oxidorreductasa Clon
821, 822
Oxidorreductasa Clon
741, 742
Oxidorreductasa Clon
743, 744
Oxidorreductasa Clon
679, 680
Oxidorreductasa Clon
665, 666
Oxidorreductasa Clon
667, 668
Oxidorreductasa Clon
669, 670
Oxidorreductasa Clon
677, 678
Oxidorreductasa Clon
Tabla 2
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
1, 2
Desconocido
3, 4
Desconocido
5, 6
Desconocido
7, 8
Desconocido
35
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
9, 10
Desconocido
11, 12
Desconocido
13, 14
Desconocido
15, 16
Desconocido
17, 18
Desconocido
19, 20
Desconocido
21, 22
Desconocido
23, 24
Desconocido
25, 26
Desconocido
27, 28
Desconocido
29, 30
Desconocido
31, 32
Desconocido
33, 34
Desconocido
35, 36
Desconocido
37, 38
Desconocido
39, 40
Desconocido
41, 42
Desconocido
43, 44
Desconocido
36
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
45, 46
Desconocido
47, 48
Desconocido
49, 50
Desconocido
51, 52
Desconocido
53, 54
Desconocido
55, 56
Desconocido
57, 58
Desconocido
59, 60
Desconocido
61, 62
Desconocido
63, 64
Desconocido
65, 66
Desconocido
67, 68
Desconocido
69, 70
Desconocido
71, 72
Desconocido
73, 74
Desconocido
75, 76
Desconocido
77, 78
Desconocido
79, 80
Desconocido
37
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
81, 82
Desconocido
83, 84
Desconocido
85, 86
Desconocido
87, 88
Desconocido
89, 90
Desconocido
91, 92
Desconocido
93, 94
Desconocido
95, 96
Desconocido
97, 98
Desconocido
99, 100
Desconocido
101, 102
Desconocido
103, 104
Desconocido
105, 106
Desconocido
107, 108
Desconocido
109, 110
Desconocido
111, 112
Desconocido
113, 114
Desconocido
38
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
115, 116
Desconocido
117, 118
Desconocido
119, 120
Desconocido
121, 122
Desconocido
123, 124
Desconocido
125, 126
Desconocido
127, 128
Desconocido
129, 130
Desconocido
131, 132
Desconocido
133, 134
Desconocido
135, 136
Desconocido
137, 138
Desconocido
139, 140
Desconocido
141, 142
Desconocido
143, 144
Desconocido
39
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
145, 146
Desconocido
147, 148
Desconocido
149, 150
Desconocido
151, 152
Desconocido
153, 154
Desconocido
155, 156
Desconocido Probabilidad: 0.991 AA1: 19 AA2: 20 KNSPIIAAYRAATPGSAAA
157, 158
Desconocido
159, 160
Desconocido
161, 162
Desconocido
163, 164
Desconocido
165, 166
Desconocido
167, 168
Desconocido
169, 170
Rhodococcus erythropolis DSMZ 44522
171, 172
Desconocido
173, 174
Desconocido
40
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
175, 176
Desconocido
177, 178
Desconocido
179, 180
Desconocido
181, 182
Desconocido
183, 184
Desconocido
185, 186
Desconocido
187, 188
Desconocido
189, 190
Desconocido
191, 192
Desconocido
193, 194
Desconocido
195, 196
Desconocido
197, 198
Desconocido
199, 200
Desconocido
201, 202
Desconocido
203, 204
Desconocido
41
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
205, 206
Desconocido
207, 208
Desconocido
209, 210
Desconocido
211, 212
Desconocido
213, 214
Desconocido
215, 216
Desconocido
217, 218
Desconocido
219, 220
Desconocido
221, 222
Desconocido
223, 224
Desconocido
225, 226
Desconocido
227, 228
Desconocido
229, 230
Desconocido
231, 232
Desconocido
233, 234
Desconocido
42
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
235, 236
Desconocido
237, 238
Desconocido
239, 240
Desconocido
241, 242
Desconocido
243, 244
Desconocido
245, 246
Desconocido
247, 248
Desconocido
249, 250
Desconocido
251, 252
Desconocido
253, 254
Desconocido
255, 256
Desconocido
257, 258
Desconocido Probabilidad: 0.612 AA1: 20 AA2: 21 MKSAIVLGAGMVGIATAVHL
259, 260
Desconocido
261, 262
Desconocido
263, 264
Desconocido
43
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
265, 266
Desconocido
267, 268
Desconocido
269, 270
Desconocido
271, 272
Desconocido Probabilidad: 0.836 AA1: 22 AA2: 23 MKPTSILVLGAGMVGTCTALHL
273, 274
Desconocido
275, 276
Desconocido
277, 278
Desconocido
279, 280
Desconocido
281, 282
Desconocido
283, 284
Desconocido Probabilidad: 0.549 AA1: 20 AA2: 21 MKAIVLGSGVLGTTTAYYLA
285, 286
Desconocido Probabilidad: 0.957 AA1: 24 AA2: 25 MARPRSVIICGGGIIGLCTAYSLA
287, 288
Desconocido
289, 290
Desconocido
291, 292
Desconocido
293, 294
Desconocido
44
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
295, 296
Desconocido
297, 298
Desconocido Probabilidad: 0.898 AA1: 21 AA2: 22 MQSIAVIGGGITGVTSAYALA
299, 300
Desconocido Probabilidad: 0.898 AA1: 21 AA2: 22 MQSIAVIGGGITGVTSAYALA
301, 302
Desconocido
303, 304
Desconocido Probabilidad: 0.945 AA1: 18 AA2: 19 MKVLVLGAGVVGTATALA
305, 306
Desconocido
307, 308
Desconocido
309, 310
Desconocido
311, 312
Desconocido
313, 314
Desconocido
315, 316
Desconocido
317, 318
Desconocido
319, 320
Desconocido Probabilidad: 0.725 AA1: 25 AA2: 26 MKSARPVKTVGIAGAGTMGRGIAAA
321, 322
Desconocido
323, 324
Desconocido
45
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
325, 326
Desconocido Probabilidad: 0.552 AA1: 20 AA2: 21 MRVLVLGSGVIGTASAYYLA
327, 328
Desconocido
329, 330
Desconocido
331, 332
Desconocido
333, 334
Desconocido Probabilidad: 0.725 AA1: 25 AA2: 26 MKSARPVKTVGIAGAGTMGRGIAAA
335, 336
Desconocido
337, 338
Desconocido
339, 340
Desconocido
341, 342
Desconocido
343, 344
Desconocido
345, 346
Desconocido
347, 348
Desconocido
349, 350
Desconocido
351, 352
Desconocido
353, 354
Desconocido Probabilidad: 0.791 AA1: 24 AA2: 25 MRQSRSVIICGGGVIGLSCAYYLA
46
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
355, 356
Desconocido
357, 358
Desconocido
359, 360
Rhodococcus ruber DSMZ 44319
361, 362
Rhodococcus ruber DSMZ 44319
363, 364
Rhodococcus ruber DSMZ 44319
365, 366
Desconocido
367, 368
Desconocido
369, 370
Desconocido
371, 372
Desconocido
373, 374
Desconocido
375, 376
Desconocido
377, 378
Desconocido
379, 380
Desconocido
381, 382
Rhodococcus ruber DSMZ 44319
47
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
383, 384
Desconocido Probabilidad: 0.657 AA1: 21 AA2: 22 MMKIMVLGGGVIGVTTAYYLA
385, 386
Desconocido
387, 388
Desconocido Probabilidad: 0.930 AA1: 20 AA2: 21 MRIVVLGAGVVGTTAAYCLA
389, 390
Desconocido
391, 392
Desconocido Probabilidad: 0.711 AA1: 20 AA2:21 MSSTRRVIVIGGGVIGAASA
393, 394
Desconocido Probabilidad: 0.968 AA1: 18 AA2: 19 MKILVIGAGVIGVATAWA
395, 396
Desconocido Probabilidad: 0.638 AA1: 20 AA2: 21 MTKDIVVLGAGVVGVCTALA
397, 398
Desconocido
399, 400
Desconocido
401, 402
Desconocido Probabilidad: 0.999 AA1: 18 AA2: 19 MKTLVLGGGIAGLSSAFA
403, 404
Desconocido Probabilidad: 0.959 AA1: 20 AA2: 21 MSKKGTSVIIGGGISGLASA
405, 406
Desconocido
407, 408
Desconocido
409, 410
Desconocido
411, 412
Desconocido
48
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
413, 414
Desconocido
415, 416
Desconocido
417, 418
Desconocido Probabilidad: 0.709 AA1: 20 AA2: 21 MKITILGAGVIGVTSAYYLA
419, 420
Desconocido
421, 422
Desconocido
423, 424
Desconocido
425, 426
Desconocido
427, 428
Desconocido
429, 430
Desconocido
431, 432
Desconocido
433, 434
Desconocido
435, 436
Desconocido Probabilidad: 0.738 AA1: 22 AA2: 23 MPGTVDAIVLGAGIVGVSAALA
437, 438
Desconocido
439, 440
Desconocido
441, 442
Desconocido
49
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
443, 444
Desconocido
445, 446
Desconocido
447, 448
Desconocido
449, 450
Desconocido Probabilidad: 0.823 AA1: 23 AA2: 24 MKRDVIVLGAGMVGVGCALHLQA
451, 452
Desconocido
453, 454
Desconocido
455, 456
Desconocido
457, 458
Desconocido
459, 460
Desconocido Probabilidad: 0.950 AA1: 21 AA2: 22 MQRIAVIGGGITGITSAYALA
461, 462
Desconocido Probabilidad: 0.557 AA1: 18 AA2: 19 MPSVLITGATSGFGKAAA
463, 464
Desconocido
465, 466
Desconocido
467, 468
Desconocido
469, 470
Desconocido
471, 472
Desconocido
50
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
473, 474
Desconocido
475, 476
Desconocido
477, 478
Desconocido
479, 480
Desconocido
481, 482
Desconocido
483, 484
Desconocido
485, 486
Desconocido
487, 488
Desconocido
489, 490
Desconocido
491, 492
Desconocido Probabilidad: 1.000 AA1: 21 AA2: 22 MKISIVGAGLAGLCAAHALVA
493, 494
Desconocido
495, 496
Desconocido
497, 498
Desconocido
499, 500
Desconocido Probabilidad: 0.852 AA1: 23 AA2: 24 MKFDVAVLGAGIVGISTALHLQA
501, 502
Desconocido
51
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
503, 504
Desconocido
505, 506
Desconocido
507, 508
Desconocido
509, 510
Desconocido
511, 512
Desconocido Probabilidad: 0.696 AA1: 28 AA2:29
513, 514
Desconocido
515, 516
Desconocido Probabilidad: 0.898 AA1: 21 AA2: 22 MQSIAVIGGGITGVTSAYALA
517, 518
Desconocido Probabilidad: 0.798 AA1: 21 AA2: 22 MKSVIIIGGGIIGLCSAYYLA
519, 520
Desconocido
521, 522
Rhodococcus erythropolis DSMZ 44522
523, 524
Desconocido Probabilidad: 0.601 AA1: 22 AA2: 23 MKKKILVIGGGAIGLFCAYYLR
525, 526
Desconocido
527, 528
Desconocido
529, 530
Desconocido
531, 532
Desconocido
52
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
533, 534
Desconocido Probabilidad: 0.716 AA1: 24 AA2: 25 MRNSKSVVVCGGGIVGLCTAYYLA
535, 536
Desconocido
537, 538
Desconocido
539, 540
Desconocido
541, 542
Desconocido
543, 544
Desconocido
545, 546
Desconocido
547, 548
Desconocido Probabilidad: 0.696 AA1: 24 AA2: 25 MTDKRRVVVCGGGVIGLCCADSLA
549, 550
Desconocido
551, 552
Desconocido
553, 554
Desconocido
555, 556
Desconocido
557, 558
Desconocido
559, 560
Desconocido
561, 562
Desconocido Probabilidad: 0.765 AA1: 22 AA2: 23 MDPHVVIAGCGFGGLFAARALA
53
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
563, 564
Desconocido
565, 566
Desconocido
567, 568
Desconocido
569, 570
Desconocido
571, 572
Desconocido
573, 574
Desconocido Probabilidad: 0.982 AA1: 24 AA2: 25 MSRPRSVIICGGGIVGLCTAYSLA
575, 576
Desconocido
577, 578
Desconocido
579, 580
Desconocido Probabilidad: 0.772 AA1: 20 AA2: 21 MKITILGAGVIGVTSAYYLA
581, 582
Desconocido
583, 584
Desconocido
585, 586
Desconocido
587, 588
Desconocido
589, 590
Rhodococcus erythropolis DSMZ 44522
591, 592
Desconocido
54
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
593, 594
Desconocido
595, 596
Desconocido
597, 598
Desconocido Probabilidad: 0.672 AA1: 20 AA2: 21 MKVLVLGGGVIGVSSAYFLA
599, 600
Desconocido Probabilidad: 0.873 AA1: 20 AA2: 21 MKVIVLGAGV VGVTSAYQLA
601, 602
Desconocido Probabilidad: 0.773 AA1: 20 AA2: 21 MKITILGAGVIGVTSAYYLA
603, 604
Desconocido Probabilidad: 0.781 AA1: 21 AA2: 22 MKRVIVIGSGALGLCSAYFLQ
605, 606
Desconocido
607, 608
Desconocido
609, 610
Desconocido
611, 612
Desconocido Probabilidad: 0.772 AA1: 20 AA2: 21 MKITILGAGVIGVTSAYYLA
613, 614
Desconocido Probabilidad: 0.995 AA1: 18 AA2: 19 MKITIIGAGIAGVSTAWA
615, 616
Desconocido
617, 618
Desconocido
619, 620
Desconocido
621, 622
Desconocido Probabilidad: 0.710 AA1: 24 AA2: 25 MRTSKSVIVCGGGIVGLCTAYYLA
55
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
623, 624
Desconocido
625, 626
Flavobacteriu m sp. ATCC 27551
627, 628
Desconocido
629, 630
Desconocido
631, 632
Desconocido
633, 634
Desconocido Probabilidad: 0.648 AA1: 20 AA2: 21 MKVIVLGAGVIGTTTAYYLA
635, 636
Desconocido Probabilidad: 0.651 AA1: 20 AA2:21 MKVIVLGAGVIGTTTAYYLA
637, 638
Desconocido
639, 640
Desconocido
641, 642
Desconocido
643, 644
Desconocido Probabilidad: 0.993 AA1: 24 AA2: 25 MTRARHVVVIGAGVVGSCTAQALA
645, 646
Desconocido
647, 648
Desconocido
649, 650
Desconocido
651, 652
Desconocido Probabilidad: 0.598 AA1: 21 AA2: 22 MAREVIVLGAGIVGVSTAAHL
56
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
653, 654
Desconocido
655, 656
Desconocido
657, 658
Desconocido
659, 660
Desconocido
661, 662
Desconocido Probabilidad: 0.944 AA1: 39 AA2:40
663, 664
Desconocido
665, 666
Desconocido Probabilidad: 0.910 AA1: 17 AA2: 18 MKSVAIIGAGLAGLATA
667, 668
Desconocido
669, 670
Desconocido
671, 672
Desconocido
673, 674
Desconocido
675, 676
Desconocido
677, 678
Desconocido
679, 680
Desconocido
681, 682
Desconocido Probabilidad: 0.781 AA1: 22 AA2: 23 MRIVVIGAGLPGVTTACFLAQA
57
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
683, 684
Desconocido Probabilidad: 0.549 AA1: 18 AA2: 19 MNVLVVGAGVVGTSTALS
685, 686
Desconocido Probabilidad: 0.957 AA1: 24 AA2: 25 MNKRTPERVVVIGGGVVGATTALA
687, 688
Desconocido
689, 690
Desconocido
691, 692
Desconocido Probabilidad: 0.984 AA1: 19 AA2: 20 MKTIAVLGAGVTGTTTAYA
693, 694
Desconocido
695, 696
Desconocido
697, 698
Desconocido
699, 700
Desconocido
701, 702
Desconocido Probabilidad: 0.999 AA1: 22 AA2: 23 MNRSVAIIGAGVSGLTCGVVFA
703, 704
Desconocido
705, 706
Desconocido Probabilidad: 0.935 AA1: 19 AA2: 20 MKSAIVLGAGMVGVSTALA
707, 708
Desconocido
709, 710
Desconocido
711, 712
Desconocido
58
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
713, 714
Desconocido
715, 716
Desconocido Probabilidad: 0.528 AA1: 18 AA2: 19 MKVIVIGAGVVGATTALS
717, 718
Desconocido
719, 720
Desconocido
721, 722
Desconocido
723, 724
Desconocido Probabilidad: 0.857 AA1: 20 AA2: 21 MHTIVIGAGVVGASTALSLA
725, 726
Desconocido
727, 728
Desconocido Probabilidad: 0.785 AA1: 18 AA2: 19 MHIVVIGAGVMGVTTAYA
729, 730
Desconocido
731, 732
Desconocido
733, 734
Desconocido Probabilidad: 0.903 AA1: 18 AA2: 19 MHVIVIGAGVVGSTTALA
735, 736
Desconocido Probabilidad: 0.983 AA1: 21 AA2: 22 KEFGTSISAATLALAARPAQS
737, 738
Desconocido
739, 740
Desconocido
741, 742
Desconocido
59
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
743, 744
Desconocido
745, 746
Desconocido Probabilidad: 0.754 AA1: 23 AA2:24 MTHSDILIIGGGIAGMSAAFFLA
747, 748
Desconocido
749, 750
Desconocido
751, 752
Desconocido
753, 754
Desconocido
755, 756
Desconocido
757, 758
Desconocido Probabilidad: 0.911 AA1: 19 AA2: 20 MQDILVLGAGMVGVSTALA
759, 760
Desconocido
761, 762
Desconocido
763, 764
Desconocido Probabilidad: 0.857 AA1: 20 AA2: 21 MHTIVIGAGVVGASTALSLA
765, 766
Desconocido
767, 768
Desconocido Probabilidad: 0.682 AA1: 22 AA2: 23 MSLHVIVIGAGVVGASTVLSLA
769, 770
Desconocido
771, 772
Desconocido
60
E08869698
21-08-2015
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
773, 774
Desconocido
775, 776
Desconocido Probabilidad: 0.527 AA1: 15 AA2: 16 MRVLVIGAGLAGLTA
777, 778
Desconocido
779, 780
Desconocido
781, 782
Desconocido
783, 784
Desconocido
785, 786
Desconocido Probabilidad: 0.706 AA1: 20 AA2: 21 MHTIVIGAGVVGTSTALSLA
787, 788
Desconocido Probabilidad: 0.639 AA1: 20 AA2: 21 MHAIVIGAGVVGASTALSLA
789, 790
Desconocido Probabilidad: 0.953 AA1: 19 AA2: 20 MKEVVVLGAGMVGTATALA
791, 792
Desconocido
793, 794
Desconocido
795, 796
Desconocido
797, 798
Desconocido
799, 800
Desconocido
801, 802
Desconocido Probabilidad: 0.903 AA1: 18 AA2: 19 MHVIVIGAGVVGSTTALA
61
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
803, 804
Desconocido Probabilidad: 0.763 AA1: 22 AA2: 23 MPPHVIVVGAGVVGASTALSLA
805, 806
Desconocido
807, 808
Desconocido Probabilidad: 0.785 AA1: 18 AA2: 19 MHIVVIGAGVMGVTTAYA
809, 810
Desconocido
811, 812
Desconocido
813, 814
Desconocido
815, 816
Desconocido
817, 818
Desconocido Probabilidad: 0.973 AA1: 18 AA2: 19 MKILVLGAGVVGTATALA
819, 820
Desconocido Probabilidad: 0.926 AA1: 20 AA2: 21 MHVVVLGAGVVGTTTALALA
821, 822
Desconocido
823, 824
Desconocido
825, 826
Desconocido
827, 828
Desconocido
829, 830
Desconocido Probabilidad: 0.973 AA1: 24 AA2: 25 MNKRTPERVVVIGGGVVGASTALA
831, 832
Desconocido Probabilidad: 0.995 AA1: 33 AA2: 34
62
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
833, 834
Desconocido Probabilidad: 0.903 AA1: 18 AA2: 19 MHVIVIGAGVVGSTTALA
835, 836
Desconocido
837, 838
Desconocido
839, 840
Desconocido
841, 842
Desconocido
843, 844
Desconocido
845, 846
Desconocido
847, 848
Desconocido
849, 850
Desconocido Probabilidad: 0.930 AA1: 18 AA2: 19 MRVLVLGAGVVGTATALA
851, 852
Desconocido
853, 854
Desconocido
855, 856
Desconocido Probabilidad: 0.553 AA1: 23 AA2: 24 MQKDIWDFVIVGAGMAGASTAWQ
857, 858
Desconocido Probabilidad: 0.553 AA1: 23 AA2: 24 MQKDIWDFVIVGAGMAGASTAWQ
859, 860
Desconocido Probabilidad: 0.553 AA1: 23 AA2: 24 MQKDIWDFVIVGAGMAGASTAWQ
861, 862
Desconocido Probabilidad: 0.672 AA1: 23 AA2: 24 MAHYDAVVVGAGVVGLTTAVSLA
63
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
863, 864
Desconocido Probabilidad: 0.544 AA1: 20 AA2: 21 MRVLVLGSGVIGTASAYYLA
865, 866
Desconocido
867, 868
Desconocido
869, 870
Desconocido
871, 872
Desconocido
873, 874
Desconocido
875, 876
Desconocido
877, 878
Desconocido
879, 880
Desconocido
881, 882
Desconocido
883, 884
Desconocido
885, 886
Desconocido
887, 888
Desconocido
889, 890
Desconocido
891, 892
Desconocido
64
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
893, 894
Desconocido
895, 896
Desconocido
897, 898
Desconocido
899, 900
Desconocido
901, 902
Desconocido
903, 904
Desconocido
905, 906
Desconocido
907, 908
Desconocido Probabilidad: 0.665 AA1: 18 AA2: 19 MAADVVWLNGAVVPAAEA
909, 910
Desconocido
911, 912
Desconocido
913, 914
Desconocido
915, 916
Desconocido
917, 918
Desconocido
919, 920
Desconocido
921, 922
Desconocido
65
SEQ ID NO:
Fuente Sitio de escisión Signalp Secuencia de señalización predicha
923, 924
Desconocido
925, 926
Desconocido
927, 928
Desconocido
929, 930
Desconocido
931, 932
Desconocido
933, 934
Desconocido Probabilidad: 0.607 AA1: 30 AA2: 31 MARVSRRFLEDSSSGATTMAFAQLAS EAKR
935, 936
Desconocido
937, 938
Desconocido
939, 940
Desconocido
941, 942
Desconocido
943, 944
Desconocido
945, 946
Desconocido
947, 948
Desconocido
949, 950
Desconocido
951, 952
Pyrolobus fumarius
66
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Tabla 4. Actividad de subclones de D-aminotransferasa sobre R,R-monatina y D-triptófano
SEQ ID NO:
Actividad sobre R,R-monatina Actividad sobre D-triptófano Expresión relativa
µg/mL de D-alanina formados a la hora indicada
µg/mL de D-alanina formada a la hora indicada
928
30@24hr NT +
938
122@24hr NT ++
940
5@24hr NT ND
942
12@24hr NT ND
944
75@24hr NT ND
946
39@24hr NT ND
948
200@0.5hr 441@0.5hr ND
950
75@0.5hr 452@0.5hr ND
962
NT NT +
964
7@24hr ND@24hr ++
966
NT NT ++
968
6.7@24hr 52@24hr +++
886 /expresado en células XL1Blue)
NT NT ++
886 (expresado en células E, coli HMS174)
15.4@24hr 143@24hr +++
888 (expresado en células XL1Blue)
NT NT ++
888 (expresado en células HMS174)
7@24hr 317@24hr +++
890 (expresado en células XL1 Blue)
NT NT ++
890 (expresado en células HMS174)
54@24hr 278@24hr +++
892 (expresado en células XL1 Blue)
NT NT +
892 (expresado en células HMS174)
113@24hr <5@24hr ++
894 (expresado en células XL1 Blue)
NT NT ND
894 (expresado en células HMS174)
16@24hr 116@24hr +
866
28@24hr NT +++
145
SEQ ID NO:
Actividad sobre R,R-monatina Actividad sobre D-triptófano Expresión relativa
µg/mL de D-alanina formados a la hora indicada
µg/mL de D-alanina formada a la hora indicada
868
<1@24hr NT +++
970
10.8@24hr NT +
870
123.5@24hr NNTT +++
872
62.3@24hr NT +++
874
46.5@hr NT +++
876
44@24hr NT ++
878
37@24 NT +++
972
<5@24 NT +
880
72.4@24hr 79.6@24hr +
882
158.8@24hr 344@2hr +++
884
290@24hr 363@2hr ++
896
54@24hr 450@2hr +++
898
466@24hr 300@24hr +
900
135@24hr 154@24hr +
902
280@24hr 130@24hr ++
904
170@24hr 140@24hr +
906
700@24hr 500@24hr +++
908
55@24hr 45@24hr Insoluble
910
384@24hr 240@24hr +++
912
NT NT ND
914
NT NT ND
916
NT NT ND
918
NT NT ND
920
NT NT ND
922
NT NT ND
924
NT NT ND
926
NT NT ND
974 (expresado en células E, coli HMS174)
NT NT ND
146
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imagen102
bien 30 o 60 segundos. El tiempo de extensión (a 72°C) fue al menos 2 minutos por kb. Los productos de reacción fueron separados normalmente sobre un gel de agarosa 1x TAE al 1%, y las bandas de tamaños apropiados fueron purificadas con el QIAquick Gel Extraction Kit según lo recomienda el fabricante excepto que se utilizó un volumen de dilución de 10 a 50 µl. Se utilizaron volúmenes de 1 a 4 µl del producto de PCR ya purificado para la ligazón con
5 el plásmido PCRII-Topo Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) según lo recomienda el fabricante.
Clonación de DAT en pET30a para expresión no etiquetada
Los DATs que tienen la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 945, 947, 949 , 891, 893, 869, 873, 877, 881, 883, y 895 (que codifican los polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 946, 948, 950 , 892, 894, 870, 874, 878, 882, 884, y 896) fueron amplificados a partir de plásmidos o productos de PCR con Pfu Turbo (Stratagene, La Jolla,
10 CA) y cebadores agregando un Nde I en el extremo 5’ y un sitio de restricción Not I o BamH I en el extremo 3’. Los fragmentos de PCR fueron clonados en pCR-Blunt II-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA) según lo recomienda el fabricante. La secuencia fue verificada por secuenciación (Agencourt, Beverly, MA) y los insertos con las secuencias correctas fueron liberadas entonces del vector utilizando las enzimas de restricción apropiadas y ligados en los sitios de restricción Nde I y Not I (o BamH I) de pET30a. Véase la Tabla 5 para cebadores específicos.
15 El ácido nucleico DAT que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 155 (que codifica el polipéptido que tiene SEQ ID NO: 156) fue amplificado con Pfu Turbo (Stratagene) y los cebadores que agregan un sitio de restricción Nde I y Hind III en el extremo 5’ y 3’, respectivamente. Los fragmentos de PCR fueron digeridos utilizando enzimas de restricción Nde I y Hind III y ligados en los sitios de restricción de Nde I y Hind III de pET30a. Véase la Tabla 5 para cebadores específicos. Debe anotarse que el polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 156 parecía contener la
20 siguiente secuencia guía con una probabilidad de 0.991 (determinada según SignalP, como se discute en Nielsen, 1997, Protein Engineering, 10:1-6): KNSPIIAAYRAATPGSAAA (SEQ ID NO: 1084). El ácido nucleico que codifica este polipéptido DAT fue clonado con la secuencia guía aparente.
Tabla 5. Cebadores para amplificación
Amplifica SEQ ID NO:
Cebadores para PCR SEQ ID NO
945
5’-CCGCCCCATATGAACGCACTAGGATATTACAACGGAAAATGG-3’ 5’-GGCGGATCCTTATCCAAAGAATTCGGCACGAGCTGTC-3’ 978 979
947
5’-CCGCCCCATATGCGCGAAATTGTTTTTTTGAATGGG -3’ 5’-CGGATCCCTAAACCATCTCAAAAAACTTTTGCTGAATAAACCGTG -3’ 980 981
949
5’-CCGCCCCATATGTTGGATGAACGGATGGTGTTCATTAAC-3’ 5’-GGCGGATCCCTAGTCCACGGCATAGAGCCACTCGG-3’ 982 983
891
5’-GGCCGCATATGGACGCACTGGGATATTACAACGGAAAATG-3’ 5’-GGCCGCGGCCGCCTATGCCTTTCTCCACTCAGGCGTGTAGC -3’ 984 985
893
5’-GGCCGCATATGGACGCACTGGGATATTACAACGGAAAATG -3’ 5’-GGCCGCGGCCGCCTATACTGTGCTCCACTCAGGCGTGTAGCC -3’ 986 987
869
5’-CATATGTATTCATTATGGAATGATCAAATAGTGAAGG -3’ 5’-GCGGCCGCCTATTTATTCGTAAAAGGTGTTGGAATTTTCG -3’ 988 989
873
5’-CATATGAGCACCCCGCCGACCAATC-3’ 5’-GCGGCCGCCTAGGCCGCCTTCACTTCACGCTC -3’ 990 991
877
5’-CATATGAGCACCCCGCCAACCAATTC-3’ 5’-GCGGCCGCCTACGCGGCCTTCACTTCGCGC -3’ 992 993
151
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imagen104
Síntesis in vitro de LsDAT
El DAT de Lactobacillus salivarius fue ensamblado utilizando un método revisado basado en Stemmer et al., 1995, Gene, 164:49-53. En resumen, 43 oligonucleótidos (primariamente 40-meros) fue ordenado a partir de IDT con base en la secuencia genética y su secuencia de ADN complementaria, con 20 superposiciones de pares de bases entre 5 las cadenas en sentido y antisentido. Véase la Tabla 9 para la lista de cebadores. Los cebadores fueron diluidos a 250 µM en agua y 5 µL de cada cebador fueron mezclados juntos en un tubo de microcentrífuga. Se llevó a cabo el PCR como sigue: por 100 µL de reacción, 1.5 µL del conjunto de cebadores, 4 µL dNTP, regulador de PCR 1X XL, acetato de magnesio 1 mM, 2 µL rTth polimerasa (Roche, Indianápolis, IN) y fueron agregados 0.25 µL de Pfu polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA). Se hizo un inicio en caliente de 3 minutos a 94°C, seguido por 15 ciclos de 10 94°C durante 30 segundos, 42°C durante 30 segundos, y 68°C durante 15 segundos. Se realizaron diez ciclos más con un tiempo de extensión de 30 segundos (a 68°C). Se llevaron a cabo diez ciclos más con un tiempo de extensión de 75 segundos. Finalmente, se realizó una etapa de extensión de cadena durante siete minutos a 68°C.
Tabla 9. Oligos utilizados para la síntesis de LsDAT
Designación
Secuencia (5´ → 3´) SEQ ID NO:
F1:
ATGAAGCAAG TTGGATACTA CAATGGTACT ATCGCTGATT 1017
F2:
TAAATGAACT TAAGGTGCCT GCTACTGATC GTGCACTTTA 1018
F3:
TTTTGGTGAT GGTTGCTACG ATGCAACTAC ATTTAAGAAC 1019
F4:
AATGTTGCAT TTGCCTTAGA AGATCATCTT GATCGTTTTT 1020
F5:
ATAATAGTTG TCGCCTACTA GAGATCGATT TCCCTTTAAA 1021
F6:
TCGCGATGAA CTTAAAGAAA AGCTTTACGC TGTTATTGAT 1022
F7:
GCTAACGAAG TTGATACTGG TATCCTTTAT TGGCAAACTT 1023
F8:
CACGTGGTTC TGGTTTACGT AACCATATTT TCCCAGAAGA 1024
F9:
TAGCCAACCT AATTTATTAA TTTTTACTGC TCCTTATGGT 1025
F10:
TTAGTTCCAT TTGATACTGA ATATAAACTT ATATCTCGCG 1026
F11:
AAGACACTCG CTTCTTACAT TGCAATATTA AAACTTTGAA 1027
F12:
TTTACTTCCA AACGTTATTG CAAGTCAAAA GGCTAATGAA 1028
F13:
AGTCATTGCC AAGAAGTGGT CTTCCATCGC GGTGACAGAG 1029
F14:
TTACAGAATG TGCACACTCT AACATCTTAA TTCTAAAAGA 1030
F15:
TGGCGTTCTT TGCTCCCCAC CTAGAGATAA TTTAATCTTG 1031
F16:
CCAGGAATTA CTTTGAAACA TCTCTTGCAA TTAGCAAAAG 1032
F17:
AAAATAATAT TCCTACTTCC GAAGCACCAT TCACTATGGA 1033
F18:
TGATCTTAGA AATGCTGATG AAGTTATTGT TAGTTCTTCA 1034
F19:
GCTTGTCTAG GTATTCGCGC AGTCGAGCTT GATGGTCAGC 1035
F20:
CTGTTGGTGG AAAAGATGGA AAGACTTTAA AGATCTTGCA 1036
F21:
1037
R1:
TAGTATCCAA CTTGCTTCAT 1038
154
R2:
AGGCACCTTA AGTTCATTTA AATCAGCGAT AGTACCATTG 1039
R3:
CGTAGCAACC ATCACCAAAA TAAAGTGCAC GATCAGTAGC 1040
R4:
TCTAAGGCAA ATGCAACATT GTTCTTAAAT GTAGTTGCAT 1041
R5:
TAGTAGGCGA CAACTATTAT AAAAACGATC AAGATGATCT 1042
R6:
TTTCTTTAAG TTCATCGCGA TTTAAAGGGA AATCGATCTC 1043
R7:
CCAGTATCAA CTTCGTTAGC ATCAATAACA GCGTAAAGCT 1044
R8:
ACGTAAACCA GAACCACGTG AAGTTTGCCA ATAAAGGATA 1045
R9:
TTAATAAATT AGGTTGGCTA TCTTCTGGGA AAATATGGTT 1046
R10:
TCAGTATCAA ATGGAACTAA ACCATAAGGA GCAGTAAAAA 1047
R11:
ATGTAAGAAG CGAGTGTCTT CGCGAGATAT AAGTTTATAT 1048
R12:
CAATAACGTT TGGAAGTAAA TTCAAAGTTT TAATATTGCA 1049
R13:
ACCACTTCTT GGCAATGACT TTCATTAGCC TTTTGACTTG 1050
R14:
AGAGTGTGCA CATTCTGTAA CTCTGTCACC GCGATGGAAG 1051
R15:
GTGGGGAGCA AAGAACGCCA TCTTTTAGAA TTAAGATGTT 1052
R16:
TGTTTCAAAG TAATTCCTGG CAAGATTAAA TTATCTCTAG 1053
R17:
GGAAGTAGGA ATATTATTTT CTTTTGCTAA TTGCAAGAGA 1054
R18:
CATCAGCATT TCTAAGATCA TCCATAGTGA ATGGTGCTTC 1055
R19:
GCGCGAATAC CTAGACAAGC TGAAGAACTA ACAATAACTT 1056
R20:
TCCATCTTTT CCACCAACAG GCTGACCATC AAGCTCGACT 1057
R21:
ATTTCTTAGC ATAAGCATCT TGCAAGATCT TTAAAGTCTT 1058
R22:
TTAACGACTT ACAGTTTCAG CATTAT 1059

