ES2225407T3 - Metodo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad. - Google Patents
Metodo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad.Info
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Abstract
Un método para producir una disposición ordenada de alta densidad que comprende las etapas de enrollar una membrana impregnada con líneas de sustancias diana para producir un haz y cortar en sentido transversal el haz para producir una pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad, caracterizado por que: el haz de hebras diana se ha estabilizado embebiendo el haz en un material; y en el que la localización de cada sustancia diana en el haz está registrada en una base de datos.
Description
Método para producir disposiciones ordenadas de
alta densidad.
Disposiciones ordenadas de alta densidad de
sustancias dianas inmovilizadas naturales o sintéticas permiten
seleccionar simultáneamente analitos para conseguir propiedades
específicas. Tales disposiciones ordenadas de alta densidad han
demostrado ser útiles en diversos campos tecnológicos incluyendo
química, genética, inmunología, ciencia de materiales, medicina,
biología molecular y farmacología. Por ejemplo, se usan
disposiciones ordenadas de alta densidad de ácidos nucleicos para
determinar secuencias de genes, para detectar la presencia de
mutaciones génicas y para detectar la expresión diferencial
cualitativa y cuantitativa de productos génicos. De forma similar,
disposiciones ordenadas de alta densidad de péptidos se usan para
cartografiar secuencias epitópicas que producen respuestas inmunes.
Además, disposiciones ordenadas de sustancias dianas se usan para
identificar compuestos para el desarrollo de agentes
farmacéuticos.
Actualmente, los métodos para la construcción de
disposiciones ordenadas de alta densidad de sustancias de ensayo son
generalmente de dos tipos. El primero, las disposiciones ordenadas
se construyen aplicando individualmente las sustancias dianas
preformadas naturales o sintéticas, tales como biomoléculas,
directamente a posiciones específicas en un soporte. Los soportes
incluyen membranas de nitrocelulosa, nailon, poli(fluoruro
de vinilideno), vidrio, silicio u otros materiales y las sustancias
dianas se pueden inmovilizar en el soporte exponiendo el soporte a
radiación ultravioleta o cociendo el soporte, entre otras técnicas.
Uno de tales métodos se describe en Pietu et al., "Novel
Gene Transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed
by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array",
Genome Research (1996) 6: 492-503,
incorporado íntegramente en esta memoria por referencia. Se han
ideado varios dispositivos para automatizar el método de
aplicación.
El segundo método de fabricar disposiciones
ordenadas de alta densidad implica sintetizar in situ en un
soporte las sustancias dianas individuales en posiciones
específicas. En una versión de este método, se usa química
fotosintética para preparar simultáneamente series de distintas
sustancias dianas en posiciones únicas del soporte. En otra versión
de este método, las sustancias dianas se sintetizan enmascarando o
bloqueando físicamente áreas seleccionadas de un soporte y la
deseada reacción química de síntesis se lleva a cabo en la porción
del soporte sin enmascarar. Ejemplos de este método se describen en
Fodor et al., "Light-Directed, Spatially
Addressable Parallel Chemical Syntheses", Science
(1991)251:767-777; Patente de Estados Unidos
5.436.327; y en Southern, E.M. et al., "Analyzing and
Comparing Nucleic Acid Sequences by Hybridization to Arrays of
Oligonucleotides; Evaluation using Experimental Models",
Genomics (1992) 13: 1008-1017, incorporadas
íntegramente en este documento por referencia.
Ambos métodos de construir disposiciones
ordenadas de alta densidad tienen asociadas varias desventajas.
Primeramente, los métodos sólo pueden producir un número
relativamente limitado de disposiciones ordenadas idénticas a la
vez. En segundo lugar, es difícil verificar las disposiciones
ordenadas producidas mediante estos métodos durante la producción
para determinar la integridad de las etapas de producción. En
tercer lugar, muchas sustancias potencialmente dianas no se pueden
aplicar a soportes y no se pueden sintetizar in situ en
soportes mediante los métodos usados actualmente. Además, no se
describen las disposiciones ordenadas compuestas por sustancias de
ensayo demás de una categoría química, tales como disposiciones
ordenadas de sustancias de ensayo péptidos y ácidos nucleicos.
También, los métodos sólo son capaces de producir disposiciones
ordenadas de sustancias dianas en una capa que tiene un espesor
relativamente limitado. Además, cada uno de los métodos puede
producir disposiciones ordenadas con dimensiones de la zona de la
sustancia diana relativamente limitadas.
La patente internacional WO 99/03341 describe el
uso de materiales porosos en forma de varillas o láminas que tienen
compuestos inmovilizados sobre ellos. Al material poroso se le da
forma de haz comprimiendo radialmente las varillas o envolviendo la
lámina en espiral.
La patente internacional WO 96/17246 describe
elementos delgados que son vehículos en forma de haz planos o
alargados que tienen moléculas inmovilizadas sobre ellos. Después
el haz se corta en sentido transversal para formar una disposición
ordenada.
El documento US 4.820.504 describe un bloque de
tisú con múltiples muestras que tiene una pluralidad de muestras de
tisú en varillas, envueltas en una carcasa que posteriormente se
corta en sentido transversal.
Por lo tanto, existe la necesidad de un método
alternativo para producir disposiciones ordenadas de alta densidad
que no tenga las desventajas inherentes a los métodos conocidos
para producción de disposiciones ordenadas de alta densidad. Por
ejemplo, el método preferiblemente debería poder producir un gran
número de disposiciones ordenadas idénticas simultáneamente,
rápidamente y con un coste eficaz. El método debería poder usar una
amplia variedad de sustancias dianas y de soportes, incluyendo
sustancias de ensayo y soportes que no se pueden incorporar en
disposiciones ordenadas obtenidas por los métodos presentes. El
método debería poder producir disposiciones ordenadas de más de dos
dimensiones, con espesores y tamaños variables y con configuraciones
distintas de la configuración plana. Además, el método debería
poder producir disposiciones ordenadas que tengan distintas
dimensiones de la zona de la sustancia diana, incluyendo zonas de
distinto tamaño para diferentes sustancias dianas en una
disposición ordenada. También, el método debería poder producir
disposiciones ordenadas de alta densidad para sustancias de ensayo
de diferentes categorías o clases químicas, tales como
disposiciones ordenadas de sustancias de ensayo péptidos y ácidos
nucleicos. Además, el método debería poder usar sustancias dianas
preformadas o usar sustancias dianas sintetizadas in situ,
si es necesario, para incorporar las ventajas de estos métodos.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para producir disposiciones ordenadas de alta
densidad de sustancias dianas que comprende la etapa de cortar en
sentido transversal un haz de hebras dianas, en las que las hebras
dianas comprenden las sustancias dianas y en las que el cortar en
sentido transversal da como resultado una disposición ordenada de
alta densidad. El método también puede comprender una etapa de
estabilizar el haz, incorporar un material adicional en el haz o
interrogar la disposición ordenada de alta densidad.
