WO2005116206A1 - 改良型ニトリルヒドラターゼ - Google Patents

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WO2005116206A1
WO2005116206A1 PCT/JP2005/010107 JP2005010107W WO2005116206A1 WO 2005116206 A1 WO2005116206 A1 WO 2005116206A1 JP 2005010107 W JP2005010107 W JP 2005010107W WO 2005116206 A1 WO2005116206 A1 WO 2005116206A1
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WO
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amino acid
protein
residue
nitrile hydratase
activity
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PCT/JP2005/010107
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English (en)
French (fr)
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Fumiaki Watanabe
Dai Ujihara
Miki Sakai
Fujio Yu
Tetsuji Nakamura
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an improved type of avian trinolehydratase having improved heat resistance or altered substrate specificity, a gene DNA encoding the protein, a recombinant vector containing the gene DNA, and the recombinant vector.
  • nitrile hydratase an enzyme having nitrile hydration activity that hydrates nitrile groups and converts them into amide groups, has been discovered, and it has been discovered to use such enzymes or microbial cells containing the enzymes.
  • a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound is disclosed. This production method is known for its higher conversion and selectivity from nitrile compounds to the corresponding amide compounds as compared to conventional chemical synthesis methods.
  • microorganisms that produce nitrile hydratase include, but are not limited to, Corynepacteri (plum Cory neb a cteriuni), birds, genus Pseudomonas), and Rhodococcus.
  • Microorganisms belonging to the genus Rhizobium (MMzob ii), Klebsiella Uebsiella, or the genus Pseudonocardia ooo ⁇ 's) can be mentioned.
  • Rhodococcus' Rhodocrows Rlwdococcus l'hodoch thighs and J'l strains are used for industrial production of acrylamide, and their usefulness has been demonstrated.
  • a gene encoding nitrile hydratase produced by the strain has been clarified (see Reference 1). Development of an enzyme with improved heat resistance has been desired from the viewpoints of reducing the amount of enzyme during the reaction and reducing costs. .
  • nitrile hydratase isolated from microorganisms existing in nature and its residues
  • nitrile hydratase is used to alter the activity, substrate specificity, Vmax, ⁇ , thermal stability, substrate stability, product stability, etc. of nitrile hydratase. Attempts have been made to introduce mutations into these (see References 2 and 3).
  • Nitrile hydratase is an enzyme that has already been used in the industrial production of acrylamide.However, compared to currently used enzymes, obtaining an enzyme with improved properties such as heat resistance is an enzyme This is useful in that the cost during the reaction can be reduced.
  • an object of the present invention is to provide a protein having nitrile hydratase activity with further improved nitrile hydratase and improved thermostability, a gene DNA encoding the protein, a recombinant vector having the gene DNA, A transformant or a transductant having a vector, nitrile hydratase collected from a culture of the transformant or the transductant, a method for producing the same, and an amide compound using the culture or the treated product It is to provide a manufacturing method of.
  • an object of the present invention is to improve nitrile hydratase and obtain an enzyme having improved thermostability, and / or to obtain an enzyme having improved reactivity to aromatic nitrile.
  • At least one amino acid residue in the amino acid sequence of nitrinolehydratase from vermilion is replaced with a residue selected from the group of natural amino acids
  • the inventors have found that the heat resistance of the enzyme is improved and / or the reactivity of the enzyme to an aromatic nitrile is improved, thereby completing the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • (b) It contains an amino acid sequence in which the 167th arginine residue in the amino acid sequence of the ⁇ -subunit of wild-type nitrinolehydratase is substituted with another amino acid residue, and has a thermostable nitrile hydratase activity.
  • (C) The amino acid sequence of the protein of (a) or (b) above contains an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been deleted, substituted or added, and has a thermostable nitrile hydratase activity.
  • the amino acid sequence of the protein of (a) or (b) contains an amino acid sequence in which one or several amino acid residues have been deleted, substituted or added, and has a thermostable double trinolehydratase activity Protein
  • a recombinant vector comprising the gene DNA according to any one of (7) to (: 13).
  • a method for producing nitrile hydratase which comprises culturing the transformant or transductant according to (15) and collecting nitrile hydratase from the resulting culture.
  • a culture obtained by culturing the transformant of the above (15) or the treated product is brought into contact with a nitrile compound, and an amide compound produced by the contact is collected.
  • a method for producing an amide compound comprising: According to the present invention, there is provided a mutant nitrile hydratase having improved thermostability to wild-type nitrile hydratase and improved reactivity to wild or aromatic nitril, and a gene encoding the enzyme. You.
  • a recombinant DNA containing the above mutant type atrinitole hydratase gene a transformed (introduced) body containing the recombinant DNA, and a method for producing an amide compound using the transformed (introduced) body.
  • Figure 1 shows the configuration of the plasmid pJH601.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of the plasmid p3R.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of the plasmid pMH301.
  • FIG. 4 is a configuration diagram of the plasmid 1) 52.
  • Figure 5A shows the construction of plasmid pCF002.
  • FIG. 5B is a construction diagram of plasmid pFY529. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides an improved nitrino rehydratase in which wild-type nitrino rehydratase has improved heat resistance and / or substrate specificity by mutating a part of the amino acid sequence of wild-type nitrile rehydratase. Things.
  • Tro Toriruhi Dorataze is an enzyme that catalyzes the hydration reaction to convert the amino-de-compound corresponding to a nitrile compound (RCN + H 2 0 ⁇ RCONH 2).
  • RCN + H 2 0 ⁇ RCONH 2 a nitrile compound
  • ditolyl hydratase consists of a collection of hyunsubunits and / or subunits. Takes a higher order structure.
  • Wild-type nitrile hydratase is defined as a nitrile hydratase having an amino acid sequence derived from a wild-type (parent strain) of a microorganism as a source of the enzyme and a gene sequence encoded by a gene sequence derived from a wild-type strain (parent strain). It is tolyl hydratase.
  • Wild-type subunit or “wild-type ⁇ -subunit” is encoded by a gene sequence derived from a 0-subunit or a subunit having an amino acid sequence derived from a wild-type strain (parent strain) and from a wild-type strain (parent strain). / 9 Subunit or ⁇ 'subunit.
  • Wild-type nitrile hydratase j includes wild-type nitrile hydratase from various microorganisms.
  • the microorganism is not particularly limited as long as it is a microorganism having a gene encoding nitrile hydratase.
  • Rhodococcus such as Rhodococcus rhodochrous) J-l (FERM BP-1478), Rhodococcus' Rhodococcus rhodochrous M8 (SU1731814), Rhodococcus rhodochrous Mouth Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac'1515D) ⁇ or Mouth dococus Rhodococcus rhodochrous
  • Rhodococcus rhodochrous J-l
  • Rhodococcus' Rhodococcus rhodochrous M8 SU1731814
  • Rhodococcus rhodochrous Mouth Rhodococcus rhodochrous M33
  • Mouth dococus Rhodococcus rhodochrous There is a nitrile hydratase encoded by the gene sequence.
  • Bacillus smithii) Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • Rhodococcus l'hodoch hired, M33 (VKM, etc.) include nitrinolehydratase having an amino acid sequence derived from M8 and nitrile hydratase encoded by its gene sequence.
  • Ac-1515D is a strain that was constitutively selected from M8 (SU1731814) as a strain that expresses nitrile hydratase by spontaneous mutation. No mutation (US Pat. No. 5,827,699).
  • the improvement in heat resistance means that the residual activity of the enzyme derived from the mutant strain subjected to the heat treatment is at least 10% higher than the residual activity of the enzyme derived from the parent strain subjected to the same treatment.
  • "Remaining ⁇ Activity '' refers to the ratio of the amount of amide compound produced using the heat-treated cells to the amount of amide compound measured and the amount of amide compound produced using the same amount of untreated cells.
  • the culture solution or the collected and washed culture cells may be placed in a container, and then placed in a heating device such as a water bath incubator or the like and kept at a constant temperature for a certain period of time.
  • a heat treatment may be performed by adding a nitrile compound or an amide compound to enhance the stability of the enzyme.
  • conditions for the heat treatment it is preferable to appropriately examine the treatment temperature and the treatment time, and to set conditions under which the activity of the parent strain decreases to 50% or less. Specifically, heat treatment is performed at 50 ° C to 70 ° C for 5 to 30 minutes.
  • untreated cells use a culture solution or cells collected and washed and kept at 4 for cooling. The activity is measured by using a heat-treated or untreated cell, bringing a nitrile compound as a substrate into contact with the cell, converting the cell into a corresponding amide compound, and quantifying the amide compound.
  • any -tolyl compound can be used as long as nitrile hydratase reacts, but acrylonitrile is preferred.
  • the reaction conditions for example, the substrate concentration is 2.5%, the reaction temperature is 10 ° C to 30 ° C, and the reaction time is 10 minutes to 30 minutes. The enzymatic reaction is stopped by adding phosphoric acid, and the formed acrylamide is analyzed by HPLC or gas chromatography.
  • the improved nitrile hydratase of the present invention can be obtained, for example, by modifying the amino acid sequence of nitritole hydratase derived from the strain Mouth dococcus, Mouth mouth, Rhodococus rhodochro s) J′l, and comparing the amino acid sequence with that of the parent strain. It can be obtained by selecting an improved nitrile hydratase having improved thermostability.
  • Examples of the modification method include a method of bringing a mutagenic agent such as hydroxyxylamine or nitrite into contact with and acting on the J1 bacterium, a method of inducing a mutation by irradiation with ultraviolet light, and encoding nitrile hydratase derived from the J1 bacterium.
  • a method of randomly introducing mutations into a gene (hereinafter, nitrile hydratase gene) using PCR can be employed.
  • an improved nitrile hydratase in which asparagine at position 167 of the amino acid sequence of the subunit of wild-type nitrile hydratase (eg, SEQ ID NO: 2) has been replaced with serine has been found.
  • an improved nitrile hydratase having further improved heat resistance is used. Ze was selected. The selection method was performed by selecting mutants (mutant genes) corresponding to the above definition of “thermostability”.
  • the enzymes thus obtained include, in the amino acid sequence of the nitrile hydratase subunit (for example, SEQ ID NO: 2), the 24th fuyunilalanine residue, the 88th iso-leucine residue, the 92nd Glutamic acid residue at position 93, Glutamic acid residue at position 93, Histidine residue at position 96, Glutamic acid residue at position 103, Asparagine residue at No. 167, and Tyrosine residue at position 225 It is a protein having an amino acid sequence in which at least one amino acid residue is substituted with another amino acid residue.
  • the asparagine residue at position 42 In the amino acid sequence of the ⁇ -subunit of nitril hydratase (eg, SEQ ID NO: 4), the asparagine residue at position 42, the alanine residue at position 80, the alanine residue at position 118, and the alanine residue at position 132 It is a protein having an amino acid sequence in which at least one amino acid residue among the aspartic acid residues is substituted with another amino acid residue.
  • the present invention relates to an amino acid sequence in which the 167th asparagine residue of the wild-type nitrile hydratase subunit (SEQ ID NO: 2) is substituted with another amino acid, the / 3 subunit Leucine residue at position 144, valine residue at position 219 in the amino acid sequence, and valine residue at position 129 and leucine residue at position 196 in the amino acid sequence of the ⁇ -subunit (SEQ ID NO: 4). It is a protein having an amino acid sequence in which at least one amino acid residue has been substituted with another amino acid residue and having nitrile hydratase activity.
  • the means for producing the above-mentioned complex mutant may be any method, for example, a method for generating site-specific substitution using a synthetic single-stranded oligonucleotide, a method for converting a DNA fragment containing a plurality of different single mutation sites with a restriction enzyme. It can be created by cutting and joining.
  • one or more amino acids may be substituted, deleted and / or added in addition to the above mutations.
  • the amino acid sequence of the subunit of wild-type nitrile hydratase IJ for example, SEQ ID NO: 2
  • the ⁇ subunit of wild-type nitrile hydratase One or two amino acid sequences (eg, SEQ ID NO: 4), or a gene encoding a subunit of wild-type nitrile hydratase (eg, SEQ ID NO: 3), or a gene encoding a subunit of wild-type nitrile rehydratase (eg, For example, one or two amino acid residues of the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 3) may be substituted with another amino acid residue.
  • the embodiment of the mutation can be described using the one-letter code of amino acid and the amino acid number of the amino acid sequence of ⁇ or ⁇ subunit.
  • the notation F24L means "a mutation in which the amino acid at position 24 in the amino acid sequence of the subunit (for example, SEQ ID NO: 2) is substituted with phenylalanine for leucine”.
  • the notation N0167S means "a mutation in which the amino acid at position 167 of the amino acid sequence of the subunit (for example, SEQ ID NO: 2) is substituted with asparagine for serine”. Mutation and substitution modes (1)>
  • This embodiment reduces at least one amino acid residue of the ct or ⁇ -subunit of nitrile hydratase.
  • the base substitution at the time of producing the above amino acid substitution I is as follows.
  • the gene DNAs encoding the ⁇ -subunit and the ⁇ - subunit will be described with reference to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively, as examples.
  • TTC single mutation 1: In the SEQ ID NO: 1, the 70th to 72nd bases, "TTC", are replaced with CTT, CTC, CTA or CTG bases. In particular, it is preferable to replace the 70th T with C (TTC ⁇ CTC).
  • Single mutation 2 The nucleotide sequence at positions 262 to 264 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with TTT or TTC. In particular, it is preferable to replace the 2nd A with T (ATC ⁇ TTC).
  • Univariate # 3 The base sequence at positions 274 to 276 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with AAA or AAG. In particular, it is preferable to substitute G at position 274 with A (GAA ⁇ AAA).
  • Single mutation 4 The nucleotide sequence "GAG" at positions 277 to 279 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with GGG, GGC, GGA or GGT. In particular, it is preferable to replace the 278nd A with G (GAG ⁇ GGG).
  • Single mutation 5 The base sequence at positions 286 to 288 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with CGC, CGG, CGA or CGT. In particular, it is preferable to replace the 287th A with G (CAC-CGC).
  • Single mutation 6 The base sequence at positions 307 to 309 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 "GAG" is replaced with 'GAC or GAT. In particular, it is preferable to replace the 309th G with (GAG ⁇ GAT).
  • Single mutation 7 The base sequence IJ “AAC” at the 499-501st position in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with AGC or AGT. In particular, the 500th A to G Substitution (AAC ⁇ AGC) is preferred.
  • Single mutation 8 Substituting CAC or CAT for the base sequence IJ “TAC” at position 673-675 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In particular, it is preferable to replace T at the 673rd position with C (TAC ⁇ CAC).
  • Single mutation 9 Substitution IJ “AAC” of the 124th to 126th base in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with GAC or GAT. In particular, it is preferable to substitute A at position 124 with G (AAC-GAC).
  • Single mutation 10 The 238th to 240th base in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the GCC is replaced with ACC, ACG, ACA or ACT.
  • Single mutation 11 The nucleotide sequence at positions 352-354 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 "GCCJ is substituted with GTC, GTG, GTA or GTT. (GCC-GTC) is preferred.
  • Single mutation 12 The nucleotide sequence "GAC" at the 394th to 396th positions in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with AAC or AAT. In particular, it is preferable to replace the 394th G with A (GAC ⁇ AAC).
  • substitution of the nucleotide sequence of the compound mutations 1 to 4 is the same as the substitution of the single mutation.
  • At least one amino acid sequence of the amino acid sequence of the nitrile hydratase that mutates at least two amino acid sequences of the / 3 subunit of the nitrile hydratase and at least one amino acid sequence of the ⁇ subunit are reduced. Both are modes in which one mutation is performed.
  • 167S In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence at position 499 to 501 is substituted with AGC or AGT. In particular, it is preferable to replace the 50th A with G (AAC ⁇ AGC).
  • LIS144H Replaces the 43rd to 43rd 2nd base sequence IJ “CTC” in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 with CAC or CAT. In particular, it is preferable to replace the 43rd T with A (CTC ⁇ CAC).
  • V 219A The nucleotide sequence at the 655-657 position in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • G “GTC” is replaced with GCT, GCC, GCA or GCG.
  • GTC-GCC the nucleotide sequence at the 655-657 position in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • G “GTC” is replaced with GCT, GCC, GCA or GCG.
  • GTC-GCC the C at the 656th (GTC-GCC).
  • V a 129A The base sequence at position 385-187 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is replaced with GCT, GCC, GCA or GCG. In particular, it is preferable to replace the 386th T with C (GTG ⁇ GCG).
  • La 196P In the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, the 58th to 58th base sequence IJ “CTC” is replaced with CCT, CCC, CCA or CCG. In particular, it is preferable to replace the 587th T with C (CTC ⁇ CCC).
  • At least the 26th or 48th amino acid residue in the amino acid sequence of the subunit of nitrinolehydratase is replaced with another amino acid.
  • the present invention is to provide a nitrile hydrator having improved reactivity with aromatic nitrile and improved Z or heat resistance.
  • "Two Torinorehi Dorataze” is an enzyme that catalyzes the hydration reaction that converts the amino-de-compound corresponding to a nitrile compound (RCN + 2H 2 0 ⁇ RCONH 2).
  • nitrile hydratase having improved reactivity with aromatic nitrile means one whose specific activity with respect to 3-cyanopyridine is improved by 1.5 times or more.
  • the selection method is to select a mutant (mutated gene) that meets the definition of “mutation” above. Unplug.
  • the enzyme having improved reactivity with aromatic nitriles obtained by the above-mentioned method includes, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 subunit), the 48th tryptophan residue was substituted with another amino acid residue. It is a protein having an amino acid sequence.
  • the enzyme having improved heat resistance is a protein having the amino acid sequence in which the histidine residue at position 26 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with another amino acid.
  • the notation W 48; R means “a mutation in which the amino acid residue at position 48 of the subunit (SEQ ID NO: 1) is replaced with tryptophan by arginine”.
  • W48R In SEQ ID NO: 1, bases are substituted so that the 142 to 144th base sequence "TGG" becomes CGT, CGC, CGA, CGG, AGA or AGG. 'Especially, it is preferable to replace the 142nd T with C (TGG ⁇ CGG).
  • H26R In SEQ ID NO: 1, bases are substituted so that the base sequence "CAC" at positions 76 to 78 becomes CGT, CGC, CGA, CGG, AGA or AGG. In particular, it is preferable to replace A at position 77 with G (CAC-CGC).
  • a mutant enzyme having both properties can be created. it can.
  • Any method can be used to generate a composite mutant, for example, a method of generating site-specific substitution using a synthetic single-stranded oligonucleotide, or a method of cutting a DNA fragment containing a plurality of different single mutation sites with a restriction enzyme. It can be created by the method of linking.
  • deletion, substitution, addition, etc. of the amino acid sequence may occur in addition to the above mutation.
  • one or several, for example 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acid residues of the amino acid sequence of the embodiment in which the above mutation has been made may be deleted.
  • one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, amino acid residues may be added to the amino acid sequence of the above-described embodiment.
  • One or several, for example 1 to 10, preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence may be replaced by other amino acid residues.
  • Preparation of the nitrile hydratase gene into which the single mutation or the compound mutation has been introduced is performed by a known method such as the Kimkel method or the Gapped duplex method, for example, a kit for mutagenesis using a site-directed mutagenesis method, for example, Using QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Utan-K MutarrSuper Express Km, etc .: manufactured by Takara Nano) [Nucleic. Acid. Res. 10, 6487 (1982), Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • a known method such as the Kimkel method or the Gapped duplex method
  • a kit for mutagenesis using a site-directed mutagenesis method for example, Using QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit
  • a DNA consisting of a base sequence complementary to a base sequence in which a mutation is introduced into the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 and a DNA that can hybridize under stringent conditions are also available. Included in the gene DNA of the invention.
  • Stringent conditions include, for example, a salt (sodium) concentration of 150-900 mM, a temperature of 55-75 ° C, preferably a salt (sodium) concentration of 250-450 ° C, and a temperature of 68 ° C. Condition.
  • the improved nitrile hydratase of the present invention further has properties as amide compound resistance.
  • amide compound resistance means that the activity of ditrinorehydratase can be maintained in the presence of an amide compound as compared to ditrinorehydratase derived from other wild strains.
  • the amide compound to which the mutant ditrinolehydratase of the present invention is resistant is not particularly limited, but, for example, an amide compound represented by the following chemical formula:
  • R is a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, or a substituted or unsubstituted saturated or (Means an unsaturated heterocyclic group)
  • the amide compound resistance can be determined, for example, by culturing a transformant having the improved nitrile hydratase of the present invention or a nitrile hydratase isolated from the transformant with an amide compound such as acrylamide (In the presence of a high concentration (for example, 30 to 50%), it can be evaluated by analyzing the consumption amount or consumption rate of a nitrile compound such as acrylonitrile as a substrate. And the parent strain-derived two-linolehi draughter For example, when the consumption amount or the consumption rate exceeds 1.1 times, it can be evaluated that the amide compound is resistant.