Tabla 10. Secuencias de cebadores
Una amplificación secundaria con cebadores de L. sal DAT R Not I y L. sal DAT F Nde I (más abajo) dieron como resultado un banda del peso molecular correcto. Véase la Tabla 10 para estas secuencias de cebadores de amplificación secundarias.
Designación
Secuencias (5´→ 3´) SEQ ID NO:
L. sal DAT R NotI
TTGGCCAAGCGGCCGCTTAACGACTTACAGTTT 1060
L. sal DAT F NdeI
GGTTCAAGGCATATGAAGCAAGTTGGATACTA 1061
La reacción de PCR secundaria fue configurada de la misma forma que la anterior con la excepción de que solamente se agregaron 2 cebadores. Para la plantilla de PCR, se utilizaron 2.5 µl de la reacción de PCR primaria. Se hizo un inicio en caliente de 3 minutos a 94°C., seguidos por 10 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 42°C
10 durante 30 segundos, y 68°C durante 15 segundos. Se hicieron 10 ciclos más con una temperatura de fusión incrementada de 48°C durante 30 segundos con un tiempo de extensión de 30 segundos (a 68°C). Finalmente, se hizo una etapa de extensión de cadena durante siete minutos a 68°C.
155
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5
10
15
20
25
30
Los marcos de lectura abierta que codifican los polipéptidos DAT que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 898, 900, 902, 904, 906, 910, y 896 fueron evaluados. Una persona de experiencia normal en la técnica puede sintetizar los genes que codifican estas D-aminotransferasas utilizando las técnicas de PCR en ensamblaje tales como las descritas en el Ejemplo 4.
Un cultivo de E. coli BL21 DE3 que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido DAT que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 896 en el vector pET30a (subclonado como se describe en el Ejemplo 4) fue cultivado en 50 mL de Overnight Express (Novagen) en un matraz con deflexión de 250 mL durante la noche a 30°C y 250 rpm. Las células fueron recolectadas por centrifugación cuando la densidad óptica a 600 nm fue superior a 10.
Células de E. coli Top10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) fueron transformadas con el plásmido pSE420-cHis que contiene los ácidos nucleicos de DAT que tienen la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 897, 899, 901, 903, 905, y 909 y se sembraron en medio LB que contenía ampicilina (100 µg/mL). Se utilizaron 500 µL de un cultivo durante la noche para inocular 50 mL del mismo medio en un matraz con deflexión de 250. Las células fueron cultivadas a 30°C hasta una OD600nm de aproximadamente 0.4 y se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Las células fueron cultivadas a 30°C durante 4 horas y recolectadas por centrifugación.
Se prepararon extractos celulares como se describe en el Ejemplo 4. Las concentraciones de proteína soluble y DAT estimada fueron determinadas como se describe en el Ejemplo 4.
Se llevó a cabo un ensayo de formación de R,R monatina tal como se describe en el Ejemplo 5 con concentraciones de polipéptidos de DAT de 0.5 mg/mL, excepto que se utilizaron 0.3 mg/mL del polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 896; se usaron 0.06 mg/mL del polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 898; se usaron 0.4 mg/mL del polipéptido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 900; se usaron 0.1 mg/mL del polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 902; y se usaron 0.12 mg/mL del polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 904. Como controles positivos, se probaron SEQ ID NO: 870, 870 T242N, y B. sphaericus purificado a concentraciones de polipéptido de DAT de 0.5 mg/mL. Después de 2, 6, y 24 horas, se tomó una alícuota, se agregó ácido fórmico hasta una concentración final de 2% y las muestras fueron congeladas. Las muestras fueron luego descongeladas, agitadas y filtradas. Las muestras fueron analizadas en cuanto al contenido de monatina utilizando la metodología de LC/MS/MS descrita en el Ejemplo 3. Se tomaron alícuotas adicionales para el análisis de distribución estereoisomérica y no fueron tratadas con ácido fórmico. Los resultados para el punto de tiempo de 24 horas se muestran en la Tabla 24. El ácido nucleico de DAT que codifica el polipéptido de DAT que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 908 no fue subclonado y no pudo ser probado.
Tabla 24
Polipéptido (SEQ ID NO:)
Monatina 2 horas (ppm) Monatina 6 horas (ppm) Monatina 24 horas (ppm) 24 horas % R,R
B. sphaericus
261 1203 2604 95.6
870
193 1067 2490 96.8
870 T242N
813 2230 3380 98.8
896
30 127 286 99.8
898
nd 3 15 95.7
900
4 16 56 92.9
902
144 411 1209 96.7
904
nd 1 4 92.3
906
14 18 25 98
910
487 1154 2770 94.5
nd = no detectable bajo las condiciones probadas
170
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Polipéptido (SEQ ID NO:)
2 horas 4 horas 8 horas 24horas
196
1 1.8 nd 8
156
64.8 156 296 796
B. sphaericus
422 791 1302 2124
nd = no detectable bajo las condiciones probadas