También se proporciona una disposición ordenada
de alta densidad producida cortando en sentido transversal un haz
que comprende un gran número de hebras dianas, en la que el gran
número de hebras dianas comprende sustancias dianas. Las
disposiciones ordenadas de alta densidad pueden tener sustancias
dianas presentes en uno, dos o tres ejes cartesianos.
Además se proporciona un método para preparar una
disposición ordenada de alta densidad que comprende la etapa de
enrollar una membrana o apilar membranas impregnadas con líneas de
sustancias dianas para producir un haz. También, se proporciona un
método para determinar secuencias de genes, detectar la presencia
de mutaciones génicas, detectar la expresión diferencial cualitativa
o cuantitativa de productos génicos, cartografiar secuencias
epitópicas que producen respuestas inmunes o identificar compuestos
para el desarrollo de agentes farmacéuticos, usando las
disposiciones ordenadas de alta densidad producidas según la
presente invención.
Las características, aspectos y ventajas de la
presente invenciones entenderán mejor con respecto a la siguiente
descripción, reivindicaciones anexas y figuras acompañantes en las
que:
las Figuras 1 a 3 representan la producción de
disposiciones ordenadas de alta densidad que usan un haz o fibras
que comprenden sustancias dianas según la presente invención;
las Figuras 4 a 5 representan la producción de
disposiciones ordenadas de alta densidad que usan un haz que
comprende una membrana que tiene líneas de sustancias dianas
apiladas en la membrana según la presente invención;
las Figuras 6 a 8 representan la producción de
disposiciones ordenadas de alta densidad empleando un haz que
comprende un gran número de membranas que tienen líneas de
sustancias dianas conocidas aplicadas en la membrana según la
presente invención;
las Figuras 9 a 11 representan la producción de
disposiciones ordenadas de alta densidad que emplean un haz que
comprende una membrana enrollada que tiene líneas de sustancias
dianas conocidas aplicadas en la membrana según la presente
invención;
las Figuras 12 a 14 representan la producción de
disposiciones ordenadas de alta densidad empleando un haz que
comprende tubos rellenos con sustancias dianas según la presente
invención;
la Figura 15 es una fotografía de un
autorradiógrafo que muestra el resultado de un estudio de
hibridación realizado en una disposición ordenada producida según
la presente invención; y
la Figura 16 es una fotografía de un
autorradiógrafo que muestra el resultado de un estudio de
hibridación desarrollado en otra disposición ordenada producida
según la presente invención.
Según una realización de la presente invención,
se proporciona un método para fabricar una disposición ordenada de
alta densidad de sustancias dianas para determinar la identidad o
propiedades de analitos o para determinar la identidad o
propiedades de sustancias dianas. Según otra realización de la
presente invención, se proporciona una disposición ordenada de alta
densidad de sustancias dianas para determinar la identidad o
propiedades de analitos o para determinar la identidad o
propiedades de las sustancias dianas.
El término "sustancia diana", como se emplea
en este documento, se refiere al componente de la disposición
ordenada de alta densidad que potencialmente interactúa con uno o
más analitos de interés. Las sustancias dianas pueden ser átomos,
moléculas, productos químicos complejos, orgánulos, virus, células o
materiales, o pueden ser combinaciones de esas entidades, o pueden
ser otras entidades como entenderán los que tengan experiencia en
la técnica a que se refiere lo que se describe en este documento.
Por ejemplo, las sustancias dianas de una disposición ordenada de
alta densidad según la presente invención se pueden seleccionar
entre una o más del grupo de átomos tales como cinc, azufre y oro;
biomoléculas tales como polinucleótidos, DNA, RNA, péptidos,
proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, lípidos,
inmunoglobulinas y sus análogos y variantes sintéticos; virus;
componentes subcelulares tales como cromosomas microdiseccionados y
mitocondrias, células, incluyendo células procariotas,
arqueobacterias y células eucariotas; y materiales tales como
aleaciones metálicas, materiales cerámicos, vidrios,
semiconductores, superconductores, plásticos, materiales polímeros,
madera, tejidos y hormigón.
El término "analito", como se emplea en este
documento se refiere a una entidad cuya identidad o propiedades se
han de determinar por interacción con las sustancias dianas de una
disposición ordenada de alta densidad según la presente invención.
Alternativa o simultáneamente, el analito se puede usar para
determinar la identidad o propiedades de las sustancias dianas por
interacción con las sustancias dianas de una disposición ordenada
de alta densidad según la presente invención. Los analitos se
pueden seleccionar del mismo grupo que las sustancias dianas, tales
como proteínas o ácidos nucleicos, o pueden ser una condición
física o medioambiental tal como una o más condiciones seleccionadas
del grupo que consiste en temperatura, pH, o concentración
salina.
El término "hebra diana", como se emplea en
este documento, se refiere a una tira de la sustancia diana. Estas
tiras pueden estar formadas en su totalidad por una o más
sustancias dianas, o pueden comprender una o más sustancias dianas
con un soporte o un contenedor. Las sustancias dianas pueden estar
absorbidas, adsorbidas, unidas, embebidas en el soporte o revestir
al mismo o pueden estar contenidas en el contenedor. Por ejemplo,
las hebras dianas pueden incluir varillas coladas de sustancias
dianas tales como aleaciones metálicas, hormigón o plástico, o
pueden incluir sustancias dianas absorbidas en fibras de vidrio o
hilos de seda, unidas a fibras de polímero, embebidas en una varilla
porosa, revistiendo un alambre metálico o contenidas en una matriz
de gelatina. Además, las hebras dianas pueden incluir líneas de
sustancias dianas que están escritas, trazadas, impresas o
abollonadas en un portaobjetos de vidrio o en una membrana tal como
una hoja plana de sustancia polimérica o en un soporte equivalente.
Además, las hebras dianas pueden incluir sustancias dianas unidas a
la parte interior de tubos.
El término "matriz", como se usa en este
documento, se refiere a un material en el que se pueden embeber
sustancias dianas o al que se pueden unir sustancias dianas para
suministrar un soporte estructural adicional, para servir como
espaciador, para exponer la sustancia diana a analito o para
influir en la interacción entre la sustancia diana y el analito tal
como por aislamiento eléctrico de sustancias dianas unas de otras.
Las matrices pueden ser materiales polímeros tales como una o más
sustancias seleccionadas del grupo que consiste en aerogel,
agarosa, albúmina, gelatina, hidrogel y poliacrilamida.
El término "haz", como se usa en este
documento, se refiere a una disposición ordenada o grupo de hebras
dianas. Por ejemplo, un haz puede incluir un apilamiento de hebras
dianas en la que cada hebra diana comprende un tubo lleno con una
sustancia diana, o en el que cada hebra diana comprende líneas de
sustancias dianas extendidas en una membrana, o en la que cada hebra
diana comprende un alambre de una sustancia diana.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad según la presente invención comprende las etapas de
(a) reunir un haz de hebras dianas, y (b) cortar en sentido
transversal el haz para producir una disposición ordenada. Además,
el método puede incluir una etapa de estabilización de las hebras
dianas o haces. También, el método puede incluir una etapa de
incorporar uno o más materiales adicionales a las disposiciones
ordenadas de alta densidad. Además, el método puede incluir una
etapa de interrogar la disposición ordenada de alta densidad.
