KR20140026408A - 포유동물에서 지방 세포를 표적화하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

포유동물에서 지방 세포를 표적화하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

비만/지방과다 관련 장애를 치료하기 위한 치료제의 진단, 조영 또는 표적에서 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제시되고, 이러한 조성물 및 방법은 실험실내 및 생체내 둘 다에서 포유동물에서 지방 조직 기질 세포를 선택적으로 표적화하기 위한 펩타이드를 확인하고 사용한다.

Description

포유동물에서 지방 세포를 표적화하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING ADIPOSE CELLS IN MAMMALS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 3월 30일에 출원된 미국 가출원 제61/469,345호(모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함됨)의 이익을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 치료제 전달을 표적화하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더 특히, 본 개시내용은 실험실내 및 생체내 둘 다에서 포유동물에서의 지방 조직을 선택적으로 표적화하는 펩타이드의 확인 및 사용을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
줄기 세포 이식은 준임상 시험에서 조직 재생을 북돋우는 방식으로 인정되고, 이러한 전략은 병상으로 옮겨지고 있다(Kolonin and Simmons, Nat. Biotechnol. 27, 252-253, 2009). 줄기 세포 치료는 조영 또는 치료 용도를 위한 특정 장기에서 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell: MSC)를 표적화하는 성능으로 매우 유리할 것이다. MSC는 다기능 성체 전구 세포를 포함하는 혼합 세포 집단이다(Bianco, et al, Cell Stem Cell 2, 313-319, 2008). 조골세포, 연골세포 및 지방세포와 같은 중간엽 계통으로 분화하는 이 세포의 능력으로 인해, 이것은 흔히 중간엽 줄기 세포라 칭한다(Pittenger, et al, Science 284, 143-147, 1999; Prockop, Science 276, 71-74, 1997). 최근의 연구로 MSC가 혈관 통합성을 유지하면서 혈관주위 세포(주피세포)로서 기능한다는 것이 밝혀졌다(Crisan, et al, Cell Stem Cell 3, 301-313, 2008; Tang, et al, Science 322, 583-586, 2008; Traktuev et al, Circ. Res. 102, 77-85, 2008).
이식된 MSC에 의한 준임상 연구 및 임상 시험은 이 세포의 치료학적 가능성을 지지하고 이 세포가 또한 질병 동안 활성화되어 조직 수복 및 재생에 참여한다는 것을 제시한다. 그러나, 세포 치료에 대한 MSC의 임상 적용은 암을 촉진하는 이의 성능과 관련된 안전성 문제로 인해 이 플라스틱 세포 집단을 추적하고 제어하는 능력을 요한다(Zhang et al, Cancer Res. 69, 5259-5266, 2009).
MSC는 원래 섬유아세포 형태학에 기초하여 일명 섬유아세포 콜로니 형성 단위(fibroblast colony-forming unit: CFU-F) 및 골수 기질로부터 단리되었다((Friedenstein, Haematol. Blood. Transfus. 25, 19-29, 1980). 이후, MSC는 대부분의 성인 장기에서 확인되었고, 백색 지방 조직(white adipose tissue: WAT)은 가장 큰 MSC 저장소이고, 이 세포는 지방 기질 세포(adipose stromal cell: ASC)라 칭하다(Gimble et al, Circ. Res. 100, 1249-1260, 2007; Daquinag et al, Trends in Pharmacol. Sci. 22, 1-8, 2011). WAT가 주로 지방세포로 이루어지지만, ASC는 또한 내피 세포(endothelial cell: EC) 및 침윤성 조혈 세포(infiltrating hematopoietic cell)를 포함하는 기질/혈관 분획(stromal/vascular fraction: SFV)에서 대부분의 세포를 구성한다(Hausman et al, Obes. Rev. 2, 239-254, 2001). ASC는 골수 MSC의 것과 비슷한 다능성 및 증식 성능을 나타내고, 또한 명확한 독특한 특징을 갖는 다기능 전구체의 풍부한 공급원인 것으로 밝혀졌다(Rodeheffer et al, Cell 135, 240-249, 2008; Tang et al, 2008(상기 참조); Zuk et al, 2001, Tissue Eng. 7, 211-228).
MSC와 다른 조직 성분과의 세포간 상호작용이 조직 개형을 매개하는 메커니즘에 대한 현재의 이해는 특이적 MSC 마커의 결여로 제한된다. 혈소판 유도 성장 인자 수용체-β(PDGFRβ), CD146, CD44, CD90, CD105, CD73, CD29 및 Stro-1을 비롯한 다수의 세포 표면 분자가 MSC의 양성 선택에 사용되지만, 이들 각각은 또한 다른 세포 유형에서 발현된다(Bianco et al, 2008(상기 참조); Gimble et al, 2007(상기 참조); Nie et al, Stem Cells 26, 2735-2745, 2008). MSC(WAT 유래의 것을 포함)는 범백혈구 마커 CD45의 결여에 기초한 조혈 세포와 범내피 마커 CD31/PECAM-1의 결여에 기초한 내피 세포(EC)와 구별될 수 있다(Bianco et al., 2008(상기 참조); Rodeheffer et al, 2008(상기 참조)). CD34가 몇몇 장기의 혈관주위 MSC에서 생체내 발현되므로, 다른 세포로부터 MSC를 분리하기 위해 CD34+CD45-CD31-면역표현형이 사용된다(Gimble et al, 2007(상기 참조); Tang et al., 2008(상기 참조); Traktuev et al., 2008(상기 참조); Zhang et al., 2009(상기 참조)). 그러나, 이 서명이 상이한 조직에서 MSC를 분화시키지 않으므로, 다른 조직에서의 ASC 및 MSC의 장래의 단리 및 추적에 대한 새로운 마커가 시급히 필요하고 줄기 세포 이식 분야를 전체로서 제약한다.
게다가, 지방 관련 장애는 신체 지방 및 체중의 조절에 영향을 미치는 섭식 및 다른 장애를 비롯하여 비만, 체중 및 체성분 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 모든 선진국에서 주요 건강 문제를 나타낸다. 선진국에서의 비만 유행은 높다. 예를 들면, 2002년까지 대략 30%의 미국인이 비만이다(National Health and Nutrition Examination Survey). 비만은 제지방 체중에 비해 지방 체중이 과다한 병증이고, 30㎏/㎡보다 큰 체질량 지수(중량/높이2)로서 정의된다(Kopelman, Nature 404:635-643, 2000). 비만은 다른 합병증 중에서 2형 당뇨병, 뇌졸중, 고혈압, 관상 동맥 질환, 특정 암, 특정 조직에서의 만성 섬유증, 지방간 질환, 만성 정맥 부전, 심부정맥 혈전증, 관절염, 호흡 문제, 예컨대 폐쇄성 수면 무호흡증 및 담낭 질환, 예컨대 담석증(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 많은 진행성 중증 질환의 위험 증가와 관련된다(Willett et al, N. Engl. J. Med. 341 :427-434, 1999).
추가로 흥미로운 것은, 기질 세포는 장기의 실질 세포의 기능을 지지하는 연결 조직 세포이다. 섬유증은 조직 손상에 대한 반응으로서 연결 조직에 의한 세포외 매트릭스의 과생성 및 반흔 형성을 포함하는 병리학 과정이다. 융합성 섬유증은 기초하는 장기 또는 조직의 정상 구조 및 기능을 없앨 수 있다. 섬유성 장애로는 피부에서의 병리학적 반흔, 예컨대, 콜로이드 및 비후성 반흔; 간 및 담낭의 간경변증, 심장, 눈 및 신장, 폐 및 골수에서의 섬유증, 위장관에서의 섬유증을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않고, 이들은 암, 예컨대 육종 및 주피세포종 및 강피증과 관련된다. 추가의 섬유성 장애로는 괴혈병 및 자가면역 장애, 예컨대 류마티스 관절염 및 전신 홍반 루푸스를 들 수 있고, 이의 유전자 장애로는 무엇보다도 마르팡(Marfan syndrome), 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 로에이스-디에츠 증후군(Loeys-Dietz syndrome), 탄력섬유 가성 황색종(pseudoxanthoma elasticum), 불완전 골생성증(osteogenesis imperfect), 진행성 골화성 섬유이형성증(flbrodysplasia ossificans progressive) 및 자연 기흉(spontaneous pneumothorax)을 들 수 있다.
상기 언급된 질환 연관은 비만의 경제적 비용이 100십억 달러를 넘는 것으로 예측되는 이유를 설명하고(Daniels, Am. J. Nurs. 106:40-49, 2006), 이는 전체 건강 관리 비용의 7%인 것으로 예측된다(Seidell, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 19(Suppl 6):S13-S16, 1995).
포유동물에서의 체성분 조절은 식욕 및 에너지 소비 둘 다의 조절을 포함하는 복잡한 과정이다. 인간 체성분 및 체중 항상성은 완전히 이해되지 않고 있다. 비만의 전염병학은 이 장애가 유전 특징을 나타낸다는 것을 강력히 보여주고, 인간 이중 연구는 체성분 및 체중 조절에서 실질적인 유전적인 기반을 강력히 제시하고, 유전률 추정이 약 80 내지 90%이다. 인간 비만 및 동물 모델의 유전자의 연구는 비만이 식품 섭취 조절 결함, 식품 유발 에너지 소비 및 지질과 제지방 동화작용 사이의 균형의 복잡한 상호작용으로 생긴다는 것을 입증한다. 따라서, 비만은 단순히 나쁜 행동, 즉 자발적인 섭식항진증의 결과가 아니라, 섭식 패턴, 대사 및 신경/대사 상호작용의 차이로부터 생긴다. 이러한 차이는, 어느 정도, 유전자 생성물의 수준 또는 활성 중 어느 하나인 유전자 발현의 차이로 인한 것으로 보인다(Friedman et al, Mamm. Genome 1: 130-144, 1991).
체중 조절을 위한 현재의 방법은 식이 및 수술 절차를 포함한다. 그러나, 식이는 대개 성공적이지 않고, 펜터민, 펜플루라민, 메리디아(Meridia), 제니칼(Xernical), 오를리스타트(Orlistat), 아디펙스(Adipex)-P, 본트릴(Bontril) 및 요오노민(Ionomin)과 같은 식약청이 허가한 몇몇 비만 치료제는 허용되지 않거나 해로운 부작용을 갖고, 허가받은 것 중 몇몇은 시장으로부터 철수되었다. 지방흡인술, 위 우회술 또는 밴드 수술과 같은 중량 감량을 위한 수술 방법은 많은 위험을 갖는다. 중량 조절을 위해 현재 이용 가능한 방법 중 어느 것도 성공적이지 않고, 개선된 중량 감량 및 조절 방법에 대한 필요성이 존재한다.
인간 집단에서의 비만 문제점 이외에, 개 및 고양이와 같은 반려 동물에서의 비만의 위험이 성장하고 있다(German, J. Nutr. 136: 1940S-1946S, 2006). 미국에서, 모든 개 및 고양이 중 25 내지 40%가 과체중 또는 비만인 것으로 추정된다. 인간에서처럼, 비만은 반려 동물의 건강 및 수명에 해로운 효과를 가질 수 있다. 추가로, 상업용 가축 공급물에서 체성분 및 체중 조정제의 사용을 감소시키거나 제거하는 능력은 사육사뿐만 아니라, 전체 소비자 및 사회에게도 비용에 있어서 상당히 유익하다. 따라서, 체성분 및 체중을 조정하고 인간 및 반려 동물에서의 비만(이것으로 제한되지는 않음)과 같은 체성분 장애를 치료하는 능력 및 가축의 몸집을 증가시키는 능력은 광범위하게 유익하고 상당한 기회를 나타낸다.
당뇨병은 구체적으로 비만 및 대사 증후군과 관련된 현재 치유 불가능한 장기간 장애이고, 추가의 병리학적 병증을 진행시키는 큰 위험 증가는 잘못된 혈당 제어로 생긴다. 단기간 만성 위험으로는 저혈당증, 감염 및 고혈당증과 관련된 장애, 예컨대 케토산증을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당뇨병으로부터 생기는 장기간 합병증으로는 심장 질환, 뇌졸중, 높은 혈압, 혈관 질환, 시각 장애, 신장병 및 신경병증을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 국제 당뇨병 및 소화 및 신장 질환 기관(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)에 의한 2005년 조사에 따르면, 미국에서 20백만명이 넘는 사람들이 당뇨병을 앓고 있고, 당뇨병을 앓고 있는 집단의 백분율이 빠르게 증가하고 있다. 미국에서 2005년에, 1.5백만명의 사람들이 당뇨병으로 진단받았다. 일부 연구는 전세계적으로 약 250백만명의 사람들이 2020년까지 당뇨병으로 고통 받을 것으로 제시하고 있다(O'Rahilly, BMJ, 314: 955-959, 1997). 이러한 장애의 가장 흔한 형태는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM 또는 I형) 및 인슐린 비의존성 당뇨병(NIDDM 또는 II형)이다. 높은 당뇨병 발병률 및 많은 관련 합병증으로 발생하는 비가역적 손상으로 인해, 치료 비용은 미국에서 임의의 다른 단독 질환을 능가한다. 2002년에, 132십억 달러가 넘게 직접 및 간접 치료 비용에 소비되었고, 직접 의학 비용에 약 92십억 달러가 들었다(Hogan et al, Diabetes Care 26:917-932, 2003).
최근에, 비만은 암 환자가 진전된 암 진행의 결과로서 사망하게 하는 인자 중 하나로서 나타난다(예를 들면, 문헌[Daquinag et al., Vascular targeting of adipose tissue as an anti-obesity approach. Trends in Pharmacol Sci. 22, 1-8, 2011; Zhang, et al. Adipose-tissue derived progenitor cells and cancer, World Journal of Stem Cells (Topic Highlight), 2 (5): 103-113, 2010; Bellows, et al., Influence of BMI on Level of Circulating Progenitor Cells, Obesity, online; Flegal, et al. Cause-specific excess deaths associated with underweight, overweight, and obesity. JAMA. 298, 2028-2037, 2007; Roberts, et al. Biological mechanisms linking obesity and cancer risk: new perspectives. Annu Rev Med. 61 :301-316, 2010] 참조). 전립선 및 유방 암종증을 앓고 있는 환자의 생존이 다른 암보다 비만에 의해 감소하였다. WAT는 염증 및 대사 증후군에서 연루된 다양한 가용성 아디포카인을 분비하는 강력한 내분비 장기로서(Rosen et al., Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature; AAA: 847-853, 2006) 암 진행에 직접적인 효과를 미친다(Vona-Davis, et al, Adiposity, type 2 diabetes and the metabolic syndrome in breast cancer. Obes Rev; 8: 395-408, 2007). 인슐린양 성장 인자(insulin-like growth factor: IGF)는 종양 세포 증식을 직접 자극할 수 있는 것 중 하나이다. 렙틴인 인터류킨-6 및 다양한 다른 호르몬 및 염증 사이토카인은 또한 중요한 역할을 할 수 있다(Baillargeon. Obestity adipokines and prostate cancer (review). Int J Oncol; 28: 737-745 2006). 그러나, 암에서 이러한 인자의 역할을 조사하는 임상 및 실험 데이터는 여전히 논란이 된다. 예를 들면, 동물 모델에서 순환 IGF-1의 절제는 전립선 종양 성장에 효과를 미치지 않는 것으로 나타났다(Anzo et al., Targeted deletion of hepatic Igfl in TRAMP mice leads to dramatic alterations in the circulating insulin-like growth factor axis but does not reduce tumor progression. Cancer Res; 68(9):3342-9, 2008). 따라서, 대안적인 메커니즘이 고려되어야 한다.
생리학적 기능이 과도한 에너지를 저장하는 것인 WAT와 반대로, 갈색 지방 조직(brown adipose tissue: BAT)은 열 형태의 에너지 소산을 담당한다. WAT와 BAT 사이의 우수한 균형이 표적 치료를 설계하는 데 있어서 고려해야 할 중요한 사안이다. 설치류 모델로부터 얻은 다수의 결과는 BAT가 비만의 병리학적 결과에 대해 보호 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 성인에서 BAT를 발견하는 것의 중요성은 비만 및 관련 장애의 치료에 대한 가능한 새로운 접근법에 있다. ASC는 BAT를 발생시키는 전구 세포 유형 중 하나이다(Elabd et al. Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into functional brown adipocytes. Stem Cells 27, 2753-2760, 2009). 더 중요하게, 백색 지방세포는 배양물 및 생체내 둘 다에서 BAT양 표현형으로 직접 전환될 수 있다(Cinti. Trans differentiation properties of adipocytes in the adipose organ. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297, 977-986, 2009). 마우스에서, WAT 내의 잔류 BAT "패치"의 확장은 실질적으로 모든 지방 축적물이 WAT를 희생시키면서 BAT양이 되게 할 수 있다. 맥관구조 상태에 대한 지방세포 생리학의 명확한 의존성은 혈관-표적 물질이 더 생리학적이고 안전한 항비만 치료제로서 조직을 함께 파괴하기보다는 WAT를 BAT로 전환시키도록 설계된다는 것을 제시한다. 존재하는 잔류 BAT의 증식, 혈관신생 및/또는 대사를 활성화하는 약물학적 접근법의 개발은, 이론상, WAT/BAT 균형을 치우치게 하고 비만을 치료하기 위해 사용된다.
요약하면, 지방 관련 체성분 및 체중 장애, 예컨대 비만 및 당뇨병은 중요한 건강 문제를 나타낸다. 지방 관련 체중 장애의 심각성, 유행성 및 복잡성을 고려하면, 체성분 및 체중 조절에 관여하는 유전자 및 단백질을 확인하고, 지방 관련 체성분 장애, 비만, 대사 증후군 및 당뇨병을 치료하기 위한 새로운 약물 및 치료제를 개발할 필요성이 아주 크다. ASC와 같은 지방 조직(WAT 및 BAT)에서의 상이한 유형의 세포로의 표적 치료 및 조영 양상은 비만, 암 및 섬유증에서의 생물의학 적응증에 유리할 수 있다.
현재 개시된 방법 및 조성물은, 부분적으로, 포유동물에서의 체성분 장애, 체중 장애, 당뇨병, 비만, 또는 대사 증후군 및 암 및 섬유증(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 지방 관련 장애의 진단, 예방 및/또는 치료를 돕기 위해 사용될 수 있는 특정한 펩타이드의 발견 및 확인에 기초한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 표적 펩타이드는 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 펩타이드는 기질 세포에 결합한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 WAT7 아미노산 서열 SWKYWFGE를 포함한다. 본원에 기재된 다른 실시양태에서, 단백질 조성물은 표적 펩타이드를 포함하고, 추가의 실시양태에서, 단백질 조성물은 WAT7 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 전부 D-아미노산으로 이루어지고, 다른 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 전부 L-아미노산으로 이루어지고, 추가의 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 L 아미노산, D 아미노산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 WAT7을 포함하고, WAT7은 D-아미노산으로 이루어지고, 상기 조성물은 지방 조직, 섬유성 조직 또는 종양 조직에서 기질 세포에 결합한다. 단백질 조성물의 추가의 몇몇 실시양태에서, WAT7은 ASC 세포의 표면 위의 ΔDCN에 선택적으로 결합한다.
본 발명의 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 표적 펩타이드는 조영제; 세포독성 물질; 아폽토시스유도제(pro-apoptotic agent); 융합 단백질; 세포정지제(cytostatic agent); 살세포제(cytocidal agent); 방사성 동위원소; ACS 세포 분화제; 유사분열 억제제, 항종양제; 항생제, 효소; 화학치료제; 항혈관생성제 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 작동인자 물질(effector agent)에 커플링된다. 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드 및 작동인자 물질은 D-아미노산으로 이루어지고; 단백질 조성물의 다른 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 L-아미노산으로 이루어지고, 상기 작동인자는 D-아미노산을 포함하고; 단백질 조성물의 추가의 다른 실시양태에서, 표적 펩타이드는 L-아미노산으로 이루어지고, 상기 작동인자는 L-아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드는 작동인자 물질에 커플링되어 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 전환되는 것을 유도한다. 추가의 실시양태에서, 상기 작동인자 물질은 백색 지방 조직에서 b3-아드레날린 수용체를 활성화한다. 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 상기 작동인자 물질은 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드이다.
일 실시양태에서, 지방 조직을 표적화하기 위해 단백질 조성물을 제조하는 방법은 작동인자 물질을 표적 펩타이드에 커플링하는 단계를 포함하고, 상기 표적 펩타이드는 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고; 상기 표적 펩타이드는 세포 지방 조직을 선택적으로 표적한다. 추가의 실시양태에서, 상기 작동인자 물질 및 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기 작동인자는 L-아미노산으로 이루어지고; 상기 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다.
본원에 개시된 단백질 조성물을 제조하는 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 커플링 단계는 상기 작동인자 물질을 연결 모이어티에 의해 상기 표적 펩타이드에 연결하는 것을 포함하고; 추가의 실시양태에서, 상기 연결 모이어티는 아미노헥산산; (CH2)4; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 또는 이들의 조합을 포함한다. 본원에 개시된 단백질 조성물을 제조하는 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 작동인자 물질은 세포독성 물질; 아폽토시스유도제; 조영제 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, 지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법은 펩타이드에 커플링된 작동인자 물질을 포함하는 단백질 조성물을 지방 조직을 포함하는 세포 집단에 노출시키는 단계를 포함하고, 상기 펩타이드는 아미노산 길이가 100 미만인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 지방 조직 표적 펩타이드 모이어티를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 단백질 조성물은 링커를 포함하고, 상기 링커에서 아미노헥산산; (CH2)4; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 또는 이들의 조합을 포함하여 이루어질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 표적 펩타이드 모티프는 D-아미노산으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기 작동인자 물질 및 상기 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 본원에 기재된 지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 세포독성 물질; 아폽토시스유도제; 조영제 또는 이들의 조합을 포함하고, 추가의 실시양태에서, 상기 물질은 D-아미노산으로 이루어진다.
지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 노출 단계는 피험체를 상기 단백질 조성물에 노출시켜 지방과다 관련 장애를 치료하는 것을 포함하고, 상기 장애는 비만; 섬유증; 암 또는 이들의 조합을 포함하고; 추가의 실시양태에서, 상기 세포 집단은 포유동물 피험체의 세포 집단이고; 다른 추가의 실시양태에서, 상기 세포 집단은 인간 피험체의 세포 집단이고; 다른 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 집단은 조직 박편이다.
