KR102232500B1 - 암 치료 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 및 의약, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

암 치료 조성물 및 방법
본 발명은 암 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 폴리펩타이드, 조성물 및 이의 의학적 용도, 특히 암의 치료 및/또는 예방에서의 용도에 관한 것이다.
이상적인 암 치료제는, 종양을 유지하기 위해서는 지속적으로 필요하지만 임의의 정상 조직을 유지하고 기능하게 하는데에는 불필요한, 비-중복 기능을 타겟으로 하여야 한다. 그래서, 가장 일반적인 논리는 암에서 특이적으로 돌연변이된 유전자 산물을 타겟으로 하는 것으로, 이는 이들 돌연변이 분자가 암의 그럴듯한 "구동인자"이고, 아마도 정상 조직에는 거의 중요하지 않을 것이라는 점에 근거한다. 이러한 이유로, 특정 암 타입들에서 재발성 병변 리스트 작성에 많은 관심들이 집중되었다. 불행하게도, 이러한 접근 방식에는 몇가지 문제점이 존재한다. 첫째, 대부분의 고형 인간 암은 게놈 불안정성의 에피소드를 거쳐, "구동인자" 돌연변이 및 그에 수반되는 작동자 경로를 불명료하게 만들 수 있는 돌연변이 노이즈 (mutational noise)를 나타낸다. 두번째로, 암은 다수의 진화적 보틀넥 (evolutionary bottleneck)을 통해 이행된 프로세스의 최종 결과물이다. 각각의 보틀넥은, 향후 어떤 시점에서 종양 유지에 불필요하여 결과적으로 종양의 진화에서 그 시점 이후에는 양호한 치료학적 타겟이 되지 못하는 기능을 가진, 특정 타입의 돌연변이를 요구할 수 있다.
Myc는 증식 조절 및 암에 관여하는 염기성의 나선-루프-나선 루신 지퍼 (b-HLH-LZ) 단백질이며, 이는 구조적으로 관련된 단백질들 Max, Mad 및 Mnt와 네트워크 형태로 작동한다. Myc/Max 다이머는 유전자 전사를 활성화하고, 세포 증식 또는 세포 자살을 유도한다. Mad/Max 및 Mnt/Max 복합체는 억제인자로서 작용하며, 세포 증식 정지 및 분화를 유발한다. 이들 다이머 모두 동일한 DNA 컨센서스 부위, 즉 CACGTG E-박스를 인지한다.
Myc는 정상 세포에서 엄격하게 조절되어, 그 수준은 증식 중인 세포에서는 높고, 비-증식 세포에서는 낮다. 비정상적으로 높거나 및/또는 통제되지 못한 Myc 활성은 대부분의 암에 원인으로서 연루되어 있으며, 종종 공격적이고 덜 분화된 혈관신생 종양과 연관되어 있다. Myc 발현의 조절 이상은 유전자 증폭을 통한 과발현, 전사 조절 저하, 분해 손상 또는 안정화 증가가 원인이다. 이로써, 비정상적인 증식, 생존성 증가, 대사 변화, 혈관신생 및 염증이 발생하며, 이들 모두 암의 주요 홀마크이다. 다수의 실험들에서, Myc가 종양 발생과 관련된 세포내 및 세포외 측면들을 지배하는데 중요한 역할을 한다는 것이, 입증되었으며, 이는 그 기능을 타겟으로 하는 것이 치료학적으로 유용할 것임을 시사한다.
BET 브로모도메인 저해제에 의한 Myc의 하향 조절이 여러가지 종양 타입들을 퇴화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 접근 방식은 잠재성이 양호하지만, 독성 및 다수의 오프 타겟 효과와 같은 일부 한계가 있다. Myc/Max 상호작용을 방해하는 다수 소분자들은 세포내 특이성이 낮다.
그러나, 아직까지 Myc 저해제는 임상적으로 이용가능해지지 않았으며, 이를 설계하는데 다양한 위험들이 따른다: 첫째, Myc는 핵 전사 인자이므로, 결과적으로 막 또는 세포질 분자 보다 도달하기가 어려우며; 두번째로, Myc는 타겟이 될 수 있는 효소적 "활성 부위"가 없고; 세번째로, Myc 패밀리는 3종의 상이한 단백질, c-Myc, N-Myc 및 L-Myc로 구성되며, 이들 단백질이 어떤 상황에서는 기능적으로 과잉이어서 이들 모두를 동시 저해하여야 한다. 또한, Myc 저해가 정상 조직의 증식을 저해함으로써 심각한 부작용을 유도할 것이라는 우려도 존재한다. 이러한 모든 이유들로 인해, Myc 저해 약물을 구축하기가 매우 어렵다.
Omomyc는 Myc의 b-HLH-LZ 도메인을 포함하는 우성-네거티브 MYC 돌연변이로, Myc의 루신 지퍼에 4개의 아미노산 치환을 가지고 있다 (Soucek, L. et al., 1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. et al. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). 아미노산 치환 E61T, E68I, R74Q 및 R75N은, 천연 파트너인 Max에 대한 결합력과, 그 자체와의 호모다이머 뿐만 아니라 야생형 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc와 헤테로다이머를 형성하는 능력을 가지도록, 단백질에 변형된 다이머화 특이성 (altered dimerization specificity)을 부여한다.
이러한 특성들로 인해, Omomyc는, Myc가 그것의 DNA 인지 결합부위인 E 박스에 결합하는 Myc의 결합력을 무력화함으로써, 시험관내 및 생체내에서 Myc-의존적인 유전자 전사활성화 기능 (transactivation function)을 방지할 수 있다. 동시에, Omomyc는 Myc 발현 수준에 의존적인 방식으로 Myc-유도성 세포자살을 상당히 강화하여, Myc 전사억제 (transrepression) 활성을 증가시킨다. 따라서, Omomyc는, 프로모터에 대한 Miz-1-의존적인 결합 및 전사억제는 유지하면서, 프로모터 E-박스에 대한 Myc의 결합 및 타겟 유전자의 전사활성화는 방지한다. Omomyc 존재시, Myc 인터액톰 (Myc interactome)은 억제로 전환되고, 그 활성은 전암성에서 종양-억제성으로 스위칭된다.
EP2801370 A1에서, Omomyc 펩타이드 자체가 세포 막을 통해 효율적으로 형질도입되어 핵으로 전위될 수 있으며, 종양 억제 효과를 발휘하는 것으로, 입증되었다.
그러나, 본 기술 분야에서는 새롭고 개선된 치료학적 암 치료 방법에 대한 개발이 여전히 요구되고 있다.
제1 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 89번 X 잔기가 시스테인이 아닌, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1의 89번 X 잔기가 시스테인이 아닌 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체 (functionally equivalent variant)에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 접합체에 관한 것이다:
a. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 및
b. 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은 약학적 유효량의, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다.
제7 측면에서, 본 발명은, 의약에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
제8 측면에서, 본 발명은, 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
도 1. OmoCS (C89S 변형 포함)가 Omomyc 보다 훨씬 효과적으로 (낮은 농도에서) U87 악성 신경교종 세포 (A 패널) 및 A549 폐 선암종 세포 (B 패널)의 증식을 저해함을 보여주는, 세포 생존성 분석. 리포펙타민 (Lipo)은 영향을 미치지 않는다. T-검정을 이용해 통계학적 유의성을 계산하였다. ** = P < 0.01, *** = P < 0.001.
도 2. OmoCA (C98A 변형 포함)가 더 낮은 농도에서 OmoCS (C98S 변형 포함)와 같이 효과적으로 A549 폐 선암종 세포의 증식을 저해함으로 보여주는, 세포 밀도 분석. 리포펙타민 (Lipo)은 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 발명자들은, 89번 위치의 시스테인이 세린으로 치환된, 서열번호 1의 폴리펩타이드, 즉 OmoCS가 Omomyc 보다 훨씬 효과적으로 종양 억제 효과를 발휘할 수 있다는 것을 발견하였다 (실시예 1). 이러한 종양 억제 효과는, 서열번호 1의 89번 시스테인이 다른 아미노산으로 치환된 경우에도 유지된다. 실시예 2는, 89번 위치의 시스테인이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩타이드, 즉 OmoCA가 OmoCS와 동일한 종양 억제 효과를 가진다는 것을, 보여준다.
본 발명의 폴리펩타이드
이에, 제1 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 89번 X 잔기가 시스테인이 아닌, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1의 89번 X 잔기가 시스테인이 아닌 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체에 관한 것이다.
서열번호 1은 하기 서열이다:
Figure 112019015834465-pct00001
서열번호 1의 폴리펩타이드 서열은 Omomyc 단백질 서열이지만, 89번 위치의 잔기 X는 시스테인이 아니다. 본원에서, 용어 "Omomyc"는, E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이를 가진, Myc 단백질의 bHLHZip 도메인의 돌연변이 버전들로 구성된, 폴리펩타이드를 지칭한다 (여기서, 돌연변이되는 위치의 번호는 2015년 3월 15일에 공개된 NCBI 데이타베이스에서 등재번호 NP_002458로 제공된 폴리펩타이드의 아미노산 365-454에 해당하는 Myc 영역의 서열에 대하여 부여됨). NCBI 데이타베이스에 등재번호 NP_002458로 제공된 c-Myc의 서열은 아래에 제시하며 (서열번호 5), 서열에서 Omomyc로부터 유래된 영역은 밑줄 표시된다:
Figure 112019015834465-pct00002
본원에서, 용어 "Myc"는 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc를 포함하는 전사 인자 패밀리를 지칭한다. Myc 단백질은 컨센서스 서열 CACGTG (인핸서 박스 서열 또는 E-박스)에 결합하여 히스톤 아세틸-트랜스퍼라제 또는 HAT를 동원함으로써, 다수 유전자들의 발현을 활성화한다. 그러나, Myc는 전사 억제인자로도 작용할 수 있다. Miz-1 전사 인자에 결합하여 p300 공동-활성인자를 치환함으로써, Miz-1 타겟 유전자의 발현을 저해한다. 또한, Myc는 DNA 복제 조절에 직접적인 역할을 담당한다.
Myc b-HLH-LZ 또는 Myc 염기성 영역 나선-루프-나선 루신 지퍼 도메인은, Max 단백질과의 Myc 다이머 형성 및 Myc-타겟 유전자에의 결합을 결정하는 영역을 의미한다. 이 영역은 인간 Myc의 아미노산 365-454에 해당하며, 루프에 의해 연결된 2개의 알파 나선을 특징으로 한다 (Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).
바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 아래 서열번호 3을 포함하거나, 서열번호 3으로 구성되거나 또는 서열번호 3으로 필수적으로 구성된다.
Figure 112019015834465-pct00003
문맥에서, "필수적으로 구성된"다는 것은 지정된 분자가 서열번호 3의 활성을 변형시키는 어떠한 부가적인 서열을 포함하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명은, 서열번호 1의 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌, 서열번호 1을 포함하거나, 서열번호 1로 구성되거나 또는 서열번호 1로 필수적으로 구성되는, 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이 폴리펩타이드는, 종양 억제 효과를 발생시키는 돌연변이가 보존되는 한, 당해 기술 분야에 공지된 모든 Myc 단백질의 bHLHZip 도메인으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본 발명에 이용될 수 있는 폴리펩타이드는, 가축 및 농장 동물 (소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류), 영장류 및 인간 등의 모든 포유류 종들로부터 유래할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 Myc 단백질로부터 유래된다 (등재번호 NP_002458, 공개일: 2015년 3월 15일).