Se puede producir un haz de disposiciones
ordenadas de hebras dianas mediante varios métodos. Por ejemplo, un
haz de hebras dianas se puede producir llenando primero tubos con
sustancias dianas o con sustancias dianas en combinación con una
matriz. La sustancia diana se puede incluir dentro de la matriz sin
estar químicamente enlazada a la matriz o se puede unir a la matriz
por fuerzas covalentes, por fuerzas iónicas, por enlace de
hidrógeno o por otras formas de unión. Después los tubos se
disponen y se aseguran de manera sustancialmente paralela a sus
ejes longitudinales para producir el haz de hebras dianas.
También se puede producir un haz de hebras dianas
revistiendo o impregnando primero un soporte, tal como una membrana,
fibra, tubo o varilla, con una sustancia diana, o aplicando
disoluciones de sustancia diana a un soporte con la punta de una
pluma estilográfica, tal como la punta de una pluma de ave o un
aerógrafo, o con una impresora de tinta, abollonando o transfiriendo
térmicamente disoluciones de sustancias dianas a un soporte. A
continuación, estos soportes se apilan, se enrollan o se doblan
para producir el haz de hebras dianas. El haz resultante contiene
filas de sustancias dianas que se alinean relativamente paralelas
al eje longitudinal de aplicación de la sustancia diana.
Después de la unión, los haces se cortan en
sentido transversal para producir las disposiciones ordenadas. Los
haces se pueden cortar en sentido transversal con un microtomo,
láser, sierra, alambre caliente u otro dispositivo o método de
corte como se entenderá por los que tengan experiencia en la técnica
a que se refiere lo que se describe en este documento. El corte en
sentido transversal puede dar como resultado una disposición
ordenada de alta densidad con sustancias dianas que tiene
cualquiera de una amplia variedad de espesores. Por ejemplo, la
disposición ordenada puede tener sustancias dianas con un espesor de
entre alrededor de 0,1 \mum a alrededor de 1 mm o más grueso.
Además, al contrario que los métodos conocidos anteriormente para
producir disposiciones ordenadas, el método descrito en este
documento puede producir fácilmente disposiciones ordenadas que
tienen sustancias dianas con un espesor mayor que 50 \mum. Esto es
ventajoso porque puede aumentar la señal generada por la sustancia
diana comparada con las señales generadas por sustancias dianas en
disposiciones ordenadas más finas.
En una realización preferida, el haz reunido
tiene hebras dianas cuyos ejes longitudinales son sustancialmente
paralelos unos a otros y el haz se corta en sentido transversal
sustancialmente de manera perpendicular a los ejes longitudinales
de las hebras dianas para producir las disposiciones ordenadas de
alta densidad. El corte en sentido transversal también se puede
realizar a otro ángulo que no sea sustancialmente perpendicular a
los ejes longitudinales de las hebras dianas, tal como para
producir disposiciones ordenadas ovales a partir de un haz
cilíndrico.
Dependiendo de la forma del haz y de la dirección
de corte en sentido transversal, la etapa de corte en sentido
transversal puede producir disposiciones ordenadas de alta densidad
con uno, dos o tres ejes analíticos, esto es, disposiciones
ordenadas de alta densidad que tienen sustancias dianas en uno, dos
o tres ejes cartesianos. Por ejemplo, disposiciones ordenadas con un
eje analítico se pueden obtener cortando en sentido transversal un
haz que tiene sustancias dianas en un único plano. Disposiciones
ordenadas con dos ejes analíticos pueden ser el resultado de cortar
en sentido transversal un haz que tiene sustancias dianas situadas
en distintos planos. Disposiciones ordenadas con dos ejes
analíticos también se pueden producir mediante la combinación de
disposiciones ordenadas con un único eje analítico y con ejes
múltiples. Las disposiciones ordenadas con tres ejes analíticos se
pueden producir mediante combinación de disposiciones ordenadas con
un único eje analítico y con ejes analíticos múltiples, mediante la
combinación de una disposición ordenada con un único eje analítico
con una disposición ordenada con dos ejes analíticos o mediante la
combinación de varias disposiciones ordenadas con dos ejes
analíticos.
Por ejemplo, una disposición ordenada de alta
densidad con un eje analítico se puede producir cortando en sentido
transversal un haz formado a partir de hebras dianas preparadas
depositando sustancias dianas en líneas paralelas en una membrana
plana, en la que el corte en sentido transversal se realiza en un
plano perpendicular al plano formado por las líneas. De manera
similar, una disposición ordenada de alta densidad con dos ejes
analíticos se puede producir cortando en sentido transversal un haz
formado a partir de hebras dianas que comprenden un apilamiento de
membranas, en el que cada membrana tiene sustancias dianas
depositadas en líneas paralelas y en la que se corta en sentido
transversal en un plano perpendicular al eje longitudinal de las
líneas de sustancia diana. Además, una disposición ordenada de alta
densidad con tres ejes analíticos se puede producir apilando varias
disposiciones ordenadas de alta densidad con dos ejes analíticos
producidos por este corte en sentido transversal.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad según la presente invención también puede incluir
una etapa de estabilización del haz de hebras dianas. La
estabilización puede mejorar la forma o la función del haz u
disposición ordenada, tal como haciendo que el haz sea más fácil de
cortar en sentido transversal o aislando las sustancias dianas unas
de otras en la disposición ordenada. La etapa de estabilización se
puede realizar en cualquier momento durante o después de la unión
del haz de hebras dianas, según sea apropiado para el tipo de
estabilización. Por ejemplo, la estabilización se puede realizar
embebiendo el haz de hebras dianas en una matriz, tal como resinas
epoxídicas, polipropileno o poliesti-
reno.
reno.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad según la presente invención también puede incluir
una etapa de incorporación de uno o más materiales adicionales en
las disposiciones ordenadas de alta densidad durante o después de la
unión del haz de hebras dianas, incluso después de la etapa de
corte en sentido transversal. Estos materiales pueden mejorar la
forma o la función de la disposición ordenada de alta densidad. Por
ejemplo, la etapa de incorporación puede incluir añadir
antioxidantes o inhibidores microbianos u otras sustancias para
mantener la integridad de la disposición ordenada de alta densidad
con el tiempo.