Tabla 29. Monatina formada (ppm)
Polipéptido (SEQ ID NO:)
2 horas 4 horas 8 horas 24horas
166
nd nd 1 nd
216
69 91 109 134
200
nd nd 1 1
198
nd nd nd nd
210
1.6 3.8 6.2 15.2
202
3.4 6.2 12.2 29.8
222
3.6 7 12.8 25.8
236
nd nd nd nd
204
nd nd nd 3.6
238
10.4 21.8 46.4 115.6
240
3 6 12.4 32.2
224
39.8 85 171.8 268.8
226
2.6 5.8 12.4 30.6
228
4.2 9.8 21.4 66.8
230
9.2 21.8 42.2 94.4
232
3.6 9.4 21.6 57
246
nd nd nd nd
214
160 327 694 1346
B. sphaericus
393 986 1624 2597
nd = no detectable bajo las condiciones probadas
La alta actividad del polipéptido de SEQ ID NO: 220 fue confirmada en otro ensayo de formación de monatina donde el polipéptido de SEQ ID NO: 220 fue comparado con los polipéptidos DAT de SEQ ID NO: 870, 870 T242N y B. sphaericus. Se utilizó una concentración de polipéptido de DAT de 0.1 mg/mL y 0.5 mg para cada uno de los polipéptidos de DAT ensayados. Los resultados se muestran en la Tabla 30. Debido al alto grado de actividad de los polipéptidos de DAT probados, las muestras de monatina tuvieron que ser diluidas 100 veces para que estuvieran dentro del rango cuantitativo de los instrumentos usados (en oposición a una dilución típica de 10 o 20 veces).
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Tabla 42
Línea
Muestra % de expresión de DAT estimado
L
Pro260 Ladder
1
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIII#1 4.3
2
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIII#2 2.3
3
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#1 14.6
4
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#2 14.2
5
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIII#1 4.4
6
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIII#2 5.2
7
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#1 13.8
8
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#2 16.1
9
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#1 16.2
10
BL21(DE3):: SEQ ID NO:893/pCOLDIV#2 16.8
Los resultados de Experion Pro260 muestran que la proteína de DAT de SEQ ID NO: 894 se expresa mejor cuando el ácido nucleico es incorporado en el vector pCOLDIV que en el vector pCOLDII o pCOLDIII. A partir de los 5 experimentos mostrados anteriormente, el nivel de expresión promedio para SEQ ID NO: 893/pCOLDII fue aproximadamente 8%, independientemente del anfitrión de expresión usado; el nivel de expresión promedio para SEQ ID NO: 893/pCOLDIII fue aproximadamente 4%, mientras que el nivel de expresión promedio para SEQ ID NO: 893/pCOLDV fue -15%. Estos niveles de expresión son significativamente menores que los descritos en los Ejemplos 16 cuando el ácido nucleico de SEQ ID NO: 893 fue coexpresado con las chaperonas GroEL-GroES y en
10 el Ejemplo 17 cuando el ácido nucleico fue expresado en el sistema Startagene ArcticExpressTM.
Ejemplo 21 – Modificación de codón de un DAT
Un intento para mejorar la solubilidad del polipéptido de SEQ ID NO: 894 expresado en E. coli fue llevado a cabo con la presunción de que, disminuyendo la rata de traducción en E. coli permitiría un mayor tiempo para un plegamiento apropiado del polipéptido de SEQ ID NO: 894, dando por lo tanto una expresión superior de la proteína
15 soluble. Una búsqueda BLAST (NCBI) de la secuencia del polipéptido de SEQ ID NO: 894 reveló que algunas de las secuencias públicas más cercanamente relacionadas eran de especies de Clostridium, específicamente Clostridium beijerinckii. El Ejemplo 9 describe los resultados de clonar, expresar y ensayar el CbDAT y su uso en las reacciones de formación de monatina. Específicamente, la expresión fue alta en la fracción de proteína total pero muy baja en la fracción de proteína soluble.
20 Las tablas de utilización de codón de C. beijerinckii y E. coli K12 fueron comparadas. Varios codones raramente usados en C. beijerinckii que fueron encontrados como altamente abundantes en E. coli K2 (Tabla 43). Es posible que estos codones produzcan pausas de traducción en C. beijerinckii, mientras que en un anfitrión E. coli K12 pueden no ser una pausa. En la secuencia de SEQ D NO: 894, se identificaron 4 dobletes en los cuales codones raros en tándem para C. beijerinckii se han convertido en “no raros” (esto es, abundante) en E. coli K12. La meta era
25 cambiar estos codones en codones raros para la expresión en el anfitrión E.coli K12 utilizando la tabla de utilización del codón de E. coli K12. Se diseñaron cebadores para cambiar estos dobletes. Se utilizó SEQ ID NO: 893/PpET30a (descrito en el Ejemplo 4) como plantilla y se llevó a cabo la mutación de acuerdo con las instrucciones del kit Stratagene QuickChange. Los cebadores utilizados para modificar las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 893 se muestran más abajo, junto con el gen nativo (las secuencias de doblete objetivo están subrayadas).
30
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Como se muestra más arriba, las enzimas aminotransferasa y aldolasa fueron muy activas a las concentraciones de reactivo más altas y se alcanzó una concentración de monatina mucho mayor.
A las 18 horas, utilizando indol-3-piruvato 200 mM, piruvato de sodio 200 mM y D-triptófano 100 mM, la concentración de monatina fue 61 mM. Se observó un pequeño descenso en la producción de monatina (47.8 mM) 5 bajo las condiciones del ensayo, con la adición de D-triptófano 50 mM en vez de utilizar solamente D-alanina 400 mM.
La Tabla 45 muestra algunos de los polipéptidos de DAT más activos y los homólogos correspondientes más cercanos de las bases de datos publicadas o literatura.
10 Tabla 45

