WO2005084794A1 - マイクロ流路チップの製造方法、マイクロ流路チップ、そのマイクロ流路チップを用いる生体分子の分離方法、およびそのマイクロ流路チップを有する電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

　本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法は、表面に溝状の流路が形成された基材の表面を、該流路全体が露出するマスクで遮蔽し、露出した基材表面に、高分子化合物膜を形成する工程、および前記基材の流路が形成されている側の表面に、カバー材を貼り合わせる工程を含むことを特徴としている。

Description

明 細 書

マイクロ流路チップの製造方法、マイクロ流路チップ、そのマイクロ流路チ ップを用いる生体分子の分離方法、およびそのマイクロ流路チップを有する電気 泳動装置

技術分野

[0001] 本発明は、マイクロ流路チップの製造方法に関する。また、本発明は、マイクロ流路 チップ、該マイクロ流路チップを用いる生体分子の分離方法および電気泳動装置に 関する。

背景技術

[0002] キヤピラリー電気泳動あるいはマイクロ流路チップ電気泳動は、微量の生体分子を 分離分析する方法として非常に優れており、分析の自動化、高速化が可能になるた め、これまで数多くの研究がなされている。（非特許文献 1)

[0003] キヤピラリー電気泳動あるいはマイクロ流路チップ電気泳動に使用される一般的な 材料は、ガラスが挙げられるが、蛋白質を分離するためには、解決すべき課題が数 多くある。

たとえば、ガラスにより作成されたキヤビラリ一電気泳動ある ヽはマイクロ流路チップ 電気泳動は、電気浸透流の影響があった。

[0004] このため、たとえばキヤビラリ一内部に発生する電気浸透流の抑制のために、キヤピ ラリーの内壁にポリマーをコーティングする試みがなされている（特許文献 1、 2、 3)。 コーティング方法としては、化合物を化学的に表面に結合させる方法や、物理的な 吸着による方法が試みられて 、る。

[0005] 化学的なコーティング方法としては、ガラスを用いたキヤビラリ一あるいはマイクロ流 路チップを用いる場合に、シランカップリング剤を被覆する方法が知られている。この 方法は、共有結合によりシランカップリング剤を結合させるため、非常に強くマイクロ 流路内をコーティングすることができる力 均一にコーティングすることが困難であり、 高い再現性が求められるキヤビラリ一あるいはマイクロ流路チップを作製することがで きない。また、化学反応によるため、複雑なコーティング方法となり、製品化する上で 有効な方法とは!ヽえなかった。

[0006] また、物理的なコーティング方法として、流路内にコーティング剤を流して、被覆す る方法が知られている。たとえば、コーティング剤を混合した泳動緩衝液を流して被 覆する方法がある。この方法は非常に簡便な方法であるが、静電相互作用、あるい は疎水性相互作用による吸着であるため、吸着状態が非常に弱ぐ簡単にコーティ ングが剥がれるという問題があった。また、静電的相互作用による場合、 pHの影響を 受けやす ヽため、適用範囲が狭!ヽと!ヽぅ問題もあった。

[0007] このため、基材表面に均一で安定なコーティングを行う方法が求められていた。たと えば、ガラスの基材表面にマイクロ流路が存在するチップの基材表面全体を、プラズ マ重合膜でコーティングする試みがなされて 、る（非特許文献 2)。

[0008] しかし、ガラスの基材およびカバー上にプラズマ重合膜をコーティングする場合、基 材とカバーとの貼り合わせを熱圧着で行おうとすると、極めて高温 (たとえば、 500— 600°C)の温度が必要となり、プラズマ重合膜が劣化する場合がある。このため、基 材とカバー材とを接着剤で結合させる方法が採られている (非特許文献 2)が、接着 剤を使用すると、接着剤の使用量あるいは塗布する場所によっては、マイクロ流路内 に接着剤が滲出する場合があり、使用量や塗布箇所等を制御するなど製造プロセス が煩雑となる場合があった。

非特許文献 1 :ジャーナル ォブ クロマトグラフィー（F. E. P. Mikkers, F. M.

Everaerts, Th. P. E. M. Veerheggen, J. Chromatogr.) , 169, 11, 1979

非特許文献 2 : Analyst, 2003, 128, 237-244

特許文献 1：特表平 5— 503989号公報

特許文献 2：特表平 7-506432号公報

特許文献 3：特表平 9- 504375号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] マイクロ流路チップは、通常、表面に流路を有する基材とカバー材とを貼り合わせ て得られるが、本件発明者らは、基材表面全体を、プラズマ重合膜、表面重合膜など の高分子化合物膜でコーティングすると、貼り合わせにおける接着強度が弱いあるい は低下し易ぐ基材にカバー材を貼り合わせても、流路を流れる媒体が、流路から基 材とカバーとの隙間に滲出する可能性があることを見出している (本件出願時非公知

) o

すなわち、本件発明は、高分子化合物膜で該基材表面をコーティングした場合に おいて、基材とカバー材との貼り合わせの際の接着強度を向上させることが可能な、 簡便なマイクロ流路チップの製造方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0010] 本件発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、以下の工程を経ることにより

、基材とカバー材との貼り合わせの際の接着強度を向上させることが可能で、しかも、 簡便なマイクロ流路チップの製造方法を提供できることを見出し、本件発明を完成す るに至った。すなわち、本件発明は以下を含む。

[0011] 〔1〕 表面に溝状の流路が形成された基材の表面を、該流路が露出するマスクで 遮蔽し、露出した基材表面に、高分子化合物膜を形成する工程、および

前記基材の流路が形成されている側の表面に、カバー材を貼り合わせる工程 を含む、マイクロ流路チップの製造方法。

〔2〕 前記基材を貼り合わせる側のカバー材表面に、高分子化合物膜を形成するェ 程を含む、〔1〕に記載の方法。

〔3〕 前記基材を貼り合わせる側のカバー材表面に、高分子化合物膜を形成するに 際し、

前記カバー材の表面を、前記基材のマスクの露出部分の一部又は全部と露出部分 が同一形状のマスクで遮蔽し、露出したカバー材表面に、高分子化合物膜を形成す る、〔2〕に記載のマイクロ流路チップの製造方法。

〔4〕 前記基材表面の高分子化合物膜が、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合膜

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

である、〔1〕一〔3〕のいずれかに記載の方法。 [5] 前記基材表面の高分子化合物膜が、プラズマ重合膜である、〔1〕一〔4〕のいず れかに記載の方法。

〔6〕 前記カバー材表面の高分子化合物膜が、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合膜

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

である、〔2〕一〔5〕のいずれかに記載の方法。

〔7〕 前記カバー材表面の高分子化合物膜が、プラズマ重合膜である、〔2〕一〔6〕の いずれかに記載の方法。

〔8〕 前記基材の表面に形成する高分子化合物膜と、前記カバー材の表面に形成 する高分子化合物膜とが、同一の高分子化合物膜である、〔2〕一〔7〕のいずれかに 記載の方法。

〔9〕 前記貼り合わせを、圧着または熱圧着により行う、〔1〕一〔8〕のいずれかに記載 の方法。

〔10〕 前記基材および前記カバー材の少なくとも一方が、プラスチックである〔1〕一〔 9〕の 、ずれかに記載の方法。

〔11〕 前記基材およびカバー材カ プラスチックである、〔1〕一〔10〕のいずれかに 記載の方法。

〔12〕 前記基材およびカバー材のいずれもが、熱可塑性榭脂であり、

前記貼り合わせる工程が、基材とカバー材とを、熱圧着により貼り付ける方法である、

〔11〕に記載の方法。

〔13〕 前記熱圧着を 200°C以下の温度で行う、〔12〕に記載の方法。

〔14〕 前記基材およびカバー材のいずれか一方がケィ素榭脂であり、残りの一方が ガラスまたはプラスチックであり、

前記貼り合わせる工程が、基材とカバー材とを、圧着により貼り付ける方法である、〔1 0〕に記載の方法。

[15] 前記マスク力 フォトレジストマスクまたは金属マスクである、〔1〕一〔14〕のい ずれかに記載の方法。

〔16〕 表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わさ れてなり、前記基材表面のうち、流路の一部又は全部の表面に高分子化合物膜が 被覆されている、マイクロ流路チップ。

〔17〕 前記カバー材の基材側の表面に、高分子化合物膜が被覆されている、〔16〕 に記載のマイクロ流路チップ。

〔18〕 前記カバー材の基材側の表面の、基材の高分子化合物膜が形成されている 領域と対向する領域に、前記基材の高分子化合物膜が形成されて!ヽる部分の一部 又は全部と同一形状の高分子化合物膜が被覆されている、〔17〕に記載のマイクロ 流路チップ。

〔19〕 次の工程を含む生体分子の分離方法：

a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされて なり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイク ロ流路チップに、分析すべき生体分子を加える工程、および

b)分離媒体に分離圧を加える工程。

〔20〕 前記分離圧が電気泳動によるものである、〔19〕に記載の方法。

〔21〕 前記電気泳動が、キヤピラリー電気泳動である、〔20〕に記載の方法。

[22] 前記生体分子が、蛋白質である、〔19〕一〔21〕のいずれかに記載の方法。 〔23〕 次の要素で構成される電気泳動分析装置：

a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされて なり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイク ロ流路チップ、

b)該マイクロ流路チップを保持するための支持体、および

c)支持体に保持されたマイクロ流路チップに電圧を印加するための電極。

図面の簡単な説明

[図 1]プラズマ重合膜が、 200 μ mの幅で成膜されたことを示す電子顕微鏡写真であ る。電子顕微鏡の加速電圧 5. 00kV、写真倍率 100倍である。

[図 2]電子プローブマイクロアナライザによる成膜部の元素マッピング分析組成を示 す写真である。

[図 3]チップへの試料導入時、分離時における電圧の加え方を示す模式図である。

[図 4]プラズマ重合膜を有するチップと、成膜なしのチップとで、 Cy5染色したカルボ ニックアンヒドラーゼを電気泳動した結果を示す図である。図 4中、 Aはプラズマ重合 膜 (HMDS)を有するチップの場合を示し、 Bは成膜なしのチップの場合を示す。 発明を実施するための最良の形態