바람직한 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 1의 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌, 서열번호 1의 폴리펩타이드로 구성되는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 89번 잔기는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
본원에서, "시스테인"은 식 HO2CCH(NH2)CH2SH의 아미노산을 지칭한다. 이는 코돈 UGU 및 UGC로 코딩된다. 이 용어는 또한 비-천연 시스테인도 포함한다.
시스테인은 Omomyc의 호모다이머 형태에서 이황화 결합을 형성할 수 있어, 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이시 이황화 결합을 형성할 수 없게 될 것이며, 이로써 OmoCS에서 달성되는 동일한 효과 특성이 달성된다. 따라서, 서열번호 1의 89번 잔기는 시스테인을 제외한 모든 천연, 비-천연 또는 합성 아미노산일 수 있으며, 특히 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 모노머와 가교를 형성하여 호모다이머를 형성할 수 없는, 임의의 아미노산일 수 있다.
용어 "아미노산" 또는 "잔기"는 천연 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연 아미노산과 비슷한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 아미노산은 본원에서 통상적으로 공지된 3문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권고한 한문자 기호로 언급될 수 있다.
용어 아미노산은 천연 아미노산 (Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), 희귀 천연 아미노산 및 비-천연 (합성) 아미노산을 포함한다. 아미노산은 바람직하게는 L 배위이며, 또한 D 배위일 수 있으며, 또는 D 배위와 L 배위의 아미노산 혼합물도 고려된다.
용어 "천연 아미노산"은 지방족 아미노산 (글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신), 하이드록시화 아미노산 (세린 및 트레오닌), 황 함유 아미노산 (메티오닌), 다이카르복실릭 아미노산 및 이의 아미드 화합물 (아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산 및 글루타민), 2개의 염기성 기를 가진 아미노산 (라이신, 아르기닌 및 히스티딘), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 및 사이클릭 아미노산 (프롤린)을 포함한다. 일 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 지방족 아미노산이다. 다른 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 황 함유 아미노산이다. 다른 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 다이카르복실릭 아미노산 또는 이의 아미드 화합물이다. 다른 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 염기성 기 2개를 가진 아미노산이다. 다른 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 방향족 아미노산이다. 다른 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 사이클릭 아미노산이다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 하이드록시화 아미노산이며, 바람직하게는 세린이다. 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기 X는 세린, 트레오닌 및 알라닌으로부터 선택되는, 바람직하게는 세린 및 알라닌으로부터 선택되는 아미노산이다.
본원에서, 용어 "비-천연 아미노산"은 이의 카르복시산 또는 아민기로 치환되며, 천연 아미노산과 구조적으로 비슷한 이의 유도체를 지칭한다. 변형된 또는 희귀 아미노산에 대한 비-제한적인 예로는, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, beta-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로익산, 2-아미노헵타노익산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜릭산, 2,4-다이아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-다이아미노피멜릭산, 2,3-다이아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 하이드록시 라이신, 알리오 하이드록시 라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로이소루신, N-메틸글리신, N-메틸이소 루신, 6-N-메틸-라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르루신, 오르니틴, 등이 있다.
희귀 아미노산에 대한 예시적인 비-제한적인 예로는 하이드록시라이신 및 하이드록시프롤린, 티록신 (thyroxine), N-메틸 아르기닌 및 n-아세틸 라이신이 있다.
바람직한 구현예에서, 89번의 잔기 X는, 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 모노머와 가교하여 호모다이머 쌍을 형성할 수 없는, 임의의 다른 아미노산이다.
본 발명의 폴리펩타이드에 대한 보다 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기는 세린 아미노산이다.
본원에서, "세린"은 인간에서 코돈 UCU, UCC, UCA, UCG, AGU 및 AGC으로 코딩되는 2-아미노-3-하이드록시프로판산이다. 이 용어는 또한 인산화 또는 황화 세린과 같은 변형된 세린을 포함하며, 비-제한적인 예로는 N-벤조일-(2R,3S)-3-페닐이소세린, D-사이클로세린, L-이소세린, 페닐세린 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 2에 나타낸 서열을 포함한다.
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다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 4로 구성되거나, 또는 서열번호 4로 필수적으로 구성된다.
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본 발명의 폴리펩타이드에 대한 보다 바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 89번 잔기는 알라닌 아미노산이다.
본원에서, "알라닌"은 인간에서 코돈 GCU, GCC, GCA 및 GCG으로 코딩되는 2-아미노프로판산이다. 이 용어는 또한 N-아세틸-L-알라닌과 같은 변형된 알라닌을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 63에 나타낸 서열을 포함한다.
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다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 64로 구성되거나 또는 서열번호 64로 필수적으로 구성된다.
Figure 112019015834465-pct00007
서열번호 1의 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1을 언급하는 경우, 용어 "기능적으로 동일한 변이체"는, 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 결손, 삽입 또는 부가를 통해 수득되거나, 또는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 화학적 변형으로부터 수득되며, 서열번호 1의 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 종양 억제인자 활성을 실질적으로 보유한, 바람직하게는, OmoCS의 종양 억제인자 활성을 실질적으로 보유한, 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 종양 억제인자 활성의 보유에는, 변이체가 Myc 및/또는 이의 절대 (obligate) 파트너 p21/p22Max와 이량체를 형성하고 핵에서 발견시 Myc 활성을 저해할 수 있어야 하며; 세포 막을 통과하여 전위할 수 있어야 하며; 핵막을 통과하여 전위할 수 있어야 한다는 것이, 필수적임을 알 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체는 Omomyc에 비해 호모다이머화 정도가 낮거나 또는 이황화 결합 형성에 의해 강제로 호모다이머화 되지 않는다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드의 호모다이머 형태에서 이황화 결합 형성이 폴리펩타이드 OmoMyc 보다 적다.
본원에서, "낮은 호모다이머화 (homodimerization)는, 본 발명의 폴리펩타이드가 심지어 환원 조건에서도 절대 호모다이머 (obligate homodimer)를 형성하는 능력이 낮다는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 능력은, Omomyc의 호모다이머 형성력 보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45 %, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 낮다. 본원에서, 환원 조건은, 환원제, 즉 레독스 화학 반응에서 전자를 다른 화학종에게 주는 화합물이 존재하는 것을 의미한다. 환원제에 대한 예시적인 비-제한적인 예는 DTT (다이티오트레이톨), β-머캅토에탄올 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)이다. 호모다이머의 양은 시험관내에서 동일할 수 있고, 본 발명의 폴리펩타이드와 Omomyc 간의 차이는, 이황화 결합의 부재가 헤테로다이머의 형성을 잠재적으로 높일 수 있는, 세포내 헤테로다이머화 파트너가 존재하는 존재 조건에서만 나타날 수 있다.
몇가지 분석을 이용해 펩타이드의 호모다이머화를 확인하였으며, 예시적인 비-제한적인 예로는 원이색법 (Circular dichroism)으로 모니터링하는 열 변성이 있으며, 다이머화는 폴딩 및 열 안정성 정량화를 통해 검출할 수 있다.
적합한 기능적으로 동일한 변이체는, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌, 서열번호 1의 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되는, 폴리펩타이드를 포함한다.
이러한 맥락에서, "필수적으로 구성되는"은, 명시된 분자가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 활성을 변형시키는 임의의 부가적인 서열을 포함하지 않는다는 것을 의미한다.
타겟팅 펩타이드에 대한 적합한 기능적으로 동일한 변이체는, 서열번호 1의 펩타이드에 대해, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%와 같은 약 25% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 펩타이드 (바람직하게는, OmoCS, 서열번호 4)이다. 2개의 폴리펩타이드 간의 동일성 정도는 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용해 결정된다. 2개의 아미노산 서열 간의 동일성은 바람직하게는 기존에 공지된 BLASTP 알고리즘을 이용해 결정된다 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 전장에 대해 또는 변이체의 전장에 대해 또는 이 둘다에 대해 결정된다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체는 당화, 아세틸화, 이소프레닐화, 미리스토일화, 단백질 분해 프로세스 등과 같은 번역 후 수정을 포함할 수 있다.
다른 예로, 타겟팅 펩타이드에 적합한 기능적으로 동일한 변이체는, 본 발명의 폴리펩타이드 내 하나 이상의 위치가 전술한 단백질에 존재한 아미노산의 보존적인 치환인 아미노산을 포함하는, 것이다. "보존적인 아미노산 치환"은 아미노산을 비슷한 구조 및/또는 화학적 특성을 가진 다른 아미노산으로 대체함으로써 달성된다. 예를 들어, 다음과 같은 6가지 그룹은 그룹 내 구성원 서로에 대해 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소루신 (I), 루신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W). 이러한 보존적인 아미노산 치환의 선택은 당해 기술 분야의 당업자의 기술에 속하며, 예를 들어 Dordo et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739) 및 Taylor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218)에 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체의 전체 서열은 시스테인 아미노산을 포함하지 않는다. 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 인간 c-Myc에서 유래된 Omomyc에서 발견되는 돌연변이 E61T, E68I, R74Q 및 R75N에 대응되는 위치에 돌연변이를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 기능적으로 동일한 변이체에서 상기한 돌연변이가 이루어져야 하는 위치는 여러가지 Myc 서열들의 다중 서열 정렬에 의해 결정될 수 있으며, 인간 c-Myc에서 유래된 Omomyc 서열의 61번, 68번, 74번 및 75번 위치에 대응되는 위치들을 정렬함으로써 동정할 수 있다.
다중 서열 정렬은 2 이상의 서열을 한번에 쌍 정렬하는 것이다. 다중 정렬 방법은 모든 서열들을 주어진 쿼리 세트에서 정렬시킨다. 바람직한 다중 서열 정렬 프로그램 (및 이의 알고리즘)은 ClustalW, Clustal2W 또는 ClustalW XXL이다 (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). 본원에 기술된 바와 같이, 여러 유기체의 c-Myc의 서열과 변이체의 서열을 비교 (정렬)하여, 당해 기술 분야의 당업자는 각 서열에서 Omomyc에서 발견된 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 위치에 대응되는 각 위치를 쉽게 동정할 수 있으며, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 변이체에 인간 c-Myc에서 유래된 Omomyc의 서열에서 발견되는 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이에 대응되는 돌연변이를 도입할 수 있다.
폴리펩타이드가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체로서 간주될 수 있는 지를 확인하는데 적합한 분석으로는 비-제한적인 예로 다음과 같은 분석 등이 있다:
- Soucek et al. (Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472)에 기술된 리포터 유전자의 발현에 기초한 분석 뿐만 아니라 PLA (단백질 라이게이션 분석) 또는 공동-면역-침강과 같이, Max 및 Myc와 다이머 복합체를 형성하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 전기영동 이동성 쉬프트 분석 (EMSA)과 같이, DNA 내 Myc/Max 인지 부위 (CACGTG 부위)에 결합하는 폴리펩타이드 결합력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 바와 같이 Myc/Max에 특이적인 DNA 결합 부위의 통제 하에 리포터 유전자의 발현에 기초한 분석 등의, Myc-유도 전사활성화를 억제하는 억제력을 측정하는 분석.