  • Nitrile hydratase must be incorporated into a vector so that it can be expressed in the transformed or transduced host organism.
  • vectors include plasmid DNA, bacteriophage DNA, retrotransposon DNA, and artificial chromosomal DNA.
  • bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used.
  • an expression vector having high expression efficiency for example, an expression vector PKK233-2 (manufactured by Amersham Bioscience) having a trc promoter, or pTrc99A (manufactured by Amersham Bioscience). Replying to
  • the vector can be ligated with the promoter of the nitrile hydratase gene, a terminator, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selectable marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like.
  • the selection marker include a kanamycin resistance gene, a dihydrofolate reducing enzyme gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
  • Escherichia coli includes, for example, Escherichia coli, Esche « ⁇ ) and the like
  • oral dococcus oi / ococcws include, for example, oral dococcus Mouth dococca Mouth dococuff, ⁇ Mouth dokurous (ihodococcus rhodoc rous) 9140 and the like.
  • the method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions, an electroporation method and the like can be mentioned.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Nsaccharomyces ponvis (Scmzosaccharo yces pombe) Pichfu nostrils ⁇ icnm pastoi 'iS)
  • the method for introducing the recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electoral poration method, a subeloplast method, and a lithium acetate method.
  • monkey cells such as COS-7, Vero, CHO cells, mouse L cells, rat GH3, and human FL cells are used.
  • Examples of a method for introducing the recombinant vector into animal cells include an electoral port method, a calcium phosphate method, a riboxoxy method, and the like.
  • Sf9 cells When insect cells are used as hosts, Sf9 cells, Sf21 cells and the like are used.
  • a method for introducing a recombinant vector into an insect cell for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an Electoporation method and the like are used.
  • tobacco BY-.2 cells and the like are exemplified, but not limited thereto.
  • a method for introducing a recombinant vector into a plant cell for example, an agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method, an electroporation method, or the like is used. Production of Kunitril Hydratase>
  • the nitrile hydratase of the present invention can be obtained by culturing a transformant (introduced) containing the nitrile hydratase gene prepared by the above method, and collecting from the culture.
  • culture means any of a culture supernatant, a cultured cell or a cultured cell, or a cell or a disrupted cell.
  • the method for culturing the transformed (introduced) body of the present invention comprises culturing the host exemplified below. This is performed according to the usual method used for
  • the culture medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as hosts contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be used by the microorganisms, and efficiently cultivates the transformants.
  • the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch; organic acids such as acetic acid and propionic acid; and alcohols such as ethanol and propanol.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts or other nitrogen-containing compounds, as well as paptone, meat extract, corn steep liquor, etc. Is mentioned.
  • the inorganic substance include first phosphoric acid phosphate, second phosphoric acid phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like. Cultivation is usually performed at 30 to 40 ° C under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During the culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed.
  • the medium may be supplemented with cobalt or iron ions, which are prosthetic metals of nitrile hydratase, and nitriles or amides, which may be enzymes inducing enzymes.
  • cobalt or iron ions which are prosthetic metals of nitrile hydratase, and nitriles or amides, which may be enzymes inducing enzymes.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactoside
  • IPTG or the like can be added to the medium.
  • II indoleacetic acid
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host a commonly used RPMI1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to such a medium can be used. Culturing is usually, 5% C0 2 presence 1 at 37 ° C for Do ⁇ 30 days. During the culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed.
  • a method for collecting nitrile hydratase from a culture is to repeatedly sonicate, freeze-thaw, homogenize, etc., and disrupt the cells or cells to obtain the target protein.
  • the cultivation can be performed by using a usual plant culture medium, for example, MS basic medium, LS basic medium and the like.
  • a usual plant culture medium for example, MS basic medium, LS basic medium and the like.
  • the culture method any of the usual solid culture method and liquid culture method can be adopted.
  • nitrile hydratase In the method of collecting nitrile hydratase from the culture, first, cells are destroyed by cell lysis treatment using an enzyme such as cellulase or pectinase, ultrasonic crushing treatment, and grinding treatment. Next, insolubles are removed by filtration or centrifugation to obtain a crude protein solution. To purify the protein of the present invention from the above crude solution, salting out, various types of chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.), SDS polyacrylamide gel electrophoresis, etc. are used alone. Or in combination as appropriate.
  • various types of chromatography eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis etc.
  • the cells or cells are removed by centrifugation or the like using the culture solution as it is. Then, use common biochemical methods used for the isolation and purification of proteins, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography alone or in combination as appropriate.
  • the protein of the present invention can be isolated and purified from the culture.
  • a cell-free protein synthesis system is adopted from a gene DNA encoding the mutant nitrile hydratase of the present invention or the above-mentioned vector without using living cells at all. It is also possible to collect proteins.
  • a cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes proteins in an artificial container such as a test tube using a cell extract.For example, it reads niRNA information and synthesizes proteins on ribosomes. is there.
  • the cell-free protein synthesis system used in the present invention also includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using a DNA as a cycl type. I will.
  • an extract derived from eukaryotic cells or prokaryotic cells for example, an extract such as wheat germ, ephedra reticulocytes, mouse L-cells, HeLa cells, CHO cells, budding yeast, and E. coli. Can be. These cell extracts may be concentrated or non-concentrated.
  • the genetic information encoded on DNA is transcribed into mRNA, which is further translated and converted into protein.
  • mRNA messenger RNA
  • the cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation, or the like.
  • cell-free protein synthesis can also be performed using a commercially available kit.
  • kits include, for example, reagent kits PROTEIOSTM (Toyobo), TNTTM System (Promega), PG-Mate TM (Toyobo), RTS (Roche Diagnostics) of a synthesizer, and the like.
  • Mutant nitrile hydratase obtained by cell-free protein synthesis can be purified by appropriate selection of chromatography. The isolation and purification of the mutant nitrile hydratase can be confirmed by SDS-PAGE, etc., and the activity can be measured by measuring the conversion of nitrile compounds to amide compounds. Noh.
  • Biocatalysts for converting nitrile compounds to corresponding amide compounds.
  • the nitrile compound used as a substrate for the conversion reaction is appropriately selected depending on the substrate specificity of the biocatalyst.
  • the preferred substrate is acrylonitrile.
  • the use form and reaction mode of the biocatalyst are appropriately selected depending on the type of the biocatalyst and the like.
  • the above-mentioned culture and purified enzyme may be used as they are, or they may be held on a suitable carrier and used as an immobilized enzyme.
  • Rhodococcus rhodochrous J'l strain was designated as FERM BP'1478 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), at the Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki Prefecture, Japan) 6) (Original deposit date: September 18, 1987).
  • Rhodococcus rhodochrous Rhodococcus rhodochrous
  • MYK medium 0.5% polypeptone, 0,3% pact yeast extract, 0.3% bacto malt extract, 1 o / 0 glucose, ⁇ ⁇ 2% K 2 HP0 4, 0.2% KH 2 P0 4, pH7.0
  • the cells were collected, and the collected cells were suspended in 4 ml of Saline-EDTA solution (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)). The suspension was added with 8 mg of lysozyme, shaken at 37 ° C for 1-2 hours, and then frozen at -20 ° C.
  • Saline-EDTA solution 0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)
  • is-SDS solution 1% SDS, 0.1 mM NaCK 0.1M TVis-HCl (pH 9.0)
  • proteinase K final concentration O. lmg
  • the DNA was dissolved in 3 ml of TE buffer, and the ribonuclease A solution (100 ° C, (Heat-treated for 15 minutes) to a concentration of 10 ⁇ g / ml and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Furthermore, proteinase K was added, and the mixture was shaken at 37 C for 30 minutes. Then, an equal amount of TE-saturated phenol was added, and the mixture was centrifuged to separate the upper and lower layers.
  • wild-type nitrinolehydratase gene was amplified by normal PCR for use as a control for thermostability evaluation.
  • PCR was performed under the following reaction solution composition and reaction conditions.
  • JH1-02 GGAATGAGGCCATGGATGGTATCC (SEQ ID NO: 5)
  • NH-17 GCGTAAGCTTCCGCGAGATCAGTATCCACCG (SEQ ID NO: 6) PO was cycled 30 times (94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes) using Thermalcycler personal (Takara Shuzo).
  • the reaction solution 51 was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, The amplified fragment was detected.
  • the reaction solution was purified using a GFX column (Amersham Bioscience) and cut with restriction enzymes and H Kail.
  • the restriction enzyme-treated PCR product was electrophoresed on a 0.7% agarose gel, and a band around 3 kb was recovered.
  • the recovered PCR product was ligated to the vector (Ncol-Hindlll site of pTi'c99A) using Ligation Kit (Takara Shuzo), and JM109 was transformed.
  • Plasmid pJH601 is an expression plasmid for wild-type nitrile hydratase, and has the receipt number FERM ABP-103 14 as the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba Ito, Ibaraki Prefecture, Japan). Deposited at Chome No. 1 1 Chuo No. 6) (Original deposit date: December 26, 2002).
  • TRC-02 GGAATTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC (SEQ ID NO: 7)
  • TRC-03 GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC (SEQ ID NO: 8)
  • PCR was performed using Theraialcyclei 'personal (Takara Shuzo) for 30 cycles (94 ° C for 30 seconds, 65. C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes).
  • the JM109 transformant containing the mutant nitrile hydratase gene and the JMl09 / pJH601 obtained in the above step (3) were placed in a 96-well deep plate containing 1 ml of LB-Amp medium (ImM IPTG, containing 5 ⁇ g / ml C0CI2). ⁇ Each well was inoculated into a plate and liquid-cultured at 37 ° C for 12 hours. The obtained culture was subjected to a heat treatment at a temperature of 55 ° C. for 30 minutes, and the residual nitrile hydratase activity was measured.
  • the activity was measured using 50 mM phosphate buffer pH7.7 containing 5% acrylonitrile. An equivalent amount of the suspension was added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by adding an equal volume of 0.1 M phosphoric acid, the cells were removed by centrifugation, the supernatant was subjected to HPLC, and the concentration of acrylamide formed was analyzed (WAKOSIL 5C8 (Wako Pure Chemical), 5 mM phosphoric acid). 10% acetonitrile with acid, mobile phase flow rate lml / min and ultraviolet absorption detector wavelength 260nm). As a comparative control, those that were kept at 4 ° C without heat treatment were used as untreated bacteria to determine the residual activity.
  • JM109 was re-transformed using the plasmid p3 obtained in Example 1 (JM109 / p3), and the obtained colonies were grown at 37 ° (:, ⁇ ⁇ ) on an LB medium (containing ampicillin, IPTG, and cobalt). The cells were collected by centrifugation and washed twice with 50 ⁇ phosphate buffer to obtain a cell suspension.
  • 0.5 ml of the obtained cell suspension was placed in a test tube, kept warm in a water bath at 50 ° (: 6060 ° C.) for 5 to 20 minutes, and cooled in ice.
  • the activity of the cells was measured by the method of Example 1 (4). .
  • the wild-type enzyme maintains 6% of the residual activity after heat treatment at 60 ° C for 5 minutes, while the improved enzyme retains almost 100% of the remaining activity. Was admitted.
  • Example 1 The properties of the improved enzyme obtained in Example 1 were confirmed for the recombinant Rhodococcus.
  • a plasmid for oral dococcus introduction having a p3 mutation was prepared by the following method. Mutation was introduced using a site-directed mutagenesis method, using a commercially available kit: QikChange XL Site-Dii-ected Mutagenesis Kit (Stratagene 1 soil). The experiment followed the operation manual. PSJ034 was used as a type I plasmid for introducing a mutation.
  • pSJ034 is a plasmid that expresses nitrile hydratase in oral dococcus, and pSJ034 is disclosed by DSJ023 in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-337185. It was prepared by the method shown in the report.
  • PSJ023 has been deposited as a transformant ⁇ R. rliodochrous ATCC12674 / pSJ023J at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki Pref. BP-6232) (Original deposit date: March 4, 1997).
  • NHM-R gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (Rooster system IJ ⁇ 10)
  • the PCR for introducing the mutation was performed under the following conditions using GeneArap9700 (PE Bioscience) at 95 ° C for 1 minute, (95 ° C for 50 seconds, 60 ° C for 50 seconds, 68 ° C for 20 minutes) X 18 The cycle was performed at 68 ° C for 20 minutes.
  • the reaction mixture was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to detect an amplified fragment of about llkb. After confirming the amplified fragment, ⁇ of Dpnl (supplied with the kit) was added to the PCR reaction solution and reacted at 37 ° C for 1 hour to remove the cyclized DNA.
  • transformation was performed using XL1OG0LD ultracompetent cell (attached to the kit).
  • 2 Mix the Dpnl-treated PCR reaction solution in step 1 with the combi- nation cell of 451, incubate at 4 ° C for 30 minutes, heat shock at 42 ° C for 30 seconds, and add 0.5 ml of ⁇ + medium (1 % Nyuzeta Amin, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl 2 , 12.5mMMgS0 4, 0.4% glucose, pH 7.5) was added for an additional hour at 37 ° C for Cultured.
  • the culture 2501 was plated on an LB plate (1% NaCl, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 2% agar, 50 mg / L ampicillin) and cultured at 37 ° C for 1 day.
  • the cells of the logarithmic growth phase of Mouth dococcus rhodochrous ATCC 1267 were collected by centrifugation, washed three times with ice-cold sterile water, and suspended in sterile water.
  • the plasmid p3R11 prepared in (1) and 10 ⁇ l of the cell suspension were mixed and cooled on ice.
  • a suspension of DNA and cells was placed in a cuvette, and subjected to electric pulse treatment at 2.0 KV, 200 OHMS using a gene transfer device Gene Pulser (BIO RAD).
  • MYK medium (0.5% polypeptone, 0.3% Bacto-East extract, 0.3% Bacto-malt extract, 0.2% K 2 HP0 4, 0.2% ⁇ 2 ⁇ 4) 500 ⁇ 1 , and the mixture was allowed to stand 30 ° C, 5 hours. Then, it was spread on MYK agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and cultured at 30 ° C. for 3 days. Inoculate 10 ml of the MYK medium (containing 50 g / ml kanamycin) with the oral recombinant Dococcus sp.
  • the main culture was performed in 100 ml of MYK medium (containing 50 g / ml kanamycin, 5 ⁇ g / ml CoCl 2 and 0.1% urea), inoculated with 1% from the preculture, and cultured at 30 ° C for 96 hours.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with lOOniM phosphate buffer (pH 8.0), and finally suspended in a small amount of buffer.
  • the heat resistance was examined using the obtained recombinant mouth dococcus.
  • Field as comparison ATCCl2674 / pSJ034 having a raw form of double-dose reductase was prepared.
  • ATCCl2674 / pSJ034 maintained only 4% of the residual activity after heat treatment at 70 ° C for 10 minutes
  • ATCC 12674 / p3R retained 46% of the residual activity, which was an improvement. It was confirmed that the heat resistance was improved by the type enzyme.
  • the 93rd amino acid sequence of the ⁇ -subunit was selected as the site to introduce the mutation, and two primers for introducing the mutation were synthesized.
  • the underlined part indicates the mutation introduction site.
  • 93RM-F caagatcatcaccgaagaaNNScgaaagcaccgtgtgcaag (Rooster system
  • 93RM-R cttgcacacggtgctttcgSNNttcttcggtgatgatcttg (SEQ ID NO: 12)
  • a + T + G + CS G + C PCR was performed using GeneAmp9700 (PE Biosciences) at 95 ° C for 1 minute under the following conditions (95 ° C for 50 seconds, 60 ° C for 50 seconds, 68 ° C for 14 minutes) X 18 cycles, 68 ° C for 7 minutes The reaction was performed.
  • the reaction mixture 10 // 1 was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to detect an amplified fragment of about 6 kb. After confirming the amplified fragment, 1 / ⁇ of Dpnl (supplied with the kit) was added to the PCR reaction solution, and reacted at 37 ° C for 1 hour to remove type I DNA. Next, transformation was performed using XL10-GOLD ultraconpetent cell (supplied with the kit). 42. Mix the Dpnl-treated PCR reaction solution from above with 45 ⁇ l of the competent cell and incubate at 4 ° C for 30 minutes.
  • NZY + medium 1% NZ Amin, 0.'5 ⁇ / ⁇ yeast extract, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl2, 12.5mMMgS0 4, 0.4% glucose, ⁇ 7 ⁇ 5
  • 0.5 ml of NZY + medium 1% NZ Amin, 0.'5 ⁇ / ⁇ yeast extract, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl2, 12.5mMMgS0 4, 0.4% glucose, ⁇ 7 ⁇ 5
  • LB plate 1% NaCl, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 2% agar, 50 mg / L ampicillin
  • the colony obtained in the above step (1) and XL10 / pJH601 were inoculated into a 96-well deep-well plate containing 1 ml of LB-Amp medium (ImM IPTG, containing 5 ⁇ g / ml C0CI2) at 37 ° C. C. Liquid culture was performed for 12 hours. The obtained culture was subjected to a heat treatment at a temperature of 55 ° C. for 30 minutes, and the residual nitrile hydratase activity was measured.
  • the activity was measured in the same manner as in Example 1 (4).
  • the residual activity was determined by treating the untreated bacteria with heat treatment. Those having higher residual activities than the control were further subjected to nucleotide sequence determination.
  • a random mutation was introduced at amino acid 167 of the submit.
  • Example 4 The same operation as in Example 4 was performed except for changing two kinds of primers for introducing a mutation.
  • the underlined part indicates a mutation introduction site.
  • Table 5 shows the results.
  • IGTRM-e 1 gtgcccgaaatatgtgcggNNSaagatcggggaaatcgtcer (distribution ij number " ⁇ 13)
  • Mouth dococcus rhodochrous M8 strain was cultured in the same manner as in Example 1, and chromosomal DNA was prepared from the cultured cells. Next, PCR was performed under the following conditions to expand the nitrinolehydratase gene.
  • Rhodococcus rhodochrous M8 strain can be easily obtained from Russian Strain Center IBFM (VKPM S-926). ''
  • PCR was performed using Theraialcycler personal (Takara Shuzo) for 30 cycles (94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes).
  • reaction solution 51 was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to detect a 1.5 kb amplified fragment (SEQ ID NO: 17).
  • the reaction solution was purified by GFX cohmm (Amersham Biosciences), and cut with restriction enzymes Nco and a.
  • the pen product that had been treated with the restriction enzyme was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis.
  • a band around 5 kb was recovered.
  • the collected PCR product was ligated to a vector (HHi;? IflII site of pTrc99A) using a Ligation Kit (Takara Shuzo) and transformed into JM109.
  • Several clones from the obtained transformant colonies were inoculated into 1.5 ml of LB-Amp medium and cultured with shaking at 37 ° C for 12 hours. After the culture, the culture was collected by centrifugation. Plasmid DNA was extracted from the collected cells by using Flexi Prep (manufactured by Amersham Bioscience).
  • the obtained plasmid DNA was digested with restriction enzymes Nco and ndlll, electrophoresed on a 0.7% agarose gel, and a clone in which the nitrile hydratase gene fragment (1.5 kb) was correctly ligated was selected. ). JM109 was transformed using pMH301 (JM109 / pMH301).
  • the site-directed mutagenesis was performed according to the method described in Example 3. Third, we introduced mutations. The underlined part of the primer base sequence indicates the mutation site.
  • NHM-F gatcatcaccgaagaagggcgaaagcaccgtgtgc (Rooster system number 9)
  • NHM-R gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (SEQ ID NO: 10)
  • the reaction mixture was changed to 0.7 ° //.
  • the sample was subjected to agarose gel electrophoresis, and an amplified fragment of about 5 kb was detected.
  • Dpnl supplied with the kit
  • Dpnl was added to the PCR reaction solution, and reacted at 37 ° C for 1 hour to remove the cyclized DNA.
  • transformation was performed using XL10-GOLD ultracompetent cell (supplied with the kit).
  • a 2 il Dpnl-treated PCR reaction solution and 451 competent cells were mixed, incubated at 4 ° C for 30 minutes, and heat-shocked at 42 ° C for 30 seconds.
  • NZY + medium 1% NZ Amin, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 12.5mM MgCl 2 , 12.5mMMgS0 4, 0.4% glucose, pH 7.5
  • the culture 2501 was plated on an LB plate (1% NaCL 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 2% agar, 50 mg / L ampicillin) and cultured at 37 ° C for 1 day.
  • a mutation was introduced at position 167 of the submit using the following primers.