Ejemplo 24 – Tabla de homología
Polipéptido de DAT (SEQ ID NO:)
Acierto más cercano de la base de datos % identidad de secuencia
896
Bacillus sp. YM-1 76
874
Serina glioxilato transaminasa de Acidiphilium cryptum JF-5 (NR Accession No: 148260372) 51
878
glutamato-1-semialdehído 2,1-aminomutasa putativa de Planctomyces maris DSM 8797 (NR Accession No. 149173540) 43
882
D-alanina transaminasa de Oceanobacter sp. RED65 (NR Accession No: 94500389) 57
910
DAT de B. macerans 91
176
D-amino acid aminotransferasa de Clostridium beijerincki (NCIMB 8052) 62
220
D-amino acid aminotransferasa de Clostridium beijerincki (NCIMB 8052) 62
156
Aminotransferasa clase-III (guiada) de Chloroflexus aggregans DSM 9485 (NR Accession No: 118045454) 46
214
D-amino acid aminotransferasa de Clostridium beijerincki (NCIMB 8052) 61
918
Aminotransferasa clase IV de Robiginitalea biformata HTCC2501 (NR Accession No: 88806011) 57
902
glutamato-1-semialdehído 2;1-aminomutasa putativa de Planctomyces maris DSM 8797 (misma proteína de más arriba) 46
884
D-alanina transaminasa de Thiobacillus denitrificans ATCC 25259 (NR Accession No: 74316285) 40
866
D-alanina aminotransferasa de Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius UCC118 49
946
D-amino acid aminotransferasa de Clostridium beijerincki (NCIMB 8052) 63
193
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primera mutación listada “Y6L” se refiere a cambiar la tiroxina en la posición de aminoácido 6 de la enzima tipo silvestre (SEQ ID NO: 220) a leucina. A nivel de ácidos nucleicos, cualquier codón que codifique el aminoácido deseado (mutado) puede ser usado.
Todas las secuencias de aminoácidos descritas en las Tablas 46, 47 y 53, a continuación, son polipéptidos de ejemplo; también se proveen secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos.
Ejemplo 26 – Lista de mutaciones por GSSMSM

