TWI829893B - 診斷肺癌的方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種包含Omomyc或其功能等效變體和可檢測標記物的綴合物用於通過肺部施用該綴合物來檢測肺癌的診斷用途。本發明還涉及使用所述綴合物檢測肺癌或對肺癌成像的方法、包括所述綴合物的套組以及包括造影劑或顯像劑的綴合物。

Description

診斷肺癌的方法

本發明包括在診斷領域內，更具體地，包括在借助於一種特異性地積累在增殖細胞中的可示蹤劑的肺癌體內診斷領域內。

肺癌是全世界以及西班牙國內的高致死率的癌症之一，並且這種趨勢是由於沒有症狀和缺乏具有高靈敏性的早期診斷方法導致的。

大多數患者在診斷之前已進入晚期，並且因此未能在早期接受治療。兩種常見的肺癌類型是小細胞肺癌（SCLC）（16.8％）和非小細胞肺癌（NSCLC）（80.4％）。非小細胞肺癌主要包括鱗狀細胞癌、肺腺癌和大細胞肺癌，其中肺腺癌是最常見的肺癌（30％至65％）。肺癌的病因尚不清楚。

當前的醫學研究集中於肺癌早期的診斷和治療。從統計上講，非小細胞肺癌早期患者的5年生存率高達80％，而非小細胞肺癌總的5年生存率僅為15％。因此，診斷和治療肺癌早期很重要。

當前診斷肺癌的方法包括痰液細胞學檢查、影像學檢查、內窺鏡檢查和活檢。痰液細胞學檢查的靈敏度較低。通常用於肺癌的影像學檢查方法包括X射線、CT、MRI（磁共振成像）、超聲、核素成像、PET-CT（正電子發射斷層掃描/電腦斷層掃描）等。影像學檢查方法不夠靈敏，並且通常僅可見尺寸大於1cm的病灶。在內窺鏡檢查中，僅當腫瘤位於內窺鏡可接近的氣道中時，腫瘤才可見。低劑量胸部CT儘管是最公認的診斷方法，但靈敏度有限。像X射線檢查一樣，CT涉及電離輻射，其本身會導致癌症。

未顯示典型症狀的早期患者的診斷率僅為15％。傳統的用於篩查肺癌的方法對於高風險人群是不足的，因為它們的特異性和靈敏度有限，繁重且成本高。這些傳統方法不能顯著地降低肺癌的死亡率。因此，需要用於篩查肺癌的替代或補充方法，以提高對早期肺癌的診斷率，並減少外科手術的次數以降低併發症的風險。

在第一方面，本發明涉及一種綴合物，包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物， 所述綴合物用於通過肺部施用該綴合物來“體內（in vivo ）”診斷有此需要的受試者的肺癌的方法。

在第二方面，本發明涉及一種用於檢測受試者中肺癌細胞或對受試者中肺癌細胞成像的方法，包括： i）鼻內施用一種綴合物，該綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體以及可檢測標記物； ii）等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞；以及 iii）通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或對增殖部位成像。

在第三方面，本發明涉及一種用於診斷肺癌的套組，包括： i）綴合物，包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物， ii）用於鼻滴注或鼻吸入第i）項的綴合物的裝置；以及 iii）用於包裝第i）項和第ii）項的工具。

在第四方面，本發明涉及一種根據本發明第三方面的套組在診斷肺癌或監測肺癌的進展或監測治療效果中的用途。

在第五方面，本發明涉及一種綴合物，包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物，選自由造影劑或顯像劑組成的群組。

本發明涉及提供用於診斷和/或監測肺癌的新試劑。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。

在本發明的一個方面的上下文中公開的所有實施方案也適用於本發明的其他方面。

本發明的綴合物的診斷用途

在此和本發明的每個其他方面提供的定義同樣適用於整個發明。

如實施例中所公開，本發明的發明人已經證明，包含SEQ ID NO：1的多肽以及可檢測標記物例如螢光標記物（AF660）或放射性同位素標記物（⁸⁹ Zr）的綴合物當通過鼻內途徑在體內施用時可以用作肺腫瘤示蹤劑，因為它特異性地積累至癌細胞中，從而能夠區分健康細胞和增殖細胞。出人意料的是，本發明的綴合物在腫瘤中積累達24小時，但卻後從正常組織清除。

因此，在第一方面，本發明涉及一種綴合物，包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物， 其用於通過肺部施用所述綴合物來“體內”診斷有此需要的受試者的肺癌的方法。

在另一方面，本發明涉及一種綴合物用於通過所述綴合物的肺部施用來診斷或檢測受試者的肺癌的用途，所述綴合物包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物。

如本文所用，術語“綴合物”是指結合在一起以使每種化合物的功能保留在綴合物中的兩種或更多種化合物。兩種化合物的鍵合可以是物理或化學相互作用，優選是化學相互作用，更優選是離子鍵或共價鍵；更優選共價鍵。

術語“多肽”和“肽”在本文可互換使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。本發明的多肽可以包含修飾的氨基酸，並且可以被非氨基酸中斷。在一個優選的實施方案中，該多肽僅由氨基酸形成。優選地，形成綴合物的（i）項的多肽的長度為80至500個氨基酸，更優選為80至300個氨基酸，更優選為80至250個氨基酸，更優選為80至150個，甚至更優選為 80至130個氨基酸，優選90至130個氨基酸，優選不超過125個氨基酸，更優選不超過100個氨基酸。在一個優選的實施方案中，多肽的長度為90至98個氨基酸，優選為90至95個氨基酸，更優選為91個氨基酸。

術語“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和非天然（合成）氨基酸，以及作用方式類似於天然存在的氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸類比物。此外，術語“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸（立體異構體），優選L-氨基酸。

術語“天然氨基酸”或“天然存在的氨基酸”包括20種天然存在的氨基酸；通常在體內翻譯後修飾的那些氨基酸，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他不常見的氨基酸，包括但不限於2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。

如本文所用，術語“非天然氨基酸”或“合成氨基酸”是指在位置“a”處被胺基取代並且在結構上與天然氨基酸相關的羧酸或其衍生物。修飾的或不常見的氨基酸的說明性、非限制性實例包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬醯胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸等。

本發明的多肽還可以包含非氨基酸部分，例如與肽連接的疏水部分（各種直鏈、帶支鏈的、環、多環或雜環的烴和烴衍生物）；連接到化合物末端以減少降解的各種保護性基團。1991年的Green和Wuts的"Protecting Groups in Organic Synthesis"，John Wiley and Sons, 第5章和第7章中描述了合適的保護性官能團。

可以包括存在於多肽中的化學（非氨基酸）基團以改善各種生理特性，諸如，降低的降解或清除率、降低的各種細胞泵的排斥力、改善各種施用方式、提高的特異性、增加的親和力、提高的穩定性、生物利用度、溶解度、降低的毒性等。

“類比物”包括類比肽結構的化學結構並保留肽結構的功能特性的分子。設計肽類似物、衍生物和模擬物的方法是本領域已知的。

在一個實施方案中，綴合物的組分（i）是由序列SEQ ID NO：1組成的多肽或由SEQ ID NO：1的功能等效變體組成的多肽，優選地是由序列SEQ ID NO：1組成的多肽。SEQ ID NO：1對應於

序列SEQ ID NO：1的多肽對應於Omomyc蛋白序列。 如本文所用，術語“Omomyc”是指由帶有E61T、E68I、R74Q和R75N突變的Myc蛋白的bHLHZip結構域的突變形式組成的多肽（根據2015年3月15日發佈的NCBI數據庫中登錄號NP_002458下定義的對應於多肽的氨基酸365-454的Myc區的序列給出了突變位置的編號）。下面顯示了NCBI數據庫中以登錄號NP_002458提供的c-Myc的序列（SEQ ID NO：2），其中Omomyc衍生的區域以下劃線示出：

Omomyc還包含c-Myc的M2結構域，具有序列RQRRNELKRSF（SEQ ID NO：3）（參見Dang and Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054）（上面雙下劃線部分），並且其對應於核定位信號。

Omomyc的特徵在於，它顯示出與所有三種致癌Myc蛋白（c-Myc、N-Myc和L-Myc）的增強的二聚能力。Omomyc可以衍生自本領域已知的任何Myc蛋白的bHLHZip結構域，前提是保留導致腫瘤抑制作用的突變。因此，可用於本發明的Omomyc可以來源於任何哺乳動物，包括但不限於家畜和農場動物（牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物），靈長類動物和人類。優選地，Omomyc蛋白來源於人Myc蛋白（登錄號NP_002458，2019年3月12日發佈）。

如本文所用，術語“Myc”是指包括c-Myc、N-Myc和L-Myc的轉錄因子家族。Myc蛋白通過結合共有序列CACGTG（增強子盒序列或E盒並募集組蛋白乙醯轉移酶或HAT）來啟動許多基因的表達。但是，Myc也可以作為轉錄阻遏物。通過結合Miz-1轉錄因子並置換p300輔助激活劑，它可以抑制Miz-1靶基因的表達。Myc在控制DNA複製中也具有直接作用。

Myc b-HLH-LZ或Myc基本區螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鍊結構域是指決定Myc與Max蛋白二聚並與Myc靶基因結合的區域。該區域對應於人Myc的氨基酸365-454，並且其特徵是通過環連接的兩個α螺旋（Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193–205）。

在優選的實施方案中，綴合物的組分（i）是包含由以下所示的SEQ ID NO：4的多肽、由其組成的多肽或基本上由其組成的多肽：。

在本文中，“基本上由……組成”是指指定分子將不包含任何會改變SEQ ID NO：4的活性的其他序列。

優選地，該多肽由SEQ ID NO：4組成。

術語“功能等效變體”是指相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加和/或由一個或多個氨基酸的缺失和/或由於一個或多個氨基酸的保守性置換而得到的任何多肽，和/或由SEQ ID NO：1的多肽的化學修飾而得到的任何多肽，並且其基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性。優選地，功能等效變體是指相對於SEQ ID NO: 1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加和/或由一個或多個氨基酸的缺失和/或由一個或多個氨基酸的保守性置換而得到的任何多肽，並且其基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性；更優選地是指相對於SEQ ID NO：1的多肽由一個或多個氨基酸的插入或添加而得到的任何多肽。

技術人員將理解，腫瘤示蹤活性的保留需要變體能夠穿透到細胞中。因此，Omomyc的功能等效變體能夠跨細胞膜轉位。在將Omomyc的功能等效變體與細胞接觸後，其能夠轉導所述細胞。應當理解，Omomyc的功能等效變體包含在天然Omomyc中發現的蛋白轉導結構域或另一功能性蛋白轉導結構域。因此，在優選的實施方案中，Omomyc的功能等效變體能夠跨細胞膜轉位。

在優選的實施方案中，如果多肽能夠以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率轉導靶細胞，則被認為是SEQ ID NO：1的功能等效變體。

用於確定多肽是否為SEQ ID NO：1的功能等效變體（就其跨細胞膜轉位的能力而言）的合適測定包括用對該多肽特異的試劑標記細胞。本發明的多肽的檢測可以通過使用Omomyc特異性抗體或用合適的螢光團標記的Omomyc，由共聚焦顯微術、流式細胞術、或螢光顯微術測定來進行。該檢測還可以通過細胞分數放射自顯影測定進行，以識別放射性標記的Omomyc。

另外，SEQ ID NO：1的功能等效變體也能夠跨核被膜轉位。在一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體需要能夠跨核被膜轉位。在另一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體不需要能夠跨核被膜轉位。

在優選的實施方案中，如果多肽能夠以SEQ ID NO：1的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率轉位到靶腫瘤細胞的核中，則被認為是SEQ ID NO：1的功能等效變體。

用於確定多肽是否為功能等效變體（就其轉位至核的能力而言）的合適測定包括用上述公開的對該多肽特異的試劑和特異性標記細胞核的染料（如DAPI或Hoechst染料）對細胞進行雙重標記。本發明的多肽的檢測可以通過共聚焦顯微術、流式細胞術、或通過螢光顯微術來進行。