지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법의 몇몇 실시양태는 상기 지방 조직에 대한 단백질 조성물의 선택적 결합에 기초하여 상기 집단의 지방 기질 세포를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법의 몇몇 실시양태에서, 상기 지방과다 관련 장애는 체성분 장애; 체중 장애; 비만; 지방이상증; 당뇨병; 대사 증후군, 섬유증; 암 또는 이들의 조합이다.
일 실시양태에서, 서열 번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 개시되어 있고, 상기 펩타이드는 폐 조직에 결합한다. 추가의 실시양태에서, 서열 번호 17 내지 24 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 단백질 조성물이 개시되어 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 단백질 조성물은 D-아미노산으로 이루어진다. 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 조영제; 세포독성 물질; 아폽토시스유도제 또는 이들의 조합에 커플링된다.
본원에 개시된 단백질 조성물의 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 표적 펩타이드 및 작동인자 물질을 포함하고, 상기 작동인자 물질은 그라미시딘(gramicidin); 마가이닌(magainin); 멜리틴(mellitin); 디펜신; 세크로핀(cecropin); (KFAKFAK)2, (KFXAKFXAK)2; (KHexAKHexAK)2 (KLAKLAK)2; (KLAKKLA)2; (KAAKKAA)2; (KLGKKLG)3; 안지오텐신; 라미닌 펩타이드; 피브로넥틴 펩타이드; 플라스미노겐 활성화인자 억제제; 조직 금속단백분해효소 억제제; 인터페론; 인터류킨 12; 혈소판 인자 4; IP-10; Gro-β; 트롬보스폰딘(thrombospondin); 2-메톡시오에스트라디올; 프롤리페린 연관 단백질; 카르복시아미도트라이아졸; CM101; 마리마스타트(Marimastat); 펜토산 폴리설페이트; 안지오포이에틴 2(레게네론(Regeneron)); 인터페론-알파; 헤르비마이신(herbimycin) A; PNU145156E; 16K 프로락틴 단편; 리노마이드(Linomide); 탈리도마이드(thalidomide); 펜톡시필린(pentoxifylline); 제니스테인(genistein); TNP470; 엔도스타틴; 파클리탁셀; 아쿠틴(accutin); 안지오스타틴; 시도포비르(cidofovir); 빈크리스틴(vincristine); 블레오마이신(bleomycin); AGM-1470; 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린(minocycline); 5-플루오로우라실; 블레오마이신; 부술판; 캄프토테신; 카르보플라틴; 클로르암부실; 시스플라틴(CDDP); 사이클로포스파마이드; 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신(daunorubicin); 독소루비신(doxorubicin); 에스트로겐 수용체 결합제; 에토포사이드(etoposide)(VP16); 파르네실-단백질 전환효소 억제제; 젬시타빈(gemcitabine); 이포스파마이드(ifosfamide); 메클로르에타민; 멜팔란(melphalan); 미토마이신(mitomycin); 나벨빈(navelbine); 니트로스유레아; 플리코마이신(plicomycin); 프로카르바진(procarbazine); 랄록시펜(raloxifene); 타목시펜(tamoxifen); 탁솔(taxol); 테마졸로마이드(temazolomide)(DTIC의 수성 형태); 트랜스플라티늄; 빈블라스틴(vinblastine) 및 메토트렉세이트(methotrexate); 빈크리스틴(vincristine); 알킬화제; 항대사제; 항종양 항생제; 코르티코스테로이드 호르몬; 유사분열 억제제; 나이트로소유레아; 호르몬제; 유사분열 억제제; 항종양 항생제; 효소; 생체반응 조절인자; 식물성 알카노이드; 도세탁셀(docetaxel); 에토포사이드(VP16); 테니포사이드(teniposide); 파클리탁셀(paclitaxel); 탁솔; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 비노렐빈(vinorelbine); PPAR-감마 효현제 티아졸리딘다이온; 로시글리타존(rosiglitazone); 형광단; 금속 킬레이트 복합체; 방사성 동위원소; 형광 마커; 유레아제; 알칼리 포스파타제; 리포솜; 마이크로캡슐; 마이크로입자; 나노입자; 자기 비드; 마이크로장치; 블레오마이신; 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신; 독소루비신(아드리아마이신(Adriamycin)); 플리카마이신(미트라마이신(mithramycin)) 및 이다루비신(idarubicin); 백금 배위 복합체; 안트라센다이온; 치환 유레아; 메틸 하이드라진 유도체; 암사크린(amsacrine); L-아스파라기나아제; 및 트레티노인(tretinoin); 카르보플라틴(Carboplatin); 시스플라틴(시스-DDP); 미톡산트론; 하이드록시유레아; 프로카르바진; IgFc 융합 단백질; 효소 융합 단백질; 형광 단백질; 발광 단백질 또는 이들의 조합 및 유사체를 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 실시양태는 지방 관련 장애의 진단, 예방 및/또는 치료의 선행 기술 방법과 관련된 다양한 단점을 해결하도록 의도되는 특징 및 이점의 조합을 포함한다. 상기 기재된 다양한 특징 및 다른 특징은 당업자에게 도면을 참조하여 하기 상세한 설명을 읽을 때 쉽게 명확해질 것이다.
도 1은 MSC 귀소 펩타이드에 대한 스크린을 도시한 것이다. (a)는 장기 특이적 MSC 집단으로 귀소하는 펩타이드에 대한 스크린에 대한 개요를 도시한 것이다. 3개의 파지 디스플레이 사이클릭 펩타이드 라이브러리의 혼합물을 4회의 동기적 다장기 바이오패닝에 사용하였다. 매번의 선택 회차에서, 적혈구(TER119+), 내피(CD31+) 및 조혈(CD45+) 세포를 면역고갈하고 이후 FACS를 사용하여 WAT, 폐, 골수 및 골격근으로부터 CD34+CD31-CD45- 세포(MSC)를 수집하였다. (b) 대조군 장기의 MSC에 결합된 파지-펩타이드와 동시에 WAT MSC(ASC)에 결합된 파지-펩타이드를 정량화하고, 증폭하고, 풀(pool)에 넣고, 다음 회의 바이오패닝에 사용하였다. 연속 실행의 파지 형질전환 단위(transforming unit: TU)의 회수 증가는 개별 표적 장기의 MSC로 귀소하는 파지-펩타이드의 풍부함을 반영한다. (c) 폐 CD34+CD31-CD45- 세포에서 회수된 TU에 대한 WAT CD34+CD31-CD45- 세포에서 회수된 TU의 비로서 마우스로 별개로 주사된 개별 파지-펩타이드 클론에 배정된 ASC 귀소의 상대 특이성. Fd-Tet: 대조군 무삽입물 파지(control insertless phage). 기재된 값은 3회 측정에 대해 평균±표준편차(SD)이다.
도 2는 ASC로 귀소하는 사이클릭 WAT7 펩타이드(서열 번호 13)의 검증을 도시한 것이다. A-D 패널은 WAT 귀소 펩타이드 WAT7(서열 번호 13 및 14) 또는 폐 귀소 펩타이드 LU2(서열 번호 19)를 디스플레이하는 파지가 정맥내 주사된 마우스로부터의 포르말린 고정 WAT 및 폐의 파라핀 절편에서 공초점 항파지(적색) 및 항CD31(밝은 녹색) 면역형광법이다. 디지털 채널 병합시 적색 신호는 WAT7(서열 번호 13)의 경우 폐(B)에서가 아니라 WAT(A)에서 및 LU2(서열 번호 19)의 경우 WAT(C)에서가 아니라 폐(D)에서 관찰된 비내피 혈관주위 세포에 대한 파지의 국재화(화살표)를 나타낸다. E-J 패널은 스트렙타비딘-Cy3(적색)을 검출하는 공초점 현미경검사에 의해 나타나고 면역형광법에 의해 검출된 PDGFRβ(적색), CD31(밝은 녹색) 또는 CD45(녹색)의 조직 발현과 대조되는, 정맥내 주사 1시간 후 바이오티닐화 펩타이드 WAT7의 생물분포를 나타낸다. ASC(F-G)에서 발현된 PDGFRβ와 중첩되는 패턴으로 구체적으로 혈관주위 WAT 세포(E)와의 사이클릭 WAT7(서열 번호 13)의 회합(화살표)을 주목한다. PDGFRβ와 같이, WAT7은 CD31+ 내피 세포(E) 또는 CD45+ 조혈 세포(H)와 회합되지 않는다. WAT7은 PDGFRβ+ LSC(J)이 풍부함에도 불구하고 폐(I)에서 관찰되지 않았다. 핵 TOPR03 염색은 청색이다. 기준자: 100μM.
도 3은 WAT7 결합 단백질로서 데코린의 정제를 도시한 것이다. (a) EDC 세파로스에 공유 결합된 시스테인 고리화 합성 펩타이드 WAT7(서열 번호 13) 및 WAT2(서열 번호 3: 대조군)를 마우스 ASC로부터의 막 단백질 추출물과 항온처리하였다. 세척 후, WAT7 친화도 칼럼에 결합된 단백질을 WAT2(1-4 분획), WAT7(5-8 분획) 및 0.1M 글라이신(pH 2.5)(9-12 분획)과 연속하여 용리하고; WAT2 친화도 칼럼을 위해 펩타이드 용리 순서를 바꿨다. 각각의 분획에서의 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 측정하고 OD595 흡광도로서 작도하였다. (b) 각각의 분획으로부터의 탈염 단백질을 플라스틱에 코팅하고 파지 디스플레이하는 WAT7 또는 WAT2. 7/7: WAT7 친화도/WAT7-파지; 2/7: WAT2 친화도/WAT7-파지; 7/2: WAT7 친화도/WAT2-파지; 2/2: WAT2 친화도/WAT2-파지에 노출시켰다. 파지 결합을 숙주 박테리아 감염시 TU 회수에 기초하여 정량화하고: WAT7 친화도 5 분획에 대한 WAT7-파지 결합 증가는 WAT7 결합 단백질의 용리를 나타낸다. (c) WAT7 친화도 1 분획(대조군) 및 5 분획으로부터의 단백질을 구배 4-15%의 SDS-PAGE에 의해 분해하였다. 겔의 쿠마시 염색은 WAT7과 특이적으로 용리되는 40kDa의 밴드(화살표)를 나타낸다. 질량 분광광도법은 상응하는 단백질을 DCN으로서 확인시켜준다.
도 4는 WAT에서의 데코린 과발현을 도시한 것이다. 항마우스 DCN 또는 항마우스 PDGFRβ 항체(적색)가 내피 특이적 항CD31 항체(밝은 녹색)로 대조염색된 포르말린 고정 파라핀 포매 마우스 조직의 공초점 면역형광법은 DCN(화살표) 및 PDGFRβ(화살표 머리) 둘 다 WAT에서 혈관주위 세포(ASC)에서 발현된다(A, D)는 것을 보여준다. DCN 발현은 폐(B)에서의 혈관과 회합되어 아주 적게 관찰되고 골수(C)에서는 검출 불가능한 반면, PDGFRβ은 폐 기질(E) 및 골수(F)에서 편재하여 발현된다. 블루: 핵 TOPR03 염색. 기준자: 100μM.
도 5는 DCN의 분할 단편(ΔDCN)이 ASC 위의 WAT7 수용체라는 것을 나타낸 것이다. (a) ΔDCN(화살표)이 지방세포에서가 아니라 ASC에 의해 특이적으로 발현된다는 것을 보여주는 DCN 항체를 갖는 마우스 WAT의 하위집단으로부터 추출된 막 결합 및 가용성 단백질의 면역블로팅. 액틴 항체에 의한 겔의 대조군 면역블로팅은 동일한 단백질 로드를 보여준다. (b) 마우스 막 WAT SVF 추출물로부터의 ΔDCN의 친화도 정제. 겔의 쿠마시 블루 염색은 항DCN IgG의 경쇄와 중쇄 사이의 예상된 40kDa의 밴드(화살표)를 확인시켜준다. (c) 전장 마우스 및 인간 DCN과 정렬된 (b)에서 단리된 ΔDCN의 에드먼(Edman) 분해 마이크로서열. 프로펩타이드 및 코어 DCN을 처리시키는 프로테아제 분할의 이전에 보고된 자리가 표시되어 있다. mDCN의 56-295 아미노산에 상응하는 서열은 도시되어 있지 않다. (d) ELISA에 의한 재조합 박테리아 정제 전장 코어 마우스 DCN(mDCN), 전장 글라이코실화 마우스 DCN(mDCN*), 글라이코실화 소 DCN(bDCN*) 및 BSA와 비교하여 재조합 박테리아 정제 마우스 ΔDCN에 대한 WAT7 결합의 측정. 펩타이드 농도의 함수로서 작도된 OD450 흡광도는 용량 의존적 ΔDCN-WAT7 및 mDCN-WAT7 결합을 보여준다. 3개의 웰에 대한 평균±표준편차가 도시되어 있다; *P<0.05. (e) ΔDCN(화살표)이 세포막과 회합된다는 것을 보여주는 마우스 WAT SVF로부터 추출된 전체 세포 및 세포막 결합 단백질의 항DCN 면역블로팅. (f) 바이오티닐화 시약에 의한 세포의 처치를 통해 평가된 마우스 ASC의 표면에의 ΔDCN의 노출. (스트렙타비딘 비드로 단리된) 바이오티닐화 단백질을 항DCN 면역블로팅으로 처리하였고, 이는 ΔDCN(화살표)이 배양된 ASC가 아니라 새로 단리된 ASC에서 바이오티닐화된다는 것을 나타낸다. (g) GFP(벡터), 전장 코어 마우스 DCN-GFP 융합(DCN), 또는 마우스 ΔDCN-GFP 융합(ΔDCN)을 발현하는 렌티바이러스로 안정하게 형질도입된 3T3-L1 세포. GFP 면역형광법은 GFP-ΔDCN 융합의 세포 표면 국재화를 보여준다. 기준자: 10μM.
도 6은 레지스틴을 모방함으로써 ΔDCN에 대한 WAT7 결합을 도시한 것이다. (a) 상부: KGGRAKD 펩타이드(6), 프로히비틴 단백질(7) 및 WLGEWLG 펩타이드의 대조군과 동시에 분석된 GST(1) 및 재조합 GST-융합 펩타이드 WAT1(2), WAT2(3), WAT7(4), LU2(5)의 정제를 보여주는 겔의 쿠마시 염색. 중간: 항WAT7 항체를 갖는 동일한 겔의 면역블로팅. 하부: 항WAT7 항체 생성에 사용되는 래빗으로부터의 전면역 혈청을 갖는 동일한 겔의 면역블로팅. (b) 항WAT7 항체를 갖는 마우스 배양된 3T3-L1 섬유아세포, 배양된 ASC, 배양된 LSC, 및 WAT, 골수, 또는 폐로부터 새로 단리된 세포로부터 추출된 전체 단백질의 면역블로팅은 특이적인 13kDa의 단백질(화살표 머리)을 검출한다. (c) WAT 추출물로부터의 항WAT7 항체를 갖는 마우스 단백질의 친화도 정제. 겔 쿠마시 염색은 항WAT7 IgG의 경쇄(L) 및 중쇄(H)에 비해 레지스틴으로서 확인된 동일한 13kDa의 단백질을 나타낸다. (d) ELISA에 의한 재조합 박테리아 정제 전장 코어 마우스 DCN(mDCN), 대조군 his6-태그된 단백질 CLIC4(Ctrl-prot), 전장 글라이코실화 마우스 DCN(mDCN*), 글라이코실화 소 DCN(bDCN*) 및 BSA와 비교하여 재조합 박테리아 정제 마우스 ΔDCN에 대한 FLAG 태그된 레지스틴 및 대조군 단백질(BAP) 결합의 측정. FLAG 태그된 단백질 농도의 함수로서 작도된 OD450 흡광도는 용량 의존적 ΔDCN/레지스틴 결합을 나타낸다.
도 7은 전지방세포에 대한 ΔDCN 발현의 효과를 나타낸 것이다. GFP(벡터), 전장 코어 마우스 DCN-GFP 융합(DCN), 또는 마우스 ΔDCN-GFP 융합(ΔDCN)을 발현하는 렌티바이러스로 안정하게 형질도입된 3T3-L1 세포에서 기능성 검정을 수행하였다. (a) 표시된 시점에서의 5,000개의 부착 세포의 증식을 MTT 검정에 의해 측정하였다. 3개의 웰의 평균±표준편차가 도시되어 있다; *P<0.05. (b) 트랜스웰(Transwell) 검정에 의해 측정되는 5μM 기공을 통해 10% FBS를 향한 25,000개의 미리 굶긴 세포의 이동. 12시간 후, 트랜스웰의 바닥에서의 세포를 고정하고, 염색하고, 계수하였다. 도시된 값은 3개의 웰에 대한 평균±표준편차이다; *P<0.05. (c) 하부: 지방생성 유도 10일 후 위상차 현미경검사로 검출된 지질 액적 축적에 의해 측정된 지방세포 분화. 기준자: 10μM.
도 8a는 동기적 생체내 파지 디스플레이 스크리닝의 도해이다. 매번의 선택 회차에서, 파지를 정맥내 투여하고 동시에 표적 조직으로부터 회수하고, 증폭하고, 풀에 넣고, 다음 선택 실행에 사용하였다. 나중 실행에서의 파지 형질전환 단위(TU)의 회수 증가는 표적 장기로 우선적으로 귀소하는 펩타이드의 선택을 반영한다.
도 8b는 유세포계수법에 의한 MSC의 확인을 나타낸 것이다. 대표적인 피하 WAT 분석이 도시되어 있다. 이후, CD34+를 발현하는 생존 세포(왼쪽 산포도)에 대해 CD31 및 CD45 발현(오른쪽 산포도)에 기초하여 등급화하고, CD34+CD45-CD31- ASC는 Q3에서 자주색 사건으로 확인되었다. Q1에서의 자주색 사건은 CD34+CD45-CD31+ 내피 세포에 상응한다. Q2 및 Q4에서의 사건은 CD45+ 조혈 세포에 상응한다.
도 9a는 파지-세포 결합 검정을 이용하여 평가된 파지 디스플레이 스크린에서 단리된 몇몇 펩타이드의 선택도를 나타낸 것이다. 펩타이드 WAT1(서열 번호 1 및 2), WAT2(서열 번호 3 및 4), WAT7(서열 번호 13 및 14), LU2(서열 번호 19 및 20), mPep(서열 번호 35 및 36)를 발현하는 파지 또는 무삽입물 파지(Fd-Tet)를 (1) 인간 유방 암종으로부터 유도된 내피 세포인 4T1.2 세포; (2) 마우스 3T3-L1 세포(지방세포양 표현형으로 분화될 수 있는 지방전구 세포주); (3) WAT로부터의 1차 마우스 SVF 세포; (4) 폐로부터의 1차 마우스 SVF 세포 및; (5) WAT로부터의 인간 ASC 세포의 4회 계대배양에 대한 결합(왼쪽에서 오른쪽으로의 막대)에 대해 평가하였다. 무삽입물 Fd-tet 대조군 파지와 함께 표시된 펩타이드-파지를 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다(108개의 TU). RPMI/1% BSA로 3회 세척 후, 세포를 균질기로 다우싱하였다. 회수된 파지를 사용하여 K91 이 콜라이를 감염시키고, 테트라사이클린 선택시 콜로니를 계수하여 평균 형질전환 단위(TU)를 정량화하였다. 3개의 개별 평판배양±표준오차(SEM)(오차막대)에 대한 평균 값이 도시되어 있다.
도 9b는 파지-세포 결합 검정을 이용하여 평가된 파지 디스플레이 스크린에서 단리된 몇몇 펩타이드의 선택도를 나타낸 것이다. 펩타이드 WAT1(서열 번호 1), WAT2(서열 번호 3), WAT7(서열 번호 13), LU2(서열 번호 19), mPep(서열 번호 35)를 발현하는 파지 또는 무삽입물 파지(Fd-Tet)를 계대배양되지 않은 인간 WAT SVF에 대한 결합에 대해 평가하였다. 무삽입물 Fd-tet 대조군 파지와 함께 표시된 펩타이드-파지를 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다(108개의 TU). RPMI/1% BSA로 3회 세척 후, 세포를 균질기로 다우싱하였다. 회수된 파지를 사용하여 K91 이 콜라이를 감염시키고, 테트라사이클린 선택시 콜로니를 계수하여 평균 형질전환 단위(TU)를 정량화하였다. 3개의 개별 평판배양±표준오차(오차막대)에 대한 평균 값이 도시되어 있다.
도 10은 귀소 또는 표적 사이클릭 펩타이드가 링커를 통해 세포독성/아폽토시스유발 펩타이드에 커플링된 키메라 표적 세포독성 펩타이드의 구조를 나타낸 것이다.
도 11은, 트립판 블루 배제를 이용하여 가시화되는, WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31)(모든-D-펩타이드(0.01mM, 0.05mM 및 0.10 mM)의 용량 의존적 실험실내 사멸 활성 및 따라서 배양물에서 1차 마우스 ASC의 효과적인 사멸을 표적화하기 위해 ASC 귀소 펩타이드라 칭하는 WAT7(서열 번호 13)의 능력을 나타낸 것이다.
도 12는 아폽토시스가 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드로 처치된 세포에서의 사멸의 원인이라는 검증을 나타낸 것이다. APO-트레이스(APO-TRACE) 시약(시그마(Sigma)) 및 유세포계수법을 사용하여 처치된 세포에서 아폽토시스 유도를 검출하여 세포사의 메커니즘으로서 아폽토시스를 검증하였다. 비표적된 아폽토시스 펩타이드로 처치된 세포 및 WAT7 표적 아폽토시스 펩타이드로 처치된 세포가 도시되어 있다.
도 13은 2㎎의 대조군 또는 표적된 세포독성 펩타이드인 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드에 의한 처치 48시간 후 비만 마우스를 보여준다. 표적된 세포독성 펩타이드인 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드로 처치된 마우스가 지방 조직의 양이 감소하였다는 것을 볼 수 있다.
도 14는 표적된 세포독성 펩타이드인 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드에 의한 처치가 피하 WAT에 존재하는 ASC를 고갈시키지만(F 패널 대 E 패널), 복강내 WAT에 미치는 효과가 상당히 더 크고(H 패널 대 G 패널), 또한 (B 패널 대 A 패널 및 D 패널 대 C 패널에 도시된 바대로) 종양 괴사를 발생시킨다는 것을 보여준다.
