WO2005114293A1 - 顕微鏡装置 - Google Patents

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WO2005114293A1
WO2005114293A1 PCT/JP2005/009446 JP2005009446W WO2005114293A1 WO 2005114293 A1 WO2005114293 A1 WO 2005114293A1 JP 2005009446 W JP2005009446 W JP 2005009446W WO 2005114293 A1 WO2005114293 A1 WO 2005114293A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
image
imaging
optical path
focus control
path length
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/009446
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masafumi Oshiro
Koji Ichie
Original Assignee
Hamamatsu Photonics K.K.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hamamatsu Photonics K.K. filed Critical Hamamatsu Photonics K.K.
Priority to JP2006513762A priority Critical patent/JPWO2005114293A1/ja
Publication of WO2005114293A1 publication Critical patent/WO2005114293A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/244—Devices for focusing using image analysis techniques
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing
    • G02B21/245—Devices for focusing using auxiliary sources, detectors

Definitions

  • the present invention relates to a microscope device used for acquiring an image of a sample.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3390106
  • Patent Document 2 JP-A-9-230250
  • Patent Document 3 JP-A-8-21961
  • Patent Document 4 JP-A-11-264937
  • the microscope described in Document 1 includes a line sensor installed in a state of being inclined with respect to the optical axis, and a rotating reflecting mirror arranged in front of the line sensor. Is used.
  • the sample is irradiated with laser light, and the focus is controlled with reference to the amount of reflected laser light incident on the line sensor via the reflecting mirror.
  • the microscope described in Document 2 uses a photosensor that detects the amount of light and a thickness change glass disposed in front of the photosensor. Then, similarly to the above-mentioned document 1, the sample is irradiated with laser light, and the focus is controlled with reference to the amount of reflected laser light incident on the photosensor via the thickness change glass.
  • an imaging device for acquiring an image of a sample includes a vertical position perpendicular to an optical axis and a tilt inclined at a predetermined angle.
  • the focus is controlled by changing the mounting angle depending on the position.
  • position control of the imaging device since it is necessary to change the position of the imaging apparatus, the focus control of imaging and the actual image acquisition cannot be performed at the same time as in the above-described configuration of irradiating the laser beam. . Further, since position control of the imaging device is necessary, there is a problem that the imaging operation is complicated as a whole.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and has as its object to provide a microscope apparatus capable of simultaneously performing image acquisition of a sample and focus control of imaging. You.
  • the microscope apparatus includes: (1) an optical branching unit that branches an optical image of a sample into a first optical path for acquiring an image and a second optical path for controlling a focus. And (2) a first imaging unit that is installed on the first optical path and is used to acquire a one-dimensional or two-dimensional first image based on the optical image branched to the first optical path. (3) On the second optical path, the optical path length in the light guide optical system changes along a predetermined changing direction within the imaging plane. A second imaging unit configured to acquire a two-dimensional second image for focus control using an optical image branched to a second optical path, and (4) a second image acquired by the second imaging unit. Focus control means for analyzing and controlling the focus of imaging by the first imaging means based on the analysis result; and (5) image acquisition control means for controlling the acquisition of the first image by the first imaging means.
  • two imaging units a first imaging unit and a second imaging unit
  • a sample from which an image is to be acquired it is possible to separately perform the actual image acquisition by the first imaging unit and the focus control image acquisition by the second imaging unit.
  • the second imaging means used for focus control an imaging means capable of acquiring a two-dimensional image is used, and an optical path length through which the light image is guided from the sample is determined.
  • the imaging means is arranged so that the imaging conditions change in the direction. According to the configuration in which focus control is performed by analyzing a two-dimensional image acquired using such an imaging means, it is not necessary to irradiate the sample with laser light for focus measurement. Therefore, it is possible to suitably achieve both the acquisition of the image of the sample and the focus control of the imaging.
  • the image acquisition control means may further control the setting of the imaging position with respect to the sample.
  • the second imaging means has an imaging surface such that an optical path length changes along a change direction. It is possible to use a configuration having an imaging device installed in a state inclined at a predetermined angle with respect to the second optical path. According to such a configuration, it is possible to preferably perform image acquisition for focus control.
  • the second imaging means includes an imaging device and an optical path length changing means installed at a predetermined position with respect to the imaging surface of the imaging device so that the optical path length changes along the change direction.
  • an optical path length changing means for example, there is an optical path length changing member which is formed in a ⁇ edge shape with a predetermined gradient and transmits light.
  • the second imaging means serves as an optical path length changing means for taking one image of the imaging surface of the imaging device.
  • One optical path length changing means installed at a predetermined position with respect to the image area so that the optical path length changes along the change direction, and a change at a predetermined position with respect to another imaging area of the imaging surface of the imaging device. It may be configured to have another optical path length changing means installed such that the optical path length changes at a different rate from the one optical path length changing means along the direction. In such a configuration, it is preferable that the two optical path length changing units be configured so that the optical path lengths change in opposite directions. Thereby, the accuracy of the focus control can be improved.
  • the second imaging means includes one imaging device arranged so that an optical path length changes along a change direction in the imaging surface, and one imaging device along the change direction in the imaging surface. It may be configured to have two imaging devices with another imaging device arranged such that the optical path length changes at a different rate of change. In such a configuration, it is preferable to configure the two imaging devices so that the optical path lengths change in directions opposite to each other. Thereby, the accuracy of the focus control can be improved.
  • the microscope apparatus includes a first imaging lens disposed on the first optical path and a second imaging lens disposed on the second optical path, and the second imaging lens includes the first imaging lens.
  • the configuration may be such that the imaging magnification power S is smaller than that of the image lens. Accordingly, it is possible to preferably obtain the first image in the first optical path and obtain the second image in the second optical path.
  • the focus control means analyzes a contrast change of the image in a change direction in the second image, and based on the analysis result. It is preferable to control the focus of imaging. As a result, focus control of imaging using a two-dimensional image based on the optical image of the sample can be realized with high accuracy.
  • the focus control unit cuts out the measurement target image having a predetermined width along the change direction from the second image, and shifts the measurement target image and the measurement target image in a direction perpendicular to the change direction. It is preferable to use a configuration for analyzing a change in contrast of an image using a difference absolute value image of the shifted image.
  • Focus control means determines whether or not the second image is an image that can be applied to the control of the focus of imaging. If it is determined that the second image can be applied, the focus control means analyzes the second image and outputs the analysis result. It is preferable to control the focus of imaging based on this. Thereby, it is possible to prevent focus control from being performed using an inappropriate image, and to appropriately perform focus control for imaging.
  • two imaging units are provided for the sample, and an imaging unit capable of acquiring a two-dimensional image is used as the second imaging unit for focus control.
  • an imaging unit capable of acquiring a two-dimensional image is used as the second imaging unit for focus control.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration of a first embodiment of a microscope device.
  • FIG. 2 is a block diagram showing an example of a configuration of a focus control unit.
  • FIG. 3 is a flowchart showing an example of a focus control method.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a focus control method shown in FIG. 3.
  • FIG. 5 is a flowchart showing another example of the focus control method.
  • FIG. 6 is a flowchart showing another example of the focus control method.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 8 is a diagram showing a change in contrast in the measurement target image shown in FIG. 7.
  • FIG. 9 is a block diagram showing a configuration of a second embodiment of the microscope apparatus.
  • FIG. 10 is a block diagram showing a configuration of a third embodiment of the microscope apparatus.
  • FIG. 11 is a flowchart showing an example of a focus control method.
  • FIG. 12 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 14 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 15 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 16 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 17 is a diagram showing a change in contrast in the measurement target images shown in FIGS.
  • FIG. 18 is a diagram showing a change in contrast in the measurement target images shown in FIGS.
  • FIG. 19 is a block diagram showing a configuration of a fourth embodiment of the microscope apparatus.
  • FIG. 20 is a perspective view showing an example of a configuration of an optical path length changing member.
  • FIG. 21 is a side view showing a specific configuration example of an optical path length changing member.
  • FIG. 22 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • FIG. 23 is a diagram showing a change in contrast in the measurement target image shown in FIG. 22.
  • FIG. 24 is a block diagram showing a configuration of a fifth embodiment of a microscope apparatus.
  • FIG. 25 is a block diagram showing a configuration of a sixth embodiment of the microscope apparatus.
  • FIG. 26 is a block diagram showing a configuration of a seventh embodiment of the microscope apparatus.
  • FIG. 27 is a diagram showing an optical branching optical system for an imaging device for focus control.
  • 10 irradiation light source
  • 11 condenser lens
  • 15 sample stage (XY stage), 16 to XY stage drive unit
  • 20 light guide optical system
  • 21 objective lens
  • 22 Piezo actuator
  • 23 Piezo drive
  • 25, 26, 27a, 27b ... Beam spitter
  • 26a, 26b ... Imaging lens
  • Image acquisition Control unit 37, 47 Focus control unit, 37a to AZD converter, 37b Image memory, 37c Data processing unit, 80 Illumination light source, 81 Lens, 85 Optical illumination system , 86 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Dick mouth mirror, 87 ⁇ ⁇ ⁇ excitation filter, 88 ⁇ ⁇ ⁇ cut filter.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration of a first embodiment of a microscope apparatus according to the present invention.
  • This microscope device is configured as a transmission type microscope used for acquiring an image of the sample S.
  • the sample S for which an image is to be acquired is, for example, a biological sample and is placed on the sample stage 15.
  • the sample stage 15 also has an XY stage force movable in the X and y directions (horizontal direction). By driving the XY stage 15 in the xy plane, the imaging position with respect to the sample S can be set. Or change.
  • the drive of the sample stage 15 is controlled by an XY stage drive unit 16.
  • a condensing lens 11 for converging light is installed below the sample stage 15.
  • a light guide optical system 20 for guiding a light image of the sample S is provided above the sample stage 15.
  • the light guide optical system 20 has an objective lens 21 on which light from the sample S is incident, and a beam splitter 25 disposed downstream of the objective lens 21.
  • the beam splitter 25 is an optical splitting unit that splits the optical image of the sample S into two optical paths, a first optical path and a second optical path.
  • an optical path through which light from the objective lens 21 passes through the beam splitter 25 is a first optical path used for acquiring an image of the sample S.
  • the optical path reflected by the S-beam splitter 25 from the objective lens 21 is a second optical path used for focus control of imaging.
  • the beam splitter 25 is disposed at an angle of about 45 ° with respect to the first optical path, and the second optical path is substantially orthogonal to the first optical path.
  • the direction of the optical axis of the microscope optical system including the irradiation light source 10 and the objective lens 21 is along the first optical path, the z-axis direction, and the second optical path orthogonal to the first optical path.
  • the direction along is the y-axis direction, and the direction orthogonal to the y-axis and z-axis is the X-axis direction.
  • a piezo actuator 22 is provided for the objective lens 21.
  • the piezo actuator 22 is an objective lens driving unit that drives the objective lens 21 in the z-axis direction (vertical direction, optical axis direction).
  • the driving of the piezo actuator 22 is controlled by a piezo driving unit 23.
  • the focus of imaging in the image acquisition of the sample S can be adjusted.
  • a photodetector 31 is provided at a position corresponding to the image plane of the optical image of the sample S that has passed through the beam splitter 25.
  • the photodetector 31 is a first imaging unit used to acquire an image (first image) based on the optical image branched to the first optical path for image acquisition by the beam splitter 25. Specifically, as the photodetector 31, a one-dimensional image of the sample S is obtained.
  • a linear sensor that can acquire an image or an image sensor that can acquire a two-dimensional image is used.
  • an imaging device 32 is installed at a position corresponding to the image plane of the optical image of the sample S reflected by the beam splitter 25.
  • the imaging device 32 also has a CCD camera capable of acquiring a two-dimensional image, and the second imaging device acquires an image (second image) based on the light image branched by the beam splitter 25 to the second optical path for focus control. Means.
  • the focus control of the imaging is performed using the two-dimensional image of the sample S acquired by the CCD camera 32.
  • the CCD camera 32 has its imaging surface substantially coincident with the xz plane orthogonal to the second optical path, and is inclined with respect to the second optical path at an angle ⁇ ⁇ ⁇ with the z-axis direction as the inclination direction. It is installed in a state. At this time, in the imaging plane of the CCD camera 32, the optical path length in the light guide optical system 20 through which light is guided from the sample S to the CCD camera 32 changes along the z-axis direction with the z-axis direction as the changing direction. It's like that.
  • the image acquisition control unit 36 is a control unit that controls the image acquisition operation of the sample S by controlling the acquisition of the image of the sample S and the setting of the imaging position for the sample S. Specifically, the image acquisition control unit 36 controls acquisition of an image by the photodetector 31. In addition, the control unit 36 controls the driving of the sample stage 15 via the XY stage driving unit 16 so that the imaging position on the optical axis of the microscope optical system can be determined by the sample S mounted on the sample stage 15. Set or change.
  • the focus control unit 37 analyzes an image acquired by the CCD camera 32 using a predetermined analysis method. Then, based on the analysis result, the focus of the imaging by the photodetector 31 is controlled. In the present embodiment, the focus control unit 37 drives and controls the piezo actuator 22 via the piezo drive unit 23 to adjust the position of the objective lens 21 in the z-axis direction, thereby obtaining an image. Perform focus control.
  • the CCD camera 32 which is an imaging device for focus control, is arranged to be inclined with respect to the optical axis of the second optical path as described above.
  • the 2 The two-dimensional image is an image in which the deviation of the focal position force changes along the z-axis direction.
  • FIG. 2 is a block diagram showing an example of a specific configuration of the focus control unit 37.
  • the focus control unit 37 includes an AZD converter 37a, an image memory 37b, and a data processing unit 37c.
  • the data signal of the image obtained by the CCD camera 32 is AZD-converted by the AZD conversion 37 & then stored in the image memory 37b as image data for focus control.
  • the data processing unit 37c reads necessary image data from the image memory 37b, analyzes the data, and controls the piezo driving unit 23 based on the analysis result.
  • two images of the sample S which is an image acquisition target, are captured by the photodetector 31 as the first imaging unit and the CCD camera 32 as the second imaging unit. Means are provided.
  • the image acquisition control unit 36 acquires an image of the sample S by the photodetector 31 while the focus control unit 37 automatically controls the focus with reference to the image acquired by the CCD camera 32. It is possible.
  • a CCD camera 32 capable of acquiring a two-dimensional image is used as a second imaging apparatus used for focus control, and an optical path length at which an optical image is guided from the sample S is used.
  • the camera 32 is arranged so as to be inclined with respect to the optical axis so that the imaging condition changes in the axial direction. According to such a configuration in which focus control is performed by analyzing a two-dimensional image acquired using the camera 32, irradiation of the sample S with laser light for focus measurement or the like becomes unnecessary. Therefore, it is possible to suitably achieve both acquisition of an image of the sample S and focus control of imaging.