Además, la etapa de incorporación puede incluir
añadir sustancias a la matriz que reduzcan el ruido de fondo, tal
como un colorante de contraste no fluorescente o que incrementen la
señal de detección. De forma similar, la etapa de incorporación
puede incluir añadir una sustancia centelleante a la matriz para
facilitar la detección de analitos radiactivos. También, la etapa de
incorporación puede incluir añadir a la matriz cofactores
necesarios para ciertos modos de detección, tales como enzimas
secundarias que son necesarias para el desarrollo del color
enzimático, o un colorante de transferencia de energía que puede
incrementar la detección de una marca fluorescente. Además, una de
las superficies de una disposición ordenada de alta densidad
producida con el método aquí descrito se puede revestir con plata u
otro material reflector para incrementar la cantidad de luz
disponible para la
detección.
detección.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad según la presente invención también puede incluir
una etapa de interrogar las disposiciones ordenadas de alta
densidad. En una realización preferida, la etapa de interrogación
se selecciona entre el grupo de inspección visual con o sin
magnificación, deposición química, sondeo eléctrico, percepción
mecánica y percepción magnética. En otra realización, la etapa de
interrogación comprende situar la disposición ordenada muy próxima
a un conjunto de electrodos interdigitados medir los cambios de
capacitancia resultantes de las interacciones entre las sustancias
dianas de la disposición ordenada de alta densidad y los electrodos
interdigitados.
En una realización, las disposiciones ordenadas
de alta densidad se producen a partir de haces de hebras dianas que
comprenden fibras o hilos. Las fibras o hilos pueden comprender
materiales naturales o sintéticos seleccionados del grupo que
consiste en algodón, seda, nailon y poliéster, o pueden ser otros
materiales como entenderán los que tengan experiencia en la técnica
a que se refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, los haces de hebras
dianas se producen impregnando directamente fibras con una
disolución acuosa de la sustancia diana. Una serie de tales fibras
se impregnan con distintas sustancias dianas y la identidad de la
sustancia diana que contiene cada fibra se registra en una base de
datos. Las fibras se lavan para eluir las sustancias dianas sin
unir y se tratan con una sustancia que no interfiere para bloquear
los sitios de unión no específicos de las fibras y las sustancias
dianas inmovilizadas. Después las fibras se secan para fijar el
agente bloqueante a la fibra y a las sustancias dianas
inmovilizadas.
Después, las fibras se unen en haces anotando la
posición de cada fibra y su sustancia diana inmovilizada asociada en
la base de datos. El haz de fibras se estabiliza preferiblemente
embebiendo o impregnando de otra forma el haz en una matriz para
proporcionar un soporte estructural al haz.
Después, se corta en sentido transversal el haz
sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de las
fibras empleando instrumentación adecuada para proporcionar
diversas disposiciones ordenadas de alta densidad. Preferiblemente,
el corte en sentido transversal da como resultado gran cantidad de
disposiciones ordenadas de alta densidad idénticas. La identidad y
posición de las sustancias dianas en cada disposición ordenada se
siguió a través de la información de la base de datos. Estas
disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar
simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o
se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que
tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe
en este documento.
Haciendo ahora referencia a las Figuras 1 a 3, en
ellas se muestran respectivamente, hebras dianas 10 que comprenden
una serie de fibras revestidas 12 impregnadas con sustancias dianas
conocidas; las hebras dianas 10 están embebidas en una matriz 14 y
reunidas en un haz 16; y el haz 16 se corta en sentido transversal
para producir un gran número de disposiciones ordenadas de alta
densidad idénticos 18, donde cada disposición ordenada tiene
sustancias dianas en dos ejes analíticos.
En una realización, se producen disposiciones
ordenadas de alta densidad a partir de haces que comprenden
membranas. Las membranas pueden comprender láminas planas finas de
una sustancia polímero, o pueden comprender otros materiales como
entenderán los que tengan experiencia en la técnica a que se
refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, los haces se
producen aplicando líneas de una composición que contiene las
sustancias dianas en las membranas escribiendo, dibujando,
imprimiendo o abollonando. La identidad y posición de cada sustancia
diana se registra en una base de datos. Después, las membranas se
tratan, si es necesario, para fijar las sustancias dianas a la
membrana.
Una membrana producida de esta manera se puede
cortar en sentido transversal para producir una gran cantidad de
disposiciones ordenadas de alta densidad, teniendo cada disposición
ordenada sustancias dianas dispuestas en un eje analítico. Haciendo
ahora referencia a las Figuras 4 y 5, en ellas se muestran
respectivamente, un haz 20 que comprende una membrana 33 que tiene
líneas 24 de sustancias dianas conocidas aplicadas a la membrana
22; el haz 20 se corta en sentido transversal para producir una
gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad 26, donde
cada disposición ordenada tiene sustancias dianas dispuestas en un
eje analítico.
Alternativamente, una gran cantidad de membranas
producidas de esta manera se pueden reunir en haces teniendo la
identidad y posición de cada sustancia diana inmovilizada anotadas
en la base de datos. La reunión puede comprender enrollar o doblar
la membrana, o puede comprender apilar una gran cantidad de
membranas impregnadas en sustancias dianas. Si es necesario, el haz
se estabiliza tal como embebiendo o impregnando de otra manera el
haz en una matriz para proporcionar soporte estructural al haz.
Después, el haz se corta en sentido transversal
sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de las
líneas de la sustancia diana de las membranas usando
instrumentación adecuada para proporcionar una gran cantidad de
disposiciones ordenadas de alta densidad, en las que cada
disposición ordenada tiene sustancias dianas dispuestas en dos ejes
analíticos. Preferiblemente, el corte en sentido transversal da
como resultado una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta
densidad idénticas. La posición e identidad de las sustancias
dianas se siguen a través de la información de la base de datos.
Estas disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar
simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o
se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que
tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se
describe en este documento.
Haciendo ahora referencia ahora a las Figuras 6 a
8, en ellas se muestra respectivamente, una gran cantidad de
membranas 28 que tienen líneas 30 de sustancias dianas aplicadas en
cada membrana 28; las membranas 28 están apiladas y estabilizadas
para formar el haz 32; el haz 32 se corta en sentido transversal
para producir una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta
densidad 34, donde cada disposición ordenada tiene sustancias
dianas 30 dispuestas en dos ejes analíticos.
Haciendo referencia ahora a las Figuras 9 a 11,
en ellas se muestra respectivamente, una membrana 36 que tiene
líneas de sustancias dianas conocidas 38 aplicadas a la membrana
36; la membrana 36 se enrolla y se estabiliza para formar un haz
40; el haz 40 se corta en sentido transversal para producir una
gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad 42, donde
cada disposición ordenada tiene sustancias dianas 38 dispuestas en
dos ejes analíticos.
En una realización, se producen disposiciones
ordenadas de alta densidad a partir de hebras dianas que comprenden
tubos. Los tubos pueden comprender poliimida, nailon,
polipropileno, poliuretano, silicona, vinilacetato de etilo, acero
inoxidable, cobre, vidrio o sílice fundida o pueden ser otros
materiales como entenderán los que tengan experiencia en la técnica
a que se refiere lo que se describe en este documento.
En una realización preferida, se producen hebras
dianas revistiendo el interior de los tubos con una disolución
acuosa de la sustancia diana tal que la sustancia diana se absorbe,
adsorbe o se une covalentemente a la superficie interior de los
tubos. Alternativamente, los tubos se pueden llenar con las
sustancias dianas con o sin embeber las sustancias dianas en una
matriz. Se produce una serie de tales tubos revistiendo o llenando
los tubos con diferentes sustancias dianas y la identidad de cada
hebra diana y la sustancia diana que contiene se registra en una
base de datos.