- 전술한 Soucek 문헌에 기술된 바와 같이 myc 발암유전자를 발현하는 세포의 증식을 저해하는 유전자 산물 또는 폴리펩타이드의 저해력에 기초한 분석.
- Soucek et al. (Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472)에 기술된 분석 등의, myc-유발성 세포자살을 강화하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 분석. 또한, 세포에서 세포자살을 평가하는 기술 분야에서 통상적으로 공지된 임의 분석, 예를 들어 훼스트 (Hoechst) 염색, 프로피듐 아이다이드 (PI) 또는 아넥신 V 염색, 트립판 블루, DNA 래더링/단편화 및 TUNEL이 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 다음과 같은 특징을 하나 이상, 바람직하게는 모두 가진 서열을 포함한다: Myc와 이량체를 형성하는 이의 활성, 세포 막 통과 전위 (translocation), 핵으로의 전위, Omomyc와 비교해 호모다이머 형성 불능 또는 호모다이머 형성력 감소, 실시예 1에서 수행된 시험관내 분석에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 12.5 nM 농도에서 Omomyc 보다 낮은 세포 생존성. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 기능적으로 동일한 변이체는, 실시예 1에서 수행된 시험관내 분석에서 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA 12.5 nM 농도에서 Omomyc 보다 낮은 수준의 세포 생존성을 매개하는, 서열에 해당한다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드의 활성이 상기 하나 이상의 분석에서 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1 서열의 활성 (바람직하게는 OmoCs 활성)에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%인 경우, 이 폴리펩타이드는 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체로 간주된다.
또한, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 또한, 변이체와 세포의 접촉 후에, 세포를 형질도입시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1 (바람직하게는, OmoCS, 서열번호 4)에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 수준으로 효과적으로 타겟 세포를 형질도입시킬 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체로서 간주된다.
아울러, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 또한, 타겟 종양 세포의 핵으로 전위될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1 (바람직하게는, OmoCS, 서열번호 4)에 대해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 수준으로 효과적으로 타겟 종양 세포의 핵으로 전위할 수 있다면, 이 폴리펩타이드는 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체로서 간주된다.
세포막을 통과하여 핵으로 전위할 수 있는 능력 측면에서 폴리펩타이드가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체인지를 결정하는데 적합한 분석은, 세포를 폴리펩타이드 특이 시약과 세포의 핵을 특이적으로 표지하는 염료로 이중 표지하는 방법을 포함한다 (예, DAPI 또는 Hoechst dye). 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 검출은 공초점 현미경 또는 형광 현미경에 의해 수행된다.
서열번호 1의 본 발명의 폴리펩타이드는, 또한, 핵 위치화 신호에 해당하는 서열 RQRRNELKRSF (서열번호 55)를 가진, c-Myc의 M2 도메인을 포함한다 (Dang and Lee, Mol. Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054).
다른 바람직한 구현예에서, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는 서열번호 55의 서열을 포함한다.
본원에서, 용어 "핵 위치화 신호"는 단백질을 핵으로 향하게 하는 아미노산 잔기 약 4-10개로 된 아미노산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 핵 위치화 서열에는 염기성 아미노산이 풍부하며, 서열의 예들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7).
일부 구현예에서, NLS는 SV40 라지 T 항원 NLS (PKKKRKV, 서열번호 6); 뉴클레오플라스민 NLS (KRPAATKKAGQAKKKK, 서열번호 7); CBP80 NLS (RRRHSDENDGGQPHKRRK, 서열번호 8); HIV-I Rev 단백질 NLS (RQARRNRRRWE, 서열번호 9); HTLV-I Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, 서열번호 10); hnRNP A NLS (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, 서열번호 11); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, 서열번호 12)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 구현예에서, 핵 위치화 신호는 모티프 K (K/ R) X (K/ R) (서열번호 13)를 포함한다.
아울러, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 또한, 변이체가 세포와 접촉된 후, 도입된 세포의 핵에 도달할 수 있다. 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 기능적으로 동일한 변이체는, 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1에서 발견되는 NLS 또는 다른 기능적 NLS를 포함함을 이해할 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 1에서 발견되는 천연 NLS를 포함하지 않고, 서열번호 1 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 임의 파트에서 발견되는 NLS를 대체하는 다른 기능성 NLS를 포함한다.
본 발명의 접합체
다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 접합체에 관한 것이다:
a) 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체; 및
b) 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티.
본원에서, 용어 "접합체"는 각 화합물의 기능이 접합체에 유지되도록 2 이상의 화합물이 공유 결합된 것을 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티를 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그 이상 포함한다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티는 지질 또는 지방산이다.
지방산은 일반적으로 체인의 말단에 산성 모이어티 (예, 카르복시산)를 가진 탄소 체인을 포함하는 분자이다. 지방산의 탄소 체인은 임의 길이일 수 있지만, 바람직하게는, 탄소 체인의 길이는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 보다 많은 수의 탄소 원자 길이이며, 이의 임의 추정 범위 길이이다. 특정 구현예에서, 탄소 체인의 길이는 지방산의 체인 영역 내 탄소 원자 4-18개이다. 특정 구현예에서, 지방산 탄소 체인은 탄소 원자를 홀수 로 포함할 수 있지만, 특정 구현예에서 체인의 탄소 원자의 수가 짝수인 것도 바람직할 수 있다. 탄소 체인에 단일 결합만을 포함하는 지방산은 포화로 지칭되고, 체인에 이중 결합을 하나 이상 포함하는 지방산은 불포화로 지칭된다. 지방산은 분지형일 수 있지만, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 비-분지형이다. 구체적인 지방산으로는, 비-제한적으로, 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 리놀렌산, 스테아르산, 라우르산, 미리스트산, 아라키딘산, 팔미트올레산, 아라키돈산 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티는 세포 침투성 펩타이드 서열이며, 이 경우, 접합체는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체과 세포 침투성 펩타이드 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
용어 "융합 단백질"은 유전자 기술에 의해 제조되는 서로 다른 단백질로부터 유래된 2 이상의 기능적 도메인들로 구성된 단백질을 지칭한다. 융합 단백질은 통상적인 수단에 의해, 예를 들어, 적합한 세포에서 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 발현시킴으로써, 수득할 수 있다. 세포 침투성 펩타이드는, 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 일부를 형성하는 세포 침투성 펩타이드와는 다른 세포 침투성 펩타이드를 지칭하는 것으로, 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "세포 침투성 펩타이드 서열"은 "CPP", "단백질 형질도입 도메인 (protein transducing domain)" 또는 "PTD"와 상호 호환적으로 사용된다. 이는 단백질의 세포 내부로의 이동을 지시하는 가변적인 길이의 펩타이드 체인을 지칭한다. 세포로의 전달 프로세스는 통상적으로 엔도사이토시스 (endocytosis)에 의해 이루어지지만, 펩타이드는 또한 직접 막 전좌에 의해 세포 내 내재화될 수 있다. CPP는 전형적으로 라이신 또는 아르기닌과 같이 양으로 하전된 아미노산이 비교적 매우 풍부한 아미노산 조성을 가지거나, 또는 극성/하전된 아미노산 및 비-극성, 소수성 아미노산의 교차 패턴 (alternating pattern)을 포함하는 서열을 가진다. 본 발명에 사용될 수 있는 CPP의 예로는, 비-제한적인 예로, 드로소필라 안테나페디아 (Drosophila antennapedia) 단백질의 CPP (RQIKIWFQNRRMKWKK; 서열번호 14), 헤르페스바이러스 심플렉스 1 (HSV-1) VP22 DNA-결합 단백질의 CPP (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; 서열번호 15), Bac-7의 CPP (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; 서열번호 16), 아미노산 49-57 (RKKRRQRRR; 서열번호 17), 아미노산 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ; 서열번호 18), 아미노산 47-57 (YGRKKRRQRRR; 서열번호 19)로 구성되는, HIV-1 TAT 단백질의 CPP, S413-PV 펩타이드의 CPP (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; 서열번호 20), 페네트라틴 (penetratin)의 CPP (RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 21), SynB1의 CPP (RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 22), SynB3의 CPP (RRLSYSRRRF; 서열번호 23), PTD-4의 CPP (PIRRRKKLRRLK; 서열번호 24), PTD-5의 CPP (RRQRRTSKLMKR; 서열번호 25), FHV Coat-(35-49)의 CPP (RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 26), BMV Gag-(7-25)의 CPP (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 27), HTLV-II Rex-(4-16)의 CPP (TRRQRTRRARRNR; 서열번호 28), D-Tat의 CPP (GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 29), R9-Tat의 CPP (GRRRRRRRRRPPQ; 서열번호 30), MAP의 CPP (KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 31), SBP의 CPP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 32), FBP의 CPP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 33), MPG의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 34), MPG(ENLS)의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 35), Pep-1의 CPP (ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 36), Pep-2의 CPP (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 37), 구조 RN의 폴리아르기닌 서열 (N = 4 - 17), GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 38), RRRRRRLR 서열 (서열번호 39), RRQRRTSKLMKR 서열 (서열번호 40); 트란스포르탄 (Transportan) GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 41); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열번호 42); RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 43), YGRKKRRQRRR 서열 (서열번호 44); RKKRRQRR 서열 (서열번호 45); YARAAARQARA 서열 (서열번호 46); THRLPRRRRRR 서열 (서열번호 47); GGRRARRRRRR 서열 (서열번호 48) 등이 있다.
바람직한 구현예에서, 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 1에 포함된 내인성의 것이 아니다.
바람직한 구현예에서, CPP는 아미노산 49-57 (RKKRRQRRR, 서열번호 49)로 구성되는 HIV-1 TAT 단백질의 CPP이다. 바람직한 다른 구현예에서, CPP는 GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 50) 또는 RRRRRRRR 서열 (서열번호 51)이다.
일 구현예에서, 세포 침투성 펩타이드 서열은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 N-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 세포 침투성 펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 C-말단에 융합된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질은, 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체에서 발견되는 자체 세포 침투성 펩타이드 외에도, 부가적인 세포 침투성 펩타이드를 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10개 또는 그 이상 포함한다.
본 발명의 적합한 융합 단백질은 다음과 같이 정의되는 폴리펩타이드 OmoCS*TAT 및 OmoCS*LZArg를 포함한다:
명칭 서열번호 서열
OmoCS*TAT 52 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSAGRKKRRQRRR
OmoCS*LZArg 53 MTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAETQKLISEIDLLRKQNEQLKHKLEQLRNSSARRRRRRRR
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체를 포함하며, 추가적으로 N-말단 또는 C-말단 핵 위치화 신호를 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 융합 단백질이 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 세포 침투성 펩타이드 서열 및/또는 NLS를 연결하는 하나 이상의 플렉시블 펩타이드를 더 포함하는 것이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 세포 침투성 펩타이드 서열과 직접 연결된다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 플렉시블 펩타이드를 통해 세포 침투성 펩타이드에 연결된다. 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 NLS에 직접 연결된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 플렉시블 펩타이드를 통해 NLS에 연결된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 세포 침투성 펩타이스 서열 및 NLS에 직접 연결된다.