도 15는 세포독성 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 -서열 번호 31) 모든-D-펩타이드에 의한 처치에 의해 유도된 아폽토시스가 표적 조직으로 제한된다는 것을 나타낸 것이다. APO-트레이스 시약(시그마) 및 유세포계수법을 이용하여 신장 또는 말초 혈액으로부터의 세포에서가 아니라 피하 및 복강내 WAT 세포 둘 다에서 아폽토시스 유도를 검출하였다. 비표적된 아폽토시스의 결여는 세포독성 키메라 펩타이드가 단백질분해에 내성이라는 것을 나타낸다.
도 16은 (a) 마우스 DCN에 대한 항체를 갖는 마우스 WAT, 폐 및 골수(B.M.)로부터 추출한 막 결합 및 가용성 단백질의 면역블로팅을 나타낸 것이다. 비글라이코실화 코어 DCN(화살표 머리)의 이동 및 WAT 특이적 동형단백질(화살표)이 표시되어 있다. ANX2A 항체를 갖는 겔의 대조군 면역블로팅은 동일한 막 단백질 로딩을 나타낸다. (b) ELISA에 의한 재조합 코어 마우스 DCN(mDCN), 글라이코실화 소 DCN(bDCN*) 및 BSA에 대한 WAT7(상부) 및 WAT2 대조군(하부) 펩타이드 결합의 측정. 펩타이드 농도의 함수로서 작도된 OD450 흡광도는 용량 의존적 mDCN-WAT7 결합을 나타낸다.
서열 목록의 간단한 설명
서열 목록은 포유동물 지방 조직 및 폐 조직에 결합하는 펩타이드의 아미노산 서열을 제공한다. 백색 지방 조직에 결합하는 시스테인 고리화 펩타이드(WAT1-8)의 아미노산 서열이 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15에 존재한다. 상응하는 시스테인 비고리화 펩타이드가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14에 존재한다.
폐 조직에 결합하는 시스테인 고리화 펩타이드(LU1-4)의 아미노산 서열이 서열 번호 17, 19, 21 및 23에 존재하고, 상응하는 시스테인 비고리화 펩타이드가 서열 번호 18, 20, 22 및 24에 존재한다.
이미 개시된 지방 결합 펩타이드(시스테인 고리화)의 아미노산 서열이 서열 번호 25로서 존재하고, 상응하는 시스테인 비고리화 펩타이드 서열이 서열 번호 26으로서 존재한다.
다양한 대조군 펩타이드의 아미노산 서열이 서열 번호 27 및 29에서 시스테인 고리화 펩타이드로서 존재하고, 상응하는 비시스테인 고리화 대조군 펩타이드가 서열 번호 28 및 30에 존재한다. 다양한 공지된 세포독성 및/또는 아폽토시스유발 펩타이드의 아미노산 서열이 서열 번호 31 및 33에서 시스테인 고리화 펩타이드로서 존재하고, 상응하는 시스테인 비고리화 펩타이드가 서열 번호 32 및 34에 존재한다.
mPep로서 공지된 펩타이드의 아미노산 서열이 서열 번호 35에서 시스테인 고리화 펩타이드로서 존재하고, 상응하는 시스테인 비고리화 펩타이드가 서열 번호 36에 존재한다.
정의
본 개시내용에서, 구체적으로 달리 기술되지 않은 한, 단수의 사용은 복수를 포함하고, "단수"의 문자는 "적어도 하나"를 의미하고, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 게다가, 용어 "포함하는" 및 "포함한다" 및 "포함된다"와 같은 다른 형태의 사용이 제한되지 않는다. 또한, 구체적으로 달리 기술되지 않은 한, "부재" 또는 "성분"과 같은 용어는 하나의 단위를 포함하는 부재 또는 성분 및 하나 이상의 단위를 포함하는 부재 또는 성분 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 도입부는 구성 목적만을 위한 것이고 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지는 않는다. 특허, 특허 출원, 논문, 교재 및 학술논문(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 본원에 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조문헌으로 명확히 포함된다. 포함된 논문 및 유사한 자료 중 하나 이상이 특정 용어를 본원에서의 그 용어의 정의를 부인하는 방식으로 정의하는 경우, 본원이 우세하다.
본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 지방 관련 장애라는 용어는 체중 관련 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 대사 증후군 및 체중 증가, 중량 감량 유지, 중량 감량 후 중량 재증가의 위험과 관련된 병증 및 관련 혈당 장애, 당뇨병, 고혈압, 섬유화 병증 및 암(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 백색 또는 갈색 지방 조직의 장애, 지방 관련 체성분 또는 체중 장애를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 하나 이상의 증상 또는 효과의 중증도를 감소시키는 환자가 백색 지방 관련 장애를 앓고 있는 동안 발생하는 작용을 고려한다. 문맥이 허용되는 한, 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 또한 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 위험이 증가한 개인이 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 개시 전에 적절한 수술 및/또는 다른 의학 중재를 받을 수 있도록 보장하도록 취해지는 작용을 의미한다. 본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 용어 "예방한다", "예방하는" 및 "예방"은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 개시를 지연시키고/시키거나 억제하거나, 이의 중증도를 감소시키는 환자가 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 앓기 시작하기 전에 발생하는 작용을 의미한다.
본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 용어 "조절한다", "조절하는" 및 "조절"은 질환, 장애 또는 병증을 앓고 있는 환자에서 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 예방하거나, 지연시키거나, 이의 재발의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 상기 용어는 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 역치, 진행 및/또는 기간을 조절하거나, 지방 관련 체성분 또는 체중 장애에 어떻게 환자가 반응하는지를 조절하는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 화합물의 "치료학적 유효량"은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 치료 또는 관리에서 임의의 치료학적 이익을 제공하거나, 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암과 관련된 하나 이상의 증상을 지연시키거나 최소화하기에 충분한 양이다. 치료학적 유효량의 화합물은 화합물 단독 또는 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 치료 또는 관리에서 임의의 치료학적 이점을 제공하는 하나 이상의 다른 치료제 및/또는 치료학적 제제와 조합된 화합물의 양을 의미한다. 용어 "치료학적 유효량"은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 완화시키거나, 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 개선하거나 감소시키거나, 모든 치료법을 개선하거나, 다른 치료제의 치료 효율을 증대시키는 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바대로, 달리 기재되지 않은 한, 화합물의 "예방학적 유효량"은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암, 또는 하나 이상의 증상 관련 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 이의 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 예방학적 유효량의 화합물은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 예방에 있어서 예방 이점을 제공하는 하나 이상의 다른 치료제 및/또는 예방제와 조합된 화합물의 양을 의미한다. 용어 "예방학적 유효량"은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 예방하거나, 모든 예방법을 개선하거나, 다른 예방제의 예방 효율을 증대시키는 양을 포함할 수 있다. 예를 들면, 지방 조직 관련 장애의 발병 전에 "예방학적 유효량"을 처방할 수 있다.
본원에 사용되는 바대로, "환자" 또는 "피험체"는 본원에 기재된 바와 같은 지방 조직 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 앓을 수 있는 인간 및 비인간 포유동물과 같은 생물체를 포함한다. 바람직한 인간 동물로는 인간 피험체를 들 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "비인간 포유동물"로는 모든 포유동물, 예를 들면 설치류, 마우스, 랫트 등 및 비인간 영장류, 반려 동물 및 가축, 예를 들면 양, 개, 소, 말 등을 들 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "표적 펩타이드"는 장기, 조직 또는 세포 유형에 대한 선택적 국재화를 특징으로 하는 아미노산의 인접 서열을 포함하는 펩타이드이다. 예를 들면, 하기 개시된 방법에 의해 선택적 국재화를 결정할 수 있고, 추정되는 표적 펩타이드 서열을 파지 외면에서 디스플레이된 단백질로 도입하였다. 상이한 아미노산 서열의 다수의 이러한 표적 펩타이드를 발현하도록 유전 조작된 이러한 파지의 라이브러리를 피험체에 투여한 후 피험체로부터 하나 이상의 장기, 조직 또는 세포 유형을 수집하고 장기, 조직 또는 세포 유형에서 발견되는 파지를 확인하였다. 표적 펩타이드 서열을 발현하는 파지는 대조군 조직 또는 장기와 비교하여 이 조직 또는 장기에서 더 큰 결합을 나타내는 경우 조직 또는 장기에 선택적으로 국재화되는 것으로 생각된다. 바람직하게는, 표적 펩타이드의 선택적 국재화는 대조군 장기, 조직 또는 세포 유형과 비교하여 표적 장기, 조직 또는 세포 유형에서 파지가 2배 이상 풍부해야 한다. 대조군 장기, 조직 또는 세포와 비교하여 표적 장기에서 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상 더 풍부하게 하는 선택적 국재화가 더 바람직하다. 대안적으로, 선택적 국재화를 나타내는 표적 펩타이드 서열을 발현하는 파지는 바람직하게는, 다른 스크리닝 실행에 대해 표적 장기로부터 회수된 파지를 제2 숙주로 재주사할 때, 대조군 장기와 비교하여 표적 장기에서 풍부도가 증가한다는 것을 보여준다. 제3 스크리닝 실행 이후 추가로 풍부하게 나타날 수 있다. 선택적 국재화를 결정하는 다른 대안적인 수단은 추정되는 표적 펩타이드를 발현하는 파지가 바람직하게는 비특이적 펩타이드를 발현하거나 임의의 추정되는 표적 펩타이드를 발현하도록 유전 조작되지 않은 대조군 파지와 비교하여 표적 장기에서 2배, 더 바람직하게는 3배 또는 그 이상 풍부도를 나타낸다. "표적 펩타이드" 및 "귀소 펩타이드"를 본원에서 동시에 사용한다.
본원에 사용되는 바대로 "파지 디스플레이 라이브러리"는 외면에 일련의 추정되는 표적 펩타이드를 발현하도록 유전 조작된 파지 집단을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 추정되는 표적 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 파지 캡슐 단백질을 코딩하는 유전자에 프레임내 삽입한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 추정되는 표적 펩타이드 서열은 모든 20개의 아미노산의 부분적인 무작위 혼합물이고 부분적으로 비무작위이다. 특정한 바람직한 실시양태에서, 파지 디스플레이 라이브러리의 추정되는 표적 펩타이드는 표적 펩타이드 서열 내의 고정된 위치에서 하나 이상의 시스테인 잔기를 나타낸다. 사이클릭 펩타이드를 생성하기 위해 시스테인을 사용할 수 있다.
"마크로분자 복합체"는 이의 배치가 무작위, 정렬 또는 부분 정렬일 수 있는 분자 집단이다. 이 용어는 생물학적 생물체, 예컨대 박테리오파지, 바이러스, 박테리아, 단세포 병원성 생물체, 다세포 병원성 생물체 및 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 상기 용어는 또한 리포솜, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 나노입자, 자기 비드 및 마이크로장치와 같은 죽은 분자 집단을 포함한다. 유일한 요건은 이 복합체가 하나 초과의 분자를 포함한다는 것이다. 분자는 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
표적 펩타이드에 대한 "수용체"는 표적 펩타이드에 결합하는 임의의 분자 또는 마크로분자 복합체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 수용체의 비제한적인 예로는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 리포단백질, 에피토프, 지질, 탄수화물, 다분자 구조, 하나 이상의 분자의 특정 형태 및 형태해부학적(morphoanatomic) 집합체를 들 수 있다. 바람직한 실시양태에서, "수용체"는 표적 장기, 조직 또는 세포 유형 내에 혈관을 형성하는 세포의 루멘 표면에 존재하는 천연 분자 또는 분자 복합체이다.
선택적 표적 펩타이드를 생성하는 데 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 서열 번호 13 및 14, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 지방 조직에 선택적 또는 특이적인 특정한 표적 펩타이드가 제공되고, 훨씬 다른 실시양태에서, 지방 조직과 같은 표적 조직에 치료제를 선택적으로 또는 특이적으로 전달하기 위해 지방 조직에 선택적인 표적 펩타이드를 사용할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 소정의 표적 세포, 조직, 또는 장기, 예컨대 지방에 선택적 또는 특이적인 표적 펩타이드의 제조 및 확인에 관한 것이다. 지방 표적 펩타이드로는 CKGGRAKDC(서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 1-16)를 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 대조군 펩타이드로는 CARAC(서열 번호 27 및 28), 또는 CGDKAKGRC(서열 번호 29 및 30)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
백색 지방은 종양과 같이 빠르게 증식하고 확장할 수 있는 독특한 조직을 나타낸다(Wasserman, In: Handbook of Physiology, eds. Renold and Cahill, pp. 87-100, American Physiological Society, Washington, D.C., 1965; Cinti, Eat. Weight. Disord. 5: 132-142, 2000). 지방 조직의 연구는 이것이 매우 혈관화되었다는 것을 나타낸다. 다수의 모세혈관은 모든 지방세포와 접촉하여, 지방량 조절에서 맥관구조의 중요성을 제시한다(Crandall et al., Microcirculation 4:211-232, 1997). 지방 조직 증식은 종양과 유사하게 혈관생성에 의존할 것이다. 그렇다면, 지방 신생맥관구조의 파괴가 비만 진행을 방지하고, 표적화하는 기존의 지방 혈관은 잠재적으로 지방 회귀를 발생시킬 수 있다. 지방 표적 펩타이드의 사용 방법은 체중 감소 유도, 암 및 섬유증의 조영 또는 치료(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 비만 또는 다른 지방 관련 장애의 치료를 포함할 수 있다.
관심 있는 장기에서의 선택적 세포 집단으로 귀소하는 펩타이드의 단리에 대해 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS)와 함께 파지 디스플레이 생체내 기술(예컨대, 무엇보다도, 미국 특허 출원 US20090104117, US20060094672, US20060239968, US20090221505, US20080176792, US20080124277, US20100172864, US20040170955, US20010046498 및 문헌[Kolonin et al., Nature Medicine; 10, 625-32, 2004]에 기재됨)의 조합이 개시되어 있다. 장기, 조직 또는 세포 유형 표적 펩타이드를 확인하기 위해 이 생체내 선택 시스템을 파지 디스플레이 라이브러리와 조합하여 사용한다. 파지 표면 단백질을 코딩하는 cDNA로 무작위 올리고뉴클레오타이드를 삽입하고, 많은 순열로 독특한 펩타이드를 디스플레이하는 파지 입자 수집을 생성하여, 박테리오파지 표면에서 형질전환 펩타이드를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다. 파지 디스플레이는 파지 라이브러리가 표적 분자, 세포, 조직, 예를 들면 지방 조직 또는 장기에 결합하는 파지 코트 단백질 및 펩타이드 서열로 도입된 예를 들면 원하는 길이의 일련의 무작위 펩타이드 서열을 발현하는 기술이고, 파지 디스플레이 라이브러리를 표적과 항온처리하고 결합 펩타이드에 대해 선택함으로써 확인한다. 비결합 파지를 세척하고 결합 파지를 용리시키고 수집한다. 수집된 파지를 증폭하고 추가의 결합/증폭 사이클을 통해 취해 표적에 선택적으로 및/또는 특이적으로 결합하는 파지에 대한 펩타이드 풀을 풍부하게 할 수 있다. 각각의 사이클에 의해, 관심 있는 표적에 대해 표적 펩타이드를 포함하는 풀에서의 파지 비율이 풍부해진다. 여러 사이클 후, 각각의 파지 클론을 DNA 서열분석에 의해 규명하여 표적 펩타이드 서열을 확인할 수 있다(바이오패닝, 예를 들면 US20050187161 및 문헌[Pasqualini and Ruoslahti, Nature 380:364-66, 1996; Arap et al., Science 279:377-80, 1998] 참조).
마우스에 파지 디스플레이 라이브러리를 정맥내(I.V.) 투여한 후 각각의 장기로부터 파지를 회수한다. 파지 외면에서 발현된 특이적 표적 펩타이드 서열에 기초하여 지방 조직에 선택적으로 귀소할 수 있는 파지를 회수한다. 이 방법에 의해 다양한 장기 및 종양 귀소 펩타이드가 확인되었다(예를 들면, 미국 특허 문헌: US20060094672, US20080124277, US20090104117, US20090221505 및 US20100172864 참조).
하기 특정 예는 백색 지방(지방) 조직(WAT)에 적용될 때 이러한 접근법의 타당성의 입증을 제공하지만, 당해 분야의 당업자는 이 기술이 갈색 지방 조직(BAT) 및 심지어 다양한 조직 및 장기 유래의 다른 세포 유형에 적용된다는 것을 이해할 것이다. WAT는 중간엽 줄기 세포(MSC) 부류에 속하는 주피 지방 기질 세포(ASC)의 풍부한 공급을 포함한다. MSC는 CD34+CD31-CD45- 세포 표면 서명을 갖는다. MSC 및 ASC의 다기능 성질 및 이의 높은 증식 속도 및 이동능은 이들이 유리하면서도 병원성일 수 있다는 것을 의미한다. ASC는 비만에서 지방 조직의 팽창의 원인이 되고 암 진행 및 가능하게는 섬유증을 동반한 다른 질환을 촉진하는 것으로 나타났다(Zhang et al., Cancer Res. 69: 5259-5266, 2009).
파지 디스플레이 생체내 기술 및 FACS 스크리닝 접근법의 이러한 조합의 성공을 입증하기 위해, ASC의 마커에 대한 펩타이드 라이브러리를 살아 있는 마우스에서 스크리닝한다. 사이클릭 CX7C, CX8C 및 CX9C(여기서, C는 시스테인을 나타내고, X는 임의의 잔기를 나타냄)를 포함하는 무작위 펩타이드 라이브러리의 혼합물을 스크리닝한다. 파지-펩타이드 라이브러리를 동물에게 주사하고 4회의 동기적 다장기 생체내 바이오패닝을 수행하여 WAT 귀소 펩타이드를 풍부하게 한다. 매번의 선택 회차에서 파지를 정맥내 투여하고, WAT 및 대조군 장기의 기질/혈관 분획(SVF)으로부터 회수하고, 증폭하고, 풀에 넣고, 다음 실행에 사용한다. FACS를 이용하여 내피(CD31+) 및 조혈(CD45+) 세포에 결합하는 파지-펩타이드를 고갈시키고 CD34+CD3-CD45- ASC에 결합하는 파지-펩타이드를 수집한다. 파지 풍부도가 모든 후속 실행에서 파지 형질전환 단위(TU)의 회수 증가에 의해 입증되고, WAT 및 다른 표적 장기의 CD34+CD31-CD45- 세포로 귀소하는 파지-펩타이드의 선택을 반영한다.
이 결과는, 생체내 주사될 때, 상대선택에 포함된 대조군 장기를 사용하여 MSC가 아니라 ASC로 귀소하는 펩타이드가 확인된다는 것이다. 스크리닝된 장기로는 폐, 골, 골수 및 골격근을 들 수 있다. WAT7(서열 CSWKYWFGEC 및 SWKYWFGE: 서열 번호 13 및 14 각각)이라 칭하는 특정한 일 펩타이드는 대부분의 한정적인 ASC 표적 패턴을 보여주고, 폐에서 MSC를 표적화하는 대조군 펩타이드로서 펩타이드 LU-2(서열 CESGFPTVGC: 서열 번호 19 및 20)가 선택된다.
각각의 파지-펩타이드 클론에 대한 WAT의 CD34+CD31-CD45- 세포로의 귀소 특이성을 마우스에 주사하여 입증하였다. 파지 보유 WAT-7 펩타이드의 결합은 폐 MSC의 결합에 비해 ASC에서 매우 풍부하다(도 1c 참조). 반대로, 시험된 α5β1 귀소 펩타이드 mPep(Nie et al., 2008(상기 참조)) 및 다른 대조군 펩타이드는 임의의 WAT 특이성을 나타내지 않는다.
WAT7는, 전신 투여될 때, 다른 장기에서의 MSC가 아니라 ASC로 귀소하는 사이클릭 옥타펩타이드(아미노산 서열 CSWKYWFGEC 및 SWKYWFGE(서열 번호 13 및 14)이다. 말단 CYS 모이어티를 통해 WAT7을 고리화할 수 있다. 글라이코실화 자리가 결여된 단백질분해 단편인 데코린(DCN) 단백질의 이전에 간과되었던 동형단백질로서 확인된 상응하는 ASC 표면 수용체를 생화학적으로 정제하기 위한 미끼(bait)로서 WAT-7을 사용한다. 이러한 절두된 DCN(델타-DCN(ΔDCN)이라 칭함)이 ASC에 의해 과발현되고 세포 표면에 노출되어, 새로운 ASC 마커를 제공하는 것으로 결정되었다. 또한 이 아이디어를 뒤집고 WAT-7을 모방하는 단백질을 스크리닝함으로써, 레지스틴은 WAT에서의 ΔDCN의 내인성 리간드로서 확인되었다. 전지방세포에서의 ΔDCN의 이소성 발현은 이전에 레지스틴으로서 보고된 표현형과 일치하는 표현형을 유도하고, 이는 레지스틴-ΔDCN 상호작용이 ASC의 운명을 조절하는 신호전달 케스케이드를 조절한다는 결론을 지지한다. 개시된 펩타이드를 전신 주사하여 선택적 세포 집단을 고갈시킬 수 있다. 하기 실시예에서, 백색 지방(지방) 조직(WAT)에서의 펩타이드 표적 지방 줄기 세포(ASC)가 기재되어 있다. ASC 표적은 비만, 암 및 섬유증의 치료로서 유용할 수 있다.