Después, los tubos se reúnen en haces anotando la
posición de cada tubo y su sustancia diana asociada en la base de
datos. El haz de tubos se estabiliza preferiblemente embebiendo el
haz en una matriz para proporcionar soporte estructural al haz.
Después, el haz se corta en sentido transversal
sustancialmente de manera perpendicular al eje longitudinal de los
tubos usando instrumentación adecuada para proporcionar una gran
cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad.
Preferiblemente, el corte en sentido transversal da como resultado
una gran cantidad de disposiciones ordenadas de alta densidad
idénticas. La identidad y posición de las sustancias dianas se
siguen a través de la información de la base de datos. Estas
disposiciones ordenadas se pueden utilizar para seleccionar
simultáneamente analitos para conseguir propiedades específicas, o
se pueden utilizar para otros propósitos como entenderán los que
tengan experiencia en la técnica a que se refiere lo que se
describe en este documento.
Haciendo referencia ahora a las Figuras 12 a 14,
en ellas se muestran respectivamente, hebras dianas 44 que
comprenden una serie de tubos 46 llenos con sustancias dianas 48
conocidas; las hebras dianas 44 embebidas en una matriz 50 y
reunidas en un haz 52; el haz 52 se corta en sentido transversal
para producir disposiciones ordenadas de alta densidad 54, donde
cada disposición ordenada tiene sustancias dianas 48 dispuestas en
dos ejes analíticos.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hilos
según la presente invención se emplea para producir disposiciones
ordenadas de alta densidad de sustancias dianas DNA como sigue. Se
evalúa hilo de algodón en cuanto a su capacidad para humedecerse por
una disolución acuosa sumergiendo el hilo en agua. El agua formando
una capa en la superficie del hilo indica que el hilo podría tener
aglutinantes, aceites u otros materiales en su superficie que
pueden afectar negativamente a la capacidad para humedecerse del
hilo para producir hebras dianas. Si durante el ensayo para
determinar la capacidad para humedecerse, tiene lugar la formación
de una capa, los hilos deberían lavarse en metanol, etanol u otro
disolvente adecuado miscible con el agua para eliminar los
materiales no deseados. Después los hilos se colocan en agua y se
cambia el agua varias veces hasta que cada hilo está completamente
mojado.
Después, los hilos se transfieren a una
disolución acuosa de una sustancia catiónica polímera tal como
poli(L-lisina) y se les deja alcanzar el
equilibrio con la disolución de
poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los
hilos se retiran de la disolución de
poli(L-lisina) y se secan para fijar la
poli(L-lisina) a la superficie de los hilos.
Después de la fijación, los hilos se lavan en una disolución
tamponada y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran
del tampón y se dejan secar.
Los hilos se cortan después con una longitud que
varía desde un centímetro hasta unos pocos metros, según sea
apropiado para las dimensiones del haz que se va a construir. Cada
hilo destinado al haz se corta preferiblemente con la misma
longitud.
A continuación, cada hilo cortado se pone en
contacto con una disolución de DNA que tiene una secuencia
específica conocida que será la sustancia diana inmovilizada.
Preferiblemente, la secuencia de DNA es diferente para cada hilo.
El DNA empleado preferiblemente debe ser monocatenario si es para
usar en estudios de hibridación de ácidos nucleicos, pero también
se puede dejar en forma bicatenaria. El DNA puede ser de fuentes
naturales tales como preparaciones de plásmidos, cromosomas
artificiales en levadura, librerías BAC, librerías YAC u otras
librerías de DNA tales como marcadores de secuencias expresadas, o
pueden producirse sintéticamente mediante la reacción en hebra de
la polimerasa u otros procesos sintéticos. El hilo y la disolución
de DNA se incuban durante un periodo que está en el intervalo de
unos pocos minutos a unas pocas horas, según se necesite para
saturar completamente con DNA los sitios de unión disponibles en el
hilo.
Después, los hilos revestidos con DNA se secan en
un horno a aproximadamente 60ºC durante un periodo suficiente para
fijar el DNA a los hilos. Alternativamente, el DNA se puede fijar
a los hilos humedeciendo el hilo revestido con DNA seco con etanol
o metanol 100% durante unos pocos minutos y dejando secar los
hilos. La identidad de cada hilo y su sustancia diana secuencia de
DNA inmovilizado se registra en una base de datos. A continuación,
los hilos se lavan individualmente en un tampón tal como 1xTE (10 mM
tris, 1 mM EDTA, Ph 7,6) para eliminar del hilo el DNA sin unir.
Los hilos revestidos con DNA se secan de nuevo.
Un haz de hilos revestidos con DNA se reúnen
después situando los hilos paralelos y adyacentes unos a otros
registrando en la base de datos la posición de cada hilo en el haz
y el DNA asociado a él. El haz de hilos se estabiliza embebiéndolo
en una matriz tal como polimetacrilato, resinas epoxídicas,
polietilenglicol, ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros
materiales similares que, preferiblemente, a temperatura elevada o
en forma sin polimerizar, pueden manejarse en forma líquida que es
adecuada para embeber los hilos. Los hilos embebidos se dejan
endurecer o reticular para comunicar una estructura rígida al
haz.
En una realización preferida, se evita que los
hilos se impregnen completamente con la matriz en la que se embeben
y se separe el DNA inmovilizado, revistiendo los hilos con una
sustancia tal como gelatina, sacarosa o poli(alcohol
vinílico), a la que la matriz es impermeable. Esto se realiza
humedeciendo los hilos que llevan el DNA inmovilizado en una
disolución que contiene de alrededor de 0,01% a alrededor de 10% en
peso de la sustancia y dejando secar los hilos antes de embeberlos
en la matriz.
El haz estabilizado se corta después
perpendicularmente al eje longitudinal de los hilos empleando un
microtomo o dispositivo similar para crear un gran número de
disposiciones ordenadas de alta densidad preferiblemente con un
espesor entre alrededor de 0,1 y 100 micrómetros. Cada disposición
ordenada de alta densidad resultante tiene el mismo patrón de
secuencias de DNA en regiones espaciales específicas o zonas de la
disposición ordenada con las sustancias dianas dispuestas en dos
ejes analíticos.
Un uso de estas disposiciones ordenadas de DNA es
detectar secuencias marcadas de DNA de una muestra que son
complementarias a sustancias dianas DNA monocatenario de la
disposición ordenada incubando la muestra y la disposición ordenada
en condiciones de hibridación durante un periodo de tiempo
suficiente para que tenga lugar la hibridación. El DNA sin hibridar
se elimina lavando. Las marcas se detectan después y se determinan
las zonas que proporcionan señal. Estas zonas se comparan con la
base de datos que contiene la identidad de las sustancias dianas
DNA de la disposición ordenada para establecer la identidad del DNA
marcado de la muestra.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad a partir de un haz que comprende fibras o hilos
según la presente invención se emplea para producir disposiciones
ordenadas de alta densidad de sustancias dianas péptidos como
sigue. Se evalúa hilo de algodón en cuanto a su capacidad para
humedecerse por una disolución acuosa sumergiendo el hilo en agua.