[0013] <マイクロ流路チップの製诰方法 >

本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法は、表面に溝状の流路が形成された 基材の表面を、該流路が露出するマスクで遮蔽し、露出した基材表面に、高分子化 合物膜を形成する工程、および前記基材の流路が形成されている側の表面に、カバ ー材を貼り合わせる工程を含むことを特徴としている。

[0014] この場合、流路を露出させるマスクは、流路の全部、または流路の全部および流路 の近傍が露出するマスクであることが好ましぐ流路近傍の露出部分は小さいほど好 ましい。

マスクの種類は限定されず、たとえば、フォトレジストマスク、金属マスクなどを用い ることがでさる。

[0015] このようにして得られるマイクロ流路チップでは、基材の表面は、流路が高分子化合 物膜で被覆され、他の部分は高分子化合物膜で被覆されていないので、カバー材と の貼り合わせの際の接着強度に優れている。

[0016] この場合、前記基材と貼り合わせる側のカバー材表面に、高分子化合物膜を形成 する工程が含まれていてもよい。すなわち、基材とカバー材の表面は、ともに、高分 子化合物膜が形成されていてもよい。カバー材の表面にも高分子化合物膜が形成さ れていれば、マイクロ流路チップを用いて分離すべき試料の分解能をより高めること ができる。

[0017] また、カバー材の表面に、高分子化合物膜を形成する場合、前記カバー材の表面 を、前記基材のマスクの露出部分の一部又は全部と露出部分が同一形状のマスクで 遮蔽し、露出したカバー材表面に、高分子化合物膜を形成することが好ましい。

[0018] この場合において、カバー材の露出部分は小さいほど好ましいが、前記基材のマ スクの露出部分の全部と露出部分が同一形状であることがより好ましい。

[0019] また、基材表面に設けた流路内、あるいはカバー材表面には、分離能を向上させる ため、高分子化合物膜を各種のパターン、グラジュェントで形成させることができる。 この場合は、たとえば、カバー材側に、基材のマスク形状とは異なる形状の高分子化 合物膜を形成させてもよい。

[0020] このようにして得られるマイクロ流路チップでは、基材およびカバー材のいずれの表 面も、高分子化合物膜で被覆されていない領域が存在するため、基材とカバー材と の貼り合わせの際の接着強度により優れている。

[0021] 貼り合わせは、基材とカバー材の表面に被覆された高分子化合物膜同士が、相対 する形状でちょうど重なるように行うことが好ま 、。

[0022] 前記基材表面に形成させる前記高分子化合物膜は、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合膜

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

の！、ずれかであることが好まし！/、。

これらのうちでは、プラズマ重合膜が好ましい。プラズマ重合膜であると、より均一で 、安定性に優れた膜を形成できる。

[0023] また、前記カバー材表面に形成させる高分子化合物膜は、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合膜

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

の！、ずれかであることが好まし！/、。

これらのうちでは、プラズマ重合膜が好ましい。プラズマ重合膜であると、より均一で 、安定性に優れた膜を形成できる。

[0024] 某材およびカバー材

カバー材表面にも高分子化合物膜を形成させる場合、基材とカバー材とに設けら れる高分子化合物膜の種類の組み合わせは特に限定されず、同一の高分子化合物 膜を用いても、異なる高分子化合物膜を用いてもよい。このうち、前記基材の表面に 形成する高分子化合物膜と、前記カバー材の表面に形成する高分子化合物膜とは 、同一の高分子化合物膜であることが好ましい。同一の高分子化合物膜の場合、とも にプラズマ重合膜であることが好ましぐプラズマ重合膜のうちでも、同一のモノマー 原料力もなるプラズマ重合膜であることがより好ましい。

[0025] 前記基材を構成する素材は任意である。本発明においては、少なくとも、基材表面 に形成された流路表面がプラズマ重合膜、表面重合膜または高分子結合膜によって 改質されている。そのため、基材そのものの素材は電気泳動等の分離の結果には直 接的な影響を与えない。したがって、たとえば次に示すような最低限の条件を満たす 任意の素材を選択することができる。

一電気泳動等の泳動に伴う発熱に耐えなければならないこと、

一一定の物理的な強度を有すること

一絶縁体であること

[0026] また基材には、一般に透明な素材が利用される。透明な素材を利用することによつ て、外部力もの光学的な観測が可能となる。具体的には、たとえば、ガラスやプラスチ ックなどを基材として利用することができる。

[0027] プラスチックとしては、たとえば、熱可塑性榭脂、ケィ素榭脂などが挙げられる。

[0028] 熱可塑性榭脂としては、たとえば、ポリメタクリル酸メチル (PMMA)などのポリ (メタ) アクリル酸エステル；ポリカーボネート（PC)；ポリエチレンテレフタレート（PET)；ポリ エチレン、ポリプロピレンなどのポリビュル系化合物；ポリスチレンなどが挙げられる。

[0029] 熱可塑性榭脂は、種類にもよるが、熱変形温度が好ましくは 200°C以下、さらに好 ましくは 150°C以下、特に好ましくは 120°C以下である。このような温度範囲であると

、高分子化合物膜の性能劣化を防ぐことができる。

[0030] ケィ素榭脂としては、ポリジメチルシロキサン (PDMS)などのシリコーンゴムが挙げ られる。このようなケィ素榭脂を用いると、基材あるいはカバー材表面が粘着性を有し

、圧着による接着が可能となる。

[0031] 基材の形状は、板状の平面基板が好ましい。基材の厚さは限定されないが、たとえ ば、好ましくは 1一 20mm程度の範囲である。

[0032] 前記カバー材としては、前記基材と同様の材質のものを用いることができる。

カバー材は、基材をカバーするものであるため、その形状、大きさは基材と同一で あることが好ましい。

カバー材の厚さは限定されないが、たとえば、好ましくは 1一 20mm程度の範囲で ある。

[0033] 基材とカバー材の材質の組み合わせは特に限定されず、同一の材質を用いても、 異なる材質を用いてもよい。

このうち、前記基材および前記カバー材の少なくとも一方力 プラスチックであること が好ましい。

[0034] また、前記基材およびカバー材は、ともに、プラスチックであることが好ましぐこの 場合、ともに熱可塑性榭脂であることがより好ましい。

[0035] また、前記基材およびカバー材の一方がケィ素榭脂の場合、残りの一方はガラスま たはプラスチックであってもよぐ残りの一方はプラスチックであることがより好ましい。

[0036] たとえば、前記基材およびカバー材の 、ずれもが、熱可塑性榭脂である場合、前 記貼り合わせる方法としては、基材とカバー材とを、熱圧着する方法が採用できる。 熱圧着の際の温度は、用いるプラスチックの種類にもよるが、好ましくは 200°C以下、 さらに好ましくは 150°C以下、特に好ましくは 120°C以下である。

[0037] またたとえば、前記基材およびカバー材の 、ずれか一方がケィ素榭脂であり、残り の一方が任意のプラスチックまたはガラスである場合、貼り合わせる方法としては、基 材とカバー材とを圧着する方法が採用できる。

[0038] このような基材とカバー材の材質における好ましい組み合わせ (基材:カバー材、ま たはカバー材:基材）としては、たとえば、下記のものが挙げられる。

PMMA:PMMAゝ PDMS:PDMSゝ PDMS:PMMA、 PDMS:ガラス、 PET:PE T、 PMMA:PET、 PDMS: PET, PC: PC, PDMS: PC, PMMA:PC、 PS:PS、 PDMS: PS, PMMA:PS

[0039] これらのうちでは、 PMMA:PMMA、 PDMS: PDMS, PDMS:PMMA、 PMM A: PET, PDMS: PET, PDMS: PC, PMMA:PC、 PDMS: PS, PMMA:PSな どの組み合わせを好ましく用いることができる。

[0040] これらのうちでは、 PDMSと他のプラスチックの組み合わせ、 PMMAと PMMAの 組み合わせが特に好まし!/、。

[0041] 上記のような組み合わせであると、低温で、し力も、接着剤を使用しなくても、接着 強度に優れた接着が可能となる。具体的には、このような材料を適宜組み合わせるこ とにより、基材とカバー材との貼り合わせを、上述のように圧着または熱圧着で行うこ とがでさる。

[0042] さらに、本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法では、マスクにより基材表面等 への高分子化合物膜の形成領域を最小限にしているため、このようなプラスチックの 接着効果を最大限に発揮することができる。

[0043]

前記流路は、基材の表面に形成される溝である。たとえば溝の幅は、 1一 100 /z m といった微細な空間とすることができる。溝の断面は、三角形や四角形のような多角 形、あるいは U字型や半円状とすることができる。このような微細な構造の溝をガラス

、プラスチック等の基材に設けるには、次のような方法を利用することができる。

•半導体加工技術のウエットエッチング法 (フッ酸を使う方法）

•半導体加工技術のドライエッチング法 (イオンスパッタリング、リアクティブイオンェ ツチング（ICPエッチングなど） )

'レーザーせん孔

•ダイシングソー

[0044] ウエットエッチング、ドライエッチング、あるいはレーザーせん孔の方法を利用すれ ば、 自由な形状を有する微細な構造を容易に設けることができる。たとえば、 10— 10 0 /z mの幅、ならびに深さを有する溝を、ガラス表面に設ける技術が公知である。 たとえば本発明者らは、リアクティブイオンエッチング (reactive ion etching)を利用 した微小流路の作製に成功して 、る。基材の素材に応じた異なる種類のエッチング ガスを利用して、選択性の良い、またエッチレートの大きいエッチングが可能となって いる。

[0045] 基材表面に形成された溝は、カバー材を重ねることにより閉鎖系とすることができる [0046] また、カバー材表面にも、溝を設けることができる。この場合、基材に設けられた溝 と重なるように設けることが好まし 、。

[0047] さらに、カバー材に、基材またはカバー材に設けられた溝と重なる位置に穴を設け ることによって、溝に試料や分離媒体を供給するための連絡流路を形成することがで きる。あるいは、カバー材に設けられた穴は、試料や緩衝液を保持するリザーバーと して利用することもできる。

[0048] ^iv^

本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法は、表面に溝状の流路が形成された 基材の表面を、該流路全体が露出するマスクで遮蔽し、露出した基材表面に、高分 子化合物膜を形成する工程を含む。また、前記基材と貼り合わせる側のカバー材表 面に、高分子化合物膜を形成する工程を含んでもよい。前記のとおり高分子化合物 膜としては、プラズマ重合膜、表面重合膜または高分子結合膜などが挙げられる。

