MX2013011294A - Metodos y composiciones para dirigir celulas adiposas en mamiferos. - Google Patents

Abstract

Se presentan métodos y composiciones para su uso en diagnostico, formación de imágenes o direccionamiento de agentes terapéuticos para tratar obesidad/trastornos asociados con adiposidad, en donde dichas composiciones y métodos identifican y usan péptidos para dirigir selectivamente las células estromales del tejido adiposo en mamíferos, tanto in vitro como in vivo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DIRIGIR CÉLULAS ADIPOSAS EN MAMÍFEROS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente Estadounidense No. 61/469,345 presentada el 30 de Marzo de 2011, que se incorpora en este acto mediante referencia en su totalidad para todos los fines.

CAMPO TÉCNICO Esta divulgación se relaciona con métodos y composiciones que se pueden usar para dirigir la administración de agentes terapéuticos. Más específicamente, la presente divulgación se relaciona con composiciones y métodos para identificación y uso de péptidos que dirigen selectivamente el tejido adiposo tanto in vitro como in vivo.

ANTECEDENTES El trasplante de células madre se acepta como una manera de impulsar la regeneración de tejidos en los ensayos preclínicos, y esta estrategia se está trasladando al lecho (Kolonin y Simmons, Nat. Biotechnol . 27, 252-253, 2009.) . La terapia con células madre se beneficiaría enormemente de la capacidad para dirigir las células estromales mesenquimales (MSC) en órganos específicos para la formación de imágenes o aplicaciones terapéuticas. Las MSC son una población celular mixta que comprende células progenitoras adultas multipotentes (Bianco, et al, Cell Stem Cell 2, 313-319, 2008). Debido a la capacidad de estas células para diferenciarse en linajes mesenquimales, tales como osteoblastos, condrocitos, y adipocitos, se denominan comúnmente como células madre mesenquimales (Pittenger, et. al., Science 284, 143-147, 1999; Prockop, Science 276, 71- 74, 1997) . Estudios recientes revelan que la función de MSC como células perivasculares (pericitos) que mantienen la integridad vascular (Crisan, et al, Cell Stem Cell 3, 301- 313, 2008; Tang, et al, Science 322, 583-586, 2008; Traktuev et al, Círc. Res 102, 77-85, 2008) .

Los estudios preclínicos y ensayos clínicos con MSC trasplantado apoyan el potencial terapéutico de estas células y sugieren que estas células también se activan durante la enfermedad para participar en la reparación y regeneración de tejidos. Sin embargo, la aplicación clínica de MSC para terapia celular requiere la capacidad de rastrear y controlar esta población de células de plástico, debido a las preocupaciones de seguridad relacionadas con su capacidad para promover el cáncer (Zhang et al, Cáncer Res. 69, 5259 hasta 5266, 2009).

Las MSC fueron aisladas originalmente del estroma de la médula ósea y las unidades formadoras de colonias de fibroblastos (CFU-F) en función de su morfología fibroblástica ( riedenstein, Haematol . Blood Transfus. 25, 19-29, 1980) . Desde entonces, las MSC se han identificado en la mayoría de los órganos de adultos, con el tejido adiposo blanco (WAT) siendo la mayor reserva de MSC, estas células se denominan células estromales adiposas (ASC: Gimble et al, Circ. Res. 100, 1249 - 1260, 2007; Daquinag et al, Trends in Pharmacol Sci 22, 1-8, 201 1) . Mientras WAT se compone principalmente de adipocitos, ASC constituye la mayoría de las células en la fracción estromal/vascular (SFV) , que también contiene células endoteliales (CE) y células hematopoyéticas de infiltración (Hausman et al, Obes. Rev. 2, 239-254, 2001). Se ha revelado que ASC es una fuente rica de células progenitoras multipotentes que muestran multipotencia y capacidad de proliferación comparables a las de MSC de médula ósea, mientras que también tiene características únicas claras (Rodeheffer et al, Cell 135, 240-249, 2008; Tang et al, 2008, ibid; Zuk et al, 2001, Tissue Eng 7, 21 1-228)..

La comprensión actual de los mecanismos a través de los cuales las interacciones intercelulares de MSC con otros componentes del tejido median la remodelación de tejidos está limitada por la falta de marcadores específicos de MSC. Mientras que un número de moléculas de superficie celular, incluyendo el receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas -(PDGFR ), CD146, CD44, CD90, CD105, CD73, CD29, y Stro-1, se han utilizado para la selección positiva de MSC, cada uno de ellos se expresa también en otros tipos de células (Bianco et al, 2008, ibid; Gimble et al, 2007, ibid; Nie et al, Stem Cells 26, 2735-2745, 2008). Las MSC (incluidos WAT) se pueden distinguir de las células hematopoyéticas en base a la falta del marcador pan-leucocitario CD45 y de las células endoteliales (CE) con base en la falta del marcador pan- endotelial CD31/PECAM-1 (Bianco et al., 2008, ibid; Rodeheffer et al, 2008, ibid. ) Debido a que CD34 se expresa en el MSC perivascular de varios órganos in vivo, el inmunofenotipo de CD34 + CD45-CD31- se ha utilizado para separar el MSC de otras células (Gimble et al, 2007 ibid; Tang et al, 2008, ij id; Traktuev et al., 2008, ibid; Zhang et al, 2009, ibid. ) . Sin embargo, debido a que esta firma no diferencia MSC en diferentes tejidos, nuevos marcadores para el aislamiento prospectivo y el seguimiento de ASC y el MSC en otros tejidos se necesitan con urgencia y están limitando el campo de trasplante de células madre en su conjunto .

Además, los trastornos asociados a adiposas incluyen, pero no se limitan a, obesidad, peso corporal y trastornos de la composición del cuerpo, incluyendo comer y otros trastornos que efectúan la regulación de la grasa corporal y el peso corporal, representan los principales problemas de salud en todos los países industrializados. La prevalencia de la obesidad en los países desarrollados es alta. Por ejemplo, para el año 2002 aproximadamente el 30% de los estadounidenses eran obesos (National Health and Nutrition Examination Survey) . La obesidad es una condición en la que hay un exceso de grasa corporal con relación a la masa corporal magra, y se define como un índice de masa corporal (peso/talla2) mayor que 30 kg/m2 (Kopelman, Nature, 404:635-643, 2000). La obesidad está asociada con un mayor riesgo de padecer muchas enfermedades graves, incluyendo, pero no limitado a, diabetes tipo 2, accidentes cerebrovasculares, hipertensión, enfermedad coronaria, ciertos tipos de cáncer, fibrosis crónica en determinados tejidos, enfermedad de hígado graso, insuficiencia venosa crónica, trombosis venosa profunda, artritis, problemas respiratorios, tales como apnea obstructiva del sueño, y de la vesícula biliar, tales como colelitiasis, entre otras complicaciones (Willett et al, N. Engl. J. Med. 341:427- 434, 1999) .

Como nota, además, las células estromales son células del tejido conectivo que apoyan la función de las células del parénquima de un órgano. La fibrosis es un proceso patológico, que incluye la formación de cicatrices y la producción de la matriz extracelular, por el tejido conectivo, como respuesta al daño tisular. La fibrosis confluente puede borrar la arquitectura y función del órgano o tejido subyacente normal. Los trastornos fibróticos incluyen, pero no se limitan a, cicatrización patológica de la piel, tales como, cicatriz coloide e hipertrófica; cirrosis del hígado y vesícula biliar, fibrosis del corazón, ojos y ríñones, pulmonar y de médula ósea, fibrosis en el tracto gastro intestinal, que se asocia con cánceres, tales como sarcomas y hemangiopericitoma, así como la esclerodermia . El trastorno fibrótico adicional incluye el escorbuto y enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico y trastornos genéticos, ejemplos de los cuales incluyen el síndrome de Marfan, síndrome de Ehlers-Danlos, síndrome de Loeys-Dietz, pseudoxantoma elástico, osteogénesis imperfecta , fibrodisplasia osificante progresiva y neumotorax espontáneo, entre otros.

Las asociaciones de enfermedades antes mencionadas explican por qué se estima que los costos económicos de la obesidad en más de 100 mil millones de dólares (Daniels, A . J. Nurs. 106:40-49, 2006), que se estima en la medida de un 7% de los costos totales de la atención de salud (Seidell, Int. J. Obes Relat Metab Disorders, 19 (Supl. 6):S13-S16, 1995).

La regulación de la composición corporal en mamíferos es un proceso complejo que implica la regulación del apetito y el gasto energético. La composición del cuerpo humano y la homeostasis del peso corporal son poco conocidas. La epidemiología de la obesidad muestra fuertemente que el trastorno muestra características heredadas, y los estudios de gemelos humanos sugieren fuertemente una base genética sustancial en el control de la composición corporal y el peso corporal, con las estimaciones de heredabilidad del orden de 80-90 por ciento. Los estudios de la genética de la obesidad humana y de modelos animales demuestran que la obesidad resulta de las interacciones complejas de una regulación defectuosa de la ingesta de alimentos, gasto de energía inducida por la comida, y el equilibrio entre el lípido y el anabolismo corporal magro. Por lo tanto, la obesidad no es simplemente el resultado de un comportamiento negativo, es decir, el resultado de hiperfagia voluntaria, sino que resulta de las diferencias en los patrones de alimentación, el metabolismo e interacciones neurológicas/metabólicas . Estas diferencias parecen deberse, en cierto grado, a las diferencias en la expresión genética, ya sea el nivel o la actividad de productos genéticos (Friedman et al, Mamm Genome 1:130-144, 1991) .

Los métodos actuales para el control del peso corporal incluyen procedimientos de dieta y quirúrgicos. Sin embargo, la dieta a menudo no es exitosa, y los pocos terapéuticos para la obesidad aprobados por la U.S. Food and Drug Administration, tales como Phentermen, fenfluramina, Meridia, Xernical , Orlistat, Adipex-P, Bontril y Ionomin tienen efectos adversos inaceptables o peligrosos y aquellos pocos que se han aprobado han sido retirados de los mercados. Los métodos quirúrgicos de reducción de peso, como la liposucción, la derivación gástrica o cirugía de bandeo, tienen muchos riesgos. Ninguno de los métodos actualmente disponibles para el control del peso es satisfactorio, y existe una necesidad de mejorar los métodos de pérdida de peso y el control.

Además del problema de la obesidad en la población humana, hay un problema creciente de obesidad en los animales de compañía, como perros y gatos (Germán, J. Nutr 136:1940S-1946S, 2006). En los Estados Unidos, se estima que el 25-40% de todos los perros y los gatos tienen sobrepeso o son obesos. Al igual que en los seres humanos, la obesidad puede tener efectos perjudiciales sobre la salud y la longevidad de los animales de compañía. Además, la capacidad de reducir o eliminar el uso de la composición corporal y manipuladores de peso corporal en la alimentación del ganado comercial tiene utilidad significativa no sólo en un ahorro para el cultivador, sino para el consumidor y para la sociedad en su conjunto. Por lo tanto, la capacidad de manipular la composición corporal y el peso corporal y para el tratamiento de trastornos de la composición corporal en los seres humanos y los animales de compañía tales como, pero no limitados a, la obesidad, y la capacidad de aumentar el tamaño de los animales, tienen una amplia utilidad y representan oportunidades significativas .

La diabetes es una enfermedad a largo plazo, actualmente incurable, asociada con trastornos de la composición del cuerpo, especialmente la obesidad y el síndrome metabólico, con gran aumento de riesgos para el desarrollo de condiciones patológicas adicionales derivadas de un mal control de la glucemia. Los riesgos crónicos a corto plazo incluyen, pero no se limitan a, hipoglucemia, infecciones, y trastornos asociados con la hiperglucemia, tales como cetoacidosis . Las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad cardíaca, derrame cerebral, presión arterial alta, enfermedad vascular, deterioro visual, nefropatía y neuropatía. De acuerdo con una encuesta realizada en 2005 por el National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, más de 20 millones de personas en los Estados Unidos tienen diabetes, y el porcentaje de la población con diabetes está aumentando rápidamente. En 2005 en los Estados Unidos, 1.5 millones de personas fueron diagnosticadas con diabetes . Algunos estudios proyectan que alrededor de 250 millones de personas en todo el mundo se verán afectadas por la diabetes en el año 2020 (O'Rahilly, BMJ, 314: 955-959, 1997). Las formas más frecuentes de este trastorno son diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID o tipo I) y diabetes mellitus no insulino-dependiente (DMNID o tipo II) . Debido a la alta incidencia de diabetes, y el daño irreversible que se incurre con muchas de las complicaciones asociadas, el costo del tratamiento supera cualquier otra enfermedad solo en los Estados Unidos. En 2002, se gastaron más de $132 billones en costos directos e indirectos para el tratamiento, con cerca de $92 millones de estos para la dirección de gastos médicos (Hogan et al, Diabetes Care 26:917-932, 2003).

Recientemente, la obesidad se ha convertido en uno de los factores que predisponen a los pacientes con cáncer a la mortalidad como resultado de la progresión del cáncer avanzado (véase, por ejemplo, Daquinag et al, Trends in Pharmacol. Sci. 22, 1-8, 2011, Zhang, Adipose-tissue derived progenitor cells and cáncer, World Journal of Stem Cells (Tema destacado), 2 (5): 103-113, 2010; Bellows, et al, Invluence of BMI on Level of Circulating Progenitor Cells, Obesity, en línea, . Flegal et al Cause-specific excess deaths associated with underweight, overweight and obesity. JAMA 298, 2028-2037, 2007,.. Roberts, et al Biological mecanisms linking obesity and cáncer risk: new prospectives. Annu Rev Med 61:301-316, 2010). La supervivencia de los pacientes con carcinomasis de próstata y de mama disminuyó por obesidad más que para otros tipos de cáncer. WAT tiene un efecto directo en la progresión del cáncer (Vona-Davis, et al, Adiposity, type 2 Diabetes and the Metabolic Syndrome in Breast Cáncer. Obes Rev; 8:395- 408, 2007) , como un órgano endocrino potente que secreta numerosas adipoquinas solubles implicadas en la inflamación y el síndrome metabólico (Rosen et al, Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis, Nature; AAA: 847-853, 2006) . Los factores de crecimiento de tipo insulina (IGF) están entre aquellos que podrían estimular directamente la proliferación de células tumorales. La leptina, interleuquina-6, así como varias otras hormonas y citoquinas inflamatorias, también pueden desempeñar un papel (Baillargeon . Obesity adipokines and prostate cáncer (revisión) Int J Oncol, 28:. 737-745 2006). Sin embargo, los datos clínicos y experimentales que abordan la función de estos factores en el cáncer se han mantenido en controversia. Por ejemplo, en modelos animales de la ablación de IGF-1 circulante no ha mostrado ningún efecto sobre el crecimiento del tumor de próstata (Anzo et al., Targeted deletion of hepatic Igfl in TRAMP ice leads to dramatic alterations in the circulating insulin-like growth factor axis but does not reduce tumor progression. Cáncer Res; 68 (9) :3342-9, 2008). Por lo tanto, se deben considerar mecanismos alternativos.

A diferencia de WAT, cuya función fisiológica es la de almacenar el exceso de energía, el tejido adiposo marrón (BAT) es responsable de la disipación de energía en forma de calor. El delicado equilibrio entre WAT y BAT es un tema importante a tener en cuenta en el diseño de terapias dirigidas. Un número de resultados de los modelos de roedores indican que BAT tiene un efecto protector frente a las consecuencias patológicas de la obesidad. La importancia de descubrir BAT en adultos se encuentra en posibles nuevos enfoques para el tratamiento de la obesidad y de los trastornos asociados. Las ASC son uno de los tipos de células progenitoras que dan lugar a BAT (Elabd et al., Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into functional brown adipocytes, Stem Cells 27, 2753-2760, 2009) . Más importante aún, los adipocitos blancos se pueden convertir directamente a un fenotipo tipo BAT tanto en cultivo como in vivo (Cinti. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. Am. J.

Physiol. Endocrinol. Metab. 297, 977-986, 2009) . En ratones, la expansión de los "parches" de BAT residuales dentro de WAT puede conducir a que prácticamente todos los depósitos adiposos se conviertan en BAT a expensas de WAT. La aparente dependencia de la fisiología del adipocito sobre el estado de la vasculatura sugiere que los agentes dirigidos vascularmente podrían ser diseñados para convertir WAT en BAT, en lugar de destruir el tejido por completo, como un tratamiento contra la obesidad más fisiológico y más seguro. El desarrollo de enfogues farmacológicos para activar la proliferación, vascularización y/o metabolismo del BAT residual existente podría, en teoría, inclinar el equilibrio deWAT/BAT y usarse para tratar la obesidad.

En resumen, la composición del cuerpo adiposo asociado y los trastornos del peso corporal, tales como la obesidad y la diabetes representan los principales problemas de salud. Dada la gravedad, prevalencia, y complejidad de trastornos del peso corporal asociados a adiposas, existe una gran necesidad de identificar los genes y las proteínas que participan en la composición corporal y el control de peso corporal, y de desarrollar nuevos fármacos y terapias para el tratamiento de trastornos de la composición corporal asociados a adiposas, la obesidad, el síndrome metabólico, y la diabetes. El tratamiento dirigido y las modalidades de formación de imágenes a diferentes tipos de células en el tejido adiposo (WAT y BAT) , tales como ASC, puede ser beneficioso para aplicaciones biomédicas en la obesidad, el cáncer y la fibrosis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos y composiciones descritos en la presente se basan, en parte, en el descubrimiento y la identificación de ciertos péptidos que se pueden utilizar para ayudar en el diagnóstico, la prevención, y/o el tratamiento de trastornos asociados a adiposas tales como, pero no limitado a, trastornos de la composición corporal, trastornos del peso corporal, diabetes, obesidad, o el síndrome metabólico, así como el cáncer y la fibrosis, en los mamíferos.

En algunas modalidades de la presente invención, un péptido dirigido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1- 16, en el que dicho péptido se une a las células estromales. En otra modalidad de la presente invención, el péptido dirigido comprende la secuencia de aminoácidos WAT7 SWKYWFGE de la SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 14. En otras modalidades descritas en este documento, una composición de proteina comprende un péptido dirigido, y en una modalidad adicional una composición de proteina comprende la secuencia de aminoácidos WAT7.

En algunas modalidades, el péptido dirigido se compone enteramente de D-aminoácidos, en otras modalidades, el péptido dirigido se compone enteramente de L- aminoácidos , y en otras modalidades el péptido dirigido puede comprender L aminoácidos, D amino ácidos o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades de la invención, una composición de proteina comprende WAT7, en donde WAT7 se compone de D-aminoácidos, y en donde dicha composición se une a las células estromales en el tejido adiposo, tejido fibrótico o tejido tumoral. En algunas modalidades adicionales de la composición de proteínas, WAT7 se une selectivamente a ADCN en la superficie de las células ASC.

En algunas modalidades de la composición de la proteína de la presente invención, un péptido dirigido está acoplado a un agente efector seleccionado de entre el grupo que comprende: un agente de imagen, un agente citotóxico, un agente pro-apoptótico; una proteína de fusión; un agente citostático; un agente citocida; un radioisótopo; una célula ACS de agente diferenciador; inhibidores de la mitosis, agentes antitumorales; agente antibiótico, enzimas; agente quimioterapéutico; agentes anti- angiogenéticos o una combinación de los mismos. En algunas modalidades de la composición de proteina, el péptido dirigido y el agente efector se componen de D-aminoácidos ; en otras modalidades de la composición de la proteina, el péptido dirigido se compone de L-aminoácidos, y el efector comprende D-aminoácidos; en otras modalidades más de la composición de la proteina, el péptido dirigido se compone de L-aminoácidos, y el efector comprende L-aminoácidos.

En algunas modalidades de la composición de proteínas descrita en este documento, el péptido dirigido está acoplado a un agente efector e induce un tejido adiposo blanco a convertirse en un tejido adiposo marrón. En otras modalidades, el agente efector activa los receptores adrenérgicos b3 en el tejido adiposo blanco. En algunas modalidades de la composición de la proteína, el agente efector es un péptido compuesto de D-aminoácidos.

En una modalidad, un método de fabricación de una composición de proteína de tejido adiposo blanco, comprende: el acoplamiento de un agente efector a un péptido dirigido, en donde el péptido dirigido se compone de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1-16, y en donde dicho péptido dirigido dirige selectivamente el tejido adiposo celular. En otras modalidades, el agente efector y el péptido dirigido se componen de D-aminoácidos . En otras modalidades, el efector se compone de L-aminoácidos, y el péptido dirigido se compone de D-aminoácidos.