El agua formando una capa en la superficie del hilo indica que el
hilo podría tener aglutinantes, aceites u otros materiales en su
superficie que pueden afectar negativamente a la capacidad para
humedecerse del hilo para producir hebras dianas. Si durante el
ensayo para determinar la capacidad para humedecerse, tiene lugar la
formación de una capa, los hilos deberían lavarse en metanol,
etanol u otro disolvente adecuado miscible con el agua para
eliminar los materiales no deseados. Después los hilos se colocan
en agua y se cambia el agua varias veces hasta que cada hilo está
completamente mojado.
Después, los hilos se transfieren a una
disolución acuosa de una sustancia catiónica polímera tal como
poli(L-lisina) y se les deja alcanzar el
equilibrio con la disolución de
poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los
hilos se retiran de la disolución de
poli(L-lisina) y se secan para fijar la
poli(L-lisina) a la superficie de los hilos.
Después de la fijación, los hilos se lavan en una disolución
tamponada y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran
del tampón y se dejan secar.
Los hilos se cortan después con una longitud que
varía desde un centímetro hasta unos pocos metros, según sea
apropiado para las dimensiones del haz que se va a construir. Cada
hilo destinado al haz se corta preferiblemente con la misma
longitud. El hilo de algodón se evalúa en cuanto a su capacidad para
humedecerse con una disolución acuosa, se transfiere a una
disolución acuosa de una sustancia catiónica polimérica tal como
poli(L-lisina), y se deja que alcance el
equilibrio con la disolución de
poli(L-lisina) durante unas pocas horas. Los
hilos se retiran de la disolución de
poli(L-lisina) y se secan par fijar la
poli(L-lisina) a la superficie de los hilos.
Después de la fijación, los hilos se lavan en disolución tamponada
y el tampón se cambia varias veces. Los hilos se retiran del tampón
y se dejan secar.
A continuación, cada hilo cortado se pone en
contacto con una disolución en dimetilsulfóxido (DMSO) de péptidos
con una secuencia específica conocida que será la sustancia diana
inmovilizada. Preferiblemente, la secuencia de péptidos es
diferente para cada hilo. Los péptidos individuales para usar como
sustancias dianas se obtienen comercialmente o se preparan con la
síntesis de Merifield, (tal como se trata en Bodanszky, M y Troust,
B. Eds. Principles of Peptide Synthesis, 2ª edición,
Springer-Verlag, New York, 1993, incorporado
íntegramente por referencia), como entenderán los que tengan
experiencia en la técnica a que se refiere lo que se describe en
este documento. Cada hilo y la disolución de péptido se incuban
durante un periodo que está en el intervalo de unos pocos minutos a
unas pocas horas, según se necesite para saturar completamente con
el péptido los sitios de unión disponibles en el hilo.
Los hilos revestidos con péptido se escurren para
eliminar el exceso de disolución de DMSO y después se incuban con
pentanos mezclados o una sustancia equivalente para precipitar los
péptidos en la superficie de los hilos. Los hilos revestidos con
péptidos se secan a temperatura ambiente o entre alrededor de 60ºC
y 70ºC, con o sin vacío. La identidad de cada hilo y de su sustancia
diana secuencia de péptidos inmovilizada se registra en una base de
datos. Los hilos revestidos con péptidos se lavan después en un
tampón acuoso tal como 0,01 a 1,0 M tris pH 7,0 o disolución salina
de pH 7,0 tamponada con fosfato, tal como cloruro sódico 120 mM,
cloruro potásico 2,7 mM y fosfato 10 mM (disponible en Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA) para eliminar de los hilos los
péptidos sin unir y se seca de nuevo a temperatura ambiente o entre
alrededor de 60ºC y 70ºC, con o sin vacío.
Un haz de hilos revestidos de péptidos se reúne
después situando los hilos paralelos y adyacentes unos a otros
registrando la posición de cada hilo en el haz y su péptido
asociado. El haz de hilos se estabiliza embebiéndolo en una matriz
tal como polimetacrilato, resinas epoxídicas, polietilenglicol,
ceras de parafina, gomas, poliacrilamida y otros materiales
similares que, preferiblemente, a temperatura elevada o en forma
sin polimerizar, pueden manejarse en forma líquida que es adecuada
para embeber los hilos. Los hilos embebidos se dejan endurecer o
reticular para comunicar una estructura rígida al haz.
En una realización preferida, se evita que los
hilos se impregnen completamente con la matriz en la que se embeben
y se separe el péptido inmovilizado, revistiendo los hilos con una
sustancia tal como gelatina, sacarosa o poli(alcohol
vinílico), a la que la matriz es impermeable. Esto se realiza
humedeciendo los hilos que llevan el péptido inmovilizado en una
disolución que contiene de alrededor de 0,01% a alrededor de 10% en
peso de la sustancia y dejando secar los hilos antes de embeberlos
en la matriz.
El haz estabilizado se corta después
perpendicularmente al eje longitudinal de los hilos empleando un
microtomo o dispositivo similar para crear un gran número de
disposiciones ordenadas de alta densidad preferiblemente con un
espesor entre alrededor de 0,1 y 100 micrómetros. Cada disposición
ordenada de alta densidad resultante tiene el mismo patrón de
secuencias de péptidos en regiones espaciales específicas o zonas
de la disposición ordenada.
Un uso de estas disposiciones ordenadas de
péptidos es detectar la presencia del analito anticuerpo en una
muestra, en la que el anticuerpo se puede unir a al menos una
sustancia diana péptido en la disposición ordenada. La presencia de
los analitos anticuerpos se determina incubando la muestra y la
disposición ordenada en condiciones adecuadas durante un periodo de
tiempo suficiente para que tenga lugar la unión del analito
anticuerpo. La muestra sin unir se elimina lavando. El anticuerpo
unido se detecta después empleando anticuerpos secundarios
biotinilados y detección con estreptavidina marcada tal como
fosfatasa alcalina, fluoresceína o estreptavidina marcada con oro,
según las técnicas conocidas por los que tienen experiencia en la
técnica, la identidad de las sustancias dianas de las zonas que
muestran unión se establece por referencia a la base de datos. La
unión indica la presencia de anticuerpos que tienen un dominio
epitópico para el péptido en la zona. Esta unión puede ser la
evidencia de la exposición a un organismo o de la infección por el
mismo, si la muestra proviene del suero de un paciente.