[0049] プラズマ重合によれば、微細な溝表面に対しても、プラズマ重合膜を形成すること が可能である。し力もプラズマ重合によれば、得られる膜は極めて均質なものとなる。 このため、基材表面のピンホールの発生を抑制し、信頼性の高い分離分析用基材を 作成することができる。

表面重合によれば、膜の剥離が抑制された所望の表面重合膜を、基材表面の所 望の位置に、形成させることができる。

さらに、基材表面に高分子化合物を結合させる高分子結合膜によれば、基材表面 に、膜厚の制御をしながら、所望の高分子化合物膜を、所望の位置に形成させること ができる。

[0050] これらのプラズマ重合膜、表面重合膜または高分子結合膜で被覆された基材、ある いはカバー材は、公知の方法によって得ることができる。以下、それぞれの膜につい て説明する。

[0051] (プラズマ重合膜)

具体的には、プラズマ重合は、真空中でモノマー物質をプラズマ励起によって直接 支持体表面に成膜を行う技術である。モノマー物質の成分を換えることによって、さま ざまな特徴を持つプラズマ重合膜を得ることができる。プラズマ重合では原理的には どのようなモノマーを用いても、重合が可能である。通常のポリマーを得るためには二 重結合の開裂が必要となるのに対して、プラズマ中ではモノマー物質がばらばらにな り多くの活性種を介した重合反応が起きるためである。

[0052] 本発明におけるプラズマ重合膜のためのモノマー物質は、基材あるいはカバー材 表面に電気泳動分離等の分離に応じた好適な性状を与える重合膜を形成できるも のであればよい。たとえば電気泳動分離に応じた好適な性状としては、以下に示すよ うな性状を示すことができる。これらの性状のうち、いずれかの任意の性状を与えるこ とができるモノマー物質は、本発明に利用することができる。

被分離物質の基材への吸着の抑制

-被分離物質に対する親和性

[0053] 基材あるいはカバー材がプラスチックの場合、上記表面重合膜または高分子結合 膜を形成することは困難な場合があるが、プラズマ重合によれば、プラスチック表面 であっても、微細な溝表面に対しても、プラズマ重合膜を形成することが可能である。 し力も得られる膜は極めて均質であり、プラスチックへのコーティングに特に優れる。

[0054] プラズマ重合膜が被覆された基材とカバー材との貼り合わせは、他の高分子化合 物膜が被覆された場合と比較して貼り合わせ強度の向上が必要な場合があつたが、 本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法では、マスクにより基材表面等への高 分子化合物膜の形成領域を最小限にしているので、前記プラスチックを用いる接着 効果を最大限に発揮することができる。

[0055] したがって、本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法においては、好ましくはプ ラズマ重合膜でコーティングされた流路を用い、前記プラスチックの組み合わせを採 用することが望ましぐこれにより、極めて均一にコーティングされた流路を有し、しか も基板とカバー材との接着強度にも優れるマイクロ流路チップを、簡便かつ歩留まり よく製造することができる。

[0056] なお、キヤピラリー電気泳動に利用されるガラスは、表面に蛋白質を吸着しやすい。

蛋白質の基材への吸着はプラズマ重合膜によって制御することができる。たとえば、 基材の疎水性度や表面電荷によって制御可能である。 [0057] 前記条件を満足するプラズマ重合膜を与えるモノマー物質としては、以下のような ものを示すことができる（「プラズマ重合」長田義人'編、角田光雄、中島薫、宫村雅 隆、森田慎三、他著、東京化学同人 1986年発行)。

[0058] アルカン、またはシクロアルカンとして、次の化合物を示すことができる。

メタン、ェタン、プロノ ン、ブタン、イソブタン、ペンタン、イソペンタン、ネ才ペンタン 、へキサン、イソへキサン、 3—メチルペンタン、 2,2—ジメチルブタン、 2,3 ジメチルブタ ン、ヘプタン、 2,2,3—トリメチルブタン、オクタン、ノナン、デカン、メタン dl、メタン d2 、メタン d3、メタン d4、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロへキサ ン、メチルシクロへキサン、シクロオクタン、 cis—デカリン、および trans—デカリン。

[0059] アルケン、アルキン、ある!/ヽはシクロアルケンとしては、次の化合物を示すことができ る。

エチレン、プロピレン、 1ーブテン、（Z)— 2—ブテン、（E)— 2—ブテン、 2—メチルプロべ ン、 1 ペンテン、 2—メチルー 1ーブテン、 3—メチルー 1ーブテン、 2—メチルー 2—ブテン、 1 一へキセン、（E)— 2—へキセン、（E)— 3—へキセン、 3—メチルー 1 ペンテン、 2,3—ジメ チルー 2—ブテン、 1—ヘプテン、 1 オタテン、（E)— 2 オタテン、 1—デセン、 1,3 ブタジ ェン、（Z)— 1,3—ペンタジェン、（E)— 1,3—ペンタジェン、イソプレン、 2, 3 ジメチルー 1,3 ブタジエン、へキサジェン、アセチレン、プロピン、 1ーブチン、 2—ブチン、 1 ペン チン、 3 メチル—1ーブチン、ビュルアセチレン、シクロプロペン、シクロブテン、シクロ ペンテン、シクロへキセン、シクロヘプテン、シクロペンタジェン、 1,3—シクロへプタジ ェン、およびシクロォクタテトラエン。

[0060] アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、あるいはエステルとしては次の化合物 を示すことができる。

メタノール、エタノール、 1-プロパノール、 2-プロパノール、 1ーブタノール、 2—ブタノ ール、 2—メチルー 1 プロパノール、 2—メチルー 2 プロパノール、ァリルアルコール、 1,3 ブタンジオール、 2,3 ブタンジオール、 2, 3 エポキシ 1 プロパノール、ホル ムアルデヒド、ァセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、バレルアル デヒド、イソバレルアルデヒド、アクリルアルデヒド、クロトンアルデヒド、グリオキサール 、アセトン、 2—ブタノン、 2 ペンタノン、 3—メチルー 2—ブタノン、 3 ペンタノン、 2—へキ サノン、 4ーメチルー 2 ペンタノン、 2—へプタノン、シクロブタノン、シクロペンタノン、シ クロへキサノン、シクロへプタノン、シクロォクタノン、 4ーメチルー 3 ペンテン 2 オン、 2,3 ブタンジオン、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、アクリル酸、ギ酸メチ ル、ギ酸ェチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、酢酸メチル、酢酸ェチ ル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸 s—ブチル、 プロピオン酸メチル、酪酸メチル、酢酸ビニル、および酢酸ァリル。

[0061] エーテル、ァミン、あるいはその他のモノマー物質として利用可能な化合物を以下 に示す。

ジメチルエーテル、ジェチノレエーテノレ、ジプロピルエーテル、ジイソプロピノレエーテ ル、ジブチルエーテル、エチレンォキシド、 1,3—ジォキソラン、 1,3—ジォキサン、 1,4 ジォキサン、メチルビニルエーテル、メチルァミン、ェチルァミン、プロピルァミン、イソ プロピルァミン、ブチルァミン、イソブチルァミン、 s—ブチルァミン、 tーブチルァミン、 ペンチルァミン、へキシルァミン、ジメチルァミン、トリメチルァミン、ジェチルァミン、ト リエチノレアミン、ジプロピルァミン、ジイソプロピルァミン、トリプロピノレアミン、ジブチノレ ァミン、ァリルァミン、ホルムアミド、ァセトアミド、 N メチルァセトアミド、 N, N—ジメチ ルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、メタンチオール、エタンチオール、硫化 ジメチル、硫化ジェチル、硫化ジプロピル、二硫化ジメチル、二硫化ジェチル、メタン ジチオール、 1,2 エタンジチオール、ニトロメタン、ニトロェタン、 1一二トロプロパン、 2 一二トロプロパン、 1一二トロブタン、 2—二トロブタン、ァセトニトリノレ、プロピオ二トリノレ、了 タリロニトリル、アミノアセトアルデヒドジメチルァセタール、へキサメチルジシロキサン などが挙げられる。

[0062] また、次のようなハロゲンィ匕物をモノマー物質に利用することができる。

フルォロメタン、ジフルォロメタン、フルォロホルム、テトラフルォロメタン（四フッ化炭 素）、フッ化ビュル、 1,1ージフルォロエチレン、（Z)— 1,2—ジフルォロエチレン、（E)— 1,2—ジフルォロエチレン、トリフルォロエチレン、テトラフルォロエチレン、 1,1, 4,4ーテト ラフルォロブタジエン、ペルフルォロブタジエン、 2—フルォロエタノール、トリフルォロ 酢酸、 1,1,1—トリフルオロー 2—プロパノン、ペルフルォロアセトン、クロロメタン、ジクロロ メタン、クロ口ホルム、テトラクロロメタン（四塩化炭素）、クロロェタン、 1,1ージクロ口エタ ン、 1 ,2—ジクロ口エタン、 1 クロ口プロノ ン、 2 クロ口プロノ ン、 1 ,2—ジクロ口プロノ ン、 1 ,3—ジクロ口プロパン、 1 クロロブタン、 2 クロロブタン、 1 クロ口一 2 メチルプロパン 、 2—ク口口 2—メチノレプロノ ン、ク シクロプロノ ン、 1 , 1ージク口口シクロプロノ ン、塩 化ビュル、 1 , 1ージクロ口エチレン、 （Z)— 1 ,2—ジクロ口エチレン、 （E)— 1 ,2—ジクロロェ チレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、 3 クロ口プロペン、 1 ,3—ジクロ口プロ ペン、クロ口アセチレン、ジクロロアセチレン、 1 クロ口プロピン、 2—クロ口エタノーノレ、 クロロアセトアルデヒド、クロロアセトニトリル、ジクロロアセトニトリル、トリクロロアセトニト リル、ブロモメタン、ジブロモメタン、ブロモホルム、テトラブロモメタン（四臭化炭素）、 ブロモエタン、 1 , 1 ジブロモェタン、 1 ,2 ジブロモェタン、 1 ブロモプロパン、 2—ブロ モプロノ ン、 1 ,3 ジブロモプロパン、 1 ブロモブタン、 2 ブロモブタン、 1ーブロモー 2— メチルプロパン、 2—ブロモー 2 メチルプロパン、 1 ,4 ジブロモブタン、 1 ブロモビシク 口 [2.2.1]ヘプタン、 1ーブロモビシクロ [2.2.2]オクタン、臭化ビュル、 3 ブロモプロべ ン、 1 ,3 ジブロモプロペン、ブロモアセチレン、ジブロモアセチレン、 1 ブロモプロピ ン、 2—ブロモエタノール、ョードメタン、ジョードメタン、ョードホルム、テトラョードメタン (四ヨウ化炭素）、ョードエタン、 1 ョードプロパン、 2 ョードプロパン、 1 ョードブタン 、 2 ョードブタン、 1ーョードー 2 メチルプロパン、 2—ョードー 2 メチルプロパン、 1ーョー ドペンタン、 3 ョードプロペン、ョードアセチレン、ジョードアセチレン、 2—ョードエタノ ール、 1ーブロモー 2 クロロェタン、 1 , 1 , 1—トリフルォロ— 2—ョードエタン、 2—クロ口— 1 , 1 —ジフルォロエチレン、 1 クロ口一 1 ,2,2—トリフルォロエチレン、 1 , 1—ジクロロー 2,2—ジフ ルォロエチレン、 1ーブロモー 2—クロ口アセチレン、 1 クロ口— 2 ョードアセチレン、およ び 1ーブロモー 2 ョードアセチレン。