En algunas modalidades del método de fabricación de una composición de proteina descrita en este documento, el acoplamiento comprende dicho agente efector que une a dicho péptido dirigido con una fracción de unión; en otras modalidades, la fracción de unión comprende ácido aminohexanoico; (CH2)4 ; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 o una combinación de los mismos. En algunas modalidades del método de fabricación de una composición de proteina descrita en este documento, el agente efector se selecciona de entre el grupo que comprende un agente citotóxico, un agente pro-apoptótico, un agente de formación de imágenes o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades un método de administración de un agente efector a un tejido adiposo comprende: la exposición de una composición de proteina que comprende: un agente efector acoplado a un péptido, en donde el péptido se compone de una secuencia de aminoácidos de menos de 100 aminoácidos de longitud, y en donde la secuencia de aminoácidos comprende una fracción de tejido adiposo de péptido dirigido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 1-16; a una población de células que comprende el tejido adiposo. En otras modalidades, la composición de proteínas comprende un enlazador, y dicho enlazador comprende ácido aminohexanoico; (CH2) 4; (CH2)5; (CH2)6; (CH2)7; (CH2)8 o una combinación de los mismos. En algunas modalidades el motivo del péptido dirigido se compone de D- aminoácidos. En otras modalidades, el agente efector y dicho péptido dirigido se compone de D-aminoácidos . En algunas modalidades del método de adminstración de un agente efector a un tejido adiposo descrito en este documento, el agente comprende: un agente citotóxico, un agente pro-apoptótico, un agente de formación de imágenes o combinaciones de los mismos, y en otras modalidades el agente se compone de D- aminoácidos.

En algunas modalidades del método de administración de un agente efector a un tejido adiposo, dicha exposición comprende: la exposición de un sujeto a dicha composición de proteínas al tratamiento de un trastorno asociado con la adiposidad, en donde dicho trastorno comprende obesidad; fibrosis; cáncer o una combinación de los mismos, y en otras modalidades, dicha población de células está en un sujeto mamífero, en otras modalidades, la población de células está en un sujeto humano; en algunas otras modalidades, la población de células es una sección delgada de un tejido.

Algunas modalidades del método de administración de un agente efector a un tejido adiposo, que comprende además la detección de células estromales adiposas en dicha población con base en dicha unión selectiva de la composición de proteina a dicho tejido adiposo. En otras modalidades el método de administración de un agente efector a un tejido adiposo, el trastorno asociado a adiposidad es un trastorno de la composición corporal; un trastorno del peso corporal; obesidad; lipodistrofia; diabetes; síndrome metabólico, fibrosis; cáncer o una combinación de los mismos.

En una modalidad se divulga un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17-24, en donde dicho péptido se une al tejido pulmonar. En otras modalidades se divulga una composición de proteína que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NOS: 17-24 o combinaciones de las mismas. En otras modalidades, la composición de proteínas se compone de D- aminoácidos. En algunas modalidades de la composición de la proteína, el péptido está acoplado a un agente de creación de imagen, un agente citotóxico, un agente pro-apoptótico o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades de la composición de proteínas descrita en este documento, la composición comprende un péptido dirigido y un agente efector, en donde dicho agente efector comprende: gramicidina, magainina, melitina; defensing; cecropina; (KFAKFAK)2, (KFXAKFXAI ) 2; (KHexAHexAK) 2 (KLAKLAK)2; (KLAKKLA)2; ( KAAKKAA) 2 ; (KLGKKLG) 3; angiotensina, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores del activador del plasminógeno, inhibidores de las metaloproteinasas de tejidos; interferones , interleucina 12, factor plaquetario 4; IP - 10; Gro-ß; proteina relacionada CON proliferina; trombospondina, 2-metoxiestradiol carboxiamidotriazol; C 101; Marimastat; polisulfato DE pentosan; angiopoyetina 2 [Regeneron) , interferón-alfa; herbimicina A; PNU145156E; fragmento de prolactina 16K; linomida; talidomida; pentoxifilina, genisteina, TNP470; endostatina; paclitaxel; acutinA; angiostatina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor plaquetario 4 o minociclina, 5- fluorouracilo, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino (CDDP) , ciclofosfamida; dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, agentes vinculantes de receptor de estrógenos; etopósido (VP16) , inhibidores de la farnesil-proteina; gemcitabina; ifosfamida; mecloretamina; melfalán; mitomicina; navelbina; nitrosurea; plicomicina, procarbazina, raloxifeno, tamoxifeno, taxol; temazolomida (una forma acuosa de DTIC) ; transplatinum, vinblastina y metotrexato, vincristina, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, hormonas corticosteroides, inhibidores mitóticos, nitrosoureas , agentes hormonales, inhibidores mitóticos, antibióticos antitumorales, enzimas, modificadores de la respuesta biológica; alcaloides vegetales; docetaxel; etopósido (VP 16); teniposida; paclitaxel; taxol, vinblastina, vincristina, vinorelbina, tiazolidinedionas de agonistas gamma de PPAR, rosiglitazona, fluoróforos, complejos de quelatos metálicos; radioisótopos, marcadores fluorescentes, ureasa, fosfatasa alcalina, liposomas, microcápsulas, micropartículas, nanoparticulas ; perlas magnéticas; microdispositivos , bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (Adriamicina) , plicamicina (mitramicina) e idarrubicina, complejos de coordinación de platino; antracenedionas , ureas sustituidas, derivados de metilo hidracina; amsacrina, L-asparaginasa, y tretinoína. Carboplatino, cisplatino (cis-DDP) ; mitoxantrona; hidroxiurea; procarbazina; proteínas de fusión de IgFc, proteínas de fusión de enzimas; proteína fluorescente; proteínas luminiscentes o combinaciones y análogos de los mismos .

Por lo tanto, las modalidades descritas en este documento comprenden una combinación de características y ventajas destinadas a abordar diversos inconvenientes asociados con los métodos de la técnica anterior de diagnóstico, prevención, y/o tratamiento de trastornos asociados a adiposas. Las diversas características descritas anteriormente, así como otras características, serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia al leer la siguiente descripción detallada, y haciendo referencia a los dibujos que se acompañan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la proyección de péptidos autoguiados por MSC. (A) representa el esquema de una proyección para los péptidos autoguiados a las poblaciones de MSC específicas de órgano. Una mezcla de bibliotecas de péptidos cíclicos desplegadas de tres fagos se utilizó para 4 rondas de biopaneo sincrónico de múltiples órganos. En cada ronda de selección, células eritroides (Terll9+) , endoteliales (CD31 +) y hematopoyéticas (CD45 +) fueron immunoagotadas y luego las FACS se utilizaron para recolectar células CD34 + CD31-CD45 (MSC) de WAT, pulmón, médula ósea, y el músculo esquelético. (B) Péptidos de fagos unidos a WAT MSC (ASC) , en paralelo con péptidos de fagos unidos a MSC de los órganos de control, se cuantificaron, amplificaron, agruparon, y se utilizaron para la siguiente ronda de biopaneo. El aumento de la recuperación de las unidades de transformación de fagos (TU) en rondas sucesivas refleja el enriquecimiento de péptidos de fagos autoguiados a MSC de órganos objetivo individuales. (C) La especificidad relativa de la autoguia de ASC evaluada para los clones de péptidos de fagos individuales inyectados por separado en ratones como una proporción de TU recuperado en WAT a CD34 + CD31-CD45 a TU recuperado en células de pulmón CD34 + CD31-CD45. Fd-Tet: fago de control sin inserción. Los valores mostrados son la media ± SD de mediciones por triplicado.

La figura 2 representa la validación de péptido WAT7 cíclico (SEQ ID NOS: 13) de autoguia a ASC. Los paneles AD son de inmunofluorescencia de anti-fago confocal (rojo) y anti-CD31 (verde brillante) en secciones de parafina de WAT fijado en formol y pulmón de los ratones inyectados por vía intravenosa con péptido de autoguí de WAT con proyección de fago WA 7 (SEQ ID No 13 y 14) o un péptido de autoguia de pulmón LU2 (SEQ ID NOS: 19). La señal roja a la fusión de canal digital indica la localización (flecha) de fago en las células perivasculares no endoteliales observadas para WA 7 (SEQ ID No: 13) en WAT (A), pero no en el pulmón (B) , y para LU2 (SEQ ID No: 19) en el pulmón (D) , pero no en WAT (C) . Los paneles E-J ilustran la biodistribución de péptido biotinilado WAT 1 hr después de la inyección intravenosa, revelada por microscopía confocal de detección de estreptavidina-Cy3 (rojo) y contrastada con la expresión tejido de PDGFRp (rojo) , CD31 (verde brillante) o CD45 (verde) detectado por inmunofluorescencia . Nótese la asociación (flecha) del WAT7 cíclico (SEQ ID No 13) , específicamente con las células perivasculares WAT (E) en un patrón de superposición con PDGFR expresado en ASC (FG) . Al igual que PDGFRp, WA 7 no está asociado con células endoteliales CD31 + (E) o CD45 + células hematopoyéticas (H) . WAT7 no se detectó en el pulmón (I) a pesar de la abundancia de PDGFRß + LSC (J) . La tinción TOPR03 nuclear es azul. Barra de escala: 100 µ?.

La Fig. 3 representa la purificación de decorina como una proteína de unión a WAT7. (A) péptidos sintéticos ciclados con cisteína WAT7 (SEQ ID NOS: 13) y WAT2 (SEC ID No: 3: Control) unidos covalentemente a la EDC Sefarosa fueron incubadas con extracto de proteína de membrana de ratón ASC. Después del lavado, las proteínas unidas a la columna de afinidad de WAT7 se eluyeron consecutivamente con WAT2 (fracciones 1-4), WAT7 (fracciones 5-8) y 0.1 M de glicina pH 2.5 (fracciones 9-12); para la columna de afinidad de WAT2 el orden de eluciones de péptidos se invirtió. La concentración de proteína en cada fracción se midió por el ensayo de Bradford y se representó como absorbancia OD595. (B) Las proteínas desaladas de cada fracción se recubrieron en plástico y se expusieron a fagos con despliegue de WAT7 o WA 2. 7/7: WA 7 afinidad/WAT7- fago; 2/7: WA 2 afinidad/fago WA 7 ; 7/2: afinidad WAT7/fago WAT2 ; 2/2: afinidad WAT2/fago WA 2. La unión del fago se cuantificó en base a la recuperación de TU después de la infección con bacterias huéspedes: el incremento de la unión WAT7-fago de la fracción de afinidad 5 WAT7 indica la elución de una proteina WAT7 vinculante. (C) Las proteínas de las fracciones de afinidad de WAT7 1 (control) y 5 fueron resueltas mediante un gradiente de 4-15% de SDS- PAGE. La tinción de Coomassie del gel demuestra una banda de 40 kDa (flecha) eluida específicamente con WAT7. La espectrometría de masas identificaó la proteína correspondiente como DCN.

La Fig. 4 representa la sobreexpresión de decorina en WAT. Inmunofluorescencia confocal de tejidos de ratón embebidos en parafina fijados en formol con DCN antiratón o anticuerpos PDGFF^ (rojo) contra teñidos con endoteliales anticuerpos anti-CD31 específicos (verde claro) que demuestran que tanto DCN (flechas) como PDGFRp ( puntas de flecha) se expresan en las células perivasculares (ASC) en WAT (A, D) . La expresión de DCN sólo en raras ocasiones se encuentra en asociación con los vasos sanguíneos en los pulmones (B) y es indetectable en la médula ósea (C) , mientras que PDGFR se expresa de forma ubicua por el estroma pulmonar (E) y en la médula ósea (F) . Azul: tinción nuclear TOPR03. Barra de escala: 100 µ?.

La Fig. 5 ilustra que un fragmento de escisión de DCN (ADCN) es el receptor de WAT7 en ASC. (A) La inmunotransferencia de las proteínas solubles y asociadas a la membrana extraídas de las subpoblaciones de WAT de ratón con los anticuerpos de DCN que muestran que ADCN (flecha) se expresa específicamente por ASC pero no por los adipocitos. La inmunotransferencia de control del gel con anticuerpos de actina demuestra igual carga de proteínas. (B) La purificación por afinidad de ADCN del extracto de membrana de ratón WAT SVF. Tinción de Coomassie azul del Gel identificó la banda de 40 kDa esperada (flecha) entre las cadenas ligeras y pesadas de la IgG de anti-DCN. (C) Degradación de microsecuencia de Edman de ADCN aislado en (B) alineada con DCN de ratón y humano de longitud completa. Se indican los sitios previamente reportados de escisión de la proteasa, lo que resulta en el procesamiento de propéptido y el núcleo de DCN. No se muestra la secuencia correspondiente a los aminoácidos 56 a 295 de mDCN. (D) Medición de la unión de WA 7 a ADCN de ratón purificado de bacterias recombinante, en comparación con núcleo de ratón de longitud completa purificado de bacterias recombinante DCN (Mdcn) , DCN (Mdcn *) glicosilada de ratón de longitud completa, DCN (bDCN *) glicosilada bovina, y BSA mediante ELISA. La absorbancia de DO450, representará gráficamente como una función de la concentración de péptido, muestra unión de ADCN-WAT7 y dcn-WAT7dependiente de la dosis. Se muestran los media ± SD de tres pocilios; * P <0.05. (E) Inmunotransferencia anti-DCN del total de células y de células proteínas asociadas a la membrana extraída de ratón WAT SVF que muestra que ADCN (flecha) se asocia con la membrana celular. (F) La exposición de ADCN en la superficie de ratón ASC se evaluó mediante el tratamiento de las células con un reactivo de biotinilación . Las proteínas con biotina (aisladas con perlas de estreptavidina) se sometieron a inmunotransferencia anti-DCN, revelando ADCN (flecha) sometida a biotinilización en ASC recién aislada, pero no en cultivo. (G) Las células 3T3-L1 establemente transducidas con lentivirus que expresan GFP (vector) , fusión de DCN-GFP (DCN) de núcleo de ratón de longitud total, o fusión ?DCN-GFP (ADCN) de ratón. La inmunofluorescencia de GFP muestra la localización en la superficie celular de la fusión GFP-ADCN. Barra de escala: 10 µ?.

La Fig. 6 representa la unión de WAT7 a ADCN imitando la resistina. (A) Inicio: tinción de Coomassie de un gel que demuestra la purificación de GST (1) y péptidos recombinantes GST-fusionados WATl (2), WAT2 (3), WAT7 (4), LU2 (5) , analizado en paralelo con los siguientes controles: péptido KGGRAKD (6), proteína de la prohibitina (7), y péptido WLGEWLG. Medio: inmunotransferencia del mismo gel con anticuerpos anti-WAT7. Parte inferior: inmunotransferencia del mismo gel con suero pre-inmune de un conejo utilizado para la generación de anticuerpos anti- WAT7. (B) La inmunotransferencia de las proteínas totales extraídas de cultivos de fibroblastos de ratón 3T3-L1, ASC cultivado, LSC cultivado, así como las células recién aisladas de WAT, médula ósea o pulmones con anticuerpos anti-WAT7 detecta una proteína 13 kDa específica (punta de flecha) . (C) Purificación por afinidad de las proteínas de ratón con anticuerpos anti-WAT7 de extracto de WAT. La tinción de coomassie en el gel revela la misma proteína 13 kDa, identificada como resistina, en relación a la luz (L) y las cadenas pesadas (H) de anti-IgG WAT7. (D) Medición de FLAG etiquetado con resistina y la proteína de control (BAP) de unión a ADCN recombinante de ratón purificado en bacterias, en comparación con DCN de ratón con núcleo de longitud completa recombinante purificadp en bacterias (Mdcn) , una proteína de control etiquetada his6 CLIC4 (prot-ctrl) , glicosilada DCN (Mdcn *) de ratón de longitud total, DCN (bDCN *) bovina glicosilada y BSA mediante ELISA. La absorbancia de DO450, representada gráficamente como una función de la concentración de proteína marcada con FLAG, muestra unión de ADCN/resistina dependiente de la dosis.

La Fig. 7 ilustra los efectos de la expresión de ADCN en preadipocitos . Los ensayos funcionales se realizaron en células 3T3-L1 establemente transducidas con lentivirus que expresa GFP (vector) , fusión de DCN-GFP (DCN) de ratón de núcleo de longitud total, o fusión de ADCN-GFP (ADCN) de ratón. (A) La proliferación de 5000 células adherentes en los puntos de tiempo indicados se midió por el ensayo MTT. Se muestran las media ± SD de tres pocilios, * P <0,05. (B) La migración de 25,000 células pre-ayunadas a través de poros de 5 µ? hacia FBS al 10% medido por el ensayo Transwell. Después de 12 h, las células en la parte inferior de Transwell fueron fijadas, se tiñeron y se contaron. Los valores mostrados son la media ± SD de tres pocilios, * P <0,05. (C) Conclusión: la diferenciación de adipocitos medida por la acumulación de gotas de lipidos detectadas con el microscopio de contraste de fase 10 días después de la inducción de la adipogénesis. Barra de escala: 10 µ .

La Fig. 8? es una descripción esquemática de la detección sincrónica de la proyección de fagos in vivo. En cada ronda de selección, los fagos se administraron i.v. y se recuperaron de forma simultánea desde los tejidos objetivo, se amplificaron, se juntaron, y se utilizaron para la siguiente ronda de selección. El aumento de la recuperación de las unidades de transformación de fagos (TU) en las rondas posteriores refleja la selección de péptidos preferentemente mensajeros en el órgano objetivo.

La Fig. 8B ilustra la identificación de MSC por citometria de flujo. Se muestra un análisis WAT subcutáneo representativo. La supresión de células viables que expresan CD34 + (diagrama de dispersión izquierdo) , fueron después suprimidas con base en la expresión de CD31 y CD45 (diagrama de dispersión derecho) , CD34 + CD45-CD31-ASC fueron identificados como eventos de color púrpura en Q3. Los eventos de color púrpura en Ql corresponden a células endoteliales CD34 + CD45-CD31 +. Los eventos en Q2 y Q4 corresponden a células hematopoyéticas CD45 +.

La Fig. 9A ilustra la selectividad de varios de los péptidos aislados en la proyección de fagos que se evaluó mediante un ensayo de unión fago-celular. Los fagos que expresan el péptido WATl (SEQ ID NOS: 1 y 2) , WAT2 (SEQ ID NOS: 3 y 4), WAT7 (SEQ ID NOS: 13 y 14), LU2 (SEC ID NOS. 19 y 20), mPep (SEQ ID NOS: 35 y 36) o de fago sin inserto (Fd-Tet) se ensayaron para la unión en: (1) células 4T1.2, células endoteliales derivadas de un carcinoma mamario humano (2) células de ratón 3T3-L1 (una linea de células pre-adiposas que pueden diferenciarse en un fenotipo tipo adipocito) , (3) células SVF de ratón primario de WAT, (4) células de ratón SVF de pulmón principales, y (5) el paso 4 de las células ASC humanas de WAT (barras de izquierda a derecha) . Se añadieron los péptido-fago indicados junto con Fd-tet de control de fago sin inserto (108 UT) durante 1 hora a 37C. Después de lavar 3 veces con RPMI/1% de BSA, las células fueron sometidas a aspersión con un homogeneizador . El fago recuperado se utilizó para infectar E. coli K91., y sobre colonias de selección de tetraciclina se contaron para cuantificar la media de unidades transformadoras (TU) . Se muestran los valores medios de tres recubrimientos individuales + SEM (barras de error) .

La Fig. 9B ilustra la selectividad de varios de los péptidos aislados en la pantalla de representación de fagos que se evaluó usando un ensayo de unión fago-celular. Los fagos que expresan el péptido WATl (SEC ID NO. 1), WAT2 (SEC ID NO. 3), WA 7 (SEC ID NO. 13), LU2 (SEC ID NO. 19), mPep (SEQ ID NO. 35) o fago sin inserto (Fd-Tet) se ensayaron para la unión en WAT SVF humanas sin pasaje. Se añadió el péptido-fago indicado junto con Fd-tet de control de fago sin inserto (108 UT) durante 1 hora a 37C. Después de lavar 3 veces con RPMI/1% de BSA, las células se sometieron a aspersión con un homogeneizador. El fago recuperado se utilizó para infectar E. coli K91, y sobre colonias de selección de tetraciclina se contaron para cuantificar la media de unidades transformadoras (TU) . Se muestran los valores medios de tres recubrimientos individuales + SEM (barras de error) .

La Fig. 10 ilustra la estructura de un péptido citotóxico quimérico dirigido en donde el péptido cíclico autoguiado o dirigido se acopla a través de un enlazador a un péptido citotóxico/pro-apoptótico .