保持腫瘤示蹤活性可能需要該變體能夠與Myc和/或其專性配偶體（partner）p21/p22Max二聚並抑制Myc活性。在一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體不需要與Myc和/或其專性配偶體p21/p22 Max二聚並抑制Myc活性以保持腫瘤示蹤活性。在另一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體需要該變體能夠與Myc和/或其專性配偶體p21/p22Max二聚並抑制Myc活性。

在一些實施方案中，本發明的多肽的功能等效變體的同源二聚化比Omomyc少，或不會因為二硫橋鍵的形成而被迫形成同源二聚體。

如本文所用，“較少的同源二聚化”涉及形成本發明的多肽的專性同源二聚體的能力較低，即使在還原條件下。在一個優選的實施方案中，該能力比形成Omomyc的同源二聚體的能力低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％。如本文所用，還原條件涉及還原劑的存在，該還原劑是在氧化還原化學反應中向另一化學物質提供電子的化合物。還原劑的說明性的非限制性實例是DTT（二硫蘇糖醇）、b-巰基乙醇或TCEP（三（2-羧乙基）膦）。同源二聚體的量在體外（in vitro ）可能是相同的，並且功能等效變體和Omomyc之間的差異僅存在於有異源二聚體配偶體的細胞中，其中不存在二硫鍵使得形成異源二聚體的可能性更高。

幾種測定法可用於確定肽的同源二聚化，例如用圓二色譜監測熱變性的非限制性實例，因此可以通過折疊和熱穩定性定量來檢測二聚化。

合適的功能等效變體包括基本上由SEQ ID NO：1的多肽組成的多肽。在本文中，“基本上由……組成”是指指定分子將不包含會改變SEQ ID NO：1的活性的任何其他序列。

在一個優選的實施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效變體是由相對於SEQ ID NO：1的多肽插入或添加一個或多個氨基酸而產生的多肽。在一個實施方案中，功能等效變體是由插入少於10個氨基酸、更優選少於5個氨基酸、更優選由插入一個氨基酸而產生的。在一個優選的實施方案中，是由插入一個氨基酸即蛋氨酸而產生的。

在另一個實施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效變體是由相對於SEQ ID NO：1的多肽使一個或多個氨基酸缺失而產生的多肽。在一個實施方案中，功能等效變體是由使少於10個氨基酸、更優選少於5個氨基酸缺失而產生，更優選由一個氨基酸缺失而產生。

靶向肽的合適的功能變體是顯示出一致性程度相對於SEQ ID NO：1的肽顯示出約大於25％的氨基酸序列一致性的一致性程度的那些變體，例如25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。使用本領域技術人員眾所周知的電腦演算法和方法確定兩種多肽之間的一致性程度。優選使用如先前所述的BLASTP演算法來確定兩個氨基酸序列之間的一致性[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]。在一個優選的實施方案中，通過SEQ ID NO：1的多肽的整個長度或其變體或兩者的整個長度確定序列一致性。

本發明的多肽的功能等效變體還可以包括翻譯後修飾，例如糖基化、乙醯化、異戊二烯基化、肉豆蔻醯基化、蛋白水解處理等。

靶向肽的合適的功能變體是其中本發明的多肽中的一個或多個位置含有保守性置換上述序列中存在的氨基酸的氨基酸。“保守性氨基酸置換”是由一種氨基酸替換為具有相似結構和/或化學性質的另一種氨基酸。例如，以下六組每一個均包含彼此保守性置換的氨基酸：1）丙氨酸（A）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）；2）天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）；3）天冬醯胺（N）、穀氨醯胺（Q）; 4）精氨酸（R）、賴氨酸（K）; 5）異亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、纈氨酸（V）；和6）苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）。這樣的保守性氨基酸置換的選擇在本領域普通技術人員的技術範圍內，並且由例如Dordo等人（J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739）和Taylor等人（J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218）所描述。

應當理解，Omomyc的功能等效變體在與源自人c-Myc的Omomyc中發現的突變E61T、E68I、R74Q和R75N相對應的位置處包含突變。其中所述突變必須在功能等效變體中發生的位置可以通過不同Myc序列的多序列比對來確定，並且可以通過比對與源自人c-Myc的Omomyc序列中的位置61、68、74和75相對應的那些位置來確定。在一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體在對應於源自人c-Myc的Omomyc中發現的突變E61T、E68I、R74Q和R75N的位置處包含突變。

在另一個實施方案中，Omomyc的功能等效變體在對應於Omomyc序列中E61、E68、R74和R75的位置處包含突變，其中E61已突變為E61A或E61S，E68已突變為E68L、E68M或E68V，R74已突變為R74N，並且R75已突變為R75Q。

多序列比對是成對序列比對的擴展，一次合併超過兩個序列。多比對方法比對給定查詢集中的所有序列。優選的多序列比對程式（及其演算法）是ClustalW、Clusal2W或ClustalW XXL（參見Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680）。如本文所述，一旦比較（比對）了來自不同生物體的c-Myc序列和來自變體的序列，本領域技術人員可以容易地識別每個序列中與在Omomyc中發現的E61T、E68I、R74Q和R75N位置相對應的位置，並在Omomyc變體中引入與源自人的c-Myc的Omomyc中發現的E61T、E68I、R74Q和R75N突變相對應的突變。

在一個優選的實施方案中，SEQ ID NO：1的功能等效變體包括具有一個或多個、優選具有所有以下特徵的那些序列：與Myc二聚並抑制其活性的能力，跨細胞膜轉位，向核轉位，無法形成同源二聚體或相比Omomyc形成同源二聚體的能力降低。

用於確定多肽是否可以被視為Omomyc的功能等效變體的合適測定包括但不限於：

-測量多肽與Max和Myc形成二聚複合體的能力的測定，例如如Soucek等人（Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472）所述的基於報告基因的表達的測定以及PLA（蛋白質連接測定）或免疫共沉澱。

-測量多肽結合DNA內的Myc/Max識別位點（CACGTG位點）的能力的測定，例如Soucek等人（同上）描述的電泳遷移率測定（EMSA）。

-測量抑制Myc誘導的反式激活的能力的測定，如Soucek等人（同上）所述的基於在Myc/Max特異的DNA結合位點的控制下的報告基因的表達的測定。

-基於多肽抑制表達myc致癌基因的細胞生長的能力的測定，如Soucek等人（同上）所述。

-測量多肽增強myc誘導的細胞凋亡能力的測定，例如Soucek等人（Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472）所述的測定。此外，可以使用本領域中通常已知的用於評估細胞凋亡的任何測定，例如Hoechst染色、碘化丙啶（PI）或膜聯蛋白V染色、錐蟲藍、DNA梯化/片段化和TUNEL。

-使用Omomyc特異性抗體或用合適的螢光團標記的Omomyc進行流式細胞術或螢光顯微術分析。

-細胞分數放射自顯影測定可識別放射性標記的Omomyc。

在一個優選的實施方案中，如果多肽在一種或多種上述測定中顯示出天然Omomyc的活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的活性，則認為該多肽是Omomyc的功能等效變體。

在一個具體實施方案中，SEQ ID NO：1的多肽的功能等效變體包含SEQ ID NO：1的多肽，其中SEQ ID NO：1的位置89處的殘基X不是半胱氨酸。優選地，SEQ ID NO：1的位置89處的殘基X是脂族氨基酸、或硫代氨基酸、或二羧酸氨基酸或其醯胺、或具有兩個堿性基團的氨基酸、或芳族氨基酸、或環狀氨基酸、或羥基化氨基酸。氨基酸更優選地選自絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸，優選地選自絲氨酸和丙氨酸。

下表中公開了SEQ ID NO：1的合適的功能等效變體，其在SEQ ID NO：1的位置89處具有的殘基X不是半胱氨酸。

因此，在一個優選的實施方案中，SEQ ID NO：1的多肽的功能等效變體選自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10組成的群組。

在一個具體的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物另外包含促進細胞攝取包含SEQ ID NO：1的多肽或SEQ ID NO：1的多肽的功能等效變體的化學部分。

在另一個實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物不包含促進細胞攝取包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的化學部分。

術語“化學部分”是指包含至少一個碳原子的任何化合物。化學部分的實例包括但不限於任何富含疏水性氨基酸和疏水性化學部分的肽鏈。

在優選的實施方案中，根據本發明的綴合物包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、或更多個促進細胞攝取多肽或所述多肽的功能等效變體的化學部分。

在一個實施方案中，促進多肽被細胞攝取的化學部分是脂質或脂肪酸。

脂肪酸通常是包含碳鏈且在該鏈的末端具有酸性部分（例如，羧酸）的分子。脂肪酸的碳鏈可以具有任何長度，但是，優選地，碳鏈的長度為至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、或更多個碳原子、以及其中可衍生的任何範圍。在某些實施方案中，碳鏈的長度在脂肪酸的鏈部分中為4至18個碳原子。在某些實施方案中，脂肪酸碳鏈可以包含奇數個碳原子，然而，在某些實施方案中，鏈中偶數個碳原子可能是優選的。在其碳鏈中僅包含單鍵的脂肪酸稱為飽和脂肪酸，而在其鏈中包含至少一個雙鍵的脂肪酸稱為不飽和脂肪酸。脂肪酸可以是帶支鏈的，儘管在本發明的優選實施方案中，它是無支鏈的。具體的脂肪酸包括但不限於亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸、月桂酸、肉豆蔻酸、花生酸、棕櫚油酸、花生四烯酸。

在一個優選的實施方案中，促進細胞攝取包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的化學部分是細胞穿透肽序列，在這種情況下，綴合物將包括融合蛋白，所述融合蛋白包括包含 SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體和細胞穿透肽序列。

術語“融合蛋白”涉及通過基因技術產生的蛋白，其由兩個或更多個衍生自不同蛋白的功能域組成。融合蛋白可以通過常規方式獲得，例如，通過編碼所述融合蛋白的核苷酸序列在合適的細胞中的基因表達。應當理解，細胞穿透肽是指與形成包含SEQ ID NO：1的多肽或SEQ ID NO：1的功能等效變體的一部分的細胞穿透肽不同的細胞穿透肽。

術語“細胞穿透肽序列”在本說明書中與“CPP”、“蛋白轉導結構域”或“PTD”互換使用。它是指可變長度的指導蛋白質在細胞內的運輸的肽鏈。向細胞內的遞送過程通常通過內吞作用發生，但也可以通過直接的膜轉位將肽內化到細胞中。CPP通常具有氨基酸組成，其包含較高相對豐度的帶正電荷的氨基酸（如賴氨酸或精氨酸），或具有包含極性/帶電氨基酸和非極性疏水性氨基酸交替模式的序列。