更に、以下のような芳香族炭化水素がモノマー物質として利用できる。

ベンゼン、トルエン、ェチルベンゼン、プロピルベンゼン、タメン、ブチルベンゼン、 s —ブチルベンゼン、 t ブチルベンゼン、 0—キシレン、 m—キシレン、 p—キシレン、 0—ジ ェチルベンゼン、 m—ジェチルベンゼン、 p—ジェチルベンゼン、メシチレン、 1 ,2,4,5- テトラメチルベンゼン、スチレン、フエニルアセチレン、 （E)— 1 プロぺニルベンゼン、 (E)— 1 フエ-ルブタジエン、 2—フエ-ルブタジエン、ビフエ-ル、ナフタレン、 1ーメチ ルナフタレン、 2—メチルナフタレン、アントラセン、フエナントレン、ピレン、ナフタセン、 タリセン、およびペンタセン。

[0064] カロえて、次のベンゼン誘導体等も本発明のモノマー物質に有用である。

フエノール、ベンズアンデヒド、ァセトフエノン、ァ-ソール、ベンジルメチルエーテル 、ァニリン、ペンジルァミン、チォフエノール、ベンゾニトリル、フルォロベンゼン、クロ口 ベンゼン、ブロモベンゼン、ョードベンゼン、 0—ジクロ口ベンゼン、 m—ジクロ口べンゼ ン、 p—ジクロ口ベンゼン、 0—ジブロモベンゼン、 m ジブロモベンゼン、 p—ジブロモべ ンゼン、トリフルォロベンゼン、へキサフルォロベンゼン、 0—フルォロトルエン、 m—フ ノレ才ロトノレェン、 p—フノレ才ロトノレェン、 0—クロロトノレェン、 p—クロロトノレェン、 0—ブロモ トノレェン、 p—ブロモトノレェン、 0—ョードトノレェン、 m—ョードトノレェン、 p—ョードトノレェン、 p—クロロフノレォロベンゼン、および 0—クロロヨードベンゼン。

[0065] また、次のような複素環式ィ匕合物がモノマー物質として利用できる。

ピリジン、 2 メチルピリジン、 3 メチルピリジン、 4 メチルピリジン、 2,6—ジメチルピリ ジン、 2,5—ジメチルビリジン、 2,4 ジメチルビリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、 1,3,5 トリアジン、ピリジン N—ォキシド、 2 メチルピリジン N—ォキシド、 3 メチルピリジ ン N—ォキシド、 4 メチルピリジン N—ォキシド、 2,6 ジメチルビリジン N—ォキシド、フ ラン、メチルフラン、テトラヒドロフラン、ピロール、ピロリジン、チォフェン、および 2—ク ロロチォフェン。

[0066] その他、トロポンゃトロボロンのようなトロポノイド化合物、またテトラメチルシラン、テ トラメチルスズ、テトラメチル鉛に代表される有機金属化合物をモノマー物質に用いる ことちでさる。

[0067] これらのうち pHが中性付近の条件において基材表面が中性付近の電荷を持つ場 合には、ァセトニトリル、へキサジェンを好ましく用いることができる。

pHが中性付近の条件において基材表面が負の電荷を持つ場合には、へキサメチ ルジシロキサンを好ましく用いることができる。

pHが中性付近の条件において基材表面が正の電荷を持つ場合には、へキシルァ ミンやアミノアセトアルデヒドジメチルァセタールを好ましく用いることができる。

[0068] これらのモノマー物質によってプラズマ重合膜を成膜する条件は公知である。具体 的には、プラズマ重合反応の再現性に影響を与える主な要因として、たとえば流速、 放電電力、放電時間、そして圧力といった条件が重要であるとされている。プラズマ 重合においては、装置やモノマーに合わせて最適な重合条件を設定する必要があ る。 W/FM (ここで Wは放電電力、 Fは流速、 Mはモノマーの分子量）が同じであれば、 膜質はほぼ同じであるとする報告 (Yasuda, Plasma Polymerization, Academic Press, New York, 1985)がある。

[0069] 利用するモノマー物質や、最終的に必要なプラズマ重合膜の膜厚等を考慮して、 これらの条件を適切に調整することは当業者が日常的に行っていることである。また 文献的にも各種のパラメーターがプラズマ重合膜の性質に及ぼす影響は明らかにさ れて 、る (surface and Coatings Tecnnology 82:1— 15,199b, Polymer Engineering ana Science 37/7:1188-1194,1997)。後にポリヌクレオチドの固定化を目的とする場合に 有利なモノマー物質として説明するへキサメチルジシロキサンでプラズマ重合膜を作 成するには、たとえば次のような範囲のもとで最適な条件を選択することにより、およ そ 0を超えて 240A以下のプラズマ重合膜を形成することができる。

[0070] 流速： 0— 50cm³/min.

放電電力： 0— 300W

圧力： 10"⁶— lO Torr

放電時間 0— 5分

(温度： 0— 100°C)

[0071] あるいは、 0を超えて 240 A以下のプラズマ重合膜を形成するための、より望ましい 条件として、次の条件を示すことができる。

0一 50cm /min.

放電電力： 20— 100W

圧力： 0. 05—0. 6Torr

放電時間 30秒一 5分

(温度:室温）

[0072] このようなプラズマ重合によれば、モノマー物質の選択によって、種々の官能基を 基材表面に付与することができるので、種々の性状を有する膜を容易に形成すること ができる。たとえば、種々の範囲の表面電荷、疎水性 Z親水性を有する基材表面を 得ることができる。

[0073] たとえば、 pHにより異なる力 物質の荷電状態を示すゼータ電位を好ましくは 10 0一" h lOOmVの範囲にコントロールすることができる。

またたとえば、表面の接触角を、好ましくは 1度一 140度の範囲にコントロールする ことができる。

このようなプラズマ重合膜の膜厚は、たとえば、好ましくは 1一 200nmの範囲にある ことが望ましい。

また、このようにして得られるプラズマ重合膜は、極めて均質な膜であり、ピンホール の発生が著しく抑制されて！ヽる。

またプラズマ重合によれば、プラズマ重合膜を任意の形状の基材表面に形成させ ることがでさる。

[0074] 導入された官能基を利用して、蛋白質と多様な相互作用をさせながら各種方法に よる分離が可能となる。例えば、ァセトニトリルのような窒素原子を持つ有機物質をモ ノマー物質とすると、表面にアミノ基を持つプラズマ重合膜が合成できることが公知で ある。このようなプラズマ重合膜コート表面を利用して、静電的な相互作用（膜のブラ ス電荷と蛋白質のマイナス電荷)を行わせながら蛋白質の電気泳動等を行うことが可 能である。

[0075] また酢酸などカルボン酸やエステルなどの有機物質をモノマー物質とすると、表面 にカルボキシル基を持つプラズマ重合膜が合成される。その結果、膜のマイナス電 荷と蛋白質のプラス電荷の間での相互作用による電気泳動分離等が可能になる。

[0076] さらにアルカンゃシクロアルカン、芳香族炭化水素などをモノマー物質とすると、表 面が極めて疎水的なプラズマ重合膜が合成されるので、疎水的相互作用に基づく分 離が可能である。すなわち上記 3つの例では、それぞれ陰イオン交換クロマトグラフィ 一、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーと類似の作用を有する表 面を実現できる。

[0077] 本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法において、表面に溝状の流路が形成 された基材の表面を、該流路全体が露出するマスクで遮蔽し、露出した基材表面に 、高分子化合物膜を形成する工程を含むが、フォトマスクのパターンを光で一括転写 すること (フォトフアプリケーション:榷岡清威、二瓶公志、フォトエッチングと微細加工

、総合出版社、 1989)により、マイクロ流路チップを大量生産することができる。

フォトフアプリケーションを利用すれば、超 LSIに代表されるように数百万個からなる 部品が組み立てられたデバイスを、数 mm角のシリコン基板上に、一体構造として作 製可能である。更にフォトフアプリケーションにおいては、複数のフォトマスクのパター ンを組み合せて利用することができる。この特徴を利用すれば、付着加工、表面改質 加工といった異なる処理工程を組み合せることが可能である。

[0078] フォトフアプリケーションに応用される表面改質ゃ薄膜形成のための技術は、ドライ プロセスである。前記プラズマ重合法はドライプロセスなので、フォトフアブリケーショ ンによるデバイス作成に好適である。更にプラズマ重合法を利用すれば、適切なモノ マー物質を選択することにより表面に官能基を持つ薄膜を作製することができる。ま たプラズマ重合膜は、高度な橋かけ構造を持つピンホールフリーな膜であることから 流路内部の修飾薄膜として最適である。

[0079] n^ )

表面重合膜は、前記基材表面上で重合性モノマーを重合して得られる重合膜であ る。

重合は、基材表面上の、末端に二重結合を有する疎水性官能基に重合性モノマ 一を重合して実施することが好まし 、。

[0080] 前記疎水性官能基としては、好ましくは炭素原子数 2— 6、さらに好ましくは炭素原 子数 3— 6、特に好ましくは 4一 6の末端に二重結合を有するァルケ-ル基が挙げら れる。