지방 조직(이것으로 제한되지는 않음)을 포함하는 표적 조직의 선택적 및/또는 특이적 결합을 나타내는 아폽토시스유발 하이브리드 펩타이드에 커플링된 예를 들면 생체내 세포 표적 하이브리드 펩타이드를 생성하기 위한 펩타이드의 용도 및 표적 펩타이드로서의 이의 용도는 이전에 보고되었다(예를 들면 미국 특허 출원 공보 US20090104117, US20060094672, US20060239968, US20090221505, US20080176792, US20080124277 및 US20100172864 참조). 이러한 하이브리드 펩타이드는 관심 있는 세포에서 분화 발현된 수용체에 결합하는 귀소(세포 표적) 도메인 및 펩타이드를 내입시키는 세포의 아폽토시스 사멸을 유도하는 세포독성 도메인의 2개의 기능적 도메인으로 이루어진 합성 펩타이드이다. 귀소 펩타이드는 아미노산 길이가 통상적으로 7개 내지 8개이고 환형이다(2개의 이황화 결합된 시스테인에 의해 구속됨). 세포독성 도메인은 수용체 매개 세포 내입시 미토콘드리아 막을 파괴하고 프로그래밍된 세포사(아폽토시스)를 야기하는 양친매성 펩타이드 서열 KLAKLAKKLAKLAK(서열 번호 31) 지정 (KLAKLAK)2이다. 이러한 세포독성 펩타이드로는 또한 화학식(FXR)n(여기서, n = 4, 6, 8 및 10이고, F는 페닐알라닌이고, Fx는 사이클로헥실-알라닌이며, Hex는 6개의 탄소 알킬 사슬 잔기임)을 갖는 것을 포함하는 것을 들 수 있고, 예는 (KFAKFAK)2, (KFXAKFXAK)2 및 (KHexAKHexAK)2 및 예를 들면 문헌[Horton, KL and Kelley, SO. Engineered Apoptosis-Inducing Peptides with Enhanced Mitochondrial Localization and Potency. J. Med. Chem. 52, 3293-3299, 2009; Yousif, L. F., Stewart, K. M., Horton, K. L. and Kelley, S. O. Mitochondria-Penetrating Peptides: Sequence Effects and Model Cargo Transport. ChemBioChem, 10: 2081-2088, 2009; Kelley SO, Stewart KM, Mourtada R. Development of novel peptides for mitochondrial drug delivery: amino acids featuring delocalized lipophilic cations. Pharm Res. Nov; 28(11):2808-19, 2011. Epub 2011 Aug 11; Horton, KL, Pereiral, MP, Stewart, KM, Fonseca SB and Kelley, SO. Tuning the Activity of Mitochondria-Penetrating Peptides for Delivery or Disruption, ChemBioChem, 13(3), 476-185, 2012. Published online: 11 JAN 2012]에 기재된 것이다.
그러나, 이러한 하이브리드 펩타이드의 성공은 이전에 제한되었고, 독성과 관련될 수 있는데, 왜냐하면 귀소 도메인 및 공개된 Gly-Gly 링커가 전통적으로 생체내 단백질분해될 수 있는 L-아미노산으로 이루어지기 때문이다. 단백질분해는 활성 하이브리드 펩타이드를 감소시키고 다양한 하위펩타이드를 결국 방출시킬 수 있고, 이들 중 몇몇은 하이브리드 펩타이드의 표적 또는 작동인자 부분을 나타낼 수 있다. 표적 펩타이드가 없는 DKLAKLAK2(서열 번호 31)와 같은 아폽토시스유발 펩타이드(이것으로 제한되지는 않음)와 같은 작동인자 펩타이드의 가능한 방출은 신장 독성과 같은 부작용을 야기할 수 있다. 또한, 단백질분해로 인한 불안정성은 치료학적 수준을 얻기 위해 주사에 필요한 펩타이드 양을 증가시킨다. 따라서, 선행 기술의 작동인자 펩타이드의 임상 효율 및 안전성은 제한된다.
추가로, 이전에 기재된 링커 구역을 구성하는 글라이신이 D 형태로 존재하지 않으므로, 모든-D 아폽토시스유발 펩타이드의 합성은 본원에 기재된 바대로 아미노헥산산에 의한 링커의 대체까지 이전에 가능하지 않았다. 또한, (펩타이드가 원래 단리된) L 형태로부터 D 형태로의 전환이 표적 수용체와의 불상용성 및 인지 결여 및 상응하는 귀소 결여를 발생시키는 형태학적 변화를 발생시킬 수 있다는 우려로 인해, D 형태 아미노산으로부터의 귀소/표적 펩타이드 도메인의 구성이 이전에 시도되지 않았다. 그러나, 본원에 기재된 바대로, 이러한 모든-D 펩타이드는 표적 세포 및 선행 기술의 L 펩타이드로 귀소할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩타이드를 포함하고, 펩타이드는 지방 조직에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 전부 D-아미노산으로 이루어진다. 다른 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 조영제에 커플링된 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 표적 펩타이드는 세포독성제 또는 아폽토시스유도제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 전환되도록 유도하는 물질에 커플링된 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 링커를 통해 상기 물질 또는 다른 펩타이드에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 (CH2)4; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 백색 지방 조직에서 b3-아드레날린 수용체를 활성화한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 펩타이드이고, 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 링커를 통해 상기 물질 또는 다른 펩타이드에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
다른 몇몇 실시양태에서, 단리된 핵산 조성물은 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 단리된 핵산 분자를 포함하고, 추가의 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 세포독성, 아폽토시스, 전환발생 또는 이미징 펩타이드를 지방 조직에 전달하는 방법은 (a) 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 표적 펩타이드에 커플링하는 것을 포함하고, 표적 펩타이드는 지방 세포를 선택적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커 펩타이드를 통해 커플링되고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
다른 몇몇 실시양태에서, 화합물 또는 물질을 지방 조직에 전달하는 방법은 a) 지방 조직에 선택적으로 결합하는 펩타이드를 얻는 것; 및 b) 지방 조직을 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단에 펩타이드를 노출시키는 것을 포함하고, 펩타이드는 아미노산 길이가 100개 미만이고 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 지방 조직 표적 모티프를 포함하고, 펩타이드는 지방 조직에 표적화하고자 하는 화합물 또는 물질에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 및 상기 물질 둘 다 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 커플링은 링커 펩타이드를 통해 일어나고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 세포독성 또는 아폽토시스유발 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 조영제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, (b)는 피험체를 펩타이드에 노출시켜 지방 관련 장애를 치료하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포 집단은 인간 피험체이다. 몇몇 실시양태에서, 세포 집단은 조직 박편이다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 상기 집단에서 지방 줄기 세포를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 지방 관련 장애는 체성분 장애, 체중 장애, 비만, 지방이상증, 당뇨병, 대사 증후군, 섬유증 또는 암이다.
다른 실시양태에서는, 서열 번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폐 조직에 결합한 단리된 펩타이드이다. 몇몇 실시양태에서는, 서열 번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 조성물이고, 몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 전부 D-아미노산으로 이루어진다. 다른 실시양태에서는, 펩타이드가 조영제에 커플링된 단백질 조성물이다. 몇몇 실시양태에서는, 펩타이드가 세포독성제 또는 아폽토시스유도제에 커플링된 단백질 조성물이다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 커플링은 링커 펩타이드를 통해 일어나고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
키메라 세포독성 펩타이드 조성물의 예시적인 조성물에서, 도메인 둘 다에서의 모든 아미노산은 D-거울상이성질체로 이루어지고, 따라서 생체내 단백질분해에 저항하여, 전신 투여시 펩타이드의 장기간 효과를 허용한다. 2개의 도메인을 연결하는 링커는 아미노헥산산(Ahx): NH-(CH2)5-CO이고, 이것은 또한 생체내 프로테아제에 의해 분해되지 않는다. 하기 실시예에서 사용하기 위해, 키메라 펩타이드를 상업적으로 제조하고(예를 들면 아나스펙(Anaspec), 바켐(Bachem) 또는 셀텍(Celtek)사제), 종래의 펩타이드 화학("메리필드(Merrifield) 합성")에 의해 합성한다.
셀텍(내슈빌에 소재하는 셀텍 바이오사이언스, TN 37210)에 의해 합성된 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드의 세포독성 활성을 처음에 하기 실시예에 기재된 바대로 처치 및 비처치 1차 쥐과 ASC 배양물 둘 다의 트립판 블루를 사용하여 실험실내 입증하였다. Apo-트레이스(미국 세인트 루이스에 소재하는 시그마) 및 유동세포 계수 분석을 이용하여, WAT7 표적 아폽토시스유발 펩타이드가 처치 ASC 세포에서 아폽토시스 및 세포사를 실제로 유도한다는 것을 입증하였다(하기 실시예 8 참조). WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드의 생체내 활성 및 효율을 입증하기 위해, 2㎎의 펩타이드를 마우스에 주사하고, WAT에서 WAT7-KLAKLAK2(서열 번호 13 내지 서열 번호 31) 모든-D-펩타이드에 의한 처치 48시간 후 세포사가 발견되었다. 신장 또는 말초 혈액에서는 세포사가 확인되지 않았고, 펩타이드 용량을 증가시키더라도(100㎎/㎏(체중)까지) MTD가 성취되지 않았다. 이러한 발견은, 개시된 방법을 이용하여 확인되고 모든 D 아미노산 조성으로 인해 안정성이 증가된 표적 펩타이드를 사용하여, 지방 조직에 대해 세포독성 도메인을 표적화하는 것의 효율을 명확히 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 지방 조직에서의 혈관형성 맥관구조에 선택적인 표적 펩타이드를 예를 들면 체중 감소 또는 체중 증가 예방을 위해 비만 관련 장애를 치료하기 위해 사용할 수 있다. 지방 표적 펩타이드에 항혈관형성 또는 독성 모이어티를 부착함으로써, 새로운 지방 조직을 제공하는 혈관이 선택적으로 억제되어, 새로운 지방 침착물의 성장 및 잠재적으로 기존의 지방 침착물의 사멸을 방지한다. 갈색 지방 조직이 더 혈관화되므로, 맥관구조 기반 표적 접근법은 이 조직의 활성화를 위해 BAT에 대한 치료 시약의 전달에 매우 효과적일 것이다.
특정한 실시양태에서, 대안적인 치료제를 예를 들면 백색 지방 조직에 선택적으로 전달하기 위해 표적 펩타이드 또는 융합 단밸질에 부착할 수 있다. 사용하기에 적합한 물질 또는 인자로는 아폽토시스, 세포사, 세포 정체 및/또는 항혈관생성을 유도하는 임의의 화학 화합물을 들 수 있다. 아폽토시스, 또는 프로그래밍된 세포사는 정상적인 배자 발생에 필수 과정이여서, 성인 조직에서 항상성을 유지시키고, 발암을 억제한다. 이러한 펩타이드의 커플링 및 용도의 예는 미국 특허 출원 US20090104117, US20060094672, US20060239968, US20090221505, US20080176792 및 US20080124277을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 범위 내에 고려되는 아폽토시스유발 물질의 비제한적인 예로는 그라미시딘, 마가이닌, 멜리틴, 디펜신, 세크로핀, (KLAKLAK)2(서열 번호 31), (KLAKKLA)2(서열 번호 32), (KAAKKAA)2(서열 번호 33) 또는(KLGKKLG)3(서열 번호 34)을 들 수 있다.
특정한 실시양태에서 안지오텐신, 라미닌 펩타이드, 피브로넥틴 펩타이드, 플라스미노겐 활성화인자 억제제, 조직 금속단백분해효소 억제제, 인터페론, 인터류킨 12, 혈소판 인자 4, IP-10, Gro-β, 트롬보스폰딘, 2-메톡시오에스트라디올, 프롤리페린 연관 단백질, 카르복시아미도트라이아졸, CM101, 마리마스타트, 펜토산 폴리설페이트, 안지오포이에틴 2(레게네론), 인터페론-알파, 헤르비마이신 A, PNU145156E, 16K 프로락틴 단편, 리노마이드, 탈리도마이드, 펜톡시필린, 제니스테인, TNP470, 엔도스타틴, 파클리탁셀, 아쿠틴, 안지오스타틴, 시도포비르, 빈크리스틴, 블레오마이신, AGM-1470, 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린과 같은 항혈관생성제에 부착된 표적 펩타이드의 투여가 포함된다.
특정한 실시양태에서 세포독성 물질에 부착된 표적 펩타이드의 투여가 포함된다. 이러한 세포독성 화학치료제로는 5-플루오로우라실, 블레오마이신, 부술판, 캄프토테신, 카르보플라틴, 클로르암부실, 시스플라틴(CDDP), 사이클로포스파마이드, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에스트로겐 수용체 결합제, 에토포사이드(VP16), 파르네실-단백질 전환효소 억제제, 젬시타빈, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 멜팔란, 미토마이신, 나벨빈, 니트로스유레아, 플리코마이신, 프로카르바진, 랄록시펜, 타목시펜, 탁솔, 테마졸로마이드(DTIC의 수성 형태), 트랜스플라티늄, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 또는 상기한 것들의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대부분의 화학치료제는 알킬화제, 항대사제, 항종양 항생제, 코르티코스테로이드 호르몬, 유사분열 억제제 및 나이트로소유레아, 호르몬제, 천연물, 기타 물질 및 이들의 임의의 유사체 또는 유도체 변이체의 카테고리에 해당한다.
천연물은 일반적으로 천연 공급원으로부터 원래 단리되고, 약물학적 활성을 갖는 것으로 확인된 화합물을 의미한다. 이러한 화합물, 이의 유사체 및 유도체는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 화학적으로 합성되거나 재조합으로 제조된 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 천연물은 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 효소 및 생체반응 조절인자와 같은 카테고리를 포함한다. 이러한 천연물의 예로는 식물성 알카노이드 및 도세탁셀, 에토포사이드(VP16), 테니포사이드, 파클리탁셀, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 세포 분할 또는 유사분열에 필요한 단백질 합성을 억제할 수 있는 다른 천연 물질을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
화학치료제 및 투여 방법, 용량 등은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고(예를 들면, 문헌["Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics"] 및 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th ed., pp 1035-1038 및 1570-1580](관련 부분에서 본원에 참조문헌으로 포함됨) 참조), 본원의 개시내용의 견지에서 개시된 조성물과 조합될 수 있다. 여러 용량 변경은 반드시 치료되는 피험체의 병증에 따라 달라질 것이다. 투여 담당자는, 어떠한 경우에도, 각각의 피험체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 특정한 화학치료제 및 용량 섭생의 예가 또한 본원에 기재되어 있다. 물론, 본원에 기재된 이러한 용량 및 물질 모두 제한이라기보다는 예시적이고, 당업자가 다른 용량 또는 물질을 특정 환자 또는 용도에 사용할 수 있다. 이 지점 사이의 임의의 용량 또는 여기서의 범위 변수는 또한 특정한 실시양태에 포함되는 것으로 예상된다.
몇몇 실시양태에서, ASC 세포가 BAT로 분화하도록 하거나, WAT가 BAT가 되게 하는 화합물 또는 물질을 전달하기 위해 WAT를 표적화하는 펩타이드를 사용할 수 있다. ASC는 PPAR-감마 효현제에 의해 갈색 지방세포로 분화될 수 있다(Elabd et al. Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into functional brown adipocytes(인간 다기능 지방 유도 줄기 세포는 기능성 갈색 지방세포로 분화한다). Stem Cells 27, 2753-2760, 2009). 따라서 몇몇 실시양태에서, 로시글리타존과 같은 티아졸리딘다이온 부류의 약물(이들로 제한되지는 않음)과 같은 PPAR-감마 경로를 매개하는 화합물 또는 물질은 또한 기재된 표적 펩타이드에 커플링되고 지방생성의 조절에 사용되어 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 치료하거나 예방할 수 있다.
백색 지방세포는 또한 배양물 및 생체내 둘 다에서 BAT양 표현형으로 직접 전환된다(Cinti. Trans differentiation properties of adipocytes in the adipose organ. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297, 977-986, 2009). 이러한 전환은 교감신경계 자극, 예컨대 차가운 온도 및 WAT에서의 b3-아드레날린 수용체 활성화에 의해 촉발된 신호 전달 케스케이드에 의해 구동된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 아드레날린을 활성화하는 화합물 또는 물질은 기재된 펩타이드에 커플링되어 BAT로의 전환에 대해 WAT를 표적화여, 따라서 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 치료하거나 예방하기 위해 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 개시된 펩타이드 또는 단백질은 다양한 질병 있는 장기, 조직 또는 세포 유형을 조영 및 진단하기 위한 용도의 조영제에 부착될 수 있다. 펩타이드 또는 단백질을 조영제로서 사용하기 위해 형광단 또는 방사성 트레이서에 의해 표지하거나 접합한다. 금속 킬레이트 복합체, 방사성 동위원소, 형광 마커, 또는 효소(이의 존재는 비색 마커(예컨대, 유레아, 알칼리 포스파타제, (홀스래디쉬) 하이드로젠 퍼옥시다제 및 글루코스 옥시다제(이들로 제한되지는 않음)를 사용하여 검출될 수 있음)를 사용하여 단백질 또는 펩타이드에 대한 이의 부착 방법에서처럼 많은 적절한 조영제가 당해 분야에서 공지되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 조영 접합체는 또한 방사성 동위원소로 이중 표지되어 핵 접근법을 통해 조영과 조합되고 독특한 사이클릭 구조로 되고 결합 친화도 및 약물동태학적에 최적화된다. 경구 투여, 흡입, 피하(sub-q), 정맥내(I.V.), 복강내(I.P.), 근육내(I.M.), 또는 지주막하 주사(이들로 제한되지는 않음)를 비롯하여 당업자에게 공지된 임의의 여러 방법에 의해, 또는 하기 더 자세히 기재된 바대로 이러한 물질을 투여할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 단독으로 또는 다른 기술과 조합되어 사용되어 지방 관련 장애의 접근 및 모니터 및 직접 치료를 진단할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 플리카마이신(미트라마이신) 및 이다루비신(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 항균제 및 세포독성 활성 둘 다를 갖는 항생제를 포함하거나 이에 커플링된, 단독의 또는 조합된, 죽은 분자 집단, 예컨대 리포솜, 마이크로캡슐, 마이크로입자, 나노입자, 자기 비드 및 마이크로장치의 전달을 지시하기 위해 표적 펩타이드를 사용할 수 있다. 개시된 표적 펩타이드를 사용하여 전달되는 추가의 유형의 세포독성 물질로는 백금 배위 복합체, 안트라센다이온, 치환 유레아, 메틸 하이드라진 유도체, 암사크린, L-아스파라기나아제 및 트레티노인을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 백금 배위 복합체는 카르보플라틴 및 시스플라틴(시스-DDP)과 같은 화합물을 포함한다. 예시적인 안트라센다이온은 미톡산트론이다. 예시적인 치환 유레아는 하이드록시유레아이다. 예시적인 메틸 하이드라진 유도체는 프로카르바진(N-메틸하이드라진, MIH)이다. 이 예는 제한되지 않고, 임의의 공지된 세포독성제, 세포정지제 또는 살세포제가 현재 개시된 표적 펩타이드에 부착되고 표적된 장기, 조직 또는 세포 유형에 투여될 수 있는 것으로 생각된다. 원하는 표적, 세포독성 또는 하이브리드 펩타이드 아미노산 서열은 본원에 기재된 아미노산 서열 및 이의 유사체 및 유도체를 포함하는 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 사실, 몇몇 실시양태에서, 원하는 펩타이드 아미노산 서열의 전부 또는 임의의 일부를 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 사용에서처럼, 특정한 뉴클레오타이드 서열이 코딩하는 임의의 원하는 펩타이드 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 유전자 코드의 축퇴 성질은 널리 공지되어 있고, 따라서 각각의 표적, 세포독성 또는 하이브리드 펩타이드 아미노산 코딩 뉴클레오타이드 서열은 널리 공지된 핵산 "삼중항" 코돈, 또는 많은 경우에, 아미노산을 코딩할 수 있는 코돈의 유전적으로 대표적인 것이다. 그러므로, 본원에서 고려되는 것처럼, 본원에 기재된 표적, 세포독성 또는 하이브리드 펩타이드 아미노산 서열은 유전자 코드와 함께 취해질 때(예를 들면, 문헌["Molecular Cell Biology", 페이지 109에서의 표 4-1 (Darnell et al., eds., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1986)] 참조), 이러한 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 핵산 서열의 모든 다양한 순열 및 조합의 유전적으로 대표적인 것이다.
이러한 기능성 등가 표적, 세포독성, 이미징 또는 하이브리드 펩타이드 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열이 코딩하는 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 첨가 또는 치환(이들로 제한되지는 않음)을 포함하지만, 침묵 변화를 발생시켜, 기능성 등가 유전자 생성물을 생성한다. 포함된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수화도, 친수화도 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있고; 극성 천연 아미노산으로는 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 들 수 있고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.
아미노산 치환을 대안적으로 아미노산의 수치 지수에 기초하여 만들 수 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수화도 및 전하 특징에 기초하여 수치 지수가 배정된다. 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다. 단백질에 상호적인 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서의 수치 아미노산 지수의 용도는 당해 분야에서 이해된다(Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982). 특정한 경우에, 특정한 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 공지되어 있다. 수치 지수에 기초하여 변화시킬 때, 특정한 실시양태에서, 수치 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다른 실시양태에서 ±1 내인 아미노산 치환이 포함되고, 또 다른 실시양태에서 ±0.5 내인 아미노산 치환이 포함된다.
친수화도에 기초하여 아미노산 치환이 대안적으로 이루어질 수 있고, 특히 이에 의해 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩타이드는 면역학적 실시양태에서의 용도에 의도된다. 특정한 실시양태에서, 이의 인접한 아미노산의 친수화도에 의해 지배되는 것처럼, 단백질의 가장 큰 국소적인 평균 친수화도는 이의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관된다. 하기 친수화도 값이 이 아미노산 잔기에 배정된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수화도 값에 기초하여 변화시킬 때, 특정한 실시양태에서, 친수화도 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 특정한 실시양태에서 ±1 내인 아미노산의 치환이 포함되고, 특정한 실시양태에서 ±0.5 내인 아미노산의 치환이 포함된다. 또한 친수화도에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다.
전장 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 또는 펩타이드의 절두된 또는 돌연변이체 버전이 비연관 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드에 융합된 융합 단백질의 용도가 본원에 기재된 원하는 펩타이드 코딩 핵산 및/또는 아미노산 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 이러한 융합 단백질로는 단백질 또는 펩타이드를 안정화시키고 생체내 반감기를 연장시키는 IgFc 융합; 융합 단백질이 세포막에 부착되게 하는 임의의 아미노산 서열에 대한 융합; 또는 마커 기능을 제공하는 효소, 형광 단백질, 또는 발광 단백질에 대한 융합을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서 표적 펩타이드는 리포솜 또는 지질 복합체 기반 전달 시스템에 부착될 수 있다. 이러한 기술의 예가 문헌["Liposomes: A Practical Approach" (Torchilin and Weissig, eds., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2003)] 및 미국 특허 제4,594,595호, 제5,459,127호, 제5,948,767호 및 제6,110,490호에 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 발현되는 융합 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 사용하여 융합 단백질을 용이하게 정제할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 융합 단백질은 재조합 플라스미드, 또는 이의 일부로 펩타이드 코딩 핵산 서열을 서브클로닝하여 정제되고, 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노 말단(N 말단) 또는 카르복시 말단(C 말단) 태그에 번역으로 융합될 수 있다("His-태그"; 예를 들면, 문헌[Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976, 1991] 참조). 이러한 구성체를 발현하는 세포로부터의 추출물을 Ni2 + 니트릴로아세트산-아가로스 칼럼에 로딩하고, 히스티딘-태그된 단백질을 이미다졸 함유 완충제로 선택적으로 용리한다.