일 구현예에서, NLS는 M1 펩타이드 (PAAKRVKLD, 서열번호 54) 또는 M2 펩타이드 (RQRRNELKRSF, 서열번호 55)와 같은 Myc 서열에 내인성인 NLS들 중 하나 이다.
다른 구현예에서, 부가적인 NLS는 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS와 다른 NLS를 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 접합체 또는 융합 단백질은, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS 외에도, NLS를 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10개 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 제1 플렉시블 펩타이드 링커를 통해 세포 침투성 펩타이드 서열에, 제2 플렉시블 펩타이드 링커를 통해 NLS에 연결된다.
본원에서, 용어 "플렉시블 펩타이드", "스페이서 펩타이드" 또는 "링커 펩타이드"는 2개의 단백질 또는 모이어티와 공유 결합하지만 폴리펩타이드의 일부는 아닌, 펩타이드로서, 이는 단백질 또는 모이어티의 기능에 실질적으로 유해한 효과를 야기하지 않으면서 하나를 다른 것에 대해 움직일 수 있도록 만드는 것이다. 즉, 플렉시블 링커는 폴리펩타이드 서열의 종양 억제 활성, 세포 침투성 폴리펩타이드의 세포 침투 활성 또는 NLS의 핵 위치화 능력에 영향을 미치지 않는다.
플렉시블 펩타이드는 하나 이상의 아미노산, 적어도 2개의 아미노산, 적어도 3개의 아미노산, 적어도 4개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 6개의 아미노산, 적어도 7개의 아미노산, 적어도 8개의 아미노산, 적어도 9개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 12개의 아미노산, 적어도 14개의 아미노산, 적어도 16개의 아미노산, 적어도 18개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산, 적어도 40개의 아미노산, 적어도 45개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 60개의 아미노산, 적어도 70개의 아미노산, 적어도 80개의 아미노산, 적어도 90개의 아미노산, 또는 약 100개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 플렉시블 펩타이드는, 단백질의 용해성을 높이거나 및/또는 활성을 개선하기 위해, 하나의 단백질이 다른 것에 대해 움직일 수 있도록 허용할 것이다. 적합한 링커 영역으로는 폴리-글리신 영역, 글리신, 프롤린 및 알라닌 잔기들로 된 조합물 GPRRRR 서열 (서열번호 56) 등이 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은, 특히 플루오레센스 기, 바이오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 비-천연 아미노산, 포스페이트 기, 글리코실 기, 방사성동윈원소 표지물 및 약제학적 분자 등의, 부가적인 화학적 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 이종의 폴리펩타이드는, 특히 케톤, 알데하이드, Cys 잔기 및 Lys 잔기 등의 하나 이상의 화학적 반응성 기를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 융합 단백질은, 접합체에 결합되거나 또는 융합 단백질 또는 이 폴리펩타이드의 변이체의 C-말단 또는 N-말단 도메인에 결합된, 테그를 포함한다. 이러한 테그는 일반적으로 융합 단백질을 분리 또는 정제하는데 사용할 수 있는 펩타이드 또는 아미노산 서열이다. 따라서, 이러한 테그는 하나 이상의 리간드, 예를 들어, 크로마토그래피 지지체 또는 비드와 같은 친화성 매트릭스의 하나 이상의 리간드에 고 친화성으로 결합할 수 있다. 이러한 테그에 대한 예로는, 히스티딘 테그 (His-tag 또는 HT), 예를 들어, 니켈 (Ni2+) 또는 코발트 (Co2+) 컬럼에 고 친화성으로 결합할 수 있는 히스티딘 잔기 6개를 포함하는 (His6 또는 H6) 테그 등이 있다. His-tag는, 대부분의 단백질을 변성시키고 대부분의 단백질-단백질 상호작용을 파괴하는 조건에서, 이의 리간드에 결합할 수 있는, 바람직한 특징을 가진다. 이에, 이는 미끼 (bait) 단백질을 이용해 단백질-단백질 상호작용을 교란시킨 다음 H6이 부착된 미끼 단백질을 제거할 수 있다.
융합 단백질의 분리 또는 정제에 사용가능한 테그에 대한 부가적인 예시적인 비-제한적인 예로는, Arg-tag, FLAG-tag (DYKDDDDK; 서열번호 57), Strep-tag (WSHPQFEK; 서열번호 58), 항체에 의해 인지될 수 있는 에피토프, 예를 들어, c-myc-tag (anti-c-myc 항체에 의해 인지됨), HA tag (YPYDVPDYA; 서열번호 59), V5 tag (GKPIPNPLLGLDST; 서열번호 60), SBP-tag, S-tag, 칼모듈린 결합성 펩타이드, 셀룰로스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-tag, 말토스 결합 단백질, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, 등 (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), 아미노산 서열, 예로, AHGHRP (서열번호 61) 또는 PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (서열번호 62), β-갈락토시다제 등이 있다.
테그는, 적절할 경우, 융합 단백질을 분리 또는 정제하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 상호 호환적으로 임의 길이의 뉴클레오티드로 된 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 이의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 임의의 공지된 또는 비-공지된 기능을 수행할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어, 단일 가닥, 이중 가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머 등을 포함한다. 천연 핵산 분자 외에도, 본 발명의 핵산 분자는 또한 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본원에서, mRNA는 세포에서 번역될 수 있는 RNA를 의미한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다.
mRNA는 화학적으로 합성하거나, 시험관내 전사에 의해 수득하거나, 또는 타겟 세포에서 생체내 합성할 수 있다. 본 발명의 접합체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 형성하는 뉴클레오티드 서열은 이의 발현을 위해 동일한 올바른 리딩 프래임으로 배치된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "벡터"는, 세포에서 서열의 전사 및 번역 후, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드가 제조되도록, 필수 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 이 서열은 대상 숙주 세포에서 자율적인 복제를 제공하는 부가적인 세그먼트에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 벡터는 발현 벡터이며, 이는 숙주 세포에서의 자율적인 복제 영역 외에도 본 발명의 핵산에 작동가능하게 연결된 영역을 포함하며; 본 발명에 따른 핵산의 산물의 발현을 강화할 수 있는, 벡터로서 정의된다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법을 이용해 수득할 수 있다.
벡터의 예로는, 비-제한적으로, 바이러스 벡터, naked DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합 물질 (condensing agent)과 조합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터 및 특정 진핵생물 세포, 예를 들어 생산자 세포 등이 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터는 원핵생물의 발현 벡터, 예를 들어, pUC18, pUC19, pBluescript 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl, RP4, 파지 및 "셔틀" 벡터, 예를 들어 pSA3 및 pAT28, 효모에서의 발현 벡터, 예를 들어, 2-micron 플라스미드 타입의 벡터, 통합 플라스미드, YEP 벡터, 센트로미어 플라스미드 및 유사체, 곤충 세포에서의 발현 벡터, 예를 들어 pAC 시리즈의 벡터 및 pVL 시리즈의 벡터, 식물에서의 발현 벡터, 예를 들어 pIBI 시리즈 벡터, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 및 유사 벡터, 및 바이러스 벡터 (아데노바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스 부속 바이러스, 특히 렌티바이러스) 및 비-바이러스 벡터에 기초한 고등 진핵생물에서의 발현 벡터, 예를 들어 pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDT1으로부터 유래된 벡터이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 pEGFP 또는 pBabe 레트로바이러스 벡터 및 pTRIPZ 또는 pSLIK 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터에 포함된다.
본 발명의 벡터는 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 감염될 수 있는 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 이 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다.
벡터는, 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열에 작동가능하게 결합된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 조절 서열은 핵 프로모터일 수 있으며, 또는 다른 예로 이종의 핵산 서열의 발현을 증가시키는 인핸서 서열 및/또는 기타 조절 서열일 수 있다. 원칙적으로, 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 세포에 적합한 한, 임의 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명을 구현하는데 적합한 프로모터로는, 비-제한적으로, 구성적인 프로모터, 예를 들어, 진핵생물 바이러스 게놈의 유도체, 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, SV40, CMV, 조류 육종 바이러스, B형 간염 바이러스, 메탈로티오네인 유전자 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자 프로모터, 레트로바이러스의 LTR 영역, 면역글로불린 유전자의 프로모터, 액틴 유전자의 프로모터, EF-1alpha 유전자의 프로모터 뿐만 아니라 단백질 발현이 분자 또는 외인성 신호의 부가에 따라 단백질 발현이 결정되는 유도성 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 시스템, NFκB/UV 광 시스템, Cre/Lox 시스템 및 열 충격 유전자 프로모터, WO/2006/135436에 기술된 조절성 RNA 중합효소 II 프로모터 및 조직-특이 프로모터 등이 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 접합체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 적합한 세포로는, 비-제한적으로, 포유류, 식물, 곤충, 진균 및 박테리아 세포 등이 있다. 박테리아 세포로는, 비-제한적으로, 바실러스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코커스 속의 종과 같은 그람 양성 박테리아 유래 세포 및 에스케리키아 및 슈도모나스 속의 세포와 같은 그람 음성 박테리아 유래 세포 등이 있다. 진균 세포로는, 바람직하게는, 사카로마이세스, 피키아 파스토리스 및 한세뉼라 폴리모르파와 같은 효소 세포 등이 있다. 곤충 세포로는, 비-제한적으로, 드로소필라 세포 및 Sf9 세포 등이 있다. 식물 세포로는 특히 농작물 세포, 예를 들어, 곡물, 약용 또는 장식용 식물 또는 구근계 식물의 세포 등이 있다. 본 발명에 적한한 포유류 세포로는 상피 세포주 (돼지 등), 골육종 세포주 (인간 등), 신경모세포종 세포주 (인간 등), 상피 암종 (인간 등), 신경교 세포 (뮤라인 등), 간 세포주 (원숭이 등), CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, COS 세포, BHK 세포, HeLa, 911, AT1080, A549, 293 또는 PER.C6 세포, 인간 NTERA-2 ECC 세포, mESC 세포주 유래 D3 세포, 비-인간성 배아 줄기 세포, NIH3T3, 293T, REH 및 MCF-7 세포 및 hMSC 세포 등이 있다.
전술한 모든 용어 및 구현예들은 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용가능하다.
본 발명의 약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은, 약학적 유효량의, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적 조성물"이라는 표현은 암과 같이 세포 분열이 통제되지 않는 세포, 세포 군, 장기, 조직 또는 동물에 하나 또는 수개의 치료학적으로 유용한 물질을 미리 결정된 용량으로 투여하는데 적합한, 제형을 지칭한다.
본원에서 "약학적 유효량"이라는 표현은 치료학적 효과를 제공할 수 있는 양으로서 이해되며, 이는 통상적으로 사용되는 수단을 통해 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 조합될 수 있는 항-종양 화합물의 함량은, 개체 및 구체적인 투여 방식에 따라 변경될 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 투여량은 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 및 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493의 지침에 따라 결정될 수 있음을, 알 것이다.