El método para producir disposiciones ordenadas
de alta densidad de sustancias dianas según la presente invención se
usó para crear disposiciones ordenadas a partir de DNA impregnado
en una membrana como sigue. Se empleó The Saccharomyces Genome
Database de Stanford University, Palo Alto, California,
USA como fuente para identificar secuencias genómicas existentes de
forma natural. Empleando esta información, se seleccionaron al azar
16 oligonucleótidos con temperaturas de fusión similares entre el
genoma de levadura como sustancias dianas. Cada secuencia tenía
entre 28 y 35 nucleótidos y se sintetizó mediante la química
estándar de la cianoetilfosforamidita según el método descrito en
Gait, M.J., Ed., Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach, IRL Press, Oxford, 1984. Cada secuencia de sustancias
dianas tenía 100 residuos de timidina en el extremo 3' para
facilitar la unión del oligonucleótido a la membrana. Véase, por
ejemplo, Erlich, Henry A. y Bugawan, Teodorica L., HLA Class II
Gene Polymorphism: DNA Typing, Evolution, and Relationship to
Disease Susceptibility in PCR Technology: Principles and
Applications for DNA Amplification, Stockton Press, Nueva York,
págs. 193-208, 1989, incorporado íntegramente a
este documento por referencia. Las 16 sustancias dianas,
etiquetadas con el nº 1 al nº 16, se disolvieron individualmente en
agua tratada con pirocarbonato de dietilo hasta una concentración
final de 10 \mug/\mul.
Las sustancias dianas se aplicaron usando una
punta de aplicación que tiene un depósito con una capacidad de 11
\mul conectado con el extremo mediante un pequeño canal capilar.
La punta se usó para dibujar líneas de sustancias dianas con una
separación de aproximadamente 1 mm a 3 mm en membranas de 20 cm x 20
cm, membranas de nailon cargadas + Hybond^{TM} N (Amersham,
Arlington Heights, IL, USA). El depósito de la punta se rellenó con
10,5 \mul de una disolución de la primera de las 16 sustancias
dianas usando un pipeteador Eppendorf® 2-10
\mul.
La primera membrana, membrana nº 1, se situó en
el tablero de una mesa, plano y limpio con una lámina de papel
encerado mayor que la membrana, que se usó como separador situado
entre la membrana y el tablero de la mesa en la preparación del
empaquetado. La punta se alineó de forma que ambos lados del canal
capilar tocaran el papel encerado a alrededor de 1 cm desde el borde
de la membrana y suavemente la punta se arrastró manualmente a
través del papel encerado y la membrana usando una regla como guía
para dibujar una línea recta de la sustancia diana paralela a un
borde de la membrana. La disolución de sustancia diana salió de la
punta y se agotó después de dibujar una línea de aproximadamente
12-16 cm de largo. Este ciclo se repitió para cada
disolución de sustancias dianas en la primera membrana hasta que la
membrana nº 1 comprendió 16 líneas paralelas de distintas
sustancias dianas de DNA separadas aproximadamente por 1 mm a 3
mm.
Este procedimiento se repitió para producir dos
membranas adicionales, membranas nº 2 y nº 3, excepto que cada
disolución de sustancia diana DNA se aplicó tres veces consecutivas
resultando un total de 48 líneas paralelas de sustancias dianas en
las membranas nº 2 y nº 3. Cada línea de sustancias dianas se marcó
con el propósito de identificarla en todas las membranas.
Las membranas que comprendían las líneas de
sustancias dianas DNA se dejaron secar al aire durante unas 2 horas
y después se reticularon mediante la aplicación de 1.200
\mujulios de radiación electromagnética UV durante 35 segundos
usando un Stratagene 2400 Stratalinker® (Stratagene, La Jolla, CA,
USA). En cada una de las tres membranas, se cortó una tira de
aproximadamente 2 cm de ancho por 20 cm de largo, empezando por el
borde de la membrana que contenía la primera de las líneas de la
sustancia diana, de manera que las líneas de las sustancias dianas
fueran paralelas al borde de 2 cm de las tiras.
Se prepararon sondas de DNA marcadas
radiactivamente que eran complementarias a la secuencia de
sustancias dianas nº 1 y nº 7 empleando técnicas estándar. Se
ensayó la hibridación entre las sondas marcadas radiactivamente y
una disposición ordenada producida a partir de la membrana nº 1
usando técnicas estándar. En resumen, los oligonucleótidos de DNA se
marcaron empleando el equipo Ready to Go Kinase^{TM} (Pharmacia,
Piscataway, NJ, USA) empleando
gamma-^{32}P-ATP (ICN
Radiochemicals, Irvine, CA, USA) según las instrucciones del
fabricante. Las sondas marcadas se purificaron empleando columnas
Nick^{TM} (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante, y se
diluyeron hasta aproximadamente 1x10^{6} cpm/ml.
Se realizaron la prehibridación e hibridación
empleando 10 ml de tampón HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc.
Huntsville, AL, USA) según las instrucciones del fabricante en un
horno de hibridación Mini-6^{TM} (Hybaid, Ltd.,
Middlesex, UK) a 42ºC durante una hora cada una. Los lavados
posteriores a la hibridación se realizaron empleando tres lavados
de 10 ml durante 15 minutos cada uno en 1xSSC, dodecil sulfato
sódico (SDS) al 0,01% a 42ºC. El lavado final se realizó con 100 ml
de 1xSSC (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2) (Research
Genetics), tampón SDS al 0,01% (Sigma) a 42ºC durante 15 minutos. El
aclarado final se realizó con 10 ml de tampón 1xSSC. Después las
membranas se secaron al aire durante 1-2 horas a
temperatura ambiente.
Se realizó una autorradiografía situando las
disposiciones ordenadas en contacto con una película para
rayos-X Biomax^{TM} MS ó MR (Eastman Kodak,
Rochester, NY, USA) a temperatura ambiente durante entre
aproximadamente ½ hora a 4 horas hasta que se obtuvo la intensidad
de imagen deseada. Todas las sondas se hibridaron con la sustancia
diana adecuada de la disposición ordenada demostrando que las
sustancias dianas DNA estaban unidas a la membrana y disponibles
para el sondeo y que tal sondeo daba resultados de hibridación
específicos y no ambiguos.
A continuación, la porción que quedaba de 20 cm
por 18 cm de las membranas nº 1, 2 y 3 se empleó para producir
disposiciones ordenadas como sigue. Las membranas se sumergieron en
gelatina teleóstea al 3% (Sigma) en agua desionizada y se incubaron
durante la noche a temperatura ambiente para bloquear las
membranas. Las membranas se lavaron después tres veces en 600 ml de
agua desionizada para eliminar la gelatina sin unir. Se secó el
exceso de humedad de las membranas entre dos láminas de papel
secante 903 (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) y se dejaron
secar al aire a temperatura ambiente durante la noche.