기재된 원하는 펩타이드 아미노산 서열을 화학적으로 합성할 수 있지만(예를 들면, 문헌["Proteins: Structures and Molecular Principles" (Creighton, ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY, 1984)] 참조), 원하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 발현하기 위해 당해 분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 큰 폴리펩타이드 서열을 제조하는 것이 유리할 수 있다. 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구성하도록 이러한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들면 실험실내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 들 수 있다(예를 들면, 상기 문헌["Molecular Cloning, A Laboratory Manual"] 및 상기 문헌["Current Protocols in Molecular Biology"] 참조). 대안적으로, 예를 들면 합성기를 사용하여 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 RNA 및/또는 DNA를 화학적으로 합성할 수 있다(예를 들면, 문헌["Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach"(Gait, ed., IRL Press, Oxford, United Kingdom, 1984)] 참조).
펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 원하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 가용성이거나, 가용성 유도체일 때, 숙주 세포 배양물로부터, 즉 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 분비되지 않는 경우에는 숙주 세포 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 숙주 세포에 의해 분비되는 경우에는 배양 배지로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 회수할 수 있다. 그러나, 적합한 발현 시스템은 세포막에서 부착된 원하는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능성 등가물을 발현하는 조작된 숙주 세포를 또한 포함한다. 적절한 세제 및 지질 미셀 및 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 이러한 발현 시스템으로부터의 원하는 펩타이드의 정제 또는 풍부화를 수행할 수 있다. 게다가, 예를 들면 특정한 약물 스크리닝 검정에서 펩타이드의 구조적 및 기능적 특징을 보유할 뿐만 아니라, 생물학적 활성을 평가하기 위해 바람직한 경우에 이러한 조작된 숙주 세포 그 자체를 사용할 수 있다.
특정 용도에서, 일시 발현 시스템이 바람직하다. 그러나, 재조합 단백질 또는 펩타이드의 장기간의 고수율 제조의 경우, 안정한 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 원하는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 원점을 포함하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 제어 요소(예를 들면, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 자리 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 숙주 세포를 DNA로 형질전환할 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농후 배지에서 약 1 내지 2일 동안 성장시키고, 이후 선택 배지로 전환한다. 재조합 플라스미드에서의 선택 가능한 마커는 선택 저항을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이의 염색체로 안정하게 통합하게 하고 자라서 병소를 형성하고, 이는 결국 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있다. 원하는 유전자 생성물 또는 이의 일부를 발현하는 세포주를 조작하기 위해 상기 방법을 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 원하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 내인성 활성에 영향을 미치는 화합물의 스크리닝 및 평가에서 특히 유리할 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있는 단순포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., Cell 11:223-232, 1977), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad . Sei. USA 48:2026-2034, 1962) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:817-823, 1980) 유전자(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있다. 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)(Wigler et al., Proc. Natl. Acad . Sei. USA 77:3567-3570, 1980 및 O'Hare et al., Proc. Natl. Acad . Sei. USA 78:1527-1531, 1981); 마이코페놀산에 내성을 부여하는 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt)(Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad . Sei. USA 78:2072-2076, 1981); 아미노글라이코사이드 G-418에 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)(Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14, 1981); 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hpt)(Santerre et al., Gene 30:147-156, 1984)의 유전자에 대한 선택에 기초하여 항대사물질 내성을 또한 사용할 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 조성물을 제공할 목적으로 사용될 수 있는 숙주 세포/발현 시스템으로는 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아(예를 들면, 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들면, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)); 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 포유동물 세포 게놈(예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유도된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구성체를 운반하는 포유동물 세포계(예를 들면, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
박테리아 시스템에서, 다수의 상이한 발현 벡터는 발현되는 원하는 유전자 생성물에 의도되는 사용에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 원하는 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하기 위해 또는 단백질에 대한 항체를 키울기 위해 많은 분량의 이러한 단백질을 제조할 때, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는 이. 콜 라이 발현 벡터 pUR278(Ruther and Muller-Hill, EMBO J. 2:1791-1794, 1983)을 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않고, 원하는 펩타이드 코딩 서열을 개별적으로 lacZ 코딩 구역과 벡터에 골격내 결찰하여 융합 단백질을 제조할 수 있다; pIN 벡터(Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3110, 1985 및 Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989) 등. 글루타티온 S-트랜스퍼라제와의 융합 단백질로서 원하는 펩타이드 모이어티를 발현하기 위해 pGEX 벡터(미국 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 지이 헬스케어(GE Healthcare))를 또한 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타티온-아가로스 비드로 흡착된 후, 자유 글루타티온의 존재 하에 용리되어 용리 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터를 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 분해 자리를 포함하도록 설계하여 클로닝된 원하는 펩타이드 코딩 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예컨대, 무엇보다도, 문헌[Park, et al., (Production of D-amino acid using whole cells of recombinant Escherichia coli with separately and coexpressed D-hydantoinase and N-carbamoylase. Biotechnol Prog. Jul-Aug; 16(4):564-70, 2000)]에 기재된 것과 같은 방법에서 D-아미노산이 바람직하다.
예시적인 곤충계에서, 오토그래파 칼리포르니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)를 원하는 펩타이드 코딩 서열을 발현하도록 벡터로서 사용한다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 원하는 펩타이드 코딩 서열을 바이러스의 비필수 구역(예를 들면, 폴리헤드린 유전자)으로 각각 클로닝하고, AcNPV 프로모터(예를 들면, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 위치할 수 있다. 원하는 펩타이드 코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자의 불활성화 및 봉입체 비형성(non-occluded) 재조합 바이러스(즉, 폴리헤드린 유전자에 의해 코딩된 단백질성 코트가 결여된 바이러스)를 생성시킬 것이다. 이후, 재조합 바이러스를 사용하여 삽입된 폴리뉴클레오타이드가 발현된 스포도프테라 프루기페르다 세포를 감염시킨다(예를 들면, 문헌[Smith et al., J. Virol. 46:584-593, 1983] 및 미국 특허 제4,215,051호 참조).
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템을 사용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우, 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열을 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들면, 후기 프로모터 및 3조 리더 서열에 결찰할 수 있다. 이후, 이 키메라 서열을 실험실내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에서 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 구역(예를 들면, 구역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 가변성이고 원하는 펩타이드 생성물을 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 발생시킬 것이다(예를 들면, 문헌[Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659, 1984] 참조). 특이적 개시 신호가 또한 삽입된 원하는 펩타이드 코딩 뉴클레오타이드 서열의 효과적인 번역에 필요할 수 있다. 이 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 아마도, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 전사 제어 신호가 제공될 수 있다. 게다가, 개시 코돈은 전체 인서트의 번역을 보장하기 위해 원하는 펩타이드를 코딩하는 코딩 서열의 리딩 프레임을 갖는 파지에 있어야 한다. 이 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등의 삽입에 의해 증강될 수 있다(예를 들면, 문헌[Nevins, CRC Crit. Rev. Biochem. 19:307-322, 1986] 참조).
효모에서, 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터를 사용할 수 있다. 검토를 위해, 예를 들면 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", supra, Ch. 13, Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987, "DNA Cloning", Vol. II, Ch. 3 (Glover, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1986); Bitter, Meth. Enzymol. 152:673-684, 1987, "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance" (Strathern et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1981), 및 "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression" (Strathern et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982)]을 참조한다.
식물에서, 다양한 상이한 식물 발현 벡터를 사용할 수 있고, 임의의 다수의 프로모터에 의해 원하는 펩타이드 코딩 서열의 발현을 구동할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV의 35S RNA 또는 19S RNA 프로모터(Brisson et al., Nature 310:511-514, 1984), 또는 TMV의 코트 단백질 프로모터(Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311, 1987)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 식물 프로모터, 예컨대 RUBISCO의 작은 아단위의 프로모터(Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1679, 1984, 및 Broglie et al., Science 224:838-843, 1984), 또는 열 충격 프로모터, 예를 들면 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565, 1986)를 사용할 수 있다. 예를 들면, Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 마이크로주사, 또는 전기천공을 이용하여 이러한 구성체를 식물 세포에 도입할 수 있다. 이러한 기술의 검토를 위해, 예를 들면 바이스바흐(Weissbach) 및 바이스바흐의 문헌[""Methods in Plant Molecular Biology", Section VIII (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press, Inc., New York, NY, 1988), 및 "Plant Molecular Biology", 2nd Ed., Ch. 7-9 (Grierson and Covey, eds., Blackie & Son, Ltd., Glasgow, Scotland, United Kingdom, 1988)]을 참조한다.
또한, 삽입된 원하는 펩타이드 코딩 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 방식으로 원하는 펩타이드 코딩 핵산 서열을 조절하거나 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 조절(예를 들면, 글라이코실화) 및 처리(예를 들면, 분해)는 단백질의 특정 기능에 영향을 미칠 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 펩타이드의 번역후 과정 및 조절에 대해 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 발현된 원하는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드의 정확하거나 원하는 조절 및 처리를 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주계를 선택할 수 있다. 이를 위해, 1차 번역물의 원하는 처리 및 원하는 펩타이드 코딩 핵산 서열의 글라이코실화 및/또는 포스포릴화를 위한 세포 기계를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO), VERO, 베이비 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK), HeLa, 원숭이 신장(monkey kidney: COS), MDCK, 293, 3T3, WI38, 인간 간세포 암종(예를 들면, Hep G2), 및 U937 세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 실시양태에서, 현재 개시된 조성물은 지방 관련 체성분 또는 체중 장애 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 치료에 사용된다.
특정한 실시양태에서, 현재 개시된 조성물을 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 치료, 관리 및/또는 예방을 위해 하나 이상의 추가의 화합물 또는 물질("추가의 활성제")과 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 치료제를 지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암을 치료하거나 완화시키기 위한 치료학적 유효량으로 환자에게 투여할 수 있다. 치료학적 유효량은 질환 증상의 임의의 개시 지연, 완화 또는 지체를 발생시키기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.
몇몇 실시양태에서는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩타이드이고, 상기 펩타이드는 생체내 기질 세포에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 기질 세포는 지방 조직, 섬유화 병변 또는 종양 내에 위치한다.
몇몇 실시양태에서는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 단백질 조성물이다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 전부 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 조영제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 세포독성제 또는 아폽토시스유도제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 전환하도록 유도하는 물질에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 백색 지방 조직에서 b3-아드레날린 수용체를 활성화하는 물질에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커를 통해 커플링되고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
다른 실시양태에서는, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩타이드이고, 상기 펩타이드는 생체내 기질 세포에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 기질 세포는 폐 조직, 섬유화 병변 또는 종양 내에 위치한다.
몇몇 실시양태에서는, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 단백질 조성물이다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 전부 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 조영제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 또는 단백질 조성물은 세포독성제 또는 아폽토시스유도제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커를 통해 커플링되고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단백질 조성물은 전부 D-아미노산으로 이루어지고, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하고, 상기 조성물은 생체내 예를 들면 지방 조직, 섬유성 조직 또는 종양 조직 내에 위치한 기질 세포에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 조영제, 세포독성제, 아폽토시스유도제에 커플링된다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드는 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 전환되도록 유도하는 물질, 예컨대 백색 지방 조직 내에 b3-아드레날린 수용체를 활성화하는 물질(이것으로 제한되지는 않음)에 커플링된다.
몇몇 실시양태에서는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자이다. 몇몇 실시양태에서는, 이 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
몇몇 실시양태에서는, 지방 조직에 세포독성, 아폽토시스유발, 전환발생 또는 이미징 펩타이드를 전달하는 방법으로서, (a) 세포독성, 아폽토시스유발, 전환발생 또는 이미징 펩타이드를 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 표적 펩타이드에 커플링하는 단계; 및 (b) 지방 세포에 커플링된 표적 펩타이드를 선택적으로 결합하는 단계를 포함하는 방법이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커를 통해 커플링되고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다.
다른 실시양태에서는, 지방 조직을 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단에 화합물 또는 물질 커플링 펩타이드를 노출시키는 단계를 포함하는 지방 조직에 화합물 또는 물질을 전달하는 방법으로서, 상기 화합물 또는 물질 커플링 펩타이드는 지방 조직에 선택적으로 결합하는 펩타이드에 커플링된 화합물 또는 물질을 포함하고, 펩타이드는 아미노산 길이가 100개 미만이고 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 지방 조직 표적 모티프를 포함하는 방법이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 링커를 통해 커플링되고, 몇몇 실시양태에서, 링커는 아미노헥산산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 펩타이드 및 상기 물질 둘 다 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 세포독성 또는 아폽토시스유발 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 조영제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 노출 단계는 비만, 섬유증 또는 암(이들로 제한되지는 않음)과 같은 지방과다 관련 장애를 치료하기 위해 커플링될 수 있는 펩타이드에 피험체를 노출시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포 집단은 인간 피험체로부터 유래하거나 이 내에 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포 집단은 수의학적 피험체로부터 유래하거나 이 내에 있다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 조직 박편으로서 생체외 세포 집단이다. 몇몇 실시양태에서는, 상기 지방 조직에 대한 화합물 또는 물질 커플링 펩타이드의 선택적 결합에 기초하여 불균일 세포 집단에서의 지방 기질 세포를 검출하는 방법이다. 몇몇 실시양태에서, 세포독성제 또는 아폽토시스유도제(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 화합물 또는 물질에 커플링된 펩타이드 표적된 펩타이드에 의한 치료로부터 이익을 얻는 환자를 확인하는 것으로서 지방 기질 세포를 검출하는 방법이다. 환자의 예로는 체성분 장애, 체중 장애, 비만, 지방이상증, 당뇨병, 대사 증후군, 섬유증 또는 암을 앓고 있는 인간 또는 수의학적 환자를 들 수 있다.
WAT7 펩타이드(서열 번호 13 및 14)의 단리 및 규명과 관련하여 구체적인 상세내용이 제공되고, 또한 추가의 WAT 표적(서열 번호 1-16) 및 개시된 방법의 유전적 이용가능성을 나타내는 폐 표적 펩타이드(서열 번호 17 내지 24)가 제공된다.
예를 들면, LD50(집단 중 50%에 치사인 용량) 및 ED50(집단 중 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 이러한 조성물의 독성 및 치료 효율을 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량비는 LD50/ED50 비로서 표시되는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 특정한 실시양태에서 사용할 수 있지만, 이러한 조성물을 이환 조직의 자리에 우선적으로 표적화하여, 비감염 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키는 전달 시스템을 설계하기 위해 일반적으로 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻은 데이터를 인간에서 사용하기 위한 용량 범위의 제제화에서 이용할 수 있다. 이러한 조성물의 용량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 용량은 이용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 임의의 조성물의 경우, 세포 배양 검정으로부터 치료학적으로 효과적인 용량을 초기에 추정할 수 있다. 세포 배양에서 결정되는 것처럼 IC50(즉, 증상의 반최대 억제를 성취하는 시험 조성물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 용량을 제제화할 수 있다. 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하기 위해 이러한 정보를 이용할 수 있다. 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장 수치를 측정할 수 있다.
지방 관련 체성분 또는 체중 장애, 예컨대 비만, 지방이상증, 당뇨병 또는 대사 증후군, 섬유증 및 암의 치료학적 처치가 고려될 때, 시험 피험체의 1킬로그램 체중당 생물활성제의 최대 허용 용량, 또는 MTD를 결정하기 위해 동물 연구를 이용하여 적절한 용량을 또한 결정할 수 있다. 일반적으로, 시험되는 적어도 하나의 동물 종은 포유동물이다. 당업자는 효율적이고 인간을 비롯한 다른 종에 대한 독성을 피하는 용량을 자주 추론할 것이다. 효율의 인간 연구를 수행하기 전에, I상 임상 연구는 안전한 용량의 확립을 돕는다.
추가로, 생물활성제는 예를 들면 생물활성제의 안정성을 증대시키거나, 그렇지 않으면 이의 약물학적 특성을 증대시키는(예를 들면, 생체내 반감기 증가, 독성 감소 등) 다양한 잘 확립된 조성물 또는 구조와 커플링되거나 복합체화될 수 있다.
이러한 치료제를 하기 더 자세히 기재된 바대로, 흡입, 피하(sub-q), 정맥내(I.V.), 복강내(I.P.), 근육내(I.M.), 또는 지주막하 주사, 또는 국소로 도포되는 트랜스덤(transderm), 연고, 크림, 고약, 점안액 등(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 다수의 방법에 의해 투여할 수 있다.
현재 기재된 조성물에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 종래의 방식으로 제제화할 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들면 pH, 몰삼투압농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균도, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 조성물 흡착 또는 침투를 조절하거나 유지시키거나 보존하기 위한 제제 재료를 포함할 수 있다. 적합한 제제 재료로는 아미노산(예를 들면, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 및 리신); 항균제; 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 아황산나트륨 및 아황산수소나트륨); 완충제(예를 들면, 붕산염, 중탄산염, 트라이스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 및 다른 유기 산); 벌크화제(예를 들면, 만니톨 및 글라이신); 킬레이트화제(예를 들면, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예를 들면, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 및 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만노스 및 덱스트린); 단백질(예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린); 착색제, 항료 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예를 들면, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 펩타이드; 염 형성 반대이온(예를 들면, 나트륨); 보존제(예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 및 과산화수소); 용매(예를 들면, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜 및 폴리에틸렌 글라이콜); 당 알코올(예를 들면, 만니톨 및 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들면, 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스터, 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80), 트라이톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤 및 티록사팔); 안정성 증강제(예를 들면, 수크로스 및 소르비톨); 등장성 증강제(예를 들면, 알칼리 금속 할라이드(예를 들면, 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨 및 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제; 및 약제학적 아쥬번트("Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Ed. (Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990))를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가로, 기재된 치료학적 펩타이드는 반감기 연장 비히클에 결합될 수 있다. 특정한 예시적인 반감기 연장 비히클은 당해 분야에 공지되어 있고, Fc 도메인, 폴리에틸렌 글라이콜 및 덱스트란을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, PCT 특허 출원 공보 WO 99/25044 참조).
상기 물질을 주사, 예를 들면 볼루스 주사 또는 연속 점적에 의해 비경구 투여에 대해 제제화할 수 있다. 주사용 제제는 첨가된 보존제와 함께 단위 제형, 예를 들면 앰플 또는 다용량 용기 내에 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 무균 발열원 비함유 물과 용해하기 위한 분말 형태일 수 있다.
상기 물질을 또한 예를 들면 코코아 버터 또는 다른 글라이세라이드와 같은 종래의 좌제 기제를 포함하는 직장 투여를 위한 조성물, 예컨대 좌제 또는 정체 관장제로서 제제화할 있다.
이전에 기재된 제제 이외에, 상기 물질을 또한 데포 제제로서 제제화할 수 있다. 이러한 장기간 작용 제제를 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 예를 들면, 적합한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀션으로서), 이온 교환 수지, 또는 난용성 가용성 유도체로서, 예를 들면, 난용성 가용성 염으로 물질을 제제화할 수 있다. 성기 조성물은, 원하는 경우, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 분배 장치 중에 존재할 수 있다. 팩은 예를 들면 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 수포 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배 장치에는 투여에 대한 설명서가 수반될 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 제어 방출 수단 또는 전달 장치에 의해 활성 조성물을 투여할 수 있다. 예로는 미국 특허 제3,845,770호, 제3,916,899호, 제3,536,809호, 제3,598,123호, 제4,008,719호, 제5,674,533호, 제5,059,595호, 제5,591,767호, 제5,120,548호, 제5,073,543호, 제5,639,476호, 제5,354,556호 및 제5,733,566호에 기재된 것을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 하이드로프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 마이크로입자, 리포솜, 마이크로구, 또는 이들의 조합을 이용하여 하나 이상의 활성 성분의 방출을 느리게 하거나 제어하여 다양한 비율의 원하는 방출 프로필을 제공하기 위해 이러한 제형을 사용할 수 있다. 예시적인 서방 매트릭스로는 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락타이드(예를 들면, 미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 출원 공보 EP 058,481 참조), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(예를 들면, 문헌[Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983] 참조), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(예를 들면, 문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981 및 Langer, Chemtech 12:98-105, 1982] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer 외 문헌 참조) 및 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허 출원 공보 EP 133,988)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서방 조성물을 당해 분야에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조할 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985] 참조 및 유럽 특허 출원 공보 EP 036,676, EP 088,046 및 EP 143,949). 현재 개시된 조성물과 사용하기 위해 본원에 기재된 것을 비롯하여 당업자에게 공지된 적합한 제어 방출 제제를 용이하게 선택할 수 있다. 특정한 실시양태는 제어 방출에 채택되는 정제, 캡슐, 겔캡 및 캐플릿(이들로 제한되지는 않음)과 같은 경구 투여에 적합한 단일 단위 제형을 포함한다.
모든 제어 방출 약제학적 생성물은 비제어 대응물질에 의해 성취되는 치료에 비해 치료를 개선하고자 하는 일반적인 목적을 갖는다. 이상적으로, 의학 치료에 최적으로 설계된 제어 방출 제제의 용도는 최소 시간으로 병증을 치유하거나 제어하도록 사용되는 최소의 약물 물질을 특징으로 한다. 제어 방출 제제의 이점으로는 약물 활성 연장, 용량 빈도 감소 및 환자 순응도 증가를 들 수 있다. 또한, 제어 방출 제제를 작용 개시 시간 또는 다른 특징, 예컨대 약물의 혈중 수치에 영향을 미치고, 따라서 부작용(예를 들면, 부정적 효과)의 발생에 영향을 미치도록 사용할 수 있다.
원하는 치료 효과를 즉시 발생시키는 활성 성분의 양을 초기에 방출하고, 연장된 시간 기간에 걸쳐 이러한 치료학적 또는 예방학적 효과의 수준을 유지시키기 위해 활성 성분의 다른 양을 점진적으로 그리고 계속해서 방출하도록 대부분의 제어 방출 제제를 설계한다. 신체에서 이러한 비교적 일정한 수준의 활성 성분을 유지하기 위해, 대사되고 신체로부터 배출되는 활성 성분의 양을 대체하는 속도로 제형으로부터 약물이 방출되어야 한다. pH, 온도, 효소, 물, 또는 다른 생리학적 조건 또는 조성(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 다양한 조건에 의해 활성 성분의 제어 방출을 모의할 수 있다.