可以用於本發明的CPP的實例包括但不限於在果蠅的觸角足突變蛋白中發現的CPP（RQIKIWFQNRRMKWKK，SEQ ID NO:13）；單純皰疹病毒1（HSV-1）VP22 DNA結合蛋白中發現的CPP（DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE，SEQ ID NO：14）；Bac-7的CPP（RRIRPRPPRLPRPRPRPLPLPFPRPG; SEQ ID NO：15）；由氨基酸49-57（RKKRRQRRR，SEQ ID NO：16）組成的HIV-1 TAT蛋白的CPP；由氨基酸48-60（GRKKRRQRRRTPQ，SEQ ID NO：17）組成的HIV-1 TAT蛋白的CPP；由氨基酸47-57（YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO：18）組成的HIV-1 TAT蛋白的CPP; S413-PV肽的CPP（ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; SEQ ID NO：19）；penetratin的CPP（RQIKWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO：20）；SynB1的CPP（RGGRLSYSRRRFSTSTGR; SEQ ID NO：21）；SynB3的CPP（RRLSYSRRRF; SEQ ID NO：22）；PTD-4的CPP（PIRRRKKLRRLK; SEQ ID NO：23）；PTD-5的CPP（RRQRRTSKLMKR; SEQ ID NO：24）、FHV Coat-（35-49）的CPP（RRRRNRTRRNRRRVR; SEQ ID NO：25）；BMV Gag-（7-25）的CPP（KMTRAQRRAAARRNRWTAR; SEQ ID NO：26）；HTLV-II Rex-（4-16）的CPP（TRRQRTRRARRNR; SEQ ID NO：27）；D-Tat的CPP（GRKKRRQRRRPPQ; SEQ ID NO：28）；CPP R9-Tat（GRRRRRRRRRPPQ; SEQ ID NO：29）；MAP的CPP（KLALKLALKLALALKLA; SEQ ID NO：30）；SBP的CPP（MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO：31）；FBP的CPP（GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO：32）；MPG的CPP（ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO：33）；MPG（ENLS）的CPP（ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; SEQ ID NO：34）；Pep-1的CPP（ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKRK-cya; SEQ ID NO：35）；Pep-2的CPP（ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKRK-cya; SEQ ID NO：36）；具有結構RN（其中N介於4至17之間）的聚精氨酸序列；GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：37）、RRRRRRLR序列（SEQ ID NO：38）、RRQRRTS KLMKR序列（SEQ ID NO：39）；Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（SEQ ID NO：40）；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA（SEQ ID NO：41）；RQIKIWFQNRRMKWKK（SEQ ID NO：42）；YGRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：43）；RKKRRQRR序列（SEQ ID NO：44）；YARAAARQARA序列（SEQ ID NO：45）；THRLPRRRRRR序列（SEQ ID NO：46）；GGRRARRRRRR序列（SEQ ID NO：47）。

在一個優選的實施方案中，所述細胞穿透肽不是SEQ ID NO：1中包含的內源性肽。

在一個優選的實施方案中，CPP是由氨基酸49-57（RKKRRQRRR，SEQ ID NO：16）組成的HIV-1 TAT蛋白的CPP。在另一個優選的實施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：37）或RRRRRRLR（SEQ ID NO：38）。在另一個實施方案中，CPP是GRKKRRQRRR序列（SEQ ID NO：37）或RRRRRRRR（SEQ ID NO：65）。

在一些實施方案中，CPP是如WO2019/018898中所述的CPP，其內容通過引用整體併入本文。

在一個實施方案中，細胞穿透肽序列在本發明的多肽或所述多肽的功能等效變體的N-末端融合。在另一個實施方案中，細胞穿透肽在本發明的多肽或所述多肽的功能等效變體的C-末端融合。

在優選的實施方案中，除了在SEQ ID NO：1的多肽或所述多肽的功能等效變體中發現的自身細胞穿透肽外，本發明的綴合物或融合蛋白還包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個其他細胞穿透肽。

本發明合適的融合蛋白包括如下定義的多肽Omomyc*TAT和Omomyc*LZArg：

因此，在優選的實施方案中，融合蛋白是選自SEQ ID NO：11和12的多肽。

用於確定綴合物是否保留Omomyc的細胞膜轉位能力的合適測定包括但不限於測量綴合物轉導培養細胞的能力的測定。該測定基於使綴合物與培養細胞接觸並檢測在細胞內的位置中綴合物的存在。

在另一個優選的實施方案中，本發明的綴合物還包含另外的核定位信號。

如本文所用，術語“核定位信號”（NLS）是指長度為約4-20個氨基酸殘基的氨基酸序列，其用於將蛋白質引導至核。典型地，核定位序列富含鹼性氨基酸，並且示例性序列是本領域眾所周知的（Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7）。在一些實施方案中，NLS選自由以下組成的群組：SV40大T抗原NLS（PKKKRKV，SEQ ID NO：48）；核質蛋白（Nucleoplasmin）NLS（KRPAATKKAGQ AKKKK，SEQ ID NO：49）；CBP80 NLS（RRRHSDENDGGQPHKRRK，SEQ ID NO：50）; HIV- I Rev蛋白NLS（RQARRNRRRWE，SEQ ID NO：51）；HTLV-I Rex（MPKTRRRPRRSQRKRPPT，SEQ ID NO：52）; hnRNP A NLS（NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY，SEQ ID NO：53）；rpL23a NLS（VHSHKKKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY，SEQ ID NO：54）。在本發明的一個實施方案中，核定位信號包含基序K（K/R）X（K/R）（SEQ ID NO：55）。

在另一個優選的實施方案中，NLS可以在包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的綴合物或融合蛋白的N-末端或C-末端。

技術人員將理解，可以期望的是，根據本發明所述之用途的綴合物還包含一種或多種柔性肽，其連接包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、細胞穿透肽序列和/或NLS。因此，在一個具體實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體直接連接到細胞穿透肽序列。在另一個具體實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體通過柔性肽連接至細胞穿透肽序列。在一個實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能變體直接連接至NLS。在另一個實施方案中，包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體通過柔性肽連接至NLS。

在一個具體的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物的多肽直接連接至細胞穿透肽序列和NLS。

在一個實施方案中，NLS是在Myc序列中內源地出現的NLS之一，例如M1肽（PAAKRVKLD，SEQ ID NO：56）或M2肽（RQRRNELKRSF，SEQ ID NO：57）。

在另一個實施方案中，另外的NLS是指與在包含SEQ ID NO：1的多肽中或在SEQ ID NO：1的功能等效變體中發現的內源性NLS不同的NLS。

在優選的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物或融合蛋白除了在本發明的多肽或其功能等效變體中發現的內源性NLS外，還包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個NLS。

在另一個具體實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物的多肽通過第一柔性肽接頭（flexible peptide linker）連接至細胞穿透肽序列，並通過第二柔性肽接頭連接至NLS。

如本文所用，術語“柔性肽”、“間隔肽”或“接頭肽”是指共價結合兩個蛋白質或部分但不屬於任一多肽的一部分的肽，允許一個相對於另一個移動，其不會對任一蛋白質或部分的功能產生實質性的有害影響。因此，柔性接頭不影響多肽序列的腫瘤示蹤活性、細胞穿透肽的細胞穿透活性或NLS的核定位能力。

柔性肽包含至少1個氨基酸、至少2個氨基酸、至少3個氨基酸、至少4個氨基酸、至少5個氨基酸、至少6個氨基酸、至少7個氨基酸、至少8個氨基酸酸、至少9個氨基酸、至少10個氨基酸、至少12個氨基酸、至少14個氨基酸、至少16個氨基酸、至少18個氨基酸、至少20個氨基酸、至少25個氨基酸、至少30個氨基酸、至少35個氨基酸、至少40個氨基酸、至少45個氨基酸、至少50個氨基酸、至少60個氨基酸、至少70個氨基酸、至少80個氨基酸、至少90個氨基酸，或大約100個氨基酸。在一些實施方案中，柔性肽允許一種蛋白質相對於另一種蛋白質移動，以增加蛋白質的溶解度和/或改善其活性。合適的接頭區域包括聚甘氨酸區域，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸殘基的組合的GPRRRR序列（SEQ ID NO：58）。

在一個甚至更優選的實施方案中，核定位信號選自由PKKKRKV（SEQ ID NO：48）、PAAKRVKLD（SEQ ID NO：56）和KRPAATKKAGQ AKKKK（SEQ ID NO：49）組成的群組。

在一個具體的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物包含與綴合物結合或與所述多肽或其融合蛋白或變體的C-末端或N-末端結構域結合的標籤。所述標籤通常是可以用於所述融合蛋白的分離或純化的肽或氨基酸序列。因此，所述標籤能夠以高親和力結合至一個或多個配體，例如親和基質（如色譜載體和珠子）的一個或多個配體。所述標籤的實例是組氨酸標籤（His-標籤或HT），例如包含6個組氨酸殘基（His6或H6）的標籤，其可以以高親和力結合至鎳（Ni²⁺ ）柱或鈷（Co²⁺ ）柱。His-標籤具有預期的功能，即可以在使大多數蛋白質變性且破壞大多數蛋白質-蛋白質相互作用的條件下結合其配體。因此，在誘餌蛋白參與的蛋白質-蛋白質相互作用被破壞後，它可以用於去除帶有H6標籤的誘餌蛋白。

用於分離或純化綴合物或包含SEQ ID NO：1的多肽或其變體或融合蛋白的標籤的其他說明性的非限制性實例包括Arg-標籤；FLAG-標籤（DYKDDDDK；SEQ ID NO：59）；Strep-標籤（WSHPQFEK，SEQ ID NO：60）；能夠由抗體識別的表位，例如c-myc-標籤（由抗c-myc抗體識別）、HA 標籤（YPYDVPDYA，SEQ ID NO：61）、V5 標籤（GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO：62）、SBP- 標籤、S-標籤、鈣調蛋白結合肽、纖維素結合結構域、甲殼素結合結構域、谷胱甘肽S-轉移酶標籤、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-標籤等（Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525）；氨基酸序列如AHGHRP（SEQ ID NO：63）或PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC（SEQ ID NO：64）；β-半乳糖苷酶等。

如果需要，標籤可以用於所述融合蛋白的分離或純化。

在一個優選的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物用於肺癌的診斷，其中肺癌是選自小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）的原發性腫瘤，或癌症轉移。

包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體用於通過與可檢測標記物綴合來製備診斷試劑。

在另一方面，本發明涉及根據本發明的第一方面的綴合物在製備診斷試劑中的用途。

在本發明的上下文中，術語“診斷試劑”應理解為包括經修飾的包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的試劑，從而可以在施用於個體後對其進行檢測。

術語“可檢測標記物”、“顯像劑”、“成像化合物”和“造影劑”在本文中可互換使用，並且是指具有直接或間接被檢測的能力的生物相容性化合物，其使用通過增加圖像的這些不同區域之間的“對比度”有助於區分圖像的不同部分。它們是指原子、分子、化合物或其他物質，其通過本領域已知並在下文中描述的體內方法有助於診斷、檢測或視覺化與攝取包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體有關的癌症或其他病況。

根據本文所述的實施方案，可檢測標記物可以包括但不限於放射性物質（例如，放射性同位素、放射性核素、放射性標記物或放射性示蹤劑）、染料、造影劑、螢光化合物或分子、生物發光化合物或分子、酶和增強劑（例如順磁離子）。另外，應注意，一些納米顆粒（例如量子點和金屬納米顆粒（如下所述））也可能適合用作檢測試劑。

在優選實施方案中，可檢測標記物是放射性物質，優選放射性同位素。

根據本公開的實施方案，可以用作可檢測標記物的放射性物質包括但不限於¹⁸ F、³² P、³³ P、⁴⁵ Ti、⁴⁷ Sc、⁵² Fe、⁵⁹ Fe、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、⁷⁵ Sc、⁷⁷ As、⁸⁶ Y、⁹⁰ Y、⁸⁹ Sr、⁸⁹ Zr、⁹⁴ Tc、⁹⁴ Tc、⁹⁹ mTc、⁹⁹ Mo、¹⁰⁵ Pd、¹⁰⁵ Rh、¹¹¹ Ag、¹¹¹ In、¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、¹⁴² Pr、¹⁴³ Pr、¹⁴⁹ Pm、¹⁵³ Sm、¹⁵⁴ -¹⁵⁸¹ Gd、¹⁶¹ Tb、¹⁶⁶ Dy、¹⁶⁶ Ho、¹⁶⁹ Er、¹⁷⁵ Lu、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、¹⁸⁹ Re、¹⁹⁴ Ir、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、²¹¹ At、²¹¹ Pb、²¹² Bi、²¹² Pb、²¹³ Bi、²²³ Ra和²²⁵ Ac。根據本公開的實施方案，可以用作可檢測標記物的順磁離子包括但不限於過渡金屬離子和鑭系金屬離子（例如，原子序數為6至9、21至29、42、43、44或57至71的金屬）。這些金屬包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的離子。在更優選的實施方案中，放射性物質或放射性同位素為⁸⁹ Zr。