Tabla 46: Mutantes por GSSMSM identificados como aciertos de la selección secundaria
Nombre del mutante
Mutación Nombre del mutante Mutación
1
Y6L 92 D2G
2
Y6C; MUTACION SILENCIOSA AT AA31 (GGC → GGT) 93 D2Q
3
Y6F 94 D2F
4
Y6L 95 D2A
5
Y6H 96 D2T
6
Y6L 97 D2N
7
Y6M 98 D2R
8
N10S 99 D2I
9
N10W 100 D2V;G9A
10
N10T 101 G12A
11
N10R 102 D47W
12
N10T 103 S56S
13
L14V 104 I64H
14
L14L 105 L66L
15
G41G 106 I64C
16
T18W 107 L66G
17
N40N 108 E69Y
18
V19T 109 T74L
19
V42V 110 K73L
20
I62C 111 T74V
21
V82A 112 T74M
22
A57M 113 T74R
23
V42M 114 T74A
24
G41Y 115 N76C
25
A45L 116 E77R
195
Nombre del mutante
Mutación Nombre del mutante Mutación
26
V93Y 117 R156A
27
V93G 118 K72M
28
L46A 119 S205A
29
L46H 120 Q209S
30
G98A 121 V212E
31
P20S 122 R213W
32
V93A 123 I216T
33
V103T 124 P217H
34
P108F 125 P217V
35
V93L 126 D219F
36
S101S 127 E220V
37
A106G 128 R221E
38
S101Q 129 F223C
39
P108T 130 S226P
40
N118G 131 L228F
41
P108G 132 V234A
42
I120L 133 S238S
43
A106W 134 V236T
44
N118R 135 V236T
45
N110A; N118G 136 T241R
46
N118A 137 L242F
47
N118R 138 T241R
48
P117W; N118K 139 T241C
49
D133N 140 E248F
50
K126Q 141 D250E
51
K126R 142 K257V
52
K128S 143 G256K
53
I127M 144 E260G
54
T131T 145 L262R
55
D133L 146 K263M
56
M132A 147 D267G
196
Nombre del mutante
Mutación Nombre del mutante Mutación
57
D133E 148 D267R
58
L129V 149 1265L
59
K126K 150 E268S
60
I130M 151 L270S
61
M132Y 152 L270G
62
K128R 153 L270W
63
M132R 154 R271S
64
L129I 155 I274W
65
K128L; D2D (GAC → GAT) 156 G278S
66
F137W 157 Y279C
67
I152V 158 S284R
68
N55L 159 E282G
69
N150S 160 T280N
70
L138L 161 V286G
71
P149P 162 R285F
72
G161G 163 V286R
73
A165T 164 G240G
74
H163R 165 E61R
75
H163K 166 E61D
76
H168A 167 E61Y
77
E171S 168 G85G
78
E171R 169 G85D
79
E171R 170 S80R
80
T172I 171 Y79R
81
C176G 172 Y79V
82
A177S 173 W283V
83
A177S 174 W283E
84
S80L; R156W 175 W283A
85
H182G 176 W283S
86
N186S 177 W283G
87
K185R 178 W283A
197
imagen140
Mutante
Mutación Actividad relativa a control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220)
Reacción con sustrato de monatina 1 mM
Reacción con sustrato de monatina 15 mM
35
V93L 1.14 0.96
40
N118G 2.61 1.52
44
N118R 1.55 0.47
45
N110A; N118G 2.50 2.02
46
N118A 2.28 0.69
48
P117W; N118K 2.54 1.12
58
L129V 1.04 0.85
66
F137W 1.25 1.44
67
I152V 1.19 1.24
81
C176G 1.11 1.27
82
A177S 1.24 1.02
104
I64H 1.37 1.07
109
T74L 1.37 1.31
110
K73L 2.83 3.75
111
T74V 1.99 2.19
112
T74M 1.78 2.01
135
V236T 3.44 2.88
136
T241R 2.64 1.79
152
L270G 1.24 0.89
153
L270W 2.00 1.54
174
W283E 1.23 0.84
175
W283A 1.61 1.09
177
W283G 1.71 1.06
6
Y6L 2.52 2.21
88
K185T 1.04 0.95
107
L66G 1.08 1.02

Ejemplo 28 – Actividad de mutantes por GSSMSM en el proceso de monatina
Se identificaron varias muestras que sobrepasaban el rendimiento del control tipo silvestre bajo las condiciones probadas. Se identificaron sobremutantes potenciales Km y Vmax. Estos resultados indican que el control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220) es evolucionable fácilmente hacia una actividad específica incrementada de Daminotransferasa sobre la monatina.
199
imagen141
Beverly, MA) para verificar que se incorporaron las mutaciones correctas. Los plásmidos fueron transformados entonces en anfitriones de expresión E. coli B834(DE3) (Novagen, San Diego, CA).

Tabla 49. Cebadores para mutagénesis
Mutante producido
Cebadores para PCR Plantilla
Mutante 2
imagen142 SEQ ID NO: 220
Mutante 6
SEQ ID NO: 220
Mutante 27
SEQ ID NO: 220
Mutante 40
SEQ ID NO: 220
Mutante 44
SEQ ID NO: 220
Mutante 45
imagen143 Mutante 40
Mutante 58
imagen144 SEQ ID NO: 220
Mutante 110
SEQ ID NO: 220
Mutante 135
imagen145 SEQ ID NO: 220
Mutante 136
SEQ ID NO: 220
El Mutante 2, Mutante 6, Mutante 27, Mutante 40, Mutante 45, Mutante 58, Mutante 110, Mutante 119, Mutante 131, Mutante 135, Mutante 136, Mutante 152, Mutante 154 fueron generados en el vector pMET1a y transformados en el anfitrión de expresión compatible de E. coli B834(DE3) (Novagen, San Diego, Ca) descrito en el Ejemplo 2. Los
201
cultivos nocturnos en medio LB que contenían carbenicilina (100 µg/mL) fueron diluidos 1:100 en 100 mL del mismo medio y cultivados en un matraz con deflexión de 500 mL. El cultivo fue hecho crecer a 30°C durante la noche hasta una OD600nm de 10 en medio Overnight Express II (Solución 1-6, Novagen). Las muestras para proteína total fueron tomadas inmediatamente antes de la recolección. Las células fueron recolectadas por centrifugación y lavadas con
5 10 mL de regulador de fosfato de potasio pH 7.8. Las células fueron congeladas inmediatamente a -80°C hasta que se prepararon los extractos celulares. Hay que anotar, que además de la mutagénesis dirigida al sitio, una persona experimentada en la técnica puede sintetizar los genes que codifican estas D-aminotransferasas utilizando técnicas de PCR de mutagénesis multicambio tales como las descritas en el Ejemplo 25.
Los extractos celulares fueron preparados y desalinizados como se describe en el Ejemplo 4 utilizando fosfato de
10 potasio 100 mM como regulador para eludir y equilibrar la columna PD10. Las concentraciones de proteína total y DAT fueron determinadas como se describe.
La transaminación de R,R monatina con piruvato como receptor de amino fue llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 5 excepto que se utilizó R,R monatina 15 mM. Los análisis iniciales de los niveles de alanina, monatina y precursor de monatina identificados como Mutante 40, Mutante 135 y Mutante 136 como mutantes superiores dio
15 como resultado los niveles más altos de producción de alanina como se muestra en la Tabla 50. El Mutante 136 de DAT pareció tener la actividad más alta para la conversión de R,R monatina a R-MP. Los números de producción de alanina (en mM) para los diversos puntos del tiempo se muestran en la Tabla 50.
Tabla 50: Formación de alanina (mM) a partir de reacciones de transaminación de R,R monatina a partir de DATs clonados en pMET1a
Polipéptido de DAT
Alanina (mM) 15 minutos Alanina (mM) 30 minutos Alanina (mM) 60 minutos Alanina (mM) 120 minutos
Control tipo silvestre
3.08 5.47 8.19 10.07
Mutante 2
3.38 5.74 8.85 10.52
Mutante 6
3.51 5.97 8.99 10.81
Mutante 27
4.36 8.00 10.72 10.52
Mutante 40
7.89 10.37 11.79 12.50
Mutante 44
2.65 4.58 7.18 --
Mutante 58
3.90 6.95 9.93 10.52
Mutante 110
3.50 6.17 9.53 10.52
Mutante 135
5.35 8.64 10.82 10.91
Mutante 136
6.24 9.46 11.24 11.15
Mutante 152
4.26 7.12 9.83 10.32
Mutante 154
4.16 7.13 10.07 10.76
--: no determinado bajo las condiciones presentes
20
Para establecer adicionalmente la actividad, se realiza un ensayo de formación de monatina como se describe en el Ejemplo 1 con una concentración de DAT de aproximadamente 0.2 mg/mL. Como control, se evaluó una concentración de 0.2 mg/mL de DAT tipo silvestre purificado. Después de 0.5, 1. 2 y 4 horas se tomó una alícuota y se agregó ácido fórmico hasta una concentración de 2% y las muestras fueron agitadas y filtradas. Las muestras
25 fueron analizadas en cuanto al contenido de monatina utilizando la metodología de LC/MS/MS descrita aquí y en cuanto al contenido de triptófano y alanina utilizando la metodología de fluorescencia postcolumna LC/OPA descrita en el Ejemplo 36.
202