  • the focus control from the sample S to the photodetector 31 is performed by controlling the driving of the piezo actuator 22 to adjust the position of the objective lens 21 in the z-axis direction.
  • focus feedback control using the image acquired by the CCD camera 32 can be executed at high speed and reliably.
  • a focus control is not limited to the configuration for driving the objective lens 21, but may be a configuration for driving the sample stage 15 on which the sample S is mounted, for example, in the z-axis direction.
  • a drive mechanism for driving the objective lens 21 and the sample stage 15 for example, a stepping motor or the like can be used in addition to the piezoelectric actuator.
  • the second imaging device for acquiring a two-dimensional image of the sample S used for focus control can acquire a two-dimensional image such as a CMOS-type imaging device in addition to the CCD camera. Other imaging devices may be used.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a specific example of the focus control method.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the focus control method shown in FIG. The focus control described below is performed by the focus control unit 37 in the configuration shown in FIG.
  • the CCD camera 32 uses the a pixel in the z-axis direction, which is the tilt direction of the imaging surface, and the b pixel in the X-axis direction, which is perpendicular to the tilt direction. Then, a two-dimensional image X of the sample S composed of the aXb pixels is obtained (step S101). Then, from the image X, an image X ′ to be measured is cut out along the tilt direction, which has a full width in the tilt direction (a pixel) and a fixed width in the tilt direction and vertical direction (b ′ pixel) (S102).
  • a shifted image X ′′ is created by shifting the cut-out measurement target image X ′ by a certain number of pixels (s pixels) in the direction perpendicular to the inclination (S 103). Then, a difference (X'—X ") is calculated between the two and an absolute value IX'-X" I is calculated to create a difference absolute value image Y (S104).
  • the difference image Y is an image of aX (b'-s) pixels because the pixel component obtained by shifting the measurement target image X 'becomes an invalid pixel.
  • the measurement target image X It is preferable to select an appropriate number of pixels as to the number of pixels s for shifting the 'in consideration of the optical magnification and the numerical aperture NA of the objective lens.
  • the difference absolute value image Y and the data sequence Z averaged in the inclination and the vertical direction correspond to the absolute value of the differential of the image component at each position of the measurement target image X along the inclination direction.
  • the contrast pattern of the sample S from which the image is to be acquired is uniform, the contrast of the image acquired by the camera 32 increases as the image is focused. Also, when the contrast of an image is large, the absolute value of the differential of the corresponding image component becomes large. Therefore, information about focus control can be obtained by performing analysis for obtaining a change in data value corresponding to a change in contrast of an image in the tilt direction in the data string Z. Further, by referring to the analysis result, it is possible to suitably execute the focus control of the imaging.
  • a threshold m on the negative side and a threshold n on the positive side are set with respect to the sum T, and the sum T is determined by these thresholds m to n
  • this method as shown in FIG. 3, it is determined whether the sum T is smaller than the negative threshold value m (T ⁇ th threshold value m) (S107). And the threshold m If it is smaller, focus control is performed to raise the focus position (S108). Further, it is determined whether or not the sum T is larger than the positive threshold n (T> threshold n) (S109). Then, when it is larger than the threshold value n, focus control is performed so as to lower the focus position (S110).
  • the data string Z is created for each pixel.
  • the specific method of creating the data string Z is not limited to the above method.
  • a data sequence Z may be created by performing a process of interlacing by sampling for each of a plurality of pixels. In such a method, the focus control can be performed at higher speed.
  • FIG. 5 is a flowchart showing another example of the focus control method.
  • steps S201 to S210 are the same as steps S101 to S110 in the control method of FIG.
  • a step S211 for removing noise is provided between the step S204 of creating the absolute difference image Y and the step S205 of creating the data sequence Z in the tilt direction.
  • the noise level p is set for the data value of each pixel in order to remove the influence on focus control such as image noise in the difference absolute value image Y.
  • the data value of each pixel of the difference absolute value image Y is smaller than the noise level p, the data value of the pixel is set to 0 as noise data, and the noise-removed difference An absolute value image Y 'is created (S211).
  • the data sequence Z in the tilt direction is created using this noise-removed image Y '.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating another example of the focus control method.
  • steps S301 to S310 are the same as steps S101 to S110 in the control method of FIG.
  • the focus control unit 37 captures an image acquired by the CCD camera 32. It is determined whether the image is applicable to the control of the focus of the image. Then, when it is determined that the image can be applied, the image is analyzed, and the focus of imaging is controlled based on the analysis result!
  • steps S311 to S313 are added between step S302 of cutting out the measurement target image X ′ and step S303 of creating the shift image X ′′.
  • the image X is divided into blocks, the standard deviation of each block is calculated, and a standard deviation data sequence SD is created, and the standard deviation Sd and the standard deviation Sd are calculated from the standard deviation data sequence SD.
  • the average value Av is calculated (S311), and the standard deviation and the average value are calculated.
  • Steps S321 and S322 are added between step S305 for creating the data string Z in the tilt direction and step S306 for calculating the sum T of the product of the address and data of the data string Z. are doing.
  • an average value is obtained from the inclination and b' pixels in the vertical direction to create a data sequence A of a pixels in the inclination direction, and the average value Z data of the data sequence Z is obtained. It is determined whether or not the average value of the column A (corresponding to the change amount Z brightness, that is, the contrast) is smaller than the threshold value r (the average value of Z, the average value of ZA, and the threshold value r) (S321).
  • the threshold value r the average value of Z, the average value of ZA, and the threshold value r
  • the focus control is performed using an inappropriate image. Is performed, and focus control of imaging can be suitably performed.
  • the analysis of the change in contrast of the focus control image is performed by analyzing the absolute difference between the measurement target image cut out at a predetermined width along the tilt direction of the imaging surface and the shifted image. This is done using a value image.
  • the image The change in contrast can be reliably analyzed by a simple method.
  • a method other than the above may be used.
  • each data string A and Z are created for each pixel.
  • the specific method of creating these data strings is not limited to the above method.
  • each data string may be created by performing the interlacing process by sampling for each of a plurality of pixels. In such a method, the focus control can be performed at higher speed.
  • the blocks that divide the image X ′ in steps S311 and S312 are not limited to the two-dimensional matrix and may be one-way block divisions.
  • the size of the block is preferably set to an appropriate size in consideration of the optical magnification, the size of the CCD camera, the number of pixels, and the like.
  • steps S313 and S322 when the target image is not a uniform contrast pattern, or when the sample S exists only in a part of the image, a sufficient contrast level can be obtained. In some cases, focus control is not performed because the focus position cannot be determined.
  • the focus control information on the imaging position where the focus position cannot be determined is obtained by referring to the focus control information on the other imaging positions. May be set. In this case, for example, focus control information on an imaging position where the focus position cannot be determined is obtained by a series of focus measurements and is arbitrary focus control information stored in the data storage unit or the latest (latest) focus control information. A method of executing focus control on the assumption that the information is the same as the information can be used.
  • the focus control of the imaging can be realized with high accuracy by using the method of analyzing the contrast change of the image.
  • a method other than using a contrast change may be used.
  • a pathological sample of leiomyosarcoma is used as the sample S.
  • the tilt direction of the CCD imaging surface Has a depth of about 3.7 mm in the optical axis direction. This is because the change in the optical axis direction on the sample S is a square of the magnification on the imaging surface, and is converted to a depth on the sample of about 9 ⁇ m.
  • the focus was measured at five points with a deviation of —4 m, 1 m, 0 m, 2 m, and 4 m.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • the images (a) to (e) in Fig. 7 show that the focal position shifts are (a) — 4 m, (b) — 2 m, (c) 0 m, (d) 2 ⁇ m, and (e), respectively.
  • the measurement target image X which was acquired, is shown.
  • a shifted image X is created by shifting by four pixels, and a difference absolute value image Y and a data string ⁇ are obtained from the images X, X".
  • the data F of the focal center of gravity which is the sum ⁇ of the product of the address and the data in the data string ⁇ , is obtained.
  • FIG. 8 is a diagram showing a contrast change in the measurement target image shown in FIG.
  • the horizontal axis indicates the pixel position in the tilt direction
  • the vertical axis indicates the data string Z corresponding to the contrast at each position.
  • the graphs (a) to (e) in FIG. 8 correspond to the images (a) to (e) in FIG. 7, respectively.
  • FIG. 9 is a block diagram showing the configuration of a second embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • the irradiation light source 10 the condenser lens 11, the sample stage 15, the XY stage drive unit 16, the piezo drive unit 23, the image acquisition control unit 36, and the focus control unit 37 are the same as those shown in FIG. Is the same as
  • a light guide optical system 20 is provided above the sample stage 15. Have been killed.
  • the light guide optical system 20 has an objective lens 21, a beam splitter 26, and imaging lenses 26a and 26b. Further, a piezo actuator 22 for driving the objective lens 21 in the z-axis direction is provided for the objective lens 21.
  • a photodetector 31 as a first imaging means is provided on the optical path through which the light from the objective lens 21 passes through the beam splitter 26 .
  • a CCD camera 32 as a second imaging means is installed in a state inclined with respect to the optical path.
  • the optical path from the objective lens 21 to the beam splitter 26 is an optical path at infinity.
  • a first imaging lens 26a for forming an optical image on the photodetector 31 is provided between the beam splitter 26 and the photodetector 31, a second imaging lens 26b for forming an optical image on the camera 32 is provided.
  • the magnification of imaging on the photodetector 31 for image acquisition and the magnification of imaging on the CCD camera 32 for focus control can be set separately by the lenses 26a and 26b. it can. Therefore, it is possible to set the magnification of the image formation on the camera 32 without affecting the image acquisition of the sample S to a magnification suitable for focus measurement.
  • the second imaging lens 26b It is preferable that the imaging magnification is smaller than that of the first imaging lens 26a.
  • FIG. 10 is a block diagram showing a configuration of a third embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • the irradiation light source 10 the condenser lens 11, the sample stage 15, the XY stage drive unit 16, the piezo drive unit 23, the image acquisition control unit 36, and the focus control unit 37 are the same as those shown in FIG. Is the same as
  • a light guide optical system 20 is provided above the sample stage 15.
  • the light guide optical system 20 has an objective lens 21 and beam splitters 27a and 27b.
  • a piezoelectric actuator 22 for driving the objective lens 21 in the z-axis direction is provided for the objective lens 21.
  • the light from the objective lens 21 passes through the beam splitters 27a and 27b on the optical path.
  • a photodetector 31 as an image means is provided.
  • the CCD camera is tilted with respect to the optical path so that the optical path length changes along the z-axis direction. 33 are installed.
  • the imaging surface faces the optical path so that the optical path length changes along the z-axis direction and in the opposite direction to the camera 33.
  • the CCD camera 34 is installed in the tilted state!
  • the above-mentioned CCD cameras 33 and 34 installed in a state where they are tilted in opposite directions with the z-axis direction as a tilt direction constitute a second imaging means for focus control.
  • the two cameras 33 and 34 are arranged so that the inclination is symmetrical with respect to the optical axis.
  • the CCD cameras 33 and 34 are configured such that the optical path lengths change in opposite directions along the predetermined change direction as described above. Thereby, the accuracy of the focus control can be improved.
  • the CCD cameras 33 and 34 may be configured so that the optical path lengths change at different rates of change along a predetermined change direction. As such a configuration, for example, there is a configuration in which the optical path length changes in the same direction but different amounts from each other.
  • FIG. 11 is a flowchart illustrating an example of the focus control method.
  • the focus control described below is performed by the focus control unit 37 in the configuration shown in FIG.
  • the specific analysis method of the image is the same as the focus control method shown in FIGS.
  • X are obtained (step S501). Then, from these images X and X,
  • the measurement target images X ′ and X along the direction are cut out (S502). These measurement target images X,
  • X ′ are images tilted in the opposite direction about the z-axis direction, as described above.
  • a shifted image X ", X" is created (S503). Also acquired by camera 33 For the image ⁇ , the difference (,, is taken between the image ⁇ "and the image ⁇ , and the absolute value IX '-X" I is calculated to create a difference absolute value image ⁇ .
  • the address at the center position is set to 0, and an address is assigned to the data at each position.
  • the product of the address and the data in the data strings Z, Z is calculated, and their sum T, T
  • the focus control using the threshold values m and n is performed with reference to the spectrum (S507 to S510).
  • the focus control method using the above-described microscope device will be described.
  • the two CCD cameras 33 and 34 constituting the second imaging means for focus control the first CCD camera 33 is camera 1 and the second CCD camera 34 is camera 2.
  • a pathological sample of an oral sarcoma mass is used as the sample S.
  • This pathological sample is set on a microscope (NIKONTMD, 20X, NAO.75), and a CCD camera (ORCA, manufactured by Hamamatsu Photonitas) is arranged.
  • both ends of the imaging surface of the CCD in the tilt direction have a depth of about 3.7 mm in the optical axis direction. This is because the change in the optical axis direction on the sample S is a square of the magnification on the imaging surface, and is converted to a depth on the sample of about 9 ⁇ m.
  • Focus measurement was performed at five points, 4 ⁇ , one 2 ⁇ , ⁇ ⁇ , and 2 ⁇ , where the deviation from the new focus position was 4 ⁇ .
  • FIGS. 12 to 16 are diagrams showing examples of measurement target images used for focus control.
  • the images (a) and (b) in FIG. 12 are obtained for the case where the focal position shift is 4 m, (a) the image X to be measured by the camera 1, and (b) the image to be measured by the camera 2 Show image X.
  • images (a) and (b) in Fig. 13 show (a) the measurement target image X 'of camera 1 and (b) the measurement target of camera 2 obtained when the focal point shift was -2 m. Shows image X '
  • images (a) and (b) in FIG. 14 show (a) images X ′ and (b) to be measured by camera 1 obtained when the displacement of the focal position is 0 ⁇ m. ) Shows the measurement target image X 'of camera 2.
  • images (a) and (b) in FIG. 15 show (a) measurement target image X ′ of camera 1 and (b) measurement target of camera 2 obtained when the focal position shift is 2 / zm. Shows image X '
  • the images (a) and (b) in FIG. 16 are (a) the image X 'to be measured by the camera 1 and (b) the image to be measured by the camera 2 obtained in the case of the focal position shift force / zm. X 'shows
  • the focal center which is the sum ⁇ , T of the product of the address and data in the data strings Z, Z
  • FIG. 17 is a diagram showing a contrast change in the measurement target image X of the camera 1 shown in the images (a) of FIGS. 12 to 16.
  • the horizontal axis represents the pixel position in the tilt direction.
  • the vertical axis indicates the data sequence corresponding to the contrast at each position.