當可檢測標記物是放射性金屬或順磁離子時，標記物可以與具有長尾的試劑反應，其中一個或者多個螯合基團附著於該長尾用於結合這些離子。在那種情況下，螯合基團可以共價地附著於包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效物。長尾可以是聚合物，例如聚賴氨酸、多糖、或其他具有能夠結合至螯合基團以結合離子的側基的衍生鏈或可衍生鏈。可以根據本公開使用的螯合基團的實例包括但不限於乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、DOTA、NOTA、NETA、卟啉、多胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟、DFO（去鐵胺-馬來醯亞胺）等基團。這些螯合物當與非放射性金屬（例如錳、鐵和釓）絡合時可以用於MRI。大環螯合物如NOTA、DOTA和TETA可分別與多種金屬和放射性金屬（包括但不限於鎵、釔和銅的放射性核素）一起使用。可以使用因穩定結合核素（例如用於RAIT的²²³ Ra）而受到關注的其他環型螯合物（例如大環聚醚）。在某些實施方案中，螯合部分可以用於將PET成像試劑（例如AI-¹⁸ F絡合物或DFO-⁸⁹ Zr）附著於用於PET分析的靶向分子。在一個優選的實施方案中，螯合基團是DFO。在一個更優選的實施方案中，綴合物是Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr。

根據本公開的實施方案，可以用作可檢測標記物的酶包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶或β-內醯胺酶。這些酶可以與色原、螢光化合物或發光化合物結合使用以產生可檢測的信號。

因此，術語“造影劑”包括用於增強圖像品質的試劑，所述圖像在不存在這種試劑的情況下仍然可以產生（例如，在MRI中就是這種情況），以及作為產生圖像的前提的試劑（例如，在核成像中就是這種情況）。合適的造影劑包括但不限於用於放射性核素成像、用於電腦斷層掃描、用於拉曼光譜、用於磁共振成像（MRI）和用於光學成像的造影劑。

在本發明的上下文中，造影劑可以是本發明的綴合物的一部分，或者可以與本發明的綴合物一起施用，以便獲得可以疊加例如用電腦斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）獲取的圖像的核醫學圖像，以產生特殊視圖，這種做法稱為圖像融合或共配准。這些視圖使得來自兩種不同檢查的資訊能夠在一張圖像上關聯在一起並進行解釋，從而獲得更精確的資訊和更準確的診斷。在一個具體實施方案中，在能夠同時進行兩種成像檢查的單光子發射電腦斷層掃描/電腦斷層掃描（SPECT/CT）和正電子發射斷層掃描/電腦斷層掃描（PET/CT）單元甚至PET/MRI中同時進行放射性核素標記的綴合物的檢測和參考身體圖像或截面的獲取。

用於放射性核素成像的造影劑包括通常用正電子發射體（例如，¹¹ C、¹³ N、¹⁵ O、¹⁸ F、⁸² Rb、⁶² Cu和⁶⁸ Ga）標記的放射性藥物。SPECT放射性藥物通常用正電子發射體如⁹⁴ mTc、²⁰¹ Tl和⁶⁷ Ga標記。放射性核素成像模式（正電子發射斷層掃描（PET）；單光子發射電腦斷層掃描（SPECT））是診斷性截面成像技術，其繪製放射性核素標記的放射性示蹤劑的位置和濃度。PET和SPECT可以用於定位和表徵放射性核素。在PET中，當發射正電子的放射性綴合物移動通過人體時，可以監測該物質。與PET密切相關的是單光子發射電腦斷層掃描或SPECT。兩者之間的主要區別在於，SPECT使用發射低能量光子的放射性示蹤劑代替了發射正電子的物質。

用於CT成像的造影劑包括例如碘化造影劑或溴化造影劑。這些試劑的實例包括碘酞酸鹽（iothalamate） 、碘海醇（iohexyl）、泛影酸鹽（diatrizoate）、碘異酞醇（iopamidol）、乙碘油（ethiodol）和碘番酸鹽（iopanoate）。釓試劑也已被報導用作CT造影劑。例如，釓噴酸鹽（gadopentate）試劑已被用作CT造影劑。在本發明的上下文中，電腦斷層掃描（CT）被認為是成像模式。通過從不同角度拍攝一系列X光片（有時超過一千片），然後用電腦將其結合，CT使得能夠建立身體任何部位的三維圖像。電腦被程式設計為從任何角度和任何深度顯示二維切片。在CT中，當初始CT掃描不具診斷性時，諸如本文所述的不透射線的造影劑可以協助識別和描繪軟組織腫塊。

用於光學成像的造影劑包括，例如、螢光素、螢光素衍生物、吲哚菁綠、俄勒岡綠、俄勒岡綠衍生物、若丹明綠、若丹明綠衍生物、曙紅、赤蘚紅、德克薩斯紅、德克薩斯紅衍生物、孔雀石綠、納米金磺基琥珀醯亞胺酯、級聯藍、香豆素衍生物、萘、吡啶噁唑衍生物、級聯黃染料、達巴氧基（dapoxyl）染料和本文公開的各種其他螢光化合物。

在優選的實施方案中，造影劑是能夠通過磁共振成像裝置成像的化合物。可以通過磁共振成像裝置成像的造影劑不同於在其他成像技術中使用的造影劑。它們的目的是幫助區分具有相同信號特性的組織成分，並縮短弛豫時間（這將在T1加權的自旋回波MR圖像上產生更強的信號，而將在T2加權的圖像上產生較弱的信號）。 MRI造影劑的實例包括釓螯合物、錳螯合物、鉻螯合物和鐵顆粒。在一個具體實施方案中，MRI造影劑為¹⁹ F。CT和MRI均提供有助於區分組織邊界的解剖資訊。與CT相比，MRI的缺點包括患者的耐受性較低，對起搏器和某些其他植入的金屬裝置有禁忌症以及與多種原因相關的偽影，其中最重要的是動態CT，在另一方面，動態CT速度快、耐受性好，且容易獲得，但對比度解析度低於MRI，並且需要碘化的造影劑和電離輻射。CT和MRI的一個缺點是兩種成像模式都無法在細胞水準上提供功能資訊。例如，兩種模式都不能提供有關細胞活力的資訊。磁共振成像（MRI）是一種比CT更新的成像模式，其使用高強度磁體和射頻信號來生成圖像。生物組織中最豐富的分子種類是水。水質子核的量子力學“自旋”最終在成像實驗中產生信號。在MRI中，將待成像的樣品置於強大的靜磁場（1-12特斯拉）中，並用射頻（RF）輻射脈衝激發自旋，從而在樣品中產生淨磁場。然後，各種磁場梯度和其他RF脈衝作用於自旋，以將空間資訊編碼為記錄的信號。通過收集和分析這些信號，可以計算出通常（像CT圖像一樣）以二維切片形式顯示的三維圖像。

MRI造影劑包括金屬絡合物，所述金屬選自由鉻（III）、錳（II）、鐵（III）、鐵（II）、鈷（II）、鎳（II）、銅（II）、釹（ III）、釤（III）、鐿（III）、釓（III）、釩（II）、鋱（III）、鏑（III）、鈥（III）和鉺（III）組成的群組。在一個優選的實施方案中，能夠通過磁共振成像裝置成像的化合物是釓基化合物。

如本文所用，術語“釓基化合物”是指，當就肺成像而使用時，可施用於受試者導致血管內增強的任何含釓的物質。在另一個實施方案中，含釓造影劑選自由釓、gadolinium pentate和釓雙胺(gadoliamide)組成的群組。

將可檢測標記物與包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體綴合有幾種形式。在一個具體的實施方案中，綴合將通過馬來醯亞胺介導的方法進行，即通過將馬來醯亞胺-DFO（或其他螯合基團）與Omomyc結合，或使馬來醯亞胺-AF660（或其他螢光團）與Omomyc結合，並且後者的馬來醯亞胺與Omomyc的C-末端處的唯一的半胱氨酸殘基反應。使用馬來醯亞胺標記的標準程式進行該偶聯反應。

例如，該化學標記步驟也可以通過其他化學試劑例如NHS-（通過遊離胺進行標記）或例如二硫化偶聯劑來進行。

通過體內成像模式（例如磁共振成像（MRI）、正電子發射斷層掃描（PET）或microPET、電腦斷層掃描（CT）、PET/CT組合成像器、冷電荷耦合器件（CCD）、相機光學成像、光學成像和單光子發射電腦斷層掃描（SPECT）來檢測根據本發明所述之用途的綴合物的存在、不存在、濃度、位置或特定分佈。

在一個甚至更優選的實施方案中，在施用綴合物之後通過mPET/mCT或PET/CT成像（優選mPET/mCT）來進行癌細胞的檢測。

本發明還提供了多模式成像方法。本發明的某些實施方案涉及使用涉及測量多個信號的多成像模式來對受試者或受試者內的部位進行成像的方法。在某些實施方案中，多個信號由細胞上或細胞中的單個標記產生。如上所述，本領域普通技術人員已知的任何成像模式都可以應用於本發明成像方法的這些實施方案中。

在綴合物施用期間或之後的任何時間進行成像模式。例如，可以在施用本發明的綴合物的期間（即，以幫助引導遞送到特定位置）或者在此後的任何時間進行成像研究。

額外的成像模式可以與第一成像模式同時執行，或者在第一成像模式之後的任何時間執行。例如，可以在完成第一成像模式之後約1秒、約1小時、約1天或任何更長的時間段，或者在這些規定的時間之間的任何時間執行額外的成像模式。在本發明的某些實施方案中，多成像模式被同時執行，使得它們在使用綴合物之後同時開始。本領域普通技術人員會熟悉本發明所設想的各種成像模式的性能。

在本發明的成像方法的一些實施方案中，同一成像裝置用於執行第一成像模式和第二成像模式。在其他實施方案中，不同的成像裝置用於執行不同的成像模式。本領域普通技術人員會熟悉可用於執行本文所述的成像模式的成像裝置。

本發明提供了使用一種或多種成像模式對細胞進行成像的方法。在一些實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物具有超過一種的可檢測標記物或具有多個、相等或不同的可檢測標記物，其與包含SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體連接。在其他實施方案中，綴合物與單個可檢測標記物連接。在某些實施方案中，單個可檢測標記物是多模式可檢測標記物。

在一個優選的實施方案中，可檢測標記物選自由以下組成的群組：¹⁸ F、³² P、³³ P、⁴⁵ Ti、⁴⁷ Sc、⁵² Fe、⁵⁹ Fe、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、⁷⁵ Sc、⁷⁷ As、⁸⁶ Y、⁸⁹ Sr、⁸⁹ Zr、⁹⁴ Tc、⁹⁴ Tc、⁹⁹ mTc、⁹⁹ Mo、¹⁰⁵ Pd、¹⁰⁵ Rh、¹¹¹ Ag、¹²³ I、¹²⁴ I、¹⁴² Pr、¹⁴³ Pr、¹⁴⁹ Pm、¹⁵³ Sm、¹⁵⁴ -¹⁵⁸¹ Gd、¹⁶¹ Tb、¹⁶⁶ Dy、¹⁶⁶ Ho、¹⁶⁹ Er、¹⁷⁵ Lu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁹ Re、¹⁹⁴ Ir、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、²¹¹ Pb、²¹² Bi、²¹² Pb、²²³ Ra和²²⁵ Ac。在更優選的實施方案中，放射性物質或放射性同位素為⁸⁹ Zr。