La Fig. 11 ilustra la actividad de destrucción in Mitro dependiente de la dosis de WAT7 KLAKLAK2 (SEC ID NO: 13-SEQ ID NO: 31) ( todo-D-péptido (0.01 mM, 0.05 mM y 0.10 itiM) y por lo tanto la capacidad de la péptido ASC- autoguiado denominado WAT7 (SEQ ID NO: 13) para dirigir la matanza eficiente de ASC principal del ratón en cultivo, tal como se visualiza mediante exclusión con azul tripán.

La Fig. 12 ilustra la validación de que la apoptosis fue la causa de la muerte en las células tratadas con WAT7 KLAKLAK2 (SEC ID NO. 13-SEQ ID NO: 31) todo-D- péptido. Reactivo de APO-TRACE (Sígma) y citometría de flujo se utilizaron para detectar la inducción de apoptosis en las células tratadas para validar la apoptosis como el mecanismo de la muerte celular. Se muestran las células tratadas con el péptido apoptótico no dirigido y las tratadas con péptido apoptótico WA 7 dirigido.

La Fig. 13 muestra ratones obesos 48 horas después del tratamiento con 2 mg de control o con el péptido citotóxico dirigido, WA 7 KLAKLAK2 (SEC ID NO. 13- SEQ ID NO. 31) todos-D-péptido . Se puede observar que el ratón tratado con el péptido citotóxico dirigido, WA 7 KLAKLAK2 (SEQ ID NO. 13-SEQ ID NO. 31) todo-D-péptido, tiene una reducción en la cantidad de tejido adiposo.

La Fig. 14 muestra que el tratamiento con el péptido citotóxico dirigido, WA 7 KLAKLAK2 (SEQ ID NO. 13- SEQ ID NO, 31) todo-D-péptido ha agotado la ASC presente en WAT subcutáneo (panel F frente a E) , pero el efecto sobre WAT intraperitoneal es significativamente mayor (panel H frente a G) y también da como resultado la necrosis tumoral (como se muestra en los paneles B frente a A y el panel D frente a C) .

La Fig. 15 ilustra que la apoptosis inducida por el tratamiento con WAT7 KLAKLAK2 citotóxico (SEQ ID NO. 13- SEQ ID NO. 31) todo-D-péptido se limita a tejido objetivo. Reactivo de APO-TRACE (Sigma) y citometria de flujo se utilizaron para detectar la inducción de apoptosis en células WAT tanto intraperitoneales como subcutáneas, pero no en las células de los ríñones o la sangre periférica. La falta de la apoptosis no específica indica que los péptidos quiméricos citotóxicos son resistentes a la proteólisis.

La Fig. 16 ilustra (A) inmunotransferencia de las proteínas asociadas a la membrana y solubles extraídas de WAT de ratón, pulmón y médula ósea (MO) con anticuerpos contra DCN de ratón. Se indica la migración del núcleo de DCN no-glicosilado (punta de flecha) , y una isoforma especifica de WAT (flecha) . El control de inmunotransferencia del gel con anticuerpos ???2? demuestra la igualdad de carga de proteínas de membrana. (B) La medición de péptido de control de unión de WAT7 (parte superior) y de WAT2 (parte inferior) de DCN de ratón de núcleo recombinante (Mdcn) , DCN (bDCN *) bovina glicosilada y BSA mediante ELISA. La absorbancia DO450, representada gráficamente como una función de la concentración de péptido, muestra la unión de mDCN-WAT7 dependiente de la dosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias proporciona secuencias de aminoácidos de péptidos que se unen al tejido adiposo de mamífero y al tejido pulmonar. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos ciclados en cisteína que se unen al tejido adiposo blanco (WAT 1-8) se presentan en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Los péptidos ciclados no-cisteínicos correspondientes se presentan en SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14.

Las secuencias de aminoácidos de péptidos ciclados cisteínicos que se unen al tejido pulmonar (LU1-4) se presentan en las SEQ ID NOS: 17, 19, 21 y 23 con los correspondientes péptidos ciclados no cisteínicos se presentan en las SEQ ID NOS: 18, 20, 22 y 24.

Las secuencias de aminoácidos de un péptido de unión adiposo (ciclado cisteinico) descrito previamente se presenta como SEQ ID NO: 25 con la secuencia de péptido no-ciclado cisteinico correspondiente presentada como SEQ ID NO: 26.

Las secuencias de aminoácidos de diversos péptidos de control se presentan como péptidos ciclados cisteinicos en las SEQ ID NOS: 27 y 29 los péptidos de control ciclados no cisteinicos correspondientes se presentan en la SEQ ID NOS: 28 y 30. Las secuencias de aminoácidos de diversos péptidos citotóxicos conocidos y/o pro-apoptosis se presentan como péptidos ciclados cisteinicos en las SEQ ID NOS: 31 y 33 con los correspondientes péptidos ciclados no cisteinicos presentados en las SEQ ID NOS: 32 y 34.

Las secuencias de aminoácidos de un péptido conocido como mPep se presentan como péptidos ciclados cisteinicos en la SEQ ID NO: 35 con el correspondiente péptido no-ciclado cisteinico presentado en la SEQ ID NO. 36.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones .

En esta descripción, el uso del singular incluye el plural, la palabra "un", "uno" o "una" significa "al menos uno", y el uso de "o" significa "y/o", a menos que se indique específicamente lo contrario. Por otra parte, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos o componentes que comprenden más de una unidad a menos que se indique específicamente lo contrarío.

Los encabezados de sección usados en este documento son sólo para fines de organización y no deben interpretarse como limitantes de la materia de referencia descrita. Todos los documentos o partes de documentos citados en esta solicitud, incluyendo, pero no limitado a, las patentes, solicitudes de patentes, artículos, libros y tratados, están expresamente incorporados aquí por referencia en su totalidad para cualquier propósito. En el caso de que uno o más de la literatura incorporada y materiales similares definan un término de una manera que contradiga la definición de ese término en esta solicitud, esta solicitud controlará.

Tal como se usa en este documento, y a menos que se indique lo contrario, el término trastornos asociados a adiposas incluye pero no se limita a trastornos de tejido adiposo blanco o marrón, trastornos del peso corporal o composición corporal asociados a adiposas incluyendo, pero no limitado a, trastornos relacionados con el peso corporal, tales como obesidad, lipodistrofia, síndrome metabólico, y condiciones asociadas con el aumento de peso, mantenimiento de la pérdida de peso, riesgo de la recuperación de peso después de la pérdida de peso, y trastornos de azúcar en la sangre relacionados, diabetes, hipertensión, condiciones fibróticas, y cáncer.

Como se usa en este documento, y a menos que se indique lo contrario, los términos "tratamiento", "tratar", "que trata" y "terapia" contemplan una acción que se produce cuando el paciente está sufriendo de un trastorno relacionado con el tejido adiposo blanco que reduce la gravedad de uno o más síntomas o efectos de una trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como obesidad, lipodistrofia, diabetes, síndrome metabólico, fibrosis y cáncer. Cuando el contexto lo permita, los términos "tratamiento", "tratar" y "que trata" también se refieren a las medidas adoptadas para asegurar que los individuos con mayor riesgo de un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, como la obesidad, lipodistrofia, diabetes o síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer sean capaces de recibir la intervención médica quirúrgica y/o de otro tipo apropiado antes de la aparición de un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer. Como se usa en este documento, y a menos que se indique lo contrario, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" contemplan una acción que se produce antes de que un paciente comience a sufrir de un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer, retrasar la aparición de, y/o inhibir o reducir la gravedad de, un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer .

Tal como se usa en este documento, y a menos que se indique lo contrario, los términos "gestionar", "gestión", y "manejo" abarcan prevenir, retardar, o reducir la gravedad de una recurrencia de un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer en un paciente que ya ha sufrido de una enfermedad, trastorno o afección como tal. Los términos abarcan la modulación del umbral, el desarrollo, y/o la duración del trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer o el cambio de cómo un paciente responde al trastorno de peso o composición corporal asociado a adiposidad.

Tal como se usa en este documento, y a menos que se especifique lo contrario, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar algún beneficio terapéutico en el tratamiento o la gestión del trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con el trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad del compuesto, solo o en combinación con uno o más de otras terapias y/o agentes terapéuticos que proporcionan algún beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo del trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que alivia el trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer, mejora o reduce el trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, fibrosis y cáncer, mejora la terapia global, o aumenta la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico .

Tal como se usa en este documento, y a menos que se especifique lo contrario, una "cantidad profilácticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para prevenir o retrasar la aparición del trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer, o uno o más síntomas asociados al trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer o prevenir o retrasar su repetición. Una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto significa una cantidad del compuesto, solo o en combinación con uno o más otros tratamientos y/o agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer. El término "cantidad profilácticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que previene el trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer, mejora la profilaxis global o mejora la eficacia profiláctica de otro agente profiláctico. La "cantidad profilácticamente eficaz" puede ser prescrita antes de, por ejemplo, el desarrollo de un trastorno asociado al tejido adiposo.

Tal como se usa en este documento, "paciente" o "sujeto" incluye organismos que son capaces de sufrir un trastorno de peso corporal o composición corporal asociado a adiposidad, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes, síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer tal como se describe en este documento, tales como mamíferos humanos y no humanos. Los animales humanos preferidos incluyen sujetos humanos. El término "mamíferos no humanos", como se usa aquí incluye todos los mamíferos, por ejemplo, roedores, ratones, ratas, etc., y los primates no humanos, animales de compañía y ganado, por ejemplo, ovejas, perro, vaca, caballo, etc.

Como se usa en este documento, un "péptido dirigido" es un péptido que comprende una secuencia contigua de aminoácidos, que se caracteriza por la localización selectiva a un tipo de órgano, tejido o célula. La localización selectiva puede ser determinada, por ejemplo, por los métodos descritos a continuación, en los que la supuesta secuencia de péptido dirigido se incorpora en una proteina que se muestra en la superficie exterior de un fago. La administración a un sujeto de una biblioteca de fagos tales que han sido modificados genéticamente para expresar una multitud de tales péptidos dirigidos de diferentes secuencias de aminoácidos es seguido por la recolección de uno o más órganos, tejidos o tipos de células del sujeto y la identificación de fagos encontrados en ese órgano, tejido o célula. Un fago que expresa una secuencia de péptido dirigido se considera que está localizado selectivamente a un tejido u órgano si exhibe una mayor unión en el tejido u órgano en comparación con un tejido de control u órgano. Preferiblemente, la localización selectiva de un péptido dirigido debe dar lugar a un enriquecimiento de dos veces o más del fago en el órgano, tejido o célula de destino, en comparación con un órgano, tejido o célula de control. La localización selectiva que resulta en al menos un enriquecimiento de tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más en el órgano objetivo en comparación con un órgano de control, tejido o célula tipo es más preferido. Alternativamente, un fago que expresa una secuencia de péptido dirigido que muestra la localización selectiva muestra preferiblemente un aumento de enriquecimiento en el órgano objetivo en comparación con un órgano de control cuando el fago recuperado del órgano objetivo se re-inyecta en un segundo anfitrión para otra ronda de selección. El enriquecimiento puede ser mostrado después de la tercera ronda de selección. Otro medio alternativo para determinar la localización selectiva es que los fagos que expresan el péptido putativo objetivo muestren preferiblemente enriquecimiento del doble, más preferiblemente de tres veces o más en el órgano objetivo en comparación con el control de fago que expresa un péptido no especifico o que no ha sido modificado genéticamente para expresar cualquier péptido dirigido putativo. "Péptido Dirigido" y "péptido autoguia" se utilizan como sinónimos en este documento.

Como se usa en este documento "biblioteca de despliegue de fagos" significa una colección de fagos que han sido modificados genéticamente para expresar un conjunto de péptidos dirigidos putativos sobre su superficie exterior. En modalidades preferidas, las secuencias de ADN que codifican los péptidos dirigidos putativos se insertan en el marco en un gen que codifica una proteina de fago en cápsula. En otras modalidades preferidas, las secuencias de péptidos dirigidos putativos son mezclas en parte aleatorias de los veinte aminoácidos y en parte no aleatorias. En ciertas modalidades preferidas, los péptidos dirigidos putativos de la biblioteca de despliegue de fagos muestran uno o más residuos de cisteina en ubicaciones fijas dentro de la secuencia de péptido dirigido. Las cisteinas se pueden utilizar, por ejemplo, para crear un péptido cíclico.

Un "complejo macromolecular" se refiere a una colección de moléculas que pueden ser aleatorias, ordenadas o parcialmente ordenadas en su disposición. El término abarca organismos biológicos tales como bacteriófagos, virus, bacterias, organismos patógenos unicelulares, organismos patógenos multicelulares y células procariotas o eucariotas. El término también abarca conjuntos de moléculas inertes, tales como liposomas, microcápsulas, microparticulas, nanopartículas, perlas magnéticas y microdispositivos . El único requisito es que el complejo contenga más de una molécula. Las moléculas pueden ser idénticas, o pueden diferir entre sí.

Un "receptor" para un péptido dirigido incluye pero no se limita a cualquier molécula o complejo macromolecular que se une a un péptido dirigido. Ejemplos no limitativos de receptores incluyen péptidos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, epítopos, lípidos, hidratos de carbono, estructuras multi-moleculares , una conformación específica de una o más moléculas y una entidad morfoanatómica . En modalidades preferidas, un "receptor" es una molécula o complejo de moléculas de origen natural que está presente en la superficie luminal de las células que forman los vasos sanguíneos dentro de un órgano, tejido o célula tipo objetivo.

Las composiciones y métodos se proporcionan para su uso en la generación de péptidos dirigidos selectivos. En algunas modalidades, se proporcionan péptidos dirigidos particulares selectivos o específicos para tejido adiposo, incluyendo, pero no limitado a, las SEQ ID NOS: 13 Y 14, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18 o SEQ ID NO: 19, y en otras modalidades, péptidos dirigidos selectivos para el tejido adiposo se pueden utilizar para administrar selectivamente o específicamente agentes terapéuticos a los tejidos objetivo, tal como el tejido adiposo. En ciertas modalidades, los métodos se refieren a la preparación y la identificación de péptidos dirigidos selectivos o específicos para una célula dada, tejido, u órgano objetivo, tal como tejido adiposo. Los péptidos dirigidos adiposos incluyen, pero no se limitan a CKGGRAKDC (SEQ ID ??. 25, SEQ ID ??. 26, y SEQ ID NO: 1-16) . Los péptidos de control incluyen, pero no se limitan a CARAC (SEQ ID NOS: 27 y 28), o CGDKAKGRC (SEQ ID NOS: 29 y 30).

La grasa blanca representa un tejido exclusivo que, al igual que los tumores, puede proliferar y expandirse rápidamente (Wasserman, en: Handbook of Physiuology, eds . Renold and Cahill, p.p. 87-100, American Physiological Society, Washington, D.C., 1965; Cinti, Eat. Weight, Disord. 5:132-142, 2000). Estudios de tejido adiposo revelan que es altamente vascularizado . Múltiples capilares hacen contacto con todos los adipocitos, lo que sugiere la importancia de la vasculatura para el mantenimiento de la masa de grasa (Crandall et ah, Microcirculation 04:211-232, 1997). La proliferación de tejido adiposo podría depender de la angiogénesis de manera similar a los tumores. Si es asi, la destrucción de la neovasculatura de la grasa podría prevenir el desarrollo de la obesidad, mientras que los vasos sanguíneos dirigidos existentes podrían potencialmente resultar en la regresión de grasa. Los métodos de uso de péptidos dirigidos a tejido adiposo pueden incluir la inducción de la pérdida de peso, tratamiento de la obesidad u otros trastornos asociados a adiposas tales como, pero no limitado a, formación de imágenes o tratamiento de cáncer y fibrosis.

Se da a conocer la combinación de la tecnología de despliegue de fagos in vivo (tal como la descrita en, entre otros, las solicitudes de patente Estadounidenses Nos. US20090104117, US20060094672, US20060239968, US20090221505, US20080176792 , US20080124277 , US20100172864, US20040170955, US20010046498 y Kolonin et al, Nature Medicine, 10, 625-32, 2004) con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para el aislamiento de péptidos autoguiados a las poblaciones selectivas de las células en un órgano de interés. Este sistema de selección in vivo se utilizó en combinación con las bibliotecas de despliegue de fagos para identificar péptidos dirigidos de órgano, tejido o tipo de célula. Las bibliotecas de despliegue de fagos que expresan péptidos transgenéticos en la superficie del bacteriófago se pueden generar mediante la inserción de oligonucleótidos al azar en los ADNc que codifican una proteina de superficie del fago, generando colecciones de partículas de fagos que presentan péptidos únicos en muchas permutaciones. El despliegue de fagos es una técnica en la que una biblioteca de fagos expresa, por ejemplo, un conjunto de secuencias de péptidos al azar de longitud definida, que se incorpora en una proteína de recubrimiento de fago y secuencias de péptidos que se unen a una molécula, célula, tejido, objetivo por ejemplo tejido adiposo u órgano identificado mediante la incubación de una biblioteca de despliegue de fagos. Los fagos no unidos se lavan y el fago unido se eluye y recolecta. El fago puede ser amplificado y llevado a través de ciclos adicionales de unión/amplificación para enriquecer el conjunto de péptidos para que de forma selectiva y/o específicamente se unan al objetivo. Con cada ciclo, la proporción de fagos en el grupo que contiene péptidos dirigidos al objetivo de interés, se enriquece. Después de varios ciclos, los clones de fagos individuales se pueden caracterizar mediante la secuenciación para identificar las secuencias de péptidos dirigidos (biopaneo, véase, por ejemplo, US20050187161 , así como Pasqualini y Ruoslahti, Nature 380:364-66, 1996; Arap et al, Science 279: 377-80, 1998) .

La administración por vía intravenosa (IV) de bibliotecas de despliegue de fagos a los ratones fue seguida por la recuperación del fago a partir de órganos individuales. Los fagos que se recuperaron eran capaces de autoguía selectiva al tejido adiposo, basándose en las secuencias específicas de péptidos dirigidos expresadas en la superficie exterior del fago. Una variedad de órganos y los péptidos de autoguía tumorales han sido identificados por este método (véase por ejemplo los documentos de patentes de Estados Unidos: US20060094672, US20080124277, US200901041 17, US20090221505 y US20100172864) .

Los siguientes ejemplos específicos proporcionan una demostración de la validez de este enfoque cuando se aplica a tejido adiposo (grasa) blanco (WAT) , sin embargo, los expertos en la técnica se darán cuenta de que esta técnica podría ser aplicada a tejido adiposo marrón (BAT) e incluso a otros tipos de células de diversos tejidos y órganos. WAT contiene un suministro abundante de células estromales adiposas pericítico (ASC) , que pertenecen a la clase de las células madre mesenquimales (MSC) . MSC tiene la firma de superficie de células CD34+CD31-CD45. La naturaleza multipotente de MSC y ASC, así como su alta tasa de proliferación y la capacidad de migración significan que pueden ser tanto beneficiosas como patógenos. ASC han demostrado ser responsables de la expansión del tejido adiposo en la obesidad y también promover la progresión del cáncer y posiblemente otras enfermedades acompañadas por la fibrosis (Zhang et al., Cáncer Res. 69:5259 a 5266, 2009).

Para demostrar el éxito de esta combinación de la tecnología de despliegue de fagos ín vivo y un método de proyección de FACS, bibliotecas de péptidos para los marcadores de ASC fueron seleccionados en ratones vivos. Una mezcla de bibliotecas de péptidos al azar que comprende CX7C, CX8C, y CX9C cíclico (en donde C representa cisterna y X representa cualquier fracción) fue seleccionada. La biblioteca de fagos-péptido se inyecta en un animal y 4 rondas de biopaneo sincrónico de múltiples órganos in vivo se llevan a cabo para enriquecer los péptidos autoguía de WAT. En cada ronda de selección de fagos se administra I.V. y se recuperan de la fracción del estroma/ ascular (SVF) de WAT y los órganos de control, se amplifica, se junta y se utiliza para la siguiente ronda. FACS se utilizó para agotar los fagos péptidos unidos a células endoteliales (CD31+) y hematopoyéticas (CD45+) y recoger fagos péptidos unidos a CD34+CD31~CD45~ ASC. El enriquecimiento de fagos se demuestra por el aumento de la recuperación de unidades de transformación (TU) de fagos en cada ronda subsiguiente refleja la selección de fagos-péptidos autoguia de células CD34+CD31"CD45~ de WAT y de otros órganos objetivo.

El resultado fue que los péptidos que se dirigen a la ASC cuando se inyectan ín vivo, pero no en SC, se identificaron utilizando los órganos de control incluidos para contra-selección. Los órganos dirigidos fueron pulmón, hueso, médula ósea, y músculo esquelético. Un péptido particular designado como WAT7 (secuencia CSW YWFGEC y SWKYWFGE: SEQ ID NOS: 13 y 14, respectivamente) mostró el patrón más definitivo de dirección de ASC, mientras que el péptido LU-2 (secuencia CESGFPTVGC: SEQ ID NOS: 19 y 20) fue elegido como un péptido de control que se dirige a MSC en el pulmón.