약학적 조성물 내 활성 성분 또는 성분들의 적절한 투여량은 치료할 암의 타입, 질병의 중증도 및 경로, 조성물이 예방 또는 치료 목적인지의 여부, 과거 치료, 환자의 임상적인 병력 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 결정될 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주의 함량은 적합하게는 환자에게 한번에 또는 연속 처리로 투여된다. 질병의 타입과 중증도에 따라, 적합한 투여량 수준은 일반적으로 1일 당 환자 체중 kg 당 약 0.01 - 500 mg일 것이며, 이는 단일 투여로 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여량 수준은 약 0.1 내지 약 250 mg/kg/일 (day); 더 바람직하게는, 약 0.5 내지 약 100 mg/kg/일일 것이다. 적합한 투여량 수준은 약 0.01 - 250 mg/kg/일, 약 0.05 - 100 mg/kg/일, 또는 약 0.1 - 50 mg/kg/일일 수 있다. 이러한 범위 내에서, 투여량은 0.05 - 0.5, 0.5 - 5 또는 5 - 50 mg/kg/일일 수 있다. 경구 투여할 경우, 조성물은, 바람직하게는, 치료할 환자에 대한 투여량을 증상에 따라 조정하기 위해, 활성 성분을 1.0 - 1000 mg, 특히 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0 및 1000.0 mg으로 포함하는 정제 형태로 제공된다. 화합물은 1일 1-4회, 바람직하게는 1일 1-2회 용법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 하나 또는 수종의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는, 활성 성분을 통합하기 위해 사용되는 것으로 일컫어지며; 조성물, 제형, 안정성, 환자의 순응성 (acceptation) 및 생체이용성과 관련하여, 약리학적/독성학적 관점에서 환자에게 허용가능하며 물리학적/화학적 관점에서 이를 제조하는 약제 화학자에 허용가능한, 치료학적으로 비-활성인 물질로서 이해된다. 또한, 부형제 또는 담체는 약학적 조성물 내 활성 성분의 전달 및 효능을 개선하기 위해 사용되는 임의의 물질을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예로는 물, 식염수, 포스페이트 완충화된 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 다수 경우에, 등장성 물질, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드가 조성물에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는, 약학적 조성물의 일부를 구성하는 융합 단백질 또는 조성물의 유통 기한 (shelf life) 또는 효능을 강화하는, 습윤제, 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질을 소량 더 포함할 수 있다. 적절한 담체의 예들은 문헌에 잘 알려져 있다 (예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 담체의 예로는, 비-제한적인 예로, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨 및 말티톨과 같은 사카라이드 시리즈; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분과 같은 전분 시리즈; 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시 메틸 셀룰로스 및 하이드록시 프로필메틸 셀룰로스와 같은 셀룰로스 시리즈; 및 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈와 같은 충진제 시리즈 등이 있다. 일부 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 붕해제도 첨가될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 부형제의 수와 특성은 원하는 투약 형태에 따라 결정된다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당해 기술 분야의 당업자에 공지되어 있다 (Fauliy Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galenica", Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid). 이러한 조성물은 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 방법을 이용해 제조할 수 있다 ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).
핵산 분자 물질을 포함하는 약학적 조성물의 경우, 핵산 분자는, 핵산, 및 박테리아, 바이러스 및 포유류 발현 시스템, 예를 들어 본원에 제공된 재조합 발현 구조체 등의, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 다양한 임의의 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. DNA를 이러한 발현 시스템에 통합시키는 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 또한, DNA는, 예를 들어, Ulmer et al., Science 259:1745-49, 1993 및 Cohen, Science 259:1691-1692, 1993에 기술된 바와 같이, "naked"일 수 있다. naked DNA의 흡수는, 효과적으로 세포에 전달되는 생분해성 비드에 DNA를 코팅함으로써 증가시킬 수 있다.
핵산 분자는 당해 기술 분야에 개시된 여러가지 방법들 중 어느 한가지 방법에 따라 세포에 전달할 수 있다 (예, Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); 미국 특허 6,395,713; 국제 특허 출원 공개공보 WO 94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); 미국 특허 출원 공개공보 2001/0007666 및 2003/077829). 당해 기술 분야의 기술을 가진 당업자에게 공지된 이러한 전달 방법으로는 리포좀내 캡슐화, 이온토포레시스 또는 생분해성 폴리머; 하이드로겐; 사이클로덱스트린 (예, Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang et al., 국제 출원 공개공보 WO 03/47518 및 WO 03/46185); 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA) 및 PLCA 미소구 (이는 또한 펩타이드 및 폴리펩타이드 및 그외 물질을 전달하는데 이용가능함) (예, 미국 특허 6,447,796; 미국 특허 출원 공개공보 2002/130430); 생분해성 나노캡슐제; 및 생부착성 미소구, 또는 단백질성 벡터 (국제 출원 공개공보 WO 00/53722)와 같은 기타 비히클내의 통합에 의한 방법 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 구현예에서, 면역 세포에서 면역 반응을 변형 (억제 또는 강화)하는데 이용하고 면역 질환 또는 장애를 치료하기 위한 핵산 분자 역시 폴리에틸렌이민 또는 이의 유도체, 예를 들어, 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-트리GAL) 유도체 (예, 미국 특허 출원 공개공보 2003/0077829)와 함께 제형화되거나 또는 복합체를 형성할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 약학적 조합물은 항-종양제를 함께 또는 별도로 더 포함한다.
본원에서, "항-종양제"는 종양을 치료하거나 또는 종양의 형성을 예방하는 생물학적 또는 화학적 화합물로서 이해된다. 바람직한 구현예에서, 항-종양제는 세포독성제, 항-혈관신생제, 항-전이제 및 항-증식제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서, 용어 "세포독성제"는 세포 사멸을 촉진할 수 있으며, 세포, 특히 빠르게 증식하는 세포, 더욱 구체적으로 종양 세포의 증식을 저하, 증식을 정지 또는 파괴할 수 있는, 물질을 지칭한다. 세포 사멸은, 대사 저해, 세포골격의 조직화 방해 또는 DNA의 화학적 변형에 의해, 예를 들어 세포자살과 같은 임의의 기전에 의해 유발될 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 용어 "세포독성제"는 소형 유기 분자, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드 등의 임의의 화학요법제; 독소; 효소; 사이토카인; 방사성 동위원소 또는 방사성치료제를 포함한다.
"항-혈관신생제"는 새로운 혈관의 형성, 즉 혈관신생을 저해 또는 감소시키는 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다.
본 발명의 제1 측면에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명의 제2 측면에 따른 융합 단백질과 함께 사용될 수 있는 항-혈관신생제로는, 비-제한적인 예로, 파클리탁셀, 2-메톡시에스트라디올, 프리노마스타트 (prinomastat), 바티마스타트 (batimastat), BAY 12-9566, 카르복시아미도트리아졸, CC-1088, 덱스트로메토르판 아세트산, 다이메틸크산테논 아세트산, 엔도스타틴, IM-862, 마리마스타트, 페니실라민, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, 수쿠알라민 락테이트, SU5416, 탈리도미드, 콤브레타스타틴 (combretastatin), 타목시펜 (tamoxifen), COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, SU6668, anti-VEGF 항체, Medi-522 (Vitaxin II), CAI, 인터루킨 12, IM862, 아밀로라이드 (amiloride), 안지오스타틴, Kl-3 안지오스타틴, Kl-5 안지오스타틴, Captopril, DL-alpha-다이플루오로메틸오르니틴 (다이플루오로메틸오르니틴), DL-alpha-다이플루오로메틸오르니틴 (다이플루오로메틸오르니틴) HCl, 엔도스타틴, 푸마길린, 허비마이신 A (herbimycin A), 4-하이드록시페닐레틴아미드, 주글론 (juglone), 라미닌, 라미닌 헥사펩타이드, 라미닌 펜타펩타이드, 라벤두스틴 A, 메드록시프로게스테론, 미노사이클린, 태반 리보뉴클레아제 저해제, 수라민, 트롬보스폰딘, 혈관신생촉진 인자 (proangiogenic factor)에 대한 항체 (예, 아바스틴 (avastin), 에르비툭스 (Erbitux), 벡티빅 (Vectibix), 헤르셉틴 (herceptin)); 혈관신생촉진성 성장인자의 저 분자량 티로신 키나제 저해제 (예, 타르세바 (tarceva), 넥사바르 (nexavar), 수텐트 (Sutent), 이레사 (iressa)); mTOR 저해제 (예, 토리셀 (Torisel)); 인터페론 alpha, beta 및 gamma, IL-12, 매트릭스 메탈로프로테나제 저해제 (예, COL3, marimastat, batimastat); ZD6474, SUl1248, vitaxin; PDGFR 저해제 (예, 글리벡 (gleevec)); NM3 및 2- ME2; 사이클로펩타이드, 예를 들어, 실렌기티드 (cilengitide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-혈관신생제 등이 있다.
"항-전이제"는, 전이, 즉, 기본적으로 림프 또는 혈액 흐름에 의해, 암 유발 세포의 원거리 전파 (distance propagation) 및 전이 목적지에서 새로운 종양의 증식을 저해 또는 감소시키는, 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다.