在本發明的該方面的實施方案中，綴合物不包含細胞穿透肽序列。在另一個實施方案中，綴合物不包含促進細胞攝取SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的化學部分。在本發明的綴合物的另一個實施方案中，綴合物不包含螢光標記物或放射性同位素，更優選地，綴合物不包含螢光素-馬來醯亞胺（FITC）或選自由¹³¹ I、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁸ Re、⁶⁷ Cu、²¹¹ At、²¹³ Bi、¹²⁵ I和¹¹¹ In組成的群組的放射性同位素。在另一個實施方案中，本發明的綴合物不包含細胞穿透肽序列、螢光標記物或放射性同位素，更優選不包含螢光素-馬來醯亞胺（FITC），或選自由¹³¹ I、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁸ Re、⁶⁷ Cu、²¹¹ At、²¹³ Bi、¹²⁵ I和¹¹¹ In組成的群組的放射性同位素。

在另一個實施方案中，本發明的綴合物不包括螢光基團、生物素、PEG、氨基酸類似物、非天然氨基酸、磷酸基團、糖基基團、放射性同位素標記物、標籤（例如組氨酸標籤、Arg-標籤、FLAG-標籤、Strep-標籤）、能夠被抗體識別的表位（例如c-myc-標籤、HA標籤、V5標籤、SBP-標籤、S-標籤、鈣調蛋白結合肽、纖維素結合結構域、甲殼素結合結構域、谷胱甘肽S-轉移酶標籤、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi標籤）、氨基酸序列（例如AHGHRP（SEQ ID NO：63）、或PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC（SEQ ID NO：64））、或β-半乳糖苷酶等。

術語“診斷”或“檢測”在本文中被模糊地使用，並且是指對病理狀況的存在或特徵的識別。如本文所用，術語“診斷”既指嘗試確定和/或識別受試者可能患有疾病的過程，即診斷程式，也指通過該過程所達成的意見，即診斷意見。這樣，它也可以被認為是嘗試將個人病況分類為單獨的和不同的類別，從而可以做出有關治療和預後的醫學決定。如本領域技術人員將理解的，儘管對於待診斷的受試者來說，這樣的診斷可能不是100％正確的，但它是優選的。然而，該術語要求統計學顯著部分的受試者可以被識別為患有疾病，特別是本發明上下文中的增殖性疾病。本領域技術人員可以使用眾所周知的不同統計評估工具，例如通過確定置信區間、p值確定、Student’s檢驗、Mann-Whitney等，來確定一方是否是統計學顯著的。優選的置信區間為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。p值優選為0.05、0.025、0.001或更低。

在一個實施方案中，診斷方法包括： a）向受試者肺部施用綴合物，所述綴合物包括包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體以及可檢測標記物，以及 b）通過查看可檢測標記物來檢測所述患者中的肺腫瘤。

根據本發明所指的表述“診斷方法”是指該方法可以基本上由上述步驟組成或可以包括其他步驟。

如本文所用，表述“體內診斷”是指應用於人體或動物身體的診斷方法。

就本發明的目的而言，診斷是識別肺癌的存在。

術語“肺癌”或“肺腫瘤”是指哺乳動物中以肺組織中細胞生長不受調節為特徵的生理狀況。術語肺癌是指任何肺癌，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌。在一個實施方案中，肺癌是非小細胞肺癌（NSCLC）。在另一個實施方案中，肺癌是小細胞肺癌（SCLC）。

本文使用的術語非小細胞肺癌（NSCLC）是指一組異質性疾病，將它們分組在一起是因為它們的預後和管理方法大致相同，並且根據世界衛生組織/國際肺癌研究協會的組織學分類（ravis WD et al. Histological typing of lung and pleural tumours. 3rd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999），包括： （i）鱗狀細胞癌（SCC），占NSCLC的30％至40％，始於較大的呼吸管，但生長較慢，這意味著這些腫瘤的大小在診斷時會有所不同。 （ii）腺癌，是NSCLC最常見的亞型，占NSCLC的50％至60％，其始於肺的氣體交換表面附近，並且包括亞型細支氣管肺泡癌，其對治療的反應可能不同。 （iii）大細胞癌，是生長在肺表面附近的一種快速增長形式。它主要是排除性診斷，當進行更多研究時，通常將其重新分類為鱗狀細胞癌或腺癌。 （iv）腺鱗癌，是一種包含鱗狀細胞（排列在某些器官內的稀薄的扁平細胞）和腺樣細胞兩種類型的細胞的癌症。 （v）具有多形性、肉瘤樣或肉瘤成分的癌。這是一組罕見的腫瘤，反映了組織學異質性的連續性以及上皮和間充質的分化。 （vi）類癌腫瘤，是一種生長緩慢的神經內分泌性肺腫瘤，始於能夠回應於神經系統提供的刺激而釋放激素的細胞。 （vii）唾腺型癌，始於位於肺大氣道內的唾腺細胞。 （viii）未分類的癌症，包括不屬於上述任何肺癌類別的癌症。

如本文所用，術語“受試者”或“患者”是指被分類為哺乳動物的所有動物，包括但不限於家畜和農場動物、靈長類動物和人類，例如人類、非人類靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物。優選地，受試者是任何年齡或種族的人類男性或女性。

如本文所用，術語“原發性腫瘤”是指起源於其存在的位置或器官而並不是從另一位置轉移到該位置的腫瘤。

在本發明的上下文中，“轉移”被理解為癌症從其開始的器官向不同器官的增殖。它通常通過血液或淋巴系統發生。當癌細胞擴散並形成新的腫瘤時，後者被稱為繼發性或轉移性腫瘤。形成繼發性腫瘤的癌細胞與原始腫瘤的癌細胞相似。例如，如果乳腺癌擴散（轉移）到肺部，則繼發性腫瘤由惡性乳腺癌細胞形成。肺部疾病是轉移性乳腺癌，而不是肺癌。

在一個具體實施方案中，NSCLC選自肺鱗狀細胞癌、大細胞肺癌和肺腺癌。

在一個甚至更優選的實施方案中，肺癌是腺癌。

在一個甚至更優選的實施方案中，肺腺癌是KRAS突變的腺癌。

KRAS是指Kirsten大鼠肉瘤病毒性致癌基因同源（KRAS）蛋白。對於NSCLC，KRAS突變主要（95％）發生在密碼子12（＞ 80％）和13處。最常見的密碼子變體是KRAS-G12C突變，約占KRAS突變體NSCLC的39％。其他常見突變包括KRAS-G12V（18％至21％）和KRAS-G12D（17％至18％）變體。值得注意的是，吸煙者和從不吸煙者在KRAS中具有不同的突變譜和密碼子變體譜。因此，在從不吸煙者中，轉換突變（G＞A）更為常見，而在前吸煙者或現吸煙者中，顛換突變（G＞ C或G＞ T）更為常見。在一個優選的實施方案中，KRAS突變腺癌是KRAS-G12D突變體。

如本文所用，術語小細胞肺癌（SCLC）是指具有獨特且嚴格的形態學特徵的小細胞的增殖，其包含緻密的神經分泌顆粒，使該腫瘤伴有內分泌/副腫瘤綜合征。大多數病例發生在較大的氣道（初級和次級支氣管）中。這些癌症生長迅速，並在病程的早期擴散。

在另一個實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物診斷的癌症是癌症轉移。

本發明的綴合物的施用是肺部施用。

術語“肺部施用”是指將藥物活性物質遞送至肺部任何表面的任何施用方式。遞送方式可以包括但不限於液體混懸液、乾粉“散劑”或氣霧劑。

“跨肺表面轉運”是指穿透或滲透肺的內表面的任何穿過方式。這包括穿過通過任何肺表面（包括肺泡表面、細支氣管表面），以及穿過通過任何這些表面之間。優選地，該穿過通過肺泡表面。最優選地，該穿過通過肺泡表面上的II型細胞。穿過可以直接進入肺組織進行局部作用，或者可以通過肺組織進入循環系統進行全身作用。

在具體實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物鼻內施用。

在甚至更優選的實施方案中，鼻內施用是通過滴注。

在具體實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物通過鼻滴注、鼻吸入或口腔吸入施用；優選地通過鼻滴注或鼻吸入施用；更優選地通過鼻滴注施用。

“滴注”包括能夠向哺乳動物鼻孔提供有效量的根據本發明所述之用途的綴合物的任何遞送系統。代表性和非限制性形式包括滴劑，噴霧劑，散劑，氣霧劑，薄霧劑，導管，管，注射器，用於霜劑、微粒劑、丸劑的施藥器等。

本發明可以用各種鼻遞送載體和/或載劑來實施。此類載體增加了綴合物在滴注入鼻孔後在鼻孔中的半衰期。這些載劑包括天然聚合物、半合成聚合物、合成聚合物、脂質體和半固體劑型。天然聚合物包括例如蛋白質和多糖。半合成聚合物是改性的天然聚合物，例如殼聚糖，它是天然多糖甲殼素的脫乙醯形式。合成聚合物包括，例如，樹枝狀聚合物、聚磷酸酯、聚乙二醇、聚（乳酸）、聚苯乙烯磺酸鹽（PSSA）和聚（丙交酯乙交酯）。半固體劑型包括例如霜劑、軟膏劑、凝膠劑和洗劑。這些載劑也可以用於微囊化綴合物或與綴合物共價連接。

在一個實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物包含載劑顆粒，或共價或非共價結合至載劑顆粒，其可以配製成散劑、噴霧劑、氣霧劑、霜劑、凝膠劑等以應用於鼻孔。在一個實施方案中，綴合物被塗覆在可溶解的膜中的載劑顆粒核上，所述可溶解的膜可以包含粘膜粘著劑。載劑顆粒核可以是惰性的或可溶解的。

本發明還公開了包含根據本發明所述之用途的綴合物和藥學上可接受的載劑的藥物組合物，所述藥學上可接受的載劑可以是例如散劑、霜劑或液體。藥學上可接受的載劑包括無菌液體，例如水、油（包括石油、動物油、植物油、花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等）。合適的藥物載劑在Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (56)中有描述，其通過引用併入本文。

用於鼻內和肺內施用的組合物的劑型優選為液體、混懸液或固體。混懸液是含有分散在液體載體中的固體顆粒的液體製劑。劑型優選為計量的。例如，計量的液滴/噴霧是指包括液滴/噴霧的分配器輸送含有計量劑量（預定量）的根據本發明所述之用途的綴合物的液滴/噴霧。

鼻內施用途徑的情況下，一種優選的劑型包括鼻滴劑。滴劑主要沉積在鼻子的後部，因此迅速移入鼻咽。滴劑的問題通常是如何精確控制藥物的劑量，這對於綴合物的施用特別重要。

可以施用本發明所述之用途的綴合物的另一種鼻內劑型是鼻噴霧劑。鼻噴霧劑通常包含在非加壓分配器中溶解或混懸在溶液或輔料（例如防腐劑、粘度調節劑、乳化劑、緩衝劑）混合物中的綴合物。鼻噴霧劑具有幾個優點，包括遞送裝置的簡潔、便利性、使用的簡便性以及輸送劑量為25 pL至200 pL的的準確性。它們沉積在鼻前部，並通過粘膜纖毛間隙而緩慢進入鼻咽。本文所用的鼻噴霧劑可以是液體或混懸液。

另一種鼻內劑型是鼻氣霧劑。鼻氣霧劑與鼻噴霧劑的不同之處在於綴合物分配方法：在氣霧劑中，由較高的壓力來分配化合物，並通過閥門釋放。在噴霧劑中，由於微型泵桶（micropump bucket）的用力推進而分配化合物，而小瓶中的壓力類似於大氣壓。氣霧劑具有與噴霧劑相似的優點。

替代地，根據本發明所述之用途的綴合物可以優選地通過鼻乳劑、軟膏劑、凝膠劑、糊劑或霜劑施用。這些是應用於鼻粘膜的高粘度溶液或混懸液。

由於可以有效遞送至鼻粘膜的組合物的體積有限，液體鼻內劑型通常較相應的靜脈注射劑型具有較高的濃度。當物質溶解性差或以液體形式不穩定時，可以使用散劑來施用本發明所述之用途的綴合物。散劑的其他優點是它們不需要防腐劑，並且與液體製劑相比通常具有更高的穩定性。鼻內散劑應用的主要局限性在於其對鼻粘膜的刺激作用。