このような疎水性官能基としては、ビュル基、ァリル基、 1ーブテュル基、 1 ペンテ- ル基、 1一へキシニル基などが挙げられる。

[0081] このような疎水性官能基と重合性モノマーとを重合させることにより、表面重合膜は 、該疎水性官能基をスぺーサ一として、炭素 -炭素単結合により共有結合することと なる。

[0082] したがって、このような表面重合膜が結合した基材は、疎水性のスぺーサ一により 水分子の接近が抑制されて 、るので、 pH等の影響による加水分解による疎水性ス ぺーサ一自体の脱離が抑制される。また、疎水性スぺーサ一と表面重合膜とが炭素 炭素結合により結合して ヽるので、表面重合膜が疎水性スぺーサ一との結合位置 で剥離することもない。

[0083] したがって、分析すべき物質がタンパク質の場合に、水溶性溶媒中で分析を行って も pHの影響による表面重合膜の剥離がなぐ信頼性の高い分析を行うことができる。

[0084] また、表面重合法では、重合性モノマーを重合させて表面のポリマー膜を形成させ るので、ポリマー自体を結合させる場合と比較して、ポリマーの凝集がないので、基 材表面との結合を効率的に行うことができる。

[0085] 疎水性官能基の基材表面への導入は、トルエン、メタノール、エタノール等の溶媒 に、前記末端に二重結合を有する疎水性官能基を誘導する化合物を溶解し、ガラス 等の基材を接触させて実施することができる。接触反応は、たとえば、室温 (25°C程 度）一 100°C程度の温度で、たとえば、 1一 24時間程度の時間実施する。

[0086] このような前記末端に二重結合を有する疎水性官能基を誘導する化合物は、一方 の末端がガラス表面のシラノール基と反応しうるものであることが好ま 、。このような 化合物としては、たとえば、トリエトキシビュルシラン、トリエトキシァリルシラン、トリエト キシブテニルシラン、トリエトキシペンテニルシラン、トリエトキシへキシルシランなどの ァルケ-ルシランが挙げられる。

[0087] これらのうちでは、より好ましくはトリエトキシァリルシラン、トリエトキシブテュルシラン 、トリエトキシペンテニルシラン、トリエトキシへキシルシラン、特に好ましくはトリェトキ シブテニノレシラン、トリエトキシペンテ-ノレシラン、トリエトキシへキシルシランを用いる ことが望ましい。これらのァルケ-ルシランは、市販品又は公知の方法により製造す ることができる。たとえば、溶媒の存在下、所望のァルケ-ル基を含有するグリニヤー ル試薬又はアルキルリチウム化合物と、クロロシラン等のハロゲン化シラン又はアルコ キシシランとを反応させて、容易に合成することができる。

[0088] 前記重合性モノマーとしては、ビニル基、ァリル基、ジェンなどを有するものであれ ばよぐ限定されない。

[0089] このような重合性モノマーとしては、ノ-オン性モノマー、ァ-オン性モノマー、カチ オン性モノマーなどが挙げられる。 ノ-オン性 (疎水性、親水性など)表面を作るノ-オン性モノマーとしては、たとえば アクリルアミド、メタクリルアミドなどのアミド類；

アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、酢酸ビュル、酢酸ァリル、ァセト酢酸ァリル、ト リメチル酢酸ビュル、ビュル蟻酸、へキサン酸ビュル、ラウリン酸ビュル、メタクリル酸 ビュル、オクタン酸ビュル、パルミチン酸ビュル、ピバル酸ビュル、プロピオン酸ビ二 ル、ステアリン酸ビュル、へキサヒドロフタル酸モノ 2- (メタクリロイルォキシ）ェチル、フ タル酸モノ- 2- (メタクリロイルォキシ）ェチル、安息香酸ビュル、 P-ビュル安息香酸、 酪酸ビュル、力プリン酸ビュル、カプロン酸ビュル、クロトン酸ビュル、デカン酸ビュル 、けい皮酸ビニル、ァリルプチレート安息香酸ァリル、 n-酪酸ァリル、 n-力プリン酸ァリ ル、 n-力プロン酸ァリル、ェナント酸ァリル、ヘプタン酸ァリル、イソフタル酸ァリル、ィ ソチオシアン酸ァリル、イソ吉草酸ァリル、 n-吉草酸ァリルなどのエステル類； ビュルメチルケトンなどのケトン類；

ビニノレブチノレエーテノレ、ァリノレエーテノレ、ァリノレエチノレエーテノレ、ァリノレブチノレエ一 テル、ビュルェチルエーテル、 n-デカン酸 ァリルなどのエーテル類；

ビュルアルコール、ァリルアルコールなどのアルコール類；

塩化ビニル、塩化ァリル、塩化メタクリロイル、クロ口酢酸ビュル、塩化アタリロイル、 臭化ァリル、よう化ァリル、クロ口酢酸ァリル、クロ口ぎ酸ァリル、ァリルクロ口ホルメート などのハロゲン化物；

スチレン、ァリルベンゼン、 4-メタアクリルォキシ -2-ヒドロキシベンゾフエノン、ビニル トルエン、ァリルべンジルエーテル、 4-ァリル- 2,6-ジメトキシフエノール、ァリルァリソ ール、 4-ァリル- 1,2-ジメトキシベンゼンなどのベンゼン環を有する芳香族化合物；

3-メタクリルォキシプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、ァリルクロロジ メチルシラン、ァリルクロロメチルジメチルシランなどのシラン類；

メタタリ口-トリル、ビュルァセトニトリル、アクリロニトリル、シァノ酢酸ァリル、シアン 化ァリルなどのシアン類；

2-ァリルシクロへキサノン、 1-ァリルシクロへキサノール、ァリルシクロペンタンなどの シクロアルカン誘導体； その他、ビニルアントラセン、ビニルスルホン、ァリルアルコールプロポキシレート、 ァリル- L-システィン、ァリルエチレン、ァリルグリシジルエーテル、ァリルトリフルォロ 酢酸、ァリルシクロペンタジェ-ルニッケル、ジェチルホスホノ酢酸ァリル、ァリルジフ ェニルホスフィン、ァリルジフエ-ルホスフィンォキシド、ァリルジスルフイドなどが挙げ られる。

[0091] これらのうち、親水性ノ-オン性表面として、アクリルアミドゃビュルアルコール、疎 水性ノニオン性表面として、スチレンゃァリルベンゼンなどを好ましく用いることができ る。

[0092] ァ-オン性表面を作るァ-オン性モノマーとしては、たとえば、

アクリル酸、メタクリル酸、モノ- 2- (アタリロイルォキシ）ェチルスクシネートなどの力 ルポキシル基含有化合物；

ァリルスルホン酸、ビニルスルホン酸、 2-アクリルアミド -2-メチルプロパンスルホン 酸、 3-ァリルォキシ -2-ヒドロキシ- 1-プロパンスルホン酸、 p-ビュルベンゼンスルホン 酸などのスルホン酸基含有化合物などが挙げられる。

[0093] これらのうち、強ァニオン性として、ビニルスルホン酸ゃァリルスルホン酸、弱ァニォ ン性としてアクリル酸ゃメタクリル酸などを好ましく用いることができる。

[0094] カチオン性表面を作るカチオン性モノマーとしては、たとえば、

ァリルァミン、 3-アクリルアミド- Ν,Ν-ジメチルプロピルァミン、ァリルシクロへキシル ァミン、 3-メタクリルアミド- Ν-ジメチルプロピルァミンなどの第一級ァミン；

メチルァリルァミンなどの第二級ァミン；

Ν-ァリルジェチルァミン、 Ν-ァリルジメチルァミンなどの第三級ァミン； ァリルトリェチルアンモ-ゥム、（3-アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモ -ゥムクロ リド、ビュルトリメチルアンモ-ゥムブロミド、 3- (メタクリロイルァミノ）プロピルトリメチル アンモ-ゥムクロリド、メタクリル酸ェチルトリメチルアンモ -ゥムクロリド、ジァリルジメ チルアンモ -ゥムなどの第四級アンモ-ゥムが挙げられる。

[0095] また、上記ノ-オン性モノマー、ァ-オン性モノマー、カチオン性モノマーの他、た とえば、複素環式化合物を側鎖に有する、ァリルヒドラジン、 2-ビュルピラジン、 2-ビ ニルピリジン、 4-ビニルピリジン、 Ν-ビニル -2-ピロリドン、 1-ァリルべンゾトリアゾール 、ァリル- 1-ベンゾトリアゾールカーボネートなどを用いることもできる。

[0096] これらのうち、強力チオン性としてジァリルジメチルアンモニゥム塩、弱カチオン性と して、ァリルァミンなどを好ましく用いることができる。

[0097] このような重合性モノマーは、 1種単独で、または複数を併用して用いることができ る。

[0098] 基材表面上での前記重合性モノマーのラジカル重合は、公知の方法を採用するこ とができる。たとえば、溶媒の存在下又は非存在下で、必要に応じ重合開始剤を添 カロして、重合性モノマーを重合性官能基が導入された基材表面で重合させて行うこ とがでさる。

[0099] 溶媒としては、重合性モノマーが溶解するものであればよぐ限定されない。たとえ ば、 THF、メタノール、 DMF、 DMSOなどを用いることができる。

[0100] 重合開始剤としては、たとえば 2, 2'—ァゾビス (イソブチ口-トリル）（AIBN)、 1, 1' —ァゾビス（シクロへキサン— 1 カルボ-トリル）、 2, 2'—ァゾビス（2—メチルブチ口-ト リル)などを用いることができる。また、このようなァゾ化合物の他に、過酸化物、有機 金属化合物などを用いることもできる。

[0101] 上記 THF等の溶媒に溶解しない重合性モノマーを用いる場合は、たとえば、超純 水を溶媒として用い、 N, N, Ν', N'—テトラメチルエチレンジァミン、 4, 4'ーァゾビス シァノ吉草酸などの重合開始剤を用いて重合を行うことができる。

[0102] 重合は、重合性モノマーの種類により異なり限定されないが、通常、たとえば、室温 一 100°C程度の温度範囲で、 1一 72時間程度の時間で実施することができる。

[0103] このようにして得られる表面重合膜を、用いる重合性モノマーの種類ある!/、は複数 のポリマーの組み合わせにより、種々の範囲の電荷、疎水性 Z親水性の表面とさせ ることがでさる。