"항-증식제"는 종양의 형성 또는 증식을 방지 또는 저해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다. 항-증식제로는, 비-제한적으로, (i) 항-대사산물제, 예를 들어, 폴릭산 항-대사산물제 (아미노프테린, 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 에다트렉세이트 (edatrexate), 트리메트렉세이트 (트리메트렉세이트), 놀라트렉세드 (nolatrexed), 로메트렉솔 (lometrexol), 페메트렉세드 (pemetrexed), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 피리트렉심 (piritrexim), 프테로프테린 (pteropterin), 루코보린 (leucovorin), 10-프로파길-5,8-다이데아자폴레이트 (PDDF, CB3717)), 퓨린 유사체 (클라드리빈 (cladribine), 클로파라빈 (clofarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 머캅토푸린, 펜토스타틴 (pentostatin), 티오구아닌 및 피리미딘 유사체 (카페시타빈 (capecitabine), 시타라빈 (cytarabine) 또는 ara-C, 데시타빈 (decitabine), 플루오로우라실, 5-플루오로우라실, 독시플루리딘 (doxifluridine), 플록스우리딘 (floxuridine) 및 겜시타빈 (gemcitabine)), (ii) 천연 산물, 예를 들어, 항-종양 항생제 및 유사분열 저해제, 예를 들어 빈카 알카로이드, 예를 들어 빈데신 (vindesine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 비노렐빈 (vinorelbine); 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀 (Taxol™), 도세탁셀 (docetaxel) (Taxotere™); 콜히친 (NSC 757), 티오콜히친 (NSC 361792), 콜히친 유도체 (예, NSC 33410), 및 알로콜히친 (NSC 406042); 할리콘드린 B (halichondrin B) (NSC 609395); 돌라스타틴 (dolastatin) 10 (NSC 376128); 메이탄신 (NSC 153858); 리족신 (rhizoxin) (NSC 332598); 에포틸론 (epothilone) A, 에포틸론 B; 디스코더몰라이드 (discodermolide); 에스트라무스틴 (estramustine); 노코다졸 (nocodazole); (iii) 호르몬 및 이의 길항제, 예를 들어, 타목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 아나스트로졸 (anastrozole), 아르족시펜 (arzoxifene), 라소폭시펜 (lasofoxifene), 랄록시펜(raloxifene), 나폭시딘 (nafoxidine), 풀베스트란트 (fulvestrant), 아미노글루테티미드, 테스토락톤, 아타메스탄 (atamestane), 엑세메스탄 (exemestane), 파드로졸 (fadrozole), 포르메스탄 (formestane), 레트로졸 (letrozole), 고세렐린 (goserelin), 루프로렐린 (leuprorelin) 또는 루프롤라이드, 부세렐린, 히스트렐린 (histrelin), 메게스트롤 (megestrol) 및 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone); (iv) 생물 제제, 예를 들어 바이러스 벡터, 인터페론 alpha 및 인터루킨; (v) 백금계 화합물, 예를 들어, 카보플라틴 (carboplatin), 시스플라틴 (cisplatin) [cis-다이아민다이클로로플라티넘, (CDDP)], 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 이프로플라틴 (iproplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 트리플라틴 (triplatin) 테트라나이트레이트, 테트라플라틴 (tetraplatin), 사트라플라틴 (satraplatin) (JM216), JM118 [cis 아민 다이클로로 (II)], JM149 [cis 아민 다이클로로 (사이클로헥실아민) 트랜스 다이하이드옥소 플라티넘 (IV)], JM335 [트랜스 아민 다이클로로 다이하이드록소 플라티넘 (IV)], 트랜스플라틴 (transplatin), ZD0473, cis, trans, cis-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl, 말라네이트-l,2-다이아미노시클로헥사노플라틴(II), 5-설포살리실레이트-trans-(l,2- 다이아미노시클로헥산)플라틴 (II) (SSP), 폴리-[(트랜스-l,2-다이아미노사이클로헥산)플라틴]-카르복시아밀로스 (POLY-PLAT) 및 4-하이드록시-설포닐페닐아세테이트 (trans-1,2-다이아미노사이클로헥산)플라티넘 (II) (SAP) 등 및 (vi) DNA-알킬화제, 예를 들어, 니트로겐 머스타드 (질소 머스타드), 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트 및 트리아젠 (triazene), 비-제한적인 예로, 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) (Cytoxan™), 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan), 피포설판 (piposulfan), 피포브로만 (pipobroman), 멜팔란 (melphalan) (L-sarcolysin), 클로람부실 (chlorambucil), 메클로르에타민 (mechlorethamine) 또는 무스틴, 우라무스틴 (uramustine) 또는 우라실 머스타드, 모벰비신 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 트로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴 (carmustine) (BCNU), 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 클로로조톡신, 포테무스틴 (포테무스틴), 니무스틴 (nimustine), 라님누스틴 (ranimnustine), 세무스틴 (semustine) (메틸-CCNU), 스트렙토족신 (streptozocin), 티오테파 (티오tepa), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 프로카바진 (procarbazine), 알트레타민 (알트레타민 (altretamine)), 다카르바진 (dacarbazine), 미토졸로미드 (mitozolomide) 및 테모졸로미드 등이 있다.
항-종양제를 포함하는 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 조합물의 경우에, 조성물은 단독 제형으로서 (예, 구성성분 각각을 고정된 함량으로 포함하는 정제 또는 캡슐제) 제시될 수 있거나, 또는 다른 예로 병합 (joint), 연속 또는 개별 투여를 위해 향후 조합되는 별개의 제형들로서 제시될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 조합물은, 또한, 구성성분들이 각각으로 제형화되지만 동일 용기에 포장된, 부품 키트 (kit-of-parts)로서 제형들을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명에 따른 제2 약학적 조성물의 경우, 여러가지 구성성분들의 제형이 비슷할 수 있는, 동일한 경로에 의한 투여가 가능한, 즉 비슷하게 제형화 (정제 또는 환제로) 될 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 여러가지 구성성분들이 각각 제형화되는 경우, 구성성분 2종이 블리스터 (blister) 내에 제공될 수 있다. 각 블리스터는 당일 소모되어야 하는 약물을 포함한다. 약물을 하루에 수회 투여하여야 하는 경우, 각 투여에 해당되는 약물은 블리스터의 서로 다른 섹션 내에 배치될 수 있으며, 바람직하게는, 투여하여야 하는 당일 시간이 블리스터의 각 섹션에 기록된다. 다른 예로, 본 발명의 조성물의 구성성분들은, 여러가지 구성성분들이 다르게 투여되도록, 서로 다르게 제형화될 수 있다. 따라서, 제1 구성성분은 경구 투여용 정제 또는 캡슐제로 제형화하고, 제2 구성성분은 정맥내 투여용으로 제형화되거나, 또는 그 역도 가능하다. 본 발명에 따른 제2 약학적 조성물에 사용되는 조성물의 일부인 구성성분들 간의 비율은, 각각의 구체적인 사례에서 사용되는 항-종양제 뿐만 아니라 바람직한 적응증에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 구성성분 2종 간의 함량 비율이 50:1 내지 1:50, 특히 20:1 내지 1:20, 1:10 내지 10:1 또는 5:1 내지 1:5 범위일 수 있는, 조성물을 고려한다.
본 발명의 약학적 조성물 또는 조합물은, 경구 경로, 국소 경로, 흡입 또는 비경구 경로 등의 임의 타입의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있으며, 그래서 바람직한 투약 형태의 제형화에 필수적인 약제학적으로 허용가능한 부형제가 포함될 것이다. 약학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내 경로 (endovenous route)이다.
"경구 경로"는 약학적 조성물이 연하 행위 (deglutition)에 의해 유기체에 섭취되는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 액체 또는 고체에 무관하게 경구 경로에 의해 투여하기에 적합한 투약 형태일 수 있다. 경구 경로에 의한 투여에 적합한 투약 형태는 정제, 캡슐제, 시럽제 또는 용액제일 수 있으며, 결합제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨 또는 폴리비닐피롤리돈; 충진제, 예를 들어 락토스, 당 (sugar), 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 소르비톨 또는 글리신; 압축용 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트; 붕해제, 예를 들어 전분, 폴리비닐피롤리돈, 전분의 소듐 글리콜레이트 또는 미세결정 셀룰로스; 또는 약제학적으로 허용가능한 습윤제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 등의 당해 기술 분야에 공지된 임의의 통상적인 부형제를 포함할 수 있다. 고체 경구 조성물은 통상적인 혼합, 충진 또는 압축 프로세스에 의해 제조할 수 있다. 반복적인 혼합 조작을 이용해, 충진제를 다량 사용하는 조성물에 활성 물질을 완전히 분산시킬 수 있다. 이러한 조작은 당해 기술 분야에서 통상적이다. 정제는, 예를 들어, 습식 또는 건식 과립화에 의해 제조할 수 있으며, 선택적으로 이를 통상적인 약학 실무에서 공지된 프로세스에 따라, 특히 장용 코팅을 적용해 이를 코팅할 수 있다.
한편, "국소 경로"는 비-전신 경로에 의한 투여로서 이해되며, 혈류에 현저하게 유입되지 않는, 구강 내 상피에의 본 발명의 약학적 조성물의 외용 적용 및 조성물의 눈, 귀 및 코 내 점적 (instillation)을 포함한다. "전신 경로"는 경구 경로, 정맥내 경로, 복막내 경로 및 근육내 경로에 의한 투여로서 이해된다. "흡입"은 비강내 경로 및 경구 흡입에 의한 투여로서 이해된다. 이러한 투여에 적합한 투약 형태, 예를 들어, 에어로졸 형태의 제형 또는 정량식 흡입기 (meter dosed inhaler)의 제형은 통상적인 기법을 이용해 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 투여경로는 비강내 경로이다.
본원에서, 용어 "비경구"는 정맥내 경로, 복막내 경로, 근육내 경로 또는 피하 경로에 의한 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하, 근육내 및 정맥내 투약 형태가 일반적으로 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 적절한 투약 단위 형태의 무균성 용액제, 현탁제 또는 동결건조 산물 등의 비경구 투여용으로 설계될 수 있다. 주사가능한 용도로 적합한 약학적 조성물은 무균성 수용액 (수 용해성인 경우) 또는 분산제 및 무균성 주사용 용액 또는 분산제를 즉석 제조하기 위한 무균성 산제를 포함한다. 정맥내 경로에 의해 투여하는 경우, 일부 적합한 담체는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)이다. 모든 경우에, 조성물은 무균성이어야 하며, 주사 용이한 정도로 유동성이어야 한다. 이는 조제 및 저장 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 약제학적으로 허용가능한 폴리올, 예로, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 적합한 이의 혼합물을 포함하는, 용매 또는 분산제일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나, 분산제의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 이용함으로써, 적합한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티오메르살 등을 이용함으로써 달성할 수 있다. 대부분의 경우에, 등장제, 예를 들어, 당; 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨; 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수 (prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 및 젤라틴 모노스테아레이트를 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
주사용 무균성 용액은, 적절한 용매에 필요에 따라 전술한 성분들 중 하나 또는 조합과 더불어 필요한 함량으로 활성 화합물을 첨가한 다음, 멸균 막을 통한 여과에 의해 멸균 처리함으로써, 제조할 수 있다. 통상적으로, 분산제는, 염기성 분산 매질을 포함하는 무균성 비히클에 활성 화합물과 상기 열거된 성분들 중 필요한 나머지 성분을 투입함으로써, 제조한다. 주사용 무균성 용액을 제조하기 위한 무균성 산제의 경우, 바람직한 제조 공정은, 이미 여과된 무균성 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 바람직한 부가적인 성분을 가진 산제를 제조하는, 진공 건조 및 동결건조이다.
본 발명의 약학적 조성물은, 적합하게는, 예를 들어, 조성물의 용량을 줄이면서, 펄스 주입 방식으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투여량은, 부분적으로 투여가 급성 또는 만성인지에 따라, 주사 방식으로, 더 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제1 또는 제2 약학적 조성물은, 임플란트 및 미세캡슐화된 투여 시스템 등의 제어 방출형 제형과 같이, 폴리펩타이드가 체내에서 빨리 소실되지 않도록 보호하는 담체를 사용해, 제조된다. 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합한 폴리머가 사용될 수 있다. 제형의 제조 공정은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 재료는 또한 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.에서 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 서방형 조성물 (sustained release composition)은 현탁액 내에 결정을 유지시킬 수 있는 적합한 제형으로 현탁된 항체 결정의 조제물을 포함한다. 이러한 조제물은, 피하 또는 복막내 경로에 의해 주사하는 경우, 서방성 효과 (sustained release effect)를 발휘할 수 있다. 기타 조성물은 또한 리포좀에 포획된 항체를 포함한다. 이러한 항체를 포함하는 리포좀은 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949 등의 공지된 방법으로 제조된다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 접합체 및 융합 단백질이 생물 막을 통과하여 이동할 수 있음에도 불구하고, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 접합체 또는 융합 단백질을 나노입자로 제형화하는 것이 편리할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서, 용어 "나노입자"는 1-1,000 nm 범위의 직경을 가진 임의 물질을 의미한다. 일부 구현예에서, 나노입자는 2-200 nm 범위, 바람직하게는 2-150 nm 범위, 보다 더 바람직하게는 2-100 nm 범위의 직경을 가진다.