肺內施用的情況下，一種劑型是吸入氣霧劑。吸入氣霧劑通常在壓力下包裝，並含有根據本發明所述之用途的綴合物，其在閥門系統啟動時被釋放進入呼吸道，特別是肺中。釋放的氣霧劑在空氣或其他氣體中是細小固體顆粒（混懸液）或液滴（溶液）的膠體。因此，該氣霧劑可以是溶液或混懸氣霧劑。液滴或固體顆粒的直徑優選小於100pm，更優選小於10pm，最優選小於1pm。

肺內施用的情況下，另一種劑型是吸入噴霧劑。吸入噴霧劑通常是水基的，並且不含任何推進劑。它們通過口服吸入來將綴合物遞送至肺部。

霧化的吸入溶液和混懸液也可以用於通過肺內途徑遞送綴合物。霧化的吸入溶液和混懸液通常是水基製劑，其包含根據本發明所述之用途的綴合物。霧化的吸入溶液和混懸液通過口服吸入將綴合物遞送至肺部以產生全身作用，並與霧化器一起使用。

乾粉吸入劑是氣霧劑吸入的替代方法。綴合物通常包含在用於手動載入的膠囊中或吸入器內。乾粉通常由吸入器通過口服吸入遞送到肺部。本文所用的乾粉可以配製成純的。純的製劑僅包含藥物或基本僅包含藥物，例如，作為噴霧幹粉。本文所用的乾粉也可以與諸如乳糖的載體一起配製。

優選地對肺內劑型進行計量，即以預定量遞送至肺部。

活性成分的劑量可以以每千克體重的以mg計的活性成分或每平方米體表的以mg計的活性成分表示。Reagan-Shaw S.的文章“Dose translation from animal to human studies revisited” , FASEB J 2007, 22:659-661提供了用於將mg/kg轉換為mg/m² 的標準轉換因子。 劑量(mg/kg) x Km = 劑量(mg/m² )

該轉換是將第一動物物種的劑量轉換為第二動物物種的劑量（異位劑量（allometric）轉換）的基礎。因此，可以使用以下公式將以mg/kg計的動物劑量（AD）轉換為以mg/kg計的人等效劑量（HED）： 其中每個物種的Km如表1所示。

表 1 ： AD 轉換為 HED 的 Km 係數
物種	Km 係數
人	成年人	37
兒童	25
狒狒	20
狗	20
猴	12
兔	12
豚鼠	8
大鼠	6
倉鼠	5
小鼠	3

特別地，根據FDA的基於體表面積的劑量換算指南（Guidance for Industry, Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005, 見表1），本文提及的劑量可以針對任何哺乳動物更改。

在一個優選的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物的劑量範圍為0.5mg/kg至10mg/kg，更優選1mg/kg至5mg/kg，並且更優選2mg/kg至3mg/kg。在一個優選的實施方案中，綴合物的劑量為2.37±0.5mg/kg，優選為2mg/kg，更優選為2.37mg/kg。在另一個優選的實施方案中，根據本發明所述之用途的綴合物的劑量範圍為0.04mg/Kg至0.8mg/Kg，更優選為0.08 mg/Kg至0.4mg/Kg，並且更優選為0.16mg/Kg至0.24mg/Kg。 在一個優選的實施方案中，綴合物的劑量為0.19±0.5mg/kg，優選為0.16mg/kg，更優選為0.19mg/kg。可選地，根據本發明所述之用途的綴合物的劑量範圍為1.48 mg/m² 至30mg/m² ，更優選為3mg/m² 至14.8mg/m² ，並且更優選為5.9 mg/m² 至8.8mg/m² 。在一個優選的實施方案中，綴合物的劑量為7±0.5mg/m² ，優選為5.92mg/m² ，更優選為7.03mg/m² 。

在一個優選的實施方案中，在將綴合物施用至有此需要的受試者後30分鐘至96小時、優選30分鐘至48小時，進行綴合物的檢測。在一個實施方案中，在將綴合物施用於有此需要的受試者後至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少8小時、至少9小時、至少10小時、至少11小時、至少12小時、至少13小時、至少14小時、至少15小時、至少16小時、至少17小時小時、至少18小時、至少19小時、至少20小時、至少21小時、至少22小時、至少23小時、至少24小時、至少25小時、至少26小時、至少27小時小時、至少28小時、至少29小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時、至少45小時、至少48小時、至少54小時、至少60小時、至少66小時、至少72小時、至少78小時、至少84小時、至少90小時、至少96小時，進行綴合物的檢測。在一個優選的實施方案中，施用後，優選地鼻內施用後，在選自30分鐘、1小時、4小時、24小時和48小時的時間處進行綴合物的檢測。

在一個優選的實施方案中，在診斷步驟之後，至少再施用一次綴合物，以監測肺癌的進展或監測對患有肺癌的受試者實施的治療的效果。

在本發明的上下文中，“監測肺癌的進展”是指瞭解肺癌的大小和/或程度是否相對於先前的測量有減小或增大。

在本發明的上下文中，“監測對受試者實施的治療的效果”是指瞭解施用於患有肺癌的受試者的治療是否減小了肺癌的大小和/或範圍，並且因此是有效的; 或肺癌的大小和/或範圍是否已增加或並未減少，並且因此是無效的。用於治療肺癌的療法是本領域技術人員眾所周知的。

在另一方面，本發明涉及包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體在製備診斷試劑中的用途。

在另一方面，本發明涉及綴合物在製備診斷劑中的用途，其中，該綴合物包括包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體以及可檢測標記物。

本發明的診斷和檢測方法

在另一方面，本發明涉及一種用於檢測受試者中肺腫瘤的診斷方法，包括： i) 通過肺途徑施用綴合物，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物， ii) 等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中， iii) 通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像，以及 iv) 如果檢測到特異性標記物，則識別出肺腫瘤。

在另一方面，本發明涉及一種用於診斷和治療懷疑患有肺癌的受試者的方法，其中，所述方法包括： i) 通過肺途徑施用綴合物，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物， ii) 等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中， iii) 通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像， iv) 如果檢測到特異性標記物，則識別出肺腫瘤，以及 v) 對識別出患有肺癌的受試者施用選自外科手術切除肺腫瘤和/或施用化學療法和/或放射療法的治療。

在另一方面，本發明涉及一種用於在受試者中檢測肺癌細胞或對肺癌細胞成像的方法，包括： i) 鼻內施用綴合物，該綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物， ii) 等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中， iii) 通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像。

“檢測”是指確定樣品中分析物的存在、不存在或量，並且可以包括量化樣品中的分析物的量或樣品中每個細胞中的分析物的量。

在另一方面，本發明涉及一種使用綴合物對肺癌成像的方法，該綴合物包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物， 其中所述綴合物通過肺途徑施用。

在本發明的診斷用途的上下文中公開的所有實施方案也適用於本發明的診斷和檢測方法。

本發明的 綴合物的監測用途

在另一方面，本發明涉及一種用於監測受試者的肺癌進展的方法，該方法包括： i）肺部施用綴合物，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物； ii）等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中；以及 iii）通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像； iv）將在iii）中獲得的積累部位與在先前測量中獲得的積累部位進行比較， 其中，與所述先前測量相比，所述積累部位顯著減少或沒有改變，表明肺癌沒有在進展中，或 其中，與所述先前測量相比，所述積累部位顯著增加，表明肺癌正在進展中。

在另一方面，本發明涉及一種用於監測患有肺癌的受試者對療法的回應的方法，該方法包括： i）肺部施用綴合物，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物； ii）等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中；以及 iii）通過將成像技術應用於受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像； iv）將在iii）中獲得的積累部位與在施用該療法之前的先前測量中獲得的積累部位進行比較， 其中，與所述先前測量相比，所述積累部位顯著減少或沒有改變，表明施用於受試者的該療法是有效的，或 其中，與所述先前測量相比，所述積累部位顯著增加，表明施用於受試者的該療法是無效的。

在另一方面，本發明涉及一種綴合物在監測肺癌進展或監測患有肺癌的受試者對療法的回應的方法中的用途，其中，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體、以及可檢測標記物。 在一個具體的實施方案中，綴合物通過肺部施用。

在另一方面，本發明提供了一種用於治療患有肺癌的受試者的方法，該方法包括施用選自外科手術切除肺癌和/或施用化學療法和/或放射療法的治療，其中，所述受試者通過本文所述的診斷、檢測、成像方法來識別。

在另一方面，本發明提供了一種用於治療患有肺癌的受試者的方法，該方法包括施用選自外科手術切除肺癌和/或施用化學療法和/或放射療法的治療，其中通過本文所述的監測方法評估受試者中肺癌的進展。

本發明的套組

在另一方面，本發明涉及一種用於診斷肺癌的套組，包括： i）綴合物，包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及可檢測標記物， ii）用於鼻滴注或鼻吸入第i）項的綴合物的裝置；以及 iii）包裝第i）和ii）項的工具。

在另一方面，本發明涉及根據本發明的套組在診斷肺癌或監測肺癌進展或監測治療效果中的用途。

本發明還包括套組，該套組包括一種包含根據本發明所述之用途的綴合物的組合物，該套組與用於該組合物的合適的遞送裝置或施藥器相關，所述遞送裝置或施藥器，例如：導管，管，噴霧器，注射器，霧化器，或用於霜劑、微粒劑、丸劑、散劑、液體、凝膠劑等的施藥器。

在本發明的上下文中，用於鼻內遞送的裝置包括噴霧泵系統、用於遞送滴劑的吸液管、定量噴霧泵、鼻加壓定量吸入器、粉末噴霧系統、呼吸致動的粉末吸入器和鼻粉末吹入器。鼻內遞送裝置可以填充有單劑量或多劑量的鼻內製劑。

使用肺內途徑，可以用定量吸入器施用綴合物。定量吸入器（MDI）提供綴合物的細霧，其空氣動力學細微性通常小於5 pm。

替代地，乾粉吸入器可以用於肺內遞送綴合物。乾粉吸入器提供單劑量或多劑量的散劑。

用於肺內遞送的另一種裝置是包括超聲噴霧器和空氣噴射式噴霧器的噴霧器。在超聲噴霧器中，超聲波是在超聲噴霧器室中由陶瓷壓電晶體在電激發時的振動形成的。這會在溶液表面生成氣霧劑雲。由空氣噴射式噴霧器產生的氣霧劑是在壓縮空氣被迫通過孔口時產生的。液體可以從垂直噴嘴中被抽回（伯努利效應）以與空氣射流混合，然後使用擋板將其霧化以促進氣霧劑雲的形成。

在本發明的前述方面的上下文中公開的所有實施方案也適用於本發明的套組。

本發明的綴合物

在另一方面，本發明涉及一種綴合物，包括： i）包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體，以及 ii）可檢測標記物，優選地選自由造影劑或顯像劑組成的群組。

在本發明該方面的優選實施方案中，綴合物不包括細胞穿透肽序列。在另一個優選的實施方案中，綴合物不包括促進細胞攝取SEQ ID NO：1的多肽或其功能等效變體的化學部分。在本發明的綴合物的另一個優選實施方案中，綴合物不包括螢光標記物或放射性同位素，更優選地，綴合物不包括螢光素-馬來醯亞胺（FITC）或選自由¹³¹ I、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁸ Re、⁶⁷ Cu、²¹¹ At、²¹³ Bi、¹²⁵ I 和¹¹¹ In構成的群組的放射性同位素。在一個優選的實施方案中，本發明的綴合物不包括細胞穿透肽序列、螢光標記物或放射性同位素，更優選不包括螢光素-馬來醯亞胺（FITC）或選自由¹³¹ I、⁹⁰ Y、¹⁷⁷ Lu、¹⁸⁸ Re、⁶⁷ Cu、²¹¹ At、²¹³ Bi、¹²⁵ I 和¹¹¹ In構成的群組的放射性同位素。