  • the underlined part indicates a mutation introduction site.
  • XLlO / pMH404XL10-Gold / pMH508 Contact good beauty XLlO / p H301 resulting et a in step (2) was inoculated into LB'Amp medium (ImM IPTG, 5 ⁇ g / mi CoCi 2 containing) 10mi, 37 ° C For 12 hours. After the obtained culture was subjected to a heat treatment at a temperature of 55 ° C. for 30 minutes, the residual nitrile hydratase activity was measured.
  • Example 6 The activity was measured in the same manner as in Example 1 (4). As a control, the residual activity was determined for each untreated bacterium that had been kept at 4 ° C without heat treatment. Table 6 shows the results. Table 6
  • mutagenesis was performed on a nitrile hydratase gene derived from Mouth dococcus' Mouth Dokuguchius J-1 strain. Mutagenesis was carried out by utilizing substitution of ning groups due to erroneous nucleotide incorporation in PCR. Plasmid p52 (Fig. 4), in which the amino acid at position 167 of the wild-type submittal was mutated from asparagine to serine, was used.
  • the POR for introducing random mutation into the trisolehydratase gene was performed under the following reaction mixture composition and reaction conditions.
  • TRC-02 ggaattcgtataatgtgtggaattgtgagc (SEQ ID NO: 7)
  • TRC-03 ggctgaaaatcttctctcatccgcc (SEQ ID NO: 8)
  • PCR was performed using GeneAmp9700 (PE Bioscience) for 30 cycles (94. C for 30 seconds, 65. C for 30 seconds, 72 ° C for 3 minutes).
  • the reaction solution 51 was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to detect a 3 kb amplified fragment.
  • the reaction solution was purified using a GFX column (Amersham Bioscience), and cut with restriction enzymes V and I / II / III.
  • the restriction enzyme-treated PCR product was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and the band around 3 Kb was used. Was recovered.
  • the collected PCR product was ligated to a vector (Ncol-Hhidll site of pTrc99A) using Ligation Kit (Takara Shuzo). JM109 was transformed with this ligation product.
  • thermostable nitrile hydratase Screening of thermostable nitrile hydratase and identification of mutation sites
  • Residual nitrile hydratase activity was measured using the JM109 transformant containing the mutant ditolyl hydratase gene and the JM 109 / pJH 601 as a wild-type nitrino rehydratase producing strain obtained in the above step (1) .
  • the heat resistance was evaluated in the same manner as in Example 1 (4) except that only the processing temperature was changed to 60 ° (:, 20 minutes).
  • the recombinant was cultured to recover the plasmid, which was named plasmid pA077.
  • the nucleotide sequence of plasmid pA077 was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using BeckmanCEQ : 2000XL.
  • the amino acid sequence encoded by the mutated gene sequence of plasmid pA077 had mutations at five positions: N167S, L144H, V219A, Va129A, and Lal% P.
  • a mutation was introduced into type II plasmid p52 (FIG. 4) based on the information on the mutation site obtained in (2) of Example 7.
  • the site-directed mutagenesis was used for mutagenesis, and a commercially available kit: QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) was used. The experiment followed the operation manual.
  • ⁇ 144-F ggagccgagtttctctcacggtgacaagatc (Rooster system No. 20)
  • the reaction mixture ( ⁇ ) was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to detect an amplified fragment of about llkb. After confirming the amplified fragment, 1 w 1 of Dpnl (supplied with the kit) was added to the PCR reaction solution and reacted at 37 ° C. for 1 hour to remove type I plasmid.
  • transformation was performed using XL10-GOLDulti'acompetent cells (supplied with the kit). 21.
  • the Dpnl-treated PCR reaction mixture of 1 and 45 ⁇ l of the competent cells were mixed, incubated at 4 ° C for 30 minutes, and heat-shocked at 42 ° C for 30 seconds.
  • 0.5 ml of NZY + medium 1% NZamine, 0.5% yeast extract, 0.5 ° /. NaCl, 12.5 mM MgCl 2 , 12.5mMMgS0 4, 0.4% glucose, ⁇ 7 ⁇ 5
  • the culture 2501 was plated on an LB plate (1% NaCl, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 2% agar, 50 mg / L ampicillin) and cultured at 37 ° C for 1 day.
  • ⁇ 219-F gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (Rooster system ij number ⁇ 3 ⁇ 4 "22)
  • the obtained plasmids were named pAB002 (N / 3167S, V219A), pAB003 (NS167S, Va129A), and pAB004 ( ⁇ 167S, L / 3144H, V
  • Plasmids containing the mutant nitrile hydratase gene obtained in (1) were each transformed into E. coli JM109 to obtain recombinant bacteria.
  • This recombinant bacterium was inoculated into 1.5 ml of LB-Amp medium (containing lmM IPTG and Szg / ml CoC), and liquid-cultured at 37 ° C for 12 hours.
  • the obtained culture solution was subjected to a heat treatment at a temperature of 60 ° C. for 20 minutes, and then the residual nitrile hydratase activity was measured. The activity was measured in the same manner as in Example 1, (4) '.
  • Table 8 shows the results of the residual activity. Table 8
  • a plasmid for oral dococcus ((. OCOCC) bacteria having a mutation (N 167S) at position 167 of the i3 subunit was prepared by the following method. Mutation was introduced using a site-directed mutagenesis method, and a commercially available kit: QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratageiie) was used. The experiment followed the operation manual. PSJ034 was used as a type I plasmid for introducing a mutation.
  • ⁇ 167-F cccgaaatatgtgcggagcaagatcggggaaatcg (Toriki system II number 18)
  • ⁇ 167-R cgatttccccgatcttgctccgcacatatttcggg (Toriki system number 19)
  • ⁇ 144-F gga gccgagtttctctcacggtgacaa gate (Rooster U number 20)
  • ⁇ 144-R gatcttgtcaccgtgagagaaactcggctcc (Rooster U number 21)
  • ⁇ 219-F gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (Rooster U number " ⁇ 22)
  • gagtaccggtcccgagcggtagcggaccctcg (Rooster system ij number 24)
  • the obtained plasmids were named pAROOl (N / 3167S, 144H), pAR002 (N ⁇ 167S, V ⁇ 219A), and pAR003 (N ⁇ 167S, Va 129A), respectively. Furthermore, using the obtained plasmid pAROOl as a type I plasmid, a mutation of V ⁇ 219A was introduced using the same method as described above. The obtained plasmid was named pAR004 (N ⁇ 167S, L ⁇ 144H, 219A). '
  • the cells in the logarithmic growth phase of Rhodococcus l'hodochl, ATCC 12674 strain were collected by a centrifugal separator, washed three times with ice-cold sterile water, and suspended in sterile water. 1 ⁇ l of the plasmid prepared in (1) and 10 ⁇ l of the cell suspension were mixed and cooled on ice.
  • Example 3 (2) Thereafter, the same operation as in Example 3 (2) was performed. + (3) Evaluation of thermostability of recombinant Rhodococcus (1 ⁇ 2oi ⁇ « ⁇ ci / s) bacteria Heat treatment was carried out using the obtained recombinant Mouth dococcus (? Oi3 ⁇ 4coccus) bacteria in the same manner as in Example 3 (3). The subsequent residual nitrile hydratase activity was examined.
  • Mouth Dococcus hiri iococci / s Mouth Dococcus hiri iococci / s
  • recombinant bacteria are inoculated into MYK medium (containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, 5 ⁇ g / ml CoCl 2 , and 0.1% urea) at 30 ° C.
  • the cells were cultured with shaking for 3 days.
  • the cells were collected by centrifugation, washed with 100 mM phosphate buffer (pH 8.0), and finally suspended in a small amount of buffer.
  • 0.5 ml of the appropriately diluted cell suspension was placed in a test tube, kept warm in a water bath at a temperature of 65 ° C for 30 minutes, and then cooled in ice.
  • the ATCC 12674 / pSJ03 had a residual activity of 31% after heat treatment at 65 ° C for 30 minutes, whereas the ATCC 12674 / pAR001 to pAR004 retained 60% or more of the residual activity. It was confirmed that the heat resistance was improved with tolyl hydratase. '
  • Table 10 shows the percentage (%) of acrylonitrile remaining in the filter.
  • Table 10 Remaining acrylonitrile (%) ''
  • Plasmid Mutation site Remaining amount of 1 'ril (%) AN consumption name 0 hours 0.5 hours 20 hours (%)
  • the improved nitrinolehydratase consumes more acrylonitrile than pSJ034 as a control, the improved nitrile hydratase maintains its activity even in the presence of a high concentration of acrylamide. However, it was found that resistance to acrylamide was high.
  • Rhodococcus rhodochrous Mutations were introduced into M84 red-tolyl hydratase. Site-directed mutagenesis was performed using the plasmid pMH301 ( Figure 17) containing the gene (SEQ ID NO: 17) encoding nitrile hydratase derived from the plasmid used in Rhodococcus rhodochrous M8 strain. Except for 3), the procedure was the same as in Example 6 (2). The obtained plasmids were named pMH508 (iS167S), pMH60i (N / 3167S L ⁇ 144H), pMH602 (N167S, V / 3219A), and pMH603 (N167S, Val29A), respectively.
  • the plasmid was transformed into JM109 to produce a mutated recombinant bacterium.
  • the obtained recombinant bacterium was inoculated into 10 ml of LB-Amp medium (lmM IPTG, containing 5 g / ml CoCl 2 ) and liquid-cultured at 37 ° C. for 12 hours.
  • the obtained culture was subjected to a heat treatment at a temperature of 60 ° C. for 20 minutes, and then the residual nitrile hydratase activity was measured.
  • the activity was measured in the same manner as in Example 7, (2).
  • As a control the residual activity was determined for each untreated bacterium that had been kept cool at 4 ° C without heat treatment. Table 11 shows the results of the remaining activities. Plasmid name Residual activity (%) • Mutation site
  • M8 strain also has improved-tolyl hydratase. It was shown that the heat resistance was improved.
  • the nitrile hydratase gene into which the random mutation was introduced was amplified from pJH601 prepared in Example 1 in the same manner as in Example 1 (3), and a 3 Kb PCR product was recovered. 'The recovered PCR product was inserted into the AoI-fojin site of plasmid pFY529 using a Ligation Kit (Takara Shuzo), and JM109 was transformed to obtain a transformant.
  • the preparation of pFY529 was described in Reference Example 1.
  • the JM109 transformant and the JM109 / p JH601 containing the mutant nitrinolehydratase gene obtained in the above step (1) were measured for nitrile hydratase activity in the same manner as in Example 1 (4).
  • Plasmid for introduction of oral dococcus with a ⁇ mutation was prepared by the following method. Mutation was introduced by the method of Kurosawa et al. (Gene. 1991 15; 102: 67-70). PSJ034 was used as a plasmid for introducing mutations.
  • pSJ034 is a plasmid that expresses nitrile hydratase in Bacillus subtilis, and pSJ034 was prepared from pSJ023 by the method described in JP-A-10-337185. pSJ023 has been deposited as a transformant "R.
  • NR-01 AACGTCGACACCGGTGGTGG (SEQ ID NO: 26)
  • RE1-02 CCTTAGTCAGCTTCTGTCCG (SEQ ID NO: 29)
  • reaction solution 11 was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to confirm the amplified fragment. After that, the remaining reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis under the same conditions to purify the wide fragment.
  • Pfu Turbo DNA Polymerase 1 ⁇ 1 After treatment at 93 ° C for 10 minutes without enzyme, cool to 37 ° C over 1 hour, leave at 37 ° C for 15 minutes, add enzyme for 1 minute, (95 ° C for 60 seconds, 60 ° C for 60 seconds, and 2.C for 10 minutes) The reaction was performed for 30 cycles ⁇ 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained plasmid DNA was digested with restriction enzymes Xbal and e8387I, and electrophoresed on a 0.7% agarose gel, and a clone containing a fragment (about 2 kb) containing the nitrile hydratase gene correctly selected was selected. Finally, the nucleotide sequence of the obtained plasmid was determined, and it was confirmed that the desired mutation was introduced. In this manner, a WiS 48R mutation-introduced plasmid: pAJOOl was obtained.
  • Example 3 (2) Thereafter, the same treatment as in Example 3 (2) was performed to obtain a recombinant Rhodococcus. '
  • LB-Amp medium (lmM IPTG, containing 5 ⁇ g / ml C0CI2) was inoculated into a 96-well deep-well plate containing 1 ml each, and liquid culture was performed at 37 ° C. for 12 hours. The nitrile hydratase activity of the obtained culture was measured.
  • the activity was measured by adding an equal volume of 5% atarilonitrile / 50 mM phosphate buffer, pH 7.7, or 0.5% 3-cyanopyridine / 50 mM phosphate buffer, pH 7.7, to the bacterial solution. The reaction was carried out with C for 30 minutes. After the completion of the reaction, 0.1 M phosphoric acid was added in the same amount as the reaction solution, and the mixture was centrifuged.
  • the supernatant was appropriately diluted, subjected to HPLC, and the concentration of the generated amide was analyzed (acrylamide: WAKOSIL 5C8 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) 10% acetonitrile containing 5 mM phosphoric acid, nicotinamide: WAKOSIL 5C8 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 35% acetonitrile containing 5 mM phosphoric acid).
  • ATCC12674 / pSJ03 having wild-type nitrile hydratase was prepared as a control. The results are shown in Table 12.
  • a mutant nitrile hydratase gene library was prepared in the same manner as described above using pNHMlOl as type III, and screening was performed using heat resistance as an index.
  • Beckman CEQ'2000XL was used.
  • the histidine residue (CAC) at position 26 of the / 3 subunit was changed to an arginine residue (CGC) in addition to the pNHMlOl mutation. .
  • the properties of the mutant 26 R) of the thermostable enzyme obtained in Example 13 were confirmed in a recombinant oral Bacillus bacterium.
  • a plasmid was prepared in the same manner as in Example 12 using NH-25 instead of NH-18 as a mutation primer. This was named pAJ006 and was introduced into Rhodococcus mouth Dokuguchius ATCC12674 strain in the same manner as in Example 12.
  • Rhodococcus recombinant heat resistance was determined in the same manner as in Example 3 (3). Examined. Has wild-type nitrile hydratase as control
  • ATCC12674 / pSJ034 was prepared.
  • 0.5 ml of the obtained cell suspension was placed in a test tube, and kept in a water bath at 65 ° C and 70 for 10 minutes, and then cooled in ice.
  • the residual activity was evaluated by a relative activity, where the initial activity of the sample kept at 4 ° C without heat treatment (untreated section) was set to 100%.
  • ATCCl2674 / pSJ034 had 4% residual activity after heat treatment at 70 ° C for 10 minutes, whereas ATCC 12674 / pAJ006 retained 40% residual activity. The improvement has been recognized.
  • Plasmid pFY529 contains an esterase gene derived from Pseudomo dust fluorescens. This plasmid was prepared from plasmid pFY520 described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-670190 (Fig. 5A, Fig. 5A). 5 B). Plasmid pFY520 was deposited as a transformant “JM109 / pFY520” at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1, Ibaraki Pref., Central No. 6). (FERM BP-1 469) (Original deposit date: September 3, 1987).
  • pFY520 was cleaved with a restriction enzyme
  • ligation was carried out together with an ⁇ -linker to obtain a plasmid in which the ⁇ 3 ⁇ 4eI site of pFY520 was replaced by a Hi2rfriI site.
  • This was named pCFOOl.
  • pCFOOl was digested with the restriction enzyme Hiadll to prepare an approximately 0.8 kb DNA fragment containing the esterase gene. This fragment was inserted into the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ & ⁇ sites of the expression vector pKK233-2 in the same direction as the trc promoter to obtain a plasmid pCF002.
  • pFY529 is equivalent to pCF002 (pKK233-2 vector) in that it has a trc promoter, but is characterized by a higher copy number.
  • the present invention provides an improved nitrile hydratase.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The nitrile hydratase of the present invention is useful for efficiently producing an amide compound because of its high heat resistance and high substrate specificity. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 10 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 11 synthetic DNA
  • n is a, c, g or t (location: 20-21).
  • SEQ ID NO: 12 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 12 n is a, c, g or t (location: 21-22).
  • SEQ ID NO: 14 Synthetic DNA
  • n is a, c, g or t (location: 21-22).
  • SEQ ID NO: 15 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 16 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 18 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 20 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 21 synthetic pNA
  • SEQ ID NO: 22 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 23 synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 24 Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 25 Synthetic DNA SEQ ID NO: 26: synthetic DNA SEQ ID NO: 27: synthetic DNA SEQ ID NO: 28: synthetic DNA SEQ ID NO: 29: synthetic DNA SEQ ID NO: 30: synthetic DNA

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Abstract

本発明は、ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列を改変し、野生型ニトリルヒドラターゼ活性と比較し耐熱性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子DNA、該遺伝子DNAを有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体または形質導入体、該形質転換体または形質導入体の培養物から採取されたニトリルヒドラターゼおよびその製造方法、並びにアミド化合物の製造方法を提供する。

Description

明 細 書 改良型二トリノレヒ ドラターゼ
技術分野
本発明は耐熱性の向上した又は基質特異性が変化した改良型二トリノレヒ ドラ ターゼ活性を有するタンパク質、 該タンパク質をコードする遺伝子 DNA、 該 遺伝子 DNAを含む組換えべクタ一、 該組換えベクターを有する形質転換体ま たは形質導入体、 該形質転換体または形質導入体の培養物から採取された二ト リルヒ ドラターゼおよびその製造方法並びに該培養物又は該処理物を用いたァ ミ ド化合物の製造方法に関する。 背景技術
近年、 二トリル基を水和しァミ ド基に変換する二トリル水和活性を有する酵 素である二トリルヒ ドラターゼが発見され、 該酵素または該酵素を含有する微 生物菌体等を用いて二トリル化合物より対応するアミ ド化合物を製造する方法 が開示されている。 この製造方法は、 従来の化学合成法と比較し、 二トリル化 合物から対応するアミ ド化合物への転化率および選択率が高いことで知られて いる。
二トリルヒ ドラターゼを生産する微生物としては、 例えば、 コリネパクテリ " ゥム Cory neb a cteriuni)鳥、 シユードモナス Pse udomonas)属、 ロ ドコッカス
Figure imgf000002_0001
リゾビゥム (MMzob i i) 、 クレビシエラ U ebsiella、 、 シ ユードノカルディァ ooo^ 's)属等に属する微生物を挙げることができ る。 中でもロ ドコッカス ' ロ ドクロウス Rlwdococcus l'hodoch腿 s、 J'l株は アクリルアミ ドの工業的生産に使用されており、 有用性が実証されている。 ま た、 その菌株が産生する二トリルヒ ドラターゼをコードする遺伝子も明らかと なっている （文献 1参照）。 さらに耐熱性の向上した酵素の取得は、 反応時の酵 素量の削減およびコスト削減等の観点から開発が望まれていた。 .