La especificidad de autoguia a células CD34+CD31~ CD45" de WAT para clones de fagos de péptidos individuales se demostró mediante inyección en ratones. La unión de cojinete de péptido fago WAT-7 fue altamente enriquecida en ASC en comparación con la unión de pulmón MSC (véase la fig. 1C) . Por el contrario, un péptido a5ß1 autoguia de PEP (Nie et al., 2008, ibid) y otros péptidos de control analizados no mostraron ninguna especificidad de WAT.

WAT7, es un octapéptido cíclico (secuencia de aminoácidos CSWKYWFGEC y SWKYWFGE (SEQ ID NOS. 13 y 14) que se autoguían a ASC, pero no al MSC en otros órganos, cuando se administra sistémicamente . WAT7 puede ser ciclado a través de la terminal de fracciones de CYS. WAT-7 se utiliza como cebo para purificar bioquímicamente el receptor de la superficie ASC correspondiente que fue identificado como una isoforma previamente pasado por proteína decorina (DCN) , un fragmento de escisión proteolítica que carece de sitio de glicosilación . Se determinó que este DCN truncado (denominado delta -DCN (ADCN) ) , se sobreexpresa por ASC y está expuesto en la superficie celular, proporcionando de este modo un nuevo marcador ASC. Además mediante la inversión de la idea y la detección de proteínas que imitan WAT-7, la resistina se identificó como el ligando endógeno de los ADCN en WAT. La expresión ectópica de ñDCN en preadipocitos induce un fenotipo que es coherente con lo que se había informado anteriormente sobre la resistina, apoyando la conclusión de que la interacción resistina-ADCN controla la señalización de cascadas que controlan el destino de ASC. Los péptidos descritos pueden ser inyectados sistémicamente para agotar las poblaciones de células selectivas. En los ejemplos a continuación, los péptidos dirigidos a células madre adiposas (ASC) en el tejido adiposo (grasa) del tejido blanco (WAT) se detallan. El ASC de direccionamiento puede ser beneficioso como terapia de obesidad, cáncer y fibrosis .

El uso de péptidos como péptidos dirigidos y para generar, por ejemplo, péptidos híbridos dirigidos a células in vivo acoplados a péptidos híbridos pro-apoptóticos que muestran unión selectiva y/o específica de tejido objetivo, incluyendo, pero no limitados a, tejidos adiposos, han sido informados anteriormente (véase, por ejemplo las Publicaciones de solicitudes de patente Estadounidenses US200901041 17, US2006009 672 , US20060239968, US20090221505, US20080176792, US20080124277 y US20100172864) . Tales péptidos híbridos son péptidos sintetizados compuestos de dos dominios funcionales: un dominio autoguía (direccionamiento celular) que se unen a un receptor expresado diferencialmente en las células de interés y un dominio citotóxico que provoca la muerte apoptótica de las células que internalizan el péptido. El péptido que actúa normalmente es de 7 a 8 aminoácidos de longitud y es cíclico (limitado por dos cisteínas unidas a disulfuro) . El dominio citotóxico es una secuencia de péptido anfipático KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO: 31) designado (KLAKLAK)2, que interrumpe las membranas mitocondriales sobre la internalización mediada por el receptor celular y causa la muerte celular programada (apoptosis) . Tales péptidos citotóxicos incluyen también, los que comprenden los que tienen la fórmula de (FXR)n, donde n = 4, 6, 8 y 10, y en donde F es fenilalanina, Fx es ciclohexil-alanina y es residuo 6hexagonal de carbono de la cadena alquilo, siendo ejemplos (KFAKFAK) 2, (KFXAKFXAK)2 y (KHexAKHexAK) 2, asi como los que se describen, por ejemplo, en, Horton, KL y Kelley, SO. Engineered Apoptosis-Inducing Peptides with Enganced Mitochondrial Localization and Potency, J. Med. Chem. , 52, 3293 a 3299, 2009, Yousif, LF, Stewart, KM, Horton, KL y Kelley, SO. Mitochondria-Penetrating Peptides: Sequence Effects and Model Cargo Transport . ChemBioChem, 10: 2081-2088, 2009; .. Kelley SO, Stewart KM, Mourtada R. Development of novel peptides for mitochondrial drug delivery: aminoacids featuring delocalizaed lipophilic cations. Pharm Res.Nov; 28 ( 11 ): 2808-19 , 201 1 Epub 2011 ago 11, Horton, KL, Pereiral, MP, Stewart, KM, Fonseca SB y Kelley, SO. Turning the Activity of Mitochondria- Penetrating Peptides for Delivery or Disruption, ChemBioChem, 13(3), 476-185, 2012 Publicado en linea: 11 de enero de 2012.

Sin embargo, el éxito de estos péptidos híbridos ha sido limitado previamente, y puede estar asociado con la toxicidad, debido a que el dominio de la autoguía y el enlazador Gly-Gly publicado han sido compuestos tradicionalmente de L-aminoácidos que pueden estar sujetos a la proteolisis in vivo. La proteólisis reduce el péptido híbrido activo y eventualmente puede resultar en la liberación de varios sub-péptidos , algunos de los cuales pueden representar las porciones de direccionamiento o efectoras del péptido híbrido. La posible liberación de los péptidos efectores, tales como, pero no limitados a los péptidos pro-apoptóticos, tales como DKLAKLAK2, (SEQ ID NO: 31) sin los péptidos dirigidos, puede dar lugar a reacciones adversas, tales como toxicidad renal. Además, la inestabilidad debido a la proteolisis, aumenta la cantidad de péptido necesaria para inyección para obtener niveles terapéuticos. Por lo tanto, la eficacia clínica y la seguridad de los péptidos efectores de la técnica anterior son limitadas.

Además, debido a que las glicinas que componen la región de enlace descrita anteriormente no existen como una forma D, la síntesis de un péptido pro-apoptótico todo-D no fue previamente posible hasta la sustitución del enlazador con ácido aminohexanoico, tal como se describe en este documento. Además, la construcción de un dominio de péptido que actúa/dirige a partir de aminoácidos de forma D no se ha intentado anteriormente debido a la preocupación de que la conversión de la forma L (en la que los péptidos se aislaron originalmente) a forma D puede resultar en un cambio conformacional que se traduce en incompatibilidad con el receptor objetivo y la pérdida de reconocimiento, y una pérdida correspondiente de autoguia. Sin embargo, como se describe en este documento tales péptidos todo-D pueden llegar a las células objetivo, así como los péptidos L de la técnica anterior.

En algunas modalidades, una composición incluye un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-16, en el que el péptido se une al tejido adiposo. En algunas modalidades, una composición de proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-16, y en algunas modalidades, la composición de la proteína se compone enteramente de D-aminoácidos . En algunas otras modalidades, una composición de proteína comprende un péptido acoplado a un agente de imagen. En algunas modalidades, el péptido dirigido está acoplado a un agente citotóxico o pro- apoptótico. En algunas modalidades, una composición de proteína comprende un péptido acoplado a un agente que induce el tejido adiposo blanco a convertirse a tejido adiposo marrón. En algunas modalidades, los péptidos están compuestos de D-aminoácidos . En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a los agentes u otros péptidos a través de un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico . En algunas modalidades, el enlazador comprende (CH2) (CH2)5; (CH2)5; (CH2)7; (CH2)8 o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el agente activa los receptores adrenérgicos ß3 en un tejido adiposo blanco. En algunas modalidades, el agente es un péptido y en algunas modalidades, el péptido se compone de D-aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos están compuestos de D-aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a los agentes u otros péptidos a través de un enlazador. En algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico.

En algunas otras modalidades, una composición de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 1-16. En algunas modalidades, una célula huésped recombinante comprende la molécula de ácido nucleico aislada, y en algunas modalidades adicionales, un vector de expresión comprende la molécula de ácido nucleico aislada. En algunas modalidades, una célula huésped comprende el vector de expresión.

En algunas modalidades, un método de administración de un péptido citotóxico, apoptótico, de trans-desarrollo o formación de imágenes con el tejido adiposo comprende (a) acoplamiento a un péptido dirigido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 1-16, en donde el péptido dirigido se une selectivamente una célula adiposa. En algunas modalidades, los péptidos están compuestos de D- aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a través de un péptido enlazador y en algunas modalidades el enlazador comprende ácido aminohexanoico.

En algunas otras modalidades, un método de administración de un compuesto o agente a un tejido adiposo comprende: a) obtener un péptido que se une selectivamente al tejido adiposo, en donde el péptido es de menos de 100 aminoácidos de longitud e incluye un tejido adiposo motivo de direccionamiento que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 1- 16, en donde el péptido se acopla al compuesto o agente que uno desea para dirigir al tejido adiposo, y b) exponer el péptido a una población de células que se sospecha que contiene tejido adiposo. En algunas modalidades, el péptido comprende un enlazador. En algunas modalidades, el péptido se compone de D-aminoácidos . En algunas modalidades, tanto el péptido como el agente se componen de D-aminoácidos. En algunas modalidades, el acoplamiento se produce a través de un péptido enlazador y en algunas modalidades el enlazador comprende ácido aminohexanoico . En algunas modalidades, el agente comprende un péptido citotóxico o pro-apoptótico . En algunas modalidades, el agente comprende un agente de imagen. En algunas modalidades, (b) comprende, la exposición de un sujeto al péptido para tratar un trastorno adiposo asociado. En algunas modalidades, la población de células está en un sujeto humano. En algunas modalidades, la población de células es una sección delgada de un tejido. En otras modalidades, el método comprende además la detección de células madre adiposas en dicha población. En algunas modalidades, el trastorno asociado adiposo es un trastorno de la composición corporal, un trastorno del peso corporal, obesidad, lipodistrofia, diabetes, síndrome metabólico, fibrosis o cáncer.

En otras modalidades, es un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 17-24, y en donde dicho péptido se une al tejido pulmonar. En algunas modalidades, una composición de proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 17-24 y en algunas modalidades, la composición de la proteína se compone enteramente de D- aminoácidos. En otras modalidades, es la composición de proteínas en la que el péptido está acoplado a un agente de imagen. En algunas modalidades, la composición de proteínas en la que el péptido está acoplado a un agente citotóxico o pro-apoptótica . En algunas modalidades, el péptido se compone de D-aminoácidos . En algunas modalidades, el acoplamiento se produce a través de un péptido enlazador y en algunas modalidades el enlazador comprende ácido aminohexanoico .

En un ejemplo de composición de la composición de péptido citotóxico quimérico, todos los aminoácidos en ambos dominios se han construido de D-enantiómeros, y por lo tanto son resistentes a la proteólisis in vivo, lo que permite efectos a largo plazo del péptido después de la administración sistémica. El enlazador que conecta los dos dominios es ácido aminohexanoico (Ahx) : NH- (CH2) 5-CO, que tampoco está sujeto a la escisión por proteasas in vivo. Para el uso en los ejemplos siguientes, el péptido quimérico se produce comercialmente (por ejemplo, por Anaspec, Bachem, o Celtek) y se sintetiza por química de péptidos convencional ("síntesis de Merrifield") .

La actividad citotóxica de un péptido todo-D de WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NOS: 13-SEQ ID NO: 31) sintetizado por Celtek {Celtek Bioscience, Nashville, TN 37210) se demostró por primera vez in vitro utilizando tinción azul de tripano de ambos cultivos de ASC murinos primarios tratados y no tratados como se describe en los ejemplos a continuación. Usando Apo-Trace (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y el análisis de citometria de flujo, se demostró que el péptido pro-apoptótico especifico de WAT7 de hecho había inducido la apoptosis y la muerte celular en las células tratadas con ASC (véase el ejemplo 8 más adelante) . Para demostrar la actividad in vivo y la eficacia de péptidos todo-D de WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NOS: 13-SEQ ID NO: 31), 2 mg de péptido se inyectaron en ratones y la muerte celular se detectó en WAT a las 48 horas después del tratamiento con péptidos todo-D de WAT7-KLAKLAK2 (SEQ ID NOS: 13-SEQ ID NO: 31). No se identificó la muerte celular en el riñon o en la sangre periférica y sin BAT se consiguió incluso con dosis crecientes de péptidos (hasta 100 mg/kg de peso corporal) . Estos hallazgos demuestran claramente la eficacia de los dominios citotóxicos dirigidos a tejido adiposo usando el péptido dirigido identificado usando los métodos descritos y que han aumentado la estabilidad debido a una composición de aminoácidos todos D. En algunas modalidades dirigidas a péptidos selectivos para vasculatura angiogenética en el tejido adiposo se podrían utilizar para tratar los trastornos asociados a la obesidad, por ejemplo, para la reducción de peso o para prevenir el aumento de peso. Con la colocación de fracciones anti-angiogenéticas o tóxicas a un péptido adiposo dirigido, los vasos sanguíneos que suministran nuevo tejido de grasa podrían ser inhibidos selectivamente, previniendo el crecimiento de nuevos depósitos de grasa y potencialmente matar los depósitos de grasa existentes. Debido al tejido adiposo marrón más vascularizado, un enfoque de dirección basado en la vasculatura sería muy eficaz para la adminstración de reactivos terapéuticos a BAT para la activación de este tejido.

En ciertas modalidades, los agentes terapéuticos alternativos pueden estar unidos a un péptido dirigido o proteína de fusión para la administración selectiva de, por ejemplo, el tejido adiposo blanco. Los agentes o factores adecuados para su uso pueden incluir cualquier compuesto químico que induce la apoptosis, muerte celular, la estasis celular y/o anti-angiogénesis . La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso esencial para el desarrollo embrionario normal, el mantenimiento de la homeostasis en los tejidos adultos, y la supresión de la carcinogénesis . Ejemplos del acoplamiento y el uso de tales péptidos incluyen, pero no se limitan a las solicitudes de patente de Estados Unidos US20090104117, US20060094672, US20060239968, US20090221505, US20080176792 y US20080124277. Ejemplos no limitativos de agentes pro- apoptosis contemplados dentro del alcance de la descripción incluyen gramicidina, magainina, melitina, defensina, cecropina, (KLAKLAK)2 (SEQ ID NO. 31), (KLAKKLA) 2 (SEQ ID NO: 32), (KAAKKAA)2 (SEQ ID NO: 33) o (KLGKKLG) 3 (SEQ ID NO: 34) .

En ciertas modalidades se incluye la administración de péptidos dirigidos unidos a agentes anti- angiogenéticos, tales como angiotensina, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores de activador de plasminógeno, inhibidores de metaloproteinasa de tejido, interferones, interleucina 12, factor de plaquetas 4, IP-10, Gro-ß, trombospondina, 2- metoxiestradiol, proteina relacionada con proliferina, carboxiamidotriazole, CM 101, Marimastat, polisulfato de pentosano, angiopoyetina 2 {Regeneron) , interferón-alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteína, TNP470, endostatina, paclitaxel, accutina, angiostatina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor plaquetario 4 o minociclina .

En ciertas modalidades, se incluye la administración de péptidos dirigidos unidos a agentes citotóxicos. Tales agentes quimioterapéuticos citotóxicos incluyen, pero no limitados a, 5-fluorouracilo, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino (CDDP) , ciclofosfamida, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, agentes de unión del receptor de estrógeno, etopósido (VP 16) , inhibidores de farnesil-proteina transferasa, gemcitabina, ifosfamida, mecloretamina, melfalán, mitomicina, navelbina, nitrosourea, plicomicina, procarbazina, raloxifeno, tamoxifeno, taxol, temazolomida (una forma acuosa de DTIC) , transplatino, vinblastina y metotrexato, vincristina, o cualquier análogo o variante derivada de los anteriores. La mayoría de los agentes quimioterapéuticos se clasifican en las categorías de agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales , hormonas corticosteroides, inhibidores mitóticos, y nitrosoureas, agentes hormonales, productos naturales, agentes misceláneos, y cualquier variante análogo o derivado de los mismos.

Los productos naturales se refieren en general a los compuestos aislados originalmente a partir de una fuente natural, e identificados como que tienen una actividad farmacológica. Tales compuestos, análogos y derivados de los mismos pueden ser, aislados de una fuente natural, sintetizados químicamente o producidos de forma recombinante mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Los productos naturales incluyen categorías tales como inhibidores de la mitosis, antibióticos antitumorales, enzimas y modificadores de la respuesta biológica. Ejemplos, de tales productos naturales, incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de plantas y otros agentes naturales que pueden inhibir la síntesis de proteínas ya sea necesaria para la división celular o mitosis, tales como, pero no limitados a docetaxel, etopósido (VP 16) , tenipósido, paclitaxel, taxol, vinblastina, vincristina, y vinorelbina.

Los agentes quimioterapéuticos y los métodos de administración, dosis, etc., son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el "Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman "The Pharmacological Basis of Therapeutics" y "Remington' s Pharmaceutical Sciences" 15a. ed., pp 1035-1038 y 1570-1580, que se incorporan aquí como referencia en las partes pertinentes), y se puede combinar con las composiciones descritas en la luz de las revelaciones de este documento. Alguna variación en la dosificación ocurrirá necesariamente dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. También se describen en este documento ejemplos de agentes quimioterapéuticos específicos y regímenes de dosis. Por supuesto, todas estas dosificaciones y los agentes descritos en este documento son a modo de ejemplo no limitativo, y otras dosis o agentes pueden ser utilizados por un experto en la técnica para un paciente o aplicación específica. Cualquier dosificación entre estos puntos, o rangos derivables en los mismos, también se espera que sea incluida en ciertas modalidades.

En algunas modalidades, los péptidos que se dirigen a WAT se pueden utilizar para administrar compuestos o agentes que hacen que las células ASC se diferencien en BAT o para causar que WAT se conveirta en BAT. ASC puede diferenciarse en adipocitos marrones con agonistas de PPAR-gamma (Elabd et al. Human multipotent adipose-derived stem cells differentiate into funciontal brown adipocytes, Stem Cells 27, 2753-2760, 2009) . Por lo tanto, en algunas modalidades, los compuestos o agentes de la vía de PPAR gamma, tales como, pero no limitados a, los medicamentos de la clase de las tiazolidindionas, por ejemplo rosiglitazona, también pueden ser acoplados a los péptidos dirigidos descritos y utilizados para modulación de la adipogénesis con el fin para tratar o prevenir trastornos del peso corporal o composición corporal asociadas a adiposo, tales como la obesidad, lipodistrofia, diabetes, el síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer.

Los adipocitos blancos también se han convertido directamente en un fenotipo tipo BAT tanto en cultivo como in vivo (Cinti. Transdifferentation properties of adipocytes in the adipose organ. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297, 977 - 986, 2009). Esta conversión es impulsada por estímulos simpáticos del sistema nervioso, tales como la temperatura fría y cascadas de transducción de señales desencadenadas por la activación de los receptores adrenérgicos p3-en WAT. Por lo tanto, en algunas modalidades los compuestos o agentes de la activación adrenérgica pueden ser acoplados a los péptidos descritos para dirigir WAT a la conversión a BAT y por lo tanto utilizarse con el fin de tratar o prevenir trastornos del peso corporal o composición corporal asociados a adiposo, tales como la obesidad, lipodistrofia, la diabetes o síndrome metabólico, la fibrosis y el cáncer.

En algunas modalidades, los péptidos o proteínas dados a conocer pueden estar unidos a los agentes de formación de imágenes de uso para formación de imágenes y diagnóstico de diversos tipos de órganos, tejidos o células enfermos. El péptido o proteína se etiqueta o conjuga con un fluoróforo o radiotrazador para su uso como un agente de imagen. Muchos agentes de formación de imágenes apropiados son conocidos en la técnica, como son los métodos para unión a proteínas o péptidos utilizando complejos de metales de quelato, radioisótopos, marcadores fluorescentes, o enzimas cuya presencia puede ser detectada usando marcadores colorimétricos (tales como, pero no limitado a, ureasa, fosfatasa alcalina, (rábano picante) peroxidasa de hidrógeno y glucosa oxidasa) .

En algunas modalidades, el conjugado de imágenes también será doble marcado con un radioisótopo con el fin de combinar la formación de imágenes a través de enfoques nucleares y ser hecho en una estructura cíclica única y optimizado para la afinidad de unión y farmacocinética . Tales agentes pueden ser administrados por cualquier número de métodos conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica incluyendo, pero no limitado a, administración oral, inhalación, subcutánea (q) , intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.)/ o inyección intratecal, o como se describe a mayor detalle a continuación. En algunas modalidades, los métodos y composiciones descritos en este documento pueden usarse solos o en combinación con otras técnicas, para diagnosticar el acceso y monitoreo y terapia directa de los trastornos asociados a adiposas.