在另一個實施方案中，本發明的綴合物不包括螢光基團、生物素、PEG、氨基酸類似物、非天然氨基酸、磷酸基團、糖基基團、放射性同位素標記物、標籤（例如組氨酸標籤、Arg-標籤、FLAG-標籤、Strep-標籤），能夠被抗體識別的表位（例如c-myc-標籤、HA標籤、V5標籤、SBP標籤、S標籤）、鈣調蛋白結合肽、纖維素結合結構域、甲殼素結合結構域、谷胱甘肽 S-轉移酶標籤、麥芽糖結合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-標籤、氨基酸序列（例如AHGHRP（SEQ ID NO：63）或PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC（SEQ ID NO：64））或β-半乳糖苷酶等。

在一個優選的實施方案中，造影劑或顯像劑選自由以下組成的群組：¹⁸ F、³² P、³³ P、⁴⁵ Ti、⁴⁷ Sc、⁵² Fe、⁵⁹ Fe、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、⁷⁵ Sc、⁷⁷ As、⁸⁶ Y、⁸⁹ Sr、⁸⁹ Zr、⁹⁴ Tc、⁹⁴ Tc、⁹⁹ mTc、⁹⁹ Mo、¹⁰⁵ Pd、¹⁰⁵ Rh、¹¹¹ Ag、¹²³ I、¹²⁴ I、¹⁴² Pr、¹⁴³ Pr、¹⁴⁹ Pm、¹⁵³ Sm、¹⁵⁴ -¹⁵⁸¹ Gd、¹⁶¹ Tb、¹⁶⁶ Dy、¹⁶⁶ Ho、¹⁶⁹ Er、¹⁷⁵ Lu、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁹ Re、¹⁹⁴ Ir、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、²¹¹ Pb、²¹² Bi、²¹² Pb、²²³ Ra和²²⁵ Ac。在一個更優選的實施方案中，放射性物質或放射性同位素為⁸⁹ Zr。

在本發明的前述方面的上下文中公開的所有實施方案也適用於本發明的綴合物。

除非另有說明，否則本文所用的所有術語應以本領域已知的普通含義來理解。在本申請中使用的某些術語的其他更具體的定義如下所述，並且旨在在整個說明書和發明申請專利範圍中統一應用，除非另外明確列出的定義提供了更廣泛的定義。在整個說明書和發明申請專利範圍中，詞“包括”和該詞的變體並不旨在排除其他技術特徵、添加劑、組分或步驟。 此外，詞“包括”涵蓋“由……組成”的情況。在閱讀本說明書後，本發明的其他目的、優點和特徵對於本領域技術人員將變得顯而易見，或者可以通過實施本發明而獲悉。 此外，本發明涵蓋本文描述的具體和特定實施方案的所有可能的組合。

在本說明書和所附的發明申請專利範圍中，單數形式的不定冠詞（“a”, “an”）和定冠詞（“the”）包括了複數的所指物，除非上下文中另有明確規定。不定冠詞（術語“a”或“an”）以及術語“一個或多個”和“至少一個”在本文中可以互換使用。此外，在本文中使用的“和/或”應被視為具有或不具有另外一個的兩個指定特徵或組件/組分中的每一個的具體公開。因此，在本文中在諸如“A和/或B”之類的短語中使用的術語“和/或”旨在包括“A和B”、“ A或B”、“A”（單獨）和“B”（單獨）。同樣地，在諸如“A、B和/或C”的短語中使用的術語“和/或”旨在包括以下方面中的每個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；和C（單獨）。在整個說明書和發明申請專利範圍中結合數值使用的術語“約”表示本領域技術人員熟悉並可接受的精度區間。通常，這種精度區間為±15％。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本公開的相關領域的普通技術人員通常理解的相同含義。單位、前綴和符號以其Système International de Unites (SI) 接受的形式表示。數值範圍包括定義範圍的數值。除非另有說明，否則氨基酸序列以從氨基至羧基的方向從左至右書寫。本文提供的標題不是對本公開的各個方面或方面的限制，可以通過整體參考說明書來獲得本發明的各個方面。相應地，下面直接定義的術語通過參考整個說明書得到更完整地定義。

本發明將通過以下實施例來描述，這些實施例應被認為僅是說明性的，而不是對本發明的範圍的限制。

實施例

方法

Omomyc 的生產、純化和標記

逆轉錄Omomyc肽序列（SEQ ID NO: 1），對其進行優化密碼子以在大腸桿菌（E.coli ）中表達，在N末端添加蛋氨酸，在pET3a表達載體（Novagen）中克隆，並使用從J.-F. Naud et al. 2003. J Mol Biol, 326:1577-1595；F.-O. and Mcduff et al. 2009. J Mol Recognit, 22:261-269中所述的Max°純化方案改編的方案從BL21（DE3）阿拉伯糖-可誘導的（Invitrogen®）細菌菌株進行純化。獲得的純化的構建體是SEQ ID NO: 4的多肽。通過質譜法和蛋白質印跡分析來確認每個純化的構建體的身份。根據製造商的指示來進行AlexaFluor®660部分（Invitrogen）或去鐵胺（deferoxamin）部分（Macrocyclics）至Omomyc的唯一的C-末端半胱氨酸殘基的馬來醯亞胺綴合。通過陽離子交換，然後通過尺寸排阻色譜法，從遊離的標記試劑中純化出共價修飾的肽，並通過質譜分析、SDS-PAGE和紫外光譜確認完整的標記和純度。對於體內施用，使用ToxinEraser™ Endotoxin Removal Kit（Genscript）進行了額外的純化步驟，以去除內毒素。使用Pierce® LAL Chromogenic Endotoxin Quantification Kit （Thermo Scientific）定量內毒素濃度。緩衝液交換是在Amicon Ultra-15（MerckMillipore）中進行的，排出限為3 kDa。

對於 Omomyc-DFO 的放射性標記 ，從BV Cyclotron VU（Amsterdam, The Netherlands）獲得了⁸⁹ Zr（T_1/2 =78.4 h, β⁺ =22.6%; 1 M草酸中提供~2.7 GBq/mL）。用1 M的草酸將對應於74 MBq的所需體積的⁸⁹ Zr-草酸溶液調整為總體積200 µL；加入90 µL 2 M Na₂ CO₃ ，並在室溫下孵育3分鐘。加入1 mL 0.5 M HEPES和710 µL Omomyc-DFO（2.17 mg/mL），並在室溫下在旋轉振盪器上孵育60分鐘；pH檢測為7.0-7.5。將反應混合物上樣至預平衡的PD-10柱，並用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗脫為500 µL的級分。在劑量校準器（IBC，Veenstra Instruments）中測量收集的級分。用0.02 M檸檬酸鹽緩衝液（pH 5.0）：乙腈（9：1）作為洗脫液，在ITLC試紙條上（150-771型，Biodex）採用即時薄層色譜（ITLC）進行品質控制。通過在人血清（HS）、PBS和DTPA（50 mM）中於37℃孵育24小時來研究Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr的穩定性。通過如上所述的ITLC測定放射化學純度。假設在尺寸排阻色譜後Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr綴合物幾乎完全回收，本研究中使用的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr的放射化學產率、純度和比活度分別＞98％、＞99％和34 MBq/mg。因此，該化合物無需進一步純化即可使用。在37℃的HS和PBS中進行的穩定性研究表明，超過99％的放射性示蹤劑在24小時後仍保持完好；而在DTPA中於37℃孵育24小時後，超過96%的放射性示蹤劑保持完好，這證明Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr構成了用於體內研究的合適的探測劑。

藥代動力學和生物分佈研究

為了通過microPET/CT進行藥代動力學和生物分佈研究，從JANVIER LABS購買了8周齡的雌性FVB/NRj小鼠。根據國家動物保護指南以及經CIEMAT地區動物護理委員會和動物倫理委員會的批准進行了實驗。將小鼠安置在CIEMAT的動物設施中。

對於鼻內施用研究，從誘導室中取出一組接受異氟烷麻醉的5隻小鼠，並立即通過移取30 µl Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr（2.9±0.4 MBq，2.37±0.5 mg Omomyc-DFO/kg體重）到鼻外緣上進行鼻內施用。注射後48小時，在異氟烷麻醉狀態下在O₂ 中通過頸脫位使小鼠安樂死，並立即通過心臟穿刺收集血液。對於生物分佈研究，通過如下所述的PET/mCT成像在指定的時間點對小鼠進行成像。對於生物分佈研究，切取器官組織，濕稱重並用γ射線計數器（2470 Wizard² ，PerkinElmer）進行放射性計數，同時還對注射劑量的標準樣品進行放射性計數。應用Grubbs測試以檢測全域數據集中一個離群動物的存在，並丟棄該離群數據。

對於靜脈內施用研究，對一組帶有已建立的H1975細胞皮下異種移植物（平均大小430 mm³ ）的5隻Balb/c-裸鼠在尾靜脈施用Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr （3.2±0.1 MBq，2.62±0.3 mg Omomyc-DFO/kg體重）。注射後72小時，在採用氧氣中的異氟烷的麻醉狀態下通過頸脫位使小鼠安樂死，並立即通過心臟穿刺收集血液。對於生物分佈研究，通過如下所述的PET/mCT成像在指定的時間點對小鼠成像。最終，在施用後48小時，切取器官組織，濕稱重，並用γ射線計數器（2470 Wizard² ，PerkinElmer）進行放射性計數，同時還對注射劑量的標準樣品進行放射性計數。

對於生物分佈和肺腺癌治療研究，每個時間點和病況隨機分配至少5隻小鼠，並在腺-CRE感染後16周開始治療。用吸入的異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉動物，並鼻內施用總體積30 µL的1.4 mg/kg的單劑量OmomycCPP-AF660或載體（10 mM乙酸鈉，pH 6.5），並在指定的時間點處以安樂死。收集組織，並立即通過IVIS® Spectrum成像分別使用663 nm和690 nm波長進行激發和發射將螢光視覺化。使用Living Image®4.3.1軟體（PerkinElmer）獲取並分析螢光信號的測量值。

microPET/CT 成像

在鼻內滴注後，立即用小動物Argus PET-CT掃描器（SEDECAL, Madrid, Spain）掃描小鼠。在注射後的各個時間點（30分鐘、4小時、24小時和48小時）對吸入2-2.5％異氟烷麻醉的小鼠進行了PET研究（能量視窗400-700 KeV和20分鐘靜態採集）和CT（電壓45 kV，電流150 μA，8次發射（shots），360投影和標準解析度）。使用2D-OSEM（有序子集期望最大化（Ordered Subset Expectation Maximization））演算法（16個子集和兩次反覆運算演算法）重建PET圖像，並進行隨機散點校正。通過掃描包含已知活性⁸⁹ Zr的圓柱形模體預定的校準因數用於將計數/圖元/秒轉換為kBq/cm³ 。PET圖像中人工繪製的感興趣區（ROI）（鼻內遞送、口腔和口咽區、食道和腸道）或使用CT解剖學指南從PET圖像中選擇的ROI（針對肺、肝和腎臟）用於通過將區域中獲得的平均示蹤劑濃度（kBq/cm³ ）除以總ID（kBq）來確定以ID的百分比/g組織為單位的平均放射性示蹤劑積累（衰減校正至注射時）。通過將獲得的平均示蹤劑濃度（kBq/cm³ ）乘以ROI體積（cm³ ），計算出ROI中的注射劑量的百分比。通過比較最終掃描（48小時）與動物被安樂死後對器官的直接測定，還確定了針對肺、腎和肝臟的單獨的圖像校準因數。這些校準因數用於將從PET成像獲得的ID的百分比/g標準化為注射後不同時間點的活性濃度。使用圖像分析軟體ITK-SNAP（www.itksnap.org）分析圖像。