一方、 自然界に存在する微生物から単離した二トリルヒ ドラターゼやその遺 伝子を利用するのみならず、 二トリルヒ ドラターゼに对して、 活性、 基質特異 性、 Vmax、 Κηι、 熱安定性、 基質に対する安定性、 生成物に対する安定性等を 変化させる目的で二トリルヒ ドラターゼに変異を導入することが試みられてい る （文献 2及び 3参照） 。
文献
1 ： 特許第 3162091号公報
2 ： 国際公開 2004/05699ρ号パンフレッ ト
3 ： 特開 2004-222538号公幸 発明の開示
二トリルヒ ドラターゼは既にアクリルアミ ドの工業的生産に使用されている 酵素であるが、 現在使用されている酵素と比較し、 さらに耐熱性などの性質を 向上させた酵素を取得することは、 酵素反応時におけるコストを削減できる点 で有用である。
そこで、 本発明の目的は、 二トリルヒ ドラターゼをさらに改良し、 より耐熱 性の向上した二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質、 該タンパク質を コードする遺伝子 DNA、 該遺伝子 DNAを有する組換えベクター、 該組換えべ クタ一を有する形質転換体または形質導入体、 該形質転換体または形質導入体 の培養物から採取された二トリルヒ ドラターゼおよびその製造方法並びに該培 養物又は亥処理物を用いたアミ ド化合物の製造方法を提供することにある。
さらに、 口 ドコッカス · 口 ドク口ウス Rhodococcus rhodoclu'ou ) J-l株 の二 トリルヒ ドラターゼはァクリ ロ - トリルを原料とするァクリルアミ ドのェ 業的生産に使用されているが、 ァロマティックな二トリルに対しては反応性が 低く、 ァロマティックな二トリルに対する反応性の高い酵素が望まれていると 共に、 触媒のコス ト削減の観点から、 熱に対して安定で失活しにくい酵素が望 まれていた。 そこで、 本発明は、 二トリルヒ ドラターゼを改良し、 耐熱性の向 上した酵素を取得すること、 及び/又はァロマティックな二トリルに対する反 応性の向上した酵素を取得することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 口 ドコッカス - 口 ドク口ウス 、Rhodococcus rhodoch雇 s、 J-l =|朱由来の二トリノレヒ ドラターゼ のァミノ酸配列において、 少なく とも一つ以上のァミノ酸残基を天然ァミノ酸 のグループから選択される残基で置換することにより、 該酵素の耐熱性が向上 すること、 及び/又はァ マティックな二トリルに対する反応性が向上するこ とを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は以下の通りであ る。
(1) 以下の (a)、 （b)又は (c)の ンパク質。
(a) 野生型二ト リノレヒ ドラターゼの βサブュニッ トのァミノ酸配列におい て、 第 24番目のフヱニルァラニン残基、 第 88番目のイソロイシン残基、 第 92番目のグルタミン酸残基、 第 93番目のグルタミン酸残基、 第 96番 目のヒスチジン残基、 第 103番目のグルタミン酸残基、 第 167番目のァス パラギン残基及び第 225番目のチロシン残基から選ばれる少なく とも 1個 のアミノ酸残基が、 他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性- ト リルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 野生型二トリノレヒ ドラターゼの βサブュニッ トのァミノ酸配列のうち第 167番目のアルギニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 を含み、 かつ、 耐熱性二ト リルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質 (c) 上記 (a)若しくは (b)のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数 個のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(2) 以下の (a)又は (b)のタンパク質。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの αサブュニッ トのアミノ酸配列において、 第 42番目のァスパラギン残基、 第 80番目のァラニン残基、 第 118番目の ァラニン残基及び第 132番目のァスパラギン酸残基から選ばれる少なく と も 1つのァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含 み、 かつ； 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 上記 (a)のタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 つ、 耐熱性 二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質 (3) 以下の (a)、 （b)又は (c)のタンパク質。
(a) 野生型二ト リノレヒ ドラターゼの サブュニッ トのァミノ酸配列のうち第 167番目のアルギニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 において、第 144番目のロイシン残基又は第 219番目のバリン残基が他の アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 野生型二トリノレヒ ド ターゼの βサブュニッ トのァミノ酸配列のうち第 167番目のアルギニン残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列、 及び野生型二トリルヒ ドラターゼの /3サブュニッ 卜のアミノ酸配列におい て第 129番目のバリ ン残基又は第 196番目のロイシン残基が他のアミノ酸 残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラター ゼ活性を有するタンパク質 +
(c) 上記 (a)又は (b)のタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数個の アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、 耐熱性二 ト リノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(4) 以下の (a)又は (b)のタンパク質。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブュニッ トのアミノ酸配列において 第 26番目のヒスチジン残基及び第 48番目のトリプトフアン残基のうち少 なく とも一方のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配 列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 上記 (a)のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸 残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性 二トリノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質 +
(5) 第 26 番目のヒスチジン残基がアルギニン残基に置換された、 （4)記載のタ ンパク質。
(6) 第 48番目'のトリプトファン残基が、 アルギニン、 バリン及びロイシンから 選ばれるいずれかのアミノ酸残基に置換された、 （4)記載のタンパク質。
(7) 上記 (1)〜(6)のいずれか 1項に記載のタンパク質をコードする遺伝子 DNA。
(8) 以下の (a)、 （b)又は (c)の遺伝子 DNA。 (a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの βサブュニッ トをコ一ドする遺伝子の塩 基配列において、 第 70〜72番目、 第 262〜264番目、 第 274〜276番目、 第 277〜279番目、 第 286〜288番目、 第 307〜309番目、 第 499〜501番 目及び第 673〜675番目の塩基のうち少なく とも 1個の塩基が他の異なる 塩基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(b) 野生型二トリルヒ ドラ ーゼの サブュニッ トをコ一ドする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501番目の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基 に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を 有するタンパク質をコードする遺伝子 'DNA
(c) 上記 (a)若しくは (b)の遺伝子 DNAの塩基配列に相補的な塩基配列とス ト リンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二 トリノレヒ ドラ タ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(9) 以下の (a)又は (b)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの αサブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列において、 第 124〜： 126番目、 第 238〜240番目、 第 352〜354番目 及び第 394〜396番目の塩基のうち少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩 基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性- トリルヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(b) 上記 (a)の遺伝子 DNA の塩基配列に相補的な塩基配列とス トリ ンジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性- トリノレヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA ―
(10) 以下の (a)、 （b)又は (c)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの /3サブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異な る塩基に置換された塩基配列において、第 430〜432番目及び第 655〜657 番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配 列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタン ク質を コードする遺伝子 DNA (b) 野生型二ト リノレヒ ドラターゼの サブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501番目の塩基、 並びに野生型二ト リノレヒ ドラター ゼのひサブュニッ トをコ一ドする遺伝子の塩基配列のうち第 385〜387番 目及び 586〜588番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に 置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有 するタンパク質をコ一ドする遺伝子 DNA
(c) 上記 (a)若しくは (b)の導伝子 DNA の塩基配列に相補的な塩基配列とスト リ ンジヱン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二ト リノレヒ ドラ ターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(11) 以下の (a)又は (b)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの 5サブユニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列において第 76〜78番目及び第 142〜： 144番目の塩基のうち少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐 熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(b) 上記 (a)の遺伝子 DNA の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジユン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(12) 第 77番目の塩基 Aが Gに置換された (11)記載の遺伝子 DNA。
(13) 第 142番目の塩基 Tが Cに置換された (11)記載の遺伝子 DNA。
( 14) 上記 (7)〜(： 13)のいずれか 1項に記載の遺伝子 DNAを含む組換えベクター。
(15) 上記 (14)記載の組換えベクターを含む形質転換体または形質導入体。
(16) 上記 (15)記載の形質転換体または形質導入体を培養し、 得られる培養物か ら採取された二トリルヒ ドラターゼ。
(17) 上記 (15)記載の形質転換体または形質導入体を培養し、 得られる培養物か らニトリルヒ ドラターゼを採取することを特徴とする二トリルヒ ドラター ゼの製造方法。
(18) 上記 (15)の形質転換体を培養して得られる培養物又は該処理物を二 トリ ル化合物に接触させ、 当該接触により生成されるアミ ド化合物を採取する ことを特徴とするアミ ド化合物の製造方法。 本発明により野生型二 ト リルヒ ドラターゼょり耐熱性の向上した及びノま たはァロマティックな二卜リルに対する反応性が向上した変異型二トリルヒ ド ラタ一ゼ及び該酵素をコードする遺伝子が提供される。 さらには、 上記変異型 二トリノレヒ ドラターゼ遺伝子を含む組換え DNA、該組換え DNAを含む形質転 換 （導入） 体、 該形質転換 （導入） 体を用いたアミ ド化合物の製造法が提供さ れる。
本発明により、 効率よくァクリルアミ ドを製造することが可能となる。 図面の簡単な説明
• 図 1は、 プラスミ ド pJH601の構成図である。
図 2は、 プラスミ ド p3Rの構成図である。
図 3は、 プラスミ ド pMH301の構成図である。
図 4は、 プラスミ ド 1)52の構成図である。
図 5 Aは、 プラスミ ド pCF002の構築図である。
図 5 Bは、 プラスミ ド pFY529の構築図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を詳細に説明する。 本明細書において引用された文献、 公開 公報、 国際公開公報その他の特許公報は、 参照として本明細書に組込むものと する。
く二トリルヒ ドラターゼ〉
本発明は、 野生型二トリルヒ ドラターゼのアミノ酸配列の一部を変異させる ことにより、野生型二ト リノレヒ ドラターゼょりも耐熱性及び/又は基質特異性が 向上した改良型二ト リノレヒ ドラターゼを提供するものである。
「二トリルヒ ドラターゼ」 とは、 二トリル化合物を対応するアミ ド化合物に 変換する水和反応 （RCN+H20→RCONH2) を触媒する酵素である。 また、 「二 トリルヒ ドラターゼ」 の構造は、 ひサブュニットおよび/?サブュニッ トが集ま つた高次構造をとる。 「野生型二トリルヒ ドラタ一ゼ」'とは、 その酵素源となる 微生物の野生株 （親株） 由来のアミノ酸配列を有する二トリルヒ ドラターゼぉ よび野生株 （親株） 由来の遺伝子配列でコードされる二トリルヒ ドラターゼの ことである。 「野生型 サブュニッ ト」 又は 「野生型 αサブュニッ ト」 とは、 野 生株 （親株） 由来のアミノ酸配列を有する 0サブユニッ ト又はひサブユニッ ト および野生株 （親株） 由来の遺伝子配列でコードされる /9サブユニッ ト又は Λ' サブユニッ トのことである。
「野生型二トリルヒ ドラターゼ j は、 各種微生物の野生型由来の二トリルヒ ドラターゼが挙げられる。 微生物は、 二トリルヒ ドラターゼをコードする遺伝 子を有する微生物である限り特に限定されるものではない。 好ましくは、 ロ ド コッカス属に属する微生物、例えば口 ドコッカス '口 ドク口ウス Rhodococcus rhodochrous ) J- l ( FERM BP- 1478 ) 、 ロ ドコ ッ カス ' ロ ドク ロ ウス (Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、 口 ドコッカス · 口 ドク口 ウス Rhodococcus rhodochrous) M33 (VKM Ac'1515D)ゝ または口 ドコッ カス · 口 ドク 口 ウス Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特開平 2001-292772) などに由来のアミノ酸配列を有する二トリルヒ ドラターゼ、 お よびその遺伝子配列でコードされる二トリルヒ ドラターゼが挙げられる。 ある レヽは、 バチルス ' スミシ 、： Bacillus smithii) (特開平 09-248188) 由来の- ト リルヒ ドラターゼであってもよレ、。 特に好ましくは、 ロ ドコッカス . ロ ドクロ ウス Rhodococcus rhodochrous) J- i または口 ドコッカス · 口 ドク口ウス (Rhodococcus rhodochrous) M8 に由来のァミノ酸配列を有する二トリノレヒ ドラターゼおよびその遺伝子配列でコードされる二トリルヒ ドラターゼが挙げ られる。 なお、 口 ドコッカフ、 · 口 ドク口ウス 、 Rhodococcus l'hodoch雇 s、 M33 (VKM Ac- 1515D) 菌は、 M8 (SU1731814) 菌から自然突然変異によって構 成的に二トリルヒ ドラターゼを発現する株として選抜された菌株である。 その 二トリルヒ ドラ'ターゼ自体のアミノ酸配列および遺伝子配列に変異はない （米 国特許第 5,827,699号）。
ここで耐熱性の向上とは、 加熱処理した変異株由来酵素の残存活性が、 同じ 処理を行った親株由来酵素の残存活性より 10%以上高いことを意味する。 「残 存活性」 とは、 加熱処理した菌体を用いて活性測定したアミ ド化合物の生成量 と、 同量の無処理の菌体を用いて活性測定したアミ ド化合物の生成量との比を 示す。 加熱処理の方法としては、 培養液、 または集菌 ·洗浄した培養菌体を容 器に入れ、 これをウォータ一バスゃィンキュベータ一等の加熱装置に入れて一 定時間保温すればよい。 この時、 酵素の安定性を高めるための二トリル化合物 やアミ ド化合物を添加して加熱処理を施してもよい。 加熱処理の条件としては 処理温度と処理時間を適宜検言^し、親株の活性が 50%以下に低下する条件を設 定するのが好ましい。 具体的には 50°Cから 70°Cの範囲で、 5分から 30分加熱 処理を行う。 無処理の菌体は培養液、 または集菌 ·洗浄した培養菌体を 4 で 保冷したものを用いる。 活性測定は加熱処理または無処理の菌体を用い、 基質 である二トリル化合物を該菌体と接触させ、 対応するアミ ド化合物に変換して 該アミ ド化合物を定量する。 基質としては二トリルヒ ドラターゼが反応すれば いかなる- トリル化合物でも使用できるが、 アクリ ロニトリルが好ましい。 反 応条件としては、 例えば基質濃度は 2.5%、 反応温度は 10°Cから 30°C、 反 ^時 間は 10 分から 30 分の範囲で行う。 酵素反応はリン酸を添加して停止させ、 HPLC、 またはガスクロマ トグラフィ一によつて生成したァク リルァミ ドを分 析する。
本発明の改良型二トリルヒ ドラターゼは、 例えば、 口 ドコッカス · 口 ドク口 ゥス Rhodococus rhodochro s) J' l株由来の二トリノレヒ ドラターゼのァミノ 酸配列を改変し、 親株の二トリノレヒ ドラターゼ活性と比較し耐熱性の向上した 改良型二トリルヒ ドラターゼを選択することにより得られる。 その改変方法と しては、 J1菌にハイ ドロキシルァミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触 · 作用させる方法、 紫外線照射により変異を誘発する方法、 J1菌由来の二トリル ヒ ドラターゼをコードする遺伝子（以下、二トリルヒ ドラターゼ遺伝子）に PCR を用いてランダムに変異を導入する方法等を採用することができる。
本発明においては、 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブユニッ トのァミノ 酸配列 （例えば配列番号 2 ) のうち、 第 167番目のァスパラギンがセリンに置 換された改良型二トリルヒ ドラターゼを見出した。 本発明ではこの改良型ニト リルヒ ドラターゼに加え、 さらに耐熱性の向上した改良型二ト リルヒ ドラタ一 ゼを選択した。 その選択方法は、 上記 「耐熱性」 の定義に該当する変異体 （変 異遺伝子） を選抜することで行った。
このようにして得られた酵素としては、 二トリルヒ ドラターゼの サブュニ ッ 卜のアミノ酸配列 （例えば配列番号 2 ) において、 第 24 番目のフユニルァ ラニン残基、 第 88番目のイソ.ロイシン残基、 第 92番目のグルタミン酸残基、 第 93番目のグルタミン酸残基、 第 96番目のヒスチジン残基、 第 103番目のグ ルタミン酸残基、 第 167番琴のァスパラギン残基、 及び第 225番目のチロシン 残基のうち少なく とも 1つのァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァ ミノ酸配列を有するタンパク質である。
また、 二 トリルヒ ドラターゼの αサブュニッ トのァミノ酸配列 （例えば配列 番号 4 )において、第 42番目のァスパラギン残基、第 80番目のァラニン残基、 第 118番目のァラニン残基、及び第 132番目のァスパラギン酸残基のうち少な く とも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有 するタンパク質である。
さらに、 本発明は、 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブユニッ ト （配列番 号 2 ) のうち第 167番目のァスパラギン残基が他のァミノ酸に置換されたァミ ノ酸配列において、 /3サブュニッ トのアミノ酸配列の第 144番目のロイシン残 基、 第 219番目のバリン残基、 並びに αサブュニッ トのァミノ酸配列 （配列番 号 4 )の第 129番目のバリン残基および第 196番目のロイシン残基のうち少な く とも 1つのアミノ酸残基が、 他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を 有し、 且つ、 二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質である。
上述の複合変異体を作製する手段は如何なる方法でもよく、 例えば、 合成一 本鎖オリゴヌク レオチドを用いて部位特異的な置換を生じさせる方法、 複数の 異なる単変異個所を含む DNA断片を制限酵素で切断して連結させる方法によ り作成することができる。
耐熱性を損なわない限り、 上記の変異に加えて、 1 もしくは複数個 （例えば 1個または数個） のアミノ酸が置換、 欠失および/または付加されていても構 わない。 例えば、 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブユニッ トのアミノ酸配 歹 IJ (例えば配列番号 2 ) 又は野生型二トリルヒ ドラターゼの αサブユニッ トの アミノ酸配列 （例えば配列番号 4) の 1〜2 個、 あるいは、 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブユニッ トをコードする遺伝子 （例えば配列番号 3) 又は野 生型二トリノレヒ ドラターゼのひサブュニッ トをコードする遺伝子 （例えば配列 番号 3 ) に示される塩基配列によりコードされるアミソ酸配列の 1〜2個のァ ミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換してもよい。
次に、 好ましいアミノ酸変異の態様を示す。 本発明においては、 便宜上、 ァ ミノ酸の 1文字表記と αまたは βサブュニッ トのァミノ酸配列のァミノ酸番号 を使用して変異の態様を説明することができる。 例えば、 F 2 4L という表 記は、 「 サブユニッ ト （例えば配列番号 2) のアミノ酸配列のうち第 24番目 のァミノ酸がフエ-ルァラニンからロイシンに置換される変異」 を意味する。 また、 N0167S という表記は、 「 サブユニッ ト （例えば配列番号 2) のアミ ノ酸配列のうち第 167番目のァミノ酸がァスパラギンからセリンに置換される 変異」 を意味する。 く変異と置換の態様 （ 1 ) >
この態様は、 二トリルヒ ドラターゼの ctまたは βサブュニットのァミノ酸残 基を少なく とも 1