Tabla 51: Actividad de DATs en pMET1a
Polipéptido de DAT
Monatina(mM) 0.50 horas Monatina (mM) 1,00 horas Monatina (mM) 2,00 horas Monatina (mM) 4,00 horas
Control tipo silvestre
3.96 7.83 9.70 11.18
Mutante 2
1.56 3.78 8.77 12.68
Mutante 27
4.70 9.70 n.d. 13.80
Mutante 44
3.03 5.61 8.50 12.28
Mutante 45
1.40 4.00 7.70 11.50
Mutante 58
3.83 7.23 11.33 14.12
Mutante 110
2.60 5.90 9.90 12.70
Mutante 119
4.12 7.87 11.37 13.50
Mutante 131
3.75 7.41 11.40 13.90
Mutante 135
6.39 10.65 13.49 13.15
Mutante 136
3.36 8.02 12.86 13.16
Mutante 154
3.00 6.06 10.67 13.17
Todos los DAT mostrados en la Tabla 51 produjeron monatina. Los mutantes de DAT Mutante 58, Mutante 135 y Mutante 136 tuvieron ratas iniciales más rápidas que el control tipo silvestre. El Mutante 136 fue más lento para la 5 reacción uno (conversión de D-Trp a I3P) pero tuvo mejor producción global de monatina que el control tipo silvestre.
Para el punto de tiempo final, se tomó una alícuota adicional (sin la adición de ácido fórmico) para determinar la distribución estereoisomérica de la monatina producida utilizando la metodología de derivación con FDAA descrita en el Ejemplo 36. Para los mutantes seleccionados probados, hubo poco o ningún impacto sobre la estereopureza. En todos los casos, los mutantes produjeron por encima de 98.8% de R,R bajo las condiciones de ensayo probadas.
10 Estos resultados se muestran en la Tabla 52.

Tabla 52: Estereopurezas de monatina producida por mutantes seleccionados a las 4 horas
Polipéptido de DAT
% SS % RS % RR % SR
Control tipo silvestre (pEmt1a)
0.00 0.40 99.30 0.20
Mutante 6
0.00 0.40 99.50 0.10
Mutante 27
0.00 0.80 98.80 0.30
Mutante 40
0.00 0.20 99.80 0.00
Mutante 45
0.00 0.50 99.40 0.10
Mutante 110
0.10 0.40 99.30 0.10
Mutante 135
0.00 0.40 99.50 0.10
Mutante 136
0.02 1.00 99.00 0.03
Ejemplo 29 – Construcción y prueba de mutantes con ensamblaje combinacional de sitios múltiples a la medida (TMCASM)
203
imagen146
imagen147
imagen148
Los mutantes TMCA fueron cultivados, dispuestos, probados y secuenciados utilizando el mismo método tal como se describió para la evolución GSSM en el Ejemplo 25. El rendimiento de la muestra fue comparado con el rendimiento del candidato superior de evolución GSSM – Mutante 135 – utilizando el mismo sistema de marcación como se describió en el Ejemplo 25. La Tabla 55 lista los aciertos de marcación secundaria TMCA con secuencias de ADN únicas (los mutantes TMCA están designados con caracteres alfabéticos para distinguirlos de los mutantes GSSM, los cuales están designados numéricamente).

Tabla 55: Mutantes TMCA identificados como aciertos de selección secundaria
Nombre de mutante
Mutación Nombre de mutante Mutación
A
P20S-N118G EE P20S-N110A-N118G
B
T74V-V93G-L270W FF N110A-N118G-T241R-L270W
C
P20S-T74V-L270W GG P20S-T74V-V93G-N110A-N118G-V236T-L270W
D
T74V-L270W HH V93G-N110A-N118G-V236T
E
P20S-K73L-T241R-L270W II P20S-T74V-N110A-N118G
F
K73L-V93G-V236T-T241R JJ N110A-N118G
G
P20S-T74V-V236T KK P20S-V93G-N110A-N118G-T241R
H
P20S-K73L-V93G LL N110A-N118A-L270W
I
K73L-V236T MM P20S-N110A-N118G-L270W
J
P20S-L270W NN N110A-N118A-V236T-T241R
K
2N-P20S-K73L-V93G-N118G OO N110A-N118G-L270W
L
P20S-T74V-N118A PP V93G-N110A-N18G-T241R
M
P20S-V236T QQ P20S-V93G-N110A-N18G
N
P20S-T241R-L270W RR V93G-N110A
O
P20S-T241R SS P20S-N110A-N118G-V236T
P
T74V-V93G-V236T-T241R TT T74V-N110A-N118A-V236T
Q
P20S-K73L-T74V-L270W UU P20S-K73L-T74V-N110AN118G-V236T-T241R
R
P20S-V93G-V236T VV 86E (SILENT GAG →GAA)-N110A-N118A-V236T
S
P20S-K73L-T74V-T241R-L270W WW T74V-N118G
T
P20S-K73L-L270W XX P20S-T241R-L270W-277T (SILENT ACA →ACG)
U
T74V-V93G-N118G-V236T-T241R YY T74V-N118A-L270W
V
P20S-K73L-210A (SILENT-GCC → GCT)-V236T ZZ P20S-K73L-N118A-L270W
W
N118A-L270W AAA P20S-V93G-T241R
207
Nombre de mutante
Mutación Nombre de mutante Mutación
X
P20S-58K (SILENT AAG → AAA)-L270W BBB T74V-V93G-N110A-T241R
Y
P20S-V93G-N118G CCC V93G-N110A-N118A
Z
P20S-V236T-T241R DDD P20S-T74V-V93G-N110A-N118G-T241R
AA
P20S-P117W-N118A-V236T-L270W EEE T74V-N110A-N118G-L270W
BB
V93G-V236T FFF P20S-231A (SILENT GCG →GCA)-V236T
CC
V236T-L270W GGG V93G-V236T-T241R
DD
P20S-N118G-L270W
Las muestras identificadas en la Tabla 55 fueron cultivadas, normalizadas y probadas en la selección terciaria utilizando el mismo método que se describió para la evolución GSSM en el Ejemplo 26. Los valores de monatina y alanina fueron determinados por LC/MS/MS y comparados con una curva estándar. El rendimiento de la muestra fue
5 comparado con la actividad del Mutante 135 (el de mejor rendimiento de la evolución GSSM). Los sobremutantes TMCA identificados en la selección terciaria están listados en la Tabla 56.
Ejemplo 31 – Actividad de aciertos TMCA
Este ejemplo describe los datos que demuestran la actividad enzimática de los polipéptidos de ejemplo. La Tabla 56 a continuación muestra la actividad de los sobremutantes con respecto al Mutante 135 en el punto de tiempo a 15
10 minutos en reacciones utilizando sustrato de R,R-monatina 1 mM y 15 mM. La actividad relativa es la cantidad de alanina producida por la muestra dividida por la cantidad de alanina producida por el Mutante 135.

Tabla 56: Actividad de sobremutantes TMCA en selección terciaria
Mutante
Mutación Actividad relativa a Mutante 135 por GSSM
Reacciones con sustrato de monatina 1 mM
Reacciones con sustrato de monatina 15 mM
C
P20S-T74V-L270W 1.02 0.93
E
P20S-K73L-T241R-L270W 1.32 1.31
F
K73L-V93G-V236T-T241R 1.29 0.64
G
P20S-T74V-V236T 1.28 1.30
I
K73L-V236T 1.24 1.29
J
P20S-L270W 0.79 1.01
L
P20S-T74V-N118A 1.62 0.83
M
P20S-V236T 1.27 1.46
O
P20S-T241R 1.33 1.71
R
P20S-V93G-V236T 1.22 1.02
208
Mutante
Mutación Actividad relativa a Mutante 135 por GSSM
Reacciones con sustrato de monatina 1 mM
Reacciones con sustrato de monatina 15 mM
S
P20S-K73L-T74V-T241R-L270W 1.16 1.18
V
P20S-K73L-210A (SILENT-GCC → GCT)-V236T 1.03 1.00
Z
P20S-V236T-T241R 1.02 0.89
BB
V93G-V236T 1.55 1.98
CC
V236T-L270W 1.24 1.40
DD
P20S-N118G-L270W 1.54 1.78
PP
V93G-N110A-N118G-T241R 1.40 1.53
TT
T74V-N110A-N118A-V236T 1.10 0.42
VV
86E (SILENT GAG → GAA)N110AN118A-V236T 1.31 0.52
WW
T74V-N118G 1.23 1.49
YY
T74V-N118A-L270W 1.97 1.30
ZZ
P20S-K73L-N118A-L270W 1.01 0.44
AAA
P20S-V93G-T241R 1.86 3.49
CCC
V93G-N110A-N118A 1.26 0.56
Se identificaron varias muestras que superaron al Mutante 135 bajo las condiciones probadas. Se identificaron los sobremutantes de potencial Km y Vmax. Los resultados de las evoluciones GSSM y TMCA indican que la SEQ ID NO. 220 tipo silvestre es evolucionable posteriormente para actividad específica incrementada sobre la monatina.
5 Ejemplo 32 – Evaluación de los DATs de mutante TMCA en pMET1a
Este ejemplo describe datos que demuestran la actividad enzimática de polipéptidos de ejemplo divulgados aquí. El Mutante E, Mutante G, Mutante I, Mutante M, Mutante O, Mutante P, Mutante BB, Mutante PP, Mutante WW, y Mutante AAA (DATs creado utilizando tecnología TMCA, véanse Ejemplos 29 y 30) fueron recreados por mutagénesis dirigida al sitio utilizando el QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) 10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para generar los mutantes, los constructos etiquetados de pMET1a descritos en el Ejemplo 16 y Ejemplo 28 fueron utilizados como plantillas. Los cebadores mutagénicos utilizados están listados más adelante en la Tabla 57. Los fragmentos de PCR fueron digeridos con Dpn1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 1 hora y transformados en células E. coli XL10-Gold (Stratagene, La Jolla, CA). Las preparaciones de plásmidos purificados resultantes fueron secuenciadas (Agencourt, Beverly, MA) para verificar que
15 las mutaciones correctas fueron incorporadas. Los plásmidos fueron luego transformados en el anfitrión de expresión E. coli B834(DE3) (Novagen, San Diego, CA).
209