A continuación, se cortó una tira de 2 cm por 20
cm de cada una de las tres membranas nº 1, nº 2, nº 3,
perpendicularmente a las líneas de las sustancias dianas con un
borde de 2 cm paralelo a las líneas de las sustancias dianas. Cada
una de las tiras se enrolló de forma apretada alrededor de un eje
paralelo a las líneas de sustancias dianas para producir un
cilindro, siendo la porción de membrana que no tenía sustancias
dianas aplicadas la parte interior del cilindro. Se empleó esmalte
de uñas transparente para sellar el borde libre de 3 mm de las
tiras para evitar que el cilindro se desenrollara. Se sumergió cada
cilindro en una ampolla de plástico de 1,25 por 7,5 cm rellena con
medio para embeber suave LR White (Sigma) sin polimerizar que se
preparó según las instrucciones del fabricante hasta que el
cilindro se impregnó totalmente con el medio. Después, cada
cilindro se colocó en la base de la ampolla rellena con el medio,
se centró y se dejó que polimerizara durante la noche a 60ºC. Cada
ampolla que contenía un cilindro embebido se retiró y se situó a
temperatura ambiente y se observó que la polimerización fuera
completa.
Se produjo después una gran cantidad de
disposiciones ordenadas de aproximadamente 10 micrómetros de espesor
cortando en sentido transversal repetidamente cada cilindro embebido
perpendicularmente a su eje longitudinal, esto es,
perpendicularmente al eje longitudinal de cada línea de sustancia
diana. El corte en sentido transversal se realizó empleando un
microtomo manual, modelo DK-10 (Edmund Scientific,
Barrington, NJ, USA).
Empleando técnicas estándar, se prepararon sondas
de DNA marcadas radiactivamente que eran complementarias a la
secuencia de sustancias dianas nº 1 y nº 7. Se probó la hibridación
entre las sondas marcadas radiactivamente y una disposición
ordenada producida a partir de la membrana nº 1 empleando técnicas
estándar. En resumen, los oligonucleótidos de DNA se marcaron
empleando el equipo Ready to Go Kinase^{TM} (Pharmacia,
Piscataway, NJ, USA) empleando
gamma-^{32}P-ATP (ICN
Radiochemicals, Irvine, CA, USA) según las instrucciones del
fabricante. Las sondas marcadas se purificaron empleando columnas
Nick^{TM} (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante, y se
diluyeron hasta 1x10^{6} cpm/ml.
Se realizaron la prehibridación e hibridación
empleando 10 ml de tampón HyperHyb^{TM} (Research Genetics, Inc.
Huntsville, AL, USA) según las instrucciones del fabricante en
tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con cierre de rosca) a 42ºC
durante una hora en un horno de hibridación Mini-6
(Hybaid, Ltd., Middlesex, UK) a 42ºC. Los lavados posteriores a la
hibridación se realizaron empleando tres lavados de 1,5 ml durante
15 minutos cada uno en 1xSSC, dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,01%
a 42ºC. El lavado final se realizó con 100 ml de 1xSSC (NaCl 0,15
M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2) (Research Genetics), tampón SDS
al 0,01% (Sigma) a 42ºC durante 15 minutos. El aclarado final se
realizó con 10 ml de tampón 1xSSC. Después las disposiciones
ordenadas se secaron al aire durante aproximadamente
15-30 minutos. Se realizó una autorradiografía
situando las disposiciones ordenadas en contacto con una película
para rayos-X Biomax^{TM} MS ó MR (Eastman Kodak,
Rochester, NY, USA) a temperatura ambiente durante entre
aproximadamente ½ hora a 4 horas hasta que se obtuvo la intensidad
de imagen deseada. Después se hicieron fotografías de las
autorradiografías reveladas.
Se probó la hibridación entre las sondas marcadas
radiactivamente y una disposición ordenada producida a partir de la
membrana nº 1 empleando técnicas estándar. Todas las sondas se
hibridaron con la sustancia diana adecuada de la disposición
ordenada demostrando que las sustancias dianas DNA estaban unidas a
la membrana y disponibles para el sondeo y que tal sondeo daba
resultados de hibridación específicos y no ambiguos.
Las disposiciones ordenadas se sometieron a
ensayo en cuanto a su funcionalidad como sigue. Una sonda de DNA
marcada radiactivamente complementaria a la sustancia nº 1 se usó
para sondar una disposición ordenada producida a partir de la
membrana nº 2. Haciendo ahora referencia a la Figura 15, en ella se
puede ver una fotografía de la autorradiografía del resultado. Como
se puede ver, tuvo lugar la hibridación entre la sonda y tres zonas
de la disposición ordenada que contenían sustancia diana nº 1, con
una mínima hibridación cruzada en las otras 45 zonas que
representan las 15 restantes sustancias dianas DNA. Por tanto, la
disposición ordenada demostró tanto funcionalidad para los estudios
de hibridación así como especifidad.
A continuación, una disposición ordenada
producida a partir de la membrana nº 3 se sondó con DNA marcado
radiactivamente que era complementario a las sustancias dianas nº 1
y nº 7. Haciendo ahora referencia a la Figura 16, se puede ver una
autorradiografía del resultado. Como puede verse, tuvo lugar la
hibridación entre las sondas y seis zonas de la disposición
ordenada, con hibridación cruzada mínima para las otras 42 zonas
que representan las restantes 14 sustancias dianas DNA.
Aunque la presente invención se ha discutido con
considerable detalle haciendo referencia a ciertas realizaciones
preferidas, son posibles otras realizaciones. Por lo tanto, el
alcance de las reivindicaciones adjuntas no debería limitarse a la
descripción de las realizaciones preferidas contenidas en este
documento.
Claims (4)
1. Un método para producir una disposición
ordenada de alta densidad que comprende las etapas de enrollar una
membrana impregnada con líneas de sustancias diana para producir un
haz y cortar en sentido transversal el haz para producir una
pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad,
caracterizado porque:
el haz de hebras diana se ha estabilizado
embebiendo el haz en un material; y
en el que la localización de cada sustancia diana
en el haz está registrada en una base de datos.
2. Un método para determinar secuencias génicas,
detectar la presencia de mutaciones génicas, detectar la expresión
diferencial cualitativa o cuantitativa de productos génicos,
cartografiar secuencias epitópicas que provocan respuestas inmunes,
o identificar compuestos para el desarrollo de agentes
farmacéuticos, caracterizándose el método por la etapa de
proporcionar una disposición ordenada de alta densidad según la
reivindicación 1.
3. Un método para producir una disposición
ordenada de alta densidad que comprende la etapa de apilar una
pluralidad de membranas impregnadas con líneas de sustancias diana
para producir un haz y cortar transversalmente el haz para producir
una pluralidad de disposiciones ordenadas de alta densidad,
caracterizado porque:
el haz de hebras diana se ha estabilizado
embebiendo el haz en un material; y
en el que la localización de cada sustancia diana
en el haz está registrada en una base de datos.
4. Un método para determinar secuencias génicas,
detectar la presencia de mutaciones génicas, detectar la expresión
diferencial cualitativa o cuantitativa de productos génicos,
cartografiar secuencias epitópicas que provocan respuestas inmunes,
o identificar compuestos para el desarrollo de agentes
farmacéuticos, caracterizándose el método por la etapa de
proporcionar una disposición ordenada de alta densidad según la
reivindicación 3.
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