나노입자는, 타겟 장기에 도달할 때까지, 생물학적 체액에서 폴리펩타이드의 온전성 (integrity)을 유지하는데, 기여할 수 있다. 또한, 항-종양제를 포함하는 조성물의 경우, 조성물의 캡슐화는 항-종양제에 의해 유발되는 이차적인 효과를 줄일 수 있다. 마지막으로, 나노입자는, 또한, 대상 장기로의 나노입자의 타겟팅을 허용하는 모이어티를 포함하도록, 변형될 수 있다.
이에, 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 나노입자의 일부를 구성하는 본 발명에 따른 접합체, 융합 단백질 및 조성물을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 적합한 나노입자로는, 지질-기반의 나노입자, 초상자성 나노입자, 나노셀, 반도체 나노결정, 양자점 (quantum dot), 폴리머-기반의 나노입자, 실리콘-기반의 나노입자, 실리카-기반의 나노입자, 금속-기반의 나노입자, 플러린 (fullerene) 및 나노튜브와 같은, 나노 규모의 물질 등이 있다.
타겟화된 전달은, 리간드를 부가함으로써, 폴리펩타이드 페이로드 (payload)를 전달하는 나노입자의 전달력을 해치지 않으면서, 달성할 수 있다. 이는 특정 세포, 조직 및 장기로의 전달이 가능할 수 있을 것으로 고려된다. 리간드-기반의 전달 시스템의 타겟팅 특이성은 여러가지 세포 타입 상의 리간드 수용체의 분포를 기반으로 한다. 타겟팅 리간드는 나노입자에 비-공유적으로 또는 공유적으로 조합될 수 있으며, 본원에 논의된 다양한 방법으로 나노입자에 접합시킬 수 있다.
타겟 나노입자에 사용될 수 있는 단백질 또는 펩타이드의 예로는, 트랜스페린, 락토페린, TGF-베타, 신경 성장인자, 알부민, HIV Tat 펩타이드, RGD 펩타이드 및 인슐린 뿐만 아니라 기타 물질 등이 있다.
본 발명의 산물의 나노입자 제형은 세포 내부로의 산물의 접근을 용이하게 하기 위한 의도가 아니거나 또는 유일한 의도가 아니고, 산물을 분해로부터 보호하거나 및/또는 대상 장기로의 나노입자의 타겟팅을 용이하게 위한 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 임의 타입의 포유류, 바람직하게는 인간에게 투여하기 적합하다.
앞서 언급한 용어 및 구현예들은 본 발명의 이러한 측면에 동일하게 적용가능하다.
의학적 용도
다른 측면에서, 본 발명은, 의약에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은, 필요한 개체에게 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
다른 예로, 본 발명은, 암 예방 및/또는 치료용 의약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동일한 변이체, 본 발명에 따른 접합체, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
"예방"은 질병의 최초 또는 초기 시점에 화합물을 투여하거나 또는 이의 발병을 방지하기 위해 투여하는 것으로서 이해된다.
용어 "치료"는 임상 징후가 나타나기 전 또는 나타난 후 질병의 진행을 제어하기 위해 화합물의 투여를 지시하는 것을 의미한다. 질병의 진행 제어는, 비-제한적으로, 증상의 감소, 질병의 기간 단축, 병리학적 병태 안정화 (특히 부가적인 손상 방지), 질병의 진행 지연, 병리학적 증상 개선 및 (부분 및 완전) 관해를 포함하는, 유익하거나 또는 바람직한 임상적인 결과로서 이해된다. 질병의 진행 제어는 또한 치료하지 않을 경우 예상되는 생존과 비교해 생존성 연장을 수반한다.
본원에서, "개체"는, 암을 가지고 있거나, 암 증상을 나타내거나, 또는 암 발생 또는 암 증상의 발현 위험성이 있는, 모든 동물을 포함한다. 적합한 개체 (환자)는 실험 동물 (예, 마우스, 랫, 토끼 또는 기니아피그), 농장 동물 및 가축 동물 또는 애완 동물 (예, 고양이 또는 개)을 포함한다. 인간을 제외한 영장류, 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
용어 "암"은 통제되지 않은 세포 분열 (또는 생존 증가 또는 세포자살 내성), 다른 이웃 조직으로의 세포 침투성 (침입), 또는 림프관 또는 혈관을 통해 세포가 정상적으로 위치하지 않는 신체 다른 부위로의 전파 (전이)를 특징으로 하는 질병을 지칭한다. 종양이 침입 및 전이에 의해 전파할 수 있는 지의 여부에 따라, 이는 양성 또는 악성으로 분류되며; 양성 종양은 침입 또는 전이에 의해 전파될 수 없는 종양이며, 즉 이는 국소 부위에서만 증식하며; 악성 종양은 침입 및 전이에 의해 전파가능한 종양이다. 본 발명에 따른 방법은 국소 종양 및 악성 종양을 치료하는데 유용하다. 본원에서, 용어 암은, 비-제한적으로, 다음과 같은 유형의 암을 포함한다: 유방암; 담관암; 방광암; 뇌암, 예를 들어, 교모세포종 및 수모세포종; 자궁경부암; 융모암; 대장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 혈액 신생물, 예를 들어, 급성 림프성 및 골수성 백혈병; T-세포 급성 림프모구성 백혈병/림프종; 모상세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; AIDS-관련 백혈병 및 성체 T-세포 백혈병/림프종; 상피내 신생물, 예를 들어, 보웬병 및 파제트병; 간암; 폐암; 림프종, 예를 들어, 호지킨 질환 및 림프성 림프종; 신경모세포종; 구강암, 예를 들어, 편평 세포암; 난소암, 예를 들어, 상피세포, 기질 세포, 생식 세포 및 간엽 세포에서 기원한 암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종, 예를 들어, 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종 및 골육종; 피부암, 예를 들어, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저 세포 암종 및 편평세포암; 고환암, 예를 들어, 림프소절 종양 (germinal tumor), 예로, 정상피종, 비-정상피종 (기형종, 융모암), 기질 종양 및 생식세포종; 갑상선암, 예를 들어, 갑상선 선암종 및 수질암종; 및 신장암, 예를 들어, 선암종 및 윌른 종양. 당해 기술 분야의 당업자들에게 그외 암들도 공지되어 있다. 바람직한 구현예에서, 치료 대상 암은 폐암, 바람직하게는 폐 선암종, 더 바람직하게는 KRas-유발성 폐 선암종이다.
바람직한 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
본 발명의 화합물에 대한 모든 조합 및 암 타입들이 본 발명에 포함된다.
바람직한 구현예에서, 암은 교모세포종 및 비-소 세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"교모세포종"은 교모세포종 및 4기 성상세포종으로 알려져 있으며, 뇌에서 발병하는 가장 일반적이고 가장 공격적인 암이다.
본원에서, 용어 "NSCLC" 또는 "비-소 세포성 폐암"은, 이의 예후 및 관리가 세계 보건기구/국제 폐암 연구 위원회의 조직 분류에 따르면 대략적으로 동일하므로, 이를 총괄적으로 비-균일 질환 (heterogeneous disease) 군으로 지칭된다 (Travis WD et al. Histological typing of lung and pleural tumours. 3rd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999):
1. NSCLC의 30-40%를 차지하는 편평 세포암 (SCC)은 큰 호흡기에서 발생하여 서서히 커지며, 진단 시점에 이들 종양은 크기가 다양하다.
2. 선암종은 NSCLC의 50%-60%를 차지하는 NSCLC의 가장 흔한 서브타입으로, 폐의 가스-교환이 이루어지는 표면 주변에서 발생하고, 차별적인 치료 반응을 나타낼 수 있는 기관지 폐포암을 서브타입으로 포함한다.
3. 라지 세포 암종은 폐의 표면 근처에서 증식하는 빠르게 증식하는 형태이다. 이는 주로 배제 진단이며, 더 많은 조사가 행해지게 되면, 일반적으로 편평세포암 또는 선암종으로 재분류된다.
4. 아데노편평 상피암은 2가지 타입의 세포, 편평 세포 (특정 장기를 라이닝하는 얇고 평평한 세포) 및 샘-유사 세포를 포함하는 암 타입이다.
5. 다형 (pleomorphic), 육종 (sarcomatoid) 또는 육종 인자 (sarcomatous element)를 가진 암종. 이는 조직학적인 이질성 (histological heterogeneity)과 상피 및 간엽 분화에서 연속성 (continuum)을 나타내는 희귀 종양 군이다.
6. 유암종 종양은 느리게 증식하는 신경내분비 폐 종양이며, 신경계에 의해 제공된 자극에 반응하여 호르몬을 방출할 수 있는 세포에서 발생한다.
7. 타액선 타입의 암종은 폐의 큰 기도 내부에 위치한 타액선 세포에서 발생한다.
8. 미-분류 암종은 상기한 폐암 범주로 분류되지 않는 암을 포함한다.
또한 본 발명은 다음에 관한 것이다:
[1]. 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체.
[2]. 상기 폴리펩타이드가 89번 잔기 X가 시스테인이 아닌 서열번호 1의 폴리펩타이드로 구성되거나 또는 상기 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체로 구성되는, [1]에 따른 폴리펩타이드.
[3]. 서열번호 1의 89번 잔기 X가 세린인, [1] 또는 [2]에 따른 폴리펩타이드.
[4]. 서열번호 4로 구성되는, [3]에 따른 폴리펩타이드.
[5]. 하기를 포함하는 접합체:
a. [1]-[4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 및
b. 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티.
[6]. 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체의 세포 흡수를 촉진하는 상기 화학적 모이어티가 세포 침투성 펩타이드 서열이고, 상기 세포 침투성 펩타이드 서열과 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체가 융합 단백질을 형성하는, [5]에 따른 접합체.
[7]. 상기 세포 침투성 펩타이드 서열이 GRKKRRQRRR (서열번호 38) 및 RRRRRRLR (서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택되는, [6]에 따른 접합체.
[8]. 핵 위치화 신호를 더 포함하며, 특히 핵 위치화 신호가 PKKKRKV (서열번호 6), PAAKRVKLD (서열번호 54) 및 KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택되는, [5] 내지 [7] 중 어느 하나에 따른 접합체.
[9]. [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
[10]. [9]에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
[11]. [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드, [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 접합체, [9]에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 [10]에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
[12]. [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 접합체, [9]에 따른 폴리뉴클레오티드, [10]에 따른 벡터 또는 [11]에 다른 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
[13]. 의약에 사용하기 위한, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 접합체, [9]에 따른 폴리뉴클레오티드, [10]에 따른 벡터, [11]에 다른 숙주 세포 또는 [12]에 따른 약학적 조성물의 용도.
[14]. 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, [5] 내지 [8] 중 어느 하나에 따른 접합체, [9]에 따른 폴리뉴클레오티드, [10]에 따른 벡터, [11]에 따른 숙주 세포 또는 [12]에 따른 약학적 조성물의 용도.
[15]. 상기 암이 교모세포종 및 비-소 세포성 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, [14]에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 기능적으로 동일한 변이체, 접합체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 약학적 조성물.
상기에서 기술된 모든 용어 및 구현예들은 본 발명의 이러한 측면에서 동일하게 적용가능하다.