Tabla 57. Cebadores para mutantes en vector pMET1a
Polipéptido mutante producido por TMCA
Cebadores PCR Plantilla
Mutante E
Mutante 110
Mutante G
Mutante M
Mutante I
Mutante 135
Mutante M
Mutante 135
Mutante O
Mutante 136
Mutante P
Mutante 27
Mutante BB
Mutante 135
Mutante PP
Mutante 45
Mutante WW
imagen149 Mutante M
Mutante AAA
Mutante 27
210
Los cultivos de E. coli B834(DE3) (Novagen, San Diego, CA) que expresan las proteínas etiquetadas con His en el terminal carboxi de Mutante 110, Mutante 135, Mutante 136, Mutante E, Mutante G, Mutante I, Mutante M, Mutante O, Mutante P, Mutante BB, Mutante PP, Mutante WW, Mutante AAA y tipo silvestre (SEQ ID NO: 220) fueron cultivados en 200 mL de medio Overnight Express II (Solución 1-6, Novagen) en un matraz con deflexión de 500 mL
5 durante la noche a 30°C hasta una OD600 de 10. Las muestras para proteína total fueron tomadas inmediatamente antes de la recolección. Las células fueron recolectadas por centrifugación y congeladas inmediatamente a -80°C hasta que los extractos celulares fueron preparados como se describe en el Ejemplo 4.
Los extractos celulares fueron creados mediante la adición de 50 mL de BugBuster Primary Amine Free (Novagen, San Diego, CA) con 50 µl de Benzonase Nuclease (Novagen, San Diego, CA), 0.75 µl de r-Lisozima (Novagen, San
10 Diego, CA), y 250 µl de Protease Inhibitor Cocktail II (Calbiochem, San Diego, CA). Las células fueron incubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Los extractos fueron centrifugados a 45,000 x g durante 10 minutos.
Las proteína etiquetadas con His fueron purificadas según se describe en el Ejemplo 4 utilizando la resina GE Healthcare (Piscataway, NJ) Chelating Sepharose™ Fast Flow. La excepción fue el Mutante 182, el cual fue
15 analizado como CFE tal como se describe en el Ejemplo 4. La proteína purificada fue desalinizada utilizando una columna PD10 fosfato de potasio 100 mM, pH 7.8 con PLP 0.050 mM. Las concentraciones de proteína total y DAT fueron determinadas como se describe en el Ejemplo 4.
Se realizó un ensayo de formación de monatina de 3 etapas como se describe en el Ejemplo 5 con una concentración de DAT de aproximadamente 0.2 mg/mL y la aldolasa a una concentración de 0.1 mg/mL. Como 20 control, se evaluó una concentración de 0.2 mg/mL de DAT tipo silvestre purificada (SEQ ID NO: 220). Después de 0.5, 1, 2, 4 y 24 horas, se tomó una alícuota, se agregó ácido fórmico hasta una concentración final de 2% y las muestras fueron agitadas y filtradas. Las muestras fueron analizadas en cuanto al contenido de monatina utilizando la metodología LC/MS/MS y en cuanto a triptófano y alanina utilizando la metodología de fluorescencia postcolumna LC/OPA descrita en el Ejemplo 36. En el punto de tiempo final, se tomó una alícuota adicional (sin ajuste del pH)
25 para determinar el porcentaje de R,R monatina por el método de derivación con FDAA descrito en el Ejemplo 36. La cantidad de monatina (mM) producida en diversos puntos del tipo puede encontrarse en la Tabla 58. La estereopureza también fue determinada y el porcentaje del estereoisómero R,R puede encontrarse en la columna del extremo derecho. El estereoisómero R,S constituyó la mayoría del resto.

Tabla 58: Actividad de mutantes de DAT seleccionados
Polipéptidos de DAT
Monatina (mM) 0.25 horas Monatina (mM) 0.5 horas Monatina (mM) 1 hora Monatina (mM) 4 horas % RR
Control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220)
1.60 (±0.42) 2.95 (±0.64) 5.00 (±0.85) 11.40 (±0.42) 99.50 (±0.08)
Mutante 110
1.70 (±0.00) 3.20 (±0.85) 5.75 (±0.21) 12.60 (±0.14) 99.48 (±0.32)
Mutante 135
3.65 (±0.35) 6.17 (±0.65) 10.33 (±0.32) 13.20 (±0.56) 99.42 (±0.11)
Mutante 136
2.60 5.00 8.10 12.90 98.98
Mutante 182
- 3.20 6.80 14.30 99.50
Mutante E
1.80 3.80 8.60 18.60 99.45
Mutante G
3.10 6.50 9.90 12.90 99.05
Mutante I
2.90 5.30 8.50 12.90 99.46
Mutante M
4.20 8.10 11.20 13.80 98.96
Mutante O
2.60 5.70 9.50 14.00 98.59
211
imagen150
5
10
15
20
25
30
35
con diluciones en 100µL de DAT (proteína total) preparada como se describió anteriormente. Las enzimas fueron diluidas 1:100 y 1:200 con fosfato de potasio 50 mM frio (pH 7.8) y PLP 50 µM antes de la adición al ensayo. La enzima fue agregada a la mezcla de reacción 1:100 y monitorizada en incrementos de 15 segundos durante 3 minutos. La formación de indol-3-piruvato (I3P) fue monitorizada a una longitud de onda de 340 nm durante 3 minutos en un Bio-Rad Spectrophotometer (GE Healthscince, Piscataway, NJ) y se midieron las ratas dentro del rango dinámico de una curva estándar. La curva estándar fue generada con proteína de DAT tipo silvestre purificada (SEQ ID NO: 220) y la concentración de DAT en el extracto celular fue determinada con base en la ecuación de la línea para la curva estándar. La concentración efectiva de DAT con respecto a la DAT tipo silvestre para la primera reacción se reporta en la Tabla 60.

Tabla 60: Actividad de DAT (Conversión de triptófano a I3P)
Polipéptido de DAT
Rata de formación de I3P (∆Abs340 nm/minuto) Concentración de DAT (determinada por actividad) mg/mL Actividad relativa a tipo silvestre para la primera reacción
Control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220)
0.058 0.065 1.0
Mutante 135
0.067 0.075 1.2
Mutante 136
0.017 0.019 0.3
Mutante E
0.000 0.002 0.1
Mutante G
0.027 0.030 0.5
Mutante M
0.050 0.055 0.9
Mutante O
0.031 0.033 0.8
Mutante BB
0.045 0.050 0.8
Mutante AAA
0.002 0.004 0.2
La DAT tipo silvestre (SEQ ID NO: 220) y Mutante 136, E, G, M, O, BB y AAA pueden facilitar la conversión tanto de triptófano a I3P como del precursor de monatina a monatina. La Tabla 60 muestra que estos mutantes tienen actividad más baja para la conversión de triptófano a I3P con respecto al DAT tipo silvestre (SEQ ID NO: 220). Aún así, de acuerdo con la Tabla 58, los mismos mutantes produjeron más monatina total a partir de triptófano de lo que hizo el DAT tipo silvestre (SEQ ID NO: 220). Así, bajo las condiciones del ensayo descrito aquí, parece haber un efecto beneficioso de la producción de monatina a través del control de la conversión del triptófano a I3P en la ruta biosintética de la monatina. Por ejemplo, aunque el Mutante E mostró la actividad relativa más baja para la conversión de triptófano a I3P (véase Tabla 60) también produjo la cantidad más alta de monatina a las 4 horas (véase Tabla 58). Sin estar limitados por la teoría, los efectos beneficiosos de controlar la primera etapa en la reacción podría ser atribuida a una reducción de la constitución de I3P y subsecuente degradación potencial de I3P a productos diferentes a la monatina. En general, parece ser que el control de la rata de una o más de las reacciones involucradas en la producción de la monatina a partir del triptófano, utilizando, por ejemplo, uno o más mutantes DAT, puede tener un efecto beneficioso sobre la cantidad total de monatina producida.
Ejemplo 33 – Evaluación de DATs mutantes a 35°C.
Este ejemplo describe datos que demuestran la actividad enzimática de polipéptidos de ejemplo divulgados aquí. Los cultivos de inicio fueron cultivados durante la noche a 37°C con agitación a 250 rpm hasta que la OD600nm alcanzo 0.05. 200 mL del medio Overnight Express II (Novagen, San Diego, CA) fueron inoculados y cultivados como se describe en el Ejemplo 3. Los cultivos fueron hechos crecer en duplicado y las pellas de células fueron combinadas. Las pellas fueron resuspendidas en 40 mL de regulador de fosfato de sodio 50 mM (pH 7.8) con PLP
0.05 mM y se sometieron a lisis utilizando una French Press (Sim Aminco, Rochester, NY) según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante fue recolectado en un tubo limpio y almacenado a -80°C hasta su uso.
Se llevó a cabo un ensayo de formación de monatina en 3 etapas como se describe en los métodos con una concentración de DAT de aproximadamente 0.2 mg/mL y la aldolasa a una concentración de 0.1 mg/Ml en viales de vidrio. Se incubaron muestras por duplicado a 25°C o 35°C y después de 1, 3 y 4 horas, se tomó un alícuota y se
213
agregó ácido fórmico hasta una concentración final de 2%, y las muestras fueron agitadas y filtradas. Las muestras fueron analizadas en cuanto al contenido de monatina utilizando la metodología del LC/MS/MS y para el triptófano y la alanina utilizando la metodología de fluorescencias postcolumna LC/OPA descritas en el Ejemplo 36. Las muestras fueron analizadas también con respecto a intermediarios tales como precursor de monatina, I3P, y ácido 4
5 hidroxi-4-metil glutámico (HMG) como se describe en el Ejemplo 36. La cantidad de monatina producida (mM) en diversos puntos del tiempo se muestra en la Tabla 61.
El ensayo de formación de monatina fue repetido para control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220), Mutante 135 y Mutante M bajo condiciones similares excepto que las reacciones fueron llevadas a cabo en viales plásticos. La producción de monatina en diversos momentos del tiempo puede encontrarse en la Tabal 61.
10 Tabla 61: Formación de monatina a 25°C y 35°C
Polipéptidos de DAT
Monatina (mM) 1 hora Monatina (mM) 3 horas Monatina (mM) 4 horas
25°C
Control tipo silvestre (pMET1a)
2.0 6.8 8.4
Mutante 135 (V236T)
10.0 14.4 14.2
Mutante 136 (241R)
4.0 10.8 12.4
Mutante E (20S, 73L, 241R, 270W)
0.8 4.2 5.6
Mutante M (20S, 236T)
10.0 13.4 14.2
Mutante O (20S, 241R)
8.0 13.8 13.6
Mutante BB (93G, 236T)
4.0 11.4 12.4
Mutante AAA (20S, 93G, 241R)
0.2 1.0 1.6
35°C
Control tipo silvestre (pMET1a)
2.2 5.4 6.2
Mutante 135 (V236T)
9.4 9.2 9.8
Mutante 136 (241R)
4.8 9.4 10.4
Mutante E (20S, 73L, 241R, 270W)
0.6 3.4 4.2
Mutante M (20S, 236T)
9.2 13.6 14.6
Mutante O (20S, 241R)
9.6 10.6 10.8
Mutante BB (93G, 236T)
4.6 9.0 9.2
Mutante AAA (20S, 93G, 241R)
0.2 1.6 2.2
Se observaron títulos más bajos de monatina usando las enzimas DAT descritas aquí a 35°C bajo las condiciones del ensayo. Sin embargo, los mutantes seleccionados Mutante 135, Mutante 136, Mutante M, Mutante O y Mutante BB mostraron ratas de monatina iniciales incrementadas y títulos de monatina superiores a las 4 horas que el control
15 tipo silvestre (SEQ ID NO: 220) a 35°C bajo las condiciones del ensayo.
Ejemplo34-Evaluación de DATs mutantes en biorreactores
Este Ejemplo describe datos que demuestran la actividad enzimática de polipéptidos de ejemplo divulgados aquí, en biorreactores. Se usaron reservas en glicerol del control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220), Mutante 135, Mutante 136, Mutante M, Mutante O, y Mutante BB para sembrar placas con colonias individuales. Se utilizaron las colonias
214
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5
10
15
20
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30
La rata de formación de I3P a partir de triptófano fue monitorizada a 340 nm durante 3 minutos como se describe en el Ejemplo 32. La concentración del control tipo silvestre fue determinada como 6.8 mg/mL, la concentración del Mutante 135 fue determinada como 7.0 mg/mL y el Mutante M fue determinado como 5.6 mg/mL con base en la curva estándar generada con DAT purificado de control tipo silvestre. Las concentraciones de DAT determinadas por la formación de I3P fueron utilizadas para dosificar el infors a 0.2 mg/mL de DAT. La aldolasa fue agregada como un extracto libre de células a 0.02 mg/mL de aldolasa. La mezcla de reacción contenía fosfato de potasio 10 mM, MgCl2 1 mM, PLP 0.05 mM, piruvato de sodio 200 mM y D-triptófano 130 mM bajo un espacio de cabeza de nitrógeno. Cada uno de los DAT fue evaluado para la producción de monatina en un biorreactor a 35°C y a 25°C.
Se tomaron muestras a 0.5, 1, 3, 4 y 24 horas y se analizaron utilizando la metodología de LC/MS/MS descrita en el Ejemplo 36. Los resultados se muestran en la Tabla 63.