[0104] たとえば、 pHにより異なる力 物質の荷電状態を示すゼータ電位を好ましくは 10 0一" h lOOmVの範囲にコントロールすることができる。

またたとえば、表面の接触角を、好ましくは 1一 140度の範囲にコントロールすること ができる。

[0105] 表面重合膜においては、ピンホールなどのモノマー未修飾部分が発生する場合が ある。このため、さらに、重合性モノマーまたはポリマーを結合させることができる。

[0106] 本発明で用いることができる表面重合膜では、さらに、表面重合膜のポリマー側鎖 中の官能基に、別のポリマーまたはモノマーを反応させてもよい。

導入された官能基を利用して、蛋白質と多様な相互作用をさせながら電気泳動に よる分離が可能となる。例えば、前記カチオン性モノマーを重合性モノマーとして用 いることにより、表面にカチオン性官能基を有する表面重合膜が合成できる。このよう な表面重合膜が被覆された表面を利用して、静電的な相互作用（膜のプラス電荷と 蛋白質のマイナス電荷)を行わせながら蛋白質の電気泳動を行うことが可能である。

[0107] また、ァ-オン性モノマーを重合性モノマーとして用いることにより、表面にァ-オン 性官能基を有する表面重合膜が合成される。その結果、膜のマイナス電荷と蛋白質 のプラス電荷の間での相互作用による電気泳動分離が可能になる。

[0108] さらにノ-オン性の重合性モノマーを適宜使い分けることにより、表面が極めて疎水 的あるいは親水的な表面重合膜が合成されるので、疎水的相互作用あるいは親水 的相互作用に基づく分離が可能である。

[0109] したがって、すなわち上記 3つの例では、それぞれ陰イオン交換クロマトグラフィー、 陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水 Z親水クロマトグラフィーと類似の作用を有する 表面を実現できる。

[0110] (高分早結合蹬)

高分子結合膜は、基材表面に反応性官能基を導入し、該官能性反応基にポリマー を共有結合させて得られるものである。

[0111] 高分子化合物を結合させる部位となる反応性官能基としては、アミノ基、エポキシ 基、カルボキシル基、アルデヒド基などが挙げられる。これらのうちでは、アミノ基、ェ ポキシ基を好ましく用いることができる。

[0112] このような反応性官能基を有する結合基は、さらに、疎水性のスぺーサーを介して 基材表面に結合して 、ることが好ま 、。

[0113] 疎水性スぺーサ一としては、好ましくは炭素原子数 2— 6、さらに好ましくは炭素原 子数 3— 6、特に好ましくは炭素原子数 4一 6のアルキル基を含むことが望まし 、。

[0114] このような疎水性スぺーサーを介した反応性官能基に、高分子化合物を結合した 基材は、疎水性のスぺーサ一により水分子の接近が抑制されているので、 pH等の影 響による加水分解による高分子結合膜の剥離が抑制される。

[0115] 前記スぺーサーを有する反応性官能基の基材表面への導入は、基材の種類により 異なるが、たとえば、基材がガラスの場合シランカップリング法により行うことができ、 基材が金属であればセルフアセンブルモノレイヤー法により行うことができる。

[0116] シランカップリング法を用いる場合は、たとえば、トルエン、メタノール、水等の溶媒 に、ァミノプロピルトリエトキシシラン、アミノブチルトリエトキシシラン、ァミノペンチルト リエトキシシラン、ァミノへキシルトリエトキシシランなどのアミノアルキル系シランカップ リング剤、あるいは、 3—グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、 3—グリシドキシブチル トリエトキシシラン、 3—グリシドキシペンチノレトリエトキシシラン、 3—グリシドキシへキシ ルトリエトキシシランなどのエポキシアルキル系シランカップリング剤を溶解し、ガラス 等の基材を接触させて実施することができる。これらは、市販品又は公知の方法によ り製造することができる。たとえば、アミノアルキル系シランカップリング剤あるいはェ ポキシアルキル系シランカップリング剤は、溶媒の存在下、所望のアルキル基および 官能基を含有するグリニャール試薬又はアルキルリチウム化合物と、クロロシラン等の ノ、ロゲンィ匕シラン又はアルコキシシランとを反応させて、容易に合成することができる

[0117] 接触反応は、たとえば、室温（25°C程度）一 100°C程度の温度で、たとえば、 1一 2 4時間程度の時間実施する。

[0118] セルフアセンブルモノレイヤー法を用いる場合は、たとえばスパッタリングなどによつ て基材表面に金などの金属薄膜を形成し、その金属薄膜表面に官能基とチオール 基を有するスぺーサーを導入し、さらにポリマー (あるいは重合開始剤を官能基と反 応させ、モノマーを用いて重合することも可能である。）を反応させ、高分子結合膜を 形成することができる。また、チオール基を有するポリマーを先に調製しておき、これ を金属表面に修飾させて高分子膜を形成することができる。

[0119] 金属としては、金、銀、銅などが挙げられる。スぺーサ一としては、アミノ基を有する アミノエタンチオール、カルボキシル基を有するチォタト酸などが挙げられる。

[0120] 基材上にスぺーサーあるいは、チオール基を修飾したポリマーを導入するための 溶媒は DMSO、水などの溶媒中にスぺーサーを溶解し、金属薄膜に接触させて実施 することができる。

[0121] 接触反応は、例えば室温一 100°C程度の温度で、例えば 1一 24時間程度の時間実 施する。

[0122] 前記ポリマーとしては、前記表面重合において用いる重合性モノマーを、あらかじ め重合して得られるポリマーが挙げられる。これらのうちでは、好ましくは、ポリスチレ ン、ポリアリルベンゼン、ポリビュルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビュルスルホン 酸、ポリアクリル酸、ポリジァリルジメチルアンモ -ゥム塩、ポリアリルァミン、ポリエチレ ングリコールなどを好ましく用いることができる。

[0123] これらのうち、ノニオン性表面として、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコールを さらに好ましく用いることができる。

[0124] 強ァニオン性表面として、ポリアクリル酸などをさらに好ましく用いることができる。

強力チオン性表面として、ポリアリルアミンをさらに好ましく用いることができる。

[0125] このようなポリマーは、 1種単独で、または複数を組み合わせて用いることができる。

このようなポリマーの重量平均分子量としては、たとえば、好ましくは 5000— 5000

00、さらに好ましくは 10000— 250000の範囲にあること力望まし!/、。

[0126] ポリマーを基材あるいはカバー材に結合させて得られる高分子結合膜においては

、ピンホールのような反応性官能基がポリマーと結合して 、な 、ポリマー未修飾部分 が発生する場合がある。このため、さらに、ポリマーを結合させることができる。

[0127] このような高分子結合膜の製造は公知の方法が採用でき限定されない。たとえば、 前記ポリマーを溶媒に溶解し、前記表面に反応性官能基を導入した基材を溶液に 接触させて製造することができる。

[0128] 溶媒としては、ポリマーを溶解するものであれば限定されないが、たとえば、 DMS

O (ジメチルスルホキシド）、 HEPES (2— [4— (2—ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル] エタンスルホン酸)緩衝液、などが挙げられる。

[0129] また、結合反応には、必要に応じ活性化剤を用いることもできる。たとえば、アミノ基 が導入された基材に、ポリアクリル酸を結合させる場合、 HEPESにポリアクリル酸を 溶解させた後、 N—ヒドロキシスクシンイミド、塩酸 1ーェチルー 3—（ 3—ジメチルアミノプ 口ピル)カルポジイミドを添カ卩して結合させる。

[0130] このようにして得られる高分子結合膜は、ポリマーが未修飾部分を有する場合があ る力 該ポリマー未修飾部分に対し、別のポリマーを結合させることもできる。さらに、 結合したポリマー側鎖中の官能基に、別のポリマーまたはモノマーを反応させること ちでさる。

[0131] このようにポリマーの種類、あるいは複数のポリマーの組み合わせによって種々の 範囲の電荷、疎水性 Z親水性の表面を有する高分子結合膜を得ることができる。 たとえば、 pHにより異なる力 物質の荷電状態を示すゼータ電位を好ましくは 10 0一" h lOOmVの範囲にコントロールすることができる。

またたとえば、表面の接触角を、好ましくは 1一 140度の範囲にコントロールすること ができる。

[0132] このような高分子結合膜は、予め結合すべきポリマーを調製することにより、膜厚を 容易に制御することができる。

[0133] 導入された官能基を利用して、蛋白質と多様な相互作用をさせながら電気泳動等 による分離が可能となる。例えば、前記カチオン性モノマーに由来するポリマーを用 いることにより、表面にカチオン性官能基を有する高分子結合膜が合成できる。この ような高分子結合膜が被覆された表面を利用して、静電的な相互作用 (膜のプラス 電荷と蛋白質のマイナス電荷)を行わせながら蛋白質の電気泳動等を行うことが可能 である。

[0134] ァニオン性モノマーに由来するポリマーを用いることにより、表面にァニオン性官能 基を有する高分子結合膜を合成することができる。その結果、ァミノ基と同様の静電 的な相互作用であり、かつ膜のマイナス電荷と蛋白質のプラス電荷の間での相互作 用による電気泳動分離等が可能になる。

[0135] ノニオン性の重合性モノマーに由来するポリマーを適宜使い分けることにより、表面 が極めて疎水的あるいは親水的な高分子結合膜を合成できるので、疎水的相互作 用あるいは親水的相互作用に基づく分離が可能である。

[0136] また、ァニオン性官能基を有するポリマーを修飾した後、該ァニオン性官能基に、 たとえば、疎水性 (または親水性)の官能基を有するノ-オン性ポリマーまたはノ-ォ ン性モノマーを結合させることにより、ァ-オン性と疎水性 (または親水性)の性質を 併せ持つ基材表面を形成することができる。また、ノ-オン性ポリマー又はモノマー の修飾率を変えれば、疎水性 (または親水性）のバランスをコントロールすることがで きる。

[0137] このようにして得られるマイクロ流路チップでは、基材、さらに好ましくは基材および カバー材の表面にお ヽて、高分子化合物膜で被覆されて ヽな ヽ領域が存在するた め、基材とカバー材との貼り合わせの際の接着強度に優れている。