몇몇 경우에, 개시된 방법 및 조성물의 활성 성분을 동시에 또는 동일한 투여 경로로 환자에게 투여하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 몇몇 실시양태에서는, 의학 수련의가 사용할 때, 환자에게 적절한 양의 활성 성분의 투여를 단순화할 수 있는 키트가 있다.
통상적인 키트는 하나 이상의 개시된 치료제의 단일 단위 제형을, 단독으로 또는 개시된 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 다른 물질의 단일 단위 제형과 조합하여, 포함한다. 개시된 키트는 활성 성분을 투여하기 위해 사용되는 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예로는 주사기, 드립 백, 패치 및 흡입기를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
개시된 키트는 하나 이상의 활성 성분을 투여하기 위해 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 활성 성분이 비경구 투여로 용해되어야 하는 고체 형태로 제공되는 경우, 키트는 비경구 투여에 적합한 미립자 비함유 무균 용액을 형성하기 위해 활성 성분이 용해될 수 있는 적합한 비히클의 밀봉 용기를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 비히클의 예로는 주사용수 USP; 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사 및 락트산염 링거 주사(이들로 제한되지는 않음); 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글라이콜 및 폴리프로필렌 글라이콜(이들로 제한되지는 않음)과 같은 수혼화성 비히클 ; 및 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올레에이트, 아이소프로필 미리스테이트 및 벤질 벤조에이트(이들로 제한되지는 않음)와 같은 비수성 비히클을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그러나, 구체적인 실시양태에서, 개시된 제제는 임의의 알코올 또는 다른 공용매, 오일 또는 단백질을 포함하지 않는다.
하기 섹션은 다양한 실시양태의 실시예와 관련하여 추가의 상세내용을 제공한다. 당해 분야의 당업자는 하기 실시예에서 개시된 기술이 훌륭히 작용하는 본 발명자들이 발견한 기술 및/또는 조성물을 나타낸다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 당해 분야의 당업자는, 개시내용의 견지에서, 개시된 특정한 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 동일하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 예는 본원에 기재된 방법 및 시스템의 예시이고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. WAT7 펩타이드(서열 번호 13 및 14)의 단리 및 규명과 관련하여 구체적인 상세내용이 제공되고, 또한 추가의 WAT 표적(서열 번호 1-16) 및 개시된 방법의 유전적 이용가능성을 나타내는 폐 표적 펩타이드(서열 번호 17 내지 24)가 제공된다.
실시예
세포 단리 및 배양: 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 균주/성 특이적 변수를 배제하기 위해, 펩타이드 귀소 검증 및 후속 세포 단리에 암컷 CD1 마우스를 사용하였다. 모든 연구에 마우스를 아베르틴(Avertin)으로 마취시켰다.
미국 특허 출원 제20090104117호 및 예를 들면 문헌[Traktuev, et. al., 2008(상기 참조) 및 Zhang, et al., 2009(상기 참조)]에 이미 기재된 바대로 피하 및 복강내 WAT의 혼합물로부터의 WAT 세포 하위집단 및 대조군 장기로부터의 세포를 분리하였다. 저민 조직을 디스파제(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))/콜라게나제 I형(보싱턴 바이오케미컬(Worthington Biochemical)) 중에 용해시켰다. 지방세포를 200g 원심분리 후 부유하는 세포 분획으로서 분리하였다. 대조군 장기로부터의 세포 및 SVF 분획을 70㎛ 니텍스(Nitex) 메쉬를 통해 여과시켰다. PE 접합 항CD34 MEC14.7, APC 접합 항CD31 MEC 13.3 및 APC-Cy7 접합 CD45 30-F11(비디 바이오사이언시스)의 IgG 클론을 갖는 FACSAria(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 단리된 세포를 각각의 세포 집단으로 분리하였다. 표시된 대로, 비코팅 플라스틱에서 10% 소 태아 혈청(FCS)이 보충된 DMEM 중에 세포를 성장시켰다. 밤새 플라스틱에 부착시킨 후, 기질 세포 배양물을 세척하여 세포 집단을 기재된 바대로 오염시켰다(Traktuev et al., 2008(상기 참조); Zhang et al., 2009(상기 참조)). LSR II 및 FacsDiva 소프트웨어(비디 바이오사이언시스)를 사용하여 CD31 및 CD45 항체에 의한 유세포계수법에 의해 배양된 세포 집단의 순도를 확인하였다.
파지 라이브러리 스크리닝: pIII 단백질에서 인서트 CX7C, CX8C 및 CX9C를 디스플레이하는 M13 유래 박테리오파지 벡터 fUSE5에 기초한 무작위 펩타이드 라이브러리를 혼합(1:1:1)하여 꼬리 정맥 주사에 대해 생체내 동기적 바이오패닝에 기초하여 수행된 스크린에 대해 총 1010개의 TU의 혼합 라이브러리로 만들었다(예를 들면, US20050074747 및 문헌[Arap, et al., Nat. Med. 8: 121-127, 2002; Kolonin, et al., FASEB J. 20: 979-981, 2006] 참조).
경쟁적 귀소 실험을 위해, 11개의 선택된 파지 클론의 각각에 대한 5x109개의 TU를 혼합하고 총 5.5x1010개의 TU를 주사하였다. 각각의 클론의 검증을 위해, 각각의 파지 클론에 대해 1x1010개의 TU를 주사하였다. 10㎖ 인산염 완충 식염수(PBS)에 의한 순환 및 심장 관류 1시간 후, WAT, 경골/대퇴골, 골 관련 골격근 및 폐를 수집하였다. 경골/대퇴골을 세수하여 골수를 단리하였다. 조혈 및 내피 세포를 항TER119, 항CD31 및 항CD45 항체(비디 바이오사이언시스)로 코팅된 다나비즈(Dynabeads)(인비트로겐(Invitrogen))에 의해 각각의 장기의 세포 현탁액으로부터 고갈시키고, 이후 CD34+CD31-CD45- 세포를 정제하기 위해 남은 세포를 FACS에 의해 처리하였다. K91 이. 콜라이를 감염시켜 결합 파지를 회수하고, 파지 형질전환 단위(TU) 계수에 의해 정량화하고, 문헌[Arap, et al. 2002(상기 참조) 및 Kolonin, et al., 2006(상기 참조)]에 기재된 바대로 펩타이드 코딩 DNA의 서열분석을 위해 처리하였다. 보존된 펩타이드 모티프의 확인을 위해, ClustalW2 소프트웨어를 사용하였다.
면역형광법에 의한 마우스 조직 및 세포 분석: 화학적으로 합성되고, N 및 C 말단 시스테인을 통해 고리화되고, 적어도 95%의 순도로 정제되고, 바이오티닐화된 펩타이드(게네메드(Genemed))를 꼬리 정맥을 통해 주사(500㎍)하고 1시간 동안 순환시켰다. 모든 조직 분석을 위해, 10㎖ PBS로 심장 관류 후 마취된 마우스로부터 장기를 회수하였다. 항원의 면역국재화를 EDTA 기반 항원 회수(DAKO)시 이미 기재된 바대로(Arap et al., 2002(상기 참조) 및 Kolonin et al., 2006(상기 참조)) 포르말린 고정 조직의 파라핀 절편 중에 수행하고, 0.3% 트라이톤 X-100으로 세척하고 혈청 비함유 단백질 블록(DAKO) 중에 차단하였다. 스트렙타비딘-Cy3(Zymed, 1:20) 또는 1차 항체(4℃, 12 내지 16시간) 및 2차 항체(실온, 1시간)를 PBS/0.05% 트윈-20 중에 적용하였다. 시그마사의 래빗 항파지 항체(1:500), 산타 크루즈(Santa Cruz)사의 염소 항마우스 CD31(1:150), 이바이오사이언시즈(eBiosciences)사의 랫트 항마우스 CD45(1:150), 에피토믹스(Epitomics)사의 래빗 항마우스 PDGFRβ 항체(1:150) 및 알앤디 시스템즈(R&D Systems)사의 염소 항마우스 DCN 항체(1:200)의 1차 항체를 사용하였다. 2차 당나귀 Alexa488 접합 및 Cy3 접합 IgG를 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)사로부터 얻었다. 핵을 훽스트(Hoechst) 33258 또는 TOPR03(인비트로겐)으로 염색하였다. 챔버 슬라이드(Lab-Tek II; 날게 눅 인터내셔널(Nalge Nunc International))에서 배양된 세포를 제네텍스(Genetex)사의 항GFP 항체(1:100)로 면역형광하였다. 면역염색된 조직 절편 또는 세포 제제를 벡타쉴드(Vectashield)(벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories)) 중에 탑재하였다. 올림푸스(Olympus) IX70 도립 형광 현미경/마그너파이어(Magnafire) 소프트웨어(올림푸스)로 형광 화상을 얻었다. 레이카(Leica) TCS SP5 현미경/LAS AF 소프트웨어로 공초점 화상을 얻었다.
친화도 크로마토그래피에 의한 단백질 단리: 다운스(Dounce) 균질기를 사용하여 0.2mM 페닐메탄설포닐플루오라이드/로슈 PI 칵테일을 포함하는 PBS 중에 세포를 파괴하였다; 원심분리(4℃에서 30분 동안 15,000g)를 이용하여 막 펠렛으로부터 가용성 단백질을 분리하였다. 미국 특허 출원 20090104117 및 문헌[Nie, et al., 2008 (Stem Cells 26: 2735-2745)]에 이미 기재된 바대로 세포막 단백질의 가용화를 수행하였다. 간단히 말하면, 막 펠렛을 4℃에서 밤새 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 50mM n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드, 0.2mM 페닐메탄설포닐플루오라이드/로슈 PI 칵테일(칼럼 완충제)을 포함하는 PBS 중에 항온처리하고 원심분리(4℃에서 30분 동안 15,000g)를 수행하여 불용성 조각을 제거하였다. WAT7 수용체 정제를 위해, 5㎎ 시스테인 고리화 펩타이드(게네메드 신써시스(Genemed Synthesis))를 (C 말단을 통해) 0.25㎖ EDC 세파로스(피어스(Pierce))에 커플링하고, 칼럼을 1% 트라이톤 X-100을 포함하는 칼럼 완충제와 평형시켰다. 펩타이드 커필링 수지를 40㎎ 막 추출물과 항온처리하고, 중력 유동에 의해 칼럼 완충제로 강하게 세척하였다. 1.0mM 펩타이드, 이어서 0.1M 글라이신(pH 2.8)으로 용리(0.5㎖ 분획)를 수행하였다. 용리물에서의 패닝을 위해, 표시된 파지 클론의 20㎕ 105개의 TU를 플라스틱에 고정된 마이크로콘 필터(밀리포어(Millipore))를 사용하여 탈염된 각각의 2㎖ 분획과 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 비결합 파지를 PBS로 강하게 세척하고, 이후 플레이트에 직접 숙주 K91 이. 콜라이를 감염시켜 결합 파지를 정량화하였다. 남은 WAT7-파지 결합 분획을 황산 도데실 나트륨(SDS)-PAGE로 처리하고; 프로트테크(ProtTech)에 의해 WAT7 특이적 밴드에서의 질량 분광광도법 단백질 확인을 수행하였다. ΔDCN의 정제를 위해, 20㎎ 항DCN 항체를 프로테인 A/G(Protein A/G) 비드(피어스)에 고정시키고 40㎎ 막 추출물과 항온처리하였다. 프로테인 A/G 결합 완충제(피어스)로 세척시, SDS-PAGE에 의해 확인된 40kDa의 밴드를 베일러 칼리지(Baylor College)의 의학 단백질체학 시설(Medicine proteomics facility)에서 N 말단 마이크로서열분석하였다. 레지스틴의 정제를 위해, 고리화 KLH 커플링 시스테인 고리화 WAT7(게네메드 신써시스)에 대해 키운 면역전 및 면역후 래빗 항혈청을 사용하였다. 항체 특이성을 검증하기 위해, CX7C 아미노산을 코딩하는 단편을 프레임내 GST Tag에 의해 pGEX4T-1 벡터로 클로닝하고 GST 바인드(GST Bind) 키트(노바겐(Novagen))를 사용하여 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그된 펩타이드를 제조하였다. GST 접합 펩타이드 KGGRAKD(서열 번호 25 및 26) 및 프로히비틴 및 펩타이드 mPep WLGEWLG(서열 번호 35 및 36)는 문헌[Nie, et al., 2008(상기 참조)]에 이미 기재되어 있다.
WAT7 특이적 항체에 대한 단백질 결합을 상기한 대로 전체 마우스 WAT SVF 추출물로부터 끌어 당기고, SDS-PAGE에 의해 분해하고, 프로트테크에 의해 질량 분광분석으로 확인하였다. 바이오티닐화 ASC 단백질의 단리를 위해, 스트렙타비딘 커플링 다나비즈 M270(인비트로겐)을 사용하였다. 혈장 막 단백질의 분석을 위해, 큐프로테오머(Qproteome) PM 단리 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 혈장 막 풍후 분획을 제조하였다. 문헌[Kolonin, et al., Nat. Med. 10: 625-632, 2004]에 기재된 바대로 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-바이오틴(피어스)을 사용하여 세포 표면 단백질 바이오티닐화를 수행하였다.
면역블로팅 및 결합 검정: SDS-PAGE에서 풀 다운된 단백질 제제를 이뮤노빌론(Immobilon)-FL 막(밀리포어)에 블로팅하고, 오디세이(Odyssey) 차단 완충제(리코르 바이오사이언시스(Licor Biosciences))로 차단하고, 염소 항DCN(알앤디 시스템즈, 1:1,000), 래빗 항ANX2A(아비바(Aviva), 1:1,000), 래빗 항마우스 b-액틴(아브캄(Abcam), 1:10,000) 항체, 또는 WAT7에 대한 면역전 및 면역후 항혈청(1:1,000)으로 표시된 바대로 (PBS/0.05% 트라이톤 X-100 중에) 프로빙하였다. 항염소 IRDye 800CW 또는 항래빗 IRDye 680(둘 다 리코르 바이오사이언시스사)을 사용하여 오디세이 이미징 시스템에 의해 신호를 검출하였다. 소 DCN을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 얻었고, NS0 유래 쥐과 DCN을 알앤디 시스템즈로부터 얻었다. 슈퍼스크립트(Superscript) 키트(인비트로겐)를 사용하여 WAT 전체 RNA로부터 쥐과 DCN cDNA를 생성시켰다. 박테리아 발현을 위해, 각각 마우스 DCN cDNA(오리젠(OriGene)) 또는 CLIC4 cDNA(오리젠)의 아미노산 1-354 및 45-354를 코딩하는 단편을 프레임내 His6Tag에 의해 pET28a 벡터로 클로닝하여 전장 마우스 코어 DCN 및 ΔDCN 동형단백질을 제조하였다. His-Tag 키트(노바겐)로 His6 태그된 단백질을 정제하였다. ELISA 결합 검정을 위해, 100㎕의 10㎍/㎖의 표시된 His6-DCN 제제, His6-CLIC4(대조군 His6-단백질), NS0 세포 발현 마우스 DCN(알앤디 시스템즈), 정제된 소 DCN(시그마-알드리치) 또는 BSA를 코팅하고 4℃에서 밤새 맥시소브(Maxisorb) 면역플레이트(96웰; NUNC)에 고정하고, 이후 3% BSA로 차단하고, 이후 100㎕의 표시된 농도의 WAT7 또는 대조군 WAT2 펩타이드와 항온처리하였다. 아디포카인 결합 검정을 위해, HEK293 세포에서 생성된 FLAG 태그된 마우스 레지스틴(엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences)) 또는 대조군 FLAG-BAP 단백질(시그마-알드리치)을 표시된 농도에서 항온처리하였다. 결합 펩타이드 또는 FLAG-레지스틴을 상응하는 래빗 항펩타이드 게네메드 항체(1:2,000) 또는 래빗 항FLAG 항체(시그마-알드리치, 1:2,000), 이어서 2차 염소 항래빗 HRP 접합 항체(밀리포어, 1:5,000)로 프로빙하고, Ultra-TMB(피어스) 기질로 신호를 검출하고, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
기능 검정: 안정하게 형질도입된 세포주를 생성하기 위해, 전장 마우스 코어 DCN 및 ΔDCN 동형단백질을 코딩하는 cDNA(오리젠) 단편을 pLVX-AcGFP-C1 벡터(클론테크(Clontech))로 클로닝하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 렌티-X HTX 패키징 시스템을 사용하여 렌티바이러스를 렌티-X 293T 세포에서 제조하였다. 렌티바이러스 운반 벡터 단독, DCN, 또는 ΔDCN을 사용하여 NIH3T3-L1 세포(ATCC)를 형질도입하였다. 72시간 후, 세포를 4일 내지 5일 동안 2㎍/㎖의 푸로마이신으로 처치하여 안정한 세포주를 선택하고, 이 세포주를 이후 0.5㎍/㎖의 푸로마이신을 포함하는 배지 중에 유지시켰다. MTT 검정에 의한 세포 증식을 측정하기 위해, 동일 수(5,000개의 세포)의 초기 계대배양 렌티바이러스 형질도입물(P2)을 96웰 플레이트에서 평판배양하였다. 표시된 시점에서, 세포를 37℃에서 4시간 동안 셀티터-블루(CellTiter-Blue) 시약(프로메가(Promega))으로 처치하고, 이후 560 방출 및 590 여기 파장에서 형광을 측정하였다. 기재된 바대로(Nie, et al., 2008(상기 참조)) 트랜스웰 검정에 의해 세포 이동을 측정하기 위해, 세포를 2시간 동안 DMEM/0.1% FBS 중에 굶기고, 이후 25,000개의 세포를 트랜스웰 인서트(5μM 기공 크기)에서 동일한 배지에서 시딩하였다. 인서트를 DMEM/10% FBS를 포함하는 하부 챔버의 상부에 위치시키고, 세포를 12시간 동안 트랜스웰의 하부로 이동시키고, 고정하고, 헤마톡실린/에오신으로 염색하고 계수하였다. 3T3-L1 안정한 세포주(60,000개의 세포/웰)를 12웰 플레이트에 평판배양하였다. 문헌[Nie, et al., 2008(상기 참조)]에 기재된 바대로 포화(confluence) 2일 후 지방생성을 유도하고, 0.5mM IBMX, 1.7mM 인슐린, 1uM 덱사메타손 및 0.2mM 인도메타신을 포함하는 DMEM/10% FBS를 첨가하고, 72시간 후 2일마다 재공급되는 1.7mM 인슐린을 포함하는 DMEM/10% FBS로 대체하였다.
통계 분석: 스튜턴츠 t 시험을 이용하여 수행하고 유의성은 P<0.05로 배정되었다.
실시예 1: ASC 귀소 펩타이드의 확인
C34+CD31-CD45- 면역표현형(도 8b)에 기초한 장기 세포 현탁액으로부터의 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 MSC의 단리 방법을 파지 디스플레이와 조합하고 ASC에 대해 최적화하였다. (Kolonin et al., 2006(상기 참조))의 이미 기재된 "동기적 생체내 바이오패닝(synchronous in vivo biopanning)" 방법을 채택하여, 사이클릭 CX7C, CX8C 및 CX9C(C: 이황화 결합 시스테인; X: 임의의 아미노산) 무작위 펩타이드 라이브러리의 혼합물을 스크리닝하였다(도 1a). 이 접근법은 1011개의 조합 펩타이드에 걸쳐 풀로부터 MSC 프로브를 선택하는 것이 가능하게 한다. 스크린에 걸쳐, WAT, 및 폐, 골수 및 골격근의 선택된 대조군 장기로부터 MSC에 회수된 파지 입자의 수가 점진적으로 풍부해짐(도 1b)이 관찰되었다.
펩타이드 인서트를 코딩하는 DNA의 서열분석은 CX7C 및 CX8C 라이브러리로부터의 클론의 선택을 나타내고, CX9C 라이브러리로부터의 클론은 가능하게는 pIII 단백질에서의 더 긴 펩타이드 인서트를 포함하는 파지의 전파 단점으로 인해 주로 손실된다.
4회의 동기적 생체내 바이오패닝 후, 1% 초과의 빈도로 ASC로부터 반복해서 회수된 8개의 CX7C 및 CX8C 서열을 확인하고, 이를 WAT1 내지 WAT8이라 칭했다(하기 표 1 참조). 동시에, 폐 기질 세포(LSC)로 귀소하는 일치하는 수의 펩타이드 인서트를 대조군으로서 서열분석하였다. WAT 귀소 펩타이드 중 어느 것도 폐에서 풍부하지 않았다. 1% 초과의 빈도로 폐에서 반복해서 회수된 4개의 서열을 LU1 내지 LU4라 칭했다(하기 표 1 참조). 각각의 파지 클론의 생체내 비교 분석은 ASC에 대해 가장 높은 특이성을 갖는 펩타이드로서 LSC보다 1,000배 많게 ASC로 귀소하는 WAT7를 나타냈다(도 1c). 클론 WAT8은 SPARC를 모방하는 이미 규명된 펩타이드인 mPep와 유사한 수준에서 LSC와 비교하여 ASC에 대한 가장 적절한 선호도를 나타냈다(Nie, et al., 2008(상기 참조)). 이러한 관찰과 일치하게, WAT8 펩타이드의 서열(CGQWLGNWLC: 서열 번호 15)은 mPep(CWLGEWLGC: 서열 번호 35)와 유사한 것으로 밝혀졌고, 이는 WAT8 펩타이드에 대한 유사한 수용체로서 MSC의 이미 확립된 마커인 인터그린 β1을 나타낸다. 이 연구의 중점은 WAT 특이적 MSC이므로, 이 클론은 추가의 분석으로부터 배제되었다. 다른 선택된 펩타이드를 생체내 경쟁 검정으로 처리하여 가장 높은 결합 특이성을 갖는 것을 확인하였다. WAT1 내지 WAT7(서열 번호 1-14) 및 LU1 내지 LU4(서열 번호 17 내지 24)를 디스플레이하는 11개의 클론 펩타이드에 대한 동량의 파지를 혼합하고 마우스에 주사하였다. WAT 또는 폐로부터 단리된 C34+CD31-CD45- 세포에 선택된 각각의 펩타이드를 코딩하는 파지의 빈도를 정량화함으로써 각각의 클론의 귀소 특이성을 평가하였다. 상기 데이터(도 1c)와 일치하게, 펩타이드 WAT7은 WAT 세포로 재귀소하는 이의 현저한 성능에 기초하여 두드러지고: 이는 WAT로부터 87.4%의 클론이 회수되고 폐로부터 불과 5.8%의 클론이 회수되었다는 것을 나타낸다. 상호적으로, 클론 LU-1 및 LU-2는 WAT로의 재귀소가 아니라 폐(각각 52.2% 및 40.2%)로의 재귀소를 나타냈다(하기 표 1 참조).