  • the graphs (a) to (e) in FIG. 17 correspond to the image (a) in FIG. 12, the image (a) in FIG. 13, the image (a) in FIG. 14, the image (a) in FIG. It corresponds to 16 images (a).
  • Fl 5.4 for (a) focal position
  • F1 49 for (b) focal position 2 m.
  • Fl 75.2 for focal position O / zm
  • Fl 94.1 for focal position 2 / zm
  • Fig. 18 shows a copy of the measurement target image X of the camera 2 shown in the images (b) of Figs. 12 to 16.
  • FIG. 2 is a diagram showing a contrast change.
  • the horizontal axis indicates the pixel position in the tilt direction
  • the vertical axis indicates the data string Z corresponding to the contrast at each position.
  • the graphs (a) to (e) in FIG. 18 correspond to the image (b) in FIG. 12, the image (b) in FIG. 13, the image (b) in FIG. 14, the image (b) in FIG. It corresponds to 16 images (b).
  • Focus control can be suitably performed.
  • FIG. 19 is a block diagram showing a configuration of a fourth embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • the irradiation light source 10 the condenser lens 11, the sample stage 15, the XY stage drive unit 16, the light guide optical system 20, the piezo actuator 22, and the piezo drive unit 23 are shown in FIG. This is the same as the embodiment described above.
  • a photodetector 41 is provided at a position corresponding to the image plane of the optical image of the sample S that has passed through the beam splitter 25.
  • the photodetector 41 is first imaging means used for acquiring an image (first image) based on the optical image branched by the beam splitter 25 into a first optical path for acquiring an image.
  • a linear sensor capable of acquiring a one-dimensional image of the sample S or an image sensor capable of acquiring a two-dimensional image is used.
  • an imaging device 42 is installed at a position corresponding to the image plane of the optical image of the sample S reflected by the beam splitter 25.
  • the imaging device 42 also has a CCD camera capable of acquiring a two-dimensional image, and the second imaging device acquires an image (second image) based on the light image branched to the second optical path for focus control by the beam splitter 25. Means. In the microscope apparatus shown in FIG. 19, focus control of imaging is performed using a two-dimensional image of the sample S acquired by the CCD camera 42.
  • the CCD camera 42 is arranged such that its imaging surface substantially coincides with the xz plane orthogonal to the second optical path.
  • an optical path length changing member 42a is provided at a predetermined position between the beam splitter 25 and the camera 42 with respect to the imaging surface.
  • the optical path length changing member 42a is formed of a light transmitting material that transmits light from the sample S, and has an edge shape whose thickness changes along the z-axis direction.
  • An image acquisition control unit 46 and a focus control unit 47 are provided for the sample stage 15, the light guide optical system 20, the photodetector 41, and the CCD camera 42.
  • the image acquisition control unit 46 controls the acquisition of an image of the sample S and the setting of the imaging position for the sample S.
  • control means for controlling the image acquisition operation of the sample s Specifically, the image acquisition control unit 46 controls acquisition of an image by the photodetector 41.
  • the control unit 46 controls the driving of the sample stage 15 via the XY stage driving unit 16 so that the imaging position on the optical axis of the microscope optical system can be adjusted with the sample S placed on the sample stage 15. Set or change.
  • the focus control unit 47 analyzes the image acquired by the CCD camera 42 by a predetermined analysis method. Then, based on the analysis result, the focus of the imaging by the photodetector 41 is controlled. In the present embodiment, the focus control unit 47 drives and controls the piezo actuator 22 via the piezo drive unit 23 to adjust the position of the objective lens 21 in the z-axis direction, thereby obtaining an image. Perform focus control.
  • the light path length changing member 42a having a ⁇ -edge shape is disposed in front of the optical axis of the second optical path.
  • the two-dimensional image acquired by the CCD camera 42 is an image in which the displacement of the focal position force changes along the z-axis direction, similarly to the configuration shown in FIG. 1 in which the CCD camera 32 is arranged at an angle. It becomes.
  • two image pickup units a photodetector 41 and a CCD camera 42
  • a photodetector 41 and a CCD camera 42 are provided for the sample S from which an image is to be obtained.
  • the CCD camera 42 capable of acquiring a two-dimensional image is used as the second imaging apparatus used for focus control, and the optical path length at which the optical image is guided from the sample S is used.
  • An optical path length changing member 42a whose thickness changes in the z-axis direction is arranged on the front side of the camera 42 so that the imaging condition changes in the force axis direction.
  • this configuration uses an imaging device and an optical path length changing member in combination. Focus measurement is being performed. Even with such a configuration, it is possible to suitably realize focus control of imaging.
  • the second imaging means only needs to be configured and arranged on the optical path such that the optical path length in the light guide optical system changes along a predetermined change direction in the imaging plane.
  • the range of the controllable focal position is limited in the configuration in which the imaging device is inclined.
  • the configuration using the optical path length changing member it is possible to select the shape of the optical path length changing member according to the range of the focal position to be controlled.
  • the configuration example (a) in FIG. 20 has a ⁇ edge shape in which the thickness changes continuously along the optical path length changing direction described above with reference to FIG. .
  • the configuration example (b) of FIG. 20 has a step-edge shape in which the thickness changes stepwise.
  • a plurality of microlenses having different focal lengths are arranged along the changing direction. The lens array thus arranged is used as an optical path length changing member.
  • a plurality of ⁇ -edge-shaped optical path length changing members having different amounts of change in thickness and changing directions (rate of change in thickness) differ.
  • the figure shows a configuration that uses a combination of.
  • focus measurement under various conditions becomes possible.
  • the edge gradient corresponding to the thickness change rate is small, the edge member is large and the edge component is used in combination, and the edge gradient is Accordingly, the focus control can be performed with high accuracy by selecting the measurement range and the resolution of the focus measurement.
  • the following focus control method is possible.
  • the focus position is measured using an edge member having a large gradient, and the focus position is adjusted with low accuracy.
  • the focal position is adjusted with high precision using the edge member with a small gradient!
  • the setting of the focal position can be performed quickly and easily, for example, at the start of image acquisition.
  • the focus position is adjusted using an edge member with a small gradient during image acquisition. Then, when the focal position is not measured, the focal position is measured using a ⁇ ⁇ edge member having a large gradient, and the focal position is adjusted with low accuracy. Furthermore, the focus position is adjusted with high precision again using a small edge member having a small gradient. With such a control method, it is possible to suitably realize the focus control even when the sample to be image-acquired is a sample having a large change in thickness.
  • the microscope has a configuration capable of setting a plurality of magnifications
  • the changing member may be attached directly to the imaging device in close contact with the imaging device, or may be arranged with a certain distance. Further, as the optical path length changing means, an optical element other than the optical path length changing member that transmits light may be used. Also, in the microscope apparatus shown in FIG. 19, the specific focus control method is the same as that described above for the microscope apparatus shown in FIG. [0117] A specific example of the focus control method using the above-described microscope device will be described.
  • a pathological sample of leiomyosarcoma is used as the sample S.
  • This pathological sample is set on a microscope (NIKONTMD, 20X, NAO.75), a CCD camera (ORCA, manufactured by Hamamatsu Photonitas) is arranged, and an optical path having the configuration shown in FIG. Attach the length changing member 42a.
  • the optical path length changing member 42a is made by laminating three glass plates 421, 422, and 423 having a thickness of 1.1 mm and different lengths, and has a thickness of Omm, 1.lmm, 2. It has a 4mm step ⁇ edge shape of 2mm and 3.3mm.
  • Focus measurement was performed at five points: 4 m, 1 m, 0 m, 2 m, and 4 m.
  • FIG. 22 is a diagram showing an example of a measurement target image used for focus control.
  • the images (a) to (e) in FIG. 22 show that the displacement of the focal position is (a) —4 m, (b) —2 m, (c) 0 m, (d) 2 m, and (e) 4, respectively.
  • the measurement target image X which was acquired in FIG.
  • a shifted image X is created by shifting the image by 4 pixels, and a difference absolute value image Y and a data string ⁇ are obtained from the images X, X".
  • the data F of the focal center of gravity which is the sum ⁇ of the product of the address and the data in the data string ⁇ , is obtained.
  • FIG. 23 is a diagram showing a change in contrast in the measurement target image shown in FIG.
  • the horizontal axis indicates the pixel position in the change direction of the optical path length
  • the vertical axis indicates the data string Z corresponding to the contrast at each position.
  • the graphs (a) to (e) in FIG. 23 correspond to the images (a) to (e) in FIG. 22, respectively.
  • FIG. 24 is a block diagram showing a configuration of a fifth embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • the irradiation light source 10 the condenser lens 11, the sample stage 15, the XY stage drive unit 16, the piezo drive unit 23, the image acquisition control unit 46, and the focus control unit 47 are the same as those shown in FIG. Is the same as
  • a light guide optical system 20 is provided above the sample stage 15.
  • the light guide optical system 20 has an objective lens 21, a beam splitter 26, and imaging lenses 26a and 26b. Further, a piezo actuator 22 for driving the objective lens 21 in the z-axis direction is provided for the objective lens 21.
  • a photodetector 41 as a first imaging means is provided on the optical path through which the light from the objective lens 21 passes through the beam splitter 26 . Further, on the optical path where the light from the objective lens 21 is reflected by the beam splitter 26, a CCD camera 42 as a second image pickup means having an optical path length changing member 42a disposed in front thereof is provided.
  • the optical path from the objective lens 21 to the beam splitter 26 is an optical path at infinity.
  • a first imaging lens 26a for forming an optical image on the photodetector 41 is provided between the beam splitter 26 and the photodetector 41.
  • a second imaging lens 26b for forming an optical image on the camera 42 is provided between the beam splitter 26 and the CCD camera 42.
  • magnification of the image formation on the photodetector 41 for image acquisition and the magnification of the image formation on the CCD camera 42 for focus control are set.
  • FIG. 25 is a block diagram showing a configuration of a sixth embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • the irradiation light source 10 the condenser lens 11, the sample stage 15, the XY stage drive unit 16, the piezo drive unit 23, the image acquisition control unit 46, and the focus control unit 47 are the same as those shown in FIG. Is the same as
  • a light guide optical system 20 is provided above the sample stage 15. Have been killed.
  • the light guide optical system 20 has an objective lens 21 and beam splitters 27a and 27b.
  • a piezoelectric actuator 22 for driving the objective lens 21 in the z-axis direction is provided for the objective lens 21.
  • a photodetector 41 as first imaging means is provided on the optical path through which the light from the objective lens 21 passes through the beam splitters 27a and 27b.
  • Camera 43 is installed on the optical path where the light from the objective lens 21 is reflected by the subsequent beam splitter 27b.
  • the optical path length is changed so that the optical path length changes along the z-axis direction and in the opposite direction to the camera 43 in front of it.
  • the CCD camera 44 in which the member 44a is arranged is installed on the optical path through which the light from the objective lens 21 passes through the beam splitters 27a and 27b.
  • focus control is performed by the CCD cameras 43 and 44 provided with the optical path length changing members 43a and 44a so that the optical path lengths change in opposite directions with the z-axis direction as the changing direction.
  • the second imaging means In this way, by performing focus measurement using two imaging devices whose optical path lengths change in opposite directions, even when the contrast pattern of the sample S itself is non-uniform, as in the configuration shown in FIG. Therefore, it is possible to preferably perform the focus control by reducing the influence.
  • the CCD cameras 43 and 44 are configured such that the optical path lengths change in opposite directions along the predetermined change direction as described above. Thereby, the accuracy of the focus control can be improved.
  • such a configuration may be configured so that the optical path length changes at different rates of change along a predetermined change direction.
  • a configuration for example, there is a configuration in which the optical path length changes in the same direction but different amounts from each other.
  • the configuration is not limited to the configuration of FIG. 25 using two imaging devices.
  • one optical path length changing member whose optical path length changes along a predetermined change direction is arranged for one imaging region of the imaging surface of the imaging device, and the other imaging region of the imaging surface is Along the above change direction
  • Both may have a configuration in which another optical path length changing member whose optical path length changes in a different rate of change, preferably in the opposite direction, is arranged.
  • the microscope device according to the present invention is not limited to the above-described embodiment and configuration example, and various modifications can be made.
  • FIG. 26 is a block diagram showing a configuration of a seventh embodiment of the microscope apparatus according to the present invention.
  • This microscope apparatus is a modified example of the microscope apparatus shown in FIG. Specifically, in contrast to the transmission type configuration shown in FIG. 1 in which the irradiation light source 10 and the condenser lens 11 are provided below the sample stage 15, the microscope apparatus shown in FIG.
  • the fluorescence microscope has an illumination light source 80, a lens 81, and an illumination optical system 85 in place of the optical lens 11.
  • a dichroic mirror 86 is arranged between the beam splitter 25 and the objective lens 21 in the light guide optical system 20.
  • the dichroic mirror 86 reflects the light incident from the irradiation light source 80 via the lens 81 to irradiate the sample S as excitation light, and passes the fluorescence generated from the sample S to the beam splitter 25.
  • An excitation filter 87 and a cut filter 88 are arranged between the dichroic mirror 86 and the irradiation light source 80 and between the dichroic mirror 86 and the objective lens 21, respectively.
  • An excitation optical system 85 (Fluorescence filter cube) is constituted by the excitation filter 87 and the cut filter 88.
  • the dichroic mirror 86 may be replaced with a half mirror in the configuration of FIG. 26, and the filters 87 and 88 may be removed.
  • optical path length changing member in the configuration in which the optical path length is changed by disposing an optical path length changing member in front of the imaging device, as described above, for example, as shown in the configuration example (d) of FIG. It is possible to use a configuration in which two types of optical path length changing members in which the directions of change are opposite to each other are provided for one imaging device. In this case, with respect to the first imaging area on the imaging surface of the imaging device, A first optical path length changing member whose optical path length changes along a predetermined change direction is disposed, and the second image pickup area of the image pickup surface is changed along the above change direction and at a different change rate, preferably in the opposite direction. A second optical path length changing member having a variable length is arranged.
  • the light images incident on the first imaging region and the second imaging region are different.
  • an optical image for acquiring an image for focus control is transmitted to the first optical path length changing member, the first optical path to the first imaging area of the imaging surface of the imaging device, and the second optical path length changing member.
  • FIG. 27 is a diagram showing an optical branching optical system for an imaging device for focus control.
  • the first optical path length changing member 111 is arranged in the first imaging region 101 of the imaging device 100 for acquiring an image for focus control, and
  • a second optical path length changing member 112 whose optical path length changes in a direction opposite to the first optical path length changing member 111 is arranged.
  • the light images incident on the two imaging regions 101 and 102 of the imaging device 100 are different.
  • the 50% reflection mirror 121 that reflects the light image to the first imaging region 101 and the 100% reflection mirror that reflects the light image to the second imaging region 102 A light splitting optical system 120 having 122 is provided. As a result, the same light image split by the light splitting optical system 120 enters the imaging regions 101 and 102, and the accuracy of focus control can be improved.