[0138] <マイクロ流路チップ >

本発明に係るマイクロ流路チップは、表面に流路が形成された基材の該流路側の 表面と、カバー材とが貼り合わされてなり、前記基材表面のうち、流路の一部又は全 部の表面に高分子化合物膜が被覆されている。

また、前記カバー材の基材側の表面には、高分子化合物膜が被覆されていること が好ましい。

[0139] さらに、前記カバー材の基材側の表面の、基材の高分子化合物膜が形成されてい る領域と対向する領域に、前記基材の高分子化合物膜が形成されて!ヽる部分の一 部又は全部と同一形状の高分子化合物膜が被覆されていることがより好ましい。 このようなマイクロ流路チップは、前記本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法 により製造することが好まし 、。

[0140] 前記基材、前記カバー材、前記流路、前記高分子化合物膜は、前記マイクロチッ プの製造方法で示したものと同意義である。

[0141] <牛.体分子の分離 法 >

本発明に係る生体分子の分離方法は、次の工程を含む。

a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされて なり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイク ロ流路チップに、分析すべき生体分子を加える工程、および

b)分離媒体に分離圧を加える工程。

[0142] 該生体分子の分離方法で用いることのできるマイクロ流路チップは、本発明に係る 前記マイクロ流路チップである。また、前記基材、前記カバー材、前記流路、前記高 分子化合物膜は、前記マイクロチップの製造方法で示したものと同意義である。

[0143] 分離媒体としては、電気泳動等における泳動媒体として公知のものを採用でき限定 されない。たとえば分離媒体としては、有機溶媒、ポリアクリルアミド、ァガロースなど のゲル、緩衝液等の液体が挙げられる。好ましくは電気泳動媒体を用いる。電気泳 動媒体としては、たとえば、ゲル、緩衝液などを用いることが好ましい。圧送の場合、 用いる分離媒体に特に限定はない。

[0144] 分離圧としては、用いる分離媒体などにより異なり特に限定されず、電気泳動、圧 送などを採用することができる。このうち電気泳動が好ましい。

[0145] 生体分子としては、蛋白質、 DNA、ウィルス、細菌、糖類、アミノ酸、その他の代謝 産物などが挙げられ、これらのうち、本発明は蛋白質の分離に有効である。

[0146] 前記電気泳動方法の分離原理は限定されな!、。前記表面に高分子化合物膜が被 覆された基材を用いる電気泳動分離は、分離媒体の条件によって、様々な性状に基 づく分離を可能とする。電気泳動分離の分離条件として、 pH勾配、分子篩 (ふるい)、 分離媒体中で接触する官能基との相互作用等を示すことができる。 pH勾配を備えた 分離媒体中における電気泳動を蛋白質に利用すれば、等電点電気泳動となる。また ポリアクリルアミドゲルのような分子篩効果を持つ媒体中で電気泳動を行うとき、 SDS、 尿素、あるいはグァニジンのような蛋白質変性剤を共存させれば、変性条件下での 分子篩電気泳動が成立する。あるいは、変性剤を用いなければ、ネイティブな条件 下での電気泳動となる。

[0147] 同様に分子篩 (ふるい）に基づいて核酸を泳動するとき、核酸は長さに基づいて分 離される。 PCR-SSCPのように非変性条件と変性条件下で同じ核酸を電気泳動分離 して、両者の結果を比較して立体構造の違いを明らかにする分析方法も公知である

[0148] 更に、さまざまな官能基を備えた分離媒体の利用も可能である。具体的には、静電 的相互作用、水素結合、疎水結合、あるいは任意の組み合わせの親和性物質など を示すことができる。親和性物質としては、抗原 抗体、相補的な塩基配列からなる 核酸のハイブリダィゼーシヨン、アビジン ピオチンや、糖ーレクチンのような親和性物 質の組み合わせ等がある。 [0149] 本発明に好適な電気泳動の原理の一つに、キヤピラリー電気泳動を示すことができ る。本発明に基づいてキヤビラリ一電気泳動を行う場合、前記高分子化合物膜が施 されて ヽるので、電気浸透流を制御することのできる流路を形成できる。

[0150] 本発明において、キヤピラリー電気泳動に有用な好ましいモノマー物質には、例え ば、プラズマ重合膜の場合、へキサジェン、へキサメチルジシロキサン、ァセトニトリル 、へキシルァミン、アミノアセトアルデヒドジメチルァセタールを示すことができる。 表面重合膜の場合、スチレン、アクリルアミド、ビュルスルホン酸、アクリル酸、ジァリ ルジメチルアンモ -ゥム塩、ァリルァミンが挙げられる。

高分子結合膜の場合、ポリビュルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアリルァミンが挙 げられる。

[0151] 以下は、プラズマ重合膜を用いる例である。陽極液と、陰極液を両端に導入し、両 端に電圧を印加する。陽極液には、電解質の中で最も酸性の強いものよりも低い pH を与える酸性の溶液が用いられる。一方、陰極液には、最も塩基性の強いものよりも 高 ヽ pHを与えるアルカリ性の溶液を利用する。それぞれの両性電解質は等電点の 位置まで移動した後停止する。蛋白質成分は、流路内に形成された pH勾配上の等 電点の位置で濃縮され、細 ヽゾーンとして観測される。

[0152] キヤビラリ一ゾーン電気泳動（CZE)では、 1種類の電解質溶液を流路内に導入す ることにより、流路内壁および内壁に接する電解質溶液の間に電気二重層が形成さ れる。電圧がかけられると電解質溶液が溶媒を伴って移動し、電気浸透流が生じる。 電気浸透流は分離された成分イオンを移動させる駆動力となる。試料成分はそれぞ れの電荷とサイズに応じた静電気力を受けて対極へ引き寄せられ、電荷とサイズの 違 、が移動度の違!、となり成分が分離される。

[0153] CZEでは、電気浸透流を用いて生体分子の分離を行っている力 電気浸透流は p Hによって大きく変わり、キヤビラリ一間の個体差もあるため問題である。この電気浸 透流をコントロールすることができれば、様々なモード (キヤピラリー電気泳動全般（ CZE、キヤビラリーゲル電気泳動（CGE)、キヤビラリ一等電点電気泳動（CIFE)など） 及び、クロマトグラフィー的な分離 (イオン交換、逆相、順相、ァフィユティークロマトグ ラフィ一等)）で生体分子を分離することが可能になると考えられる。本発明で用いる 高分子化合物膜 (特にプラズマ重合膜)によってコーティングされた流路は、電気浸 透流をコントロールすることができるため非常に有効である。

[0154] <雷気泳動分析 置>

更に本発明は、次の要素で構成される電気泳動分析装置に関する。

a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされ てなり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイ クロ流路チップ、

b)該マイクロ流路チップを保持するための支持体、および

c)支持体に保持されたマイクロ流路チップに電圧を印加するための電極。

[0155] 該電気泳動分析装置で用いることのできるマイクロ流路チップは、本発明に係る前 記マイクロ流路チップである。また、前記基材、前記カバー材、前記流路、前記高分 子化合物膜は、前記マイクロチップの製造方法で示したものと同意義である。支持体 は特に限定されず、マイクロ流路チップが安定に固定されるものであればよい。 なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。

実施例

[0156] 以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定さ れるものではな 、。実施例にぉ 、て用いた装置等は下記の通りである。

[0157] [プラズマ重合装置]

実施例において、プラズマ重合膜の重合方式として、 RF電源、外部電極方式によ る After glow方式を利用した。サムコネ土製のプラズマ基礎研究装置 BP- 1をベースに 種々のユニットを追カ卩して、流量、圧力、およびパワーマッチングを自動で制御可能 な装置を作製した。装置の構成を以下に示す。

[0158] 反応器 (チャンバ一) :パイレックス (登録商標)製 210mm φ、

試料ステージ:チャンバ一下部に、 SUS304製、ヒーター加熱制御ステージ設置 排気系：ファイファー社製ターボ分子ポンプ +エドワーズ社製ロータリーポンプ 電源：サムコ社製 13. 56MHz, 300W、水晶発振

マッチング：サムコ社製オートマッチング方式 圧力コントロール： MKS社製バラトロン真空計からの圧力を VAT社製オートマチック プレッシャーコントロール（APC)バルブュ ニットで自動制御

ガス導入系：試料モノマー、アルゴン、酸素ラインを STEC社製電磁弁とマスフローコ ントロール（MFC)ユニットで自動制御

[0159] [電子顕微鏡]

電子プローブマイクロアナライザー JXA-8100 (日本電子社製）

[0160] [電子プローブマイクロアナライザ]

電子プローブマイクロアナライザー JXA-8100 (日本電子社製）

[0161] 〔実施例 1〕

[マスクを用いてプラズマ重合膜が成膜されたチップの作製]

ポリメチルメタタリレート (PMMA) (クラレックス 000 (商品名）、 日東榭脂社製、厚さ 3mm X縦 70mm X横 70mm)基板に、幅 200 μ mのステンレス製マスクを載せ、これら を、プラズマ重合装置のチャンバ一内に入れた。チャンバ一内の真空度を 3 X 10— ⁵ Torrとした。へキサメチルジシロキサン（HMDS)をチャンバ一内に満たし、放電電力 (RFパワー） 150W、圧力 0. lPa、流速 lOOsccmとし、 180秒放電を行い、プラズマ 重合膜を成膜した。膜厚は lOOnmであった。

[0162] 図 1に示すように、プラズマ重合膜力 200 mの幅で成膜されたことが、電子顕微 鏡により確認できた。

[0163] 図 2に示すように、電子プローブマイクロアナライザにより、成膜部の元素マッピング 組成分析を行ったところ、基材の PMMAには含まれず、 HMDSに含まれる Siが、 200 μ m幅で強く検出された。また基材の PMMAに比較して HMDSでは含有が少 ない Cの検出が小さくなつており、マスク幅で膜が形成されていることが確認された。

[0164] 〔実施例 2〕

[マイクロ流路チップの製造]

成型チップ（ポリメチルメタタリレート： PMMA)とポリジメチルシロキサン： PDMSとの貼 り付けによって電気泳動用チップを作製し、これを用 、てタンパク質の分離を行つた

[0165] PMMA (厚さ 8mm)を射出成型することによって、十字型のマイクロ流路を設けたプ ラズマ重合用チップ (基材)を作製した (小林精工社製、図 3を参照)。マイクロ流路の 深さと幅は、それぞれ 100 /ζ πι、リザーバーの径： 4mm、導入チャネル： 10mm、分離チ ャネル： 50mmである。