免疫組織化學

通過頸脫位使小鼠安樂死。切取肺，並通過氣管先後用PBS和3.7％PFA灌注，固定過夜，轉移至70％乙醇中並包埋在石蠟中。將切片切成4微米厚，並用H＆E染色以進行病理檢查。對於抗Omomyc免疫組織化學，通過在0.01M檸檬酸鹽緩衝液（pH 6.0）中在400W微波中加熱20分鐘來進行抗原修復。在3％ BSA中封閉45分鐘並在PBS中洗滌後，將切片與最終濃度為0.02mg/mL的兔抗Omomyc多克隆第一抗體（親和純化並針對對MYC表位的識別進行選擇）在4°C孵育過夜。PBS洗滌後，將切片與以1/200稀釋的山羊抗兔IgG (H+L)–AlexaFluor®488綴合物（Thermo Fisher Scientific A-11008）孵育，並用以1/10000稀釋的DAPI （Life Technologies D1306）染色，用水洗滌一次，並用螢光封片介質（Dako S3023）封片。

小鼠

通過Transnetyx對KRas^LSL-G12D/+ 小鼠進行基因分型，雄性和雌性中肺腫瘤的產生如前人所述（E.L. Jackson. 2001. Genes & Development, 15:3243-3248）。將動物飼養在混合的C57BL/6J x FVBN背景中。每個時間點和情況隨機分配至少5隻小鼠，並在Adeno-Cre感染後16周開始治療（進行了兩次生物學重複實驗）。動物通過吸入的異氟烷（AbbVie Farmaceutica S.L.U.）麻醉，並且鼻內施用總體積為30µL的Omomyc或載體（10mM醋酸鈉，pH6.5）。

統計分析

所有分析和圖形均使用GraphPad Prism 5軟體進行。使用D’Agostino-Pearson檢驗評估了每個組的數據的正態分佈。對於正態分佈的數據，使用Student t-檢驗或ANOVA（參數）分析樣本平均值的差異，對於非正態分佈的數據，則使用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis檢驗進行分析。使用F檢驗計算各組方差的差異。

實施例 1 ：在肺腺癌的小鼠模型中，直接經肺部施用後， Omomyc 小型蛋白主要定位於肺腫瘤中。

為了評估Omomyc小型蛋白在體內的潛在診斷效用，發明人首先分析了鼻內施用（i.n.）後其組織分佈，鼻內施用是先前已被證明能夠在小鼠中直接經肺部遞送大分子製劑的技術。發明人首先將去鐵胺-馬來醯亞胺（DFO）基團共價連接到Omomyc，並用⁸⁹ Zr對其進行放射性標記，然後通過離體放射計數來測量在健康小鼠中的生物分佈和藥代動力學特性（圖1A）。平均來說，8%的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr劑量（2.37 mg/kg）在鼻內施用後（30分鐘內）很容易到達肺部，並在那裡存留超過48小時（圖1A）。使用特異性抗Omomyc抗體的免疫螢光證實，在鼻內滴注後4小時，在治療小鼠的肺上皮內檢測到未標記的Omomyc小型蛋白（未標記的Omomyc小型蛋白在治療小鼠的肺上皮內的部分核定位元）（圖1B）。為了確認該方法可以應用於荷肺腺癌的小鼠，發明人使用表徵良好的KRas^LSL-G12D/+ 誘導的肺腺癌小鼠模型（E.L. Jackson. 2001. Genes & Development, 15:3243-3248）重複了該程式。小鼠的mPET/mCT成像顯示在鼻內滴注後24小時，Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr主要位於肺腫瘤中（圖1C）。儘管尚不清楚這種優先腫瘤保留的確切原因，但可能與通常在癌症中觀察到的腫瘤血管或代謝改變有關。

在進一步的實驗中，在AdCre誘導後18周，將2mg/kg的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr經鼻內施用於荷瘤Kras^G12D 小鼠。鼻內施用後24小時獲得圖像（圖2A），我們可以看到在荷瘤小鼠中在24小時時存在的肽與腫瘤有共同的定位（圖2A），而在無腫瘤的小鼠中，同一時間點的肺分佈在整個肺部更為分散（圖2B）。圖2A中的數字表示Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr的濃度，其中較高的數字對應於綴合物的較高濃度。圖2B顯示了健康對照的肺部的擴散性和非特異性標記的過度曝光的圖像，因此未顯示定量結果。此外，與健康小鼠相比，荷瘤小鼠中分配到肺部的總量優於健康小鼠，儘管個體間存在高度的變異性（圖2C）。

使用能夠通過IVIS技術®進行離體成像的不同標記物（這次使用螢光探針AF660代替放射性標記物）進行了相同的實驗。用1.4mg/kg的OmomycCPP-AF660單次處理後4小時（圖3A），在小鼠的肺部中檢測到螢光信號。鼻內施用後24小時，雖然大部分OmomycCPP-AF660已從正常組織中清除，但在肺腫瘤中仍可明確地觀察到（圖3B）。再次，給小鼠鼻內施用後，螢光信號與腫瘤有共同的定位（圖3）。

實施例 2. 在荷肺腫瘤的小鼠中靜脈內施用 Omomyc 後的生物分佈。

五隻荷肺的小鼠靜脈內施用29.1 mg/kg的Omomyc-DFO，注射後72小時進行PET/CT成像。如圖4所示，與其他組相比，肺部中的Omomyc攝取沒有顯著增加。該結果證明瞭當直接向肺施用時，Omomyc作為肺腫瘤示蹤劑的特異性。

無。

圖1： 鼻內施用後，Omomyc在KRas^G12D 驅動的肺腺癌小鼠模型的肺中的分佈。（A）在健康小鼠的肺中檢測Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr的定量隨著時間的變化，表示為注射劑量的百分比。示出了均值、S.D.和動物的數量。（B）來自用Omomyc小型（mini）蛋白處理的小鼠的肺組織的免疫螢光。特異性抗Omomyc抗體證實在施用4小時後肺細胞中Omomyc的存在。箭頭表示核染色陽性。比例尺為10 µm。右圖示出了由白色虛線包圍的區域的更高放大倍數。數字對應於由ImageJ計算的校正後的總細胞螢光。（C）鼻內施用2.37 mg/kg Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr後24小時，荷瘤小鼠肺部的microPET/CT成像的3D渲染圖。CT數據以灰度示出，並且Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr microPET數據以比色刻度尺示出（分析了n = 2隻小鼠）。對於Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr攝取，數字對應於鼻內劑量（ID）的百分比/g。 圖2： 生物分佈和藥代動力學研究。將2 mg/kg的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr鼻內施用至健康對照組和荷瘤Kras^G12D 小鼠。（A）鼻內施用於荷瘤小鼠24小時後獲得的肺部影像。對於ID/Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr攝取，數字對應於ID的百分比/g。（B）鼻內施用於健康對照組24小時後獲得的肺部影像。（C）在對已患有肺腺癌的小鼠鼻內施用後，每個時間點的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr放射性離體（ex vivo ）定量的生物分佈。 圖3：（A）用OmomycCPP-AF660處理（鼻內施用後4h）（1.4 mg/kg，在30 µL載體10 mM乙酸鈉中（pH 6.5））的肺部的離體螢光強度。比例尺為1cm。（B）單次施用OmomycCPP-AF660後24小時，該多肽在肺腫瘤中仍可檢測到（FLI，螢光強度）。底圖示出了相同的肺部，其中肉眼可見的淺表腫瘤用圓圈標出。比例尺為1cm。 圖4. 靜脈內施用2.68 mg/kg的Omomyc-DFO-⁸⁹ Zr 後72小時時的放射性離體定量的生物分佈。注射劑量的百分比示出為每克指示組織。

Claims (16)

1. 一種綴合物在製備診斷試劑中的用途，所述綴合物包括：i)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其具有相對於SEQ ID NO：1大於90%的一致性程度並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性的功能等效變體，以及ii)可檢測標記物，其中，所述診斷試劑用於通過肺部施用所述綴合物來診斷肺癌。
2. 根據請求項1所述的用途，其中，SEQ ID NO：1的功能等效變體選自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQIDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10組成的群組。
3. 根據請求項1所述的用途，其中，所述可檢測標記物選自由¹⁸F、³²P、³³P、⁴⁵Ti、⁴⁷Sc、⁵²Fe、⁵⁹Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁵Sc、⁷⁷As、⁸⁶Y、⁸⁹Sr、⁸⁹Zr、⁹⁴Tc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Pd、¹⁰⁵Rh、¹¹¹Ag、¹²³I、¹²⁴I、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁵³Sm、¹⁵⁴-¹⁵⁸¹Gd、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷⁵Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁹Re、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹Pb、²¹²Bi、²¹²Pb、²²³Ra和²²⁵Ac和⁸⁹Zr組成的群組。
4. 根據請求項1所述的用途，其中，通過mPET/mCT成像在施用所述綴合物後對癌細胞進行檢測。
5. 根據請求項1所述的用途，其中，所述肺癌是選自小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)的原發性腫瘤，或者是癌症轉移。
6. 根據請求項1至請求項5中任一項所述的用途，其中，所述肺癌是腺癌。
7. 根據請求項6所述的用途，其中，所述肺腺癌是KRAS突變腺癌。
8. 根據請求項1至請求項5中任一項所述的用途，其中，所述綴合物的檢測在將所述綴合物施用至有此需要的受試者後30分鐘至96小時之間進行。
9. 根據請求項1至請求項5中任一項所述的用途，其中，所述肺部施用通過鼻滴注、鼻吸入或口腔吸入進行。
10. 根據請求項1至請求項5中任一項所述的用途，其中，所述綴合物的劑量範圍為0.04mg/Kg至0.8mg/Kg、或1.48mg/m²至30mg/m²，更優選為0.19mg/kg或7mg/m²。
11. 根據請求項1至請求項5中任一項所述的用途，其中，在診斷步驟之後，將所述綴合物再施用至少一次以監測肺癌的進展或施用至患有肺癌的受試者的治療的效果。
12. 一種綴合物在製備診斷試劑中的用途，所述綴合物包括： i)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其具有相對於SEQ ID NO：1大於90%的一致性程度並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性的功能等效變體，以及ii)可檢測標記物，其中，所述診斷試劑用於檢測受試者中的肺癌細胞或者用於對受試者中的肺癌細胞成像，所述檢測或成像包括：a.肺部施用一種綴合物，所述綴合物包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或所述功能等效變體、以及可檢測標記物；b.等待足夠的時間以使所述綴合物進入增殖的肺細胞中；以及c.通過將成像技術應用於所述受試者以檢測所述綴合物在所述受試者中的積累部位來檢測所述增殖的肺細胞，從而檢測增殖部位或者對增殖部位成像。
13. 一種綴合物在製備試劑中的用途，所述綴合物包括：i)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其具有相對於SEQ ID NO：1大於90%的一致性程度並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性的功能等效變體，以及ii)可檢測標記物，其中，所述試劑用於通過肺部施用所述綴合物來監測肺癌的進展，或用於通過肺部施用所述綴合物來監測患有肺癌的受試者對治療的回應。
14. 一種用於診斷肺癌的套組，包括：i)綴合物，包括：包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其具有相對於SEQ ID NO：1大於90%的一致性程度並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性的功能等效變體、以及可檢測標記物，其中，所述綴合物不包括螢光標記物；ii)用於肺部施用第i)項的綴合物的裝置；以及iii)用於包裝第i)項和第ii)項的工具。
15. 一種根據請求項14所述的套組在製備用於診斷肺癌或用於監測肺癌的進展或用於監測治療的效果的試劑中的用途。
16. 一種綴合物，包括：i)包含序列SEQ ID NO：1的多肽或其具有相對於SEQ ID NO：1大於90%的一致性程度並且基本上保留了SEQ ID NO：1的腫瘤示蹤活性的功能等效變體，以及ii)可檢測標記物，選自由造影劑或顯像劑組成的群組，其中，所述綴合物不包括螢光標記物。