単変異
1. β 2 4L
2. 8 8F
3. Ε ^ 9 2 Κ
4. Έβ 9 3G
5. 9 6R
6. 1 0 3D
7. 1 6 7 S
8. Υ /3 2 2 5 Η
9. Να 4 2D
10. Αα 8 ΟΤ
11. Αα 1 1 8V 12. Da l 3 2N
複合変異
1. E/3 9 3 G, E/3 1 03D
2. E^ 9 3G, Da l 3 2N
3. H^ 96R, Na 42D
4. Εβ 9 2 K、 Aひ 8 OT
上記のアミノ酸置換を生 I させるときの塩基置換は以下の通りである。なお、 βサブュニッ ト、 αサブュニットをコ一ドする遺伝子 DNAは、 それぞれ配列 番号 1、 配列番号 3に示すものを例として説明する。
単変異 1 ：配列番号 1において、 70〜7 2番目の塩基酉己歹 U「TTC」を CTT、 CTC、 CTA又は CTGとなるように塩基を置換させる。 特に、 70番目の Tを Cに置換すること （TTC→CTC) が好ましい。
単変異 2 ：配列番号 1に示す塩基配列において 262〜2 64番目の塩基配 歹 IJ 「ATC」 を、 TTT又は TTCに置換させる。 特に、 26 2番目の Aを Tに置 換させること （ATC→TTC) が好ましい。
単変 ¾3 ：配列番号 1に示す塩基配列において 2 74〜2 76番目の塩基配 歹 IJ 「GAA」 を、 AAA又は AAGに置換させる。 特に、 274番目の Gを Aに 置換させること （GAA→AAA) が好ましい。
単変異 4 ：配列番号 1に示す塩基配列において 27 7〜2 79番目の塩基配 列 「GAG」 を、 GGG、 GGC、 GGA又は GGTに置換させる。 特に、 278番 目の Aを Gに置換させること （GAG→GGG) が好ましい。
単変異 5 ： 配列番号 1に示す塩基配列において 28 6〜288番目の塩基配 歹 IJ 「CAC」 を、 CGC、 CGG、 CGA又は CGTに置換させる。 特に、 28 7番 目の Aを Gに置換させること （CAC—CGC) が好ましい。
単変異 6 ：配列番号 1に示す塩基配列において 30 7〜309番目の塩基配 歹 ij 「GAG」 を、' GAC又は GATに置換させる。 特に、 30 9番目の Gを に 置換させること （GAG→GAT) が好ましい。
単変異 7 ：配列番号 1に示す塩基配列において 4 9 9〜 5 0 1番目の塩基配 歹 IJ 「AAC」 を、 AGC又は AGTに置換させる。 特に、 500番目の Aを Gに 置換させること （AAC→AGC) が好ましい。
単変異 8 ：配列番号 1に示す塩基配列において 6 7 3〜 6 7 5番目の塩基配 歹 IJ 「TAC」 を、 CAC又は CATに置換させる。 特に、 6 7 3番目の Tを Cに置 換させること （TAC→CAC) が好ま.しい。
単変異 9 ：配列番号 3に示す塩基配列において 1 2 4〜1 2 6番目の塩基配 歹 IJ 「AAC」 を、 GAC又は GATに置換させる。 特に、 1 24番目の Aを Gに 置換させること （AAC—GAC) が好ましい。
単変異 1 0 ：配列番号 3に示す塩基配列において 2 3 8〜2 4 0番目の塩基 酉己列 「GCC」 を、 ACC，ACG，ACA又は ACTに置換させる。 特に、 2 3 8番目 の Gを Aに置換させること （GCC—ACC) が好ましい。
単変異 1 1 ：配列番号 3に示す塩基配列において 3 5 2〜 3 5 4番目の塩基 配列 「GCCJ を、 GTC、 GTG、 GTA又は GTTに置換させる。 特に、 3 5 3番 目の Cを Tに置換させること （GCC—GTC) が好ましい。
単変異 1 2 ：配列番号 3に示す塩基配列において 3 9 4〜 3 9 6番目の塩基 配列 「GAC」 を、 AAC又は AATに置換させる。 特に、 3 9 4番目の Gを A に置換させること （GAC→AAC) が好ましい。
複合変異 1〜4の塩基配列の置換に関しては、 単変異の置換と同様である。
<変異と置換の態様 （2) >
この態様は、 二トリルヒ ドラタ一ゼの /3サブュニッ トのァミノ酸配列を少な く とも 2箇所変異させるカ あるいは サブュニッ トのアミノ酸配列を少なく とも 1箇所、 かつ、 αサブユニッ トのアミノ酸配列をを少なく とも 1箇所変異 させる態様である。
1. 1 6 7S、 L β 144H
2. 1 6 7S、 V^219A
3. 1 6 7S、 Va 129A
4. N/3 1 6 7S、 L β 144H, V/3219A
5. N/3 1 6 7S、 L β 144Η Ί β 219A V a 129A L a 196P 上記のァミノ酸置換を生じさせるときの塩基置換は以下の通りである。
167S：配列番号 1に示す塩基配列において 4 9 9〜5 0 1番目の塩基配 歹 |J 「AAC」 を、 AGC又は AGTに置換させる。 特に、 5 0 ◦番目の Aを Gに 置換させること （AAC→AGC) が好ましい。
L IS 144H：配列番号 1に示す塩基配列において 4 3 0〜4 3 2番目の塩基配 歹 IJ 「CTC」 を、 CAC又は CATに置換させる。 特に、 4 3 1番目の Tを Aに置 換させること (CTC→CAC) が好ましい。
V 219A：配列番号 1に示す塩基配列において 6 5 5〜6 5 7番目の塩基配 歹 |J 「GTC」 を、 GCT、 GCC、 GCA又は GCGに置換させる。 特に、 6 5 6番 目の Tを Cに置換させること （GTC—GCC) が好ましい。
V a 129A：配列番号 3に示す塩基配列において 3 8 5〜3 8 7番目の塩基配 歹 IJ 「GTG」 を、 GCT、 GCC、 GCA又は GCGに置換させる。 特に、 3 8 6番 目の Tを Cに置換させること （GTG→GCG) が好ましい。
L a 196P：配列番号 3に示す塩基配列において 5 8 6〜5 8 8番目の塩基配 歹 IJ 「CTC」 を、 CCT、 CCC、 CCA又は CCGに置換させる。 特に、 5 8 7番目 の Tを Cに置換させること （CTC→CCC) が好ましい。
<変異と置換の態様 （3 ) >
この態様は、 二トリノレヒ ドラターゼの サブユニッ トのアミノ酸配列のうち 少なく とも第 26番目または第 48番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換す る態様である。
すなわち、本発明は、ァロマティックな二トリルに対する反応性が向上した、 及ぴ Z又は耐熱性の向上した二トリルヒ ドラター を提供するものである。「二 トリノレヒ ドラターゼ」 とは、 二トリル化合物を対応するアミ ド化合物に変換す る水和反応 （RCN+2H20→RCONH2) を触媒する酵素である。
ここで、 「ァロマティックな二トリルへの反応性が向上した二トリルヒ ドラ ターゼ」 とは、 3—シァノピリジンに対する比活性が 1.5倍以上向上している ものを意味する。
その選択方法は、 上記 「変異」 の定義に該当する変異体 （変異遺伝子） を選 抜する。
上記の手法により得られたァロマティックな二トリルに対する反応性の向上 した酵素としては、 配列番号 2 サブユニッ ト） のアミノ酸配列において、 第 48 番目のトリプトファン残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配 列を有するタンパク質である。
また、 耐熱性の向上した酵素としては、 配列番号 2 サブユニッ ト） のァ ミノ酸配列において、 第 26番目のヒスチジン残基が他のアミノ酸に置換され こァミノ酸配列を有するタンパク質である。
配列番号 2に示されるァミノ酸配列 （野性型二ト リ ノレヒ ドラターゼの サブ ユニッ トのアミノ酸配列） の第 48 番目のト リプトファンがアルギニンに置換 された場合、 二トリルヒ ドラターゼの耐熱性が向上する効果に加え、 アタリ口 二 トリル （短鎖脂肪族- トリル） に対する基質特異性において、 3·シァノピリ ジン （芳香族-トリル） に対する反応性が向上する。
次に、 好ましいアミノ酸変異の態様を示す。 例えば、 W 48;Rという表記は 、 「 サブユニッ ト （配列番号 1 ) の 48番目のアミノ酸残基がトリプトファン からアルギニンに置換される変異」 を意味する。
( 1 ) ァロマティックな- トリルに対する反応性向上変異
W β 48R
( 2 ) 耐熱性の向上変異
H ^ 26R
( 3 ) 複合変異
W β 48R, 26R
上記のアミノ酸置換を生じさせるときの塩基置換は以下の通りである。
W 48R：配列番号 1において、 142〜144番目の塩基配列 「TGG」 を CGT 、 CGC、 CGA、 CGG、 AGA又は AGGとなるように塩基を置換させる。'特に、 142番目の Tを Cに置換すること （TGG→CGG) が好ましい。
H 26R：配列番号 1において、 76〜78番目の塩基配列 「CAC」 を CGT、 CGC、 CGA、 CGG、 AGA又は AGG となるように塩基を置換させる。 特に、 77番目の Aを Gに置換すること （CAC—CGC) が好ましい。 く複合変異〉
さらに、 上記 「変異と置換の態様」 の （1 ) 〜 （3 ) 項に記載した変異の複 数を組み合わせて複合変異体とすることにより、 両性質を備えた変異酵素を創 製することもできる。
複合変異体を作製する手段は如何なる方法でもよく、 例えば、 合成一本鎖ォ リゴヌクレオチドを用いて部位特異的な置換を生じさせる方法、 複数の異なる 単変異個所を含む DNA断片を制限酵素で切断して連結させる方法により作成 することができる。
変異の性質を損なわない限り、 上記の変異に加えて、 アミノ酸配列の欠失、 置換、 付加等が起こっていても構わない。 例えば、 上記変異が施された態様の アミノ酸配列の 1個または数個、 例えば 1〜： 10個、 好ましくは 1〜5個のアミ ノ酸残基が欠失してもよく、 上記変異が施された態様のァミノ酸配列に 1個ま たは数個、 例えば 1〜 10個、 好ましくは 1〜5個のァミノ酸残基が付加しても よく、 あるいは、 上記変異が施された態様のアミノ酸配列の 1個または数個、 例えば 1〜： 10個、 好ましくは 1〜 5個のァミノ酸が他のァミノ酸残基に置換し てもよい。 ぐ変異導入法 >
上記の単変異又は複合変異が導入された二トリルヒ ドラターゼ遺伝子の調製 は、 Kimkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、 例えば部位特異的突 然変異誘発法を利用 した変異導入用キッ ト、 例えば QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィ ンビ トロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System ( utan-K MutarrSuper Express Km等： タカラノ ィ ォ社製） を用いて行うことができる [Nucleic. Acid. Res. 10, 6487 (1982)、 Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕。
Jl菌以外の二トリルヒ ドラターゼにおいても上述の変異の位置、変異するァ ミノ酸種、 DNA 配列によって耐熱性が向上すると考えられる。 その様な菌と しては、 前述の口 ドコッカス · 口 ドク口ウス Rhodococcus l'hododu'ous MS ( SU 1731814)、 口 ドコッカス · 口 ドク 口ウス ( liodococcus rhodochrous) M33 ( VKM Ac- 1515D )、 ロ ドコ ッカ ス ' ロ ドク ロ ウス Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特.開平 2001 -292772)、バチルス 'スミシ 、BaciUus smithii) (特開平 09-248188) 等が例示される。
さらに、 上記配列番号 1または 3に示す塩基配列に変異を導入した態様の塩 基配列に対し相補的な塩基尊己列からなる DNA と、 ストリンジヱントな条件下 でハイプリダイズすることができる DNAも本発明の遺伝子 DNAに含まれる。 ストリンジェントな条件とは、 例えば、 塩 （ナトリゥム） 濃度が 150〜900mM であり、 温度が 55〜75°C、 好ましくは塩 （ナトリウム） 濃度が 250〜450Ι Μ であり、 温度が 68°Cでの条件をいう。
<アミ ド化合物耐性〉.
本発明の改良型二ト リルヒ ドラターゼは、 さらにアミ ド化合物耐性としての 性質を有する。 ここで、 「アミ ド化合物耐性」 とは、 他の野生株由来の二トリ ノレヒ ドラターゼと比較して、 アミ ド化合物存在下で二ト リノレヒ ドラターゼ活性 を維持することができることを意味する。 本発明の変異型二ト リノレヒ ドラター ゼが耐性であるアミ ド化合物しては、特に限定されるものではなレ、が、例えば、 以下の化学式で表されるアミ ド化合物：
Figure imgf000018_0001
(ここで、 Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、 置換又は無置換のシク口アルキル基、置換又は無置換のァリール基、あるいは、 置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を意味する）
が挙げられる。 特に、 式中、 Rが CH2=CHであるァクリルァミ ドが好ましレ、。 . アミ ド化合物耐性は、 例えば、 本発明の改良型二トリルヒ ドラターゼを有す る形質転換体の培養 f勿又は形質転換体から単離した二トリルヒ ドラターゼを、 アクリルアミ ド等のアミ ド化合物 (例えば、 30〜50%等の高濃度)存在下で、 基 ' 質であるァクリ ロニトリル等の二トリル化合物の消費量又は消費速度を分析す ることによって評価することできる。 そして、 親株由来の二ト リノレヒ ドラター ゼと比較して、 例えば、 消費量又は消費速度が 1.1倍を超えた場合に、 アミ ド 化合物耐性であると評価することができる。 く組換えベクターおよび形質転換 （導入） 体の調製 >
上述の二トリルヒ ドラターゼ遺伝子を含む組換えベクターおよび形質転換 (導入） 体の調製方法に関して説明する。
二トリルヒ ドラターゼ遺伊子は、 形質転換又は形質導入される宿主生物にお いて、 発現可能なように、 ベクターに組み込むことが必要である。
例えば、 ベクターとしてはプラスミ ド DNA、 バクテリオファージ DNA、 レ トロ トランスポゾン DNA、 人工染色体 DNAなどが挙げられる。
宿主'としては、 例えば、 大腸菌、 枯草菌等の細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細 胞、 植物細胞等を用いることができる。
大腸菌を宿主とする場合、 発現効率の高い発現ベクター、 例えば trcプロモ 一ターを有する発現ベクター PKK233-2 (アマシャムバイオサイエンス社製）、 又は p Trc99A (アマシャムバイオサイエンス社製） などを用いることが好まし レ、。
ベクターには、 二トリルヒ ドラターゼ遺伝子のほ力 \ プロモーター、 ターミ ネーター、 ェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選 択マーカー、 リボソーム結合配列 （SD 配列） 等を連結することができる。 な お、 選択マーカーとしては、 例えばカナマイシン耐性遺伝子、 ジヒ ドロ葉酸還 元酵素遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げら れる。
以下、宿主の種類および宿主への組換えベクター導入方法に関して説明する。 細菌を宿主とする場合、 大腸菌としては、 例えばェシエリ ヒア · コ Esche «ώ)等が挙げられ、 口 ドコッカス oi/ococcws)菌としては、 例えば口 ド コッカス · 口 +ドク口ゥフ、 Rhodococcus
Figure imgf000019_0001
口 ドコッカ
Figure imgf000019_0002
口 ドコッカフ、 · 口 ドクロウス ( ihodococcus rhodoc rous) ΑΎΟΟΙ 9140等が挙げられる。 これらの ATCC株はァメ リカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。 細菌への組換えべクターの導入方法としては、 細菌に DNA を導入する方法 であれば特に限定されるものではなレ、。例えばカルシウムイオンを用いる方法、 エレク トロポレーシヨン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、 例えばサッカ ロ ミ セ ス · セ レ ビシェ (Sa ccharomyces cerevisiae) 、 ン ン サ ッ カ ロ セ ス · ポ ン べ {Scmzosaccharo yces pombe) ピヒフ · ノヽス ト リス ^icnm pastoi'iS) か 、 られる。 酵母への組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNAを導入す る方法であれば特に限定されず、 例えばエレク ト口ポレーシヨン法、 スブエロ プラス ト法、 酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、 サル細胞 COS-7、 Vero、 CHO細胞、 マウス L細胞、 ラッ ト GH3、 ヒ ト FL細胞等が用いられる。 動物細胞への組換えべク ターの導入方法としては、 例えばエレク ト口ポレーシヨン法、 リン酸カルシゥ ム法、 リボフ クシヨン法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、 Sf9細胞、 Sf21細胞等が用いられる。 昆虫細 胞への組換えベクターの導入方法としては、 例えばリン酸カルシウム法、 リポ フエクション法、 エレク小口ポレーション法等が用いられる。
植物細胞を宿主とする場合は、 タバコ BY-.2細胞等が挙げられるが、 これら に限定されるものではない。植物細胞への組換えべクタ一の導入方法としては、 例えばァグロパクテリ ゥム法、 パーティクルガン法、 PEG法、 エレク トロポレ ーシヨ ン法等が用いられる。 く二トリルヒ ドラターゼの製造 >
次に二トリルヒ ドラターゼおよびその製造方法に関して説明する。
本発明の二トリルヒ ドラターゼは、 上記方法で調製された二トリルヒ ドラタ —ゼ遺伝子を含む形質転換 （導入） 体を培養し、 その培養物から採取すること により得ることができる。
ここで、 「培養物」 とは、 培養上清、 培養細胞若しくは培養菌体、 又は細胞若 しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換 （導入) 体を培養する方法は、 以下に例示した宿主の培養 に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地 は、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の 培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれ を用いてもよい。 炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 デンプン等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパ ノール等のアルコール類が考げられる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化ァ ンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の 無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩又はその他の含窒素化合物のほか、 ぺ プトン、肉エキス、 コーンスティープリカ一等が挙げられる。無機物としては、 リン酸第一力リ ゥム、 リン酸第二力リゥム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネ シゥム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシゥ ム等が挙げられる。 培養は、 通常、 振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条 件下、 30〜40°Cで行う。 pH の調整は、 無機又は有機酸、 アルカリ溶液等を用 いて行う。 培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物 質を培地に添加してもよい。
さらに、 培地には二トリルヒ ドラターゼの補欠金属であるコバルトイオンや '鉄イオンを添加し、 酵素の誘導剤となる二トリル類やアミ ド類を添加してもよ い。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換 した微生物を培養する場合は、 必要に応じてインデューサーを培地に添加して もよレ、。 例えば、 イソプロピル- β チォガラク トシド (IPTG)で誘導可能なプ 口モーターを有する発現べクターで形質転換した微生物を培養するときには
IPTG等を培地に添加することができる。 また、 インドール酢酸 (ΙΑΑ)で誘導可 能な trp プロモーターを用いた発現ベクターで形質 換した微生物を培養する ときには IAA等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている RPMI1640培地、 DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清 等を添加した培地等が挙げられる。 培養は、 通常、 5 % C02存在下、 37°Cで 1 〜30 日行う。 培養中は必要に応じてカナマイシン、 ぺニシリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。
培養物からの二ト リルヒ ドラターゼの採取方法は、 超音波処理、 凍結融解の 繰り返し、 ホモジナイザ一処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによ り 目的のタンパク質を 取する。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、 培養は、 通常の植物培養 用培地、 例えば MS 基本: i 地、 LS基本培地等を用いることにより行うことが できる。 培養方法は、 通常の固体培養法、 液体培養法のいずれをも採用するこ とができる。
培養物からの二トリルヒ ドラターゼの採取方法は、 まず、 セルラーゼ、.ぺク チナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、 超音波破砕処理、 磨碎処理等により 細胞を破壊する。 次いで、 濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、 粗タ ンパク質溶液を得る。 上記粗溶液から本発明のタンパク質を精製するには、 塩 析、 各種クロマトグラフィー （例えばゲル濾過クロマトグラフィー、 イオン交 換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等）、 SDS ポリア クリルアミ ドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて実施する。
また、 本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、 培養 液をそのまま使用する力 遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、 タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモ ニゥム沈殿、 ゲルクロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフ ィ -ティークロマトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることに より、 前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。 また、本発明においては、本発明の変異型二トリルヒ ドラターゼをコ一ドする遺 伝子 DNA又は上記ベクターから、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク 質合成系を採用して、 目的のタンパク質を採取すること'も可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタ ンパク質を合成する系であり、 例えば niRNAの情報を読み取って、 リボソーム上 でタンパク質を合成するというものである。 なお、本発明において使用される無細 胞タンパク質合成系には、 DNAを鐃型として RNAを合成する無細胞転写系も含 まれる。
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球、 マウス L-細胞、 HeLa細胞、 CHO細胞、 出芽酵母、 大腸菌な どの抽出液を使用することができる。 なお、 これらの細胞抽出液は濃縮されたもの であっても濃縮されないものであってもよい。