  • a 100% reflection mirror 125 is arranged in front of the light splitting optical system 120.
  • a reflection mirror 125 By providing such a reflection mirror 125, it is possible to narrow the field of view of the optical image incident on the imaging device 100 and prevent the optical image from being superimposed between the imaging regions 101 and 102. However, such a reflection mirror 125 may not be provided if unnecessary.
  • an optical path length adjusting member 126 is provided between the reflection mirror 122 and the second imaging area 102 to correct the optical path length.
  • a light branching prism 130 shown in the configuration (c) of FIG. 27 may be used as the light branching optical system.
  • the microscope device according to the present invention can be used as a microscope device capable of simultaneously performing image acquisition of a sample and focus control of imaging. That is, according to the microscope apparatus of the present invention, two imaging means are provided for the sample, and as the second imaging means for focus control, an imaging means capable of acquiring a two-dimensional image is used, and the light guide optical path length is used. By arranging the imaging means so that the imaging conditions change in a predetermined direction, analyzing the obtained two-dimensional image and performing focus control, the image acquisition of the sample and the focus control of imaging can be performed. This can be done simultaneously.

Abstract

　対物レンズ２１及び試料Ｓの光像を第１光路及び第２光路へと分岐するビームスプリッタ２５を含む導光光学系２０と、第１光路上に設置されて試料Ｓの画像の取得に用いられる光検出器３１と、第２光路上に設置されて焦点制御用の２次元の画像を取得するＣＣＤカメラ３２とを備えて顕微鏡装置を構成する。また、カメラ３２を、ｚ軸方向に沿って導光光学系２０での光路長が変化するように、光路に対して角度θで傾いた状態で設置する。そして、このカメラ３２によって取得された画像を焦点制御部３７で解析し、その解析結果に基づいて試料Ｓに対する撮像の焦点を制御する。これにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能な顕微鏡装置が実現される。

Description

顕微鏡装置
技術分野
[0001] 本発明は、試料の画像の取得に用いられる顕微鏡装置に関するものである。
背景技術
[0002] 顕微鏡を用いて試料の画像を取得する場合、装置内の光学系、機構系の傾き、あ るいは試料自体の傾き、凹凸形状などによる焦点ずれが問題となる。これに対して、 従来、顕微鏡装置において、 CCDカメラなどの撮像装置による撮像の焦点を自動的 に制御する自動焦点 (オートフォーカス）が行われて 、る。このような自動焦点を行う 装置としては、例えば、文献 1 :特許第 3390106号公報、文献 2 :特開平 9— 23025 0号公報、文献 3 :特開平 8— 21961号公報、文献 4 :特開平 11 264937号公報に 記載された装置がある。
特許文献 1：特許第 3390106号公報
特許文献 2：特開平 9 - 230250号公報
特許文献 3：特開平 8— 21961号公報
特許文献 4：特開平 11― 264937号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 上記文献のうち、文献 1に記載された顕微鏡では、光軸に対して傾!、た状態で設 置されたラインセンサと、ラインセンサの前段に配置された回動する反射鏡とを用いる 。そして、試料にレーザ光を照射して、反射鏡を介してラインセンサに入射される反 射レーザ光の光量を参照して焦点を制御している。また、文献 2に記載された顕微鏡 では、光量を検出するフォトセンサと、フォトセンサの前段に配置された厚み変化ガラ スとを用いる。そして、上記文献 1と同様に試料にレーザ光を照射して、厚み変化ガラ スを介してフォトセンサに入射される反射レーザ光の光量を参照して焦点を制御して いる。
[0004] し力しながら、これらの装置構成では、焦点を制御する際に、焦点計測用のレーザ 光を試料に照射する必要がある。このため、撮像装置によって試料の画像を取得す るための撮像の焦点制御と、レーザ光を照射しない状態で撮像装置によって行われ る実際の画像取得とを同時に行うことができないという問題がある。
[0005] 一方、文献 3に記載された顕微鏡の自動焦点装置では、試料の画像を取得するた めの撮像装置において、光軸に対して垂直になる垂直位置と、所定角度で傾いた傾 斜位置とで取付け角度を変化させて焦点の制御を行っている。しかしながら、このよう な装置構成では、撮像装置の位置を変化させる必要があるため、上記したレーザ光 を照射する構成と同様に、撮像の焦点制御と、実際の画像取得とを同時に行うことが できない。また、撮像装置の位置制御が必要なため、全体として撮像動作が複雑ィ匕 するという問題がある。
[0006] また、文献 4に記載された顕微鏡では、自動焦点調整部にお!、て、結像光学系か ら分岐された光像を検出するセンサ部を設けている。そして、このセンサ部を予定焦 点面の前方及び後方にずらして、 2つの光像のコントラストレベルの差分を検出して 焦点調整を行っている。しかしながら、このような装置構成では、センサ部を移動させ て 2つの光像を取得しなくてはならないため、その装置構成や撮像動作が複雑ィ匕す る。また、センサ部を移動させる際に、試料とセンサ部との間の光路長が固定されな いうちに試料の光像を取り込むと光像がぼやけてしまうため、その光路長が固定され るまでの待ち時間が必要となる。このため、焦点調整及び試料の画像取得を短時間 で行うことができな 、と 、う問題がある。
[0007] 本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、試料の画像取得と 、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可能な顕微鏡装置を提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0008] このような目的を達成するために、本発明による顕微鏡装置は、（1)試料の光像を 画像取得用の第 1光路及び焦点制御用の第 2光路へと分岐する光分岐手段を含む 導光光学系と、（2)第 1光路上に設置され、第 1光路へと分岐された光像による 1次 元または 2次元の第 1画像の取得に用いられる第 1撮像手段と、（3)第 2光路上に、 その撮像面内において所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化する ように構成され、第 2光路へと分岐された光像による焦点制御用の 2次元の第 2画像 を取得する第 2撮像手段と、（4)第 2撮像手段によって取得された第 2画像を解析し、 その解析結果に基づいて第 1撮像手段による撮像の焦点を制御する焦点制御手段 と、（5)第 1撮像手段による第 1画像の取得を制御する画像取得制御手段とを備える ことを特徴とする。
[0009] 上記した顕微鏡装置にお!ヽては、画像取得の対象となる試料に対して、第 1撮像 手段及び第 2撮像手段の 2つの撮像手段を設けている。これにより、第 1撮像手段に よる実際の画像取得と、第 2撮像手段による焦点制御用の画像取得とを別に行うこと が可能となる。このような構成では、例えば、試料の画像取得と、撮像の焦点制御と を同時に行うことも可能である。
[0010] さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第 2撮像手段として、 2次元の画 像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、光像が試料から導光される光路長が所 定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置して 、る。このような撮像手 段を用いて取得された 2次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、試料 への焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、試料の画像取得と 、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。なお、画像取得制御手段は、さ らに試料に対する撮像位置の設定を制御することとしても良 、。
[0011] ここで、焦点制御用の画像を取得するための第 2撮像手段の具体的な構成につい ては、第 2撮像手段は、変化方向に沿って光路長が変化するように撮像面が第 2光 路に対して所定角度で傾いた状態で設置された撮像装置を有する構成を用いること ができる。このような構成によれば、焦点制御用の画像取得を好適に行うことができる
[0012] あるいは、第 2撮像手段は、撮像装置と、撮像装置の撮像面に対して所定位置に、 変化方向に沿って光路長が変化するように設置された光路長変更手段とを有する構 成を用いることができる。このような構成によっても、焦点制御用の画像取得を好適に 行うことができる。このような光路長変更手段としては、例えば、所定勾配のゥエッジ 形状に形成され光を透過する光路長変更部材がある。
[0013] この場合、第 2撮像手段は、光路長変更手段として、撮像装置の撮像面の一の撮 像領域に対して所定位置に、変化方向に沿って光路長が変化するように設置された 一の光路長変更手段と、撮像装置の撮像面の他の撮像領域に対して所定位置に、 変化方向に沿うとともに上記一の光路長変更手段とは異なる変化率で光路長が変化 するように設置された他の光路長変更手段とを有する構成としても良い。また、このよ うな構成では、 2つの光路長変更手段について、互いに逆方向に光路長が変化する ように構成することが好ましい。これにより、焦点制御の精度を向上することができる。
[0014] また、第 2撮像手段は、撮像面内において変化方向に沿って光路長が変化するよ うに配置された一の撮像装置と、撮像面内において変化方向に沿うとともに上記一の 撮像装置とは異なる変化率で光路長が変化するように配置された他の撮像装置との 2つの撮像装置を有する構成としても良い。また、このような構成では、 2つの撮像装 置について、互いに逆方向に光路長が変化するように構成することが好ましい。これ により、焦点制御の精度を向上することができる。
[0015] また、顕微鏡装置は、第 1光路上に配置された第 1結像レンズ、及び第 2光路上に 配置された第 2結像レンズを備え、第 2結像レンズは、第 1結像レンズよりも結像倍率 力 S小さい構成としても良い。これにより、第 1光路における第 1画像の取得、及び第 2 光路における第 2画像の取得をそれぞれ好適に行うことができる。
[0016] 第 2撮像手段によって取得された第 2画像を用いた焦点制御については、焦点制 御手段は、第 2画像における変化方向についての画像のコントラスト変化を解析し、 その解析結果に基づいて撮像の焦点を制御することが好ましい。これにより、試料の 光像による 2次元の画像を用いた撮像の焦点制御を精度良く実現することができる。
[0017] この場合、具体的には、焦点制御手段は、第 2画像から変化方向に沿った所定幅 の計測対象画像を切り出し、計測対象画像、及び計測対象画像を変化方向と垂直 方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって画像のコントラスト変化を解 析する構成を用いることが好まし 、。
[0018] また、焦点制御手段は、第 2画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であるか どうかを判断し、適用可能と判断した場合に第 2画像を解析し、その解析結果に基づ いて撮像の焦点を制御することが好ましい。これにより、不適当な画像を用いて焦点 制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことができる。 発明の効果
[0019] 本発明の顕微鏡装置によれば、試料に対して 2つの撮像手段を設け、焦点制御用 の第 2撮像手段として、 2次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、導光 光路長が所定方向で変化する撮像条件となるように撮像手段を配置し、得られた 2 次元の画像を解析して焦点制御を行うことにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制 御とを同時に行うことが可能となる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]図 1は、顕微鏡装置の第 1実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 2]図 2は、焦点制御部の構成の一例を示すブロック図である。
[図 3]図 3は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。
[図 4]図 4は、図 3に示した焦点制御方法について示す模式図である。
[図 5]図 5は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。
[図 6]図 6は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。
[図 7]図 7は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 8]図 8は、図 7に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
[図 9]図 9は、顕微鏡装置の第 2実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 10]図 10は、顕微鏡装置の第 3実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 11]図 11は、焦点制御方法の一例を示すフローチャートである。
[図 12]図 12は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 13]図 13は、焦点制御に用 ヽられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 14]図 14は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 15]図 15は、焦点制御に用 ヽられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 16]図 16は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 17]図 17は、図 12〜16に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図であ る。
[図 18]図 18は、図 12〜16に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図であ る。