[0166] カバー材は、ポリジメチルシロキサン（PDMS) (商品名 SYLGARD 184:信越シリコー ン社製)をポリスチレンケース内で重合することにより作製した。重合は、モノマーと触 媒を 10 : 1で混合し、真空ポンプにて脱気後、ポリエチレンケースにキャストし、 70°Cで 1時間反応させて蓋材である PDMSを得た。

[0167] プラズマ重合用チップのマイクロ流路内へ成膜するため、 3種類の金属マスク（幅 150、 200、 1000 μ m) (ステンレス製：健正堂社製）を使用した。

基材とカバー材の両方に、 3種類の金属マスク（幅 150、 200、 1000 m)を施し、重 合用モノマーを用い、各プラズマ重合膜が lOOnm程度の膜厚になるようプラズマ重合 を行った。重合用モノマーとして、 HMDS,へキシルァミン、ァセトニトリルを用いた。

[0168] 各モノマーのプラズマ重合の条件は下記の通りである。

HMDS

• RFパワー： 150W

• MF: 100sccm (HMDSに対する値、ァセトニトリル用マスフローメーターの値は 22.0sccm)

•時間： 180秒

[0169] へキシルァミン

• RFパワー： 200W

• MF： 4.0sccm (ァセトニトリル用マスフローメーターの値）

•時間： 900秒

[0170] ァセトニトリル

• RFパワー： 200W

• MF: 10.0sccm (ァセトニトリル用マスフローメーターの値）

•時間： 180秒

[0171] 成膜後、金属マスクをはがし、基材とカバー材のァライメントを取りながら貼り付け、 電気泳動用チップを作製した。 作製したマイクロ流路チップのマイクロ流路内に、泳動バッファー（0.6%セルロース を含む 0.1Mリン酸緩衝液 (pH8.5) )を流したところ、全てのプラズマ重合膜、および幅 150、 200、 1000 mの全てにおいてチャネル外への泳動バッファーの漏出がなぐ基 材とカバー材の貼り付けは十分であることが確認できた。

[0172] 〔実施例 3〕

[マイクロ流路チップを用いる電気泳動によるタンパク質の分離]

実施例 2で、 HMDS,幅 1000 mの金属マスクを使用して調製したマイクロ流路チ ップを用い、タンパク質としてカルボニックアンヒドラーゼを用いて分離実験を行った。 比較対照用に、被膜していないチップを用いた。

カルボニックアンヒドラーゼ lmgを下記の蛍光試薬 (Cy5)によって染色し、これを用 いた。

[0173] 带 靠による^^ 法

(Cy5によるタンパク質の染色方法）

蛍光色素である Cy5はタンパク質染色用としてキット化されており、安定で量子効率 の良い蛍光試薬である。このため、 Cy5を蛍光色素としてタンパク質を染色し、これを 使用した。染色方法を以下に示す。カルボニックアンヒドラーゼ lmg (タンパク質重量) (等電点 pl = 7. 3、分子量 30kDa (Sigma社製））とアマシャム Cy5染色キット 1パックを 0.1M炭酸緩衝液 (pH9.2) lmL中に溶解し、室温、 1時間攪拌下で反応させた。反応 後、未反応 Cy5を除去するため、マイクロコン YM3 (ミリポア社製、分画分子量 3000) 中に 500 L入れ、 14000Gで 100分間遠心し（限外ろ過）、その後、同じ炭酸緩衝液を 400 L加えて遠心を行った。これを 4回繰り返し精製した。最終液量を lmLとし、 Cy5 染色タンパク質を調製した。

[0174] 泳動バッファーのチップへの導入方法

図 3に示すように、チップのリザーバー 3に泳動バッファーを 17 L入れ、シリンジで 圧をカ卩えることによってチャネル内を泳動バッファーで満たした (気泡が入らないよう に注意して行った)。

[0175] それぞれのリザーバーまでのチャネル内を泳動バッファーで満たした後、泳動バッ ファーをリザーバー 1、 2には 17 μ L、リザーバー 4には 15.5 μ L、それぞれ添加した。 リザーバー 4にサンプルを 1.5 L添加し、ピペッティングしてよく攪拌した。

[0176] 各リザーバーに白金線で作った電極を入れ、ハイボルテージ.シーケンサーで電圧 を制御しながら電気泳動を実施した。電気泳動の検出は、リザーバー 4に入る直前の 流路で行った。導入時の電圧、分離時の電圧、導入時間、分離時間は、以下の通り である。電圧の加え方は図 3の通りである。

導入電圧 600V

導入時間 60秒

分離電圧 VI 130V

V2 750V

分離時間 1200秒

[0177] ¾

図 4にサンプルとしてカルボニックアンヒドラーゼを用いたときの電気泳動結果を示 す。最初に検出されたピークは、未反応 Cy5によるものと考えられる (成膜なし:約 160 秒、 HMDS成膜:約 180秒)。続いて検出された複数のピークがカルボニックアンヒドラ ーゼによるものであると考えられる力 成膜なしチップで検出されたピーク群 (約 170 一 1200秒）と HMDS成膜チップで検出されたピーク群（約 190— 460秒）では Cy5のピ ークを基準にしてみた場合、ほぼ同じ時間に検出された (約 10秒後)。分離能は、 HMDS成膜チップの方が速く多数のピークが検出されたことから良好であると判断さ れる。ここでの分離能とは、電気泳動パターンの相違とピークの数 (多いほど分離能 が高いと解釈される）を示している。 Cy5によるピークを基準として検出されたタンパク 質のピークを考察した。

産業上の利用可能性

[0178] 本発明に係るマイクロ流路チップの製造方法は、基材、さらに好ましくは基材およ びカバー材の表面にぉ ヽて、高分子化合物膜で被覆されて ヽな ヽ領域が存在する ようにして高分子化合物膜を形成するため、基材とカバー材との貼り合わせにおいて 接着強度に優れ、また、簡便である。

Claims

請求の範囲

[1] 表面に溝状の流路が形成された基材の表面を、該流路が露出するマスクで遮蔽し、 露出した基材表面に、高分子化合物膜を形成する工程、および

前記基材の流路が形成されている側の表面に、カバー材を貼り合わせる工程 を含む、マイクロ流路チップの製造方法。

[2] 前記基材を貼り合わせる側のカバー材表面に、高分子化合物膜を形成する工程を 含む、請求項 1に記載の方法。

[3] 前記基材を貼り合わせる側のカバー材表面に、高分子化合物膜を形成するに際し、 前記カバー材の表面を、前記基材のマスクの露出部分の一部又は全部と露出部分 が同一形状のマスクで遮蔽し、露出したカバー材表面に、高分子化合物膜を形成す る、請求項 2に記載のマイクロ流路チップの製造方法。

[4] 前記基材表面の高分子化合物膜が、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合 膜、

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

である、請求項 1一 3のいずれかに記載の方法。

[5] 前記基材表面の高分子化合物膜が、プラズマ重合膜である、請求項 1一 4の 、ずれ かに記載の方法。

[6] 前記カバー材表面の高分子化合物膜が、

(a)基材表面でプラズマ重合性モノマーをプラズマ重合して形成するプラズマ重合膜

(b)基材表面で重合性モノマーを重合して形成する表面重合膜、または

(c)基材表面に高分子化合物を結合して形成する高分子結合膜

である、請求項 2— 5のいずれかに記載の方法。

[7] 前記カバー材表面の高分子化合物膜が、プラズマ重合膜である、請求項 2— 6の 、 ずれかに記載の方法。

[8] 前記基材の表面に形成する高分子化合物膜と、前記カバー材の表面に形成する高 分子化合物膜とが、同一の高分子化合物膜である、請求項 2— 7のいずれかに記載 の方法。

[9] 前記貼り合わせを、圧着または熱圧着により行う、請求項 1一 8のいずれかに記載の 方法。

[10] 前記基材および前記カバー材の少なくとも一方力 プラスチックである請求項 1一 9 のいずれかに記載の方法。

[11] 前記基材およびカバー材カ プラスチックである、請求項 1一 10のいずれかに記載 の方法。

[12] 前記基材およびカバー材のいずれもが、熱可塑性榭脂であり、

前記貼り合わせる工程が、基材とカバー材とを、熱圧着により貼り付ける方法である、 請求項 11に記載の方法。

[13] 前記熱圧着を 200°C以下の温度で行う、請求項 12に記載の方法。

[14] 前記基材およびカバー材のいずれか一方がケィ素榭脂であり、残りの一方がガラス またはプラスチックであり、

前記貼り合わせる工程が、基材とカバー材とを、圧着により貼り付ける方法である、請 求項 10に記載の方法。

[15] 前記マスク力 フォトレジストマスクまたは金属マスクである、請求項 1一 14のいずれ かに記載の方法。

[16] 表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされてな り、前記基材表面のうち、流路の一部又は全部の表面に高分子化合物膜が被覆され ている、マイクロ流路チップ。

[17] 前記カバー材の基材側の表面に、高分子化合物膜が被覆されている、請求項 16に 記載のマイクロ流路チップ。

[18] 前記カバー材の基材側の表面の、基材の高分子化合物膜が形成されている領域と 対向する領域に、前記基材の高分子化合物膜が形成されて 、る部分の一部又は全 部と同一形状の高分子化合物膜が被覆されている、請求項 17に記載のマイクロ流 路チップ。

[19] 次の工程を含む生体分子の分離方法： a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされて なり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイク ロ流路チップに、分析すべき生体分子を加える工程、および

b)分離媒体に分離圧を加える工程。

[20] 前記分離圧が電気泳動によるものである、請求項 19に記載の方法。

[21] 前記電気泳動が、キヤピラリー電気泳動である、請求項 20に記載の方法。

[22] 前記生体分子が、蛋白質である、請求項 19一 21のいずれかに記載の方法。

[23] 次の要素で構成される電気泳動分析装置：

a)表面に流路が形成された基材の該流路側の表面と、カバー材とが貼り合わされて なり、前記基材表面のうち、流路の表面に高分子化合物膜が被覆されている、マイク ロ流路チップ、

b)該マイクロ流路チップを保持するための支持体、および

c)支持体に保持されたマイクロ流路チップに電圧を印加するための電極。