ここで、 DNA上に暗号化された遺伝情報は、 転写により mRNAとなり、 さら に翻訳されてタンパク質に 換される。人工容器内でこの翻訳過程を再現してタン パク質を合成するためには、 リボソーム、 tRNA、 各種タンパク質因子など、 翻訳 因子群を安定化し、 目的に^じて mRNA を生産するシステムを構築することが必 要である。 細胞抽出液は、 例えば限外濾過、 透析、 ポリエチレングリコール (PEG) 沈殿等によって得ることができる。
本発明において、無細胞タンパク質合 は、市販のキットを用いて行うこともで きる。 そのようなキットとしては、 例えば試薬キット PROTEIOSTM (東洋紡） 、 TNTTM System (プロメガ） 、 合成装置の； PG-Mate™ (東洋紡） 、 RTS (ロシュ · ダイァグノステイクス) などが挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって得られる変異型二トリルヒドラターゼは、適宜ク 口マトグラフィーを選択して、 精製することができる。 また、 変異型二トリルヒ ド ラターゼが単離精製されたことの確認は、 SDS-PAGE等により、 活性の測定は二 トリル化合物からアミ ド化合物への変換率を測定すること等により行うことが可 能である。
<アミ ド化合物の製造 >
次に、 形質転換 （導入） 体を利用したアミ ド化合物の製造方法について説明 する。
上記の培養法で得られた培養物、 酵素等は、 二トリル化合物を対応するアミ ド化合物に変換する際の生体触媒として使用される。 変換反応の基質として使 用する二トリル化合物としては、生体触媒の基質特異性により適宜選択される。 例えば、 口 ドコッカス ' 口 ドク口ウス 、Rlwdococcus l'hodoch醒 s、 J- 1株由来 の二トリルヒ ドラターゼであれば、 好適な基質はァクリロ二トリルである。 生体触媒の使用形態、反応様式は、生体触媒の種類等により適宜選択される。 例えば、 生体触媒の使用形態としては、 上記の培養物、 精製酵素をそのまま使 用しても良いし、 それらを適当な担体に保持し固定化酵素として使用すること もできる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこれら の例に限定されるものではない。 なお、 ロ ドコ ッカス ' 口 ドク口 ウス {Rhodococcus rhodochrous) J' l株は、 FERM BP' 1478として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託されている （原寄託日 ： 1987年 9月 18日）。
[実施例 1 ] 改良型二トリルヒ ドラターゼ遺伝子の取得 （I) ( 1 ) 染色体 DNAの調製
ロ ドコッカス . ロ ドクロウス Rhodococcus rhodochrous) -J' l株を 100ml の MYK培地 （0.5%ポリペプトン、 0.'3%パク トイーストエキス、 0.3%バク ト モルトエキス、 1 o/0 グルコース、 ο·2% K2HP04、 0.2% KH2P04、 pH7.0) 中、 30°Cにて 72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体を Saline-EDTA溶液（0.1M EDTA、 0.15M NaCl(pH8.0)) 4mlに懸濁した。 懸濁液にリゾチーム 8mgを加えて 37°Cで 1 〜2時間振盪した後、 -20°Cで凍結した。
次に、 10m】の is-SDS液 （1 % SDS、 O. lM NaCK 0.1M TVis-HCl(pH9.0)) を穏やかに振盪しながら加え、 さらにプロティナーゼ K (メルク社） （終濃度 O. lmg) を加えて 37°Cで 1時間振盪した。
次に、 等量の TE 飽和フエノールを加え撹拌後 (TE: 10niM TVis-HCl、 ImM EDTA(pH8.0))遠心し、 上層をとり 2倍量のエタノールを加えたのちガラス棒 で DNAを巻きとり、 90%、 80%、 70%のエタノールで順次フエノールを取り 除いた。
次に、 DNAを 3mlの TE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼ A溶液 (100°C、 15分間の加熱処理済）を 10μ g/mlになるよう加え 37°Cで 30分間振盪した。 さ らに、 プロティナ一ゼ Kを加え 37Cで 30分間振盪した後、 等量の TE飽和フ ェノールを加えて遠心し、 上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を 2 回繰り返した後、 同量のクロ口ホルム （4%イソ ァミルアルコール含有） を加え同様の抽出操作を繰り返した （以後この操作を フエノール処理と呼ぶ）。 その後、 上層に 2 倍量のエタノールを加えガラス棒 で DNAを卷きとり回収し、 染色体 DNA標品を得た。
(2) プラスミ ドの構築
まず、 耐熱性評価のコントロールとして用いるため、 通常の PCR にて野生 型二トリノレヒ ドラターゼ遺伝子を増幅した。
下記反応液組成、 反応条件で PCRを行つた。
なお、 プライマー JH1-02 (配列番号 5) およびプライマー NH-17 (配列番号
6) の各々には、 制限酵素 Ncoi切断認識部位および制限酵素 ]dni切断認 識部位が導入されており、増幅 DNA産物を両制限酵素で切断することにより、 後述する発現べクタ一 pTi'c99Aの Ncol部位一 H^ ll部位間に容易に挿入す ることが可能となる。
ぐ反応溶液組成〉
錶型 DNA (染色体 DNA) l \
10 X ExTaq Buffer (宝酒造社製） 10 1
プライマー JH1-02 1^1
プライマー NH-17 1μ\
2.5mM d NTPmix 8μ1
滅菌水 ISixl
ExTaqDNAポリメラーゼ （宝酒造社製） 1μ\
ぐプライマー >
JH1-02： GGAATGAGGCCATGGATGGTATCC (配列番号 5 )
NH-17： GCGTAAGCTTCCGCGAGATCAGTATCCACCG (配列番号 6 ) PO は、 Thermalcycler personal (宝酒造）を用いて （94°C 30秒、 65°C 30 秒、 72°C 3分) を 30サイクル行った。
PCR終了後、 反応液 5 1を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 3kbの 増幅断片の検出を行った。 反応終了液を GFX column (アマシャムバイオサイ エンス） で精製し、 制限酵素 と H Kailで切断を行った。 制限酵素処理 を行った PCR産物は 0.7%ァガロースゲルで電気泳動を行い、 3kb付近のバン ドを回収した。 回収した PCR産物は Ligation Kit (宝酒造）を用いてベクタ一 (pTi'c99Aの Ncol-Hindlll部位） に結合し、 JM109を形質転換した。 得られ た形質転換体コロニーより数クローンを LB-Amp培地 1.5mlに接種し、 37 C で 12 時間振盪培養した。 培養後、 この培養物を遠心分離により集菌した後、 Flexi Prep (アマシャムバイオサイエンス社製） を用いることにより、 プラス ミ ド DNAを抽出した。 得られたプラスミ ド DNAを制限酵素 Ncolと 'zidm で切断後、 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し確認した後、 二トリルヒ ドラタ ーゼ遺伝子断片（3 kb)が正しく連結されているクローンを選んで pJH601 (図 1 ) と命名 した。 こ の pJH601 を用いて JM109 を形質転換した (JMl09/pJH601)。
なお、プラスミ ド pJH 601は野生型二トリルヒ ドラターゼの発現プラスミ ド であり、 受領番号 FERM ABP- 1 0 3 1 4として独立行政法人産業技術総合研 究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に 寄託されている （原寄託日 ： 2002年 12月 26日）。
( 3 ) 変異遺伝子ライブラリーの構築
上記工程 （2 ) で得られたプラスミ ド pJH601を基に、 野生型二トリルヒ ド ラターゼ遺伝子へのランダム変異導入を行った。 変異導入は、 PCRにおけるヌ クレオチドの誤取り込みによる塩基置換を利用した。 下記反応液組成、 反応条 件で PCRを行った。
<反応液組成〉 錶型 DNA (上記工程で調製した pJH601) Ι μ ΐ
10 X PCR Buffer (GIBCO社製） 10 μ \
50mM MgC12 (GIBCO社製） 3 μ 1
プライマー Ti'c-02 1 μ 1
プライマー Trc-03 1 μ \
Figure imgf000027_0001
lOmM clITP 2 μ \
lOmM dBraUTP 2 μ 1
滅菌水 71 μΛ
Taq DNAポリメラー （GIBCO社製） 1 μ 1
<プライマー >
TRC-02： GGAATTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGC (配列番号 7 ) TRC-03： GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC (配列番号 8 )
PCRは Theraialcyclei' personal (宝酒造）を用いて（94°C 30秒、 65。C 30秒、 72°C 3分） を 30サイクル行った。
PCR終了後、 反応液 5 μ ΐを 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 3 kbの 増幅断片の検出を行った。 反応終了液を GFX column (アマシャムバイオサイ エンス） で精製し、 制限酵素 Λ¾?Ι と H^rffllで切断を行った。 制限酵素処理 を行った PCR産物は 0.7%ァガロースゲルで電気泳動し、 3Kb付近のバンドを 回収した。 回収した PCR 産物は Ligation Kit (宝酒造）を用いてベクター (PTrc99Aの NcobHindni部位） に結合し、 この結合生成物を用いて JM109 を形質転換した。 ( 4 ) 耐熱性二トリルヒ ドラターゼのスクリーニング及ぴ変異箇所の 同定
上記工程 (3)で得られた変異二トリルヒ ドラターゼ遺伝子を含む JM109形質 転換体および JMl09/pJH601を、 LB-Amp培地 (ImM IPTG、 5 μ g/ml C0CI2 含有）を 1mlずつ入れた 96穴ディープゥエルプレートにそれぞれ接種し、 37°C にて 12時間液体培養した。 得られた培養物を、 55°Cの温度下、 30分間の熱処 理に供した後、 残存二トリルヒ ドラターゼ活性の測定を行った。
活性測定は 5%ァクリロニトリルを含む 50mM リン酸緩衝液 pH7.7を菌体 懸濁液と等量加え、 30°Cで 30分反応させた。 0.1M リン酸を等量加え反応を停 止し、 遠心分離によって菌体を除去し、 上清を HPLCに供し、 生成したァクリ ルァミ ド濃度を分析した（WAKOSIL 5C8 (和光純薬）、 5mM リン酸を含む 10% ァセトニトリル、 .移動相の流速 lml/minおよび紫外吸収検出器波長 260nm)。 比較対照として熱処理を行わず 4°Cで保冷したものをそれぞれの無処理菌とし て残存活性を求めた。
数千株の形質転換体についてスクリーニングを行った結果、 野生型酵素と比 して高い残活性を示す株が 16株得られた。 また、 それら菌株を培養してプ ラ ス ミ ドを回収 し、 塩基配列の決定を行った。 塩基配列の決定は BeckmanCEQ-2000XLを； ί吏用した。 結果を表 1に示した。 表 1
Figure imgf000028_0001
[実施例 2 ] 改良型二トリルヒ ドラターゼの性質
実施例 1 で得られたプラスミ ド p 3 を用いて JM109 を再形質転換し (JM109/p3)、 得られたコロニーを LB培地 （アンピシリ ン、 IPTG、 コバルト 含有） で 37° (：、 ー晚培養した。 菌体を遠心分離によって回収し、 50ηιΜ リ ン 酸緩衝液で 2回洗浄し、 菌体懸濁液とした。
得られた菌体懸濁液 0.5m 1 を試験管に入れ、 50° (：〜 60°Cの各温度の水浴中 で 5〜20分間保温し、 その 氷中で冷却した。
菌体の活性測定は実施例 1 ( 4 ) の方法で行った。 .
比較対照として JMl09/pJH601を用い、熱処理を行わず 4°Cで保冷したもの をそれぞれの無処理菌として残存活性を求めだ。 結果を表 2に示す。 表 2
Figure imgf000029_0001
野生型酵素では 60°C、 5分の熱処理で残存活性が 6 %に対し、 改良型酵素で はほぼ 100%の残存活性を保持していることから、 改良型酵素で耐熱性が向上 していることが認められた。
[実施例 3〗 口 ドコッカス組換え体の作製
実施例 1で取得した改良型酵素の性質をロ ドコッカス菌組換え体で確認した。
( 1 ) ロ ドコッカス菌導入用プラスミ ドの構築
以下の方法で p3の変異 (E 93G)を有する口 ドコッカス菌導入用プラスミ ド を作製した。 変異の導入は部位特異的変異導入法を用い、 市販キッ ト ： Q ikChange XL Site-Dii-ected Mutagenesis Kit(Stratagene 1土)を使用し 7こ。 実験は操作マニュアルに従った。 変異を導入する鎵型プラスミ ドと して pSJ034を使用した。 pSJ034は口 ドコッカス菌において二トリルヒ ドラターゼ を発現するプラスミ ドであ.り、 pSJ034は DSJ023より特開平 10-337185号公 報に示す方法で作製した。 なお、 pSJ023 は形質転換体 「R. rliodochrous ATCC12674/pSJ023J として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センター （茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託されている (FE M BP- 6 2 3 2 ) (原寄託日 ： 1997年 3月 4日）。
変異を導入するための 2種のプライマーを合成した。 下線部は変異導入部位 を示す。
. HM-F -· gatcatcaccgaagaagggcgaaagcaccgtgtgc (酉 3歹1 J畨号 9)
NHM-R： gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (酉己歹 IJ畨 10)
変異を導入するための PCRは以下の条件で、 GeneArap9700(PEバイオサイ エンス社）を用いて 95°C 1分、 （95°C 50秒、 60°C 50秒、 68°C 20分） X 18 サイクル、 68°C 20分の反応を行った。
<反応液組成〉
p SJ034 (lOng) 2μ\
10 X 反応 Buffer δμ\
プラィマー NHIvI-F (lOOng/ μ U Ιμί
プライマー NHM-R (lOOng/^1) ' Ιμΐ
2.5mM d NTPmix Ι ΐ
滅菌水 36 / l
QuickSolution 3μ1
Pfu Turbo DNA Polymerase ΙμΙ PCR終了後、反応液 を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 llkb の増幅断片の検出を行った。 増幅断片を確認した後、 Ιμΐ の Dpnl (キッ トに 付属） .を PCR反応液に添加して 37°Cで 1時間反応し、 鐃型 DNAの除去を行 つた。
次に、 XL1OG0LD ultracompetent cell (キッ トに付属） を用いて形質転換 を行った。 2 1の Dpnl処理済みの PCR反応液と 45 1のコンビテントセルを 混ぜ、 4°Cで 30分保温し、 42°Cで 30秒ヒートショックを行った後、 0.5mlの ΝΖΥ+培地（1% ΝΖァミン、 0.5% 酵母エキス、 0.5% NaCl、 12.5mM MgCl2、 12.5mMMgS04, 0.4% グルコース、 pH7.5) を添加し、 さらに 37°Cで 1時間 培養した。 この培養液 250 1を LBプレート （1% NaCl、 1% トリプトン、 0.5% 酵母エキス、 2% 寒天、 50mg/L アンピシリ ン） にプレーティングし、 37°Cで 1 日培養した。
得られたコロニー数個を LB培地 （50mg/Lアンピシリ ン） 1.5nilで培養し、 FlexiPrep Kit (アマシャムバイオサイエンス）を使用しプラスミ ドを調製した。 最後に、 得られたプラスミ ドの塩基配列の決定を行い、 目的の変異が導入され ていることを確認した。 このようにして E 93Gの変異導入プラスミ ド： P3R を得た （図 2 )。 ( 2 ) 変異酵素遺伝子を導入した口 ドコッカス菌組換え体 （形質転換 体） の取得
口 ドコッカス . ロ ドクロウス ATCC 1267 株の対数増殖期の細胞を遠心分 離器により集菌し、 氷冷した滅菌水にて 3回洗浄し、 滅菌水に懸濁した。 （ 1 ) で調製したプラスミ ド p3R 1 1と菌体懸濁液 10 μ 1を混合し、氷冷した。 キュ べッ トに DNA と菌体の懸濁液を入れ、 遺伝子導入装置 Gene Pulser (BIO RAD)により 2.0KV、 200 OHMSで電気パルス処理を行った。 電気パルス処理 液を氷冷下 10分静置し、 37°Cで 10分間ヒートショクを行い、 MYK培地 (0.5% ポリペプトン、 0.3%バク トイース トエキス、、 0.3%バク トモルトエキス、 0.2% K2HP04 、 0.2% ΚΗ2ΡΟ4)500 μ 1 を加え、 30°C、 5 時間静置した。 その後、 50 μ g/mlカナマイシン入り MYK寒天培地に塗布し、 30°Cで 3日間培養した。 このようにして得られた口 ドコッ力ス属細菌組換え体 （ATCC 12674/p3R) を MYK培地 (50 g/mlカナマイシン含有） 10mlに接種し、 30°Cで 72時間の前培 養を行った。 本培養は MYK培地 (50 g/mlカナマイシン、 5 μ g/ml CoCl2、 0.1% 尿素含有） 100mlで行い、 前培養から 1%接種し、 30°Cで 96時間培養 した。 遠心分離により集菌し、 lOOniM リン酸緩衝液 (pH8.0)で菌体を洗浄し、 最後に少量の緩衝液に懸濁した。
( 3 ) ロ ドコッカス菌組換え体の耐熱性確認
得られた口 ドコッカス菌組換え体を用い耐熱性を調べた。 比較対照として野 生型二ト リ ノレヒ ドラタ一ゼを有する ATCCl2674/pSJ034を用意した。
得られた菌体懸濁液 0.5nilを試験管に入れ、 65で、 70°Cの各温度の水浴中で 10分間保温し、 その後氷中で冷却した。 比較対照として熱処理を行わず 4°Cで 保冷したものを無処理菌として残存活性を求めた。 結果を表 3に示す。
活性測定は 10°Cで 10分間反応させた以外は実施例 1 ( 4 ) と同様の方法で行 つた。 結果を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000032_0001
このように ATCCl2674/pSJ034では 70°C、 10分の熱処理で残存活性が 4% しか保持していなかつたのに対し、 ATCC 12674/p3Rでは 46%の残存活性を 保持していることから、改良型酵素で耐熱性が向上していることが認められた。
[実施例 4 ] 部位特異的なランダム変異
特定の変異場所について、 ランダム変異を行った。
( 1 ) 部位特異的なランダム変異導入
実施例 3の部位特異的変異導入キッ トを用いて、 pJH60 1にランダム変異を 導入した。
変異を導入する場所として βサブュニッ トのアミノ酸配列のうち第 93番目 を選び、 変異を導入するための 2種のプライマーを合成した。 下線部は変異導 入部位を示す。
β 93RM-F: caagatcatcaccgaagaaNNScgaaagcaccgtgtgcaag (酉己歹 ί|番号 11) β 93RM-R： cttgcacacggtgctttcgSNNttcttcggtgatgatcttg (配列番号 12)
N:A + T+G + C S:G+C PCRは以下の条件で、 GeneAmp9700(PEバイオサイエンス社)を用いて 95°C 1分、 （95°C 50秒、 60°C. 50秒、 68°C 14分） X 18サイクル、 68°C 7分の 反応を行った。
く反応組成液〉
pJH601 (lOng) 2μ1
10 X 反応 Buffer δμ 1
プライマー 93RM-F (lOOng/μ ϊ) Ιμ ΐ
プライマー 093RM-R (lOOiig 1) lul
2.5mM d NTPmix ll.i l
滅菌水 36 μ ΐ
QuickSolution 3μ1
Pfu Turbo DNA Polymerase
PCR終了後、 反応液 10//1を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 6kb の増幅断片の検出を行った。 増幅断片を確認した後、 1/Π の Dpnl (キットに 付属） を PCR反応液に添加して 37°Cで 1時間反応し、 鐯型 DNAの除去を行 つた。 次に、 XL10-GOLD ultraconpetent cell (キットに付属） を用いて形質 転換を行った。 の Dpnl処理済みの PCR反応液と 45μ1のコンビテントセ ルを混ぜ 4°Cで 30分保温し、 42。Cで 30秒ヒートショックを行った後、 0.5ml の NZY+培地 （1% NZ ァミン、 0.'5ο/ο 酵母エキス、 0.5% NaCl、 12.5mM MgCl2、 12.5mMMgS04, 0.4% グルコース、 ρΗ7·5) を添加し、 さらに 37°C で 1時間培養した。 この培養液 250μ1を LBプレート （1% NaCl、 1% トリ プトン、 0.5% 酵母エキス、 2% 寒天、 50mg/L アンピシリン） にブレーティ ングし、 37。Cで 1 日培養した。
(2) 部位特異的ランダム変異導入株の評価
上記工程 (1)で得られたコロニーおよび XL10/pJH601を、 LB-Amp培地（ImM IPTG、 5 μ g/ml C0CI2含有） を 1mlずつ入れた 96穴ディープゥエルプレート にそれぞれ接種し、 37°Cにて 12時間液体培養した。 得られた培養物を、 55°C の温度下、 30分間の熱処理に供した後、 残存二トリルヒ ドラターゼ活性の測定 を つた。
活性測定は実施例 1 (4) と同様の方法で行った。 比較対照として熱処理を 無処理菌として残存活性を求めた。 コントロールに対し残存活性が高かったものについては、 さらに塩基配列の 決定を行った。
結果を表 4に示す。
表 4 アミノ酸置換体の相対残存活性
Figure imgf000034_0001
表 4から明らかなように、 サブユニット 93 番目のアミノ酸は他のアミノ 酸に置換しても耐熱性は向上していた。
[実施例 5 ]
サブュニッ ト 167番目のアミノ酸にランダム変異を導入した。
変異を導入するための 2種のプライマーのみを変更し、 その他は実施例 4と 同様の操作を行った。 下線部は変異導入部位を示す。 結果を表 5に示す。
β IGTRM-e1： gtgcccgaaatatgtgcggNNSaagatcggggaaatcgtcer (配歹 ij番"^ 13)
β 167RM-R： cgacgatttccccgatcttSNNccgcacatatttcgggcac (配列番号 14)
N:A+ T+ G + C S:G+C 表 5 アミノ酸置換体の相対残存活性
Figure imgf000035_0001
表 5から明らかなように、 ]3サブュニッ ト 167番目のアミノ酸は他のアミノ 酸に置換しても耐熱性は向上していた。
[実施例 6 ] 口 ドコッカス '口 ドク口ウス M8株由来二トリルヒ ドラタ ーゼへの変異導入
( 1 ) 二トリルヒ ドラターゼ遺伝子のクローニング
口 ドコッカス ·ロ ドクロウス M8株を実施例 1に示す方法と同様の方法で培 養し、培養菌体から染色体 DNAを調製した。次に、以下の条件で PCRを行い、 二トリノレヒ ドラターゼ遺伝子を增幅した。 なお、 ロ ドコッカス ' ロ ドクロウス M8株はロシア菌株センター IBFM (VKPM S-926) から容易に入手することが できる。 ' '
く反応溶液組成〉 ' 錶型 DNA (染色体 DNA)
10 X ExTaq Buffer (宝酒造社製） 10 μ \
プライマー MH-01 Ι μ Ι
プライマー MH-02 Ι μ ΐ
5mM d NTPmix 8 μ \
滅菌水 18 μ ΐ
ExTaqDNAポリメラーゼ （宝酒造社製）
<プライマー〉
ΜΗ-01： ccatggatggtatccacgacacaggcggcatgacc (酉己列番号 15)
MH-02： aagcttcacgctggcctcgagcgcctttgtccag (酉己歹 ϋ番"^ 16)
PCRは、 Theraialcycler personal (宝酒造）を用いて （94°C 30秒、 65°C 30 秒、 72°C 3分） を 30サイクル行った。
PCR終了後、 反応液 5 1を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 1.5kbの 増幅断片 （配列番号 17) の検出を行った。 反応終了液を GFX cohmm (アマシ ャムバイォサイエンス）で精製し、制限酵素 Nco と a で切断を行つた。 制限酵素処理を行った pen産物は 0.7 %ァガロースゲル電気泳動に供し、 1 .