[図 19]図 19は、顕微鏡装置の第 4実施形態の構成を示すブロック図である。 [図 20]図 20は、光路長変更部材の構成の例を示す斜視図である。
[図 21]図 21は、光路長変更部材の具体的な構成例を示す側面図である。
[図 22]図 22は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。
[図 23]図 23は、図 22に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。
[図 24]図 24は、顕微鏡装置の第 5実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 25]図 25は、顕微鏡装置の第 6実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 26]図 26は、顕微鏡装置の第 7実施形態の構成を示すブロック図である。
[図 27]図 27は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図であ る。
符号の説明
[0021] 10…照射光源、 11· ··集光レンズ、 15· ··試料ステージ（XYステージ）、 16〜XYス テージ駆動部、 20· ··導光光学系、 21· ··対物レンズ、 22…ピエゾァクチユエータ、 23 …ピエゾ駆動部、 25、 26、 27a, 27b…ビームスプジッタ、 26a, 26b…結像レンズ、 3 1、 41· ··画像取得用の光検出器 (第 1撮像装置）、 32、 33、 34、 42、 43、 44· ··焦点 制御用の CCDカメラ（第 2撮像装置）、 42a、 43a、 44a…光路長変更部材、 36、 46 …画像取得制御部、 37、 47· ··焦点制御部、 37a〜AZD変換器、 37b…画像メモリ 、 37c…データ処理部、 80· ··照射光源、 81· ··レンズ、 85· ··照射光学系、 86· ··ダイク 口イツクミラー、 87· ··励起フィルタ、 88· ··カツ卜フィルタ。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、図面とともに本発明による顕微鏡装置の好適な実施形態について詳細に説 明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明 を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
[0023] 図 1は、本発明による顕微鏡装置の第 1実施形態の構成を示すブロック図である。
この顕微鏡装置は、試料 Sの画像の取得に用いられる透過型の顕微鏡として構成さ れている。画像取得の対象となる試料 Sは、例えば生物サンプルであり、試料ステー ジ 15上に載置されている。
[0024] 試料ステージ 15は、 X方向及び y方向（水平方向）に可動な XYステージ力もなり、こ の XYステージ 15を xy面内で駆動することにより、試料 Sに対する撮像位置が設定ま たは変更される。また、試料ステージ 15は、 XYステージ駆動部 16によって駆動制御 されている。試料ステージ 15の下方には、撮像対象となる光像を生成するための光 を試料 Sへと照射する照射光源 10、及び照射光源 10からの光を試料 Sで設定され て 、る撮像位置へと集光する集光レンズ 11が設置されて 、る。
[0025] 照射光源 10からの光が照射される試料ステージ 15上の試料 Sに対し、試料ステー ジ 15の上方に、試料 Sの光像を導光するための導光光学系 20が設けられている。 本実施形態においては、導光光学系 20は、試料 Sからの光が入射する対物レンズ 2 1と、対物レンズ 21の後段に配置されたビームスプリッタ 25とを有している。このうち、 ビームスプリッタ 25は、試料 Sの光像を第 1光路及び第 2光路の 2つの光路へと分岐 する光分岐手段である。
[0026] 図 1においては、対物レンズ 21からの光がビームスプリッタ 25を通過する光路が、 試料 Sの画像取得に用いられる第 1光路となっている。また、対物レンズ 21からの光 力 Sビームスプリッタ 25で反射される光路が、撮像の焦点制御に用いられる第 2光路と なっている。ビームスプリッタ 25は、第 1光路に対して約 45° の角度で配置されてお り、第 2光路は第 1光路に対して略直交している。ここで、説明の便宜のため、照射光 源 10及び対物レンズ 21を含む顕微鏡光学系の光軸方向であり、第 1光路に沿う方 向を z軸方向、第 1光路に直交する第 2光路に沿う方向を y軸方向、 y軸及び z軸に直 交する方向を X軸方向とする。
[0027] また、対物レンズ 21に対して、ピエゾァクチユエータ 22が設けられて!/、る。ピエゾァ クチユエータ 22は、対物レンズ 21を z軸方向（垂直方向、光軸方向）に駆動する対物 レンズ駆動手段である。また、ピエゾァクチユエータ 22は、ピエゾ駆動部 23によって 駆動制御されている。本顕微鏡装置では、このピエゾァクチユエータ 22を用いて対 物レンズ 21の z軸方向の位置を変えることにより、試料 Sの画像取得における撮像の 焦点が調整可能になっている。
[0028] 第 1光路上には、ビームスプリッタ 25を通過した試料 Sの光像の結像面に対応する 位置に、光検出器 31が設置されている。光検出器 31は、ビームスプリッタ 25で画像 取得用の第 1光路へと分岐された光像による画像 (第 1画像)の取得に用いられる第 1撮像手段である。この光検出器 31としては、具体的には、試料 Sの 1次元の画像を 取得可能なリニアセンサ、または 2次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いら れる。
[0029] 一方、第 2光路上には、ビームスプリッタ 25で反射された試料 Sの光像の結像面に 対応する位置に、撮像装置 32が設置されている。撮像装置 32は、 2次元の画像を取 得可能な CCDカメラ力もなり、ビームスプリッタ 25で焦点制御用の第 2光路へと分岐 された光像による画像 (第 2画像)を取得する第 2撮像手段である。図 1に示した顕微 鏡装置では、この CCDカメラ 32によって取得される試料 Sの 2次元の画像を用いて、 撮像の焦点制御が行われる。
[0030] 具体的には、 CCDカメラ 32は、その撮像面が第 2光路に直交する xz面と略一致す るとともに、 z軸方向を傾き方向として角度 Θで第 2光路に対して傾いた状態で設置さ れている。このとき、 CCDカメラ 32の撮像面内において、 z軸方向を変化方向として、 試料 Sから CCDカメラ 32へと光が導かれる導光光学系 20での光路長が z軸方向に 沿って変化するようになって 、る。
[0031] これらの試料ステージ 15、導光光学系 20、光検出器 31、及び CCDカメラ 32に対 し、画像取得制御部 36、及び焦点制御部 37が設けられている。画像取得制御部 36 は、試料 Sの画像の取得、及び試料 Sに対する撮像位置の設定を制御することによつ て、試料 Sの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御 部 36は、光検出器 31による画像の取得を制御する。また、制御部 36は、 XYステー ジ駆動部 16を介して試料ステージ 15を駆動制御することにより、試料ステージ 15上 に載置された試料 Sで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更す る。
[0032] 焦点制御部 37は、 CCDカメラ 32によって取得された画像について所定の解析方 法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器 31による撮像の焦点 を制御する。本実施形態においては、焦点制御部 37は、ピエゾ駆動部 23を介してピ ェゾァクチユエータ 22を駆動制御して対物レンズ 21の z軸方向の位置を調整するこ とにより、撮像の焦点制御を行う。
[0033] ここで、焦点制御用の撮像装置である CCDカメラ 32は、上記したように第 2光路の 光軸に対して傾いて配置されている。このため、 CCDカメラ 32によって取得される 2 次元の画像は、 z軸方向に沿って焦点位置力 のずれが変化する画像となる。このよ うな所定の変化方向に沿って焦点位置力 のずれが変化する画像を、焦点制御部 3 7において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整の必要性の有無、焦点 を合わせるために必要な補正量などについての焦点制御情報が得られる。
[0034] 図 2は、焦点制御部 37の具体的な構成の一例を示すブロック図である。本構成例 においては、焦点制御部 37は、 AZD変換器 37a、画像メモリ 37b、及びデータ処理 部 37cから構成されて 、る。 CCDカメラ 32によって取得された画像のデータ信号は、 AZD変 37&で AZD変換された後、焦点制御用の画像データとして画像メモリ 37bに格納される。データ処理部 37cは、画像メモリ 37bから必要な画像データを読 み出し、その解析を行うとともに、解析結果に基づいてピエゾ駆動部 23を制御する。
[0035] 本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。
[0036] 図 1に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料 Sに対して、第 1 撮像手段である光検出器 31、及び第 2撮像手段である CCDカメラ 32の 2つの撮像 手段を設けている。これにより、光検出器 31による実際の画像取得と、 CCDカメラ 32 による焦点制御用の画像取得とを別に行うことが可能となる。このような構成では、例 えば、試料 Sの画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことも可能である。すな わち、 CCDカメラ 32で取得された画像を参照して焦点制御部 37によって焦点の自 動制御を行いつつ、画像取得制御部 36によって光検出器 31による試料 Sの画像の 取得を行うことが可能である。
[0037] さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第 2撮像装置として、 2次元の画 像を取得可能な CCDカメラ 32を用いるとともに、光像が試料 Sから導光される光路長 力 軸方向で変化する撮像条件となるように、光軸に対して傾けてカメラ 32を配置し ている。このようなカメラ 32を用いて取得された 2次元の画像を解析して焦点制御を 行う構成によれば、試料 Sへの焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。した がって、試料 Sの画像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。
[0038] このように、光検出器 31による試料 Sの画像の取得を行いつつ、 CCDカメラ 32によ つて取得される試料 Sの 2次元の画像を用いた焦点制御をリアルタイムで行うリアルタ ィムフォーカス技術は、試料 Sの画像取得作業を高速ィ匕する上で有効である。例え ば、近年、生物サンプルの全体を画像データとして電子化するバーチャルスライドの 開発がすすめられているが、このようなサンプルの電子化を高速で行うためには、リア ルタイムでの焦点制御が非常に重要となる。
[0039] また、上記実施形態では、試料 Sから光検出器 31への焦点制御を、ピエゾァクチュ エータ 22を駆動制御して対物レンズ 21の z軸方向の位置を調整することによって行 つている。これにより、 CCDカメラ 32で取得された画像を用いた焦点のフィードバック 制御を高速で確実に実行することができる。ただし、このような焦点制御には、対物レ ンズ 21を駆動する構成に限らず、例えば試料 Sが載置される試料ステージ 15を z軸 方向に駆動する構成を用いても良い。また、対物レンズ 21や試料ステージ 15を駆動 する駆動機構としては、ピエゾァクチユエータ以外にも、例えばステッピングモータな どを用いることができる。
[0040] また、焦点制御に用いられる試料 Sの 2次元の画像を取得するための第 2撮像装置 については、 CCDカメラ以外にも、例えば CMOS型の撮像装置など、 2次元の画像 を取得可能な他の撮像装置を用いても良 、。
[0041] 図 1に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図 3は、焦点 制御方法の具体的な一例を示すフローチャートである。また、図 4は、図 3に示した焦 点制御方法について示す模式図である。なお、以下に説明する焦点制御は、図 1に 示した構成において焦点制御部 37によって行われる。
[0042] この制御方法では、まず、図 4に示すように、 CCDカメラ 32により、その撮像面の傾 き方向である z軸方向に a画素、傾きと垂直方向である X軸方向に b画素で、 a X b画 素からなる試料 Sの 2次元の画像 Xを取得する（ステップ S101)。そして、この画像 X から、傾き方向の全幅 (a画素）、傾きと垂直方向の一定の幅 (b '画素）からなる、傾き 方向に沿った計測対象画像 X'を切り出す (S 102)。
[0043] 次に、切り出した計測対象画像 X'について、傾きと垂直方向に一定画素（s画素） だけシフトさせたシフト画像 X"を作成する（S 103)。また、画像 X"と画像 X'との間で 差分 (X'— X")をとり、さらに、その絶対値 I X' -X" Iの計算を行って、差分絶対 値画像 Yを作成する（S 104)。この差分画像 Yは、計測対象画像 X'をシフトさせた画 素分が無効画素となるため、 a X (b '—s)画素の画像となる。ここで、計測対象画像 X 'をシフトさせる画素数 sについては、光学的な倍率及び対物レンズの開口数 NAを 考慮して適当な画素数を選択することが好ましい。
[0044] 続いて、差分絶対値画像 Yについて、傾きと垂直方向の b'— s画素分で平均値を 求めて、傾き方向の a画素のデータ列 Zを作成する（S105)。この差分絶対値画像 Y 、及び傾きと垂直方向について平均したデータ列 Zは、傾き方向に沿った計測対象 画像 X，の各位置での画像成分の微分の絶対値を求めたものに相当する。
[0045] 一方、画像取得の対象となる試料 Sのコントラストパターンが均一な場合、カメラ 32 で取得される画像では、焦点が合っているほど画像のコントラストが大きくなる。また、 画像のコントラストが大きいと、対応する画像成分の微分の絶対値が大きくなる。した がって、データ列 Zにおいて、傾き方向についての画像のコントラスト変化に相当する データ値の変化を求める解析を行うことにより、焦点制御についての情報が得られる 。また、その解析結果を参照することにより、撮像の焦点制御を好適に実行すること ができる。
[0046] 図 3においては、具体的には、図 4に示すように、データ列 Zの各データについて、 その傾き方向に沿った中心位置のアドレスを 0、前方に傾いている z軸の正の方向に ある各位置のアドレスを—、後方に傾 、て 、る z軸の負の方向にある各位置のアドレ スを +として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。そして、そのデータ列 Zでのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和 Tを計算する（S106)。
[0047] このようにして求められる総和 Tにおいて、総和 Tが負の値の場合、現在の焦点位 置は正しい焦点位置よりも近い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦 点位置からのずれが大きい。一方、総和 Tが正の値の場合、現在の焦点位置は正し い焦点位置よりも遠い位置にあり、また、その絶対値が大きいほど正しい焦点位置か らのずれが大きい。したがって、このような総和 Tの値を参照して焦点制御を行えば、 実際の焦点位置を正しい焦点位置に近付けることができる。
[0048] この場合の具体的な制御方法としては、例えば、総和 Tに対して負の側の閾値 m、 及び正の側の閾値 nを設定しておき、総和 Tがこれらの閾値 m〜nの範囲外になつた ときに焦点位置を調整する方法がある。この方法では、図 3に示すように、総和 Tが負 の閾値 mよりも小さい (Tく閾値 m)かどうかを判定する（S 107)。そして、閾値 mよりも 小さい場合に、焦点位置を上げるように焦点制御を行う（S108)。また、総和 Tが正 の閾値 nよりも大きい (T>閾値 n)かどうかを判定する（S109)。そして、閾値 nよりも 大きい場合に、焦点位置を下げるように焦点制御を行う（S110)。