En algunas modalidades, los péptidos dirigidos pueden utilizarse para dirigir la administración de los conjuntos de moléculas inertes, tales como liposomas, microcápsulas, microparticulas, nanoparticulas, perlas magnéticas y microdispositivos, solos o en combinación, que contienen o junto con antibióticos que tienen tanto actividad antimicrobiana como citotóxica, incluyendo, pero no limitado a, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina) , plicamicina (mitramicina) e idarrubicina. Tipos adicionales de agentes citotóxicos que podrían ser administrados utilizando los péptidos dirigidos descritos incluyen, pero no se limitan a, complejos de coordinación de platino, antracenedionas, ureas sustituidas, derivados de hidrazina de metilo, amsacrina, L-asparagi-n sa, y tretinoína. Complejos de coordinación de platino incluyen compuestos tales como carboplatino y cisplatino (cis-DDP) . Un ejemplar es antracenodiona mitoxantron . Una urea sustituida ejemplar es hidroxiurea. Un derivado de hidrazina metil ejemplar es procarbazina (N- metilhidrazina, MIH) . Estos ejemplos no son limitantes, y se contempla que cualquier agente citotóxico, citostático o citocido conocido puede estar unido a los péptidos dirigidos revelados en la actualidad y administrarse a un tipo de órgano, tejido o célula específica. Las secuencias de aminoácidos de péptidos citotóxicos o híbridos dirigidos deseadas se pueden utilizar en diversas modalidades incluyendo las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, así como análogos y derivados de los mismos. De hecho, en algunas modalidades cualquiera de las secuencias de aminoácidos de péptidos deseadas codificadas por secuencias de nucleótidos particulares se pueden utilizar, como es el uso de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos que codifican la totalidad, o cualquier parte, de las secuencias de aminoácidos de péptidos deseados. La naturaleza degenerada del código genético es bien conocida, y, en consecuencia, cada una de la secuencia de nucleótidos que codifican el aminoácido péptido citotóxico o híbrido dirigida es genéricamente representante del bien conocido ácido nucleico codón "triplete", o en muchos casos codones, que puede codificar el aminoácido. Por lo tanto, como se contempla aquí, las secuencias de aminoácidos de péptidos citotóxicos o híbridos dirigidos descritas en este documento, cuando se toma junto con el código genético (véase, por ejemplo, "Molecular Cell Biology", Tabla 4-1 en la página 109 (Darnell et ah, eds., WH Freeman & Company, Nueva York, Nueva York, 1986) ) , son genéricamente representantes de todas las diversas permutaciones y combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos que pueden codificar tales secuencias de aminoácidos.

Tales secuencias de aminoácidos de péptidos híbridos, de formación de imágenes, citotóxicas funcionalmente equivalentes incluyen, pero no se limitan a, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de nucleótidos, pero que dan como resultado un cambio silencioso, produciendo de este modo un producto genético funcionalmente equivalente. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse con base en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo: los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisterna, tirosina, asparagina, y glutamina; amino ácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina, y amino ácidos cargados negativamente (básicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico .

Las sustituciones de aminoácidos, alternativamente, pueden ser hechas con base en el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y características de carga. Estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (- 3.5) ; aspartato (-3.5), asparagina (-3.5), lisina (-3.9) y arginina (-4.5). El uso del índice hidropático de los aminoácidos para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, J. Mol Biol. 157:105-132, 1982). Se sabe que en ciertos casos, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el índice hidropático, en ciertas modalidades se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, mientras que en otras modalidades se incluyen sustituciones de aminoácidos que están dentro de ±1, y en otras modalidades las sustituciones de aminoácidos dentro de ±0.5 están incluidas.

Las sustituciones de aminoácidos, alternativamente, pueden ser hechas sobre la base de hidrofilicidad, especialmente cuando la proteína biológicamente funcional o péptido creado de este modo está destinado al uso en modalidades inmunológicas . En ciertas modalidades, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, que se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3 ), valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (- 2.5) y triptófano (-3.4) . Al hacer los cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, en ciertas modalidades se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en ciertas modalidades los que están dentro de ± 1 están incluidos, y en ciertas modalidades aquellos dentro de ± 0.5 están incluidos. También se pueden identificar epitopos a partir de secuencias primarias de aminoácidos con base en la hidrofilicidad.

El uso de proteínas de fusión en donde se fusiona un polipéptido o péptido de longitud completa, o una versión truncada o mutante del péptido a una proteína no relacionada, polipéptido o péptido, y pueden ser diseñados con base en el péptido deseado de codificación de ácidos nucleicos y/o secuencias de aminoácidos descritas en este documento. Tales proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a: fusiones de IgFc, que estabilizan las proteínas o péptidos y prolongan la vida media in vivo; fusiones con cualquier secuencia de aminoácidos que permite que la proteína de fusión sea anclada a la membrana celular; o fusiones a una enzima, proteína fluorescente, o proteína luminiscente que proporciona una función de marcador.

En algunas modalidades, el péptido dirigido puede estar unido a un sistema de administración basado en complejos de liposomas o lipidos. Ejemplos de tales tecnologías se describen en "Liposomes : A Practical Approach" (Torchilin y Weissig, eds . , Oxford Uníversity Press, Oxford, Reino Unido, 2003.), y en las patentes Estadounidenses Nos. 4,594,595, 5,459,127, 5,948,767 y 6, 110, 490.

En ciertas modalidades, una proteína de fusión puede purificarse fácilmente mediante la utilización de un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína de fusión que se expresa. En modalidades alternativas, una proteína de fusión se puede purificar por subclonación de secuencia de ácido nucleico que codifica péptido en un plásmido de recombinación, o una porción del mismo, fusionado traslacionalmente a una etiqueta amino-terminal (N-terminal) o carboxi-terminal (C-terminal) que consiste en seis residuos de histidina (una "etiqueta de His"; .... véase, por ejemplo, Janknecht et al, Proc Nati Acad Sci USA 88:8972-8976, 1991). Extractos de células que expresan tal construcción se cargan en columnas de agarosa Ni2+ ácido nitriloacético, y las proteínas marcadas con histidina se eluyen selectivamente con tampones que contienen imidazol. Si bien las secuencias de aminoácidos de péptidos deseados descritos pueden ser sintetizados químicamente (véase, por ejemplo, "Proteins: Structures and Molecular Principies" (Creighton, ed, WH Freeman & Company, Nueva York, Nueva York, 1984)), las grandes secuencias de polipéptidos pueden ventajosamente ser producidas por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica para la expresión de los ácidos nucleicos que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido deseado. Tales métodos se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen péptidos de codificación de secuencias de nucleótidos y las señales de control transcripcional y traslacional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo (ver, por ejemplo, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", supra, y "Current Protocols in Molecular Biology", supra) . Alternativamente, el ARN y/o ADN que codifica el péptido deseado que codifica secuencias de nucleótidos pueden sintetizarse químicamente utilizando, por ejemplo, sintetizadores (véase, por ejemplo, " Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (Gait, ed., IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984)).

Una va'riedad de sistemas de vector de expresión de huésped pueden ser utilizados para expresar péptidos de codificación de secuencias de nucleótidos. Cuando el péptido o polipéptido deseado es soluble, o un derivado soluble, el péptido o polipéptido se puede recuperar a partir del cultivo de células huésped, es decir, a partir de la célula huésped en los casos en que no se secreta el péptido o polipéptido, y de los medios de cultivo en los casos en que el péptido o polipéptido se secreta por la célula huésped. Sin embargo, los sistemas de expresión adecuados también abarcan las células huésped manipuladas que expresan los equivalentes de polipéptidos , péptidos o funcionales deseados anclados en la membrana celular. La purificación o enriquecimiento del péptido deseado a partir de tales sistemas de expresión se puede lograr usando detergentes adecuados y micelas de lipidos, y métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por otra parte, tales células huésped de diseño apropiado se pueden usar en situaciones deseables no sólo para conservar las características estructurales y funcionales del péptido, sino para evaluar la actividad biológica, por ejemplo, en ciertos ensayos de proyección de fármacos.

En ciertas aplicaciones, se desean sistemas de expresión transitoria. Sin embargo, para la producción a largo plazo de proteínas o péptidos recombinantes de alto rendimiento, se prefiere generalmente la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable la proteína deseada, polipéptido, péptido, o proteina de fusión pueden ser diseñadas. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, secuencias potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN extraño, las células diseñadas se dejan crecer durante aproximadamente 1 -2 días en un medio enriquecido, y luego cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos, que a su vez se pueden clonar y expandir en lineas celulares. Este método puede usarse ventajosamente para diseñar lineas celulares que expresan los productos genéticos deseados o partes de los mismos. Tales lineas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en la proyección y evaluación de compuestos que afectan a la actividad endógena de la proteina, polipéptido o péptido deseado.

Un número de sistemas de selección puede ser utilizado, incluyendo, pero no limitado a, genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223-232, 1977), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 48:2026-2034, 1962), y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817-823, 1980) , que se pueden emplear en células tk~, hgprt" o aprt", respectivamente, la resistencia al anti-metabolito también se puede utilizar como la base de selección para los siguientes genes: dihidrofolato reductasa (DHFR) , que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 77:3567 - 3570, 1980, y O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 78: 1527-1531, 1981); guanina fosforribosil transferasa (gpt) , que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 78:2072-2076, 1981); neomicina fosfotransferasa (neo) , que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colbere-Garapin et al, J. Mol. Biol. 150:1-14, 1981 ), y la higromicina B fosfotransferasa (HPT) , que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147-156, 1984).

Los sistemas de expresión/células huésped que pueden ser usados para el propósito de proporcionar composiciones que se utilizarán en los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con un ADN recombinante de bacteriófago, plásmido de ADN, o vector de expresión de ADN cósmido que contiene un péptido deseado que codifica la secuencia de nucleótidos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) transformada con un vector de expresión de levadura recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado; sistemas de células de insecto infectadas con un virus de vector de expresión recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado; sistemas de células vegetales infectadas con un vector de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con un vector de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo,, plásmido Ti), que contiene una secuencia de nucleótido que codifica el péptido deseado, o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan un constructo de expresión recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado y un promotor derivado del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus, el promotor de virus vaccinia 7.5K).

En sistemas bacterianos, un número de diferentes vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso previsto para el producto genético deseado expresado. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de una proteína tal se ha de producir, tal como para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido deseado, o para la producción de anticuerpos a la proteina, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteina de fusión que se purifican fácilmente pueden ser deseables. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a: la expresión de E. coli pUR278 (Ruther y Muller-Hill, EMBO J. 2: 1791-1794, 1983), en donde una secuencia que codifica el péptido deseado puede ser ligada individualmente al vector en marco con la región codificante de lacZ de modo que se produzca una proteina de fusión; vectores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-31 10, 1985, y Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264:5505-5509, 1989), y similares. Vectores pGEX ( GE Healthcare, Piscataway, NJ) también se pueden usar para expresar una fracción peptidica deseada en forma de una proteina de fusión con glutatión S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células Usadas por adsorción a perlas de glutatión-agarosa, seguida de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir trombina o sitios de escisión de factor Xa proteasa de manera que el producto del gen que codifica el péptido deseado clonado puede ser liberado de la fracción GST. Debido a que, en algunas modalidades, se prefieren los D-aminoácidos , métodos tales como los descritos en, entre otros, Park, et al., {Production of D-amino acid using whole cells of recombinant Escherichia coli with separately and coexpressed D-hydantoinase and N-carbamoylase. Biotechnol Prog. Jul-Aug; 16 (4) : 564-70, 2000) .

En un sistema de insecto ejemplar, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa calífornica (AcNPV) se utiliza como un vector para expresar una secuencia que codifica el péptido deseado. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda . Una secuencia de codificación de péptido deseada puede clonarse individualmente en una región no esencial (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus, y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina) . La inserción exitosa de una secuencia de codificación de péptido deseado resultará en la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carecen de la capa proteica codificada por el gen de la polihedrina) . Los virus recombinantes se utilizan después para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el polinucleótido insertado (véase, por ejemplo, Smith et al, J. Virol. 46:584-593, 1983, y la patente Estadounidense No. 4,215, 051) .

En las células huésped de mamífero, puede utilizarse un número de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido deseado puede ser ligada a una transcripción de adenovirus/complejo de control de la traslación, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Esta secuencia quimérica puede ser insertada a continuación en el genoma del adenovirus in vitro o por recombinación in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región El o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar productos peptídicos deseados en los huéspedes infectados (véase, por ejemplo, Logan y Shenk, Proc. Nati . Acad. Sci. U.S. A. 81:3655-3659, 1984). Las señales de iniciación específicas también pueden ser necesarias para la traslación eficiente de los péptidos insertados deseados que codifican secuencias de nucleótidos. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En algunos casos se pueden proporcionar señales de control de traslación exógenas, incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación de péptido deseada para asegurar la traslación del inserto completo. Estas señales de control de traslación exógenas y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores- -de la transcripción, etc. (véase, por ejemplo, Nevins, CRC Crít. Rev. Biochem. 19:307-322, 1986).

En la levadura, se puede utilizar un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revisión, véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", supra, cap. 13, Bitter et al., Meth. Enzy ol. 153:516-544, 1987, "DZVA Cloning", vol. II, cap. 3 (Glover, ed., IRL Press, Washington, DC, 1986.); Bitter, Meth. Enzymol. 152:673-684, 1987, "ffie Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance" (Strathern et al., eds . , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1981) , y "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression" (Strathern et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982.).

En las plantas, una variedad de diferentes vectores de expresión de plantas se puede utilizar, y la expresión de una secuencia que codifica el péptido deseado puede ser accionada por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores virales tales como promotores de ARN 35S o 19S del CaMV (Brisson et al., Nature 310:51 1-514, 1984), o el promotor de proteina de cubierta de TMV (Takamatsu et al, EMBO J. 6:3071-31, 1987). Como alternativa, promotores de plantas tales como el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1679, 1984, y Broglie et al., Science 224:838-843, 1984), o promotores de choque térmico, por ejemplo, soya hspl7.5-E o hspl7.3-B (Gurley et al., Mol. Cell. Biol . 6:559-565, 1986) pueden ser utilizados. Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales usando, por ejemplo, plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección o electroporación . Para revisiones de tales técnicas, véase, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, en "Methods in Plant Molecular Blology", Sección VIII (Schuler y Zielinski, eds . , Academic Press, Inc., Nueva York, Nueva York, 1988), y "Plant Molecular Biology", 2a. ed., cap. 7-9 (Grierson y Covey, eds., Blackie & Son, Ltd., Glasgow, Escocia, Reino Unido, 1988).

Además, se puede escoger una cepa de célula huésped que module la expresión de la secuencia de codificación de péptido deseado insertada, o modifique y procese la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido deseado en una forma deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos pueden afectar a ciertas funciones de la proteína. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traslacional y la modificación de proteínas y péptidos. Líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados se pueden elegir para asegurar la modificación y el procesamiento correcto o deseado de la proteína deseada, polipéptido o péptido expresado. Para este fin, pueden utilizarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento deseado de la transcripción, glicosilación y/o fosforilación primaria y de la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido deseado. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, ovario de hámster chino (CHO) , VERO, riñon de hámster neonato (BHK) , células HeLa, de riñon de mono (COS) , MDCK, 293, 3T3, WI38, carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y células U937.

En ciertas modalidades, las composiciones actualmente descritas se utilizan en el tratamiento de trastornos del peso corporal o composición corporal asociadas a adiposo, tales como obesidad, lipodistrofia, diabetes o síndrome metabólico, fibrosis y cáncer.

En ciertas modalidades, las composiciones aquí descritas se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos o agentes adicionales ("agentes activos adicionales") para el tratamiento, la gestión, y/o la prevención de trastornos del peso corporal o composición corporal asociadas a adiposo, tales como obesidad, lipodistrofia, diabetes o síndrome metabólico, fibrosis y cáncer. Tales terapias se pueden administrar a un paciente en dosis terapéuticamente eficaces para tratar o mejorar el trastorno del peso corporal o composición corporal asociadas a adiposo, tales como obesidad, lipodistrofia, diabetes o síndrome metabólico, fibrosis y cáncer. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para dar lugar a cualquier retraso en el inicio, mejora o demora de los síntomas de la enfermedad.

En algunas modalidades, son péptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, y en donde dicho péptido se une a las células estromales in vivo. En algunas modalidades, las células estromales se encuentran en tejidos adiposos, lesiones fibróticas o tumores.

En algunas modalidades son composiciones de proteínas que comprenden un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se componen enteramente de D- aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se acoplan a un agente de imagen. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas están acoplados a un agente citotóxico o pro-apoptótico . En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se acoplan a un agente que induce un tejido adiposo blanco a convertirse en un tejido adiposo marrón. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se acoplan a un agente que activa los receptores adrenérgicos b3 en el tejido adiposo blanco. En algunas modalidades, los agentes son péptidos compuestos de D-aminoácidos . En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a través de un enlazador y, en algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico .

En otras modalidades, son péptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y en donde dicho péptido se une a las células estromales in vivo. En algunas modalidades, las células estromales se encuentran en tejidos pulmonares, lesiones fibróticas o tumores.

En algunas modalidades son composiciones de proteínas que comprenden un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se componen enteramente de D- aminoácidos . En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas se acoplan a un agente de imagen. En algunas modalidades, los péptidos o composiciones de proteínas están acoplados a un agente citotóxico o pro-apoptótico . En algunas modalidades, los agentes son péptidos compuestos de D-aminoácidos . En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a través de un enlazador y, en algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico .

En algunas modalidades, las composiciones de proteínas se componen enteramente de D-aminoácidos y comprenden un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15 o SEQ ID NO: 16, y en donde la composición se une a las células estromales situadas en, por ejemplo, tejido adiposo, tejido fibrótico o tejido tumoral in vivo. En algunas modalidades, el péptido está acoplado a un agente de imagen, un agente citotóxico o pro-apoptótico . En algunas modalidades, el péptido está acoplado a un agente que induce un tejido adiposo blanco a convertirse en un tejido adiposo marrón, tales como, pero no limitado a, un agente que activa los receptores adrenérgicos b3 en el tejido adiposo blanco.

En algunas modalidades se aislan las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15 o SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, son vectores de expresión que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores de expresión.

En algunas modalidades son los métodos de la entrega de un citotóxico, pro-apoptosis, de trans- desarrollo o péptido de imágenes para tejido adiposo, dichos métodos comprenden: (a) acoplar un péptido citotóxico, pro-apoptótico, de trans-desarrollo o de formación de imágenes a un péptido dirigido que tiene un secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, la SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15 o SEQ ID NO. 16, y (b) unir selectivamente el péptido dirigido acoplado a una célula adiposa. En algunas modalidades, los péptidos están compuestos de D- aminoácidos. En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a través de un enlazador y, en algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico .

En otras modalidades, son métodos de administración de un compuesto o agente a un tejido adiposo que comprende: exponer un compuesto o agente de péptido acoplado a una población de células sospechosas de contener el tejido adiposo, en donde dicho péptido compuesto o agente de acoplamiento comprende el compuesto o agente acoplado a un péptido que se une selectivamente al tejido adiposo, en donde el péptido es de menos de 100 aminoácidos de longitud e incluye un tejido adiposo dirigido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, los péptidos están compuestos de D-aminoácidos . En algunas modalidades, los péptidos se acoplan a través de un enlazador y, en algunas modalidades, el enlazador comprende ácido aminohexanoico . En algunas modalidades, tanto el péptido como el agente se componen de D-aminoácidos . En algunas modalidades, el agente comprende un péptido citotóxico o pro-apoptótico. En algunas modalidades, el péptido se compone de D- aminoácidos . En algunas modalidades, el agente comprende un agente de formación de imágenes. En algunas modalidades la exposición comprende, la exposición de un sujeto al péptido que puede ser acoplado a un agente, para el tratamiento de un trastorno asociado con la adiposidad, tales como, pero no limitado a, obesidad, fibrosis o cáncer. En algunas modalidades, la población de células es de o está en un sujeto humano. En algunas modalidades, la población de células es de o está en un sujeto veterinario.

En algunas modalidades, las células están en una población de células ex vivo como en una sección delgada de un tejido. En algunas modalidades son métodos de detección de las células estromales de tejido adiposo en una población heterogénea de células en base a dicha unión selectiva del péptido compuesto o agente de acoplamiento a dicho tejido adiposo. En algunas modalidades son los métodos de detección de células estromales adiposas como la identificación de un paciente que se beneficiaría del tratamiento con un péptido dirigido, el péptido está acoplado a un compuesto o agente, tal como, pero no limitado a un agente citotóxico o pro-apoptótico . Ejemplos de pacientes incluyen a los pacientes humanos o veterinarios que sufren de un trastorno de la composición corporal, un trastorno del peso corporal, obesidad, lipodistrofia, diabetes, síndrome metabólico, fibrosis o cáncer .