5 kb付近のバンドを回収した。 回収した PCR産物は Ligation Kit (宝酒造)を 用いてベクター （pTrc99Aの HHi;?iflII部位） に結合し、 JM109へ形質転 換を行った。 得られた形質転換体コロニーより数クローンを LB-Amp 培地 1.5ml に接種し、 37°Cで 12時間振盪培養した。 培養後、 この培養物を遠心分 離により集菌した。 Flexi Prep (アマシャムバイオサイエンス社製） を用いる ことにより、 集菌した菌体からプラスミ ド DNAを抽出した。 得られたプラス ミ ド DNAを制限酵素 Nco と ndlllで切断後、 0.7 %ァガロースゲルにより 電気泳動を行い、 二トリルヒ ドラターゼ遺伝子断片 （1.5kb) が正しく連結さ れているクローンを選んで pMH301 (図 3 ) と命名した。 pMH301 を用いて JM109の形質転換を行った （JM109/pMH301)。
( 2 ) 部位特異的変異の導入
部位特異的変異の導入は実施例 3.に示す方法に従い、 サブユニッ トの 93 番目に変異を導入した。 プライマーの塩基配列のうち下線部は変異導入部位を 示す。
NHM-F： gatcatcaccgaagaagggcgaaagcaccgtgtgc (酉己歹 ll番号 9)
NHM-R： gcacacggtgctttcgcccttcttcggtgatgatc (配列番号 1 0 )
P C I は以下の条件で、 Gene Amp 9700(PEバイオサイエンス社）を用いて 95°C 1分、 （95°C 50秒、 60°C 50秒、 68°C 14分） X 18サイクル、 68°C 7分の反 応を行った。
<反応組成液 >
pMH301 (lOng) 2 \
10 X 反応 Buffer 5μ\
プライマー NHM-F (I00ng/^1) ΙμΙ
プライマー NHM-R (100ng//i l) Ιμΐ
2.5mM d NTPmix ΙβΙ
滅菌水 . 36 Ail
QuickSolution 3^1
Pfu Turbo DNA Polymerase
PCII終了後、 反応液 ΙΟμΙを 0.7°/。ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 5kb の増幅断片の検出を行った。 増幅断片を確認した後、 の Dpnl (キッ トに 付属） を PCR反応液に添加して 37°Cで 1時間反応し、 鐃型 DNAの除去を行 つた。 次に、 XL10- GOLD ultracompetent cell (キットに付属） を用いて形質 転換を行った。 2 ilの Dpnl処理済みの PCR反応液と 45 1のコンビテントセ ルを混ぜ 4°Cで 30分保温し、 42°Cで 30秒ヒートショックを行った。 その後、 0.5mlの NZY+培地（1% NZァミン、 0.5% 酵母エキス、0.5% NaCl、 12.5mM MgCl2、 12.5mMMgS04、 0.4% グルコース、 pH7.5) を添加し、 さらに 37°C で 1時間培養した。 この培養液 250 1を LBプレート （1% NaCL 1% トリ プトン、 0.5% 酵母エキス、 2% 寒天、 50mg/L アンピシリ ン） にプレーティ ングし、 37°Cで 1 日培養した。
得られたコロニー数個を LB 培地 （50nig/L アンピシリ ン） で培養した。 FlexiPrep Kit (アマシャムバイオサイエンス）を使用し、プラスミ ドを調製した。 最後に、 得られたプラスミ ドの塩基配列の決定を行い、 目的の変異が導入され ていることを確認した。 このようにして E (3 93G の変異導入プラスミ ド ： ρΜΗ 04を得た。
同様に、 以下のプライマーを用い サブュニッ トの 167番目に変異を導入し た。 下線部は変異導入部位を示す。
β 167-F： cccgaaatatgtgcggagcaagatcggggaaatcg (酉己歹 号 18)
β 167'R： cgatttccccgatcttgctccgcacatatttcggg (酉己歹 ίΙ番 19)
'得られたコロニー数個を LB培地 （50mg/Lアンピシリン） で培養し、 プラ スミ ドを抽出した。 得られたプラスミ ドの塩基配,列の決定を行い、 目的の変異 が導入されていることを確認した。 このようにして 167S の変異導入プラ スミ ド ： pMH508を得た。
( 3 ) 活性測定
工程 （ 2 ) で 得 ら れ た XLlO/pMH404XL10-Gold/pMH508 お よ び XLlO/p H301 を、 LB'Amp培地 （ImM IPTG, 5 μ g/mi CoCi2含有） 10mi に接種し、 37°Cにて 12時間液体培養した。得られた培養物を、 55°Cの温度下、 30分間の熱処理に供した後、 残存二トリルヒ ドラターゼ活性の測定を行った。
活性測定は実施例 1 ( 4 ) と同様の方法で行った。 比較対照として熱処理を 行わず 4°Cで保冷したものをそれぞれの無処理菌として残存活性を求めた。 結 果を表 6に示す。 表 6
Figure imgf000038_0001
表 6力 ら明らかなように、 ロ ドコッカス . ロ ドクロウス M8株由来の二トリ ルヒ ドラターゼにおいても、. E 3 93G、 N /3 167Sの導入によって耐熱性が向上 していることが認められた
[実施例フ] 改良型二トリルヒ ドラタ一ゼ遺伝子の取得 （II) ( 1 ) 変異遺伝子ライブラリーの構築
本実施例では、 口 ドコッカス ' 口 ドク口ウス J- 1株由来の二トリルヒ ドラタ ーゼ遺伝子へのランダム変異導入を行った。 変異導入は、 PCRにおけるヌクレ ォチドの誤取り込みによる寧基置換を利用した。 铸型となるプラスミ ドは野生 型 サブュニッ トの 167番目のァミノ酸がァスパラギンからセリンに変異した プラスミ ド p52 (図 4 ) を用いた。
二 ト リソレヒ ドラターゼ遺伝子へのランダム変異導入 POR は、 下記反応液組 成、 反応条件で行った。
<反応液組成 >
銹型プラスミ ド （p52) (lOng) 1^1
10 X PGR Buffer (GIBCO社製） 10 μ\
50mM MgCl2 (GIBCO社製） 3μ 1
プライマー Ti'c-02 (lOOng/ 1) 1
プライマー Trc-03 (lOOng/μΙ) ' ΙμΙ
2.5mMdNTPmix 8μ\
lOmM dITP 2μ\
. lOmM dBraUTP 2μ\
滅菌水 71μ\
Taq DNAポリメラーゼ （GIBCO社製）
<プライマー〉
TRC-02： ggaattcgtataatgtgtggaattgtgagc (配列番号 7 )
TRC-03： ggctgaaaatcttctctcatccgcc (配列番号 8)
PCRは GeneAmp9700(PEバイォサイエンス社）を用いて（94。C 30秒、 65。C 30秒、 72°C 3分） を 30サイクル行った。
PCR終了後、 反応液 5 1を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 3 kbの 増幅断片の検出を行った。 反応終了液を GFX column (アマシャムバイオサイ エンス） で精製し、 制限酵素 Vり Iと ί/ΙΠで切断を行った。 制限酵素処理 を行った PCR産物は 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 3 Kb付近のバン ドを回収した。 回収した PCR産物は Ligation Kit (宝酒造)を用いてベクター (pTrc99Aの Ncol-Hhidll部位）に結合した。 この結合生成物を用いて JM109 を形質転換した。
( 2 ) 耐熱性二トリルヒ ドラターゼのスクリーニングおよぴ変異箇所 の同定
上記工程 ( 1 ) で得られ:^変異二 ト リルヒ ドラターゼ遺伝子を含む JM109 形質転換体および野生型二ト リノレヒ ドラターゼ産生株として JM 109/pJH 601 を使用して、 残存二トリルヒ ドラターゼ活性を測定した。
耐熱性の評価は処理温度のみ 60° (：、 20分間に変更し、その他は実施例 1 ( 4 ) と同様の方法で行った。
ランダムに変異導入された二トリノレヒ ドラターゼ遺伝子を有する数千個の組 換え体についてスク リーニングを行った結果、 野生型二ト リルヒ ドラターゼと 比較して高い残存活性を示す組換え体が選抜された。 残存活性の結果を表 7に
表 7
Figure imgf000040_0001
該組換え体を培養してプラスミ ドを回収し、 プラスミ ド pA077 と命名した。 プラス ミ ド pA077 の塩基配列の決定を行った。 塩基配列の決定は BeckmanCEQ:2000XLを使用した。 プラスミ ド pA077の変異遺伝子配列によ つてコードされるアミノ酸配列は、 N 167S、 L 144H 、 V 219A、 V a 129A および L a l%Pの 5箇所に変異を有していた。 [実施例 8] 大腸菌組換え体の作製と評価
( 1 ) プラスミ ドの構築
鎳型プラスミ ド p 52 (図 4 ) に、 実施例 7の （2 ) で得られた変異箇所の情 報をもとに変異を導入した。 変異導入には部位特異的変異導入法を用い、 市販 キッ ト ： QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を使 用した。 実験は操作マニュアルに従った。
変異を導入するための 2種のプライマーを合成した。 下線部は変異導入部位 を'示す。
β 144-F： ggagccgagtttctctcacggtgacaagatc (酉己歹 ίΙ番号 20)
β 144-R： gatcttgtcaccgtgagagaaactcggctcc (酉 t歹 (J畨 21)
'変異を導入するための PCRは以下の条件で、 GeneAmp9700(PEバイオサイ エンス社）を用いて 95°C 1分、 （95°C 50秒、 60°C 50秒、 68°C 14分） X 18 サイクル、 68°C 7分の反応を行った。
<反応液組成 >
錶型プラスミ ド p 52 (lOng)
10 X反応 Buffer '
Figure imgf000041_0001
プライマー/ 3144-F (100ng/ l) 1 7.1
プライマー 144-R (lOOng 1) Ιβί
2.5mM d NTPmix ΙμΙ
滅菌水 36 μ\
QuickSolution 3μ 1
Pfu Turbo DNA Polymerase Ι ΐ
PCR終了後、反応液 ΙΟμΙを 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、約 llkb の増幅断片の検出を行った。 増幅断片を確認した後、 1 w 1 の Dpnl (キッ トに 付属） を PCR反応液に添加して 37°Cで 1時間反応し、 錶型プラスミ ドの除去 をラつた。
次に、 XL10-GOLD ulti'acompetent cell (キッ トに付属） を用いて形質転換 を行った。 2 1の Dpnl処理済みの PCR反応液と 45μ1のコンビテントセルを 混ぜ 4°Cで 30分保温し、 42°Cで 30秒ヒートショックを行った。 その後、 0.5ml の NZY+培地（1% NZァミン、 0.5% 酵母エキス、 0.5°/。 NaCl、 12.5mM MgCl2、 12.5mMMgS04、 0.4% グルコース、 ρΗ7·5) を添加し、 さらに 37°Cで 1時間 培養した。 この培養液 250 1を LBプレート （1% NaCl、 1% トリプトン、 0.5% 酵母エキス、 2% 寒天、 50mg/L アンピシリン） にプレーティングし、 37°Cで 1 日培養した。
得られたコロニー数個を LB培地 （50mg/Lアンピシリ ン） 1.5nilで培養し、 FlexiPrep Kit (アマシャムバイオサイエンス）を使用しプラスミ ドを調製した。 最後に、 得られたプラスミ の塩基配列の決定を行い、 目的の変異が導入され ていることを確認した。 このようにして 144H の変異導入プラスミ ド ： pABOOlを得た。
次に、上記と同様の手法を用い p52又は pABOOlを鐃型プラスミ ドとして V β 219A又は Va 129Aの変異を導入した。 用いたプライマーを以下に示す。 β 219-F： gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (酉己歹 ij番 ·¾" 22)
β 219-R： ggttcccagagatcggcgcacactacgtctttc (酉己歹リ番号 23)
ひ 129-F： gagtaccggtcccgagcggtagcggaccctcg (酉己歹 U番号 24)
129-R: cgagggtccgctaccgctcgggaccggtactc (目 d歹 lj番号 25)
得られたプラスミ ドはそれぞれ pAB002 (N/3167S, V 219A) 、 pAB003 (N S 167S、 V a 129A) 、 pAB004 (Νβ 167S, L/3144H, V|3219A) .と命名 した。 ( 2) 耐熱性評価
( 1 ) で得られた変異二トリルヒ ドラターゼ遺伝子を含むプラスミ ドをそれ ぞれ大腸菌 JM109に形質転換体し、組換え菌を得た。この組換え菌を LB-Amp 培地 （lmM IPTG、 S z g/ml CoC 含有） 1. 5mlにそれぞれ接種し、 37°Cにて 12時間液体培養した。 得られた培養菌液を、 6 0°Cの温度下、 2 0分間の熱処 理に供した後、 残存二ト リルヒ ドラターゼ活性の測定を行つた。 活性測定は実 施例 1の （4)' と同様の方法で行った。 残存活性の結果を表 8に示した。 表 8
Figure imgf000043_0001
表 8から明らかなように L 144H、 V 219A、 219Aの導入によって耐 熱性が向上していることが明らかとなった。
[実施例 9 ] 口ドコッカス ( /70C/OCOCCUS)菌組換え体の作製と評価
( 1 ) プラスミ ドの構築 ，
以下の方法で i3サブユニットの 167番目に変異 （N 167S) を有する口 ドコ ッカス ( ½。 OCOCC )菌用プラスミ ドを作製した。変異の導入は部位特異的変異 導入法を用レヽ、 市販キッ ト ： QuikChange XL Site -Directed Mutagenesis Kit(Stratageiie 社)を使用した。 実験は操作マニュアルに従った。 変異を導入 する鎳型プラスミ ドとして pSJ034を使用した。
変異を導入するための 2種のプライマーを合成した。 下線部は変異導入部位 を示す。
β 167-F： cccgaaatatgtgcggagcaagatcggggaaatcg (酉己歹 II番号 18) β 167-R： cgatttccccgatcttgctccgcacatatttcggg (酉己歹リ番号 19)
変異を導入するための PCRは実施例 3(1)と同様の条件で行った。 <反応液組成 > 鎵型プラスミ ド pSJ034 (lOng) 2μ 1
10 X 反応 Buffer 5 /1
プライマー 67-F (lOOng/^ 1) 1μ 1
プライマー (lOOng/μΙ) 1μ 1
2.5mM cl NTPmix 1μ 1
滅菌水 36 1
Quickbolut.ion 3.ί 1
Pfu Turbo DNA Polymerase
,PCR 終了後、 実施例 3(「1)と同様の手法により の口 ドコッカス
Figure imgf000044_0001
変異導入プラスミ ド： p52Rを得た。
次に、 上記と同様の手法を用い p52Rを鍚型プラスミ ドとして L/3144H、 V 219Α又は Vo;129Aの変異を導入した。 用いたプライマーを以下に示す。 β 144-F： gga gccgagtttctctcacggtgacaa gate (酉己歹 U番号 20)
β 144-R： gatcttgtcaccgtgagagaaactcggctcc (酉己歹 U番号 21)
β 219-F： gaaagacgtagtgtgcgccgatctctgggaacc (酉己歹 U番"^ 22)
β 219-R： ggttccca a gatcggcgcacactacgtctttc (酉己歹 U番^" 23)
a 129-F： gagtaccggtcccgagcggtagcggaccctcg (酉己歹 ij番号 24)
a 129-R: cgagggtccgctaccgctcgggaccggtactc (酉己歹 lj番号 25)
得られたプラスミ ドはそれぞれ pAROOl (N/3167S, 144H) 、 pAR002 (N^ 167S, V β 219A) 、 pAR003 (N^ 167S, Va 129A) と命名した。 さら に得られたプラスミ ド pAROOlを鎳型プラスミ ドとして上記と同様の手法を用 い V^219Aの変異を導入した。 得られたプラスミ ドは pAR004 (N^ 167S、 L β 144H, 219A) と命名した。 '
(2) ロ ドコッカス CffAoi¾co«?"s)菌組换え体の作製
ロ ドコッカス ' ロ ドクロウス Rhodococcus l'hodochl醒 s、 ATCC 12674 株 の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、 氷冷した滅菌水にて 3回洗浄 し、 滅菌水に懸濁した。 （1 ) で調製したプラスミ ド 1 μ 1 と菌体懸濁液 1 0 u 1 を混合し、 氷冷した。
その後実施例 3 (2) と同様の操作を行った。 + ( 3 ) ロ ドコッカス（ ½oi¾«^ci/s)菌組換え体の耐熱性評価 得られた口 ドコッカス（ ?oi¾coccus)菌組換え体を用いて実施例 3 ( 3 ) の方 法と同様に熱処理後の残存二トリルヒ ドラターゼ活性を調べた。
口 ドコッカスひ½り i ococci/s)属細菌組換え体は MYK培地 （50 μ g/mlカナマ イシン、 5 μ g/ml CoCl2、 0.1 % 尿素含有） にそれぞれ接種し、 30°Cにて 3 日 間振とう培養した。 遠心分離により集菌し、 lOOmM リン酸緩衝液 (pH8.0)で菌 体を洗浄し、 最後に少量の緩衝液に懸濁した。
加熱処理は、 適宜希釈した菌体懸濁液 0.5mlを試験管に入れ、 65°Cの温度下 の水浴中で 30分間保温し、 その後氷中で冷却した。
活性測定は実施例 3 ( 3 ) と同様の方法で行った。 残存活性結果を表 9に示 した。 表 9
Figure imgf000045_0001
ATCC 12674/pSJ03 では 65°C、 30分の熱処理で残存活性が 31 %であった のに対し、 ATCC 12674/pAR001〜pAR004では 60 %以上の残存活性を保持し ていることから、 改良型二トリルヒ ドラターゼで耐熱性が向上していることが 認められた。 '
( 3 ) アクリルアミ ド耐性の評価 実施例 9 (2)で用いた形質転換体を用いてァクリルアミ ド耐性を評価した。 以下の組成の反応液を調製し、 30°Cで攪拌しながら反応させた。 なお、 反応に 用いる各菌体懸濁液の菌量は、 実施例 3 (3) の方法で測定した活性の測定結 果に従い、 同一の酵素活性単位 (U)量となるように調製した。比較対照として野 生型二トリルヒ ドラターゼを有する ATCCl2674/pSJ034を使用した。
<反応液組成〉
30%アク リルアミ ド溶液 95g
, アク リ ロニトリル 3g
1M リン酸緩衝液 1g
保存菌液 （同一の酵素活性単位（U)量） 1g
反応開始前 （0時間） 、 0.5時間後及ぴ 20時間後にそれぞれ反応液 lmlをサン プリングし、 0.22 mのフィルターを用いて濾過を行った。 得られた濾液を、 ガスクロマトダラフィ一に供して分析した。 （分析機器： ガスクロマトグラフ GC-14B (島津製作所製)、 検出器； FID 、 検出温度： 200で、 カラム ： ポラパ ック PS (ウォーターズ社製カラム充填剤） を充填した 1. 1mパック ドガラス力 ラム、 カラム温度： 190°C、 キャリアーガス ： N2)
分析の結果、濾 中に残存するァクリロニト'リルの割合（％)を表 10に示す。 表 10残存するアク リロニ トリル （％) '
プラ ス ミ 変異場所 残ァク1 'リル量 (%) AN消費量 ド名 0時間 0.5時間 20時間 (%)
PSJ034 なし 3.12 2.81 1.98 1.14 p52R β 167 3.12 2.83 1.80 1.32 pAROOl β 167+ β 144 3.12 2.75 1.54 1.58 pAR002 β 167+ β 219 3.12 2.81 J.25 1.87 pAROり 3 /3167+ α 129 3.12 2.75 0.94 2.18 pAR004 β 167+ β 144 +
β 219+ a 129 + 3.12 2.75 0.01 3.11
196 以上のように、 改良型二ト リ ノレヒ ドラターゼは、 比較対照の pSJ034より消 費したアクリロニトリルが多いことから、 改良型二トリルヒ ドラタ一ゼは、 高 濃度のアクリルアミ ド存在下でも活性が維持され、 アクリルアミ ドに対する耐 性が高いことが判った。
[実施例 1 0 ]口 ドコッカス'口 ドク口ウス Rhodococcus rhodochrous) ' M8株由来二トリルヒ ドラターゼへの変異導入、 組換え体作製と評価
( 1 ) 変異導入組換え体の作製
ロ ドコッカス ' ロ ドクロウス 、Rhodococcus rhodochrous) M8 4朱由来-ト リルヒ ドラターゼに変異導入を行った。 部位特異的変異導入は、 使用したプラ スミ ドカ ロ ドコッカス · 口 ドク口ウス 、Rhodococcus rhodochrous) M8 株由 来二トリルヒ ドラターゼをコードする遺伝子 （配列番号 1 7 ) を含む発現プラ スミ ドの pMH301 (図 3 ) である以外は、 実施例 6(2)と同様の方法で行った。 得られたプラスミ ドは、 それぞれ pMH508 ( iS 167S) 、 pMH60i (N /3 167S L β 144H) 、 pMH602 (N 167S、 V /3 219A) 、 pMH603 (N 167S、 V a l29A) と命名した。 該プラスミ ドは JM109 に形質転換し、 変異導入組換え菌を作製 した。 得られた組換え菌は、 LB-Amp培地 （lmM IPTG、 5 g/ml CoCl2含有） 10mlに接種し、 37°Cにて 12時間液体培養した。
( 2 ) 耐熱性評価
得られ ^こ培養物は、 60°Cの温度下、 20分間の熱処理に供した後、 残存二トリ ルヒ ドラターゼ活性の測定を行つた。 活性測定は実施例 7の （ 2 ) と同様の方 法で行った。 比較対照として熱処理を行わず 4 °Cで保冷したものをそれぞれの 無処理菌として残存活性を求めた。 残存活性結果を表 1 1に示した。 プラスミ ド名 残活性 （％) •変異場所
pMH301 10 'なし
pMH508 21 Ν 67S
pMH601 42 (Νβ 167S, L/3144H) pMH602 38 (Νβ 167S V^219A) pMH603 33 (N/3167S、 V a 129A) 口 ドコッカス · 口 ドク口ウス Rhodococcus rhodochrous) M8 株において も改良型-トリルヒ ドラターゼで耐熱性が向上していることが示された。
[実施例 1 1 ] 変異型二トリルヒ ドラターゼ遺伝子の取得
( 1 ) プラスミ ドの構築
実施例 1で作製した p JH601から実施例 1 ( 3 ) と同様の方法でランダム変 異が導入された二トリルヒ ドラターゼ遺伝子を増幅し、 3Kb の PCR産物を回 収した。 ' 回収した PCR産物は Ligation Kit (宝酒造）を用いてプラスミ ド pFY529の A oI- fojin部位に挿入し、 JM109の形質転換を行い、 形質転換体を得た。 な お、 pFY529の作成は、 参考例 1に記載した。
( 2) 基質特異性変異二ト リルヒ ドラクーゼの取得及ぴ変異箇所の同 定
上記工程 (1)で得られた変異二 トリノレヒ ドラターゼ遺伝子を含む JM109形質 転換体およぴ JM109/p JH601を、 実施例 1 ( 4 ) と同様にして二トリルヒ ドラ ターゼ活性の測定を行った。