***
이하 본 발명은 후술한 실시예를 들어 상세히 설명되지만, 실시예들은 단지 예에 불과하며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
세포의 Omomyc 및 OmoCS mRNA 형질감염
Omomyc 및 OmoCS 돌연변이를 위한 mRNA를 각각 0.782 mg/mL 및 0.876 mg/mL 농도로 Trilink Biotechnologies 사에서 구입하였다 (ARCA 캡핑됨, 5-메틸-C로 전체 치환되고, 슈도-U로 변형됨).
Omomyc 또는 OmoCS DNA 서열을 벡터의 T7 RNA 중합효소 프로모터 및 3' 말단에 위치한 폴리 (T) 꼬리의 하류에 도입하였다. 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트 변형된-RNA를 T7 RNA 중합효소를 이용한 시험관내 전사로 제조하였다. 또한, RNA를 [3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G] RNA cap 구조 유사체를 사용해 캡핑하였다. 주형 DNA 벡터를 DNAse를 사용해 분해시키고, 남아있는 트리포스페이트를 포스파타제 처리에 의해 제거하였다. 그런 후, RNA 산물을 정제하고, 아가로스-겔 전기영동 및 Nanodrop 각각에 의해 온전성 및 농도를 평가하였다. RNA를 -80℃에 보관하였다.
리포펙타민 메신저MAX 형질감염 시약을 Thermo Fisher Scientific 사에서 구입하였다. A549 및 U87 세포주를 96웰 플레이트에 각각 웰 당 세포 500 및 1000개씩 접종하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)과 1% L-글루타민이 첨가된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) (완전 배지)에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 리포펙타민-mRNA 복합체로 형질감염시켰다. 리포펙타민 2 ㎕에 대해 mRNA 3 ㎍을 무혈청 배지에서 별도로 희석하여, 10분간 인큐베이션하였다. mRNA 및 리포펙타민 희석물을 혼합한 다음 5분간 인큐베이션하여 복합체가 형성되게 하였다. 웰을 무혈청 배지로 2번 헹구었다. 세포를 무혈청 배지 100 ㎕ 중에서 웰 당 mRNA 1 ㎍에서 0.0625 ㎍까지 연속 희석하였다. 각각의 농도에서, 대조군 세포에는 리포펙타민만 처리하였으며, 각 조건에 대해 3세트로 사용하였다. 형질감염 4시간 후, 무혈청 배지 및 mRNA-리포펙타민 복합체를 웰에서 제거하고, 완전 배지로 교체하였다. 세포를 3일간 배양하였다. 그런 후, Promega 사의 CellTiter-Blue를 사용해 생존성을 평가하였다. 무-처리 세포 대비 흡광도를 각각의 조건에서 계산하였다. 통계학적 유의성을 t-검정으로 계산하였다.
세포의 OmoCS 및 OmoCA mRNA 형질감염
OmoCS 및 OmoCA 돌연변이용 mRNA를 Trilink Biotechnologies (ARCA 캡핑됨, 5-메틸-C로 전체 치환되고, 슈도-U로 변형됨) 사에서 구입하였다. OmoCS 및 OmoCA의 mRNA 농도를 Nanodrop을 사용해 각각 0.845 mg/mL 및 0.832 mg/mL로 측정하였다. 리포펙타민 메신저MAX 형질감염 시약을 Thermo Fisher Scientific 사에서 구입하였다. A549 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 세포 500개씩 접종하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS)과 1% L-글루타민이 첨가된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지 (완전 배지)에서 배양하였다. 24시간 후, 세포를 리포펙타민-mRNA 복합체로 형질감염시켰다. 리포펙타민 1.5 ㎕에 대해 mRNA 2 ㎍을 무혈청 배지에서 별도로 희석하여, 10분간 인큐베이션하였다. mRNA 및 리포펙타민 희석물을 혼합한 다음 5분간 인큐베이션하여 복합체가 형성되게 하였다. 웰을 무혈청 배지로 2번 헹구었다. 세포를 무혈청 배지 50 ㎕ (200 nM) 중에서 웰 당 mRNA 1 ㎍에서 시작하여 1:2로 연속 희석하였다. 각각의 농도에서, 대조군 웰로서 세포를 무처리하거나 (비-처리) 또는 리포펙타민만 처리하였다 (Lipo 단독). 각 조건에 대해 3세트로 수행하였다. 형질감염 4시간 후, 무혈청 배지 및 mRNA-리포펙타민 복합체를 웰에서 제거하고, 완전 RPMI 배지로 교체하였다. 세포를 3일간 배양하였다. 이때, 세포 밀도를 크리스탈 바이올렛 염색을 사용해 분석하였다. 무-처리 웰 대비 흡광도를 각각의 조건에서 계산하였다.
실시예 1
놀랍게도, OmoCS 돌연변이는 낮은 농도에서 오리지날 Omomyc 서열과 비교해 보다 우수한 세포 증식 저해성을 나타내었다 (도 1). 이는, 오리지날 Omomyc 서열 대비 개선된 효능은, Omomyc 호모다이머의 산화된 계면 시스테인이 Omomyc와 Myc 또는 Mac 간의 헤테로다이머 형성을 방지함으로써 Omomyc의 활성을 E-박스 결합에 대한 단순 경쟁으로 제한할 것이라는 가설에 의해 적어도 부분적으로 해명될 수 있었다. 오히려, OmoCS 돌연변이는 헤테로다이머 집단의 형성을 촉진함으로써 Omomyc의 다른 생물학적 활성에 유익할 것이다.
실시예 2
놀랍게도, OmoCA 돌연변이는 동일한 증식 분석에서 정확히 OmoCS처럼 거동한다 (도 2).
SEQUENCE LISTING <110> Fundaci?Privada Institut d'Investigaci?Oncol?ica de Vall Hebron FUNDACI?PRIVADA INSTITUCI?CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVAN?TS <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> P13088PC00 <150> EP 16382339 <151> 2016-07-15 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <220> <221> VARIANT <222> (89)..(89) <223> Xaa may be any amino acid except Cysteine <400> 1 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala 85 90 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 2 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala 85 90 <210> 3 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <220> <221> VARIANT <222> (90)..(90) <223> X may be any amino acid except Cysteine <400> 3 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala 85 90 <210> 4 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 4 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala 85 90 <210> 5 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15 Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 45 Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile 50 55 60 Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg 65 70 75 80 Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser 85 90 95 Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 100 105 110 Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125 Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140 Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 195 200 205 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380 Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala 405 410 415 Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 420 425 430 Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445 Leu Arg Asn Ser Cys Ala 450 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 large T Antigen NLS <400> 6 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleoplasmin NLS <400> 7 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CBP80 NLS <400> 8 Arg Arg Arg His Ser Asp Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His Lys Arg 1 5 10 15 Arg Lys <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-I Rev protein NLS <400> 9 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Trp Glu 1 5 10 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HTLV-I Rex <400> 10 Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro 1 5 10 15 Pro Thr <210> 11 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hnRNP A NLS <400> 11 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Lys Pro Arg 20 25 30 Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 12 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rpL23a NLS <400> 12 Val His Ser His Lys Lys Lys Lys Ile Arg Thr Ser Pro Thr Phe Thr 1 5 10 15 Thr Pro Lys Thr Leu Arg Leu Arg Arg Gln Pro Lys Tyr Pro Arg Lys 20 25 30 Ser Ala Pro Arg Arg Asn Lys Leu Asp His Tyr 35 40 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> replace="R or K" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> replace="R or K" <400> 13 Leu Xaa Xaa Xaa 1 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP found in Drosophila antennapedia protein <400> 14 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of Bac-7 <400> 16 Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly 20 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of the HIV-1 TAT protein <400> 17 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of the HIV-1 TAT protein <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Pro Gln 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of the HIV-1 TAT protein <400> 19 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of S413-PV peptide <400> 20 Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15 Lys Arg Lys Val 20 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of penetratin <400> 21 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of SynB1 <400> 22 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of SynB3 <400> 23 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of PTD-4 <400> 24 Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of PTD-5 <400> 25 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of the FHV Coat-(35-49) <400> 26 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of BMV Gag-(7-25) <400> 27 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of HTLV-II Rex-(4-16) <400> 28 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of D-Tat <400> 29 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP R9-Tat <400> 30 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of MAP <400> 31 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of SBP <400> 32 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 33 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of FBP <400> 33 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 34 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of MPG <400> 34 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 35 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of MPG(ENLS) <400> 35 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of Pep-1 <400> 36 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP of Pep-2 <400> 37 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 38 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 39 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg 1 5 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 40 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 41 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 41 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 42 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 43 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 44 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 46 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 47 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 48 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-1 TAT protein <400> 49 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 50 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP <400> 51 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 52 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmoCS*TAT <400> 52 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala Gly Arg Lys Lys Arg 85 90 95 Arg Gln Arg Arg Arg 100 <210> 53 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmoCS*LZArg <400> 53 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala Arg Arg Arg Arg Arg 85 90 95 Arg Arg Arg <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 peptide <400> 54 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2 peptide <400> 55 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly-glycine region <400> 56 Gly Pro Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-tag <400> 57 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag <400> 58 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 59 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 tag <400> 60 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag sequence <400> 61 Ala His Gly His Arg Pro 1 5 <210> 62 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any natural occurring amino acid <400> 62 Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser Gly Met 1 5 10 15 Thr Cys Xaa Xaa Cys 20 <210> 63 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 63 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala 85 90 <210> 64 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OmoCA <400> 64 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala 85 90

Claims (18)

  1. 서열번호 3의 폴리펩타이드로 구성되는 폴리펩타이드로서,
    서열번호 3의 90번 잔기 X가 시스테인이 아닌, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 90번 잔기 X가 세린인, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 4의 서열로 구성되는, 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 90번 잔기 X가 알라닌인, 폴리펩타이드.
  5. 하기 a와 b:
    a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 및
    b. 상기 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티
    를 포함하는 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티가 세포 침투성 펩타이드 서열이고,
    상기 세포 침투성 펩타이드 서열과 상기 폴리펩타이드가 융합 단백질을 형성하는, 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포 침투성 펩타이드 서열이 GRKKRRQRRR (서열번호 38) 및 RRRRRRLR (서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  8. 제5항에 있어서, 핵 위치화 (localization) 신호를 더 포함하며,
    상기 핵 위치화 신호가 PKKKRKV (서열번호 6), PAAKRVKLD (서열번호 54) 및 KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드; 또는
    하기 a와 b:
    a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 및
    b. 상기 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티
    를 포함하는 접합체
    를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드; 또는
    하기 a와 b:
    a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 및
    b. 상기 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티
    를 포함하는 접합체
    를 함유하는, 숙주 세포.
  12. 약학적 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 또는
    하기 a와 b:
    a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 및
    b. 상기 폴리펩타이드의 세포 흡수를 촉진하는 화학적 모이어티
    를 포함하는 약학적 유효량의 접합체; 및
    약제학적으로 허용가능한 부형제
    를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암이 교모세포종 및 비-소 세포성 폐암(Non-Small-Cell-Lung Cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
KR1020197004495A 2016-07-15 2017-07-17 암 치료 조성물 및 방법 KR102232500B1 (ko)

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