실시예 2: 펩타이드 표적 ASC로서의 WAT7(서열 CSWKYWFGEC 및 SWKYWFGE(서열 번호 13 및 14))의 검증
조합된 귀소 데이터에 기초하여, 추가의 분석을 위해 가장 확정적인 ASC-표적을 나타내는 펩타이드 WAT7(서열 CSWKYWFGEC: 서열 번호 13)을 선택하였다. WAT가 아니라 폐에서 대조군 펩타이드 표적 MSC로서 펩타이드 LU2(서열 CESGFPTVGC 서열 번호 19)를 선택하였다. 정맥내 주사시 마우스 조직에서의 WAT7 디스플레이 파지의 생물분포를 분석함으로써 WAT7의 귀소를 검증하였다. 마우스 조직 절편에서의 면역형광법은 파지 축적이 폐(도 2b) 또는 다른 대조군 장기가 아니라 WAT(도 2a)의 기질/맥관구조와 관련된다는 것을 나타낸다. 상호적으로, LU2 축적은 WAT(도 2c)가 아니라 폐(도 2d)의 기질/맥관구조와 관련된다. 파지 상황 밖에서 귀소하는 펩타이드의 성능을 검증하기 위해, 이황화 결합 시스테인에 의해 플랭킹된 화학적으로 합성된 사이클릭 WAT7 및 LU2를 바이오티닐화하였다. 각각의 펩타이드를 마우스로 정맥내 투여한 후, WAT에 대한 WAT7의 선택도를 재생성하는 스트렙타비딘 접합 형광단으로 조직을 면역형광법 분석하였다(도 2). 각각 내피 세포 및 주피세포를 동정하는 CD31 특이적 항체 및 PDGFRβ 특이적 항체에 의한 동시 염색을 수행하여 표적 세포 집단을 확인하였다. 공초점 영상화는 ASC로서 이미 확립된 PDGFRβ+세포(도 2e 내지 도 2g)와 회합된 WAT7의 혈관주위 국재화를 나타낸다(문헌[Traktuev, et al., 2008(상기 참조)] 참조). 중요하게, WAT7은 WAT를 침윤하는 내피 세포(도 3e) 또는 CD45+ 조혈 세포(도 2h)에 의해 동시 국재화되지 않았다. 파지 생물분포에서의 데이터와 일치하게, WAT7 펩타이드는 PDGFRβ 면역형광법에 의해 확인된 MSC의 풍부함에도 불구하고(도 2j) 주사된 동물의 폐에서 관찰되지 않았다(도 2i). 생체내 귀소 데이터와 일치하게, 파지 디스플레이 WAT7은 동일한 동물로부터 단리된 LSC가 아니라 계대배양되지 않은 1차 ASC, 또는 3T3-L1 마우스 전지방세포 및 4T1.2 마우스 선암종 세포에 대한 높은 수준의 특이적 결합을 나타냈다(도 9).
실시예 3: WAT7 수용체의 단리
ASC 귀소 펩타이드에 대한 수용체를 확인하기 위해 WAT7 친화도 크로마토그래피 방법을 이용하였다. 막 단백질을 마우스 WAT의 SVF로부터 추출하고 이의 카르복실 말단을 통해 수지에 공유 결합된 시스테인 고리화 합성 WAT7에 적용하였다. WAT2 펩타이드(서열 CYKNVDSGGC: 서열 번호 3)에 의한 용리를 처음에 이용하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하였다(도 3a). 이후, 특이적으로 결합된 단백질을 WAT7로 용리하고 분획의 별도의 하위세트로 나타났다. WAT2 펩타이드 친화도 칼럼을 동시에 사용하여 친화도 정제 단백질의 특이성을 확인하였다. 파지-펩타이드 결합을 위해 플라스틱에 코팅된 탈염된 용리물의 시험은 이 분획이 대조군 WAT2 디스플레이 파지가 아니라 WAT7 디스플레이 파지에 대한 단백질 결합을 포함한다는 것을 확인시켜준다(도 3b). WAT2가 로딩된 대조군 친화도 칼럼으로부터 WAT7로 용리되고 동일한 막 단백질 추출물에 노출된 분획은 WAT7 디스플레이 파지에 결합하지 않았다(도 3b). 풀 다운된 단백질을 포함하고 WAT7로 특이적으로 용리된 5 분획은 WAT7 디스플레이 파지에 의해 가장 높은 수준의 결합을 나타내고 수용체 정제에 선택되었다. 이 분획에서 용리된 단백질을 농축하고 변성 구배 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분해하였다. 대조군 펩타이드 WAT2가 아니라 WAT7로 특이적으로 용리된 밴드는 대략 40kDa에서 이동하였다(도 3c). 이 밴드의 질량 분광 분석은 이것이 대안적으로 프로테오글라이칸 II로 공지된 데코린(DCN)을 포함한다는 것을 나타낸다.
DCN은 세포외 매트릭스(ECM)로 분비된 광범위하게 연구된 분자이고 몇몇 생리학적 과정을 조절한다. 이의 편재된 mRNA 발현은 WAT에서 ASC로 귀소하는 WAT7과 불일치하게 나타났다. 따라서, 마우스 장기에서 DCN 단백질 수준을 분석하기 위해, 일단의 마우스 조직 절편을 전장 글라이코실화 마우스 DCN에 대해 키운 상업적으로 구입 가능한 항체에 의해 공초점 면역형광법으로 처리하였다. 문헌[Bolton et al., 2008 (Int. J. Obes. 32: 11 13-1121, 2008)]에 의한 이전의 연구와 일치하게, DCN 단백질은 많은 장기에서 검출 가능하지만, 폐 및 골수와 비교하여 WAT에서 특히 많이 풍부하였다(도 4a 내지 도 4c). 이는 동시에 동일한 절편에서 평가된 바대로 모든 장기(도 4d 내지 도 4f)에서 비슷한 PDGFRβ의 발현과 놀랍게도 대조된다. WAT에서의 DCN 및 PDGFRβ의 패턴은 구별 가능하지 않고, CD31 양성 내피세포를 둘러싸는 혈관주위 세포에 대한 각각의 단백질의 국재화는 WAT에서의 대부분의 DCN이 ASC에 의해 생성된다는 것을 나타낸다(도 4a 및 도 4d). 그러나, 폐(도 5b) 및 몇몇 다른 장기(데이터 비도시)에서의 하위세트의 혈관의 혈관주위 세포에 의한 DCN 발현의 검출은 MSC의 상이한 하위집단에 의한 DCN 발현 수준의 차이가 ASC로 귀소하는 WAT7을 설명하기에 충분하지 않을 수 있다는 것을 제시한다.
WAT에서의 비글라이코실화 DCN의 발현을 규명하기 위해, 마우스 조직으로부터의 단백질 추출물을 전장 마우스 DCN에 대해 키운 다중클론 항체로 면역블로팅하였다(도 5a). WAT의 SVF 분획, 및 폐 및 골수로부터의 사이토졸 단백질의 분석은 이 장기에서의 고분자량 글라이코실화 DCN 동형단백질의 상당한 발현을 나타낸다. 반대로, WAT는 더마탄/콘드로이틴 설페이트 글라이코사미노글라이칸(GAG) 사슬이 결여된 약 40kDa의 비글라이코실화 코어 DCN의 발현 증가를 나타낸다(도 5a). 흥미롭게도, 3개의 장기로부터의 막 단백질의 면역블롯 분석은 다른 장기에서 이전에 규명된 비글라이코실화 코어 DCN보다 분자량이 낮은 DCN 동형단백질의 WAT 특이적 발현을 나타낸다(Imai et al., Biochem. J. 322 (Pt 3), 809-814, 1997; Roughley et al., Biochem. J. 318 (Pt 3): 779-784, 1996). 폐 및 골수에서의 이 DCN 동형단백질 발현의 부재는 단백질 로딩을 제어하기 위해 사용되는 대조군 막 단백질인 아넥신 II(ANX2A)에 대한 항체로 프로빙된 동일한 블롯으로부터 명확하다(도 5a). 면역블로팅을 또한 이용하여 WAT에서의 어떠한 세포가 저분자량 DCN 동형단백질을 발현하는지를 규명하였다. 이러한 발견은 이것이 분화된 지방세포가 아니라 ASC의 (사이토졸을 갖지 않는) 막 분획과 오로지 회합된다는 것을 나타낸다(도 16a).
실시예 4: 새로운 DCN 동형단백질은 CSWKYWFGEC(서열 번호 13) 수용체이다.
ΔDCN이라 칭하는 WAT 특이적 DCN 동형단백질을 확인하기 위해, DCN 항체를 사용하여 WAT로부터 단리된 SVF의 마우스 막 추출물로부터 DCN을 정제하였다. 변성 PAGE에 의한 면역침강된 단백질의 분석은 ΔDCN에 상응하는 예상된 40kDa의 밴드를 나타냈다(도 5b). 밴드로부터 절단된 단백질의 에드먼 분해 마이크로서열분석은 이 DCN 단편이 Leu-45에서 시작하고(도 5c), 따라서 프로펩타이드 분해 후 생성된 이전에 기재된 성숙 코어 DCN보다 짧은 14개의 아미노산이라는 것을 나타낸다(Imai et al., 1997(상기 참조); Roughley et al., 1996(상기 참조)). 따라서, ΔDCN은 코어 DCN에 존재하는 GAG 부착 자리 SerGly가 소실되었으므로 글라이코실화될 수 없다(도 5c)(Scholzen et al., J. Biol. Chem. 269: 28270-28281, 1994). ΔDCN이 소실된 코어 DCN 서열에서의 메티오닌의 결여는 ΔDCN이 대안적인 스플라이싱에 의해서보다 단백질분해에 의해 생성된다는 것을 나타낸다.
WAT7의 표적으로서 DCN을 검증하기 위해, His6 태그된 단백질을 사용하는 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 사용하였다. 이 실험실내 결합 연구는 재조합 박테리아 정제 마우스 DCN에 대한 WAT7의 명확한 용량 의존적 결합을 나타내고, 대조군 펩타이드 WAT2는 DCN 결합을 나타내지 않았다(도 16b). 흥미롭게도, WAT7은 소 혈청 알부민(BSA)에 관찰된 배경보다 높은 수준에서 상업적으로 구입 가능한 글라이코실화 소 DCN에 결합하지 않았다. ΔDCN을 포함하는 추가의 분석은 WAT7이 ΔDCN 및 박테리아로 발현된 (따라서 비글라이코실화된) DCN 코어 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다(도 5d). 배경 BSA 결합 위의 소 또는 마우스 글라이코실화 DCN에 대한 WAT7 결합의 결여(도 5d)는 성숙 DCN에서의 GAG 사슬이 WAT7 결합을 방해한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 WAT 이외의 장기에서 ECM으로의 글라이코실화 DCN의 편재된 분비(Reed and Iozzo, Glycoconj. J. 19: 249-255, 2002)가 왜 WAT7 펩타이드의 WAT 귀소를 방해하지 않는지를 설명할 수 있다.
WAT7에 대한 수용체로서 작용하기 위해, ΔDCN은 ASC의 표면에 노출되어야 한다. SVF의 전체 막 제제로부터 식물세포막 단백질 분획을 단리함으로써, ΔDCN이 ASC의 세포막과 회합된다는 것이 입증되었다(도 5e). 또한 ΔDCN이 ASC에서 디스플레이된다는 것을 확인시켜 주는 대안적인 접근법을 이용하여, 새로 단리된 WAT SVF 세포의 표면 단백질을 기재된 바대로 바이오티닐화하고(Kolonin et al., 2004(상기 참조)), 이후 바이오티닐화 단백질을 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단리하고 항DCN 면역블로팅하였다. 예상된 바대로, ΔDCN이 단리되었고, 이는 세포 표면과의 이의 회합을 나타낸다(도 5f). 흥미롭게도, MSC/ASC 전파에 통상적으로 사용되는 조건에서 플라스틱 위의 WAT SVF 세포를 밤새 배양하면 세포 표면 단백질 풀로부터 ΔDCN이 사라졌다(도 5f). 이는 생체내 발생하는 세포 표면 위의 ΔDCN의 노출이 세포 배양물에서 보유되지 않는다는 것을 나타낸다. 마지막으로, 3T3-L1 전지방세포에서 발현된 녹색 형광 단백질(GFP)과 재조합으로 융합된 ΔDCN의 세포 국재화가 렌티바이러스를 사용함으로써 입증되었다(도 5g). 대조군 벡터 형질도입 세포는 주로 핵 GFP 신호를 나타냈고, 이 신호는 전장 DCN-GFP 융합을 발현하는 세포에서 세포질로 재분포되었다. 반대로, ΔDCN-GFP를 발현하는 세포는 세포 표면 결합 SPARC의 패턴을 닮은 현저히 명확한 국재화 패턴을 나타냈고(Nie et al., 2008(상기 참조)), 이는 세포막 ΔDCN 국재화를 확인시켜준다.
실시예 5: ΔDCN의 ASC 상호작용자로서의 레지스틴
본 발명자들에 의한 선행 연구에 의하면 펩타이드가 수용체에 대한 생물학적 리간드의 수용체 결합 도메인을 모방함으로써 세포 표면 수용체를 인지하는 경향이 있는 것으로 나타났다. 따라서, WAT7-ΔDCN 결합 이외의 생물학적 상호작용을 규명하고 ΔDCN의 생물학적 리간드를 확인하기 위해, 래빗을 KLH-펩타이드 접합체로 면역화하여 WAT7에 대해 항체를 생성시키고, 이 접합체는 WAT7이 모방하는 마우스 단백질의 결합 에피토프를 인지하는 것으로 예상되었다. 도 6a는 생성된 WAT7 항체가 WAT7에 대해 높은 특이성을 갖고 스크린에서 단리된 다른 임의의 ASC 귀소 펩타이드를 인지하지 않는다는 것을 나타낸다. 마우스 단백질 추출물의 면역블로팅으로 WAT7 항체가 인지하는 약 13kDa의 단백질을 확인하였다(도 6b). 이 단백질은 폐 또는 골수에서가 아니라 WAT 조직으로부터의 새로 단리된 SVF에서 매우 풍부하였다. 흥미롭게도, MSC/ASC 전파에 통상적으로 사용되는 조건에서 플라스틱에서 밤새 ASC를 배양함으로써 이의 발현이 소실되었다(도 6b). 이러한 소실은 배양물에서의 ΔDCN 세포 표면 발현 소실과 일치하여(도 5f), ASC에서의 ΔDCN 노출이 이의 리간드의 발현과 커플링된다는 것을 제시한다.
프로테인 A/G 비드에 고정된 항WAT7 면역글로불린(IgG)을 사용하여 ΔDCN 리간드를 단리하고 SFV 단백질 추출물에서의 친화도 크로마토그래피하였다. 친화도 포획의 생성물을 PAGE에 의해 분해하고(도 6c), 이후 약 13kDa의 밴드를 절단하였다. 질량 분광학은 WAT 분비 아디포카인으로서 기능하는 것으로 공지된 레지스틴(ADSF)으로서의 단백질을 확인시켜준다(Steppan et al., Nature 409: 307-312, 2001; Kim et al., J. Biol. Chem. 276: 1 1252-1 1256, 2001). DCN과의 레지스틴 상호작용이 이전에 보고되지 않았으므로, ΔDCN과의 상호작용을 직접 확인하기 위해, FLAG 태그된 마우스 레지스틴으로 실험실내 결합 검정을 수행하였다. FLAG 태그된 소 알칼리 포스파타제(BAP)는 음성 대조군으로서 작용하였다(도 6d). 레지스틴은 전장 DCN보다 100배 낮은 몰 농도로 ΔDCN에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 이의 비슷한 배경 BSA 및 BAP 결합으로부터 명확한 것처럼, 글라이코실화 마우스 또는 소 DCN에 대한 결합에 있어서 이는 완전히 비효과적이었다. 이 결과는 레지스틴이 ΔDCN의 리간드로서 작용한다는 것을 나타낸다.
3T3-L1 세포주로부터의 세포는 지방세포 전구체의 생물학을 연구하는 데 있어서 널리 인정되는 모델이고 ΔDCN의 기능을 규명하기 위해 사용되었다. 확립된 3T3-L1 배양물을 렌티바이러스로 ΔDCN-GFP 또는 전장 DCN-GFP 융합으로 형질도입하였고; 대조군으로 GFP 벡터를 단독으로 사용하였다(도 5g). MTT 검정을 이용한 배양에서 24시간 및 48시간 후 세포수 증가 분석은 GFP 또는 전장 DCN-GFP를 발현하는 세포와 비교하여 ΔDCN을 발현하는 세포 증식 증가를 나타낸다(도 7a). 보이든(Boyden) 챔버 트랜스웰 검정을 이용한 세포 이동 분석은 ΔDCN 발현 세포의 상당한 침습성 증가를 나타내고, 전장 DCN을 발현하는 세포는 GFP를 발현하는 세포와 비교하여 반대 경향을 나타냈다(도 7b). 이 결과는 실험실내 긁힌 상처 검정에 의해 확인되었다(데이터 비도시). 마지막으로, 세포 분화에 미치는 효과를 시험하기 위해 세포를 지방생성 유도하였다(도 7c).
실시예 6: 추가의 펩타이드 및 인간 조직에 대한 결합 증거
파지 디스플레이에 의한 마우스 장기의 MSC로 귀소하는 펩타이드의 선택이 동기적 생체내 파지 디스플레이 스크리닝 공정의 도식 설명을 포함하는 도 8a에 도시되어 있다. 매번의 선택 회차에서, 파지를 정맥내 투여하고 동시에 표적 조직으로부터 회수하고, 증폭하고 이후 풀에 넣고 다음 선택 실행에 사용하였다. 나중 실행에서의 파지 형질전환 단위(TU)의 회수 증가는 표적 장기로 우선적으로 귀소하는 펩타이드의 선택을 반영한다.
도 8b는 유세포계수법을 이용한 MSC의 확인을 나타낸다. 대표적인 피하 WAT 분석이 도시되어 있다. CD34+에 양성인 생존 세포의 등급화(왼쪽 산포도)를 처음에 수행하고, 이후 CD31 및 CD45의 발현(오른쪽 산포도)에 기초하여, ASC 세포와 조합되어 원래의 산포도의 Q3에서 드문 자주색 사건으로서 나타나는 CD34+CD45-CD31- 세포로서 확인되었다. Q1에서 나타나는 자주색 사건은 CD34+CD45-CD31+ 상피 세포(EC)에 해당하였다. Q2 및 Q4에서 나타나는 사건은 CD45+ 조혈 세포에 해당하였다.
일련의 펩타이드 클론을 확인하고 하기 표 1에 기재된 바대로 지방 줄기 세포(ASC) 및 폐 줄기 세포(LSC)에서의 파지 디스플레이 스크린을 이용하여 풍부하게 하였다.
Figure pct00001
CD34+CD31-CD45- 세포에서의 4회의 동기적 생체내 바이오패닝 후 WAT 또는 폐 내에 존재하는 표시된 WAT 인서트(WAT에서의 %) 또는 LU 인서트(폐에서의 %)를 운반하는 서열분석된 파지 클론의 백분율(%)이 상기 표 1에 도시되어 있다.
각각의 클론의 선택도를 나타내기 위해, 클론 WAT1, WAT2, WAT3, WAT4, WAT5, WAT6, WAT7, LU1, LU2, LU3 및 LU4에 대한 동량의 파지를 혼합하고 마우스에 주사하여 몇 퍼센트가 복귀(재귀소)하였는지를 결정하고, 이는 WAT 또는 폐로부터 단리된 C34+CD31-CD45- 세포에서 표시된 WAT 인서트(WAT로의 재귀소(%)) 또는 LU(폐로의 재귀소(%)) 인서트를 운반하는 서열분석된 파지 클론의 백분율(%)을 나타낸다.
파지-세포 결합 검정을 이용하여 파지 디스플레이 스크린에서 단리된 몇몇 펩타이드의 선택도를 평가하였다. 펩타이드 WAT1, WAT2, WAT7, LU2, mPep 또는 Fd-Tet를 발현하는 파지를 (1) 인간 유방 암종으로부터 유도된 내피 세포인 4T1.2 세포; (2) 마우스 3T3-L1 세포(지방세포양 표현형으로 분화될 수 있는 지방전구 세포주); (3) WAT로부터의 1차 마우스 SVF 세포; (4) 폐로부터의 1차 마우스 SVF 세포; 및 (5) WAT로부터의 인간 ASC 세포의 4회 계대배양(원래 지방흡입 동안 얻어짐)에 대한 결합에 대해 평가하였다. 표적 세포를 2.5mM EDTA로 탈착하고 100,000개의 세포를 1% BSA를 포함하는 RPMI 0.2㎖ 중에 재현탁하였다. 파지 대조군(삽입물 없음) Fd-tet와 함께 파지를 발현하는 표시된 펩타이드를 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다(108개의 TU). 1% BSA를 포함하는 RPMI로 3회 세척 후, 세포를 균질기로 다우싱하였다. 회수된 파지를 사용하여 K91 이 콜라이를 감염시키고, 테트라사이클린 선택 후, 콜로니를 계수하여 평균 형질전환 단위(TU)를 정량화하였다. 3개의 개별 평판배양±표준오차(오차막대)에 대한 평균 값이 도 9a에 도시되어 있다. 도 9a에 제시된 발견을 생성하기 위해 사용되는 인간 ASC는, 사용될 때, 4회 계대배양되어 이 세포에 대한 WAT7 결합을 나타냈다. ΔDCN이 새로 단리된 마우스 ASC에 선택적으로 결합하고 반복하여 계대배양된 마우스 ASC에 잘 결합하지 않으므로, ΔDCN/WAT7 표적 시스템에서의 이러한 선호도가 보존된다고 가정되었다.