Tabla 63: Fermentadores a 25° y 35°C
Polipéptidos de DAT
Monatina (mM) 0.5 horas Monatina (mM) 1 horas Monatina (mM) 3 horas Monatina (mM) 4 horas Monatina (mM) 24 horas
25°C
Control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220)
0.9 2.4 5.6 7.9 19.1
Mutante 135
1.6 4.4 10.9 12.1 18.6
Mutante M
2.1 4.5 9.4 12.4 17.4
35°C
Control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220)
2.3 3.9 6.5 7.9 10.7
Mutante 135
4.1 6.1 9.8 11.5 14.9
Mutante M
4.1 6.3 9.9 11.3 14.9
Como se ve en el Ejemplo 34, los DAT seleccionados de mutante produjeron títulos de monatina superiores a 35°C en comparación con los DAT de control tipo silvestre (SEQ ID NO: 220). El DAT de control tipo silvestre tenía una rata inicial más lenta de producción de monatina pero un título final más alto a 25°C bajo las condiciones probadas. Ambos mutantes Mutante 135 y Mutante M mostraron una actividad mejorada sobre el control tipo silvestre a 25°C y 35°C. Los mutantes Mutante 135 y Mutante M mostraron ambos una rata inicial más alta de producción de monatina y un título final más alto a 35°C en comparación con el control bajo las condiciones probadas. Los mutantes probados fueron más estables que el control tipo silvestre a las temperaturas más altas, esto indica las ventajas de las tecnologías GSSM y TMCA en la producción de mutantes con mayor termoestabilidad que el control tipo silvestre. Una persona experimentada en la técnica podría seleccionar estas bibliotecas GSSM o TMCA para mutantes, por ejemplo, con tolerancia incrementada a la temperatura.
Ejemplo 36 – Detección de monatina, MP, triptófano, alanina y HMG
Este ejemplo describe la metodología analítica asociada con la caracterización posterior de enzimas Daminotransferasa (DAT) divulgadas aquí.
Análisis por UPLC/UV de monatina y triptófano
Los análisis de mezclas de monatina y triptófano derivados de reacciones bioquímicas fueron llevados a cabo utilizando un instrumento Waters Acquity UPLC incluyendo un monitor de absorbancia Waters Acquity Photo-Diode Array (PDA). La separaciones UPLC fueron hecha utilizando una columna Agilent XDB C8 1,8 µm 2,1 x 100 nm (parte # 928700-906) (Milford, MA) a 23°C. La fase móvil de UPLC consistió de A) agua que contenía 0.1% de ácido fórmico B) acetonitrilo que contenía 0.1% de ácido fórmico.
216
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imagen153

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que codifica un polipéptido que tiene actividad de Daminoácido transferasa que comprende
    (a)
    una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 219;
    (b)
    un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220;
    (c)
    un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220 con una, varias o todas las modificaciones de aminoácidos como se definen en la siguiente Tabla:
    (d)
    un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 220 que tiene al menos una combinación de modificaciones de aminoácidos como se establece en la siguiente Tabla:
    (c)
    una secuencia de aminoácidos como se define en SEQ ID NO: 220 que tiene al menos una de las combinaciones de modificaciones de aminoácidos como se definen en la siguiente Tabla:
    ;o
    (d)
    una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1.
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    1
    Y6L 92 D2G
    2
    Y6C; MUTACION SILENCIOSA AT AA31 (GGC → GGT) 93 D2Q
    3
    Y6F 94 D2F
    4
    Y6L 95 D2A
    5
    Y6H 96 D2T
    6
    Y6L 97 D2N
    7
    Y6M 98 D2R
    8
    N10S 99 D2I
    9
    N10W 100 D2V;G9A
    10
    N10T 101 G12A
    11
    N10R 102 D47W
    12
    N10T 103 S56S
    13
    L14V 104 I64H
    14
    L14L 105 L66L
    15
    G41G 106 I64C
    16
    T18W 107 L66G
    17
    N40N 108 E69Y
    18
    V19T 109 T74L
    19
    V42V 110 K73L
    20
    I62C 111 T74V
    21
    V82A 112 T74M
    22
    A57M 113 T74R
    23
    V42M 114 T74A
    24
    G41Y 115 N76C
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    25
    A45L 116 E77R
    26
    V93Y 117 R156A
    27
    V93G 118 K72M
    28
    L46A 119 S205A
    29
    L46H 120 Q209S
    30
    G98A 121 V212E
    31
    P20S 122 R213W
    32
    V93A 123 I216T
    33
    V103T 124 P217H
    34
    P108F 125 P217V
    35
    V93L 126 D219F
    36
    S101S 127 E220V
    37
    A106G 128 R221E
    38
    S101Q 129 F223C
    39
    P108T 130 S226P
    40
    N118G 131 L228F
    41
    P108G 132 V234A
    42
    I120L 133 S238S
    43
    A106W 134 V236T
    44
    N118R 135 V236T
    45
    N110A; N118G 136 T241R
    46
    N118A 137 L242F
    47
    N118R 138 T241R
    48
    P117W; N118K 139 T241C
    49
    D133N 140 E248F
    50
    K126Q 141 D250E
    51
    K126R 142 K257V
    52
    K128S 143 G256K
    53
    I127M 144 E260G
    54
    T131T 145 L262R
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    55
    D133L 146 K263M
    56
    M132A 147 D267G
    57
    D133E 148 D267R
    58
    L129V 149 1265L
    59
    K126K 150 E268S
    60
    I130M 151 L270S
    61
    M132Y 152 L270G
    62
    K128R 153 L270W
    63
    M132R 154 R271S
    64
    L129I 155 I274W
    65
    K128L; D2D (GAC → GAT) 156 G278S
    66
    F137W 157 Y279C
    67
    I152V 158 S284R
    68
    N55L 159 E282G
    69
    N150S 160 T280N
    70
    L138L 161 V286G
    71
    P149P 162 R285F
    72
    G161G 163 V286R
    73
    A165T 164 G240G
    74
    H163R 165 E61R
    75
    H163K 166 E61D
    76
    H168A 167 E61Y
    77
    E171S 168 G85G
    78
    E171R 169 G85D
    79
    E171R 170 S80R
    80
    T172I 171 Y79R
    81
    C176G 172 Y79V
    82
    A177S 173 W283V
    83
    A177S 174 W283E
    84
    S80L; R156W 175 W283A
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    85
    H182G 176 W283S
    86
    N186S 177 W283G
    87
    K185R 178 W283A
    88
    K185T 179 W283R
    89
    D2H 180 W283T
    90
    D2T; E250G 181 P281W
    91
    D2Y 182* V236T; T241R
    Número/designación
    Mutación Número/designación Mutación
    1
    30 imagen1
    2
    imagen2 31 imagen3
    3
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    4
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    5
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    6
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    7
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    8
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    9
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    10
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    11
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    12
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    13
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    14
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    15
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    16
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    17
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    18
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    19
    imagen32 48 imagen33
    imagen34
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    8
    N10S 99 D2I
    9
    N10W 100 D2V;G9A
    10
    N10T 101 G12A
    11
    N10R 102 D47W
    12
    N10T 103 S56S
    13
    L14V 104 I64H
    14
    L14L 105 L66L
    15
    G41G 106 I64C
    16
    T18W 107 L66G
    17
    N40N 108 E69Y
    18
    V19T 109 T74L
    19
    V42V 110 K73L
    20
    I62C 111 T74V
    21
    V82A 112 T74M
    22
    A57M 113 T74R
    23
    V42M 114 T74A
    24
    G41Y 115 N76C
    25
    A45L 116 E77R
    26
    V93Y 117 R156A
    27
    V93G 118 K72M
    28
    L46A 119 S205A
    29
    L46H 120 Q209S
    30
    G98A 121 V212E
    31
    P20S 122 R213W
    32
    V93A 123 I216T
    33
    V103T 124 P217H
    34
    P108F 125 P217V
    35
    V93L 126 D219F
    36
    S101S 127 E220V
    37
    A106G 128 R221E
    38
    S101Q 129 F223C
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    39
    P108T 130 S226P
    40
    N118G 131 L228F
    41
    P108G 132 V234A
    42
    I120L 133 S238S
    43
    A106W 134 V236T
    44
    N118R 135 V236T
    45
    N110A; N118G 136 T241R
    46
    N118A 137 L242F
    47
    N118R 138 T241R
    48
    P117W; N118K 139 T241C
    49
    D133N 140 E248F
    50
    K126Q 141 D250E
    51
    K126R 142 K257V
    52
    K128S 143 G256K
    53
    I127M 144 E260G
    54
    T131T 145 L262R
    55
    D133L 146 K263M
    56
    M132A 147 D267G
    57
    D133E 148 D267R
    58
    L129V 149 1265L
    59
    K126K 150 E268S
    60
    I130M 151 L270S
    61
    M132Y 152 L270G
    62
    K128R 153 L270W
    63
    M132R 154 R271S
    64
    L129I 155 I274W
    65
    K128L; D2D (GAC → GAT) 156 G278S
    66
    F137W 157 Y279C
    67
    I152V 158 S284R
    68
    N55L 159 E282G
    69
    N150S 160 T280N
    Nombre del mutante
    Mutación Nombre del mutante Mutación
    70
    L138L 161 V286G
    71
    P149P 162 R285F
    72
    G161G 163 V286R
    73
    A165T 164 G240G
    74
    H163R 165 E61R
    75
    H163K 166 E61D
    76
    H168A 167 E61Y
    77
    E171S 168 G85G
    78
    E171R 169 G85D
    79
    E171R 170 S80R
    80
    T172I 171 Y79R
    81
    C176G 172 Y79V
    82
    A177S 173 W283V
    83
    A177S 174 W283E
    84
    S80L; R156W 175 W283A
    85
    H182G 176 W283S
    86
    N186S 177 W283G
    87
    K185R 178 W283A
    88
    K185T 179 W283R
    89
    D2H 180 W283T
    90
    D2T; E250G 181 P281W
    91
    D2Y 182 V236T; T241R
    Número/designación
    Mutación Número/designación Mutación
    1
    30 imagen1
    2
    imagen2 31 imagen3
    3
    imagen4 32 imagen5
    4
    imagen6 33
    5
    34 imagen7
    imagen35
  2. 5.
    Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 4, en donde la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido o un gel.
  3. 6.
    Un método para producir un polipéptido recombinante de la reivindicación 4 que comprende las etapas de:
    (a) proveer el ácido nucleico de la reivindicación 1; y
    imagen36
    imagen37
    imagen38
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