[0049] 以上のステップ S101〜S110の焦点制御動作を、試料 Sでの撮像位置をスキャン しつつ繰返し行うことにより、試料 Sの画像を良好な画質で高速に取得することが可 能となる。
[0050] なお、上記した焦点制御方法では、データ列 Zの作成を画素毎に行って 、るが、デ ータ列 Zの具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複数画素毎にサ ンプリングによる間弓 Iき処理を行ってデータ列 Zを作成しても良 、。このような方法で は、焦点制御をさらに高速ィ匕することができる。
[0051] また、具体的な焦点の制御方法については、これ以外にも、様々な方法を用いるこ とがでさる。
[0052] 図 5は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法におい て、ステップ S201〜S210については、図 3の制御方法におけるステップ S101〜S 110と同様である。
[0053] この制御方法では、差分絶対値画像 Yを作成するステップ S204と、傾き方向のデ ータ列 Zを作成するステップ S205との間に、ノイズ除去を行うステップ S211を設けて いる。ここでは、差分絶対値画像 Yにおける画像のノイズなどの焦点制御への影響を 取り去るために、各画素のデータ値に対してノイズレベル pを設定して 、る。
[0054] そして、差分絶対値画像 Yの各画素のうち、そのデータ値がノイズレベル pよりも小 さければ、ノイズデータであるとしてその画素のデータ値を 0とし、ノイズ除去がなされ た差分絶対値画像 Y'を作成する（S211)。傾き方向のデータ列 Zは、このノイズ除去 画像 Y'を用いて作成される。これにより、導光光学系 20や CCDカメラ 32に起因する ノイズなどが焦点制御に与える影響を抑制することができる。
[0055] 図 6は、焦点制御方法の他の例を示すフローチャートである。この制御方法におい て、ステップ S301〜S310については、図 3の制御方法におけるステップ S101〜S 110と同様である。
[0056] この制御方法では、焦点制御部 37は、 CCDカメラ 32によって取得された画像が撮 像の焦点の制御に適用可能な画像であるかどうかを判断する。そして、適用可能で あると判断した場合に画像を解析し、その解析結果に基づ!ヽて撮像の焦点を制御す ることとして!/、る。
[0057] 具体的には、まず、計測対象画像 X'を切り出すステップ S302と、シフト画像 X"を 作成するステップ S303との間に、ステップ S311〜S313を追カロしている。ここでは、 計測対象画像 X'について、画像 X，をブロックに分割し、それぞれのブロックの標準 偏差を計算して、標準偏差データ列 SDを作成する。また、この標準偏差データ列 S Dから、その標準偏差 Sd 及び平均値 Av を計算し (S311)、標準偏差と平均値と
SD SD
の比 Sd /Av が閾値 pよりも大きい（Sd /Av >閾値 p)かどうかを判断する（S
SD SD SD SD
312)。そして、閾値 pよりも大きい場合に、試料 S自体のコントラストが不均一であり、 したがって、焦点位置の判断不可（S313)であるとして焦点制御を行わないこととす る。
[0058] また、傾き方向のデータ列 Zを作成するステップ S305と、データ列 Zのアドレスとデ ータとの積の総和 Tを計算するステップ S306との間に、ステップ S321、 S322を追 カロしている。ここでは、計測対象画像 X'について、傾きと垂直方向の b'画素分で平 均値を求めて、傾き方向の a画素のデータ列 Aを作成するとともに、データ列 Zの平 均値 Zデータ列 Aの平均値 (変化量 Z明るさ、すなわちコントラストに相当）が閾値 r よりも小さい (Zの平均値 ZAの平均値く閾値 r)かどうかを判定する（S321)。そして 、閾値 rよりも小さい場合に、撮像位置に試料 Sが存在しないか、または焦点が大きく ずれており、したがって、焦点位置の判断不可（S322)であるとして焦点制御を行わ な 、こととする。
[0059] このように、 CCDカメラ 32によって取得された画像について焦点制御に適当な画 像かどうかを判断した上で画像の解析及び焦点制御を行うことにより、不適当な画像 を用いて焦点制御が行われることを防止して、撮像の焦点制御を好適に行うことがで きる。
[0060] なお、上記した各焦点制御方法では、焦点制御用の画像のコントラスト変化の解析 を、撮像面の傾き方向に沿って所定幅で切り出した計測対象画像と、そのシフト画像 との差分絶対値画像を用いて行っている。このような方法を用いることにより、画像の コントラスト変化を簡易な方法で確実に解析することができる。ただし、コントラストの 具体的な解析方法にっ 、ては、上記以外の方法を用いても良 、。
[0061] また、上記した焦点制御方法では、データ列 A及び Zの作成を画素毎に行っている 力 これらのデータ列の具体的な作成方法は上記方法に限定されない。例えば、複 数画素毎にサンプリングによる間弓 Iき処理を行って各データ列を作成しても良 、。こ のような方法では、焦点制御をさらに高速ィ匕することができる。
[0062] また、図 6に示した方法では、ステップ S311及び S312において画像 X'を分割す るブロックは、 2次元マトリクス状の分割に限らず、一方向のブロック分割としても良い 。また、ブロックのサイズについては、光学的な倍率、 CCDカメラのサイズ、画素数等 を考慮して適当なサイズに設定することが好ましい。
[0063] また、上記方法では、ステップ S313及び S322〖こおいて、対象画像が均一なコント ラストパターンでない場合、あるいは画像の一部にのみ試料 Sが存在して充分なコン トラストレベルが得られな 、場合等に、焦点位置が判断不可であるとして焦点制御を 行わないこととしている。これに対して、ステージ 15を駆動させて試料 Sの画像を順次 取得する際には、焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報は、他の 撮像位置についての焦点制御情報を参照して設定しても良い。この場合、例えば、 焦点位置が判断不可の撮像位置に関する焦点制御情報を、一連の焦点計測で取 得されてデータ記憶部に記憶された任意の焦点制御情報、もしくは直近 (最新)の焦 点制御情報と同一とみなして焦点制御を実行する方法を用いることができる。
[0064] また、 CCDカメラ 32によって取得された画像を用いた焦点制御については、画像 のコントラスト変化を解析する方法を用いることにより、撮像の焦点制御を精度良く実 現することができる。ただし、このような焦点制御方法については、コントラスト変化を 用いる以外の方法を用いても良 、。
[0065] 上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明す る。
[0066] 本実施例では、試料 Sとして平滑筋肉腫の病理サンプルを用いる。この病理サンプ ルを顕微鏡（NIKONTMD, 20 X , NAO. 75)にセットし、 CCDカメラ（ORCA,浜 松ホトニタス製)を 0 = 25° の傾きで配置する。このとき、 CCDの撮像面の傾き方向 の両端は、光軸方向に約 3. 7mmの深さを持つ。これは、試料 S上での光軸方向の 変化は撮像面上では倍率の自乗となることから、サンプル上での深さに換算すると約 9 μ mとなる。
[0067] また、 CCDカメラで取得される焦点制御用の画像にぉ 、て、計測対象画像 X'のサ ィズを a X b' = 1024画素 X 190画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが — 4 m、 一 2 m、 0 m、 2 m、 4 mの 5点にっ 、て焦点計測を行った。
[0068] 図 7は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。図 7の画像 (a) 〜（e)は、それぞれ焦点位置のずれが（a)— 4 m、 （b)— 2 m、 (c) 0 m、 (d) 2 μ m、及び (e) 4 μ mの場合にっ 、て取得された計測対象画像 X，を示して 、る。この ような計測対象画像 X，に対し、 4画素のシフトでシフト画像 X"を作成し、画像 X，、 X" から差分絶対値画像 Y、及びデータ列 Ζを求める。そして、データ列 Ζでのアドレスと データとの積の総和 Τである焦点重心のデータ Fを求める。
[0069] 図 8は、図 7に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。図 8のダラ フ（a)〜（e)において、横軸は傾き方向の画素位置を示し、縦軸は各位置でのコント ラストに対応するデータ列 Zを示している。また、図 8のグラフ（a)〜（e)は、それぞれ 図 7の画像 (a)〜（e)に対応して 、る。
[0070] これらのデータ列 Zから、各焦点位置に対する焦点重心 F (総和 T)は、（a)焦点位 置— 4 mに対して F=— 49. 7、（b)焦点位置— 2 mに対して F=—46. 7、 (c) 焦点位置 O /z mに対して F= 21. 4、（d)焦点位置 2 /z mに対して F= 91. 0、（e)焦 点位置 に対して F= 117. 0とそれぞれ求められる。この結果より、上記した解 析方法で得られる解析結果では、焦点位置のずれと、データ列 Zから求められる焦 点重心 Fの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析 結果を参照することで、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。
[0071] 図 9は、本発明による顕微鏡装置の第 2実施形態の構成を示すブロック図である。
本実施形態において、照射光源 10、集光レンズ 11、試料ステージ 15、 XYステージ 駆動部 16、ピエゾ駆動部 23、画像取得制御部 36、及び焦点制御部 37については 、図 1に示した実施形態と同様である。
[0072] 試料ステージ 15上の試料 Sに対し、試料ステージ 15の上方に導光光学系 20が設 けられている。本実施形態においては、導光光学系 20は、対物レンズ 21と、ビーム スプリッタ 26と、結像レンズ 26a、 26bとを有している。また、対物レンズ 21に対して、 対物レンズ 21を z軸方向に駆動するピエゾァクチユエータ 22が設けられている。
[0073] 対物レンズ 21からの光がビームスプリッタ 26を通過する光路上には、第 1撮像手段 である光検出器 31が設置されている。また、対物レンズ 21からの光がビームスプリツ タ 26で反射される光路上には、光路に対して傾いた状態で第 2撮像手段である CC Dカメラ 32が設置されて!、る。
[0074] 図 9においては、対物レンズ 21からビームスプリッタ 26への光路が無限遠光路とな つている。これに対応して、ビームスプリッタ 26と光検出器 31との間には、光検出器 3 1へと光像を結像させる第 1結像レンズ 26aが設置されている。また、ビームスプリッタ 26と CCDカメラ 32との間には、カメラ 32へと光像を結像させる第 2結像レンズ 26bが 設置されている。
[0075] このような構成では、画像取得用の光検出器 31に対する結像の倍率と、焦点制御 用の CCDカメラ 32に対する結像の倍率とを、レンズ 26a、 26bによって別々に設定 することができる。したがって、試料 Sの画像取得に影響を与えることなぐカメラ 32へ の結像の倍率を焦点計測に好適な倍率に設定することが可能となる。この場合、画 像取得用の第 1光路上に配置された第 1結像レンズ 26a、及び焦点制御用の第 2光 路上に配置された第 2結像レンズ 26bについて、第 2結像レンズ 26bは、第 1結像レ ンズ 26aよりも結像倍率が小さ 、ことが好ま 、。
[0076] 図 10は、本発明による顕微鏡装置の第 3実施形態の構成を示すブロック図である。
本実施形態において、照射光源 10、集光レンズ 11、試料ステージ 15、 XYステージ 駆動部 16、ピエゾ駆動部 23、画像取得制御部 36、及び焦点制御部 37については 、図 1に示した実施形態と同様である。
[0077] 試料ステージ 15上の試料 Sに対し、試料ステージ 15の上方に導光光学系 20が設 けられている。本実施形態においては、導光光学系 20は、対物レンズ 21と、ビーム スプリッタ 27a、 27bとを有している。また、対物レンズ 21に対して、対物レンズ 21を z 軸方向に駆動するピエゾァクチユエータ 22が設けられて 、る。
[0078] 対物レンズ 21からの光がビームスプリッタ 27a、 27bを通過する光路上には、第 1撮 像手段である光検出器 31が設置されている。また、対物レンズ 21からの光が前段の ビームスプリッタ 27aで反射される光路上には、 z軸方向に沿って光路長が変化する ように撮像面が光路に対して傾 、た状態で CCDカメラ 33が設置されて 、る。また、 対物レンズ 21からの光が後段のビームスプリッタ 27bで反射される光路上には、 z軸 方向に沿うとともにカメラ 33とは逆方向に光路長が変化するように撮像面が光路に対 して傾 、た状態で CCDカメラ 34が設置されて!、る。
[0079] 図 10においては、 z軸方向を傾き方向として互いに逆方向に傾いた状態で設置さ れた上記の CCDカメラ 33、 34によって、焦点制御用の第 2撮像手段が構成されてい る。このように、逆方向に傾いた 2つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、 試料 S自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して 好適に焦点制御を行うことができる。また、このような構成では、 2つのカメラ 33、 34を 光軸に対して傾きが対称となるように配置することが好ま 、。
[0080] なお、本実施形態においては、 CCDカメラ 33、 34について、上記したように所定の 変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成して 、る。これにより 、焦点制御の精度を向上することができる。これらの CCDカメラ 33、 34については、 一般には、所定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように 構成すれば良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変 化量で光路長が変化する構成がある。
[0081] 図 10に示した顕微鏡装置における焦点制御方法について説明する。図 11は、焦 点制御方法の一例を示すフローチャートである。なお、以下に説明する焦点制御は 、図 10に示した構成において焦点制御部 37によって行われる。また、画像の具体的 な解析方法については、図 3及び図 4に示した焦点制御方法と同様である。
[0082] この制御方法では、まず、 CCDカメラ 33、 34により、試料 Sの 2つの 2次元の画像 X
, Xを取得する（ステップ S501)。そして、これらの画像 X , Xから、それぞれ傾き方
1 2 1 2
向に沿った計測対象画像 X ' , X，を切り出す (S502)。これらの計測対象画像 X，
1 2 1
, X 'は、上記したように、 z軸方向について逆方向に傾いた画像である。
2
[0083] 次に、切り出した計測対象画像 X ' , X 'について、傾きと垂直方向に一定画素だ
1 2
けシフトさせたシフト画像 X ", X "を作成する（S503)。また、カメラ 33で取得された 画像 ^について、画像 ^ "と画像 ^，との間で差分 ( ， をとり、さらに、その 絶対値 I X ' -X " I の計算を行って、差分絶対値画像 γを作成する。また、カメラ
34で取得された画像 Xについて、画像 X "と画像 X 'との間で差分 (X
2 2 2 2，—X ")をと
2 り、さらに、その絶対値 I X ' -X "
2 2 I の計算を行って、差分絶対値画像 γ
2を作成す る（S504)。
[0084] 続 、て、差分絶対値画像 Υ , Y
1 2につ 、て、傾きと垂直方向で平均値を求めて、傾 き方向のデータ列 Z， Zを作成する（S505)。また、データ列 Z， Zの各データにつ
1 2 1 2
いて、中心位置のアドレスを 0として、それぞれの位置のデータにアドレスを割り振る。 そして、そのデータ列 Z， Zでのアドレスとデータとの積をとり、それらの総和 T， T
1 2 1 2 を計算する（S506)。なお、データ列 Z , Zに対するアドレスの割り振りは、撮像面の
1 2
傾き方向である z軸方向にっ ヽて同方向に行う。図 11に示す焦点制御方法にぉ 、て は、さらに、これらのカメラ 33、 34で取得された 2画像 X , Xに対して求められた総
1 2
和 Τ , Tについて、その差分 T=T -Τを計算する（S511)。そして、この総和の差
1 2 1 2
分 Τを参照して、閾値 m, nを用いた焦点制御を行う（S507〜S510)。