Se proporcionan los detalles específicos en lo que respecta al aislamiento y caracterización de péptido WA (SEQ ID NOS: 13 y 14), y también proporcionan péptidos dirigidos a WAT (SEQ ID NOS: 1-16) y péptidos dirigidos al pulmón (SEQ ID NOS: 17-24) adicionales que demuestran la aplicabilidad genérica de los métodos descritos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales composiciones se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) . La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, expresado como la relación LD50/ED50. Se prefieren las composiciones que exhiben grandes índices terapéuticos. Los compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos pueden ser utilizados en ciertas modalidades, sin embargo, la atención debe por lo general ser tomada para diseñar sistemas de administración que se dirigen a tales composiciones preferentemente al sitio de tejido afectado, con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, con ello, reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones para su uso en seres humanos. Las dosis de tales composiciones se encuentran preferiblemente dentro de un rango de concentraciones que incluye la circulación de ED5o con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier composición, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración de plasma circulante que incluye la IC5o (es decir, la concentración de la composición de ensayo que logra una inhibición media máxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.

Cuando se contempla el tratamiento terapéutico de trastornos del peso corporal o composición corporal asociados a adiposos, tales como obesidad, lipodistrofia, diabetes o síndrome metabólico, fibrosis y cáncer, la dosis adecuada también se puede determinar usando estudios en animales para determinar la dosis máxima tolerable, o BAT, de un agente bioactivo por kilogramo de peso del sujeto de prueba. En general, al menos una especie animal en prueba es el mamífero. Los expertos en la técnica extrapolan regularmente la dosis para su eficacia y evitar la toxicidad para otras especies, incluyendo humanos. Antes de que se lleven a cabo estudios en seres humanos de eficacia, los estudios clínicos de Fase I ayudan a establecer las dosis seguras.

Además, el agente bioactivo puede estar acoplado o complejado con una variedad de composiciones o estructuras bien establecidas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad del agente bioactivo, o de otra manera mejoran sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, aumento de la semivida in vivo, reducir la toxicidad, etc.) Dichos agentes terapéuticos pueden ser administrados por cualquier número de métodos conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica incluyendo, pero no limitados a, inhalación, subcutánea (q) , intravenosa (I.V.), intraperitoneal (I.P.), intramuscular (I.M.), o inyección intratecal, o por vía tópica aplicada (transdermal, ungüentos, cremas, gotas para los ojos, y similares) , como se describe a mayor detalle a continuación.

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con las composiciones actualmente descritas se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender materiales de formulación para modificar, mantener, o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a: aminoácidos (por ejemplo, glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina) , antimicrobianos, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, sulfito de sodio y sulfito de sodio-hidrógeno) ; tampones (por ejemplo, borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos y otros ácidos orgánicos); agentes de carga (por ejemplo, manitol y glicina) , agentes quelantes (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) , agentes complejantes (por ejemplo, cafeína, polivinilpirrolidona, beta- ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina) , rellenadors ; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, mañosa y dextrinas), proteínas (por ejemplo, albúmina de suero, gelatina e inmunoglobulinas ) ; agentes colorantes, aromatizantes, y diluyentes, agentes emulsionantes, polímeros hidrófilos (por ejemplo, polivinilpirrolidona) , péptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (por ejemplo, sodio) , conservadores (por ejemplo, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicilico, timerosal, alcohol fenetilo, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno) ; solventes (por ejemplo, glicerina, propilenglicol y polietilenglicol ) , alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol y sorbitol) ; agentes de suspensión, surfactanteso agentes humectantes (por por ejemplo, plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80) , tritón, trometamina, lecitina, colesterol, y tiloxapal) ; agentes potenciadores de la estabilidad (por ejemplo, sacarosa y sorbitol) , agentes potenciadores de la tonicidad ( por ejemplo, haluros de metales alcalinos (por ejemplo, cloruro de sodio o potasio), manitol y sorbitol)), vehículos de administración, diluyentes, excipientes, y adyuvantes farmacéuticos ("Remington Pharmaceutical Sciences", 18a. Ed. (Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990) ) .

Además, los péptidos terapéuticos descritos se pueden conectar a un vehículo que extiende la vida media. Ciertos vehículos que extienden la vida media de los ejemplares son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, dominio Fe, glicol de polietileno, y dextrano (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente PCT No. WO 99/25044) .

Estos agentes se pueden formular para su administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en la forma unitaria de dosificación, por ejemplo, en ampolletas o en envases multidosis, con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Los agentes también se pueden formular en forma de composiciones para administración rectal tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los agentes se pueden formular también como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo via subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por ejemplo, los agentes se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo una emulsión en un aceite aceptable) , resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, una sal escasamente soluble. Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo metal o plástico, tal como un envase blister. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado por instrucciones para la administración.

Las composiciones activas se pueden administrar por medios de liberación controlada o por dispositivos de administración que son bien conocidos por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las patentes de Estadounidenses Nos. 3,845,770, 3,916,899, 3,536,809, 3,598,123, 4,008,719, 5,674,533, 5,059,595, 5,591,767, 5,120,548, 5,073,543, 5,639,476, 5,354,556, y 5,733,566. Tales formas de dosificación se pueden usar para proporcionar liberación lenta o controlada de uno o más ingredientes activos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, microparticulas , liposomas, microesferas , o una combinación de los mismos, para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las matrices de liberación sostenida ejemplares incluyen, pero no se limitan a, poliésteres, hidrogeles, polilactidas (véase, por ejemplo, la patente Estadounidense No. 3,773,919 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 058481), copolimeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L- glutamato (véase, por ejemplo, Sidman et al, Biopolymers 22:547-556, 1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (véase, por ejemplo, Langer et al, J. Biomed Mater. Res. 15:167-277, 1981, y Langer, Che tech 12:98-105, 1982), etileno y acetato de vinilo (Langer et al., supra) , y ácido poli-D (-)-3-hidroxibutirico (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 133 988). Las composiciones de liberación sostenida pueden incluir liposomas, que se pueden preparar por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Eppstein et al, Proc. Nati. Acad. Sci.

U.S. A. 82:3688-3692, 1985, y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. EP 036676, EP 088046, y EP 143949) . Las formulaciones de liberación controlada adecuadas, conocidas por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica, incluyendo los descritos en este documento, se pueden seleccionar fácilmente para su uso con las composiciones aquí descritas. Ciertas modalidades abarcan formas individuales de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral, tales como, pero no limitado a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gelatina, y comprimidos oblongos que están adaptados para la liberación controlada.

Los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen un objetivo común de mejorar la terapia sobre la alcanzada por los no controlados. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada diseñada óptimamente en el tratamiento médico se caracteriza por un mínimo de sustancia de fármaco que se emplea para curar o controlar la condición en una cantidad mínima de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen actividad prolongada del fármaco, frecuencia de dosificación reducida, y el aumento de la conformidad del paciente. Además, las formulaciones de liberación controlada se pueden utilizar para afectar el tiempo de inicio de la acción u otras características, tales como los niveles en sangre del fármaco, y pudiendo así afectar la aparición de efectos laterales (por ejemplo, adversos) .

La mayoría de las formulaciones de liberación controlada están diseñadas para liberar inicialmente una cantidad de ingrediente activo que produce rápidamente el efecto terapéutico deseado, y liberar gradualmente y continuamente otras cantidades de ingrediente activo para mantener este nivel de efecto terapéutico o profiláctico durante un periodo prolongado de tiempo. Con el fin de mantener este nivel relativamente constante de ingrediente activo en el cuerpo, el fármaco debe ser liberado de la forma de dosificación a una velocidad que reemplace la cantidad de ingrediente activo que se metaboliza y excreta del cuerpo. La liberación controlada de un ingrediente activo puede ser estimulada por varias condiciones incluyendo, pero no limitado a, pH, temperatura, enzimas, agua, u otras condiciones o composiciones fisiológicas.

En algunos casos, los ingredientes activos de los métodos y composiciones descritos son preferiblemente no administrados a un paciente al mismo tiempo o por la misma vía de administración. Por lo tanto, en algunas modalidades son juegos que, utilizados por el médico, pueden simplificar la administración de cantidades apropiadas de ingredientes activos a un paciente.

Un juego típico comprende una única forma de dosificación unitaria de uno o más de los agentes terapéuticos descritos, solos o en combinación con una única forma de dosificación unitaria de otro agente que puede ser utilizado en combinación con las composiciones descritas. Los juegos descritos pueden comprender, además, dispositivos que se utilizan para administrar los ingredientes activos. Ejemplos de tales dispositivos incluyen, pero no se limitan a, jeringas, bolsas de goteo, parches, e inhaladores.

Los juegos descritos pueden comprender, además, vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados para administrar uno o más ingredientes activos. Por ejemplo, si un ingrediente activo se proporciona en una forma sólida que debe ser reconstituida para su administración parenteral, el juego puede comprender un recipiente sellado de un vehículo adecuado en el que el ingrediente activo se puede disolver para formar una solución libre de partículas que es estéril, adecuada para su administración parenteral. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a: agua para Inyección USP, vehículos acuosos tales como, pero no limitado a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio inyectable, y la inyección de lactato de Ringer; agua miscible en vehículos tales como, pero no limitados a, alcohol etílico, polietilenglicol, y glicol de polipropileno, y vehículos no acuosos tales como, pero no limitado a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, oleato de etilo, isopropilode miristato y benzoato de bencilo. Sin embargo, en modalidades específicas, las formulaciones descritas no contienen alcoholes u otros co-solventes , aceites o proteínas .

La siguiente sección proporciona más detalles sobre ejemplos de varias modalidades. Se debe apreciar por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas y/o composiciones que el inventor descubrió que funcionan bien. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la divulgación, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen y aún así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Estos ejemplos son ilustraciones de los métodos y sistemas descritos en este documento y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los detalles específicos se proporcionan con respecto al aislamiento y caracterización de péptido de WAT7 (SEQ ID NOS: 13 y 14), y también se proporcionan péptidos dirigidos a WAT (SEQ ID NOS: 1-16) y al pulmón (SEQ ID NOS: 17 -24) adicionales que demuestran la aplicabilidad genérica de los métodos descritos.

EJEMPLOS Aislamiento y cultivo de células: ratones hembra C57BL/6 fueron utilizados para la proyección de la biblioteca de péptidos . Para excluir variables especificas de cepa/género, se utilizaron ratones hembra CDL para la validación del péptido autoguia y aislamientos celulares subsecuentes. Los ratones fueron anestesiados con Avertin para todos los estudios.

Las subpoblaciones de células de WAT de mezcla de WAT subcutánea e intraperitoneal y las células de los órganos de control se separaron como se describe previamente en la solicitud de patente Estadounidense No. 20090104117 y, por ejemplo, en Traktuev, et. al., 2008 , ij id y Zhang, et al., 2009, ijbid. Alimentos picados se digirieron en dispasa (BD Biosciences) /colagenasa tipo I (Worthington Biochemical) . Los adipocitos se separaron como una fracción de células flotantes después de 200 g centrifugación. La fracción de SVF, y las células de los órganos de control se filtraron a través de de malla Nitex de 70 µ??. Las células aisladas se separaron en poblaciones de células individuales utilizando un FACSAria {BD Biosciences) con los siguientes clones de IgG: PE-conjugado anti-CD34 EC14.7, APC-conjugado anti-CD31 MEC 13.3, y APC- Cy7-CD45 conjugado 30-F11 {BD Biosciences) . Cuando se indicó, las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) en el plástico sin recubrir. Después de la unión a plástico durante la noche, los cultivos de células estromales se lavaron de la contaminación de las poblaciones celulares como se describe (Traktuev et. al., 2008, ibid, Zhang et al., 2009, ibid) . La pureza de las poblaciones de células cultivadas se confirmó por citometria de flujo con CD31 y CD45 utilizando anticuerpos LSR II y el software FACSDiva {BD Biosciences) .

Biblioteca de proyección de fagos: bibliotecas de péptidos aleatorias basadas en el vector derivado de MI 3 ÍUSE5 que despliega insertos CX7C, CX8C, y CX9C en la proteina Pili se mezclaron (1: 1:1) con el combinado 1010 TU de la biblioteca mixta para la proyección efectuada basándose en los biopaneos síncronos in vivo tras la inyección en la vena de la cola (véase, por ejemplo, US20050074747 y Arap, et al., Nat. Med. 8:121-127, 2002; Kolonin, et al., FASEB J. 20: 979 -981, 2006) .

Para el experimento de autoguía competitiva, 5xl010 TU para cada uno de los 11 clones de fagos seleccionados se mezclaron y el combinado 5.5xl010 TU se inyectó. Para la validación de los clones individuales, 1,1010 TU por cada clon de fagos se inyectaron. Después de 1 hora de circulación y de perfusión del corazón con 10 mi de tampón de fosfato salino (PBS), se recolectaron WAT, tibia/fémures, músculo esquelético asociado al hueso, y pulmones. La médula ósea se aisló mediante el lavado de tibia/fémures. Las células hematopoyéticas y endoteliales se agotaron a partir de suspensiones celulares de cada órgano con Dynabeads (Invitrogen) recubiertas con anticuerpos anti-TER119, anti-CD31 y anti-CD45 ( BD Biosciences) , después de lo cual las células restantes fueron procesadas por FACS para purificar células CD34 + CD31-CD45. Los fagos unidos se recuperaron mediante la infección de E. coli K91, por el conteo de unidad de transformación de fago (TU) , y se procesaron para la secuenciación del ADN codificante del péptido como se describe en Arap, et al. 2002, ibid y Kolonin, et al, 2006, ibid. Para la identificación de peptidicos dirigidos conservados, se utilizó software ClustalW2.

Análisis de tejido de ratón y de célula por inmunofluorescencia: Los péptidos sintetizados químicamente se ciclaron a través de sus cisteínas N-y C-terminales, se purificaron a al menos 95% de pureza {Genemed) , se biotinilaron y se inyectaron (500 g) a través de vena de la cola y se dejaron circular durante 1 hora. Para todos los análisis de tejidos, los órganos fueron recuperados de ratones anestesiados después de la perfusión del corazón con 10 mi de PBS. La inmunolocalización de antigenos se realizó en secciones de parafina de tejidos fijados con formalina como se ha descrito previamente (Arap et al., 2002, ibid y Kolonin et al., 2006, ibid) sobre la recuperación de antigenos basado en EDTA (DAKO) , lavados con 0.3% de Tritón X -100 y bloqueo en el Bloque de Proteina Libre de Suero (DAKO). Estreptavidina-Cy3 {Zymed, 1:20) o anticuerpos primarios (4°C, 12-16 h) y anticuerpos secundarios (RT, 1 hr) se aplicaron en PBS/0.05% de Tween- 20. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos de anti-fagos de conejo de Sigma (1:500), de cabra anti-ratón CD31 de Santa Cruz (1:150), de rata antiratón CD45 de eBiosciences (1: 150), anticuerpos de PDGFR de conejo anti-ratón de Epitomics (1:150), y anticuerpos de cabra anti-ratón DCN de R&D Systems (1:200). Alexa488 secundaria de burro conjugado con IgG conjugado con Cy3 fueron de Jackson ImmunoResearch. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 o TOPR03 ( Invitrogen) . Las células cultivadas en cámara de diapositivas (Lab-Tek II; Nalge Nunc International) fueron sometidas a inmunofluorescencia con anticuerpos anti-GFP (1:100) de Genetex. Las secciones de tejido o preparaciones de células inmunoteñidas se montaron en Vectashield (Vector Laboratories). Las imágenes de fluorescencia fueron adquiridas con un microscopio de fluorescencia invertido Olympus lX70/software Magnafire {Olympus) . Las imágenes confocales fueron adquiridas con un microscopio Leica TCS SP5/software LAS AF.

Aislamiento de proteínas por cromatografía de afinidad: Se rompieron las células en PBS que contenia 0.2 mM de mezcla de fluoruro de fenilmetanosulfonilo/Roche PI mediante el uso de homogeneizador Dounce; la centrifugación (15,000 g durante 30 min a 4°C) se utilizó para separar las proteínas solubles del sedimento de membrana. La solubilización de proteínas de la membrana celular se realizó como se ha descrito previamente en la solicitud de patente Estadounidense 20090104117 y Nie, et al., 2008 (Stem Cells 26:2735-2745). Brevemente, el sedimento de membrana se incubó en PBS que contenía 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 50 mM de n-octil-beta-D-glucopiranósido, 0.2 mM de mezcla de fluoruro de fenilmetanosulfonilo/Roche PI (tampón de columna) durante la noche a 4°C y la centrifugación (15,000 g durante 30 min a 4°C) se realizó para eliminar los restos insolubles. Para la purificación del receptor de WAT7 , se acoplaron 5 mg de un péptido ciclado cisteínico {Genemed Synthesis) (a través de C-terminal) en 0.25 mi de EDC Sepharose (Pierce) , y la columna se equilibró con tampón de columna que contiene 1% de Tritón X-100. El péptido acoplado a resina se incubó con 40 mg de extracto de membrana, se lavó extensamente con tampón de columna por flujo de gravedad. La elución (fracciones de 0.5 mi) se llevó a cabo con 1.0 mM de péptidos, seguido por 0.1 M de glicina (pH 2.8). Para el paneo en eluatos, 20 µ? de 105 TU de clones de fagos indicadas se incubaron durante la noche a 4°C con 2 mi de cada fracción desaladas utilizando un filtro Microcon (Millipore) inmovilizado en plástico. Los fagos no unidos se lavaron extensivamente con PBS, y después el fago unido se cuantificó mediante la infección de E. coli K91 acoplado directamente en la placa. La fracción de fago de unión de WAT7 restante se sometió a dodecil sulfato de sodio (SDS)-PAGE; la identificación de proteínas por espectrometría de masas en la banda específica de WAT7 fue realizada por ProtTech. Para la purificación de ADCN, 20 mg de anticuerpos anti-DCN se inmovilizaron en perlas de proteína A/G {Pierce) y se incubaron con 40 mg de extracto de membrana. Tras el lavado con tampón de unión de proteína A/G {Pierce), la banda de 40 kDa identificada por SDS-PAGE se sometió a microsecuenciación N-terminal en las instalaciones proteómicas del Baylor College of Medicine. Para la purificación de la resistina, antisuero pre-y post- inmune de conejo se levantó contra WAT7 ciclado cisteínico acoplado con KLH ciclado {Genemed Synthesis) . Para validar la especificidad del anticuerpo, péptidos etiquetados con glutatión-S-transferasa (GST) fueron producidos por clonación de fragmentos que codifican los aminoácidos CX7C en marco con la etiqueta de GST en vector pGEX4T-l y utilizando el juego de GST Bind {Novagen) . El péptido GST conjugado KGGRAKD (SEQ ID NOS: 25 y 26) y prohibitina, así como los péptido mPep WLGEWLG (SEQ ID NO. 35 y 36) se han descrito anteriormente Nie, et al., 2008, ibid.

Las proteínas de unión a los anticuerpos específicos de WAT7 fueron sacadas de extracto WAT SVF de ratón total como se señaló anteriormente, resueltas por SDS-PAGE e identificadas por espectrometría de masas de ProtTech. Para el aislamiento de proteínas ASC biotiniladas , se utilizó estreptavidina acoplada a Dynabeads M270 ( Invitrogen) . Para el análisis de proteínas de la membrana de plasma, una fracción de membrana enriquecida con plasma se preparó usando el juego de aislamiento Qproteome PM (Qiagen) . La superficie celular de biotinilación de proteínas se llevó a cabo como se describe en Kolonin, et al., Nat. Med. 10:625-632, 2004) utilizando EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) .