数百株の形質転換体についてスク リーニングを行った結果、 野生株と比較し て明らかに 3-シァノピリジンに高い活性を示す株が 1株 （JM109/pNHMl01) が得られた。 また、 その菌株を培養してプラスミ ドを回収し、 塩基配列の決定 を行った。 塩基配列の決定は BeckmanCEQ-2000XLを使用した。 本プラスミ ド の二トリノレヒ ドラタ一ゼ遺伝子においては、 /3サブュニッ トの 48番目のトリブ トファン残基 (TGG)がアルギニン残基 (CGG)に変化していた。
[実施例 1 2] ロ ドコッカス組換え体の作製
'実施例 1 1で取得した変異酵素の性質を口 ドコッカス菌組換え体で確認した ( 1 ) ロ ドコッカス菌導入用プラスミ ドの構築
以下の方法で ρΝΗΜΙΟΙの変異 （W/348R) を有する口 ドコッカス菌導入用 プラスミ ドを作製した。 変異の導入は Kurosawa らの方法（Gene. 1991 15;102:67-70)により行った。 変異を導入するプラスミ ドとして pSJ034を使用 した。 pSJ034 は口 ドコッカス菌において二トリルヒ ドラターゼを発現するプ ラスミ ドであり、 pSJ034は pSJ023より特開平 10-337185号公報に示す方法 で作製した。 pSJ023は形質転換体 「R. rhodochrous ATCCl2674/pSJ023」 と して独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市 東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に寄託されている （FERMBP-6 2 3 2) 。 IstPCR
以下の条件で 2種の IstPCR反応を行った。 GeneAmp9700(PEバイオサイエ ンス社）を用いて 95°C 1分、 （95°C 60秒、 60°C 60秒、 72°C 10分） X30サイ クル、 72°C 7分の反応を行った。
<反応液組成 >
p SJ034 (10ng) 2μ1
10χ 反応 Buffer 5 Ι
プライマー 1 (lOOng/μΙ) 1μ\
プライマー 2 (lOOng/μΙ) ΙμΙ
2.5mM dNTPraix 1μ\
滅菌水 36μ1
Pfu Turbo. DNA Polymerase 1μ\ 2種の PCRは、 プライマー 1 (NR-01) とプライマー 2 (NH18) との組合 せ、 およびプライマー 1 (NOXbal-l) とプライマー 2 (REl'02) の組合せで 行った。
NR-01： AACGTCGACACCGGTGGTGG (配列番号 26)
NH18: CCGCGACTTGTCCCGCCACGATATGCCC (配列番号 27)
(変異導入用プライマ一、 変異個所をアンダーラインで示す） ' NOXbal- l： GTACCCGGGGATCCACTAGA (配列番号 28)
RE1-02： CCTTAGTCAGCTTCTGTCCG (配列番号 29)
PCR終了後、 反応液 1 1を 0.7%ァガロースゲル電気泳動に供し、 増幅断片 の確認を行った後、 残りの反応液を同条件によるァガロースゲル電気泳動に供 し、 增幅断片の精製を行った。
2ndPCR
IstPCRで得られた 2種の PCR断片を用いて、下記の条件で 2ndPCRを行った
<反応液組成〉
1 Ox反応 Buffer 5 μ 1
1st PCR断片 1 Ι μ ϊ
1st PCR断片 2 Ι μ ΐ
2.5mM dNTPmix Ι μ ΐ
滅菌水 36 1
Pfu Turbo DNA Polymerase 1 μ 1 酵素を入れない条件で、 93°Cで 10分処理後、 1時間かけて 37°Cに冷却し、 37 °Cで 15分間放置し、 酵素を加えて 1分、 （95°C 60秒、 60°C 60秒、 つ 2。C 10分） X 30サイクル、 72°C 7分の反応を行った。
得られた PCR産物をァガロースゲル電気泳動により確認した後、 Λ δΙ及び e8387Iにより処理し、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を精製した。 精製 した PCR 断片は Ligation Kit(宝酒造）を用いてベク タ ー pSJ034U¾aI-&e8387I部位）に結合し、 JM109の形質転換を行った。得られた 形質転換体コロニーより数クローンを LB-Arap培地 1:5mlに接種し、 37°Cで 12時間振盪培養した。培養後、 この培養物を遠心分離により集菌した後、 Flexi Prep (アマシャムバイオサイエンス社製） を用いることによ り、 プラスミ ド DNAを抽出した。 得られたプラスミ ド DNAを制限酵素 Xbal と e8387Iで 切断後、 0.7%ァガロースゲルにより電気泳動を行い、 二トリルヒ ドラターゼ遺 伝子を含む断片（約 2kb)が正しく連結されているクローンを選んだ。最後に、 得られたプラスミ ドの塩基配列の決定を行い、 目的の変異が導入されているこ とを確認した。 このようにして W iS 48Rの変異導入ブラスミ ド： pAJOOlを得 た。
( 2 ) 変異酵素遺伝子を導入したロ ドコッカス菌組換え体の取得 口 ドコッカス · 口 ドク口ウス ATCC 12674 株の対数増殖期の細胞を遠心分 離器により集菌し、 氷冷した滅菌水にて 3回洗浄し、 滅菌水に懸濁した。
( 1 )で調製したプラスミ ド p AJOOl 1 μ 1 と菌体懸濁液 1 0 μ 1を混合 し、 氷冷した。
その後は実施俐 3 ( 2 ) と同様の処理を行い、 ロ ドコッカス菌組換え体を得 た。 '
( 3 ) ロ ドコッカス菌組換え体の活性
得られた口 ドコッカス菌組換え体を用いて、 ァクリルアミ ド及び 3—シァ ノ ビリジンに対する活性を調べた。 LB-Amp培地 （lmM IPTG、 5 μ g/ml C0CI2 含有） を lmlずつ入れた 9 6穴ディープゥエルプレートにそれぞれ接種し、 37 °Cにて 12時間液体培養した。 得られた培養物の二トリルヒ ドラターゼ活性の測 定を行った。
活性測定は 5% アタリロニトリル /50mMリン酸緩衝液 pH 7.7又は 0.5% 3·シ ァノピリジン /50mMリン酸緩衝液 pH 7.7を菌液に対して等量加え、 30。Cで 30 分反応させた。 反応終了後、 0.1Mリン酸を反応液と等量加え遠心分離し、 その 上清を適宜希釈し HPLCに供し、 生成したアミ ド濃度を分析した （アクリルァ ミ ド： WAKOSIL 5C8 (和光純薬） 、 5 mMリン酸を含んだ 1 0 %ァセトニ トリノレ、 ニコチンアミ ド： WAKOSIL 5C8 (和光純薬） 、 5 mMリン酸を含 んだ 3 5 %ァセトニトリル） 。 比較対照として野生型二トリルヒ ドラターゼを有する ATCC12674 /pSJ03 を 用意した。 結果を表 1 2に示した。
表 1 2
Figure imgf000052_0001
[実施例 1 3 ]
pNHMlOl を鎳型にして前記と同様にして変異二トリルヒ ドラターゼ遺伝子 ライブラリーを作製し、 耐熱性を指標にスクリー-ングを行った。
スク リーニングは実施例 1 ( 4 ) と同様の処理条件と方法で行った。
数百株の形質転換体についてスクリーニングを行った結果、 野生株と比較し て高い残活性を示す株が 1株得られた (JIvn09/pNHlVElll)。 これを培養してブ ラスミ ドを回収し、 塩基配列の決定^行った。 塩基配列の決定は
BeckmanCEQ'2000XLを使用した。本プラスミ ドのニトリノレヒ ドラターゼ遺伝 子においては、 pNHMlOlの変異に加えて、 /3サブユニットの 2 6番目のヒス チジン残基 (CAC)がアルギニン残基 (CGC)に変化していた。.
[実施例 1 4 ]
実施例 1 3で取得した耐熱酵素の変異 2 6 R ) の性質を口 ドコッカス 菌組換え体で確認した。
変異プライマーとして NH-18の代わりに NH-25を用い、 実施例 1 2と同様 にしてプラスミ ドを作製した。 これを pAJ006と名付け、 実施例 1 2と同様に してロ ドコッカス 口 ドク口ウス ATCC12674株に導入した。
NH25 ： CCCTCCCACTCGTAGCGGAAGAAGGGCTCG (配列番号 30)
(変異導入用プライマー、 変異個所をアンダーラインで示す） 得られたロ ドコッカス菌組換え体を用いて実施例 3 ( 3 ) と同様に耐熱性を 調べた。 比較対照として野生型二トリルヒ ドラターゼを有する
ATCC12674/pSJ034を用意した。
得られた菌体懸濁液 0.5m 1を試験管に入れ、 65°C、 70の各温度の水浴中で 10 分間保温し、 その後氷中で冷却した。 残活性は、 熱処理を行わず 4 °Cで保冷し たもの （無処理区） の初期活性を 100%とした相対活性で評価した。
ATCCl2674/pSJ034では 70°C、 10分の熱処理で残活性が 4 %に対し、 ATCC 12674/pAJ006では 40%の残活性を保持していたことから、 変異酵素 （H 3 26R ) で耐熱性が向上しているこ ^が認められた。 [参考例 1 ]
エステラーゼ発現プラスミ ド pFY529の作成
プラスミ ド pFY529には Pseudomo塵 fluorescens由来のエステラーゼ遺伝 子が含まれているが、 本プラスミ ドは特開平 1— 6 7 1 9 0に記載されている プラスミ ド pFY520 より作成した （図 5 A、 図 5 B) 。 プラスミ ド pFY520は 形質転換体 「JM 1 0 9 /pFY 5 2 0」 として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託さ れている （FERM BP- 1 4 6 9 ) (原寄託日 ： 1987年 9月 3 日） 。
pFY520を制限酵素 で切断後、 ηΛΪΪ ΪΙンカーとともにライゲーショ ンを行い、 pFY520のΛ¾eI部位が Hi2rfriI部位に置き換わったプラスミ ドを得た 。 これを pCFOOlと命名した。 pCFOOlを制限酵素 Hiadllで切断し、 エステラ ーゼ遺伝子を含む約 0.8kbの DNA断片を調製した。 本断片を発現ベクター pKK233-2の ί& ΛΠ部位に trcプロモーターと同方向になるように挿入し、プラ スミ ド pCF002を得た。 pCF002を制限酵素 及ぴ ^1で切断して得られた 約 1.96M)の断片と、 プラスミ ド pUC18を制限酵素 Vi/II及び で切断して得 られた約 1.55kbの断片を結合させ、 プラスミ ド pFY529を得た。 pFY529は trc プロモーターを有する点では pCF002 (pKK233-2ベクター） と同等であるが、 コピー数がより高いという特徴を有する。 産業上の利用可能性
本発明により改良型二トリルヒ ドラターゼが提供される。 本発明の二 トリル ヒ ドラターゼは、 耐熱性が高く、 また基質特異性も高い点で、 アミ ド化合物を 効率良く製造するために有用である。 配列表フリ ―テキス卜
配列番号 5 合成 DNA
配列番号 6 合成 DNA
配列番号 7 合成 DNA
配列番号 8 合成 DNA
配列番号 9 合成 DNA
配列番号 1 0 ：合成 DNA
配列番号 1 1 ：合成 DNA
配列番号 1 1 ： nは a, c, gまたは tである (存在位置 20-21)。
配列番号 1 2 ：合成 DNA
配列番号 1 2 ： nは a, c, gまたは tである (存在位置 21-22)。
配列番号 1 3 ：合成 DNA
配列番号 1 4 ：合成 DNA
配列番号 1 4 ： nは a, c, gまたは tである (存在位置 21-22)。
配列番号 1 5 ：合成 DNA
配列番号 1 6 ：合成 DNA
配列番号 1 8 ：合成 DNA
配列番号 1 9 ：合成 DNA
配列番号 2 0 ：合成 DNA
配列番号 2 1 ：合成 pNA
配列番号 2 2 .：合成 DNA
配列番号 2 3 ：合成 DNA
配列番号 2 4 ：合成 DNA
配列番号 2 5 ：合成 DNA 配列番号 2 6 ：合成 DNA 配列番号 2 7 ：合成 DNA 配列番号 2 8 ：合成 DNA 配列番号 2 9 ：合成 DNA 配列番号 3 0 ：合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲 . 以下の (a)、 （b)又は (c)のタンパク質。
(a) 野生型二ト リノレヒ ドラターゼの サブュニッ 卜のアミノ酸配列におい て、 第 24番目のフエ二ルァラニン残基、 第 88番目のイソロイシン残基、 第 92番目のグルタミン酸残基、 第 93番目のグルタミン酸残基、 第 96番 目のヒスチジン残基、 第 103番目のグルタミン酸残基、 第 167番目のァス パラギン残基及び第 225番目のチロシン残基から選ばれる少なく とも 1個 のアミノ酸残基が、 他のァミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二ト リノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 野生型二ト リノレヒ ドラターゼの βサブュニッ トのァミノ酸配列のうち第 167番目のアルギニン残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列 を含み、 かつ、 耐熱性二トリルビドラターゼ活性を有するタンパク質
(c) 上記 (a)若しくは (b)のタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは数 個のアミノ酸残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
. 以下の (a)又は (b)のタンパク質。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの αサブュニッ トのアミノ酸配列において 第 42番目のァスパラギン残基、 第 80番目のァラニン残基、 第 118番目の +ァラニン残基及ぴ第 132番目のァスパラギン酸残基から選ばれる少なく と も 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され'たァミノ酸配列を含 み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 上記 (a)のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸 残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性 二トリノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質 .
. 以下の (a)、 (b)又は (c)のタンパク質。
(a) 野生型二 ト リノレヒ ドラターゼの /3サブュニッ トのアミノ酸配列のうち第 167番目のアルギニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列 において、第 144番目のロイシン残基又は第 219番目のバリン残基が他の ァミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二ト リノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 野生型二トリルヒ ドラタ一ゼの サブュニッ トのアミノ酸配列のうち第
167番目のアルギニン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列、 及び野生型二ト リノレヒ ドラターゼの αサブュニッ トのァミノ酸配列におい て第 129番目のバリン残基又は第 196番目のロイシン残基が他のアミノ酸 残基に置換されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラター ' ゼ活性を有するタンパク質
(c) 上記 (a)又は (b)のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個の アミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、 耐熱性二トリノレヒ ドラタ一ゼ活性を有するタンパク質
4 . 以下の (a)又は (b)のタンパク質。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブュニッ トのアミノ酸配列において 第 26番目のヒスチジン残基及び第 48番目のトリプトフアン残基のうち少 なく とも一方のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配 列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
(b) 上記 (a)のタンパク質のァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 残基が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 耐熱性 - ト リノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質
5 . 第 26番目のヒスチジン残基がアルギ-ン残基に置換された、 請.求項 4記 載のタンパク質。
6 . 第 48番目のトリプトファン残基が、 アルギニン、 ノくリン及びロイシンか ら選ばれるいずれかのアミノ酸残基に置換された、 請求項 4記載のタンパ ク質。
7 .請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のタンパク質をコードする遺伝子 DNA。 8 . 以下の (a).、 （b)又は (c)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列において、 第 70〜72番目、 第 262〜264番目、 第 274〜276番目、 第 277〜279番目、 第 286〜288番目、 第 307〜309番目、 第 499〜501番 目及び第 673〜675番目の塩基のうち少なく とも 1個の塩基が他の異なる 塩基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(b) 野生型二トリルヒ ドラターゼの /3サブュニッ トをコ一ドする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501番目の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基 に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二ト リルヒ ドラターゼ活性を 有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(c) 上記 (a)若しくは (b)の遺伝子 DNAの塩基配列に相補的な塩基配列とス ト リンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二トリノレヒ ドラ ターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
9 . 以下の (a)又は (b)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二 トリノレヒ ドラターゼのひサブュ-ッ トをコードする遺伝子の塩 基配列において、 第 124〜： 126番目、 第 238〜240番目、 第 352〜354番目 及び第 394〜396番目の塩基のうち少なくとも 1個の塩基が他の異なる塩 基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリノレヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
(b) 上記 (a)の遺伝子 DNAの塩基配列に相補的な塩基配列 ·'とストリンジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二トリノレヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
1 0 . 以下の (a)、 （b)又は (c)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの /3サブユニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501·番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異な る塩基に置換された塩基配列において、第 430〜432番目及び第 655〜657 番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配 列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質を コードする遺伝子 DNA
(b) 野生型二トリルヒ ドラターゼの サブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列のうち第 499〜501番目の塩基、 並びに野生型二トリルヒ ドラター ゼの αサブュニッ トをコ一ドする遺伝子の塩基配列のうち第 385〜387番 目及び 586〜588番目の塩基の少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に 置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐熱性二トリルヒ ドラターゼ活性を有 するタンパク質をコ一ドする遺伝子 DNA
(c) 上記 (a)若しくは (b)の遺伝子 DNAの塩基配列に相補的な塩基配列とスト リ ンジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 耐熱性二ト リノレヒ ドラ ターゼ活性を有するダンパク質をコードする遺伝子 DNA
1 1 . 以下の (a又は (b)の遺伝子 DNA。
(a) 野生型二トリルヒ ドラターゼの /3サブュニッ トをコードする遺伝子の塩 基配列において第 76〜78番目及び第 142〜144番目の塩基のうち少なく とも 1個の塩基が他の異なる塩基に置換された塩基配列を含み、 かつ、 耐 熱性二ト リノレヒ ドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
DNA
(b) 上記 (a)の遺伝子 DNA の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェン トな条件下でハイプリダイズし、 かつ、 耐熱性二ト リノレヒ ドラターゼ活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子 DNA
1 2 . 第 77番目の塩基 Aが Gに置換'された請求項 1 1記載の遺伝子 DNA。
1 3 . 第 142番目の塩基 Tが Cに置換された請求項 1 1記載の遺伝子 DNA。 1 4 . 請求項 7〜 1 3のいずれか 1項に記載の遺伝子 DNA を含む組換えべク 1 5 . 請求項 1 4記載の組換えべクターを含む形質転換体または形質導入体。
1 6 . 請求項 1 5記載の形質転換体または形質導入体を培養し、 得られる培養 .物から採取された二トリルヒ ドラターゼ。
1 7 . 請求項 1 5記載の形質転換体または形質導入体を培養し、 得られる培養 物から二トリルヒ ドラターゼを採取することを特徴とする-トリルヒ ドラ ターゼの製造方法。
1 8 . 請求項 1. 5記載の形質転換体を培養して得られる培養物又は該処理物を 二トリル化合物に接触させ、 当該接触により生成されるアミ ド化合物を採 取することを特徴とするアミ ド化合物の製造方法。 .
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