[0085] 以上のステップ S501〜S511の焦点制御動作を、試料 Sでの撮像位置をスキャン しつつ繰返し行うことにより、試料 Sの画像を良好な画質で高速に取得することが可 能となる。特に、本実施形態においては、互いに逆方向に傾いた CCDカメラ 33、 34 によって取得された画像 X , Xを用い、それぞれについて求められた総和 T , Tの
1 2 1 2 差分 Tをとつて焦点制御を行うことにより、試料 S自体のコントラストパターンの影響を 低減することができる。
[0086] 上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明す る。ここで、以下においては、焦点制御用の第 2撮像手段を構成する 2つの CCDカメ ラ 33、 34について、前段の CCDカメラ 33をカメラ 1、後段の CCDカメラ 34をカメラ 2 とする。
[0087] 本実施例では、試料 Sとして口腔肉腫瘤の病理サンプルを用いる。この病理サンプ ルを顕微鏡（NIKONTMD, 20 X , NAO. 75)にセットし、 CCDカメラ（ORCA,浜 松ホトニタス製)を配置する。本実施例では、傾き方向が逆方向の 2つの画像を用い ることによる効果の確認を目的とするため、単一の CCDカメラを用い、その配置角度 を 0 = ± 25° で変えて 2度の焦点計測を行う。このとき、 CCDの撮像面の傾き方向 の両端は、光軸方向に約 3. 7mmの深さを持つ。これは、試料 S上での光軸方向の 変化は撮像面上では倍率の自乗となることから、サンプル上での深さに換算すると約 9 μ mとなる。
[0088] また、 2つの CCDカメラのそれぞれで取得される焦点制御用の画像において、計 測対象画像 X ' , X，のサイズを a X b ' = 1024画素 X I 90画素とし、焦点位置の正
1 2
しい焦点位置からのずれが 4 πι、 一 2 πι、 Ο πι、 2 πι、 の 5点について 焦点計測を行った。
[0089] 図 12〜図 16は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。ここで 、図 12の画像 (a)、 （b)は、焦点位置のずれが 4 mの場合について取得された（ a)カメラ 1の計測対象画像 X，、及び (b)カメラ 2の計測対象画像 X，を示して 、る。
1 2
また、図 13の画像 (a)、 （b)は、焦点位置のずれが—2 mの場合について取得され た (a)カメラ 1の計測対象画像 X '、及び (b)カメラ 2の計測対象画像 X 'を示している
1 2
[0090] また、図 14の画像 (a)、 (b)は、焦点位置のずれが 0 μ mの場合にっ 、て取得され た (a)カメラ 1の計測対象画像 X '、及び (b)カメラ 2の計測対象画像 X 'を示している
1 2
。また、図 15の画像 (a)、 （b)は、焦点位置のずれが 2 /z mの場合について取得され た (a)カメラ 1の計測対象画像 X '、及び (b)カメラ 2の計測対象画像 X 'を示している
1 2
。また、図 16の画像 (a)、 （b)は、焦点位置のずれ力 /z mの場合について取得され た (a)カメラ 1の計測対象画像 X '、及び (b)カメラ 2の計測対象画像 X 'を示している
1 2
[0091] このような 2種類の計測対象画像 X ，， X，に対し、 4画素のシフトでシフト画像 X "，
1 2 1
X "を作成し、画像 X'、 X"から差分絶対値画像 Y , Y、及びデータ列 Z , Zを求め
2 1 2 1 2 る。そして、データ列 Z , Zでのアドレスとデータとの積の総和 τ , Tである焦点重心
1 2 1 2
のデータ Fl, F2を求める。また、この焦点重心のデータ Fl, F2の差分 F = F1—F2 (総和 T , Tの差分 T=T Τ )を求めて、焦点制御に用いる。
1 2 1 2
[0092] 図 17は、図 12〜図 16の画像（a)に示したカメラ 1の計測対象画像 Xでのコントラス ト変化を示す図である。図 17のグラフ（a)〜（e)において、横軸は傾き方向の画素位 置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列 を示している。また、 図 17のグラフ（a)〜（e)は、それぞれ図 12の画像（a)、図 13の画像（a)、図 14の画 像 (a)、図 15の画像 (a)、図 16の画像 (a)に対応している。
[0093] これらのデータ列 Zから、各焦点位置に対する焦点重心 F1 (総和 T )は、（a)焦点 位置 に対して Fl = 5. 4、（b)焦点位置 2 mに対して F1 =49. 0、（c)焦 点位置 O /z mに対して Fl = 75. 2、（d)焦点位置 2 /z mに対して Fl = 94. 1、（e)焦 点位置 に対して Fl = 120. 8とそれぞれ求められる。この結果では、焦点位置 のずれに対してデータ列 Z力 求められる焦点重心 F1の値の変化において、 F1の すべてが正の値であって負の値から正の値へと移行する点が存在しない。このような 焦点重心 F1の値の変化は、試料 S自体のコントラストパターンの変化に起因するもの である。
[0094] 一方、図 18は、図 12〜図 16の画像 (b)に示したカメラ 2の計測対象画像 Xでのコ
2 ントラスト変化を示す図である。図 18のグラフ（a)〜（e)において、横軸は傾き方向の 画素位置を示し、縦軸は各位置でのコントラストに対応するデータ列 Zを示している
2
。また、図 18のグラフ（a)〜（e)は、それぞれ図 12の画像 (b)、図 13の画像 (b)、図 1 4の画像 (b)、図 15の画像 (b)、図 16の画像 (b)に対応している。
[0095] これらのデータ列 Zから、各焦点位置に対する焦点重心 F2 (総和 T )は、（a)焦点
2 2
位置 【こ対して F2 = 89. 2、（b)焦^;位置 2 /z m【こ対して F2 = 55. 8、 (c) 焦点位置 0 mに対して F2= 12. 0、（d)焦点位置 2 mに対して F2=— 13. 4、 (e )焦点位置 4 μ mに対して F2 =—61. 6とそれぞれ求められる。
[0096] また、これらの焦点重心 Fl、 F2から焦点重心の差分 F (総和の差分 T)は、（a)焦 点位置 に対して F=—83. 8、（b)焦点位置 2 /z mに対して F=—6. 8、 ( c)焦点位置 O /z mに対して F = 63. 2、（d)焦点位置 2 mに対して F= 107. 5、 (e) 焦点位置 4 /z mに対して F= 182. 4とそれぞれ求められる。この結果より、上記のよう に光軸に対して逆方向に傾 、た 2つのカメラによって取得される画像を解析して得ら れる解析結果では、試料 S自体が有するコントラストパターンにかかわらず、焦点位 置のずれと、データ列 Z , Z力 求められる焦点重心の差分 Fの値の変化とが、良く
1 2
対応していることがわかる。したがって、このような解析結果を参照することで、撮像の 焦点制御を好適に実行することができる。
[0097] 本発明による顕微鏡装置について、さらに説明する。
[0098] 図 19は、本発明による顕微鏡装置の第 4実施形態の構成を示すブロック図である。
本実施形態において、照射光源 10、集光レンズ 11、試料ステージ 15、 XYステージ 駆動部 16、導光光学系 20、ピエゾァクチユエータ 22、及びピエゾ駆動部 23につい ては、図 1に示した実施形態と同様である。
[0099] 第 1光路上には、ビームスプリッタ 25を通過した試料 Sの光像の結像面に対応する 位置に、光検出器 41が設置されている。光検出器 41は、ビームスプリッタ 25で画像 取得用の第 1光路へと分岐された光像による画像 (第 1画像)の取得に用いられる第 1撮像手段である。この光検出器 41としては、具体的には、試料 Sの 1次元の画像を 取得可能なリニアセンサ、または 2次元の画像を取得可能なイメージセンサが用いら れる。
[0100] 一方、第 2光路上には、ビームスプリッタ 25で反射された試料 Sの光像の結像面に 対応する位置に、撮像装置 42が設置されている。撮像装置 42は、 2次元の画像を取 得可能な CCDカメラ力もなり、ビームスプリッタ 25で焦点制御用の第 2光路へと分岐 された光像による画像 (第 2画像)を取得する第 2撮像手段である。図 19に示した顕 微鏡装置では、この CCDカメラ 42によって取得される試料 Sの 2次元の画像を用い て、撮像の焦点制御が行われる。
[0101] 具体的には、 CCDカメラ 42は、その撮像面が第 2光路に直交する xz面と略一致す るように配置されている。また、ビームスプリッタ 25とカメラ 42との間で撮像面に対して 所定位置に、光路長変更部材 42aが設置されている。光路長変更部材 42aは、試料 Sからの光を透過する光透過材料により、 z軸方向に沿って厚さが変化していくゥエツ ジ形状に形成されている。このとき、 CCDカメラ 42の撮像面内において、 z軸方向を 変化方向として、試料 Sから CCDカメラ 42へと光が導かれる導光光学系 20での光路 長が z軸方向に沿って変化するようになって!、る。
[0102] これらの試料ステージ 15、導光光学系 20、光検出器 41、及び CCDカメラ 42に対 し、画像取得制御部 46、及び焦点制御部 47が設けられている。画像取得制御部 46 は、試料 Sの画像の取得、及び試料 Sに対する撮像位置の設定を制御することによつ て、試料 sの画像取得動作を制御する制御手段である。具体的には、画像取得制御 部 46は、光検出器 41による画像の取得を制御する。また、制御部 46は、 XYステー ジ駆動部 16を介して試料ステージ 15を駆動制御することにより、試料ステージ 15上 に載置された試料 Sで顕微鏡光学系の光軸上にある撮像位置を設定または変更す る。
[0103] 焦点制御部 47は、 CCDカメラ 42によって取得された画像について所定の解析方 法で解析を行う。そして、その解析結果に基づいて、光検出器 41による撮像の焦点 を制御する。本実施形態においては、焦点制御部 47は、ピエゾ駆動部 23を介してピ ェゾァクチユエータ 22を駆動制御して対物レンズ 21の z軸方向の位置を調整するこ とにより、撮像の焦点制御を行う。
[0104] ここで、焦点制御用の撮像装置である CCDカメラ 42では、上記したように第 2光路 の光軸に対して前方側にゥエッジ形状の光路長変更部材 42aが配置されている。こ のため、 CCDカメラ 42によって取得される 2次元の画像は、 CCDカメラ 32を傾けて 配置する図 1に示した構成と同様に、 z軸方向に沿って焦点位置力 のずれが変化 する画像となる。このような所定の変化方向に沿って焦点位置からのずれが変化する 画像を、焦点制御部 47において解析することにより、撮像の焦点のずれ、焦点調整 の必要性の有無、焦点を合わせるために必要な補正量などにっ 、ての焦点制御情 報が得られる。
[0105] 本実施形態による顕微鏡装置の効果について説明する。
[0106] 図 19に示した顕微鏡装置においては、画像取得の対象となる試料 Sに対して、光 検出器 41、及び CCDカメラ 42の 2つの撮像手段を設けている。これにより、光検出 器 41による実際の画像取得と、 CCDカメラ 42による焦点制御用の画像取得とを別に 行うことが可能となる。このような構成では、例えば、試料 Sの画像取得と、撮像の焦 点制御とを同時に行うことも可能である。すなわち、 CCDカメラ 42で取得された画像 を参照して焦点制御部 47によって焦点の自動制御を行いつつ、画像取得制御部 46 によって光検出器 41による試料 Sの画像の取得を行うことが可能である。
[0107] さらに、上記した装置では、焦点制御に用いられる第 2撮像装置として、 2次元の画 像を取得可能な CCDカメラ 42を用いるとともに、光像が試料 Sから導光される光路長 力 軸方向で変化する撮像条件となるように、 z軸方向で厚さが変化する光路長変更 部材 42aをカメラ 42の前方側に配置して 、る。このようなカメラ 42及び光路長変更部 材 42aを用いて取得された 2次元の画像を解析して焦点制御を行う構成によれば、 試料 Sへの焦点計測用のレーザ光の照射等が不要となる。したがって、試料 Sの画 像取得と、撮像の焦点制御とを好適に両立することができる。
[0108] また、焦点制御に用いられる第 2撮像装置を光軸に対して傾いた状態で設置する 図 1の構成に対し、本構成では、撮像装置と光路長変更部材とを組み合わせて用い て焦点計測を行っている。このような構成によっても、撮像の焦点制御を好適に実現 することが可能である。一般には、第 2撮像手段は、光路上に、その撮像面内におい て所定の変化方向に沿って導光光学系での光路長が変化するように構成、配置され ていれば良い。
[0109] 特に、光路長変更部材を用いる構成では、撮像装置を傾けて配置する必要がなく 顕微鏡へのマウントが簡単になるという利点がある。また、 CCDカメラの撮像面に対 して斜めに光が入射したときに、画素の不均一性に起因する固定パターンノイズが 顕著となる場合があるが、光軸に対して垂直に撮像装置を配置する上記構成では、 そのようなノイズの問題は発生しな 、。
[0110] また、試料 S上での光軸方向の変化は撮像面上では倍率の自乗となるため、撮像 装置を傾ける構成では制御可能な焦点位置の範囲に限界がある。これに対して、光 路長変更部材を用いる構成では、制御しょうとする焦点位置の範囲に合わせて光路 長変更部材の形状を選択することが可能である。なお、このように光路長変更部材を 用いた場合の光路長 (光学距離)の差 Δ χは、変更部材のガラスなどの厚み d、及び 屈折率 nから Δ x=d (n— 1) Znと求められる。
[0111] 第 2撮像装置の前方側に設置される光路長変更部材については、図 20の構成例（ a)〜（f)に示すように、具体的には様々な形状のものを用いて良い。これらの図 20に 示す光路長変更部材のうち、図 20の構成例 (a)は、図 19に関して上述した光路長 の変化方向に沿って厚さが連続的に変化するゥエッジ形状のものである。また、図 2 0の構成例 (b)は、厚さが階段状に変化するステップゥエッジ形状のものである。また 、図 20の構成例 (c)では、焦点距離が異なる複数のマイクロレンズを変化方向に沿 つて配列したレンズアレイを、光路長変更部材として 、る。
[0112] また、図 20の構成例 (d)〜(f)では、厚さが変化する変化量や変化していく方向（ 厚さの変化率)が異なる複数のゥエッジ形状の光路長変更部材を組み合わせて用い る構成を示している。このように複数種類の部材を用いることにより、様々な条件での 焦点計測が可能となる。例えば、図 20の構成例 (e)に示すように、厚さの変化率に相 当するゥエッジの勾配が小さ 、ゥエッジ部材と大き 、ゥエッジ部材とを組み合わせて 使用する構成では、ゥェッジの勾配に応じて焦点計測の計測範囲及び分解能を選 択して、精度良く焦点制御を行うことができる。
[0113] この場合、例えば、次のような焦点制御方法が可能である。最初に勾配が大きいゥ エッジ部材を用いて焦点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。次に、勾 配が小さ!/、ゥエッジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方 法では、画像取得の開始時などにおいて、焦点位置の設定を高速かつ簡単に行うこ とがでさる。
[0114] あるいは、画像取得中に勾配が小さ!/、ゥエッジ部材を用いて焦点位置の調整を行 う。そして、焦点位置が計測されない場合に、勾配が大きいゥエッジ部材を用いて焦 点位置を計測して、低精度で焦点位置を調整する。さらに、再び勾配が小さいゥエツ ジ部材を用いて高精度で焦点位置を調整する。このような制御方法では、画像取得 の対象となる試料が厚さの変化の大きい試料である場合にも好適に焦点制御を実現 することができる。
[0115] また、顕微鏡が複数の倍率に設定可能な構成である場合には、複数の倍率のそれ ぞれに対応した勾配のゥエッジ部材を設けておくことが好ましい。これにより、顕微鏡 の倍率を変更する場合にも焦点計測部分の光学的、機構的な変更が不要な構成の 顕微鏡装置とすることができる。
[0116] なお、光路長変更部材を用いる構成では、変更部材は、撮像装置に密着させて直 接取り付けるか、または多少の距離をあけて配置しても良い。また、光路長変更手段 としては、光を透過する光路長変更部材以外の光学素子を用いても良い。また、図 1 9に示した顕微鏡装置においても、その具体的な焦点制御方法については、図 1に 示した顕微鏡装置に関して上述したものと同様である。 [0117] 上記した顕微鏡装置を用いた焦点制御方法の具体的な一実施例について説明す る。