Ensayos de inmunotransferencia y de unión: preparaciones de proteína se resolvieron en SDS-PAGE y se transfirieron a membrana Immobilon-FL (Millipore) , se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey (Licor Biosciences) , y se sondaron (en PBS/0.05% de Tritón X-100) con anti-DCN de cabra [R & D Systems, 1: 1000), anti-ANX2A de conejo (Aviva, 1:1000): anticuerpos b-actina anti-ratón de conejo [Abcam, 1:10,000) o antisuero pre-y post-inmune de WAT7 (1:1, 000) como se indica. La señal fue detectada por el sistema óptico Odyssey utilizando IRDye 800CW anti-cabra o IRDye 680 anticonejo ambos de Licor Biosciences . DCN Bovina de Sigma- Aldrich, DCN murino derivado de NSO de R & D Systems. El ADNc de DCN murino se generó a partir de ARN total usando el juego de SuperScript ( Invitrogen) . Para la expresión bacteriana, el núcleo de longitud completa de ratón de DCN e isoformas de ñDCN fueron producidos por clonación de fragmentos que codifican los aminoácidos 1 a 354 y 45 a 354 del ADNc de ratón DCN {OriGene) o de ADNc de CLIC4 (OriGene) en marco con la Su 6 Tag en pET28a vector, respectivamente. Sus 6 -etiquetados proteínas se purificaron con la Hise ag (Novagen) . Para los ensayos de unión ELISA, 100 µ? de 10 µg/ml de las preparaciones indicadas de His6-DCN, His6-CLIC4 (proteina de control His6) , DCN de ratón con expresión celular de NSO {R&D Systems) , DCN bovino purificado (Sigma-Aldrich) , o BSA se recubrieron e inmovilizaron en inmunoplacas Maxisorb (96 pocilios; NUNC) durante la noche a 4°C, seguido de bloqueo con BSA al 3%, y después incubando con 100 µ? de las concentraciones indicadas de péptidos WAT7 o de control WAT2. Para el ensayo de unión de adipoquinas, marcada con FLAG de resistina de ratón producida en células HEK293 (Enzo Life Sciences) , o proteína de control FLAG-BAP (Sigma-Aldrich) fueron incubadas a las concentraciones indicadas. Los péptidos unidos o la resistina FLAG se probaron con anticuerpos Genemed de anti-péptido de conejo correspondientes (1:2000) o anticuerpos anti-FLAG de conejo {Sigma-Aldrich, 1: 2000) seguido de anticuerpos conjugados con HRP anti-conejo de cabra secundarios {Millipore, 1:5000) y detección de señal con sustrato ultra-T B (Pierce) y la medición de la absorbancia a 450 nm.

Ensayos funcionales: Para generar establemente líneas celulares transducidas , fragmentos de ADNc (OriGene) que codifican el núcleo de DCN de ratón de longitud total DCN y las isoformas ADCN fueron clonados en vector pLVX-AcGFP-Cl [Clontech) . Los lentivirus se produjeron en células Lenti-X 293T usando el sistema de envasado Lenti-X HTX de acuerdo con el protocolo del fabricante. El lentivirus que albergaba el vector solo, DCN, o ADCN se utilizó para transducir células NIH3T3-L1 (ATCC) . Después de 72 h, las células fueron tratadas con 2 g/ml de puromicina durante 4- 5 días para seleccionar líneas estables de células, que se mantuvieron después en medio con contenido de 0.5 mg/ml de puromicina. Para la medición de la proliferación celular por el ensayo MTT, igual número (5,000 células) de transductantes de lentivirus de paso temprano (P2) se sembraron en una placa de 96 pocilios. En los puntos de tiempo indicados, las células fueron tratadas con el reactivo CellTiter-Blue {Promega) durante 4 horas a 37 °C, después de lo cual se midió la emisión de fluorescencia a 560 y 590 de agitación de longitud de onda. Para la medición de la migración celular mediante el ensayo Transwell como se describe (Nie, et al., 2008, íbid) , las células se privaron durante 2 horas en DMEM/FBS al 0.1% y después se sembraron 25,000 células en los mismos medios sobre un inserto de Transwell (tamaño de poro de 5 µ?) . El inserto se colocó en la parte superior de la cámara inferior que contiene DMEM/FBS al 10%, a las células se les permitió emigrar a la parte inferior del Transwell durante 12 horas, se fijaron, se tiñeron con hematoxilina/eosina y se contaron. Lineas celulares estables 3T3-L1 (60,000 células/pocilio) se cultivaron en una placa de 12 pocilios. La adipogénesis se indujo como se describe en Nie, et al., 2008, ibid, a los 2 dias después de la confluencia, DMEM/FBS al 10% con contenido de 0.5 mM de IBMX, 1.7 mM de insulina, 1 uM de dexametasona y 0.2 mM de indometacina se añadieron y después de 72 hr fue reemplazado con DMEM/FBS al 10% con contenido de 1.7 mM de insulina renovada cada 2 dias.

Análisis estadístico: se realiza mediante el uso de la prueba t de Student y con la relevancia asignada a P<0.05.

Ejemplo 1: Identificación de péptidos ASC autoguia Los métodos para aislamiento de MSC por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) a partir de suspensiones celulares de órganos basado en el inmunofenotipo C34 + CD31-CD45- (Fig. 8B) se combinaron con la presentación de fagos y se optimizaron para ASC. Mediante la adaptación del método de "bipaneo sincrónico in vivo" descrito previamente (Kolonin et al., 2006, ibid) , una mezcla de bibliotecas de péptidos aleatorios CX7C, CXsC, y CX9C cíclico (C: cisteínas unidas por puentes de disulfuro; X: cualquier aminoácido ) se proyectó (Fig. 1A) .

Este enfoque ha permitido seleccionar sondas MSC desde el grupo de más de 1011 péptidos combinatorios. A lo largo de la proyección, el enriquecimiento progresivo en el número de partículas de fagos recuperados en el MSC de WAT, así como de los órganos de control elegidos: pulmón, médula ósea, y músculo esquelético (Fig. IB) se observó.

La secuenciación del ADN que codifica las inserciones de péptidos reveló la selección de clones de las bibliotecas de CX7C y CX8C, mientras que los clones de la biblioteca de CX9C han sido predominantemente perdidos posiblemente debido a la desventaja de propagación de fago que contiene inserciones de péptido más largas en la proteina Pili.

Después de 4 rondas de biopaneo sincrónico in vivo, ocho secuencias de CX7C y CXeC recuperadas en varias ocasiones de ASC con frecuencia superior a 1% se identificaron, que se denominaron WAT1 a WAT8 (ver Tabla 1) . En paralelo, un número coincidente de insertos de péptido autoguiados a las células estromales de pulmón (LSC) fueron secuenciados como control. Ninguno de los péptidos autoguiados a WAT fueron enriquecidos en el pulmón. Cuatro secuencias se recuperaron varias veces en el pulmón con frecuencia superior a 1%, denominados LUI a LU4 (véase la Tabla 1 más adelante) . El análisis comparativo de los clones de fagos individuales in vivo reveló WAT7, autoguiado a ASC 1,000 veces más que a LSC, como un péptido con la mayor especificidad de ASC (Fig. 1C) . El clon de WAT8 mostró preferencia ligera para ASC, en comparación con LSC en un nivel similar al mPep, un péptido caracterizado previamente que imita SPARC (Nie, et al., 2008, ibid.) En consonancia con esta observación, la secuencia de péptido WAT8 (CGQWLGNWLC: SEQ ID NO. 15) se encontró que era similar a mPep (CWLGEWLGC: SEQ ID NO. 35), lo que indica integrina ß?, un marcador previamente establecido de MSC como un probable receptor para péptido WAT8. Debido a que el enfoque de este estudio es especifico de MSC WAT, este clon se excluyó del análisis adicional. Otros péptidos seleccionados se sometieron a un ensayo de competición in vivo con el fin de identificar a aquellos con la más alta especificidad de unión. Cantidades iguales de fagos para los 11 clones que muestran péptidos WAT1 a WAT7 (SEQ ID NOS: 1-14) y LUI a LU4 (SEQ ID NOS: 17-24) se mezclaron y se inyectaron en un ratón. La especificidad de autoguia de cada clon se evaluó mediante la cuantificación de la frecuencia de fago que codifica para cada péptido seleccionado en células C34 + CD31-CD45- aisladas de cualquiera de WAT o de los pulmones. En consonancia con los datos anteriores (Fig. 1C) , el péptido WAT7 se destacó en base a su notable capacidad de volver a guiar las células WAT: representó el 87.4% de los clones recuperados de WAT y sólo el 5.8% de los clones recuperados de pulmón. Reciprocamente, los clones LU-1 y LU-2 proyectaron re- autoguia al pulmón (52.2% y 40.2%, respectivamente), pero no a WAT (véase la Tabla 1 más adelante) .

Ejemplo 2: Validación de WAT7 (secuencia CSWKYWFGEC y SWKYWFGE (SEQ ID NOS: 13 y 14)) como un péptido dirigido a ASC En base a los datos autoguia combinados, los péptidos WAT7 (secuencia CSWKYWFGEC: SEQ ID NO: 13) que muestran la dirección a ASC más definitiva fueron elegidos para su posterior análisis. El péptido LU2 (secuencia CESGFPTVGC SEQ ID NO: 19) fue elegido como un péptido de control dirigido a MSC en el pulmón, pero no en WAT. La autoguia de WAT7 fue validada mediante el análisis de biodistribución de fago con proyección de WAT7 en tejidos de ratón tras la inyección intravenosa. La inmunofluorescencia en secciones de tejido de ratón demostró que la acumulación de fago se asoció con los órganos de estroma/vasculatura de WAT (Fig. 2A) pero no de pulmón (fig. 2B) u otros órganos de control. Reciprocamente, la acumulación de LU2 se asoció con el estroma/vasculatura del pulmón (Fig. 2D) , pero no de WAT (Fig. 2C) . Para validar la capacidad de los péptidos para guiarse fuera del contexto del fago, WAT7 y LU2 cíclicos sintetizados químicamente flanqueados por cisteína unida a disulfuro se biotinilaron . La administración intravenosa de cada péptido en ratones seguida por el análisis de inmunofluorescencia de tejidos con fluoróforo conjugado con estreptavidina-reproduj o la selectividad de WAT7 para WAT (fig. 2) . La co-tinción con CD31-específico y con anticuerpos PDGFRp-específicos que identifican las células endoteliales y los pericitos, respectivamente, se llevó a cabo para identificar la población de células objetivo. Las imágenes confocales revelaron la localización perivascular de WAT7 en asociación con células PDGFRp + (Fig. 2E-G) que se han establecido previamente como ASC (ver Traktuev, et al., 2008, ibid) . Es importante destacar que, WAT7 no se co-localizó con cualquiera de las células endoteliales (Fig. 3E) o con CD45+ en las células hematopoyéticas (Fig. 2H) que infiltran WAT. En consonancia con los datos de biodistribución de fago, el péptido WAT7 no se detectó en los pulmones de los animales inyectados (Fig. 21) , a pesar de la abundancia de MSC revelada por inmunofluorescencia de PDGFR (Fig. 2J) . De acuerdo con los datos de autoguia in vivo, los fagos que presentan WAT7 mostraron alto nivel de unión a ASC primario especifico no pasado, pero no a LSC aislado del mismo animal, o a preadipocitos 3T3-L1 de ratón y células de adenocarcinoma 4T1.2 de ratón (Fig. 9) .

Ejemplo 3: Aislamiento de receptor de WA 7 Para identificar el receptor para el péptido autoguia de ASC se utilizaron métodos cromatográficos de afinidad de WAT7. Las proteínas de membrana se extrajeron de SVF de ratón WAT y se aplicaron a WAT7 ciclado cisteínico sintético acoplado covalentemente a la resina a través de su extremo carboxilo terminal. La elución con péptido WAT2 (CYKNVDSGGC secuencia: SEQ ID NO. 3) se utilizó primero para eliminar las proteínas unidas inespecíficamente (Fig. 3A) . Específicamente, las proteínas unidas fueron eluidas con WAT7 y aparecieron en subgrupo discreto de fracciones. Una columna de afinidad de péptido WAT2 se utilizó en paralelo para confirmar la especificidad de las proteínas purificadas por afinidad. Las pruebas de eluatos desalados revestidas sobre plástico para la unión de fago-péptido confirmaron que estas fracciones contenían proteínas de unión a fagos con proyección de WAT7, pero no para controlar fagos con proyección de WAT2 (Fig. 3B) . Las fracciones eluidas con WAT7 a partir de una columna de afinidad de control cargado con WAT2 y expuestas al mismo extracto de proteína de membrana no estaban ligadas por fagos con proyección de WA 7 (Fig. 3B) . La Fracción 5, que contiene proteínas tiradas hacia abajo y concretamente eluidas con WA 7 , mostró el más alto nivel de unión a fagos con proyección de WAT7 y fue elegida para la purificación del receptor. Las proteínas eluidas en esta fracción se concentraron y se resolvieron por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida en gradiente (PAGE) . Una banda eluida específicamente con WAT7, pero no con el péptido de control WAT2 , migró a aproximadamente 40 kDa (Fig. 3C) . El análisis espectrométrico de masas de esta banda reveló que contenía decorina (DCN), alternativamente conocida como proteoglicano II.

Debido a que DCN es una molécula secretada estudiada ampliamente en la matriz extracelular (ECM) y controla varios procesos fisiológicos. Su expresión de mRNA ubicuo pareció incompatible con WAT7 autoguia de ASC en WAT. Por lo tanto, para analizar los niveles de proteina DCN en órganos de ratón, un panel de secciones de tejido de ratones se sometió a inmunofluorescencia confocal con anticuerpos disponibles comercialmente producidos contra DCN glicosilado de ratón de longitud total. De acuerdo con estudios previos de Bolton et al., 2008 {Int. J. Obes. 32: 11. 13-1121, 2008), la proteina DCN fue detectable en muchos órganos, sin embargo, fue sobre todo muy abundante en WAT en comparación con el pulmón y la médula ósea (Fig. 4A-C) . Esto estaba en marcado contraste con la expresión de PDGFR que era comparable en todos los órganos (Fig. 4D-F) , como se evaluó en las mismas secciones en paralelo. El patrón de DCN y PDGFR en WAT era indistinguible, y la localización de cada proteina a las células perivasculares que rodean el endotelio CD31-positivo indica que la mayoría de DCN en WAT es producido por ASC (Fig. 4A y 4D) . Sin embargo, la detección de la expresión de DCN por las células perivasculares de un subconjunto de los vasos en los pulmones (Fig. 5B) y en algunos otros órganos (datos no mostrados) sugiere que la diferencia en el nivel de expresión de DCN por diferentes subpoblaciones de MSC podría no ser suficiente para considerar a WAT7 autoguia de ASC.

Para caracterizar la expresión de la DCN no glicosilada en WAT, extractos de proteínas de tejidos de ratón se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos policlonales producidos contra DCN de ratón de longitud total (fig. 5A) . El análisis de las proteínas citosólicas de la fracción de SVF de WAT, así como de pulmón y médula ósea, mostró expresión comparable de isoformas de DCN glicosilado de mayor peso molecular en estos órganos. En contraste, WAT mostró aumento de la expresión de un núcleo de ~40 kDa DCN no glicosilada que carece de la cadena de dermatán/ glicosaminoglicano de sulfato de condroitina (GAG) (Fig. 5A) . Curiosamente, el análisis de inmunotransferencia de las proteínas de membrana a partir de los tres órganos reveló expresión específica de WAT de una isoforma de DCN con un peso molecular más bajo que el del núcleo de DCN no glicosilado previamente caracterizado (Imai et al., Biochem. J. 322 (Pt 3), 809-814, 1997; Roughley et al., Biochem J. 318 (Pt 3): 779-784, 1996) en otros órganos. La ausencia de esta isoforma de expresión de DCN en el pulmón y la médula ósea es evidente a partir de la misma transferencia sondeada con anticuerpos contra una proteína de membrana de control, anexina II (ANX2A) , que se utiliza para controlar la carga de proteínas (Fig. 5A) . La inmunotransferencia también se utilizó para caracterizar cuáles de las células de WAT expresan la isoforma de DCN de bajo peso molecular. Estos hallazgos indican que se asocia exclusivamente con la fracción de membrana de ASC (pero no con citosólica) , pero no de adipocitos diferenciados Fig. 16A.

Ejemplo 4 : Una nueva isoforma de DCN es Receptor de CSWKYWFGEC (SEQ ID NOS: 13) Para establecer la identidad de la isoforma de DCN especifica de WAT, que se denomina ADCN, se utilizaron anticuerpos DCN para purificar DCN a partir del extracto de membrana de ratón de SVF aislado de WAT. El análisis de las proteínas inmunoprecipitadas mediante la desnaturalización PAGE reveló la banda de 40 kDa esperada correspondiente a ADCN (Fig. 5B) . La microsecuenciación de degradación de Edman de la proteína cortada de la banda reveló que este fragmento de DCN inicia en Leu-45 (Fig. 5C) , y por lo tanto es 14 aminoácidos más corto que el núcleo de DCN núcleo maduro descrito previamente generado después de la escisión del propéptido (Imai et al., 1997, ibid; Roughley et al., 1996, ibid. ) Por lo tanto, ADCN no puede estar glicosilado, ya que no se encuentra el sitio de unión de GAG SerGly (Fig. 5C) presente en el núcleo de DCN (Scholzen et al., J. Biol. Chem. 269:28.270-28.281, 1994). La falta de metioninas en la secuencia de núcleo DCN carente de ADCN indica que ADCN se genera por escisión proteolítica en lugar de por corte y empalme alternativo.

Para validar DCN como el objetivo de WAT7 , ensayos inmunoabsorbentes (ELISA) enlazados a enzima utilizando proteínas etiquetadas con His6 fueron utilizados. Estos estudios de unión in vitro demostraron la unión dependiente de la dosis clara de WAT7 a DCN de ratón bacterialmente purificados recombinante, mientras que el péptido de control de WAT2 no mostró DCN vinculante Fig. 16B. Curiosamente, WAT7 no se une a DCN bovino glucosilado disponible comercialmente en un nivel superior al antecedente observado para la albúmina de suero bovino (BSA) . Un análisis más detallado incluyendo ADCN demostró que WAT7 unido a ADCN, así como a proteína de núcleo de DCN bacterialmente expresada (y por lo tanto no glicosilada) (Fig. 5D) . La falta de WAT7 vinculante ya sea bovina o de DCN de ratón glicosilado por encima del antecedente de BSA vinculante (Fig. 5D) demuestra que la cadena de GAG en DCN maduro evita la unión de WAT7. Este hallazgo puede explicar por qué la secreción ubicua de DCN glicosilada en el ECM en otros órganos además de WAT ( eed y Iozzo, Glycoconj J. 19:249-255, 2002) no interfiere con la autoguía de WAT del péptido WAT7.

Con el fin de servir como un receptor para WAT7, ADCN debe ser expuesto en la superficie de ASC. Mediante el aislamiento de la fracción de proteína de membrana plasmática a partir de la preparación de membrana total de SVF, se demostró que ADCN se asocia con la membrana celular de ASC (Fig. 5E) . Además, el uso de un enfoque alternativo para confirmar que ADCN se muestra en ASC, las proteínas de la superficie de las células SVF recién aisladas de WAT se biotina tal como se describe (Kolonin et al., 2004, ibid) , después de lo cual las proteínas biotiniladas se aislan mediante el uso de perlas de estreptavidina y se someten a inmunotransferencia anti-DCN. Como era de esperar, ADCN fue aislado, lo que indica su asociación con la superficie celular (Fig. 5F) . Curiosamente, el cultivo durante la noche de las células SVF WAT en plástico en condiciones utilizada típicamente para la propagación de MSC/ASC dió lugar a la desaparición de ADCN del grupo de proteínas de la superficie celular (Fig. 5F) . Esto indica que la exposición de ADCN en la superficie celular que se produce in vivo no se retiene en el cultivo celular. Por último, la localización celular de ADCN recombinantemente fusionado con la proteína fluorescente verde (GFP) expresada en preadipocitos 3T3-L1 se demostró mediante el uso de lentivirus (Fig. 5G) . El control de las células transducidas por vectores mostraron señal de GFP predominantemente nuclear, que se redistribuye en el citoplasma de las células que expresan fusión DCN-GFP de longitud total. En contraste, las células que expresan ADCN-GFP proyectaron un patrón de localización marcadamente distinto parecido al de SPARC unido a la superficie celular (Nie et al., 2008, ibid) , que confirmó la localización de ADCN en la membrana celular.

Ejemplo 5: La resistina como un interactor ASC de AOCN El trabajo previo de los inventores ha demostrado que los péptidos tienden a reconocer receptores de superficie celular mediante la imitación de los dominios de unión al receptor de los ligandos biológicos a los receptores. Por lo tanto, para caracterizar la interacción biológica detrás del enlace de WAT7 - ADCN y para identificar el ligando biológico de ADCN, los anticuerpos se suscitaron contra WAT7 mediante la inmunización de conejos con conjugados de péptidos KLH, que se esperaba reconocieran el epitopo de unión de una proteina de ratón imitada por WA 7. La figura 6A demuestra que los anticuerpos de WAT7 generados tienen una alta especificidad para WAT7 y no reconocen ninguno de los otros péptidos autoguia de ASC aislados en la proyección. La inmunotransferencia de proteina de ratón extraída identificó una proteína de ~13 kDa reconocida por anticuerpos de WAT7 (Fig. 6B) . Esta proteína fue muy abundante en SVF recién aislado del tejido de WAT, pero no en el pulmón o médula ósea. Curiosamente, su expresión se perdió en el cultivo en ASC durante la noche en plástico en condiciones normalmente usadas para la propagación de MSC/ASC (Fig. 6B) . Esta pérdida es coincidente con la pérdida de la expresión en la superficie celular de ADCN en cultivo (Fig. 5F) , lo que sugiere que la exposición ADCN en ASC se acopla con la expresión de su ligando.