실제로 WAT7가 계대배양되지 않은 인간 ASC에 결합한다는 것을 나타내기 위해, 새로운 인간 ASC를 표적 조직으로서 사용하였다(각각의 파지 발현된 펩타이드의 결합이 도 9b에 도시된 도시되어 있다). 따라서, 이는 WAT7가 WAT1 및 WAT2 펩타이드보다 잘 계대배양되지 않은 결합 인간 ASC에 결합한다는 것을 나타낸다. 이 활성은 새로 단리된 마우스 ASC에 대한 WAT 귀소 펩타이드의 패턴을 반영하고, 이는 DCN 생물학이 보존되고 델타-DCN/WAT7 표적 시스템이 인간을 비롯한 다른 포유동물 피험체에서 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 7: 세포독성 펩타이드 및 펩타이드 조성물의 생체내 활성의 증거
표적된 아미노헥산산 결합 세포독성 단백질분해 저항 모든-D-거울상이성질체 펩타이드를 관심 있는 세포 집단의 선택적 생체내 결핍에 대해 설계하였다. 이 펩타이드는 합성이고, 관심 있는 세포에서 분화 발현된 수용체에 결합하는 귀소(세포 표적) 도메인(이 특정 예에서는 사이클릭 WAT7(서열 번호 13)) 및 펩타이드를 내입시키는 세포의 아폽토시스 사멸을 유도하는 세포독성 도메인의 2개의 기능적 도메인으로 이루어진다. 귀소 펩타이드는 아미노산 길이가 통상적으로 7개 내지 8개이고 환형이다(2개의 이황화 결합된 시스테인에 의해 구속됨). 세포독성 도메인은 수용체 매개 세포 내입시 미토콘드리아 막을 파괴하고 프로그래밍된 세포사(아폽토시스)를 야기하는 양친매성 펩타이드 서열 KLAKLAKKLAKLAK(서열 번호 31) 지정 (KLAKLAK)2이다. 도메인 둘 다에서의 모든 아미노산은 생체내 단백질분해에 저항하는 D-거울상이성질체여서, 전신 투여시 펩타이드의 장기간 효과를 허용한다. 2개의 도메인을 연결하는 링커는 아미노헥산산(Ahx): NH-(CH2)5-CO이고, 이는 또한 생체내 프로테아제에 의한 분해에 저항한다. 생성된 키메라 펩타이드(도 10에 도시됨)는 셀텍에 의해 제조된 WAT7(서열 번호 13)-KLAKLAK2(서열 번호 31) 단백질 조성물이다. 본원에서 소개된 조성물 설계에 기초하여 설계되고 제조된 펩타이드를 마우스에 전신 주사하여 세포 집단을 선택적으로 결핍시키는 세포독성 펩타이드 조성물의 활성을 입증하였다. 백색 지방(지방) 조직(WAT)에서의 펩타이드 표적 지방 기질/줄기 세포(ASC)를 사용하여 이러한 기술을 검증하였다. 도 11에 도시된 바대로, 트립판 블루 염료 배제 염색을 사용하여 입증된 바대로 1차 마우스 ASC를 농도 의존적 방식으로 WAT7-KLAKLAK2로 처치하여 효과적으로 사멸하였다(도 11). 유세포계수법 및 APO-트레이스 시약(시그마)을 사용하여, 아폽토시스의 유도의 증거를 확립하여, 세포독성 펩타이드 노출에 의해 유도된 세포사 메커니즘으로서 아폽토시스를 검증하였다(도 12).
도 13에 도시된 마우스에 의해 입증된 바대로, 비만 마우스에 2㎎ WAT7-KLAKLAK2 모든-D-펩타이드를 주사하여 복강내 지방 조직에서의 확실한 감소를 발생시켰다. 주사 48시간 후 입증된 바대로 아폽토시스 세포사를 통한 ASC의 표적된 결핍으로 인해 이렇게 감소하였다(도 14 참조). 피하 WAT에 존재하는 ASC의 양은 표적된 세포독성 펩타이드인 WAT7-KLAKLAK2 모든-D-펩타이드에 의한 처치에 의해 감소하였고(E 패널 대 F 패널), 복강내 WAT에 존재하는 ASC의 양은 심지어 더 크게 감소하였고(G 패널 대 H 패널), 이는 또한 상부 패널(A 패널 대 B 패널)에 도시된 바대로 또는 형광(C 패널 대 D 패널)으로 나타낸 종양 감소에 의해 입증된 바대로 종양 괴사를 발생시켰다. 도 15는 표적된 세포독성 펩타이드인 WAT7-KLAKLAK2 모든-D-펩타이드에 의한 처치가 피하 및 복강내 지방 조직 둘 다(왼쪽 측 패널)에 존재하는 ASC에서 아폽토시스 세포사를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 반대로, 처치된 마우스의 신장 또는 말초 혈액으로부터 얻은 세포에서 아폽토시스 세포사가 확인되지 않았고(도 15의 오른측 패널), 이는 아폽토시스 유발 펩타이드가 키메라 표적된 펩타이드 단백질 조성물의 표적 부분으로부터의 단백질분해에 의해 방출되지 않는다는 것을 나타낸다. 펩타이드 용량이 증가하면서 MTD가 도달되지 않았다. 이는 상기 기재된 방법에 의해 구성된 세포독성 표적 펩타이드가 단백질분해에 저항하고 생체내 사용되어 ASC를 성공적으로 표적화하고 사멸하고 지방 조직을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
추가의 수고 없이, 당업자라면, 본원의 설명을 이용하여, 본 방법을 이의 완전한 정도로 이용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에 기재된 실시양태는 예시이고 임의의 어떠한 방식으로든 개시내용의 나머지를 구속하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 바람직한 실시양태가 도시되고 기재되어 있지만, 현재 개시된 방법의 정신 및 교시로부터 벗어나는 일 없이 당업자라면 이의 많은 변경 및 변화를 만들 수 있다. 따라서, 보호 범위는 상기 기재된 설명에 의해 제한되지 않지만, 특허청구범위의 대상의 모든 등가물을 비롯하여 특허청구범위에 의해서만 제한된다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시내용은 본원에 기재된 것과 일치하고 이에 보충적인 절차 또는 다른 상세내용을 제공하는 정도로 본원에 참조문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING ADIPOSE TISSUE IN MAMMALS <130> WO2012/135729 <140> PCT/US2012/031623 <141> 2012-03-30 <150> US 61/469,345 <151> 2011-03-30 <160> 36 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Cys Lys His Tyr Gly Gly Gly Val Ala Cys 1 5 10 WAT1 peptide (sequence CKHYGGGVAC: SEQ ID NO: 1) <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 2 Lys His Tyr Gly Gly Gly Val Ala 1 5 10 Non cysteine-cyclized WAT1 peptide (sequence KHYGGGVA: SEQ ID NO: 2) <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 3 Cys Tyr Lys Asn Val Asp Ser Gly Gly Cys 1 5 10 WAT2 peptide (sequence CYKNVDSGGC: SEQ ID NO: 3) <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 4 Tyr Lys Asn Val Asp Ser Gly Gly 1 5 10 Non 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 15 Cys Gly Gln Trp Leu Gly Asn Trp Leu Cys 1 5 10 WAT8 peptide (CGQWLGNWLC: SEQ ID NO: 15) <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 16 Gly Gln Trp Leu Gly Asn Trp Leu 1 5 10 Non cysteine-cyclized WAT8 peptide (GQWLGNWL: SEQ ID NO: 16) <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 17 Cys Ala Val Tyr Arg Ser Thr Gly Cys 1 5 10 Peptide LU-1 (sequence CAVYRSTGC: SEQ ID NO: 17) <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 18 Ala Val Tyr Arg Ser Thr Gly 1 5 10 Non cysteine-cyclized Peptide LU-1 (sequence AVYRSTG: SEQ ID NO: 18) <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 19 Cys Glu Ser Gly Phe Pro Thr Val Gly Cys 1 5 10 Peptide LU-2 (sequence CESGFPTVGC: SEQ ID NO: 19) <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 20 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CKGGRAKDC (SEQ ID NO: 25) <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 26 Lys Gly Gly Arg Ala Lys Asp 1 5 Non cysteine-cyclized KGGRAKD (SEQ ID NO: 26) <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 27 Cys Ala Arg Ala Cys 1 5 CARAC (SEQ ID NO: 27) <210> 28 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 28 Ala Arg Ala 1 5 Non cysteine-cyclized ARA (SEQ ID NO: 28) <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 29 Cys Gly Asp Lys Ala Lys Gly Arg Cys 1 5 10 CGDKAKGRC (SEQ ID NO: 29) <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 30 Gly Asp Lys Ala Lys Gly Arg Cys 1 5 10 Non cysteine-cyclized GDKAKGRC (SEQ ID NO: 30) <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 31 Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 1 5 10 KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO: 31) <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 32 Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala 1 5 10 (KLAKKLA)2 (SEQ ID NO: 32) <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 33 Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala 1 5 10 (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 33) <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 34 Lys Leu Gly Lys Lys Leu Gly Lys Leu Gly Lys Lys Leu Gly Lys Leu Gly Lys Lys Leu Gly 1 5 10 15 20 (KLGKKLG)3 (SEQ ID NO: 34). <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 35 Cys Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gly Cys 1 5 mPep CWLGEWLGC (SEQ ID NO:35) <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 36 Trp Leu Gly Glu Trp Leu Gly 1 5 Non cysteine-cyclized mPep WLGEWLG (SEQ ID NO: 36)

Claims (36)

  1. 표적 펩타이드로서, 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하되, 상기 펩타이드는 기질 세포에 결합하는 것인 표적 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열 번호 13 및 서열 번호 14의 WAT7 아미노산 서열 SWKYWFGE를 포함하는 것인 표적 펩타이드.
  3. 제1항의 표적 펩타이드를 포함하는 단백질 조성물.
  4. 제2항의 WAT7 아미노산 서열을 포함하는 단백질 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 펩타이드는 전부 D-아미노산으로 이루어진 것인 표적 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 WAT7은 D-아미노산으로 이루어지고, 상기 조성물은 지방 조직, 섬유성 조직 또는 종양 조직에서 기질 세포에 결합하는 것인 단백질 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 WAT7은 ASC 세포의 표면 위의 ΔDCN에 선택적으로 결합하는 것인 단백질 조성물.
  8. 제3항에 있어서, 상기 표적 펩타이드는 조영제; 세포독성 물질; 아폽토시스유도제(pro-apoptotic agent); 융합 단백질; 세포정지제(cytostatic agent); 살세포제(cytocidal agent); 방사성 동위원소; ACS 세포 분화제; 유사분열 억제제, 항종양제; 항생제, 효소; 화학치료제; 항혈관생성제 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 작동인자 물질(effector agent)에 커플링된 것인 단백질 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적 펩타이드 및 작동인자 물질은 D-아미노산으로 이루어진 것인 단백질 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 표적 펩타이드는 L-아미노산으로 이루어지고, 상기 작동인자는 D-아미노산을 포함하는 것인 단백질 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 표적 펩타이드는 L-아미노산으로 이루어지고, 상기 작동인자는 L-아미노산을 포함하는 것인 단백질 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드는 작동인자 물질에 커플링되어 백색 지방 조직이 갈색 지방 조직으로 전환되는 것을 유도하는 것인 단백질 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 작동인자 물질은 백색 지방 조직에서 b3-아드레날린 수용체를 활성화하는 것인 단백질 조성물.
  14. 제8항에 있어서, 상기 작동인자 물질은 D-아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것인 단백질 조성물.
  15. 지방 조직을 표적화하는 단백질 조성물을 제조하는 방법으로서,
    작동인자 물질을 표적 펩타이드에 커플링하는 단계를 포함하되, 상기 표적 펩타이드는 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고; 상기 표적 펩타이드는 세포 지방 조직을 선택적으로 표적화하는 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 작동인자 물질 및 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 작동인자는 L-아미노산으로 이루어지고; 상기 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 커플링하는 단계는 상기 작동인자 물질을 연결 모이어티에 의해 상기 표적 펩타이드에 연결하는 단계를 포함하는 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 연결 모이어티는 아미노헥산산; (CH2)4; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 작동인자 물질은 세포독성 물질; 아폽토시스유도제; 조영제 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 조성물의 제조방법.
  21. 지방 조직에 작동인자 물질을 전달하는 방법으로서,
    펩타이드에 커플링된 작동인자 물질을 포함하는 단백질 조성물을, 지방 조직을 포함하는 세포 집단에 노출시키는 단계를 포함하되, 상기 펩타이드는 아미노산 길이가 100 미만인 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 아미노산 서열은 서열 번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 지방 조직 표적 펩타이드 모이어티를 포함하는 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 단백질 조성물은 링커를 포함하는 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 표적 펩타이드 모티프는 D-아미노산으로 이루어진 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 작동인자 물질 및 상기 표적 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 물질은 세포독성 물질; 아폽토시스유도제; 조영제 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 물질은 D-아미노산으로 이루어진 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 노출시키는 단계는 피험체를 상기 단백질 조성물에 노출시켜 지방과다(adiposity) 관련 장애를 치료하는 것을 포함하고, 상기 장애는 비만; 섬유증; 암 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 세포 집단은 인간 피험체의 세포 집단인 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  29. 제21항에 있어서, 상기 세포 집단은 조직 박편인 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  30. 제21항에 있어서, 상기 지방 조직에 대한 단백질 조성물의 선택적 결합에 기초하여, 상기 집단의 지방 기질 세포를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 지방과다 관련 장애는 체성분 장애; 체중 장애; 비만; 지방이상증; 당뇨병; 대사 증후군, 섬유증; 암 또는 이들의 조합인 것인, 지방 조직에의 작동인자 물질의 전달방법.
  32. 서열 번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 폐 조직에 결합하는 것인 펩타이드.
  33. 제32항의 펩타이드를 포함하는 단백질 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 단백질 조성물은 D-아미노산으로 이루어진 것인 단백질 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 상기 펩타이드는 조영제; 세포독성 물질; 아폽토시스유도제 또는 이들의 조합에 커플링된 것인 단백질 조성물.
  36. 표적 펩타이드 및 작동인자 물질을 포함하는 단백질 조성물로서, 상기 작동인자 물질은 그라미시딘(gramicidin); 마가이닌(magainin); 멜리틴(mellitin); 디펜신; 세크로핀(cecropin); (KFAKFAK)2, (KFXAKFXAK)2; (KHexAKHexAK)2 (KLAKLAK)2; (KLAKKLA)2; (KAAKKAA)2; (KLGKKLG)3; 안지오텐신; 라미닌 펩타이드; 피브로넥틴 펩타이드; 플라스미노겐 활성화인자 억제제; 조직 금속단백분해효소 억제제; 인터페론; 인터류킨 12; 혈소판 인자 4; IP-10; Gro-β; 트롬보스폰딘(thrombospondin); 2-메톡시오에스트라디올; 프롤리페린 연관 단백질; 카르복시아미도트라이아졸; CM101; 마리마스타트(Marimastat); 펜토산 폴리설페이트; 안지오포이에틴 2(레게네론(Regeneron)); 인터페론-알파; 헤르비마이신(herbimycin) A; PNU145156E; 16K 프로락틴 단편; 리노마이드(Linomide); 탈리도마이드(thalidomide); 펜톡시필린(pentoxifylline); 제니스테인(genistein); TNP470; 엔도스타틴; 파클리탁셀; 아쿠틴(accutin); 안지오스타틴; 시도포비르(cidofovir); 빈크리스틴(vincristine); 블레오마이신(bleomycin); AGM-1470; 혈소판 인자 4 또는 미노사이클린(minocycline); 5-플루오로우라실; 블레오마이신; 부술판; 캄프토테신; 카르보플라틴; 클로르암부실; 시스플라틴(CDDP); 사이클로포스파마이드; 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신(daunorubicin); 독소루비신(doxorubicin); 에스트로겐 수용체 결합제; 에토포사이드(etoposide)(VP16); 파르네실-단백질 전환효소 억제제; 젬시타빈(gemcitabine); 이포스파마이드(ifosfamide); 메클로르에타민; 멜팔란(melphalan); 미토마이신(mitomycin); 나벨빈(navelbine); 니트로스유레아; 플리코마이신(plicomycin); 프로카르바진(procarbazine); 랄록시펜(raloxifene); 타목시펜(tamoxifen); 탁솔(taxol); 테마졸로마이드(temazolomide)(DTIC의 수성 형태); 트랜스플라티늄; 빈블라스틴(vinblastine) 및 메토트렉세이트(methotrexate); 빈크리스틴(vincristine); 알킬화제; 항대사제; 항종양 항생제; 코르티코스테로이드 호르몬; 유사분열 억제제; 나이트로소유레아; 호르몬제; 유사분열 억제제; 항종양 항생제; 효소; 생체반응 조절인자; 식물성 알카노이드; 도세탁셀(docetaxel); 에토포사이드(VP16); 테니포사이드(teniposide); 파클리탁셀(paclitaxel); 탁솔; 빈블라스틴; 빈크리스틴; 비노렐빈(vinorelbine); PPAR-감마 효현제 티아졸리딘다이온; 로시글리타존(rosiglitazone); 형광단; 금속 킬레이트 복합체; 방사성 동위원소; 형광 마커; 유레아제; 알칼리 포스파타제; 리포솜; 마이크로캡슐; 마이크로입자; 나노입자; 자기 비드; 마이크로장치; 블레오마이신; 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신; 독소루비신(아드리아마이신(Adriamycin)); 플리카마이신(미트라마이신(mithramycin)) 및 이다루비신(idarubicin); 백금 배위 복합체; 안트라센다이온; 치환 유레아; 메틸 하이드라진 유도체; 암사크린(amsacrine); L-아스파라기나아제; 및 트레티노인(tretinoin); 카르보플라틴(Carboplatin); 시스플라틴(시스-DDP); 미톡산트론; 하이드록시유레아; 프로카르바진; IgFc 융합 단백질; 효소 융합 단백질; 형광 단백질; 발광 단백질 또는 이들의 조합 및 유사체를 포함하는 것인 단백질 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200077144A (ko) * 2018-12-20 2020-06-30 영남대학교 산학협력단 탈리도마이드를 유효성분으로 함유하는 가축 육질 개선용 조성물

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170042870A1 (en) * 2014-02-17 2017-02-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeted nanoparticle compositions and methods of their use to treat obesity
CN104774245A (zh) * 2014-08-22 2015-07-15 天津药物研究院 一种脑靶向肽与抗肿瘤药偶联物的制备及应用
CN114558111A (zh) * 2014-11-03 2022-05-31 清华大学 一种抑制脂肪细胞分化和胰岛素耐受的药物
CN104928320B (zh) * 2015-07-03 2018-06-01 中国医学科学院医学生物学研究所 一种携带恒河猴抵抗素剪接体基因慢病毒载体的构建方法
CN108289734A (zh) * 2015-08-17 2018-07-17 约翰·霍普金斯大学 用于组织恢复的间充质细胞结合复合材料
CN106883299A (zh) * 2015-12-16 2017-06-23 杭州阿德莱诺泰制药技术有限公司 脂肪组织靶向多肽及其制备方法和应用
CN106749524B (zh) * 2016-12-05 2020-08-18 华南理工大学 一种抗肥胖七肽npvwkrk
TW201829448A (zh) 2016-12-15 2018-08-16 大陸商深圳瑞健生命科學硏究院有限公司 纖溶酶原在製備預防或治療肥胖症及疾病倂發的肥胖的藥物中的用途
TWI684459B (zh) 2016-12-15 2020-02-11 大陸商深圳瑞健生命科學研究院有限公司 一種治療動脈粥樣硬化及其併發症的方法
CN107496900B (zh) * 2017-09-06 2020-10-16 首都医科大学附属北京同仁医院 一种调控棕色脂肪组织活性的方法
CN107569679B (zh) * 2017-09-06 2020-10-16 首都医科大学附属北京同仁医院 Ace2在调控棕色脂肪组织活性中的应用
CN107996826A (zh) * 2017-10-27 2018-05-08 威海同丰海洋生物科技有限公司 一种含有防御素的饲料添加剂及其制备方法
CN109276704A (zh) * 2017-11-07 2019-01-29 江苏省中医药研究院 蜂毒肽在制备治疗和/或预防糖尿病的药物或保健品中的用途
WO2019165134A1 (en) * 2018-02-21 2019-08-29 Texas Tech University System Particles for targeted delivery of active agents into adipose stromal cells
CN109402102B (zh) * 2018-11-09 2021-12-03 临沂大学 一种表面附有半透保护膜的酶-磷脂微囊的制备方法
KR102112702B1 (ko) * 2019-12-19 2020-05-19 (주)슈퍼노바 바이오 표면 개질된 가스-생성 나노입자를 이용한 지방 분해용 조성물
US20230096668A1 (en) * 2020-01-15 2023-03-30 Supernova Bio Co., Ltd. Gas-generating micelle for reducing localized fat
EP4132554A4 (en) * 2020-04-07 2024-06-05 Univ Arizona PEPTIDES AGAINST OBESITY AND THEIR USES
WO2023014375A1 (en) * 2021-08-06 2023-02-09 Lean Life Sciences, Inc Cosmetic peptides for improving skin rejuvenation

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US20050074747A1 (en) 2000-09-08 2005-04-07 Wadih Arap Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (brasil)
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US7214786B2 (en) 2000-12-14 2007-05-08 Kovalic David K Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2004529621A (ja) * 2001-02-14 2004-09-30 ティー ファークト，レオ 多能性成体幹細胞、その起源、それを得る方法および維持する方法、それを分化させる方法、その使用法、ならびにそれ由来の細胞
US7671010B2 (en) 2002-08-30 2010-03-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer
US8507445B2 (en) 2001-09-07 2013-08-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
WO2007046818A2 (en) 2004-11-16 2007-04-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods related to synchronous selection of homing peptides for multiple tissues by in vivo phage display
WO2008143679A2 (en) 2006-06-01 2008-11-27 Verenium Corporation Nucleic acids and proteins and methods for making and using them
EP2238242B9 (en) 2008-01-03 2015-06-10 BASF Enzymes LLC Transferases and oxidoreductases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2225390A4 (en) 2008-01-03 2012-05-09 Cargill Inc AMINO TRANSFERASE AND OXIDOREDUCTASE NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR USE
WO2010046221A1 (en) 2008-10-23 2010-04-29 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (nue)
CN102120755B (zh) * 2010-04-23 2013-04-03 江苏省人民医院 一种棕色脂肪组织靶向性多肽及其应用
CN102120034B (zh) * 2010-04-23 2015-02-11 江苏省人民医院 一种靶向至棕色脂肪组织治疗肥胖的新型靶向药物
WO2012169911A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Auckland Uniservices Limited Peptides, constructs and uses therefor

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200077144A (ko) * 2018-12-20 2020-06-30 영남대학교 산학협력단 탈리도마이드를 유효성분으로 함유하는 가축 육질 개선용 조성물

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