[0118] 本実施例では、試料 Sとして平滑筋肉腫の病理サンプルを用いる。この病理サンプ ルを顕微鏡（NIKONTMD, 20 X , NAO. 75)にセットし、 CCDカメラ（ORCA,浜 松ホトニタス製)を配置するとともに、 CCDカメラ 42の前面に、図 21に示す構成の光 路長変更部材 42aを取り付ける。この光路長変更部材 42aは、厚さ 1. 1mmで長さが 異なる 3枚のガラス板 421、 422、 423を張り合わせたもので、カメラ 42に対して、厚 さ Omm、 1. lmm、 2. 2mm、 3. 3mmの 4ステップのステップゥエッジ形状をなして いる。
[0119] また、 CCDカメラで取得される焦点制御用の画像において、計測対象画像 X'のサ ィズを a X b ' = 1024画素 X 190画素とし、焦点位置の正しい焦点位置からのずれが — 4 m、 一 2 m、 0 m、 2 m、 4 mの 5点にっ 、て焦点計測を行った。
[0120] 図 22は、焦点制御に用いられる計測対象画像の例を示す図である。図 22の画像（ a)〜 (e)は、それぞれ焦点位置のずれが（a)— 4 m、 （b)— 2 m、 (c) 0 m、 (d) 2 m、及び (e) 4 μ mの場合にっ 、て取得された計測対象画像 X，を示して 、る。こ のような計測対象画像 X，に対し、 4画素のシフトでシフト画像 X"を作成し、画像 X，、 X"から差分絶対値画像 Y、及びデータ列 Ζを求める。そして、データ列 Ζでのアドレス とデータとの積の総和 Τである焦点重心のデータ Fを求める。
[0121] 図 23は、図 22に示した計測対象画像でのコントラスト変化を示す図である。図 23 のグラフ（a)〜（e)において、横軸は光路長の変化方向の画素位置を示し、縦軸は 各位置でのコントラストに対応するデータ列 Zを示している。また、図 23のグラフ（a) 〜（e)は、それぞれ図 22の画像 (a)〜（e)に対応して 、る。
[0122] これらのデータ列 Zから、各焦点位置に対する焦点重心 F (総和 T)は、 (a)焦点位 置— 4 mに対して F=— 134. 7、（b)焦点位置— 2 mに対して F=— 74. 9、 (c) 焦点位置 O /z mに対して F= 29. 4、（d)焦点位置 2 mに対して F= 107. 6、（e)焦 点位置 に対して F= 123. 4とそれぞれ求められる。この結果より、上記した解 析方法で得られる解析結果では、焦点位置のずれと、データ列 Zから求められる焦 点重心 Fの値の変化とが、良く対応していることがわかる。したがって、このような解析 結果を参照することで、撮像の焦点制御を好適に実行することができる。
[0123] 図 24は、本発明による顕微鏡装置の第 5実施形態の構成を示すブロック図である。
本実施形態において、照射光源 10、集光レンズ 11、試料ステージ 15、 XYステージ 駆動部 16、ピエゾ駆動部 23、画像取得制御部 46、及び焦点制御部 47については 、図 19に示した実施形態と同様である。
[0124] 試料ステージ 15上の試料 Sに対し、試料ステージ 15の上方に導光光学系 20が設 けられている。本実施形態においては、導光光学系 20は、対物レンズ 21と、ビーム スプリッタ 26と、結像レンズ 26a、 26bとを有している。また、対物レンズ 21に対して、 対物レンズ 21を z軸方向に駆動するピエゾァクチユエータ 22が設けられている。
[0125] 対物レンズ 21からの光がビームスプリッタ 26を通過する光路上には、第 1撮像手段 である光検出器 41が設置されている。また、対物レンズ 21からの光がビームスプリツ タ 26で反射される光路上には、その前方側に光路長変更部材 42aが配置された第 2 撮像手段である CCDカメラ 42が設置されて 、る。
[0126] 図 24においては、対物レンズ 21からビームスプリッタ 26への光路が無限遠光路と なっている。これに対応して、ビームスプリッタ 26と光検出器 41との間には、光検出 器 41へと光像を結像させる第 1結像レンズ 26aが設置されている。また、ビームスプリ ッタ 26と CCDカメラ 42との間には、カメラ 42へと光像を結像させる第 2結像レンズ 26 bが設置されている。
[0127] このような構成では、図 9に示した構成と同様に、画像取得用の光検出器 41に対す る結像の倍率と、焦点制御用の CCDカメラ 42に対する結像の倍率とを、レンズ 26a、 26bによって別々に設定することができる。したがって、試料 Sの画像取得に影響を 与えることなぐカメラ 42への結像の倍率を焦点計測に好適な倍率に設定することが 可能となる。
[0128] 図 25は、本発明による顕微鏡装置の第 6実施形態の構成を示すブロック図である。
本実施形態において、照射光源 10、集光レンズ 11、試料ステージ 15、 XYステージ 駆動部 16、ピエゾ駆動部 23、画像取得制御部 46、及び焦点制御部 47については 、図 19に示した実施形態と同様である。
[0129] 試料ステージ 15上の試料 Sに対し、試料ステージ 15の上方に導光光学系 20が設 けられている。本実施形態においては、導光光学系 20は、対物レンズ 21と、ビーム スプリッタ 27a、 27bとを有している。また、対物レンズ 21に対して、対物レンズ 21を z 軸方向に駆動するピエゾァクチユエータ 22が設けられて 、る。
[0130] 対物レンズ 21からの光がビームスプリッタ 27a、 27bを通過する光路上には、第 1撮 像手段である光検出器 41が設置されている。また、対物レンズ 21からの光が前段の ビームスプリッタ 27aで反射される光路上には、その前方側に z軸方向に沿って光路 長が変化するような光路長変更部材 43aが配置された CCDカメラ 43が設置されてい る。また、対物レンズ 21からの光が後段のビームスプリッタ 27bで反射される光路上 には、その前方側に z軸方向に沿うとともにカメラ 43とは逆方向に光路長が変化する ような光路長変更部材 44aが配置された CCDカメラ 44が設置されている。
[0131] 図 25においては、 z軸方向を変化方向として互いに逆方向に光路長が変化するよ うに光路長変更部材 43a、 44aが設けられた上記の CCDカメラ 43、 44によって、焦 点制御用の第 2撮像手段が構成されている。このように、逆方向に光路長が変化す る 2つの撮像装置を用いて焦点計測を行うことにより、図 10に示した構成と同様に、 試料 S自体のコントラストパターンが不均一な場合においても、その影響を低減して 好適に焦点制御を行うことができる。
[0132] また、本実施形態においては、 CCDカメラ 43、 44について、上記したように所定の 変化方向に沿って互いに逆方向に光路長が変化するように構成して 、る。これにより 、焦点制御の精度を向上することができる。このような構成については、一般には、所 定の変化方向に沿って互いに異なる変化率で光路長が変化するように構成すれば 良い。そのような構成としては、例えば、同方向であるが互いに異なる変化量で光路 長が変化する構成がある。
[0133] なお、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化 させる構成では、 2つの撮像装置を用いる図 25の構成に限らず、例えば図 20の構成 例 (d)に示したように、厚さの変化方向が逆方向となる 2種類の光路長変更部材を 1 つの撮像装置に対して設ける構成を用いることが可能である。この場合、撮像装置の 撮像面の一の撮像領域に対して、所定の変化方向に沿って光路長が変化する一の 光路長変更部材を配置し、撮像面の他の撮像領域に対して、上記変化方向に沿うと ともに異なる変化率、好ましくは逆方向に光路長が変化する他の光路長変更部材を 配置する構成とすれば良い。
[0134] 本発明による顕微鏡装置は、上記した実施形態及び構成例に限られるものではな ぐ様々な変形が可能である。例えば、上記した各実施形態では、顕微鏡装置を透 過型の顕微鏡として構成している力 反射型の顕微鏡、または蛍光顕微鏡に対して も同様に焦点制御を行うことが可能である。
[0135] 図 26は、本発明による顕微鏡装置の第 7実施形態の構成を示すブロック図である。
本顕微鏡装置は、図 1に示した顕微鏡装置の変形例である。具体的には、試料ステ ージ 15の下方に照射光源 10及び集光レンズ 11を設置した図 1に示した透過型の構 成に対し、図 26に示す顕微鏡装置は、照射光源 10及び集光レンズ 11に代えて照 射光源 80、レンズ 81、及び照射光学系 85を設置した蛍光顕微鏡の構成となってい る。
[0136] すなわち、図 26においては、導光光学系 20において、ビームスプリッタ 25と、対物 レンズ 21との間に、ダイクロイツクミラー 86が配置されている。ダイクロイツクミラー 86 は、照射光源 80からレンズ 81を介して入射される光を反射して励起光として試料 S へと照射するとともに、試料 Sで発生した蛍光をビームスプリッタ 25へと通過させる。 また、ダイクロイツクミラー 86と照射光源 80との間、ダイクロイツクミラー 86と対物レン ズ 21との間には、それぞれ励起フィルタ 87、カットフィルタ 88が配置され、これらのダ ィクロイツクミラー 86、励起フィルタ 87、及びカットフィルタ 88によって照射光学系 85 (Fluorescence filter cube)が構成されて ヽる。
[0137] このような構成の蛍光顕微鏡においても、上記した透過型の顕微鏡の場合と同様 に焦点制御を行うことができる。また、顕微鏡を反射型の構成とする場合には、図 26 の構成において、ダイクロイツクミラー 86をハーフミラーに置き換え、フィルタ 87、 88 を取り除けば良い。
[0138] なお、撮像装置の前方側に光路長変更部材を配置することによって光路長を変化 させる構成では、上記したように、例えば図 20の構成例（d)に示したように、厚さの変 化方向が逆方向となる 2種類の光路長変更部材を 1つの撮像装置に対して設ける構 成を用いることが可能である。この場合、撮像装置の撮像面の第 1撮像領域に対して 、所定の変化方向に沿って光路長が変化する第 1光路長変更部材を配置し、撮像 面の第 2撮像領域に対して、上記変化方向に沿うとともに異なる変化率、好ましくは 逆方向に光路長が変化する第 2光路長変更部材を配置する構成とする。
[0139] このような構成では、通常、第 1撮像領域、及び第 2撮像領域に入射する光像が異 なるものとなる。これに対して、焦点制御用の画像を取得するための光像を、第 1光 路長変更部材及び撮像装置の撮像面の第 1撮像領域への一の光路、及び第 2光路 長変更部材及び撮像装置の撮像面の第 2撮像領域への他の光路へと分岐する光分 岐光学系を備えることが好まし ヽ。
[0140] 図 27は、焦点制御用の撮像装置に対する光分岐光学系について示す図である。
図 27の構成 (a)では、焦点制御用の画像を取得するための撮像装置 100の第 1撮 像領域 101に対して第 1光路長変更部材 111を配置し、第 2撮像領域 102に対して 第 1光路長変更部材 111とは逆方向に光路長が変化する第 2光路長変更部材 112 を配置している。この場合、上記したように、撮像装置 100の 2つの撮像領域 101、 1 02に入射する光像が異なるものとなる。
[0141] 一方、図 27の構成 (b)では、光像を第 1撮像領域 101へと反射する 50%反射ミラ 一 121、及び光像を第 2撮像領域 102へと反射する 100%反射ミラー 122を有する 光分岐光学系 120を設けている。これにより、光分岐光学系 120で分岐された同一 の光像が撮像領域 101、 102に入射することとなり、焦点制御の精度を向上すること ができる。
[0142] なお、この構成 (b)では、光分岐光学系 120の前段に 100%反射ミラー 125を配置 している。このような反射ミラー 125を設けることにより、撮像装置 100へと入射される 光像の視野を絞って、撮像領域 101、 102間での光像の重畳等を防止することがで きる。ただし、このような反射ミラー 125については、不要であれば設けなくても良い。 また、この構成 (b)では、反射ミラー 122と第 2撮像領域 102との間に光路長調整部 材 126を設置して、光路長の補正を行っている。また、光分岐光学系としては、図 27 の構成 (c)に示す光分岐プリズム 130等を用いても良い。
[0143] また、上記した構成では、撮像領域 101、 102で取得された 2つの計測対象画像 X
' , X，に対して求められた総和 T , Tについて、それらの輝度差を補正するため、 T T X (
1を X
1 2 'の平均 Ζχ 1，の平均）に置き換えることが好ましい（図 11のフローチヤ一 ト参照)。
産業上の利用可能性
本発明による顕微鏡装置は、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行う ことが可能な顕微鏡装置として利用可能である。すなわち、本発明の顕微鏡装置に よれば、試料に対して 2つの撮像手段を設け、焦点制御用の第 2撮像手段として、 2 次元の画像を取得可能な撮像手段を用いるとともに、導光光路長が所定方向で変 化する撮像条件となるように撮像手段を配置し、得られた 2次元の画像を解析して焦 点制御を行うことにより、試料の画像取得と、撮像の焦点制御とを同時に行うことが可 能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 試料の光像を画像取得用の第 1光路及び焦点制御用の第 2光路へと分岐する光 分岐手段を含む導光光学系と、
前記第 1光路上に設置され、前記第 1光路へと分岐された前記光像による 1次元ま たは 2次元の第 1画像の取得に用いられる第 1撮像手段と、
前記第 2光路上に、その撮像面内において所定の変化方向に沿って前記導光光 学系での光路長が変化するように構成され、前記第 2光路へと分岐された前記光像 による焦点制御用の 2次元の第 2画像を取得する第 2撮像手段と、
前記第 2撮像手段によって取得された前記第 2画像を解析し、その解析結果に基 づいて前記第 1撮像手段による撮像の焦点を制御する焦点制御手段と、
前記第 1撮像手段による前記第 1画像の取得を制御する画像取得制御手段と を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
[2] 前記第 2撮像手段は、
前記変化方向に沿って前記光路長が変化するように撮像面が前記第 2光路に対し て所定角度で傾 ヽた状態で設置された撮像装置
を有することを特徴とする請求項 1記載の顕微鏡装置。
[3] 前記第 2撮像手段は、
撮像装置と、
前記撮像装置の撮像面に対して所定位置に、前記変化方向に沿って前記光路長 が変化するように設置された光路長変更手段と
を有することを特徴とする請求項 1記載の顕微鏡装置。
[4] 前記第 2撮像手段は、前記光路長変更手段として、前記撮像装置の撮像面の一の 撮像領域に対して所定位置に、前記変化方向に沿って光路長が変化するように設 置された一の光路長変更手段と、前記撮像装置の撮像面の他の撮像領域に対して 所定位置に、前記変化方向に沿うとともに前記一の光路長変更手段とは異なる変化 率で光路長が変化するように設置された他の光路長変更手段とを有することを特徴 とする請求項 3記載の顕微鏡装置。
[5] 前記第 2画像を取得するための前記光像を、前記一の光路長変更手段及び前記 撮像装置の撮像面の前記一の撮像領域への一の光路、及び前記他の光路長変更 手段及び前記撮像装置の撮像面の前記他の撮像領域への他の光路へと分岐する 光分岐光学系を備えることを特徴とする請求項 4記載の顕微鏡装置。
[6] 前記第 2撮像手段は、撮像面内において前記変化方向に沿って光路長が変化す るように配置された一の撮像装置と、撮像面内において前記変化方向に沿うとともに 前記一の撮像装置とは異なる変化率で光路長が変化するように配置された他の撮像 装置との 2つの撮像装置を有することを特徴とする請求項 1記載の顕微鏡装置。
[7] 前記第 1光路上に配置された第 1結像レンズ、及び前記第 2光路上に配置された 第 2結像レンズを備え、前記第 2結像レンズは、前記第 1結像レンズよりも結像倍率が 小さ!/ヽことを特徴とする請求項 1記載の顕微鏡装置。
[8] 前記焦点制御手段は、前記第 2画像における前記変化方向についての画像のコン トラスト変化を解析し、その解析結果に基づ ヽて撮像の焦点を制御することを特徴と する請求項 1記載の顕微鏡装置。
[9] 前記焦点制御手段は、前記第 2画像から前記変化方向に沿った所定幅の計測対 象画像を切り出し、前記計測対象画像、及び前記計測対象画像を前記変化方向と 垂直方向にシフトさせたシフト画像の差分絶対値画像によって前記画像のコントラス ト変化を解析することを特徴とする請求項 8記載の顕微鏡装置。
[10] 前記焦点制御手段は、前記第 2画像が撮像の焦点の制御に適用可能な画像であ るかどうかを判断し、適用可能と判断した場合に前記第 2画像を解析し、その解析結 果に基づいて撮像の焦点を制御することを特徴とする請求項 1記載の顕微鏡装置。
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