Inmunoglobulina anti-WAT7 (IgG) inmovilizada en perlas de Proteina A/G se utilizó para aislar el ligando ADCN y para cromatografía de afinidad en el extracto de proteína de SFV. Los productos de la afinidad de captura se resolvieron mediante PAGE (Fig. 6C) , después de lo cual la banda de 13 kDa ~ fue cortada. La espectroscopia de masas identificó la proteína como resistina (ADSF) conocida por su funcionamiento como un adipocina secretada de WAT (Steppan et al., Nature 409: 307-312, 2001; Kim et al., J.

Biol. Chem. 276: 11252-11256, 2001) . Debido a que la interacción con la resistina DCN no se ha informado anteriormente que confirme la interacción con ADCN directamente, ensayos de unión in vitro se realizaron con resistina de ratón marcada con FLAG. La fosfatasa alcalina bovina marcada con FLAG (BAP) sirvió como control negativo (Fig. 6D) . La resistina se encontró que se une a ADCN a una concentración molar de 100 veces menor que la DCN de longitud completa. Curiosamente, fue completamente ineficaz en la unión a DCN de ratón o bovino glicosilado, como es evidente a partir de sus antecedentes comparables de unión a BSA y BAP. Estos resultados indican que la resistina sirve como un ligando de ADCN.

Las células de la linea celular 3T3-L1 son un modelo ampliamente aceptado para el estudio de la biología de los progenitores de los adipocitos y se utilizaron para caracterizar la función de ADCN. Cultivos de 3T3-L1 lentivirales establecidos fueron transducidos con ADCN-GFP o fusiones de DCN-GFP de longitud total; el vector de GFP solo se utilizó como control (Fig. 5G) . El análisis del aumento de número de células después de 24 h y 48 h en cultivo usando el ensayo de MTT demostró aumento de la proliferación de células que expresan ADCN, en comparación con las células que expresan GFP o DCN-GFP de longitud total (Fig. 7A) . El análisis de la migración celular mediante el uso del ensayo Transwell de cámara de Boyden demostró un aumento significativo en la invasividad de las células que expresan ADCN, mientras que las células que expresan DCN de longitud total mostraron la tendencia opuesta, en comparación con las células que expresan GFP (Fig. 7B) . Estos resultados fueron confirmados por el ensayo de herida cero in vitro (datos no mostrados) . Por último, las células fueron sometidas a inducción en adipogénesis para probar el efecto sobre la diferenciación celular (Fig. 7C) .

Ejemplo 6: Péptidos adicionales y Prueba de unión a tejidos humanos La selección de péptidos autoguia a MSC de órganos de ratón por proyección de fagos se ilustra en la Figura 8A, que contiene una descripción esquemática del proceso de selección de proyección de fagos in vivo. En cada ronda de selección, los fagos se administraron I.V. y se recuperaron de forma simultánea desde los tejidos objetivo, después se ampliaron, se agruparon y se utilizaron para la siguiente ronda de selección. El aumento de la recuperación de las unidades de transformación de fagos (TU) en las rondas posteriores refleja la selección de péptidos preferentemente autoguiados al órgano objetivo.

La Figura 8B ilustra la identificación de MSC usando citometria de flujo. Se muestra un análisis de WAT subcutáneo representativo. La supresión de células viables que fueron positivas para CD34+ (diagrama de dispersión izquierdo) se llevó a cabo primero, y luego se basó en la expresión de CD31 y CD45 (diagrama de dispersión derecha) , en combinación, las células de ASC fueron identificadas como células CD34 + CD45-CD31- que aparecían como eventos púrpuras raros en Q3 del diagrama de dispersión inicial. Los eventos púrpuras que aparecen en Ql corresponden a células epiteliales CD34 + CD45-CD31 + (CE) . Los eventos que aparecen en Q2 y Q4 corresponden a células hematopoyéticas CD45 +.

Una serie de clones de péptidos se identificó y enriqueció usando proyecciones de fagos en las células madre adiposas (ASC) y células madre de pulmón (LSC) que se enumeran en la Tabla 1, a continuación.

TABLA 1 En la Tabla 1 anterior se muestra el porcentaje (%) de los clones de fagos secuenciados que llevaban el WAT indicado o inserto LU presente dentro de WAT (% en WAT) o pulmonar (% en pulmones) después de 4 rondas de biopaneo sincronizado in vivo en células CD34 + CD31-CD45-.

Para demostrar la selectividad de cada clon, la misma cantidad de fagos de clones WAT1, WAT2 , WA 3 , WAT4 , WA 5, WA 6, WAT7 , LUI , LU2, LU3 y LU4 se mezclaron y se inyectaron en ratones para determinar qué porcentaje regresaba (re-autoguia) , se muestra el porcentaje (%) de los clones de fagos secuenciados que llevan el WAT indicado o inserto LU en células C34 + CD31-CD45- aisladas a partir de ( (%) de Re-autoguia a WAT) o pulmonar ((%) de Re- autoguia a pulmón) .

La selectividad de varios de los péptidos aislados en la pantalla de proyección de fagos se evaluó usando un ensayo de unión fago-celular. Los fagos que expresan el péptido WAT1, WAT2, WAT7 , LU2, MPEP o Fd-Tet se ensayaron para la unión en: (1) células 4T1.2, células endoteliales derivadas de un carcinoma mamario humano (2) células de ratón 3T3-L1 (una linea de células pre-adiposas que pueden diferenciarse en un fenotipo de tipo adipocito), (3) células SVF primarias de ratón de WAT, (4) células de ratón SVF primarias de pulmón, y (5) paso 4 de las células ASC humanas de WAT (se obtuvieron originalmente durante la liposucción) . Las células objetivo se separaron con 2.5 mM de EDTA y 100,000 células se resuspendieron en 0.2 mi de medio RPMI que contiene 1% de BSA. El péptido indicado que expresa fago junto con un control de fago (sin insertos) se añadió a Fd-tet (108 TU) durante 1 hora a 37°C. Después de lavar 3 veces con RPMI con contenido de 1% de BSA, las células fueron agotadas con un homogeneizador . El fago recuperado se utilizó para infectar con E. coli K91 y tetraciclina después de la selección, las colonias se enumeraron para cuantificar las unidades de transformación promedio (TU) . Se muestran en la fig. 9A valores medios de tres recubrimientos individuales + SE (barras de error) . El ASC humano utilizado para generar el hallazgo presentado en la fig. 9A se habia sometido a 4 pasajes cuando se utilizó para demostrar la unión de WAT a estas células. Se planteó la hipótesis de que debido a que ADCN se une selectivamente a ASC de ratón recién aislado y no asi a ASC de ratón con varios pasajes, esta preferencia en el sistema de direccionamiento de AVAT7 ADCN podría ser preservada.

Para demostrar que de hecho WAT7 no se une a ASC humana sin pasaje, ASC humana fresca se utilizó como un tejido objetivo (la unión de cada uno del péptido expresado del fago se ilustra en la fig. 9B.). Por lo tanto, se demostró que la ASC humana envolvente no pasada WAT7 es mejor que los péptidos WATl y WA 2. Esta actividad refleja el patrón de péptidos autoguía de WAT para ASC de ratón recién aislado, lo que sugiere que la biología de DCN se conserva y que el sistema de direccionamiento de delta- DCN/WAT7 puede ser utilizado en otros sujetos mamíferos, incluyendo los seres humanos .

Ejemplo 7: Péptidos citotóxicos y Evidencia de Actividad in vivo de la composición peptidica Péptidos todo-D enantiómeros resistentes a proteólisis citotóxica vinculados a ácido aminohexanoico dirigidos fueron diseñados para agotamiento selectivo in vivo de las poblaciones de células de interés. Estos péptidos fueron sintéticos y se componen de dos dominios funcionales: un dominio de autoguia (objetivo celular) de unión a un receptor expresado diferencialmente en las células de interés (en este ejemplo particular WAT7 cíclico (SEQ ID NO. 13) ) y un dominio citotóxico para inducir la muerte apoptótica de las células que internalizan el péptido. El péptido que actuó fue típicamente de 7 a 8 aminoácidos de longitud y cíclico (limitado por cisteínas unidas por disulfuro) . El dominio citotóxico fue una secuencia de péptido anfipático KLAKLAKKLAKLAK (SEQ ID NO: 31) designada (KLAKLAK)2, que interrumpe las membranas mitocondriales sobre la internalización mediada por el receptor celular y causa la muerte celular programada (apoptosis). Todos los aminoácidos en ambos dominios eran D-enantiómeros, que son resistentes a la proteólisis in vivo, permitiendo así los efectos a largo plazo del péptido tras la administración sistémica. El enlazador que conecta los dos dominios es ácido aminohexanoico (Ahx) : NH-(CH2)5- CO, que también es resistente a la escisión por proteasas i13 vivo. El péptido quimérico resultante (ilustrado en la Fig. 10) es una composición de proteina WAT7 (SEQ ID NOS: 13) -KLAKLAK2 (SEQ ID NO: 31) que fue producida por Celtek. Los péptidos diseñados y fabricados con base en la composición del diseño introducido en este documento fueron inyectados sistémicamente en ratones para demostrar la actividad de la composición de péptido citotóxico para agotar selectivamente las poblaciones de células. Esta tecnología fue validada utilizando péptidos dirigidos a células madre/estromales adiposas (ASC) en el tejido adiposo blanco (grasa) (WAT) . Como se muestra en la figura 11, el ASC primario de ratón murió de manera eficiente mediante el tratamiento con WAT7-KLAKLAK2 de una manera dependiente de la concentración como lo demuestra el uso de tinción de exclusión con tinte azul tripano (Fig. 11) . El uso de la citometría de flujo y el reactivo APO-TRACE {Sigma) prueba que la inducción de la apoptosis se estableció, validando la apoptosis como el mecanismo de la muerte celular inducida por la exposición péptido citotóxico (fig. 12) .

Como se ha demostrado por los ratones que se muestra en la figura 13, la inyección de 2 mg de WAT7- KLAKLAK2 todo-D-péptido en ratones obesos resultó en la reducción demostrada en el tejido adiposo intraperitoneal .

Esta reducción se debe a la depleción selectiva de ASC a través de la muerte celular por apoptosis como se evidencia a las 48 horas después de la inyección (véase la fig. 14). La cantidad de ASC presente en WAT subcutánea (panel E frente a F) se redujo mediante el tratamiento con el péptido citotóxico dirigido, WAT7-KLAKLAK2 todo-D-péptido, la cantidad de ASC presente en WAT intraperitoneal fue aún más reducida en gran medida (panel T frente a panel H) y esto también dio lugar a la necrosis tumoral como se muestra en los paneles superiores (panel A frente a panale B) o como se evidencia por la reducción del tumor como se muestra con fluorescencia (panel C frente a panel D) . La Figura 15 muestra que el tratamiento con el péptido citotóxico dirigido, WAT7-KLAKLAK2 todo-D-péptido, resultó en un acuerdo celular apoptótico en ASC presente en el tejido subcutáneo y adiposo intraperitoneal (paneles del lado izquierdo) . En contraste, no se identificó muerte celular por apoptosis ninguna en las células obtenidas a partir del riñon o de la sangre periférica de los ratones tratados (paneles del lado derecho de la Fig. 15) , lo que indica que el péptido inductor de la apoptosis no fue liberado por proteólisis de la porción de direccionamiento de la composición de proteina péptido quimérico dirigida. No se llegó a BAT con dosis crecientes de péptidos. Esto indica que los péptidos citotóxicos específicos construidos mediante los métodos descritos son resistentes a la escisión proteolitica y pueden ser utilizados in vivo para dirigirse con éxito y matar ASC y reducir el tejido adiposo .

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la técnica puede, usando la descripción del presente documento, utilizar los métodos presentes en toda su extensión. Las modalidades descritas en este documento deben interpretarse como ilustrativas y no como limitativas del resto de la descripción en modo alguno. Aunque se han mostrado y descrito modalidades preferidas, muchas variaciones y modificaciones de las mismas pueden ser hechas por un experto en la técnica sin apartarse del espíritu y las enseñanzas de los métodos descritos en la presente. En consecuencia, el alcance de la protección no está limitado por la descripción establecida anteriormente, sino sólo está limitado por las reivindicaciones, incluyendo todos los equivalentes de la materia objeto de las reivindicaciones. Las descripciones de todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones citadas en este documento se incorporan en este documento por referencia, en la medida en que proporcionen procedimientos u otros detalles consistentes con y complementarios a los establecidos en este documento.

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido dirigido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-16, caracterizado porque dicho péptido se une a células estromales.

2 . El péptido dirigido de la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia de aminoácido WAT7 SWKYWFGE de la SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14.

3. Una composición de proteína que comprende un péptido dirigido de la reivindicación 1.

4. Una composición de proteína que comprende la secuencia de aminoácido de WA 7 de la reivindicación 2.

5. El péptido dirigido de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido dirigido está compuesto enteramente de D-aminoácidos .

6. La composición de proteína de la reivindicación 4, caracterizada porque dicho WAT7 está compuesto de D-aminoácidos, y caracterizada porque dicha composición se une a células estromales en tejido adiposo, tejido fibrótico o tejido tumoral.

7. La composición de proteína de la reivindicación 6, caracterizada porque dicho WAT7 se une selectivamente a ADCN en la superficie de las células ASC.

8. La composición de proteína de la reivindicación 3, caracterizada porque dicho péptido dirigido está acoplado a un agente efector seleccionado de entre el grupo que comprende: un agente de imagen, un agente citotóxico; un agente pro-apoptótico; una proteina de fusión; un agente citostático; un agente citocida; un radioisótopo; una célula ACS de agente diferenciador; inhibidores de la mitosis, agentes antitumorales ; agente antibiótico, enzimas; agente quimioterapéutico; agentes anti-angiogenéticos o una combinación de los mismos.

9. La composición de proteina de la reivindicación 8, caracterizada porque dicho péptido dirigido y agente efector comprenden D-aminoácidos.

10. La composición de proteina de la reivindicación 8, caracterizada porque dicho péptido dirigido comprende L-aminoácidos , y el efector comprende D- aminoácidos .

11. La composición de proteina de la reivindicación 8, caracterizada porque dicho péptido dirigido comprende L-aminoácidos y el efector comprende L- aminoácidos.

12. La composición de proteina de la reivindicación 8, caracterizada porque dicho péptido está acoplado a un agente efector e induce a un tejido adiposo blanco a convertirse en un tejido adiposo marrón.

13. La composición de proteina de la reivindicación 12, caracterizada porque dicho agente efector activa los receptores b3-adrenérgicos en el tejido adiposo blanco.

14. La composición de proteina de la reivindicación 3, caracterizada porque dicho agente efector es un péptido compuesto de D-aminoácidos .

15. Un método para hacer una composición de proteina para dirigirse al tejido adiposo, que comprende: acoplar un agente efector a un péptido dirigido, caracterizado porque el péptido dirigido está compuesto de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-16; y caracterizado porque dicho péptido dirigido se dirige selectivamente al tejido adiposo celular .

16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el agente efector y péptido dirigido están compuestos de D-aminoácidos.

17. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el efector está compuesto de L- aminoácidos ; y el péptido dirigido está compuesto de D- aminoácidos .

18. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el acoplamiento comprende el enlace de dicho agente efector a dicho péptido dirigido con una fracción de' unión.

19. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque dicha fracción de unión comprende ácido aminohexanoico; (CH2) ; (CH2)5; (CH2)6 (CH2)7; (CH2)8 o una combinación de los mismos.

20. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque dicho agente efector se selecciona del grupo que comprende un agente citotóxico; un agente pro- apoptótico; un agente de formación de imágenes o combinaciones de los mismos.

21. Un método para administrar un agente efector a un tejido adiposo que comprende: exponer una composición de proteina que comprende: un agente efector acoplado a un péptido, en donde el péptido se comprende de una secuencia de aminoácidos menor a 100 aminoácidos de longitud, y en donde la secuencia de aminoácidos comprende un tejido adiposo dirigido a fracción de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-16; a una población de células que comprenden tejido adiposo.

22. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha composición de proteina comprende un enlazador.

23. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicho péptido dirigido está compuesto de D-aminoácidos .

24. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicho agente efector y dicho péptido dirigido están compuestos de D-aminoácidos.

25. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicho agente comprende: un agente citotóxico; un agente pro-apoptótico; un agente de formación de imágenes o sus combinaciones.

26. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque dicho agente comprende D-aminoácidos.

27. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque dicha exposición comprende: exponer un sujeto a dicha composición de proteína para tratar un trastorno asociado a adiposidad, en donde dicho trastorno comprende obesidad; fibrosis; cáncer o combinaciones de los mismos .

28. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque la población de células está en un sujeto humano.

29. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque la población de células está en una sección de un tejido.

30. El método de la reivindicación 21, comprendiendo, además, la detección de células estromales adiposas en dicha población con base en la unión selectiva de la composición de proteina a dicho tejido adiposo.

31. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque dicho trastorno asociado a adiposidad es un trastorno de la composición corporal; un trastorno del peso corporal; obesidad; lipodistrofia; diabetes; síndrome metabólico, fibrosis; cáncer o combinaciones de los mismos.

32. Un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 17-24, y en donde dicho péptido se une al tejido pulmonar .

33. Una composición de proteína que comprende un péptido de la reivindicación 32.

34. La composición de proteína de la reivindicación 32, caracterizada porque dicha composición de proteína comprende aminoácidos.

35. La composición de proteína de la reivindicación 32, caracterizada porque dicho péptido está acoplado a un agente de formación de imágenes; un agente citotóxico; un agente pro-apoptótico o sus combinaciones.

36. Una composición de proteína que comprende un péptido dirigido y un agente efector, caracterizada porque dicho agente efector comprende: gramicidina, magainina, melitina; defensing; cecropina; (KFAKFAK)2, (KFXAKFXAI) 2; (KHexAHexAK) 2 (KLAKLAK)2; (KLAKKLA) 2; ( KAAKKAA) 2 ; (KLGKKLG) 3; angiotensina, péptidos de laminina, péptidos de fibronectina, inhibidores del activador del plasminógeno, inhibidores de las metaloproteinasas de tejidos; interferones, interleucina 12, factor plaquetario 4; IP - 10; Gro-ß; proteína relacionada CON proliferina; trombospondina, 2-metoxiestradiol carboxiamidotriazol; CM101; arimastat; polisulfato de pentosan; angiopoyetina 2 (Regeneron) , interferón-alfa; herbimicina A; PNU145156E; fragmento de prolactina 16K; linomida; talidomida; pentoxifilina, genisteína, TNP470; endostatina; paclitaxel; acutina; angiostatina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM-1470, factor plaquetario 4 o minociclina, 5- fluorouracilo, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino (CDDP) , ciclofosfamida; dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, agentes vinculantes de receptor de estrógenos; etopósido (VP16) , inhibidores de la farnesil-proteína; gemcitabina; ifosfamida; mecloretamina; melfalán; mitomicina; navelbina; nitrosurea; plicomicina, procarbazina, raloxifeno, tamoxifeno, taxol; temazolomida (una forma acuosa de DTIC) ; transplatinum, vinblastina y metotrexato, vincristina, agentes alquilantes, antimetabolitos , antibióticos antitumorales, hormonas corticosteroides, inhibidores mitóticos, nitrosoureas, agentes hormonales, inhibidores mitóticos, antibióticos antitumorales, enzimas, modificadores de la respuesta biológica; alcaloides vegetales; docetaxel; etopósido (VP 16) ; teniposida; paclitaxel; táxol, vinblastina, vincristina, vinorelbina, tiazolidinedionas de agonistas gamma de PPAR, rosiglitazona, fluoróforos, complejos de quelatos metálicos; radioisótopos, marcadores fluorescentes, ureasa, fosfatasa alcalina, liposomas, microcápsulas, microparticulas, nanoparticulas ; perlas magnéticas; microdispositivos, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina (Adriamicina) , plicamicina (mitramicina) e idarrubicina, complejos de coordinación de platino; antracenedionas, ureas sustituidas, derivados de metilo hidracina; amsacrina, L-asparaginasa, y tretinoina. Carboplatino, cisplatino (cis-DDP) ; mitoxantrona; hidroxiurea; procarbazina; proteínas de fusión de IgFc, proteínas de fusión de enzimas; proteína fluorescente; proteínas luminiscentes o combinaciones y análogos de los mismos .